ES2285188T3 - Metodo y medios para controlar sialilacion de proteinas producidas por celulas de mamifero. - Google Patents

Abstract

Un método para controlar el contenido de ácido siálico de una proteína producida por células de mamífero que comprende cultivar las células en suspensión en un medio que comprende galactosa y fructosa.

Description

Métodos y medios para controlar sialilación de proteínas producidas por células de mamífero.

Campo de la invención

La invención se relaciona con métodos y medios para controlar la sialilación de una proteína producida por células cultivadas.

Antecedentes

Las proteínas son útiles en una variedad de aplicaciones diagnósticas, farmacológicas, agrícolas, nutricionales, y de investigación. Dados los altos costos de producir proteínas, especialmente proteínas terapéuticas, aún pequeños incrementos en la eficiencia de producción o en la función y estabilidad de una proteína pueden ser valiosos. La función y estabilidad, y de esta manera la utilidad, de una proteína se puede afectar por la adición postrasduccional de los residuos de azúcar a la proteína para formar una glicoproteína. Por ejemplo, la adición de residuos de ácido siálico terminales a polisacáridos unidos a una glicoproteína, incrementan generalmente el tiempo de vida de la proteína en el torrente sanguíneo y pueden, en casos particulares, también afectar la solubilidad, la estabilidad térmica, la resistencia al ataque de proteasa, la antigenicidad, y la actividad específica de algunas glicoproteínas. Ver, por ejemplo, Gu y Wang (1998), Biotechnol. y Bioeng. 58(6):642-48; Morell et al. (1968), J. Biol. Chem. 243(1):155-59. Por lo tanto es deseable incrementar el contenido de ácido siálico de una glicoproteína, especialmente una glicoproteína a ser utilizada para aplicaciones farmacológicas.

Resumen

La invención suministra medios y métodos para cultivar células de mamífero con el fin de producir una proteína, opcionalmente una proteína recombinante secretada, y controlar o, opcionalmente, incrementar, el contenido de ácidos siálico de la proteína. La invención provee un método para controlar el contenido de ácido siálico de una proteína producida por células de mamífero que comprende cultivar las células en suspensión en un medio que comprende galactosa y fructosa. El medio puede ser suero libre y también puede comprender N-acetil-manosamina y/o manosa. Las concentraciones de galactosa, manosa, y fructosa pueden ser cada una de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 40 mM, de aproximadamente 0.5 mM a aproximadamente 20 mM de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM, o de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM. La concentración de N-acetilmanosamina puede ser al menos aproximadamente 0.8 mM, opcionalmente al menos aproximadamente 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, o 20 mM. La proteína puede ser una proteína secretada, recombinante y las células de mamífero pueden ser células CHO (ovario de hamster chino). Las células se pueden cultivar a temperatura de aproximadamente 29ºC a aproximadamente 35ºC.

En otra modalidad, la invención suministra un medio, opcionalmente un medio libre de suero, para cultivar células de mamífero que comprenden galactosa y fructosa y manosa, y opcionalmente, N-acetilmanosamina. La galactosa, manosa, y fructosa pueden ser unas concentraciones de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 40 mM cada una, de aproximadamente 0.5 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM cada una, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM cada una. La N-acetilmanosamina puede estar a una concentración de al menos aproximadamente 0.8 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, o 20 mM.

En una modalidad, la invención comprende un método para controlar el contenido de ácido siálico de una proteína que comprende cultivar una célula de mamífero que produce la proteína en medio que comprende N-acetilmanosamina y galactosa. El medio puede además comprender fructosa y manosa. Opcionalmente, la fructosa y la manosa puede cada una estar presente en una concentración de aproximadamente 1.5 mM a aproximadamente 4.5 mM. La fructosa y la manosa pueden estar a la misma o diferente concentraciones. La célula se puede cultivar a una temperatura de aproximadamente 29ºC a aproximadamente 37ºC, opcionalmente, a una temperatura de aproximadamente 29ºC a aproximadamente 36ºC, o desde aproximadamente 30ºC a aproximadamente 35ºC. La concentración de la N-acetilmanosamina en el medio puede ser al menos aproximadamente 0.8 mM, y la concentración de galactosa en el medio puede ser de aproximadamente 1.5 mM a aproximadamente 4.5 mM. La proteína puede ser una proteína secretada y/o una proteína recombinante y se puede producir en una célula CHO.

En una modalidad adicional, la invención comprende un medio para cultivar células de mamífero en el cual la galactosa, fructosa, y N-acetlmanosamina y, opcionalmente, también manosa son combinadas. La fructosa puede estar a una concentración de aproximadamente 1.5 mM a aproximadamente 4.5 mM, y la manosa puede estar a una concentración de aproximadamente de 1.5 mM a aproximadamente 4.5 mM. La N-acetilmanosamina puede estar a una concentración de al menos aproximadamente 0.8 mM, y la galactosa puede estar a una concentración de aproximadamente 1.5 mM a aproximadamente 4.5 mM. Las células de mamífero pueden ser células CHO, y el medio puede estar libre de suero.

Además, la invención suministra un método mejorado para incrementar la producción de una proteína al cultivar las células de mamífero que expresan la proteína que comprende cultivar las células de mamífero opcionalmente a una temperatura de aproximadamente 29ºC a aproximadamente 35ºC, en un medio que comprende fructosa, manosa y galactosa. El medio también puede comprender N-acetilmanosamina. La concentración de galactosa, manosa y fructosa puede ser de aproximadamente 1.5 mM a aproximadamente 4.5 mM cada una. Las concentraciones de galactosa, manosa y fructosa pueden ser las mismas o diferentes una de la otra. La concentración de N-acetilmanosamina puede ser al menos aproximadamente 0.8 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM o 20 mM y el medio puede estar libre de suero. Las células de mamífero pueden ser células CHO, y la proteína puede ser una proteína secretada, recombinante.

Finalmente, la invención suministra un método para controlar el contenido de ácido siálico de una proteína recombinante que comprende cultivar las células de mamífero que expresan la proteína recombinante a una temperatura de aproximadamente 29ºC a aproximadamente 36ºC, o desde aproximadamente 29ºC a aproximadamente 35ºC en un medio que comprende frutosa, galactosa, manosa, y N-acetilmanosamina, en donde las concentraciones de fructosa, galactosa, y manosa en el medio son de aproximadamente 1.0 mM a aproximadamente 5.0 mM cada una o de aproximadamente 1.5 mM a aproximadamente 4.5 mM cada una y en donde la concentración de N-acetilmanosamina en el medio es al menos 0.8 mM. Las concentraciones de fructosa, manosa, y galactosa pueden ser iguales o diferentes una de la otra.

La invención también suministra un uso de un medio que comprende N-acetilmanosamina y galactosa para controlar el contenido de ácido siálico de una proteína producida por una célula de mamífero.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 muestra una red de sendas metabólicas que conducen a la sialilación de las glicoproteínas. Corfield y Schauer (1979), Biol. Cellulaire 35: 213-26; Gu y Wang (1998), Biotechnol. y Bioeng. 58(6): 642-48. Las moléculas utilizadas en la invención están en cuadros. La retroalimentación negativa se muestra por un signo menos adyacente a una flecha que comprende una línea punteada.

Figura 2 compara la fracción alta de elusión de sal de la región extracelular del receptor de factor de necrosis tumoral fusionado a la región Fc de un anticuerpo (TNFR: Fc, que se describe en la Patente U.S. No. 5,395,760) sobre una columna de intercambio de anión cuando el TNFR:Fc se produce por cultivos que crecen en medios con los aditivos indicados. Todas las muestras, que incluyen aquella producida por un cultivo sin aditivos (marcado "Control"), son comparados con una tanda simple de TNFR:Fc producida en un experimento separado por cultivos que crecen sin aditivos de medio.

Figura 3 es una gráfica de contorno hecha utilizando el software de computadora JMP (descrito adelante) que muestra las moles de ácido N-acetilneuraminico (NANA) por mol de TNFR:Fc (impreso en letra resaltada y puesto en cuadros al lado de cada punto de dato muestreado en este experimento y marcado como parte de cada línea de contorno) producida por crecimiento de células cultivadas en medios con las concentraciones indicadas de N-acetilmanosamina y azúcares (fructosa, galactosa, y manosa).

