ES2284833T3 - Procedimiento y aparato bioquimicos para detectar caracteristicas geneticas. - Google Patents

Abstract

Procedimiento bioquímico de detección de una o más características genéticas, utilizando dicho procedimiento soportes (1) cuya dimensión más grande (3) es inferior a 250 mim y en el que cada soporte (1) incorpora un medio de identificación secuencial (2), comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (a) unir una molécula de información (7) a una superficie principal (11) de cada soporte (1); (b) suspender los soportes (1) con la molécula de información asociada (7) en un fluido; (c) añadir una muestra (8) a analizar al fluido; (d) colocar el fluido que comprende sus soportes (1) asociados y la muestra (8) sobre un sustrato (49) para su posterior interrogación; (e) detectar las señales de interacción de por lo menos uno de los soportes (1) en el fluido utilizando un medio de detección de señales (40); y (f) leer el medio de identificación secuencial (2) de los soportes (1) que tienen una señal de interacción utilizando un medio de lectura (3), detectando de este modo por lo menos una de dichas una o más características genéticas (8), caracterizado por el hecho de que (g) la molécula de información (7) es capaz de interaccionar con por lo menos una de dichas una o más características genéticas; y (h) el medio de identificación secuencial (2) es un código de barras e incorpora totalmente por lo menos una de las características de orientación espacial y características de corrección de errores para ayudar al medio de lectura (3) a determinar las identidades de los soportes (1).

Description

Procedimiento y aparato bioquímicos para detectar características genéticas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento bioquímico de detección de características genéticas según el preámbulo de la reivindicación 1 que se acompaña.

Antecedentes de la invención

Durante los últimos años, ha surgido un considerable interés en técnicas y sistemas asociados para la determinación de características genéticas de numerosos tipos de organismos, por ejemplo, levaduras, bacterias y mamíferos. Previamente, las pruebas para detectar características genéticas se llevaban a cabo manualmente de manera secuencia en los laboratorios. Posteriormente, los desarrollos tecnológicos relacionados con la caracterización genética evolucionaron hacia una mayor automatización con un rendimiento de detección asociado más elevado. Dichos desarrollos tecnológicos han sido provocados por, por ejemplo, el proyecto del genoma humano; este proyecto ha indicado que realmente existen del orden de 30.000 a 40.000 genes en el genoma humano. Con millones de características genéticas y miles de especies diferentes a analizar, los procedimientos de análisis de características genéticas con un alto rendimiento han resultado muy importantes para el progreso continuo de la ciencia genética. Por ejemplo, actualmente existe la necesidad de tecnologías de rendimiento elevado en paralelo y de forma masiva para el cribado ("screening") de la expresión de genes en muestras y el genotipado, así como la búsqueda y desarrollo de fármacos. Esta necesidad de procedimientos con un alto rendimiento ha dado lugar a que muchas nuevas tecnologías y procedimientos asociados de determinación de características genéticas estén comercialmente disponibles.

Existen diversas técnicas conocidas para determinar características genéticas, estas técnicas implican una pluralidad de experimentos constituyentes que están marcados individualmente; cuando se han completado los experimentos, se pueden leer utilizando sus marcadores asociados para la identificación. Entre los marcadores utilizados actualmente incluyen:

(a) la posición de cada experimento en la superficie de un circuito integrado de prueba, conocido como un "chip de ADN de prueba";

(b) la posición de cada experimento en una placa de microtítulos o en un tubo;

(c) la posición de cada experimento en la superficie de una membrana; y

(d) espectro fluorescente u otros procedimientos de identificación de partículas a los que los experimentos están unidos.

Dichos procedimientos conocidos tienen la desventaja de utilizar componentes para su ejecución que son difíciles y caros de fabricar y utilizar. Además, los procedimientos también sufren de un alto grado de interferencia de fondo que limita sus aplicaciones potenciales con fines de caracterización genética.

