ES2285759T3 - Cianobacterias geneticamente modificadas para la produccion de etanol. - Google Patents
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Abstract
Cianobacterias genéticamente modificadas que contienen un constructo que comprende fragmentos de DNA que codifican enzimas piruvato descarboxilasa (pdc) y alcohol deshidrogenasa (adh) obtenidas de Zymomonas mobilis y un promotor que comprende un promotor cI-PL que es inducible por temperatura, en donde dichas cianobacterias son capaces de producir etanol en cantidades recuperables en al menos 1, 7 µmol de etanol por mg de clorofila por hora a una temperatura de 42ºC.
Description
Cianobacterias genéticamente modificadas para la
producción de etanol.
Esta invención se refiere a la modificación
genética de cianobacterias para la producción de etanol. En
particular, la invención se refiere a la modificación genética de
Synechococcus incorporando la información genética que
codifica para piruvato descarboxilasa (pdc) y alcohol deshidrogenasa
(adh).
El etanol es una fuente de energía que es
particularmente atractiva debido a que puede utilizarse con pocos
residuos. Además, etanol derivado de organismos vivos es una
alternativa atractiva a combustibles basados en petróleo debido a
que es un recurso renovable.
Un número de alternativas para la producción de
etanol a partir de organismos vivos se ha investigado usando
microorganismos.
La producción de etanol por microorganismos, en
gran parte, se ha investigado usando la levadura
Saccharomyces y la bacteria Zymomonas, que es una
aeróbico facultativo. Ambos microorganismos contienen la información
genética para producir enzimas pdc y adh, enzimas que
se usan para producir etanol a partir de piruvato, un producto de
la ruta glicolítica.
La Patente de EE.UU. 4.242.455 de Muller y otros
describe un procedimiento continuo en el que una suspensión acuosa
de partículas de polímero de carbohidrato, tales como gránulos de
almidón y/o trozos, fibras, etc. de celulosa, se acidifica con un
ácido orgánico fuerte para formar un azúcar fermentable. El azúcar
fermentable se fermenta a continuación hasta etanol con al menos
dos cepas de Saccharomyces. La Patente de EE.UU. 4.250.765
de Chibata describe un método para producir etanol con una alta
concentración usando una Saccharomyces o Zymomonas
inmovilizada y un caldo de cultivo nutritivo que contiene un azúcar
fermentativo. La Patente de EE.UU. 4.413.058 de Arcuri y otros
describe una nueva cepa de Zymomonas mobilis que se usa para
producir etanol poniendo el microorganismo en una columna reactora
continua y haciendo pasar una corriente de azúcar acuoso a través
de dicha columna.
La Solicitud PCT WO/88/09379 de Hartely y otros
describe el uso de cepas de bacterias termófilas anaerobias
facultativas que producen etanol fermentando una amplia gama de
azúcares, incluyendo celobiosa y pentosa. Estas cepas bacterianas
contienen una mutación en lactato deshidrogenasa. Como resultado,
estas cepas que normalmente producirían lactato bajo condiciones
anaerobias, producen en cambio etanol.
Además, se ha alterado genéticamente
Escherichia coli para producir etanol insertando el material
genético que codifica para las enzimas adh y pdc
usando el plásmido pLOI295. El material genético que codifica la
enzima pdc se aisló de Zymomonas mobilis. Esta Escherichia
coli alterada produce etanol; sin embargo, todavía requiere una
variedad de substratos orgánicos para el metabolismo y el
crecimiento bacteriano. (Ingram, y otros, (1987), "Genetic
Engineering of Ethanol Production in Escherichia coli"
(Appl. Environ Microbiol. 53: 2420-2425).
Toda la técnica anterior previa describe
microorganismos que utilizan un substrato de carbohidrato/azúcar
para producir etanol. Como tales, estos procedimientos son costosos
debido a que se requiere un substrato alimenticio de
carbohidratos/azúcares para que los microorganismos puedan producir
etanol. De ahí que el coste de estos sistemas sea un impedimento
para el refinado y el aumento a escala de tales sistemas para la
producción de etanol.
Es altamente deseable encontrar un
microorganismo que pueda producir eficazmente etanol, en donde dicho
microorganismo requiera substrato alimenticio mínimo.
En la presente invención, se proporcionan
cianobacterias fotosintéticas genéticamente modificadas que son
capaces de producir etanol. Las cianobacterias se producen
genéticamente mediante la inserción de fragmentos de DNA que
codifican las enzimas pdc y adh. Por consiguiente, las enzimas pdc y
adh se producen in vivo mediante las cianobacterias
genéticamente modificadas; enzimas que convierten el piruvato en
acetaldehído y el acetaldehído en etanol, respectivamente. En
particular, Synechococcus es una cianobacteria preferida de
la presente invención. En una modalidad preferida,
Synechococcus transformadas producen etanol en cantidades
recuperables de al menos 1,7 \mumol de etanol por mg de clorofila
por hora.