Descripción detallada Definiciones

Un anticuerpo, como se utiliza aquí, es una proteína o complejo de proteínas, cada una de las cuales comprende al menos una u opcionalmente al menos dos, dominios de inmunoglobulina de anticuerpo variable. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de cadena simple, anticuerpos diméricos, o algunos complejos de orden superior de proteínas que incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos heterodiméricos y anticuerpos tetraméricos.

Un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante es un dominio de inmunoglobulina que es idéntico a o sustancialmente similar a un dominio C_{L}, C_{H}1, C_{H}2, C_{H}3, o C_{H}4, de origen humano o animal. Ver, por ejemplo, Hasemann y Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, en William E. Paul, ed., Fundamental Immunology, Segunda Edición, 209, 210-218 (1989). Un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo tiene al menos 10 amino ácidos de longitud, opcionalmente, al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, o 90 amino ácidos de longitud.

Una porción Fc de un anticuerpo incluye dominios de inmunoglobulina humana o animal C_{H}2 y C_{H}3 o dominios de inmunoglobulina sustancialmente similares a estos. Para discusión, ver Hasemann y Capra, supra, en 212-213.

Una glicoproteína, como se utiliza aquí, es una proteína que ha sido modificada mediante la adición de uno o más carbohidratos, que incluyen, especialmente, la adición de uno o más residuos de azúcar.

Un oligosacárido o polisacárido es una cadena de dos o más residuos de azúcar ligados por enlaces químicos covalentes.

La sialilación, como se utiliza aquí, es la adición de un residuo de ácido siálico a una proteína, la cual puede ser una glicoproteína.

El término ácido siálico, como se utiliza aquí, comprende una familia de azúcares que contienen 9 o más átomos de carbono, incluyendo un grupo carboxilo. Una estructura genérica que comprende todas las formas naturales conocidas de ácido siálico se muestra adelante:

1

Los grupos R1 en varias posiciones sobre una molécula simple pueden ser iguales o diferentes uno del otro. R1 puede ser un grupo hidrógeno o un acetilo, lactilo, metilo, sulfato, fosfato, anhidro, ácido siálico, fucosa, glucosa, o grupo galactosa. R2 puede ser un grupo N-acetilo, N-glicolilo, amino, hidroxilo, N-glicolil-O-acetilo, o N-glicolil-O-metilo. R3 representa el residuo de azúcar precedente en un oligosacárido al cual el ácido siálico está unido en el contexto de una glicoproteína. R3 puede ser galactosa (conectada en su posición 3, 4, o 5), N-acetil-galactosa (conectada en su posición 6), N-acetil-glucosa (conectada en su posición 4 o 6), ácido siálico (conectado en su posición 8 o 9), o ácido 5-N-glicolil-neuraminínico. Essentials of Glycobiology, Ch. 15, Varki et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1999). Más de 40 formas de ácido siálico se han encontrado en la naturaleza. Essentials of Glycobiology, Ch. 15, Varki et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1999). Una forma común de ácido siálico es el ácido N-acetilneurámico (NANA), en el cual R1 es un hidrógeno en todas las posiciones y R2 es un grupo N-acetilo.

Las proteínas sustancialmente similares son al menos 80%, opcionalmente al menos 90%, idénticas una a la otra en la secuencia de amino ácido y mantener o alterar de una manera deseable la actividad biológica de la proteína no alterada. La identidad porcentual de dos amino ácidos o dos secuencias de ácido nucleico se puede determinar mediante inspección visual y cálculo matemático, o más preferiblemente, se hace la comparación al comparar la información de secuencia utilizando un programa de computadora. Un programa de computadora de ejemplo el Genetics Computer Group (GCG; Madison, WI) versión de paquete Wisconsin programa 10.0, "GAP" (Devereux et al. (1984). Nucl. Acids Res. 12: 387). Los parámetros preferidos por defecto para el programa "GAP" incluyen: (1) la implementación GCG de una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para los nucleótidos, y la matriz de comparación de amino ácido ponderada de Gribskov y Burgess (1986), Nucl. Acids Res. 14:6745, como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); u otras matrices de comparación comparables; (2) una pena de 30 para cada espacio y una pena adicional de 1 para cada símbolo en cada espacio para las secuencias de amino ácido, o una pena de 50 para cada espacio y una pena adicional de 3 para cada símbolo en cada espacio para las secuencias de nucleótido; (3) ninguna pena para los espacios de extremo; y (4) ninguna pena máxima para espacios largos. Las regiones de las dos proteínas que están alineadas por el GAP por comparación tienen al menos 10 amino ácidos de largo, opcionalmente al menos 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250, o 300 amino ácidos de largo. Otros programas utilizados por aquellos expertos en la técnica de la comparación de secuencia también se pueden utilizar. Un experto en la técnica reconocerá que los parámetros escogidos pueden afectar la identidad porcentual y lo harán así más si las secuencias no son similares.

Un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo variable es un dominio de inmunoglobulina que es idéntico o sustancialmente similar a un dominio de origen humano o animal V_{L} o uno V_{H}. Un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo variable es de al menos 10 amino ácidos de largo, opcionalmente, al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, o 90 amino ácidos de largo.

Descripción

La adición de los carbohidratos a las proteínas (aquí denominadas la glicolización de las proteínas) y el subsecuente procesamiento de estos carbohidratos pueden afectar el doblamiento, estabilidad, y propiedades funcionales de una proteína. Lodish et al., Molecular Cell Biology, Chapter 17, W.H. Freeman, New York (2000). Por ejemplo, la proteína precursora de la hemaglutinina falla al doblarse adecuadamente en la presencia de tunicamincina, un antibiótico que interfiere con la producción de un precursor de oligosacárido necesario para glicolización N-ligada (descrita adelante). Id. Además, una fibronectina con forma no glicosilada se secreta normalmente mediante fibroblastos, pero es degradada más rápidamente que la fibronectina glicosilada. Lodish et al., supra.

Las proteínas más secretadas y las proteínas de superficie celular contienen al menos una cadena de carbohidrato; además, numerosas proteínas citoplasmáticas y nucleares también son glicosiladas. Lodish et al., supra; Essentials of Glycobiology, Ch. 13, Varki et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1999). Un conjunto de enzimas capaces de glicosilar proteínas está localizado dentro del retículo endoplasmático y el Golgi, los organelos que secretaron y las proteínas de superficie celular pasan a través de su senda a la membrana celular y más allá. La identificación de las enzimas nucleares y/o citoplasmáticas capaces de ejecutar funciones similares permanecen inciertas.
Essentials of Glycobiology, Ch. 13, Varki et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1999).

Aunque la glicosilación de la proteína es un proceso complejo y variable, las modificaciones del carbohidrato de las proteínas puede ser aproximadamente dividida en dos clases, la glicosilación ligada a O y la glicosilación ligada a N. Ambas involucran la adición de oligosacáridos a amino ácidos específicos dentro de una proteína. Los polisacáridos ligados a O están ligados a un grupo hidroxilo, usualmente el grupo hidroxilo de un residuo de cerina o uno de treonina. Los O-glicanes no están agregados a cada residuo de cerina y treonina, y los criterios para determinar que cerinas y treoninas serán glicosiladas no han sido completamente elucidados. Los O-glicanos usualmente comprenden una o dos ramas y comprenden de una a cuatro diferentes clases de residuos de azúcar, que están agregadas una por una. A menudo, el residuo terminal es un ácido siálico. En contraste, los polisacáridos ligados a N están unidos al nitrógeno de amida como una asparagina. Solamente las asparaginas que son parte de uno de dos secuencias de tripéptido, asparagina -X-cerina o asparagina -X-trieonina (donde X es cualquier amino ácido excepto prolina), son blancos para la glicosilación. La primera etapa en la glicosilación N-ligada involucra la adición de un oligosacárido ramificado complejo, preformado, que consiste de tres glucosas, nueve manosas, y dos residuos de N-acetilglucosamina. Este oligosacárido es adicionalmente procesado mediante un complejo y series variables de etapas, que resultan en la remoción y adición de varios residuos de azúcar. En el producto final, el residuo terminal de cada rama del polisacárido puede ser, pero no es siempre, un ácido siálico. Lodish et al., supra. Los N-glicanos pueden tener de una a cuatro ramas. Varik et al. supra.