En la Patente de Estados Unidos No. US 6.027.880, se describe una micromatriz. La micromatriz se refiere a una circuito integrado cuya superficie está dividida en una pluralidad de sitios dispuestos espacialmente, correspondiendo cada sitio a un experimento individual. Cada experimento individual está dispuesto con uno o más nucleótidos correspondientes en el mismo. Cada sitio está marcado de manera eficaz en virtud de su posición espacial en la superficie del circuito integrado. Affymetrix fabrica dichas micromatrices, cada una de ellas capaz de analizar del orden de 12.000 genes de longitud completa mediante análisis paralelo. Debido a que el número de muestras ensayadas en la misma micromatriz se ha incrementado hasta varios millares en los últimos años, la demanda de una miniaturización de equipamiento de fabricación asociado y el manejo de materiales especializados ha hecho que la fabricación de dichas micromatrices sea cada vez más compleja. Las características genéticas de muestras que se monitorizan en dichas micromatrices deben ser frecuentemente conocidas y aisladas de antemano; dicho conocimiento previo hace que la fabricación de micromatrices específicas para las necesidades del cliente para cada tipo diferente de organismo o especie a estudiar sea un proceso complicado y costoso. Algunas desventajas adicionales asociadas con esta tecnología son una flexibilidad baja, tiempos de respuesta de fabricación largos, coste elevado y baja calidad de los datos.

Los costes de inversión iniciales para la fabricación de las micromatrices anteriores son frecuentemente considerables. Una gran mayoría de los usuarios potenciales de dichas micromatrices encuentran su coste prohibitivo. Además, existe un alto riesgo para los usuarios potenciales que invierten en equipamiento que utiliza micromatrices, ya que el equipo es de aplicación altamente específica y rápidamente queda obsoleta. Con pocos compradores especialistas en este tipo de equipamiento, el valor de reventa es frecuentemente bajo.

Los aparatos de instrumentación, por ejemplo lectores y sistemas robóticos, utilizados para llevar a cabo experimentos con micromatrices también están técnicamente avanzados y, por tanto, son muy caros. Algunas desventajas adicionales son una escasa sensibilidad y un considerable ruido de fondo que inhiben una determinación precisa de resultados experimentales. También se han aplicado técnicas para mejorar las cinéticas de reacción y, por lo tanto, la calidad de los resultados para micromatrices. Por ejemplo, las mejoras de las proporciones superficie con respecto a volumen de la micromatrices a través de la utilización de canales y materiales porosos se describen en la solicitud internacional de PCT publicada de Akzo Nobel no. WO 99/02266. En la práctica, se ha observado que la obtención de cinéticas de reacción suficientes cuando se utilizan dichas micromatrices es problemática. Una vez más, estos problemas han dado lugar a una fabricación complicada que ha restringido la flexibilidad para el usuario a experimentos de adaptación cuando se utilizan micromatrices.

Los bioensayos realizados sobre micropartículas proporcionan otro tipo de tecnología de matrices en paralelo de forma masiva y se utilizan actualmente. Los procedimientos de separación entre sí de muestras diferentes se han conseguido mediante la unión de moléculas de información a pequeños soportes, de manera que se pueden llevar a cabo muchas pruebas de manera simultánea. Un sistema utilizado para distinguir entre sí los soportes es normalmente los índices de fluorescencia o reflexión.

En una solicitud internacional de PCT publicada no. WO 99/35293, se describe un procedimiento de análisis de una característica genética en forma de la expresión de genes diferenciales. El procedimiento incluye una población de referencia de sondas de ácidos nucleicos hibridados con ADN de referencia clonado en soportes sólidos. Los soportes sólidos son micropartículas y utilizan marcadores ópticos para reaccionar con los polinucleótidos para indicar una reacción asociada. A continuación, se utiliza un aparato de clasificación avanzada para clasificar los aparatos que han reaccionado, dicha clasificación conseguida mediante una intensidad de señal óptica diferencial asociada con los diferentes soportes; los marcadores ópticos son emisores de luz y los soportes de micropartículas se clasifican dependiendo de la intensidad de la luz emitida desde las mismas. Dicho procedimiento de clasificación permite una mayor flexibilidad que las micromatrices en la detección de características genéticas a través de la utilización de micropartículas cargadas de forma diferente. Sin embargo, aún se experimentan problemas en referencia a la complejidad de la instrumentación requerida para determinar los niveles de intensidad diferentes de luz emitida desde las micropartículas activadas.