Las cianobacterias genéticamente modificadas
proporcionadas contienen constructos que comprenden un gen inducible
por temperatura de modo que el etanol se produce solo una vez que
se alcanza una temperatura particular. El constructo comprende el
gen inducible por temperatura CI857. El gen inducible por
temperatura CI857 puede usarse en la forma del promotor
CI-PL, Nº de Registro de EMBL L05669, Nº ID SEC
7.
\newpage
Las cianobacterias genéticamente modificadas
proporcionadas que contienen constructos que comprenden fragmentos
de DNA que codifican las enzimas pdc y adh se obtienen a partir de
Zymomonas mobilis.
En un aspecto adicional de la presente
invención, la cianobacteria es Synechococcus PCC 7942 u otras
cepas transformables capaces de producir etanol cuando un
constructo que comprende fragmentos de DNA que codifican enzimas
pdc y adh procedente del plásmido pLOI295 se transforma dentro de la
Synechococcus.
Las cianobacterias genéticamente modificadas
proporcionadas contienen constructos que comprenden fragmentos de
DNA del plásmido pLOI295 de Zymomonas mobilis que codifican
las enzimas pdc y adh, en donde el fragmento de DNA que codifica la
enzima pdc se lista en los European Molecular Biology Laboratories
("EMBL") como Nº de Registro M15393 y según se describe en
Conway y otros (1987) J. Bacterial 169: 949-954 Nº
ID SEC 5, o una secuencia génica que codifica la enzima pdc y es
capaz de expresión en cianobacterias.
Las cianobacterias genéticamente modificadas
proporcionadas contienen constructos que comprenden fragmentos de
DNA del plásmido pLOI295 de Zymomonas mobilis que codifican
las enzimas pdc y adh, en donde el fragmento de DNA que codifica la
enzima adh es adh II listada en los EMBL como Nº de Registro
M15394 y según se describe en Conway y otros, (1987) J. Bacterial
169: 2591-2597, Nº ID SEC 6, o una secuencia génica
que codifica la enzima adh que es capaz de expresión en
cianobacterias.
En otro aspecto de la presente invención, se
proporcionan cianobacterias genéticamente modificadas capaces de
producir etanol producidas de acuerdo con las siguientes etapas:
- a.
- seleccionar promotor CI-PL;
- b.
- ligar dicho promotor a una secuencia de DNA que codifica pdc y adh;
- c.
- clonar dicho promotor ligado y dicho DNA que codifica pdc y adh en un constructo apropiado;
- d.
- transformar el constructo dentro de las cianobacterias.
En una modalidad preferida, la cianobacteria
modificada es una Synechococcus PCC 7942 modificada.
Constructos producidos de acuerdo con estas etapas incluyen el
constructo pCB4-CPpa.
En el constructo proporcionado, los fragmentos
de DNA que codifican las enzimas pdc y adh se listan
en los EMBL como Nº de Registros M15393 y M15394, Nº ID SEC 5 y 6,
respectivamente, o secuencias análogas de los mismos incluyen
codificación para la enzima pdc y la enzima adh,
respectivamente.
En los constructos proporcionados que codifican
las enzimas pdc y adh los constructos incluyen un gen inducible por
temperatura CI857.
El procedimiento proporcionado para elaborar
cianobacterias genéticamente modificadas incorpora un constructo
que incluye un promotor CI-PL y que codifica las
enzimas pdc y adh del plásmido pL0I295 de Zymomonas mobilis
u otra fuente adecuada de enzimas pdc y adh, de acuerdo con las
siguientes etapas:
- a.
- recoger células de las cianobacterias;
- b.
- añadir el constructo a las células de cianobacteria recogidas;
- c.
- incubar el constructo y las células de cianobacteria de modo que el constructo se transforme dentro de las células de cianobacteria;
- d.
- cultivar en placa los constructos incubados y las células de cianobacteria sobre placas que contienen ampicilina e incubar bajo condiciones de crecimiento apropiadas;
- e.
- seleccionar las células de cianobacteria resistentes a ampicilina transformadas.
El procedimiento proporcionado para producir
etanol usando cianobacterias genéticamente modificadas comprende
las etapas de cultivar en un medio de cultivo cianobacterias, en
donde las cianobacterias contienen un constructo que comprende
fragmentos de DNA que codifican las enzimas pdc y adh obtenidas de
la Zymomonas mobilis pLOI295 y acumular etanol en el medio
de cultivo. El procedimiento para producir etanol incluye un
constructo que comprende un gen inducible por temperatura y el
procedimiento comprende la etapa adicional de incrementar la
temperatura del medio de cultivo para inducir la expresión de los
genes pdc y adh.