Trabajos previos han elucidado una red de sendas biosintéticas que conducen a la adición de ácido siálico a las proteínas, como se ilustra en la Figura 1. Gu y Wang, supra; Corfield y Schauer, supra. Una gran variedad de moléculas están involucradas en las varias etapas en la síntesis del ácido siálico y su unión a las glicoproteínas, que incluyen azúcares tales como la glucosa, manosa, fructosa, y galactosa, nucleótidos tales como el ATP y el CTP, y un huésped de enzimas necesarias para catalizar las numerosas etapas biosintéticas involucradas, a saber solo unas pocas de las numerosas moléculas involucradas. La Figura 1 también ilustra dos puntos de esta red de sendas donde la inhibición de la retroalimentación negativa es conocida que ocurre (líneas punteadas con cabezas de flechas). Más aún, Gu y Wang (supra) han reportado que la adición de N-acetilmanosamina a medio de cultivo da como resultado una sialilación incrementada de una proteína producida por las células cultivadas. Sin embargo, la utilidad comercial de la N-acetilmanosamina es habitualmente limitada por su costo, y por lo tanto las condiciones de cultivo u otros aditivos de medio con efectos similares o mejores son necesarios.

De acuerdo con esto, la invención suministra un método para incrementar la sialilación de una glicoproteína producida por un cultivo celular que comprende agregar al cultivo celular N-acetilmanosamina y galactosa. En una modalidad adicional, la invención suministra un método para incrementar la sialilación de una glicoproteína producida por un cultivo de célula que comprende células cultivadas en medio que comprenden N-acetilmanosamina, galactosa, fructosa, y manosa. Alternativamente, la sialilación se puede incrementar al cultivar las células en un medio que comprende galactosa y fructosa y, opcionalmente, también N-acetilmanosamina y/o manosa. En aún otra modalidad, la invención comprende una mejora de un método para producir una proteína que comprende cultivar células de mamífero que expresan la proteína a una temperatura por debajo de 37ºC, opcionalmente de aproximadamente 29ºC a aproximadamente 36ºC o desde aproximadamente 29ºC a aproximadamente 35ºC, o desde aproximadamente 30ºC a aproximadamente 33ºC, en un medio que comprende N-acetilmanosamina. En otro aspecto, la invención suministra un medio de cultivo para células de mamífero que comprende N-acetilmanosamina, galactosa, y, opcionalmente, también fructosa y/o manosa. La concentración de N-acetilmanosamina puede ser de al menos aproximadamente 0.8 milimolares (mM), opcionalmente al menos aproximadamente 2 mM, al menos aproximadamente 3 mM, al menos aproximadamente 4 mM, al menos aproximadamente 5 mM, al menos aproximadamente 10 mM, o al menos aproximadamente 20 mM, y la concentración de galactosa puede ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM, opcionalmente desde aproximadamente 2 mM a aproximadamente 4 mM, o desde aproximadamente 2.5 mM a aproximadamente 3.5 mM. Las concentraciones de fructosa y manosa, cuando están presentes, pueden ser iguales o diferentes de aquellas que una de la otra y aquellas de galactosa y N-acetilmanosamina. Las concentraciones de fructosa y manosa pueden ser desde aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM cada una, opcionalmente desde aproximadamente 2 mM a aproximadamente 4 mM cada una, o desde aproximadamente 2.5 mM a aproximadamente 3.5 mM cada una.

Alternativamente, la invención suministra un medio de cultivo para células de mamífero que comprende fructosa y galactosa y también manosa y/o N-acetilmanosamina. La fructosa, galactosa, y manosa pueden cada una estar presentes en concentraciones desde aproximadamente 0.1 mM cada una a aproximadamente 40 mM cada una, opcionalmente desde aproximadamente 0.5 mM cada una a aproximadamente 20 mM cada una, desde aproximadamente 1.0 mM cada una a aproximadamente 10 mM cada una, o desde aproximadamente 1 mM cada una a aproximadamente 5 mM cada una. La fructosa, galactosa, y manosa pueden estar presentes a la misma o a diferentes concentraciones. La N-acetilmanosamina puede estar presente a una concentración de al menos aproximadamente 0.8 milimolares (mM), opcionalmente al menos aproximadamente 2 mM, al menos aproximadamente 3 mM, al menos aproximadamente 4 mM, al menos aproximadamente 5 mM, al menos aproximadamente 10 mM, o al menos aproximadamente 20 mM.

Además, la invención comprende un medio de cultivo para células de mamífero que comprende fructosa, galactosa, y manosa, que pueden estar presentes a concentraciones desde aproximadamente 0.1 mM cada una a aproximadamente 40 mM cada una, opcionalmente desde aproximadamente 0.5 mM cada una a aproximadamente 20 mM cada una, desde aproximadamente 1.0 mM cada un a aproximadamente 10 mM cada una, o desde aproximadamente 1 mM cada una a aproximadamente 5 mM cada una. La fructosa, galactosa, y manosa pueden estar presentes a la misma o en diferentes concentraciones.

En un aspecto, la invención suministra un método para cultivar células de mamífero que comprende hacer crecer en cultivo una célula de mamífero que ha sido genéticamente trabajada por ingeniería para producir una proteína y agregarle al cultivo N-acetilmanosamina, galactosa, y, opcionalmente, también fructosa y/o manosa. En otro aspecto, la invención suministra un método para cultivar una célula de mamífero que ha sido genéticamente trabajada por ingeniería para producir una proteína en un medio que comprende N-acetilmanosamina a una temperatura por debajo de 37ºC. Una clase de célula trabajada por ingeniería genética es una célula que ha sido transformada con un vector recombinante que codifica la proteína. La proteína se puede expresar bajo el control de un promotor viral fuerte ( por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV) o un promotor de virus de simio 40 (SV40)) o un promotor inducible (por ejemplo, un promotor de metalotionina o un promotor que responde a tetraciclina como se describe en, por ejemplo, Gossen y Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:5547-51). Típicamente, la célula no expresa naturalmente la proteína o expresa la proteína solamente a niveles muy bajos (en ausencia de ingeniería genética).

Una proteína se entiende generalmente por ser un polipéptido de al menos 10 amino ácidos de longitud, opcionalmente, al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, o 200 amino ácidos de longitud. Las proteínas producidas utilizando los métodos y medios de la invención pueden ser proteínas secretadas.

Los métodos y medios de la invención se pueden utilizar para incrementar la sialilación de justo aproximadamente cualquier proteína, y es particularmente ventajosa para los polipéptidos cuya expresión está bajo el control de un promotor fuerte, tal como por ejemplo, un promotor viral, y/o los polipéptidos que son codificados sobre un mensaje que tienen un elemento líder tripartito adenoviral. Ejemplos de vectores de expresión útiles que pueden ser hechos para producir proteínas se describen en la Solicitud Internacional WO 01/27299 y en McMahan et al., (1991), EMBO J. 10: 2821, que describen el vector pDC409.