Los documentos WO-A-97/14028 y US-A-5.981.180 describen un procedimiento para el diagnóstico múltiple y el análisis genético de enzimas, fragmentos de ADN, anticuerpos, y otras biomoléculas. La citometría de flujo se utiliza para clasificar microesferas marcadas en un conjunto de microesferas.

El documento WO-A-00/55363 describe un procedimiento de detección y análisis de diferencias entre los ácidos nucleicos de dos fuentes, en los que las microesferas diana se mezclan con dos ácidos nucleicos y se analizan mediante citometría de flujo.

El documento DE-A-10031028 describe un procedimiento para seleccionar partículas con una característica predeterminada de una población que comprende un gran número de partículas diferentes.

El documento WO-A-95/32425 describe un procedimiento para codificar bibliotecas combinatorias utilizando microesferas marcadas con fluoróforo y el documento US-A-6.096.496 describe una microesfera de química combinatoria que incluye un emisor espectral electromagnético como identificador único.

El documento US-A-4.568.630 da a conocer un procedimiento de preparación de una placa de imprimación de aluminio anodizada.

El documento US-A-5.519.200 describe un dispositivo de identificación que incluye una tira magneto-óptica y un código de barras óptico, en el que la tira magneto-óptica se sitúa en una localización conocida en relación al código de barras óptico, de manera que en una identificación visual del código de barras se puede encontrar la localización de la tira magneto-óptica.

En la solicitud internacional de PCT publicada no. WO 00/126893 del Solicitante se describe una innovación referida a la utilización de soportes sólidos en un bioensayo, y un proceso para la fabricación de dichos soportes. Los soportes se fabrican a partir de un metal anodizado, preferiblemente aluminio. Los soportes tienen, por ejemplo, anticuerpos unidos a los mismos para unirse a antígenos.

Los procedimientos más modernos de detección de características genéticas se refieren a la identificación de expresiones de genes y el análisis de genotipos. Dichos análisis se realizan actualmente utilizando chips o micromatrices de ADN o matrices de puntos. Estos procedimientos tienen la desventaja de la calidad variable de la impresión por contacto, que puede dar lugar a una fiabilidad baja de los resultados de la prueba obtenidas de esta manera a partir de las matrices. En cambio, esta fiabilidad baja ha dado lugar a unos amplios requisitos de control de calidad durante la fabricación de las micromatrices y matrices de puntos para asegurar la calidad de la impresión por contacto. Además, se ha demostrado que la reproducibilidad de la hibridación es difícil de asegurar durante la fabricación; la dificultad al asegurar la hibridación reproducible ha conducido a dificultades en la obtención de resultados fiables cuando se reproducen los resultados experimentales.

Más recientemente, se han utilizado microesferas codificadas con colores para experimentos de genotipado y expresión de genes. Sin embargo, estos experimentos están limitados en su número de códigos, tienen un coste de fabricación relativamente elevado y, por tanto, están limitados con respecto al número de pruebas que se pueden realizar de una vez. Algunas desventajas con esta tecnología son el coste elevado de la instrumentación requerida para leer los resultados de los experimentos, y las propiedades de absorción y emisión desfavorables de los colorantes utilizados.

Otro enfoque conocido para detectar características genéticas es la detección y procedimientos de evaluación de Polimorfismo de un Solo Nucleótido (SNP). Existen muchos procedimientos de detección y evaluación de SNP que muestran muchas desventajas. Entre algunos de los procedimientos incluidos en dicha detección de SNP se incluyen la matriz de hibridación en miniatura (chip de ADN), análisis basadas en gel e hibridación dinámica específica de alelo (DASH). Estos procedimientos también se pueden utilizar cuando se detectan características genéticas para la asociación de fármacos con diana y farmacogenómica. Los procedimientos tienen la desventaja de requerir amplificación PCR de diana; dicha amplificación representa una carga que limita las posibilidades para aumentar la escala y la automatización. La mayoría de otras desventajas mencionadas para las micromatrices y bioensayos mencionados anteriormente, por ejemplo la calidad variable de la impresión por contacto, la reproducibilidad de la hibridación, y el número limitado de muestras que se pueden utilizar en cualquier instante también se aplican a estos procedimientos.