La invención se entenderá mejor ahora con
referencia a las siguientes figuras y ejemplos, y la descripción
correspondiente, que son ilustrativos de modalidades preferidas de
la invención. La invención no debe estar limitada por los
dibujos.
\global\parskip0.930000\baselineskip
La Figura 1 es una ilustración del mapa del
plásmido pLOI295 que contiene los fragmentos de DNA que codifican
para pdc y adh.
La Figura 2 es una ilustración del mapa del
constructo plasmídico pCB4-Rpa.
La Figura 3 es una ilustración del mapa del
constructo plasmídico pCB4-LRpa.
La Figura 4 es una ilustración del mapa del
constructo plasmídico
pCB4-LR(TF)pa.
La Figura 5 es una ilustración del mapa del
constructo plasmídico pCB4-CPpa.
La Figura 6 es una ilustración de una gráfica
del tiempo de incubación de células de Synechococcus PCC 7942
con el vector pCB4-CPpa, a 42 grados Celsius,
frente a la actividad de piruvato descarboxilasa.
La Figura 7 es una ilustración de la inducción
de la expresión de adh a 42 grados Celsius para Synechococcus
PCC 7942 en comparación con E. coli y Synechococcus
silvestre.
La Figura 8 es una ilustración del tiempo de
inducción de Synechococcus PCC 7942 frente a la producción de
etanol en Synechococcus PCC 7942 en células transformadas
con pCB4-Rpa.
La Figura 9 es una descripción del gen
pdc identificado como Nº ID SEC 5.
La Figura 10 es una descripción del gen
adh identificado como Nº ID SEC 6.
La Figura 11 es una descripción del promotor
CI-PL identificado como Nº ID SEC 7.
Todas las designaciones de letras similares se
refieren a los mismos sitios en los diferentes mapas de los
constructos plasmídicos en las figuras, como sigue: AMP^{R}
(resistente a ampicilina); PDC (piruvato descarboxilasa); ADH
(alcohol deshidrogenasa); ATG (codón de inicio); L (promotor
lacZ); R (promotor rbcLS); R' (EcoRI); B
(BamHI); S (SalI); X (XbaI); X/P (fusión
XbaI/PvuII); Xh/B (fusión XhoI/BamHI);
T (terminador de la transcripción) y CI-PL (gen
inducido por temperatura y promotor izquierdo del fago
bacteriano).
Las cianobacterias son bacterias fotosintéticas
que requieren luz, elementos inorgánicos, agua y una fuente de
carbono, generalmente CO_{2}, para metabolizarse y crecer.
Las cianobacterias son procariotas
fotosintéticos que pueden llevar a cabo fotosíntesis oxigénica. El
principal producto de la ruta metabólica de las cianobacterias
durante condiciones aerobias son reservas de oxígeno y
carbohidrato.
El producto inicial de la fijación fotosintética
de CO_{2} es 3-fosfoglicerato. El
3-fosfoglicerato se usa en el ciclo de Calvin para
regenerar 1,5-bifosfato de ribulosa, que es el
aceptor de CO_{2}. Existen dos puntos de ramificación principales
en los que los productos intermedios del ciclo de Calvin se conectan
a otras rutas metabólicas. En un punto, 6-fosfato
de fructosa se convierte en 6-fosfato de glucosa y
fosfato de glucosa, que son los substratos para la ruta del fosfato
de pentosa, la síntesis de celulosa (un componente principal de la
pared celular) y la síntesis de glucógeno (la forma principal de
reserva de carbohidratos). En el otro punto de ramificación,
3-fosfoglicerato se convierte en
2-fosfoglicerato, fosfoenolpiruvato y piruvato en
una secuencia de reacciones catalizada por fosfoglicerato mutasa,
enolasa y piruvato quinasa, respectivamente. El piruvato se dirige
al ciclo de TCA parcial para la síntesis de aminoácidos,
nucleótidos, etc. en condiciones aerobias. El piruvato también es
el substrato para la síntesis de etanol.