Generalmente, los métodos de la invención son útiles para inducir la producción de polipéptidos recombinantes. Las proteínas que se pueden producir con los métodos y medios de la invención incluyen aquellos que comprenden secuencias de amino ácidos idénticas a o sustancialmente similares a todo o parte de una de las siguientes proteínas: un ligando Flt3 (como se describe en WO 94/28391), un ligando CD40 (como se describe en la Patente U.S. No. 6,087,329), eritropoietina, trombopoietina, calcitonina, leptina, IL-2, angiopoietina-2 (como se describe en Maisonpierre et al. (1997), Science 277 (5322):55-60), el ligando Fas, el ligando para el activador receptor de NF-Kappa B (RANKL, como se describe en la WO 01/36637), el ligando inductor de apoptósis relacionado con factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAIL, como se describe en la WO 97/01633), linfopoietina derivada de estroma tímica, factor estimulante de colonia de granulosito, factor estimulante de colonia de granulosito-macrófago (GM-CSF, como se describe en la Patente Australiana No. 588819), factor de crecimiento de célula mástil, factor de crecimiento de célula madre (descrito en por ejemplo, la Patente U.S. No. 6,204,363), el factor de crecimiento epidérmico, el factor de crecimiento de queratinosito, el factor de crecimiento y desarrollo del megacarioto, RANTES, hormona de crecimiento, insulina, insulinotropina, factores de crecimiento similares a insulina, hormona paratiroide, interferones que incluyen unos interferones, interferón \gamma, e interferones de consenso (tales como aquellos descritos en la Patente U.S. No. 4,695,623 y 4,897471), factor de crecimiento de nervio, factor neurotrófico derivado del cerebro, proteínas similares a sinaptotagmina (SLP 1-5), neurotrofina-3, glucagon, interleuquinas 1 a 18, factores estimulantes de colonia, linfotoxina \beta, factor de necrosis tumoral (TNF), factor inhibitorio de leucemia, oncostatina-M, y varios ligandos para moléculas de superficie celular ELK y Hek (tales como los ligandos para quinazas relacionadas con eph o LERKS). Las descripciones de las proteínas que se pueden producir de acuerdo a los métodos de la invención se pueden encontrar en, por ejemplo, Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, Vol. 11 (Aggarwal y Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay y Leigh, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993); y The Cytokine Handbook (A.W. Thompson, ed., Academic Press, San Diego, CA, 1991).

Las proteínas adicionales que se pueden producir utilizando los métodos y medios de la invención incluyen proteínas que comprenden todo o parte de la secuencia de amino ácido de un receptor para cualquiera de las proteínas anteriormente mencionada, un antagonista a tal receptor de cualquiera de las proteínas anteriormente mencionadas, y/o las proteínas sustancialmente similares a tales receptores o antagonistas. Estos receptores y antagonistas incluyen: ambas formas del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR, referido como p55 y p75, como se describe en la Patente US No. 5,395,760 y la Patente US No. 5,610,279), receptores de interleuquina-1 (IL-1)(tipos I y II; descritos en la Patente EP No. 0 460 846, la Patente US No. 4,968,607, y la Patente US No. 5,767,064), los antagonistas receptores IL-1 (tales como aquellos descritos en la Patente US No. 6,337,072, los antagonistas o inhibidores IL-1 (tales como aquellos descritos en las Patentes US Nos. 5,981,713, 6,096,728, y 5,075,222, 5,767,064), como referencia), los receptores IL-2, los receptores IL-4 (como se describe en la Patente EP No. 0 367 566 y la Patente US No. 5,856,296), los receptores IL-15, los receptores IL-17, los receptores IL-18, el receptor de factor estimulante de colonia de granulosito-macrófago, el receptor del factor estimulante de colonia de granulosito, los receptores de oncostatina-M y el factor inhibitorio de leucemia, el activador receptor de NF-kappa B (RANK, descrito en la WO 01/36637 y la Patente US No. 6,271,349), osteoprotegerina (descrita en por ejemplo, la Patente US No. 6,015,938), los receptores para TRAIL (que incluyen los receptores TRAIL 1, 2, 3, y 4), y los receptores que comprenden los dominios de muerte, tales como el Receptor Inductor Fas o de Apoptósis (AIR).

Se pueden producir más proteínas utilizando los métodos y medios de la invención que incluyen proteínas que comprenden todo o parte de las secuencias de amino ácido de los antígenos de diferenciación (denominados como proteínas CD) o sus ligandos o proteínas sustancialmente similares a éstas. Tales antígenos se describen en Leukocyte Typing VI (Proceedings of the Vlth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., eds., Kobe, Japón, 1996). Las proteínas CD similares se describen en trabajos subsecuentes. Los ejemplos de tales antígenos incluyen CD22, CD27, CD30, CD39, CD40, y ligandos a éstos (ligandos CD27, ligandos CD30, etc.). Varios de los antígenos CD son miembros de la familia del receptor TNF, que también incluye 41BB y OX40. Los ligandos son a menudo miembros de la familia TNF, como lo son el ligando 41BB y el ligando OX40. De acuerdo con esto, los miembros de las familias TNF y TNFR también se pueden producir utilizando la presente invención.

Las proteínas enzimáticamente activas o sus ligandos también se pueden producir utilizando los métodos y medios de la invención. Ejemplos incluyen proteínas que comprenden todo o parte de una de las siguientes proteínas o sus ligandos o unas proteínas sustancialmente similares a una de éstas: miembros de la familia metalo-proteinasa-desintegrina, varias quinazas, glucocerebrosidaza, superoxido dismutaza, activador plasminógeno de tejido, Factor VIII, Factor IX, apolipoproteína E, apolipoproteína A-I, globinas, un antagonista IL-2, alfa-1 antitripsina, Enzima Convertidora de TNF-alfa, ligandos para cualquiera de las enzimas anteriormente mencionadas, y otras numerosas enzimas y sus ligandos.

Los métodos y medios de la invención también se pueden utilizar para producir proteínas quiméricas seleccionadas in vitro para unirse a una proteína blanco específica y modificar su actividad tal como aquellas descritas en las Solicitudes Internacionales WO 01/83525 y WO 00/24782 y anticuerpos o porciones de éstas y anticuerpos quiméricos, es decir, anticuerpos que tienen dominios de inmunoglobulina de anticuerpo constante humano acopladas a uno o más dominios de inmunoglobulina de anticuerpo variable de murino, fragmentos de éstos, o proteínas sustancialmente similares. El método de la invención también se puede utilizar para producir conjugados que comprenden un anticuerpo y una sustancia citotóxica o luminiscente. Tales sustancias incluyen: derivados de maitansina (tales como DM1); enterotoxinas (tales como una enterotoxina de Estafilococo); isótopos de yodo (tales como yodo-125); isótopos de tecnecio (tales como Tc-99m); fluorocromos de cianina (tales como Cy5.5. 18); y proteínas inactivantes de ribosoma (tales como bouganina, gelonina, o saporin-S6). Ejemplos de anticuerpos, proteínas quiméricas seleccionadas in vitro, o conjugados de anticuerpo/citotoxina o anticuerpo/luminóforo que se pueden producir utilizando los métodos y medios de la invención incluyen aquellos que reconocen una cualquiera o una combinación de proteínas que incluyen, pero no están limitadas a, cualquiera de las proteínas anteriormente mencionadas y/o los siguientes antígenos: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80, (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, receptor IL-2, receptor IL-4, receptor IL-6, receptor IL-13, subunidades de receptor IL-18, PDGF-\beta y análogos de éstos (tales como aquellos descritos en las Patentes US Nos. 5,272,064 y 5,149,792), receptor VEGF, TGF, TGF-\beta2, TGF-\beta1, EGF (que incluyen aquellos descritos en la Patente US No. 6,235,883 B1) el receptor VEGF, el factor de crecimiento de hepatocito, el ligando de osteoprotegerina, interferón gama, estimulador de linfocito B (BlyS, también conocido como BAFF, THANK, TALL-1, y zTNF4; ver Do y Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1):19-25), el complemento C5, IgE, antígeno de tumor CA125, antígeno de tumor MUC1, antígeno PEM, LCG (el cual es un producto de gen que se expresa en asocio con el cáncer de pulmón), HER-2, una glicoproteína asociada a tumor TAG-72, el antígeno SK-1, los epítopos asociados a tumor que están presentes en niveles elevados en el suero de los pacientes con cáncer de colon y/o pancreático, epítopos asociados a cáncer o proteínas expresadas sobre cánceres de mama, colon, de célula escamosa, próstata, pancreático, de pulmón, y/o de riñón y/o células de melanoma, glioma, o neuroblastoma, el núcleo necrótico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas B2, receptores TRAIL 1, 2, 3, y 4, RANK, ligando RANK, TNF-\alpha, la molécula de adhesión VAP-1, la molécula de adhesión de célula epitelial (Ep-CAM), la molécula de adhesión intercelular-3 (ICAM-3), leucointegrina adhesina, la glicoproteína de plaqueta gp IIb/IIIa, la cadena pesada de miosina cardiaca, hormona paratiroides, el rNAPc2 (que es un inhibidor del factor de tejido VIIa), MHC I, antígeno carcinoembriónico (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), factor de necrosis tumoral (TNF), CTLA-4 (que es un antígeno asociado a linfocito T citotóxico), receptor Fc-\gamma-1, HLA-DR 10 beta, antígeno HLA-DR, L-selectina, IFN-\gamma, Virus Sincital Respiratorio, virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), virus de la hepatitis B (HB V), mutantes de Estreptococo, y Estafilococo aureus.