Otro problema experimentado con la tecnología de caracterización genética moderna es la necesidad de personal que esté altamente preparado y entender los ajustes de varios sistemas diferentes cuando se llevan a cabo un número creciente de experimentos para determinar las características genéticas. Dichas necesidades de personal dan lugar a unas inversiones iniciales relativamente grandes en el entrenamiento del personal. Frecuentemente es necesario, a causa de las necesidades de validación y para aumentar la fiabilidad de los resultados de los análisis, realizar experimentos de forma repetitiva que requieren la supervisión de los científicos, reduciendo la disponibilidad de estos científicos para otras actividades. Además, en industrias, tales como la investigación y el desarrollo de fármacos, existen amplios grupos de tecnologías utilizadas a lo largo del proceso que deben validarse dando lugar a un tiempo, necesidades y costos considerables.

Descripción resumida de la invención

Un primer objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento mejorado de detección de características genéticas.

Un segundo objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento de rendimiento elevado a bajo coste para realizar experimentos para detectar características genéticas.

Según la presente invención, con el fin de cumplir uno o más de los objetivos mencionados anteriormente de la presente invención y otros objetivos que serán obvios a partir de la siguiente memoria, se proporciona un procedimiento tal como se ha definido en la reivindicación 1 que se acompaña.

El procedimiento tiene la ventaja de que es capaz de cumplir con los objetivos mencionados anteriormente.

De este modo, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar características genéticas, en el que los soportes con códigos de barras específicos tienen una molécula de información unida a una superficie principal del mismo. La unión de las moléculas sobre los soportes y la suspensión de las mismas en un fluido permite muy buenas cinéticas de reacción, mejorando de este modo la sensibilidad así como reduciendo el volumen y tiempo de reacción. La muestra que contiene potencialmente una o más características genéticas a detectar se añade al fluido. Es posible un experimento múltiple de cientos de miles de pruebas en una, ya que un gran número de soportes con diferentes códigos de barras y moléculas de información unidas pueden estar presentes de forma simultánea en el bioensayo. La utilización de dichas moléculas en combinación con soportes disminuye la necesidad de realizar experimentos por lotes o repetidos. Se utilizan diferentes tipos de señales para indicar los códigos de barras de los soportes y la señal de interacción que indica la interacción con una o más de las características genéticas. Dicho enfoque da lugar a unidades de lectura y detección menos avanzadas requeridas para realizar mediciones de ensayo, reduciendo potencialmente de este modo el coste.

En una realización preferida de la presente invención, los soportes se oxidan antes de la unión de las moléculas de información a los mismos. Dicha unión permite que las superficies de los soportes tengan unas propiedades mecánicas y de unión química mejoradas. Alternativamente, o adicionalmente, los soportes se recubren con uno o más agentes de unión molecular para mejorar la unión de la molécula de información a los mismos.

En una realización preferida adicional de la presente invención, una unidad de medición realiza la detección de marcadores emisores de señales y la lectura del código de barras sustancialmente de forma simultánea. Esta medición simultánea disminuye el riesgo de lecturas incorrectas y aumenta el rendimiento, ya que no se utiliza software avanzado para el seguimiento de los soportes.

En una realización adicional de la presente invención, la lectura del código de barras incluye la localización de una o más características dispuestas para indicar cómo se interpreta la información acumulada. Esto posibilita la identificación de los soportes independientemente de su posición o dirección de flujo a través de, por ejemplo, un sistema de lectura de citómetro de flujo.

Una realización adicional de la presente invención tiene el fluido que incluye soportes cargados colocados sobre y posteriormente fijados sobre un sustrato. Esto permite un aumento múltiple de la capacidad de rendimiento de los procedimientos de lectura planos estándar requiriendo sólo ajustes menores para la configuración de equipos existentes.

Según un enfoque especial de la presente invención, la lectura de la unidad de medición implica el transporte del sustrato con sus soportes asociados a lo largo de una trayectoria determinada. Dicho movimiento a lo largo de la trayectoria se consigue preferiblemente mediante el movimiento del sustrato con soportes localizados en los mismos a la vez que la unidad de medición está estacionaria. Es evidente que, alternativamente, la unidad de medición se podría mover a la vez que el sustrato con soportes está estacionario. Dichos enfoques son capaces de dar lugar a sustancialmente todos los soportes en el fluido que se analizan. Aquellos soportes que están sólo parcialmente en el área focal de unidad de medición a lo largo de la trayectoria de medición tienen sus correspondientes registros de posiciones, de manera que sólo se analizan una vez.