Para convertir las reservas de carbohidrato en
etanol, las reservas de carbohidrato deben desviarse a la ruta
glicolítica. Se cree que la supuesta ruta para el metabolismo de
reservas de carbohidrato en cianobacterias es a través tanto de la
ruta glicolítica como de la ruta del fosfogluconato. Para los
propósitos de la formación de etanol, la ruta glicolítica es de
importancia primordial. Aunque no está bien caracterizado en
cianobacterias, se supone que el glucógeno es metabolizado en
1-fosfato de glucosa mediante una combinación de
glucógeno fosforilasa y una 1,6-glicosidasa. La
fosfoglucomutasa, la fosfoglucoisomerasa y la fosfofrutoquinasa
convierten el 1-fosfato de glucosa en una molécula
de 1,6-bisfosfato de fructosa. Este compuesto se
segmenta mediante la acción de aldolasa y triosafosfato isomerasa
en dos moléculas de 3-fosfato de gliceraldehído.
Este compuesto se convierte en piruvato a través de una serie
secuencial de reacciones catalizadas por gliceraldehído
3-fosfato dehidrogenasa, fosfoglicerato quinasa,
fosfoglicerato mutasa, enolasa y piruvato quinasa,
respectivamente.
En algunas algas y cepas de cianobacterias, una
pequeña cantidad de etanol se sintetiza como un producto de
fermentación bajo condiciones oscuras y anaerobias (Van der Oost y
otros, 1989; Heyer y Krumbein, 1991). Sin embargo, el procedimiento
de fermentación oscuro-anaerobio generalmente está
funcionando a un nivel muy bajo, solo suficiente para la
supervivencia de los organismos bajo tales condiciones de estrés. La
síntesis de etanol bajo oscuridad y condiciones anaerobias depende
de la degradación de la reserva de glucógeno, según se describe
anteriormente. Por otra parte, se ha encontrado que la síntesis de
etanol bajo condiciones anaerobias está totalmente inhibida por
luz. Así, en los microorganismos fotosintéticos la síntesis del
etanol no está acoplada con fotosíntesis y realmente puede ser
inhibida por la fotosíntesis.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, se ha observado que las
cianobacterias no utilizan CO_{2} para producir etanol. Por otra
parte, no se conocen microorganismos fotosintéticos, incluyendo
microorganismos fotosintéticos genéticamente manipulados, que
produzcan etanol en cantidades relativamente substanciales. Una
complicación adicional es que se ha observado que algunos
organismos fotosintéticos son inhibidos por etanol de modo que la
adición de etanol al medio de cultivo inhibe la expresión de genes
implicados en la fotosíntesis.
En la presente invención, se ha encontrado que
las cianobacterias pueden manipularse genéticamente con éxito para
utilizar un flujo directo de carbono desde CO_{2} hasta
3-fosfoglicerato, y hasta piruvato, para producir
una cantidad cuantificable de etanol en oposición a utilizar una
reserva de glucógeno como se hace bajo condiciones anaerobias y
oscuras.
Se ha encontrado que las cianobacterias pueden
modificarse genéticamente introduciendo genes que codifican para
las enzimas pdc y adh para producir etanol. En
particular, se ha creado una ruta para la síntesis de etanol en
Synechococcus PCC 7942, y esta ruta está directamente
acoplada con la fotosíntesis.
Incorporando el material genético que codifica
las enzimas pdc y adh en el material genético de
Synechococcus, se crea una Synechococcus capaz de
producir etanol. Se encontró sorprendentemente que las enzimas
pdc y adh procedentes de un anaerobio obligado, Z.
mobilis, podían satisfactoriamente insertarse, expresarse y ser
completamente funcionales en Synechococcus. Sin embargo, las
enzimas pdc y adh procedentes de Z. mobilis se
han transformado dentro de E. coli. Según se describe en
Ingram y otros, (1987), "Genetic Engineering of Ethanol
Production in Escherichia coli" (Appl. Environ Microbiol.
53: 2420-2425), E. coli es un anaerobio
facultativo, tiene un gen adh inducible y crece en un medio
de carbohidrato y dichos carbohidratos se usan para producir
etanol. Por otra parte, las cianobacterias son organismos
fotosintéticos que son recalcitrantes para recoger substancias
orgánicas con cualquier propósito, incluyendo el crecimiento o la
producción de etanol. De ahí que E. coli sea un sistema muy
diferente que las cianobacterias. E. coli es más como Z.
mobilis, que depende del material de alimentación para el
crecimiento y la producción de etanol. Existen otras fuentes de
enzimas pdc y adh, incluyendo Saccharomyces
cerevisiae.
Se ha encontrado que la síntesis de etanol puede
competir con el crecimiento celular para el uso de carbono. Por lo
tanto, sería beneficioso tener un sistema inducible para la síntesis
de etanol de modo que el crecimiento celular y la síntesis de
etanol pudieran llevarse a cabo en dos fases. Durante la primera
fase, las células de cianobacteria se cultivan bajo condiciones no
inducidas, de modo que el cultivo celular pueda alcanzar una alta
densidad y acumular una gran cantidad de carbohidratos. La síntesis
de etanol se induce a continuación en la segunda fase.