Los métodos y los medios de la invención también se pueden utilizar para producir todo o parte de una proteína que es un anticuerpo anti-idiotípico o una proteína sustancialmente similar, que incluyen anticuerpos anti-idiotípicos contra: un anticuerpo que apunta a un antígeno tumoral gp72; un anticuerpo contra el gangliosido GD3; un anticuerpo contra el gangliosido GD2; o anticuerpos sustancialmente similares a éstos.

Los métodos y medios de la invención también se pueden utilizar para producir proteínas de fusión recombinante que comprenden cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente o proteínas sustancialmente similares. Por ejemplo, las proteínas de fusión recombinantes que comprenden una de las proteínas anteriormente mencionadas más un dominio de multimerización, tal como una cremallera de leucina, una bobinada, una porción Fc de un anticuerpo, o una proteína sustancialmente similar, se pueden producir utilizando los métodos y medios de la invención. Ver por ejemplo, WO 94/10308; Lovejoy et al (1993), Science 259:1288-1293; Harbury et al. (1993), Science 262: 1401-05; Harbury et al (1994), Nature 371:80-83; Hákansson et al. (1999), Structure 7: 255-64. Específicamente incluidos entre tales proteínas de fusión recombinantes están las proteínas en las cuales al menos una porción del TNFR o RANK se fusiona a una porción Fc de un anticuerpo (TNFR:Fc o RANK:Fc). El TNFR:Fc comprende una porción Fc de un anticuerpo fusionado a un dominio extracelular de TNFR, que incluye secuencias de amino ácidos sustancialmente similares a los amino ácidos 1-163, 1-185, o 1-235 de la Figura 2A de la Patente U.S. No. 5,395,760. El RANK:Fc se describe en la WO 01/36637.

Las células adecuadas para practicar la presente invención incluyen cualquier línea celular que pueden ser proteínas glicosilato, preferiblemente una línea celular de mamífero que ha sido genéticamente trabajada por ingeniería para expresar una proteína, aunque la invención también se puede utilizar para producir proteínas no recombinantes. Preferiblemente, las células son líneas celulares homogéneas. Numerosas líneas celulares adecuadas son conocidas en la técnica. Por ejemplo, el ovario de hámster chino (CHO), HeLa, VERO, BHK, Cos, MDCK, 293, 3T3, mieloma (por ejemplo, NSO, NSI), o las células WI38 se pueden utilizar. Las líneas celulares de hibridoma que produce un anticuerpo también se pueden utilizar para practicar la invención. Las líneas celulares derivadas de las células anteriormente mencionadas también son adecuadas para practicar la invención.

Las células particularmente preferidas son las células CHO, que son ampliamente utilizadas para la producción de proteínas recombinantes, por ejemplo, citoquinas, factores de taponamiento, y anticuerpos (Brasel et al. (1996), Blood 88: 2004-2012; Kaufman et al. (1988), J. Biol. Chem 263:6352-6362; McKinnon et al. (1991), J Mol Endocrinol 6: 231-239; Wood et al. (1990), J. Immunol 145: 3011-3016). Una linea celular mutante deficiente en dihidrofolato reductaza (DHFR) (Urlaub et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220), tal como DXB11 o DG-44, es útil porque el sistema de expresión de gen seleccionable y amplificable DHFR eficiente permite altos niveles de expresión de proteína recombinante en estas células (Kaufman (1990), Meth. Enzymol. 185: 527-566). Además, estas células son fáciles de manipular como cultivos adherentes o de suspensión y exhiben estabilidad genética relativamente buena. Las células CHO y las proteínas recombinantes expresadas en ellas han sido extensivamente caracterizadas y han sido aprobadas para uso en elaboración comercial clínica por agencias reguladoras.

De acuerdo con la presente invención, una célula huésped de mamífero se cultiva bajo condiciones que promueven la producción de la proteína de interés, que puede ser un anticuerpo o una proteína recombinante. Las formulaciones de medio de cultivo de célula basal para cultivar células de mamífero son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, p. 69-84, Wiley-Liss (1987). A estas formulaciones de medio de cultivo basal los expertos agregarán componentes tales como los amino ácidos, sales, azúcares, vitaminas, hormonas, factores de crecimiento, amortiguadores, antibióticos, lípidos, elementos en traza y similares, dependiendo de los requisitos de las células huéspedes a ser cultivadas. El experto también puede escoger utilizar una de las muchas formulaciones de medio individualizadas que se han desarrollado para maximizar el crecimiento celular, la viabilidad de la célula y/o la producción de proteína recombinante en una célula particular cultivada. Los métodos de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar en combinación con medio de cultivo celular disponible comercialmente o con medio de cultivo celular que se ha formulado individualmente para uso con una línea celular particular. El medio de cultivo puede o no contener proteína y/o suero. El medio comercial adecuado incluye medio RPMI 1641, medio Eagle modificado de Dulbecco, medio Eagle esencial mínimo, F-12K y medio F12, medio 5A de McCoy, medio L15 de Leivovitz, y medio libre de suero tal como series 300 EX - CELL^{TM} (disponible de JRH Biosciencies, Lenexa, Kansas, USA), entre otros, que se pueden obtener del American Type Culture Collection o de JRH Biosciencies, así como también de otros vendedores.

El experto en la técnica puede también escoger utilizar uno o muchas formulaciones de medio individualizadas que se han desarrollado para maximizar el crecimiento celular, la viabilidad celular, y/o la producción de poli péptido recombinante en una célula huésped cultivada particular. Los métodos de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar en combinación con medio de cultivo celular disponible comercialmente o con medio de cultivo celular que se ha formulado individualmente para uso con una línea celular particular. Por ejemplo, un medio enriquecido que puede soportar la producción de poli péptido incrementada puede comprender una mezcla de dos o más medios comérciales, tal como, por ejemplo, medio F12 de Ham y DMEM combinados en proporciones tales como, por ejemplo, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, a aún hasta 1:15 o más. Alternativamente o adicionalmente, un medio se puede enriquecer por la adición de nutrientes, tal como aminoácidos o pentona, y/o un medio (o la mayoría de sus componentes con las excepciones anotadas adelante) se pueden utilizar más de su concentración usual, recomendada, por ejemplo en 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, o aún concentraciones mayores. Como se utiliza aquí, "1x" significa la concentración estándar, "2x" significa dos veces la concentración estándar, etc. En cualquiera de estas modalidades, los componentes de medio que pueden afectar sustancialmente la osmolaridad, tal como sales, no se pueden incrementar en concentración de tal forma que la osmolaridad del medio cae por fuera de un rango aceptable. Así, un medio puede, por ejemplo, ser 8x con respecto a todos los componentes excepto las sales, que pueden estar presentes en solo 1x. En un medio enriquecido puede ser libre de proteína y/o libre de suero. En este contexto, "libre de proteína" significa libre de proteínas de al menos 15 aminoácidos, tal como insulina o factor de crecimiento similar a insulina. Medio "Libre de proteína" puede contener proteínas hidrolizadas, tal como las que se encuentran en las peptonas (de levadura, soya, u otras fuentes), que son aditivos de medios utilizados comúnmente. Adicionalmente, un medio se puede complementar periódicamente durante el tiempo en que un cultivo se mantiene para reponer los componentes de medio que pueden haberse agotado tales, por ejemplo, vitaminas, aminoácidos y precursores metabólicos. Como se conoce en la técnica, medios diferentes y temperaturas pueden tener algunos efectos diferentes sobres las líneas celulares diferentes, y el mismo medio y temperatura pueden no ser adecuados para todas las líneas celulares.

Los métodos de la invención son útiles para inducir la producción de proteínas recombinantes. Las proteínas recombinantes son proteínas producidas por el proceso de ingeniería genética. El término "ingeniería genética" se refiere a infectar, transfectar, transformar, o transducir una célula con una molécula de poli nucleótido recombinante de tal forma que origine que la célula altera la expresión de una proteína deseada. En algunas modalidades, tal como una molécula de poli nucleótido recombinante comprende ácidos nucleicos que codifican la proteína de interés ligada de forma operable a secuencias reguladoras adecuadas, que son parte de un "vector de expresión" dentro del que los ácidos nucleicos que codifican la proteína de interés se insertan.