En otras realizaciones preferidas de la presente invención, las características genéticas detectadas son para la expresión de genes, el análisis/evaluación de SNPs, el ensayo de ácidos nucleicos, asociación de fármacos con diana o farmacogenómica. Entre estas realizaciones de la presente invención se incluyen un sistema para llevar a cabo pruebas de bioensayo múltiples en paralelo y de forma masiva para el análisis de la expresión de genes, el análisis/evaluación de SNPs, asociación de fármacos con diana, farmacogenómica y/o el ensayo de ácidos nucleicos de una forma barata, rápida y de manera conveniente. Dicho esquema consigue un rendimiento elevado realizando una suspensión que incluye muchos miles de tipos diferentes de, por ejemplo, soportes codificados micro-mecanizados, también denominados marcadores o micro-marcadores. Cada uno de estos soportes transporta moléculas de información de ácidos nucleicos o ácidos nucleicos de péptido (PNA). Los soportes con moléculas de información unidas se mezclan con la muestra que incluye potencialmente la característica genética a prueba junto con un marcador emisor de señales, concretamente un sistema informador, tal como la fluorescencia. Sólo los soportes con sondas de ácidos nucleicos o PNAs que se unen a las características genéticas investigadas se unirán al marcador emisor de señales que a continuación emite una señal, por ejemplo, fluorescencia.

Un aparato para la detección de características genéticas puede tener un medio de detección y un medio de identificación dispuestos para registrar dos tipos de señales diferentes, estando la primera señal asociada con la detección de marcadores emisores de señales activados y la segunda señal asociada con la lectura de códigos de barras de soportes. Dicha pluralidad de diferentes tipos de señales disminuye la necesidad potencial de utilizar equipamiento avanzado y costoso para el procesado de la imagen.

Una realización de un soporte sólido utilizado de forma adecuada con dicho aparato en un ensayo bioquímico de expresión de genes, detección/evaluación de SNPs, asociación de fármacos con diana o farmacogenómica tiene una forma sustancialmente lineal o plana y tiene una capa de superficie de metal anodizada. La dimensión más grande del soporte es preferiblemente inferior a aproximadamente 250 \mum, más preferiblemente inferior a 150 \mum y aún más preferiblemente inferior a aproximadamente 100 \mum de longitud, a través de la cual se puede formar una suspensión acuosa a partir de una pluralidad de soportes. Esto permite la utilización del mismo tipo de bioensayo para diversos tipos de experimentos diferentes.

En realizaciones adicionales, la capa de superficie del soporte tiene una capa de anodización de estructura celular con la dirección de crecimiento de las células de la capa de anodización perpendicular al plano de la capa de superficie. De manera adecuada, el soporte tiene moléculas de información (sondas) de ácido nucleico o PNA unidas a la capa de superficie. La capa de superficie del soporte puede ser de aluminio y puede ser también porosa. Además, el tamaño de poro de la capa de superficie aproximadamente encaja de forma adecuada con el tamaño de las moléculas de ácido nucleico o PNA a unir. Esto proporciona al soporte excelentes propiedades de unión mecánicas y químicas para la unión de moléculas de información.

El código de barras incorporado en el soporte es un patrón de espaciado variable para objetivos de identificación. De manera adecuada, una unidad de medición, por ejemplo, un lector óptico se utiliza para leer los patrones e identificar los soportes.

Se entenderá que las características de la presente invención descritas anteriormente se pueden combinar en cualquier combinación sin apartarse del alcance de la presente invención.