En particular, se ha descubierto que podría
desarrollarse satisfactoriamente un sistema inducible por
temperatura para inducir la producción de etanol en cianobacterias.
Un operón pdc-adh con el promotor izquierdo del fago
bacteriano (P_{L}) y un gen represor sensible a la temperatura
CI857 se emplearon para producir un sistema inducible por
temperatura para producir etanol en cianobacterias.
Se cree que a una temperatura no permisible
(baja temperatura, 30 grados Celsius), el represor se une a la
secuencia operadora y así evita que la RNA polimerasa inicie la
transcripción en el promotor P_{L}. Por lo tanto, la expresión de
los genes pdc-adh se reprime. Cuando el cultivo
celular se transfiere a una temperatura permisible
(37-42 grados Celsius), el represor no puede unirse
al operador. Por lo tanto la RNA polimerasa puede iniciar la
transcripción del gen pdc-adh.
Los Ejemplos posteriores ejemplifican los cuatro
constructos diferentes pCB4-Rpa,
pCB4-LRpa,
pCB4-LR(TF)pa y
pCB4-CPpa: la síntesis de estos constructos, la
incorporación de estos constructos en Synechococcus PCC 7942
y la producción de etanol a partir de dicha Synechococcus
genéticamente modificada. También pueden usarse otras cepas
transformables de Synechococcus que son capaces de producir
etanol cuando un constructo que contiene DNA que codifica la enzima
adh y pdc se transforma dentro de la
Synechococcus.
En los Ejemplos posteriores, se usó
Synechococcus PCC 7942, que está disponible de Pasteur
Culture Collection, Rue de Dr. Roux, Paris, Francia. Los genes que
codifican las enzimas pdc y adh de Zymomonas
mobilis se cortaron del plásmido pLOI295, que está disponible
de Dr. L. O. Ingram, Dept. of Microbiology and Cell Science,
University of Florida, Gainsville, Florida, U.S.A. 32611. (Véase
también: Ingram y otros, (1987) "Genetic Engineering of Ethanol
Production in Escherichia coli" Appl. Environ Microbial
53: 2420-2425). Un mapa del plásmido pLOI295 se
ilustra en la Figura 1. En particular, el segmento de DNA cortado
del plásmido pLOI295 incluye la secuencia pdc empezando en
-46 pb (con relación al sitio de inicio de la transcripción) hasta
una posición +27 pb después del codón de parada de la traducción y
se lista en EMBL como el Nº de Registro M15393 y la secuencia de
adh de DNA partiendo de -31 pb desde el codón de iniciación
ATG hasta +164 pb después del codón de parada de la traducción, que
se lista en EMBL como el Nº de Registro M15394.
El constructo pCB4-Rpa es
conducido por un promotor obtenido del operón rbcLS de la
cianobacteria Synechococcus PCC 7942. La secuencia promotora
desde el operón rbcLS se amplificó a partir de
Synechococcus PCC 7942 mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) usando el cebador directo identificado como Nº ID
SEC 1 (que contiene un sitio BamHI) y el cebador inverso
identificado como Nº ID SEC 2 (que contiene un sitio EcoRI).
Estos cebadores se diseñaron de acuerdo con la secuencia del gen
rbcL obtenida de la cianobacteria Anacystis nidulan
6301, una cepa genéticamente similar a Synechococcus PCC
7942. (Shinozaki K. y otros, (1983) "Molecular cloning and
sequence analysis of the Cyanobacteria gene for the large subunit
of ribulose-1,5-bisphosphate
carboxylase-oxygenase". Proc Natl Acad Sci USA
80:4050-4054). La mezcla de reacción de PCR (100
\mul) contenía 0,5 \muM de cada cebador, dNTP 0,4 mM, 10 g de
DNA genómico de la especie Synechococcus PCC 7942 y 2
unidades de DNA polimerasa de VentR (New England Biolabs) en 1 x
tampón de reacción: KCl 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 10
mM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,8 a 25ºC), MgCl_{2} 2 mM
y Triton X-100 al 0,1%. Las reacciones de PCR se
llevaron a cabo en un PTC-100TM Programmable Thermal
Controller (MJ Research, Inc.) usando los ciclos de temperatura
como sigue: 93ºC/3 min; 30 ciclos de 93ºC/1 min, 62ºC/1,5 min,
72ºC/0,5 min; 72ºC/5. El producto de PCR del tamaño esperado se
clonó en los sitios BamHI-EcoRI del plásmido
pBlueScript SK (Stratagene Inc.) para generar un plásmido denominado
pRBCp.