Métodos y vectores para líneas celulares y/o células producidas con ingeniería genética para expresar una proteína de interés son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica; por ejemplo, se ilustran varias técnicas en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & sons, New York, 1988, and quarterly updates); Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); y Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69. Protocolos adicionales que utilizan reactivos comercialmente disponibles, tales como reactivos de lípido catiónico LIPOFECTAMINE^{TM}, LIPOFECTAMINE^{TM} - 2000, o LIPOFECTAMINE^{TM} - PLUS (que se pueden comprar a Invitrogen), se pueden utilizar para transfectar células. Felgner et al. (1987), Proc, Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-1417. Adicionalmente, la electroporación o bombardeo con micro partículas recubiertas con ácidos nucleicos se pueden utilizar para transfectar células utilizando procedimientos, tales como aquellos descritos en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory Manual 2nd ed. Vol. 1-3, Cold Spring Laboratory Press, y Fitzpatrick - McElligott (1992). Biotechology (NY) 10(9): 1036-40. Las técnicas de ingeniería genética incluye, pero no se limitan a, transformación de células con vectores de expresión, recombinación homóloga objetivada y activación de genes (ver, Patente Estadounidense No 5, 272, 071 otorgada a Chapel), y transactivación por factores de trascripción producidos por ingeniería (por ejemplo Segal et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (6): 2758-63).

Un gen que codifica un marcador seleccionable se utiliza a menudo para facilitar la identificación de células recombinantes y por lo tanto se incluye a menudo en vectores de expresión. La selección de transformantes se puede desarrollar utilizando métodos tales como, por ejemplo, el esquema de selección de reductasa dihidrofolato (DH-FR) o resistencia a drogas cito tóxicas. Kaufman et al. (1990), Meth. In Enzymology 185: 487-511. Una cepa de huésped adecuada para selección de DHFR puede swer, por ejemplo, cepa DX-B11 de CHO, que es deficiente en DHFR. Urlaub and Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220. Otros ejemplos de marcador seleccionables incluyen aquellos que confieren resistencia a los antibióticos, tales como G418 e higromicina B.

La secuencia reguladora se deriva típicamente de mamíferos, microbios, virus, y/o genes de insectos. Ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores de trascripción, operadores, y mejoradores, sitios de unión de ribosoma (ver por ejemplo Kozak (1991), J. Biol. Chem. 266: 19867-19870), secuencias que pueden controlar la terminación traduccional y transcripcional, señales de poli adenilación (ver por ejemplo McLauchlan et al. (1988), Nucleic Acids Res, 16: 5323-33), y sitios de unión de andamio y matriz (ver Phi-Van et al. (1988), Mol. Cell. Biol. 10: 2302-07; Stief et al. (1989), Nature 341: 342-35; Bonifer et al. (1990), EMBO J. 9: 2843-38). Las secuencias de nucleótidos se ligan operablemente cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia de codificación de la proteína. Tales secuencias pueden estar presentes en cis o en trans mientras que ellas se relacionan funcionalmente con la secuencia que codifica la proteína. Así, una secuencia de nucleótido promotora se liga operablemente a una secuencia de codificación de proteína si la secuencia de nucleótido promotor controla la trascripción de la secuencia de codificación. Aunque muchas secuencias capaces de regular la expresión, tal como promotores, ejercen sus efectos cuando están presentes en cis, este no siempre es el caso. Por ejemplo, el ARN no codificante presente en trans puede subregular o mejorar la expresión de gen. Ver por ejemplo Store (2002), Science 296: 1260-63.

Promotores y mejoradores de secuencia utilizados comúnmente se derivan del virus polioma, adeno virus 2, virus de simio 40 (SV40), y citomegalovirus humano (CMV). Por ejemplo, el promotor/mejorador CMV humano de gen inmediato 1 se puede utilizar. Ver por ejemplo Paterson et al. (1994), Applied Microbiol. Biotechnol. 40: 691-98. Las secuencias de ADN derivadas del genoma vírico SV40, por ejemplo, de origen SV40, promotor tardío y anticipado, mejorador, empalme, y sitios de poli adenilación se puede utilizar para suministrar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia de gen estructural en una célula huésped de mamífero. Los promotores iniciales y finales víricos son particularmente útiles debido a que ambos se obtienen fácilmente de un genoma vírico como un fragmento, que también puede contener un origen vírico de replicación (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978; Kaufman (1990), Meth. In Enzymol. 185: 487-511). También se pueden utilizar fragmentos SV40 más grandes o más pequeños, dado que la secuencia de aproximadamente 250 biopolímeros que se extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio Bgl I ubicado en el origen vírico SV40 del sitio de replicación se incluye.

Una secuencia que codifica un péptido señal heterólogo o nativo apropiado (secuencia líder) se puede incorporar en un vector de expresión, para promover la secreción extra celular de la proteína recombinante. La elección del péptido señal o líder depende del tipo de célula huésped en el que la proteína recombinante se produce. Ejemplos de péptidos señal que son funcionales en células huésped de mamífero incluyen la secuencia de señal para la interleuquina-7 (IL-7) descrita en la Patente Estadounidense No: 4, 965, 195, la secuencia de señal para el receptor de interleuquina-2 se describe en Cosman et al., Nature 312:768, 1984; el péptido de señal del receptor interleuquina-4 descrito en la patente EP No 367, 566; el tipo I del péptido señal de receptor interleuquina-1 descrito en la Patente Estadounidense No: 4, 968, 607; y el péptido señal del receptor interleuquina-1 tipo II descrito en la Patente EP No 460, 846.

La secuencia de control adicional mostrada para generar la expresión de genes heterólogos de vectores de expresión de mamífero incluyen tales elementos como el elemento de secuencia que aumenta la expresión (EASE) derivado de células CHO (Morris et al., in Animal Cell Technology, pp. 529-534 (1997); Patente Estadounidense No 6,312,951 B1; Patente Estadounidense No 6,027,915; Patente Estadounidense No. 6,309,841 B1) y el ARN de gen VA y líder tripartito (TPL) de adeno virus 2 (Gingeras et al. (1982), J. Biol. Chem. 257: 13475-13491). Las secuencias de sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) de mARN disistrónico permite el origen vírico para hacer traducido eficientemente (Oh ácidos nucleicos Sarnow (1993), Current Opinión in Genetics and Development 3: 295-300; Armes et al (1996), Nucleic Acids Research 24: 2697-2700). La expresión de un cADN como parte de un mARN disistrónico seguido por un gen para un marcador seleccionable (por ejemplo DHFR) se ha mostrado por mejorar la transfectabilidad del huésped y la expresión del cADN heterólogo (Kaufman et al. (1990), Methods in Enzymol. 185: 487-511). Vectores de expresión de ejemplo que emplean mARN disistrónico son pTR-DC/GFP descrito por Mosser et al., Biotechniques 22: 150-161 (1997), and p2A5I described by Morris et al., in Animal Cell Technology, pp. 529-543 (1997).

Ejemplos de vectores de expresión útiles que se pueden utilizar para producir proteínas son aquellas descritas en la WO 01/27299 y el vector pDC 409 descrito en McMahan et al. (1991), EMBO J. 10: 2821. Otro vector de expresión útil, el pCAVNOT, se ha descrito por Mosley et al. (1989), Cell 59: 335-348. Otros vectores de expresión para uso en células huésped de mamífero se pueden construir como se describe por Okayama and Berg (mol. Cell. Biol. 3: 280 (1983)). Un sistema útil para expresión de alto nivel estable para cADN de mamífero en células epiteliales de mamífero murino C127 se pueden construir sustancialmente como se describe por Cosman et al. (Mol. Inmunol. 23: 935 (1986)). Un vector de expresión altamente útil, PMLSV N1/N4 descrito por Cosman et al. (1984), Nature 312: 768, se ha depositado como ATCC 39890. Se describen vectores de expresión de mamífero útiles adicionales en la Patente EP No. A 0 367 566 y WO 01/27299. Los vectores se pueden derivar de retro virus, en lugar de secuencia señal nativa, una secuencia de señal heteróloga se puede agregar, tal como la secuencia de señal para el IL-7 descrita en la Patente Estadounidense No. 4, 965, 195; la secuencia señal para el receptor IL-2 descrito en Cosman et al. (Nature 312:768 (1984)); el péptido señal IL-4 descrito en la Patente EP No 367, 566; el péptido señal del receptor IL-1 tipo I descrito en la Patente Estadounidense No 4, 968, 607; y el péptido señal del receptor IL-1 tipo II descrito en la Patente EP No. 460, 846.