Descripción de los dibujos

Las realizaciones de la presente invención se describirán a continuación, sólo a modo de ejemplo, haciendo referencia a los dibujos que se acompañan en los que:

La Figura 1 es una vista plana y una vista lateral de un soporte individual que comprende un código de barras;

La Figura 2 es una diagrama esquemático de un bioensayo que comprende soportes, moléculas de información y marcadores emisores de señales;

La Figura 3 es una vista en sección transversal en la dirección de flujo de un lector basado en flujo;

La figura 4 es un diagrama de flujo esquemático del proceso de incubación y lectura de un lector de base plana;

La figura 5 es un diagrama esquemático que ilustra un lector de base plana para interrogar soportes sobre un sustrato plano; y

Las figuras 6a y 6b son vistas superiores esquemáticas de un sustrato plano que ilustran ejemplos de la trayectoria de medición tomadas por el lector de base plana.

Descripción de realizaciones de la invención

En la figura 1, se proporciona una ilustración de un soporte 1 individual preferido. A dicho soporte también se hará referencia como "micro marcador" en la siguiente descripción. El soporte 1 se puede fabricar a partir de una gran variedad de materiales que varían desde polímeros, vidrios hasta aleaciones metálicas, pero se fabrica preferiblemente a partir de un metal y más preferiblemente se fabrica a partir de aluminio. El soporte 1 incorpora un código de barras 2 que puede estar en forma de cómo mínimo una (o una combinación de los mismos) de ranuras, muescas, depresiones, protuberancias, proyecciones y más preferiblemente agujeros. El código de barras 2 de manera adecuada es un código de barras óptico de transmisión. El código de barras 2 está realizado como una serie secuencial de agujeros espaciados que se extiende a través del soporte 1. Dichos agujeros pueden ser de forma y tamaño variado. Son capaces de proporcionar un contraste óptico muy bueno, ya que las áreas sólidas del soporte 1 son sustancialmente no transmisivas a la luz, mientras que los agujeros del código de barras 2 son altamente transmisivos a la luz recibida en el mismo.

El soporte 1 puede tener muchos tipos de formas diferentes, pero preferiblemente tiene una forma sustancialmente plana con por lo menos una superficie principal 11. Cada soporte 1 de este tipo tiene unas dimensiones 3 máximas de menos de aproximadamente 250 \mum, más preferiblemente menos de 150 \mum, y aún más preferiblemente menos de 100 \mum de longitud. El soporte 1 tiene de forma adecuada una proporción de anchura 4 con respecto a longitud 3 en un intervalo de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:20, aunque se prefiere especialmente un intervalo de proporción de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:15. Además, el soporte 1 tiene un grosor 5 que es preferiblemente inferior a aproximadamente 3 \mum y más preferiblemente inferior a aproximadamente 1 \mum. Se ha observado que un grosor inferior a aproximadamente 1 \mum proporciona una resistencia mecánica al soporte que hace que el soporte 1 se pueda utilizar en bioensayos. Una realización preferida de la presente invención se refiere a soportes 1 que tienen una longitud 3 de aproximadamente 100 \mum, una anchura 4 de aproximadamente 10 \mum y un grosor 5 de aproximadamente 1 \mum; dichos soportes son capaces de almacenar hasta 100.000 códigos de barras 2 de secuencias de identificación diferentes. Se han realizado demostraciones experimentales de hasta 100.000 variantes diferentes de los soportes 1 para su uso en bioensayos para experimentos de caracterización genética. Se han fabricado soportes 1 de diferentes longitudes 3 en un intervalo de 40 a 100 \mum que llevan entre dos y cinco cifras decimales de datos en el código de barras 2 para su uso en diferentes experimentos para la detección de características genéticas.

Se pueden fabricar alrededor de diez millones de dichos soportes 1, concretamente micromarcadores, en un sustrato individual de 6 pulgadas de diámetro, por ejemplo, una lámina de silicio, utilizando técnicas de fabricación actualmente establecidas. Los procesos de fotolitografía convencional y grabado en seco son ejemplos de dichas técnicas de fabricación utilizadas para fabricar y diseñar una capa de aluminio anodizada para obtener soportes sólidos 1 separados.

Un proceso de fabricación para fabricar una pluralidad de soportes similares al soporte 1 implica las siguientes etapas:

(1)

depositar una capa de liberación soluble sobre un sustrato plano;

(2)

depositar una capa de material de aluminio sobre la capa de liberación alejada del sustrato;

(3)

definir las características del soporte en la capa del material de aluminio mediante procesos fotolitográficos y procesos de grabado;

(4)

opcionalmente anodizar la capa de material de aluminio; y

(5)

extraer la capa de liberación utilizando un disolvente apropiado para obtener los soportes liberados del sustrato plano.