Un fragmento de DNA EcoRI-SalI de
3,2 kbp que contiene la secuencia pdc-adh de
Zymomonas mobilis se aisló del plásmido pLOI295 y se ligó a
los sitios correspondientes de pRBCp para generar el plásmido pRpa.
El mapa del plásmido pLOI295 se ilustra en el mapa de la Figura 1.
Un fragmento de DNA BamHI de 3,6 kbp que contiene la región
promotora rbcLS y las secuencias de pdc-adh se
cortó a continuación de pRpa y se ligó al sitio BamHI del
vector lanzadera pCB4 (Gendel y otros, (1983) "Shuttle Cloning
Vectors for the Cyanobacterium Anacystis Nidulans", J.
Bacteriol, 156: 148-154) dando como resultado el
constructo vectorial pCB4-Rpa. El vector lanzadera
pCB4 contiene genes que codifican resistencia a ampicilina. El
constructo vectorial pCB4-RPa se ilustra en la
Figura 2.
Un fragmento de DNA BamHI de 3,6 kbp
procedente de pRpa se ligó en una versión modificada de pCB4. La
versión modificada de pCB4 se construye ligando un fragmento de DNA
PvuII-BamHI de 220 pb del plásmido pBS (Stratagene
Inc., 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, California, EE.UU. de
A. 92037), fragmento que contiene la región promotora lacZ
procedente de Escherichia coli, en los sitios
XbaI-BamHI del sitio de multiclonación de pCB4
(Soltes-Rak E y otros, (1993) "Effect of promoter
modification on mosquitocidal cryIVB gene expression in
Synechococcus sp. strain PCC 7942". Appl Environ Microbio.
59: 2404-2410). El fragmento de DNA de 3,6 kpb se
liga a continuación en la versión modificada de pCB4 dando como
resultado el constructo vectorial pCB4-LRpa. El
constructo vectorial pCB4-LRpa se ilustra en la
Figura 3.
La región de codificación de
pdc-adh es conducida por una combinación de las
regiones promotoras rbcLS y lacZ, como en
pCB4-LRpa, pero en este constructo el sitio de unión
al ribosoma y el codón de iniciación de pdc de Zymomonas
mobilis se ha retirado y se ha reemplazado por la región de DNA
correspondiente de la secuencia de rbcL de
Synechococcus PCC 7942 para generar un producto de fusión de
traducción.
El segmento de DNA de pdc-adh en
el plásmido pLOI295 se amplifica y se modifica mediante PCR usando
el cebador directo identificado con Nº ID SEC 3 (que contiene un
sitio EcoRI) y el cebador inverso identificado como el Nº ID
SEC 4 (que contiene los sitios BamHI y XhoI). La
mezcla de reacción de PCR era como la descrita anteriormente para
el Ejemplo 1. Los ciclos de temperatura eran como sigue: 93ºC/5 min;
4 ciclos de 93ºC/1 min, 56ºC/1,5 min, 72ºC/3,5 min; 30 ciclos de
93ºC/1 min, 65ºC/1,5ºC, 72ºC/3,5 min; 72ºC/5 min. El producto de
PCR de 3,1 kbp se ligó a continuación en pRBCp en los sitios
EcoRI-XhoI (doble corte) para generar el plásmido
pR(TF)pa (TF como en la Fusión de Traducción). La
clonación para la fusión de traducción generaba un codón extra AAT
(asparagina) inmediatamente después del codón de iniciación y el
segundo codón original, AGT, en el marco de lectura abierto de
pdc se reemplazó por TCT para codificar el mismo aminoácido
(serina). Este nuevo plásmido se digirió con XhoI, los
sitios de corte se terminaron en extremos romos con fragmento de
Klenow de DNA polI y a continuación se digirieron con
XbaI. Este fragmento de DNA que contenía rbc-(TF)
pdc-adh se ligó a continuación en
pCB4-lac que se había preparado mediante digestión
con BamHI, terminado en extremos romos con Klenow y
redigerido con XbaI. El plásmido resultante se denomina
pCB4-LR(TF)pa y se ilustra en la
Figura 4.
El vector pCB4-Rpa se digirió
con XbaI, se rellenó en los extremos con fragmento de Klenow de DNA
polimerasa I y se redigirió con EcoRI para sometere a deleción el
promotor rbcLS. El vector se ligó a continuación a un fragmento
PstI-EcoRI que contenía el gen represor CI857 y la
secuencia promotora P_{L}, denominados colectivamente la
secuencia génica cI-PL (Nº de Registro de EMBL
L05669; Sanger y otros, Nucleotide sequence of the bacteriophage
lambda DNA. 1982, J. Mole. Biol. 162: 729-773) e
identificada como el Nº ID SEC 7. El promotor P_{L} se ha aislado
del plásmido pHUB2-CI857 (Gruber y otros, (1991))
"Escherichia coli-Anacystis nidulans
plasmid shuttle vectors containing the PL promoter from
bacteriophage lambda" Curr. Microbio. 22:15-19).