Condiciones de cultivo adecuadas y para células de mamífero se conocen en la técnica. Ver por ejemplo Animal Cell Culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992). Las células de mamífero se pueden cultivar en suspensión o mientras se unen a un sustrato sólido. Adicionalmente, las células de mamífero se pueden cultivar, por ejemplo, en bioreactores de lecho fluidizado, bioreactores de fibra hueca, bioreactores de lecho empacado, bioreactores de lecho de fibra, botellas de rodillo, frascos de agitación, o bioreactores de tanque de agitación, con o sin micro portadores, y operados en una forma de tanda, tanda de alimentación, continua, semi continua, o perfusión.

Los medios y métodos de la invención se pueden combinar con otros medios o métodos adicionales, especialmente aquellos que incrementan la producción o sialilación de una proteína. Por ejemplo, las células pueden crecer en temperaturas de aproximadamente 29ºC a aproximadamente 40ºC, opcionalmente de aproximadamente 29ºC a aproximadamente 37ºC, de aproximadamente 29ºC a aproximadamente 36ºC, de aproximadamente 29ºC a aproximadamente 35ºC, o de aproximadamente 30ºC a aproximadamente 33ºC. Mas aún, sustancias diferentes de N-acetilmanosamina, galactosa, fructosa y manosa, se pueden agregar al medio. Tales sustancias incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de acetilasa histona, butirato, tricostatina, cafeína, y bisacetamida hexametileno.

Los métodos de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar para incrementar el título y/o sialilación de proteínas en procesos de cultivo de fase única y multifase. En procesos de fase única, las células se inoculan en un ambiente de cultivo, y los métodos descritos y medios se emplean durante la fase de producción única. En el proceso multietapa, las células se cultivan en dos o más fases distintas. Por ejemplo las células se pueden cultivar primero en una fase de crecimiento, bajo condiciones ambientales que maximizan la proliferación y viabilidad celular, luego se transfieren a una fase de producción, bajo condiciones que incrementan la producción y/o sialilación de una proteína. En los procesos de multifase los métodos y medios de acuerdo con la presente invención se emplean al menos durante la fase de producción.

Los ejemplos presentados adelante no se pretende que sean exhaustivos o que limiten el alcance de la invención. El experto entenderá que son posibles modificaciones y variaciones en claridad de las anteriores enseñanzas.

Ejemplo 1 Comparación de la capacidad de varios azúcares y combinaciones de estos para inducir la sialilación del TNFR: F_{C}

El siguiente experimento se hace para determinar que carbohidrato o combinación de carbohidratos agregados al medio de cultivo celular son capaces de inducir la mayoría de sialilación del TNFR: F_{C} producido por las células. El alcance relativo de la sialilación se determina al medir la fracción de TNFR: F_{C} producido por un cultivo celular que eluye de una columna de intercambio de anión solo en una alta concentración de sal. Esto da una fuerte medida del alcance de la sialilación debido a que las proteínas con más ácido siálico requieren una mayor concentración de sal para elusión de una columna de intercambio de anión.

Aproximadamente 2.0 x 10^{6} células de una línea celular CHO que se construido genéticamente para producir TNFR: F_{C} se inoculan en doce frascos que contienen 30 ml de medio libre de suero con intralipids^{TM} (una emulsión estéril o aceite de soya fraccionado y fosfolípidos de óvulo fraccionado en agua), factor - I de crecimiento similar a insulina, y butirato y sin ningún carbohidrato agregado (etiquetado "control") o con aditivos de carbohidrato indicados en la Figura 2 en una concentración de 4 mm cada uno. Los cultivos se incuban durante siete días a 30ºC con agitación en 150 revoluciones por minuto. El TNFR: F_{C} se cosecha del medio después de siete días de crecimiento y se prepurifica mediante cromatografía de afinidad de proteína A. De aquí en adelante, se determina la concentración de la proteína TNFR: F_{C} purificada al medir la absorbancia en 280 nanómetros. La concentración de la proteína TNFR: F_{C} se ajusta aproximadamente 0.25 mg/ml por dilución en 20 mm de imidazol, pH 6.2.

Una columna de intercambio de anión (4.6 mm de diámetro y 50 mm de alto) se ejecuta como sigue. La columna se calibra antes y después de ejecutar las muestras experimentales utilizando una mezcla de dos proteínas de control que contienen 0.25 mg/ml de inhibidor de tripsina de soya y 0.5 mg/ml de lactaalbúmina (obtenidas de sigma - Aldrich Corporatión, St. Louis, Missouri, USA). Una muestra de hasta 200 \mul de esta mezcla se aplica a la columna, y se ejecuta un gradiente lineal entre 20 mm de imidazol, pH 6.2 (amortiguador A) y 20 mm de imidazol, 0.7 m NaCl, pH 6.2 (amortiguador B) a través de la columna en una proporción de 0.8 ml/min. En 22.1 minutos, el gradiente se completa, y la columna contiene 100% de amortiguador B. Se determina la elusión de proteína al monitorear la absorbancia en 280 nanómetros, y una gráfica de estas mediciones versus tiempo (con relación al tiempo de carga) se registra automáticamente como la proteína eluada de la columna. La lacta albúmina eluada antes del inhibidor de tripsina de soya (aproximadamente 11.2 minutos según se compara con 15.4 minutos). Entre series, la columna se limpia al inyectar 0.2 ml 2 m NaCl, seguido por dos series de lavadas alternantes con amortiguadores A y B seguido por un lavada final con amortiguador A.

Un volumen de hasta 200 \mul (aproximadamente 0.25 mg/ml) de TNFR: F_{C} se carga en la columna de intercambio de anión, y un gradiente lineal se desarrolla a través de la columna como se explicó anteriormente. La porción del pico TNFR: F_{C} que eluye después del inhibidor de tripsina de soya se considera que eluye en alta sal. La fracción del TNFR: F_{C} que eluye en alta sal se determina al comparar el área bajo la curva que eluye después del inhibidor de tripsina de soya con el área total bajo la curva. Este número se compara en cada caso con una fracción similar de una tanda de TNFR: F_{C} producida en un experimento separado mediante el crecimiento de un cultivo celular sin manosa, fructuosa, galactosa, o N-acetil manosamina.

Los resultados se muestran en la Figura 2. El hecho que el cultivo de control del actual experimento sin agregar azúcares es solo muy ligero por encima del 100% indica que la sialilación del TNFR: F_{C} puede ser casi constante de tanta a tanda. Estos datos también indican que los cultivos crecen en N-acetilmanosamina, fructosa, manosa y galactosa (en concentraciones de 4mm cada uno) producida por los más altos niveles de sialilación de TNFR: F_{C} de cualquiera de las combinaciones ensayadas. Adicionalmente, el TNFR: F_{C} de cultivos en crecimiento con las siguientes combinaciones de azucares también muestran incrementos en sialilación: (1) galactosa sola; (2) fructuosa y galactosa; (3) fructosa, galactosa y manosa; y (4) N-acetilmanosamina y galactosa.

Ejemplo 2 Muestra de una superficie sensible para determinar concentraciones óptimas de N-acetilmanosamina y azucares

Este experimento se hace para determinar las concentraciones óptimas de N-acetilmanosamina y fructosa, manosa, y galactosa en medio de crecimiento para aumentar la sialilación del TNFR: F_{C}, los experimentos también buscan determinar una combinación que alcance la mayor sialilación del TNFR: F_{C} con la menor concentración de N-acetilmanosamina.