El vector se ligó mediante digestión con PstI, se rellenó en los
extremos con Klenow y una segunda digestión con EcoRI. El plásmido
recombinante se denomina pCB4-CPpa.
Cada uno de los cuatro constructos de los
Ejemplos 1, 2, 3 y 4 se incorporaron en la Synechococcus PCC
7942.
Los constructos de los Ejemplos, 1, 2, 3 y 4 se
incorporaron en la Synechococcus PCC 7942 usando un protocolo
estándar como el indicado en Golden S.S. y otros, (1987) "Genetic
engineering of the Cyanobacteria chromosome" Methods Enzymol
153: 215-231 y en S.S. Golden y L.A. Sherman, J.
Bacteriology 158:36 (1984), incorporado en la presente memoria
mediante referencia. Brevemente, células de Synechococcus PCC
7942 se recogen mediante centrifugación y se resuspenden en medio
BG-11 a una concentración de 2-5 x
10^{8} células por ml. A un ml de esta solución de células se
añade el DNA del constructo plasmídico apropiado hasta una
concentración final de 2 \mug.ml^{-1}. Las células se incuban
en la oscuridad durante 8 horas seguido por una incubación a la luz
de 16 h antes de cultivar en placa sobre placas
BG-11 que contienen 1 \mug.ml^{-1} de
ampicilina. Las placas se incuban bajo las condiciones de
crecimiento estándar (30ºC, intensidad de luz de 100 \mumol de
fotones.m^{-2}.s^{-1}). Las colonias resistentes a ampicilina
eran visibles en 7-10 días.
Las Synechococcus PCC 7942 genéticamente
modificadas se hicieron crecer, se burbujeraron con aire a 30ºC y
una intensidad de luz de 100 \muE M^{-2}.s^{-1} en medio
BG-11 líquido que contenía 5 \mug. ml^{-1} de
ampicilina (Soltes-Rak E y otros, (1993) "Effect
of promoter modification on mosquitocidal cryLVB gene
expression in Synechococcus sp. strain PCC 7942". Appl
Environ Microbio. 59: 2404-2410). La actividad de
pdc, adh y la producción de etanol se midieron como se
indica en la Tabla 1 posterior para los Ejemplos 1, 2 y 3. La
producción de etanol para el Ejemplo 3 también se ilustra en la
Figura 8. La Tabla 2 ilustra la producción de etanol para el
Ejemplo 4. Las Figuras 6 y 7 ilustran la actividad de pdc y
la expresión de adh, respectivamente, para el Ejemplo 4. La
actividad de pdc se midió determinando la velocidad de
reducción dependiente de ácido pirúvico de NAD^{+} con levadura
con adh como la enzima de acoplamiento según se describe
previamente en Conway y otros, J. Bacteriology
169:2591-2597 (1987). Adh se midió para los
Ejemplos 1, 2 y 3 determinando la velocidad de oxidación de NADH
dependiente de etanol según se describe en Neale y otros, Eur. J.
Biochem. 154: 119-124 (1986). El etanol se ensayó
usando un estuche de ensayo de etanol obtenido de Boehringer
Mannheim Canada, Laval, Quebec. Los resultados de las pruebas para
la actividad de pdc y adh y la producción de etanol
para los constructos de los Ejemplos 1-3 se ilustran
en la Tabla 1.
Células de Synechococcus PCC 7942 se
transformaron con el vector pCB4-CPpa. Las células
transformadas se hicieron crecer en primer lugar a 30 grados
Celsius como se indica anteriormente y a continuación se
transfirieron hasta 42 grados Celsius durante 48 horas. Las células
se recogieron a intervalos para ensayar la actividad de pdc.
Según se muestra en la Figura 6, la actividad de pdc se
indujo a 42 grados, alcanzando un incremento de 20 veces a las 48
horas después del cambio de temperatura. Sorprendentemente, la
actividad de pdc inducida a 42 grados Celsius con el vector
pCB4-CPpa después de 48 horas era aproximadamente
2000 mmol.min^{-1}.mg^{-1} SP, que es aproximadamente 20 veces
superior que en la cepa que aloja el vector lanzadera
pCB4-Rpa que tenía una actividad de pdc de
aproximadamente 130 nmol.min^{-1}.mg^{-1} de SP, como puede
observarse en la Figura 6 y la Tabla 1, respectivamente.