Aproximadamente 2.0 x 10^{6} células de la misma línea celular CHO utilizada en el ejemplo 1 se inoculan en cada uno de los trece frascos que contienen 30 ml de medio libre de suero con INTRALIP-IDS^{TM} (una emulsión estéril de aceite de soya fraccionado y fosfolípidos de óvulo fraccionado en agua), factor - I de crecimiento similar a insulina, y butirato con los aditivos de medio indicados en la Figura 3, que es, concentraciones variantes de N-acetilmanosamina y/o cóctel de azúcar que contiene cantidades equimolares de fructosa, galactosa, y manosa.

Las combinaciones de concentraciones de aditivos de medio se seleccionan para muestrear una superficie sensible. Ver por ejemplo, Öberg y Deaming, Chemical Eng. Process, Abril 2000: 53-59. Se utilizan cinco cultivos por duplicado para producir los datos para el punto central de la Figura 3, y ocho cultivos cada producen los datos para uno de los ocho puntos axiales de la Figura 3. El TNFR: F_{C} se cosecha a partir del medio después de siete días de crecimiento a 30ºC con agitación a 150 revoluciones por minuto y se prepurifican por cromatografía de afinidad de proteína A: El número de moles de ácido N-acetilneuramínico (NANA) por mol de proteína recombinante se determina como sigue. Luego la cromatografía por afinidad de proteína A, la concentración del TNFR: F_{C} se determina al leer la absorbancia en 280 nanómetros, y la concentración se proteína se ajusta a 1 mg/ml por dilución en salina amortiguada con fosfato. La sialidasa (obtenida de Glyko, Inc. de Novato, California, USA) se diluye a 1 mu/\mul (en donde una unidad es la cantidad de enzima necesaria para clivar 1 \mu mol de NANA por minuto en pH 5 y 37ºC) en amortiguador de incubación 2x (200 mm de acetato de sodio, pH 5.0). El TNFR: F_{C} y la sialidasa (10 \mul cada uno) se mezcla e incuban durante 4 horas a 37º C. Luego, la mezcla se diluye a 0.2 mg/ml de TNFR: F_{C} al agregar 30 \mul de agua. El ácido siálico liberado se detecta y cuantifica utilizando cromatografía de intercambio de anión de alto desempeño, en la que el flujo de salida se determina utilizando detección amperométrica de pulso. La detección amperométrica de pulso utiliza electrodos que interceptan los pulsos limpios (para remover analitos que fallan al electrodo y evitan lecturas exactas) sin la detección de pulsos en un potencial apropiado para detectar NANA. El sistema se calibra antes y después de ejecutar muestras experimentales utilizando cantidades conocidas de NANA compradas de un proveedor comercial tal como, por ejemplo, Sigma Aldrich Corporation de St. Louis, Misuri, USA: El sistema para desarrollar cromatografía de intercambio de anión de alto desempeño y la detección amperométrica de pulso se compran de Dionex Corporation de Sun-nyvale, California USA.

Los resultados, que se muestran en la Figura 3, se grafican utilizando software de computador para análisis estadístico y presentación gráfica de datos (JMP®, available from SAS Institute, CAry, North Carolina, USA). Se observan los más altos niveles de sialilación de TNFR: F_{C} en 3 mm de fructosa, galactosa y manosa y ligeramente por encima de 5 mm de N-acetilmanosamina. Sin embargo, cuando 3 mm de fructosa, galactosa y manosa se agregan a los cultivos que contienen ligeramente menos de 3 mm de N-acetilmanosamina, los niveles de sialilación son casi iguales a aquellos vistos utilizando aproximadamente 5 mm de N-acetilmanosamina.

Claims (38)

1. Un método para controlar el contenido de ácido siálico de una proteína producida por células de mamífero que comprende cultivar las células en suspensión en un medio que comprende galactosa y fructosa.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el medio comprende adicionalmente manosa.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el medio comprende adicionalmente N-acetilmanosamina.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 3, en donde el medio está libre de suero.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, o 4, en donde las concentraciones de galactosa, manosa y fructosa cada una son de 1 mm a 10 mm.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en donde la concentración N-acetilmanosamina en el medio es al menos 0.8 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 10 mm o 20 mm.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde la proteína es una proteína recombinante secretada.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde las células de mamíferos son células CHO (ovario de hámster chino).

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en donde las células se cultivan en una temperatura de 29ºC a 36ºC.

10. Un medio para cultivar células de mamífero que comprende galactosa, fructosa y manosa.

11. El medio de la reivindicación 10, que comprende adicionalmente N-acetil-manosamina.

12. El medio de la reivindicación 10 u 11, en donde las concentraciones de galactosa, manosa y fructosa cada una son de 1 mm a 10 mm.

13. El medio de la reivindicación 11 o 12, en donde la concentración de N-acetilmanosamina en el medio es de al menos 0.8 mm.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde el medio es libre de suero.

15. Un método para controlar el contenido de ácido siálico de una proteína que comprende cultivar una célula de mamífero que produce la proteína en medio que comprende N-acetilmanosamina y galactosa.

16. El método de la reivindicación 15 en donde el medio comprende adicionalmente fructosa y manosa.

17. El método de la reivindicación 16, en donde la concentración de fructosa en el medio es 1.5 mm a 4.5 mm y en donde la concentración de manosa en el medio es de 1.5 mm a 4.5 mm.

18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde las células se cultivan en una temperatura de 29ºC a 35ºC.

19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en donde la concentración de N-acetilmanosamina en el medio es de al menos de 0.8 mm y en donde la concentración de galactosa en el medio es de 1.5 mm a 4.5 mm.

20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en donde la proteína es una proteína secretada.

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20 en donde proteína es una proteína recombinante.

22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, en donde la célula es una célula CHO (ovario de hámster chino).

23. Un medio para cultivar células de mamífero, que comprende galactosa, fructosa y N-acetilmanosamina.

24. El medio de la reivindicación 23, en donde el medio comprende adicionalmente manosa.

25. El medio de la reivindicación 24, en donde la concentración de fructosa en el medio es de 1.5 mm a 4.5, mm y en donde la concentración de manosa en le medio es de 1.5 mm a 4.5 mm.

\newpage

26. El medio de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en donde la concentración de N-acetilmanosamina en el medio es de al menos 0.8 mm y en donde la concentración de galactosa en el medio es de 1.5 mm a 4.5 mm.

27. El medio de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en donde las células de mamífero son células CHO.

28. El medio de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en donde el medio es libre de suero.

29. Un método para incrementar la producción de una proteína al cultivar células de mamífero que expresan la proteína, el método comprende cultivar las células de mamífero en un medio que comprende fructosa, manosa y galactosa.

30. El método de la reivindicación 29, en donde el medio comprende adicionalmente N-acetilmanosamina.

31. El método de la reivindicación 30, en donde la concentración de galactosa en el medio es 1.5 mm a 4.5 mm y en donde la concentración de manosa en el medio es de 1.5 mm a 4.5 mm, y en donde la concentración de fructosa en el medio es de 1.5 mm a 4.5 mm.

32. El método la reivindicación 30 o 31, en donde la concentración de N-acetilmanosamina en el medio es al menos 0.8 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 10 mm o 20 mm.

33. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, en donde el medio es libre de suero.

34. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33, en donde las células de mamífero son células CHO (ovario de hámster chino).

35. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 34, en donde la proteína es una proteína recombinante secretada.

36. Un método para controlar el contenido de ácido siálico de una proteína recombinante que comprende cultivar células de mamífero que expresan la proteína recombinante en una temperatura de aproximadamente 29ºC a aproximadamente 36ºC en un medio que comprende fructosa, galactosa, manosa y N-acetilmanosamina, en donde la concentración de fructosa en el medio es de 1.0 mm a 5.0 mm, en donde la concentración de galactosa en el medio es de 1.0 mm a 5.0 mm, en donde la concentración de manosa en el medio es de 1.0 mm a 5.0 mm, y en donde la concentración de N-acetilmanosamina en el medio es de al menos 0.8 mm.

37. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, 15 a 22, o 36, en donde el contenido de ácido siálico de la proteína se incrementa.

38. Uso de un medio que comprende N-acetilmanosamina y galactosa para controlar el contenido de ácido siálico de una proteína producida por una célula de mamífero.