El impacto del cambio de la temperatura sobre la
síntesis de etanol se estudió en un cultivo discontinuo líquido. La
velocidad de síntesis de etanol a 42 grados Celsius era 1,7 \mumol
de etanol por mg de clorofila por hora. Como tal, era 5 veces
superior a 42 grados que a 30 grados Celsius, como puede observarse
en la Tabla 2.
Los ejemplos anteriores están destinados a
ejemplificar la invención. Se entiende por el experto en la técnica
que pueden realizarse diversas modificaciones y alteraciones sin
apartarse del alcance de la invención y según se indica en las
reivindicaciones adjuntas a la misma.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN INFORMATION:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Enol Energy Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 202-80 Tiverton Court
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Markham
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Ontario
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: CANADÁ
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): L3R 0G4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Robert Paul Woods
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 11 Albert Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Markham
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Ontario
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: CANADÁ
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): L3P 2T3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: John Robert Coleman
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2 Glencrest Coulevard
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Toronto
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Ontario
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: CANADÁ
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): M4B 1L3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Ming De Deng
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 132 Hollyberry Trail
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: North York
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Ontario
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: CANADÁ
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): M2H 2P1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Cianobacterias Genéticamente Modificadas para la Producción de Etanol, los Constructos y su Método
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEIBLE POR COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO : Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión Nº 1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTGAATTCA TGTCGTCTCT CCCTAGAGA
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTGAATTCA TGTCGTCTCT CCCTAGAGA
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGACTCGAGG ATCCCCAAAT GGCAA
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCATGAATTC TTATACTGTC GGTACCTAT
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1905 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1747 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7922 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 7:
Claims (8)
1. Cianobacterias genéticamente modificadas que
contienen un constructo que comprende fragmentos de DNA que
codifican enzimas piruvato descarboxilasa (pdc) y alcohol
deshidrogenasa (adh) obtenidas de Zymomonas mobilis y un
promotor que comprende un promotor cI-PL que es
inducible por temperatura, en donde dichas cianobacterias son
capaces de producir etanol en cantidades recuperables en al menos
1,7 \mumol de etanol por mg de clorofila por hora a una
temperatura de 42ºC.
2. Cianobacterias genéticamente modificadas de
acuerdo con la reivindicación 1, en las que dicho constructo es
pCB4-CPpa de acuerdo con la Fig. 5.
3. Las cianobacterias genéticamente modificadas
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde
dichas cianobacterias son Synechococcus.
4. Las cianobacterias genéticamente modificadas
de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dichas cianobacterias
son Synechococcus PCC 7942.
5. Un procedimiento para producir cianobacterias
genéticamente modificadas de acuerdo con la reivindicación 1, que
comprende las siguientes etapas:
- a.
- seleccionar un promotor cI-PL que es inducible por temperatura;
- b.
- ligar dicho promotor a dichos fragmentos de DNA que codifican enzimas piruvato descarboxilasa (pdc) y alcohol deshidrogenasa (adh), y
- c.
- clonar dichas secuencias ligadas que comprende el promotor y las secuencias de pdc y adh en un constructo apropiado;
- d.
- transformar dicho constructo dentro de dichas cianobacterias.
6. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que dicho constructo contiene además
fragmentos de DNA que codifican resistencia a ampicilina y la etapa
d. comprende las etapas de:
- a.
- recoger células de dichas cianobacterias;
- b.
- añadir dicho constructo a dichas células de cianobacteria recogidas;
- c.
- incubar dicho constructo con dichas células de cianobacteria de modo que dicho constructo se transforme dentro de dichas células de cianobacteria;
- d.
- cultivar en placa dichos constructos incubados y células de cianobacteria sobre placas que contienen ampicilina e incubar bajo condiciones de crecimiento apropiadas;
- e.
- seleccionar dichas células de cianobacteria resistentes a ampicilina transformadas.
7. Un procedimiento para producir etanol, que
comprende las etapas de: cultivar en un medio de cultivo
cianobacterias, conteniendo dichas cianobacterias un constructo que
comprende fragmentos de DNA que codifican enzimas piruvato
descarboxilasa (pdc) y alcohol deshidrogenasa (adh) de Zymomonas
mobilis y un promotor que comprende un promotor
cI-PL que es inducible por temperatura; y acumular
etanol en el medio de cultivo en cantidades recuperables de al
menos 1,7 \mumol de etanol por mg de clorofila por hora a una
temperatura de 42ºC.
8. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que dicho constructo es
pCB4-CPpa de acuerdo con la Fig. 5.
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