Se entenderá que las etapas (3) y (4) se pueden llevar a cabo en cualquier orden. Además, si es necesario, la etapa (4) se puede omitir. Opcionalmente, se puede utilizar la anodización gaseosa del material de aluminio durante la etapa (2); dicha anodización gaseosa es capaz de transmitir a los soportes 1 regiones de anodización que se extienden profundamente en los soportes 1. La capa de liberación es preferiblemente polimetil metacrilato (PMMA) u otro tipo de material adecuado, por ejemplo, una resistencia óptica tal y como se utiliza en la microfabricación de semiconductores convencionales; la capa de liberación se elige de manera que muestra propiedades que permiten que la capa de material de aluminio se mantenga en su lugar con respecto al sustrato plano durante las etapas (3) y (4). Cuando se utiliza PMMA, un disolvente adecuado comprende acetona y/o metil isobutil cetona (MIBK).

En referencia a la figura 2, se muestra un procedimiento de detección de características genéticas en forma de un bioensayo indicado generalmente por 6. El bioensayo 6 comprende dos experimentos de unión indicados por agrupaciones moleculares diferentes entre sí expuestas tal y como se ilustran en la figura. El ensayo 6 comprende una pluralidad de soportes, siendo cada soporte similar al soporte 1. Además, el ensayo 6 se genera mediante la mezcla de suspensiones de grupos escogidos de soportes activos 1. Cada soporte activo 1 con un código de barras 2 específico correspondiente tiene asociado con el mismo una molécula de información única 7, por ejemplo una sonda de ácido nucleico o PNA asociada con el mismo, que se une a y/o interacciona con un tipo específico de molécula de muestra 8 detectada durante el posterior análisis de caracterización genética. Las moléculas de información 7 se utilizan con un significado genérico en lugar de limitarse al significado de una molécula en su sentido físico o químico. Las moléculas de información 7 se pueden unir a los soportes 1 antes o después de que los soportes 1 se liberen de un sustrato plano correspondiente utilizado durante su fabricación. El recubrimiento mejorado de las moléculas de información 7 sobre los soportes 1 se consigue mediante la unión de las moléculas 7 a los soportes 1 después de su liberación de su sustrato de fabricación plano asociado. Los marcadores emisores de señales, por ejemplo un marcador 9, son preferiblemente marcadores fluorescentes. Sólo los soportes con moléculas de información 7 que se han unido a la molécula de muestra 8 con característica genética detectada emitirán fluorescencia. El marcador fluorescente 9 que está unido a la molécula de muestra 8 detectada e indirectamente a la molécula de información 7 provoca esta fluorescencia, indicada por 10. La molécula de muestra 8 preferiblemente comprende materia para la detección de características genéticas. La molécula de muestra 8 se marca preferiblemente con los marcadores emisores de señales 9 antes de ser introducida en el bioensayo 6, concretamente un fluido, preferiblemente una solución líquida y más preferiblemente una solución líquida que incluye agua. Alternativamente, los marcadores emisores de señales 9 se pueden introducir en la solución líquida antes de añadirse a la muestra a caracterizar genéticamente. El resultado de la prueba se mide mediante el grado de fluorescencia de los diferentes tipos de soporte 1. La intensidad fluorescente de los marcadores emisores de señales 9 cuantifica el nivel de moléculas de muestra detectadas 8 con las características genéticas presentes en el bioensayo 6. Los experimentos en los que se prefiere una indicación de reacción binaria sí/no sólo requieren la determinación de si los soportes 1 en el bioensayo 6 son o no fluorescentes.

Las moléculas de información 7 unidas a los soportes 1 se utilizan preferiblemente en experimentos para detectar moléculas de muestra con características genéticas específicas en realizaciones diferentes de la presente invención, por ejemplo las moléculas 7 pueden ser:

(a)

moléculas de ácidos nucleicos y/o PNA para el análisis de expresión de genes;

(b)

moléculas de ácidos nucleicos y/o PNA para el análisis de Polimorfismos de un Solo Nucleótido (SNP);

(c)

moléculas de ácidos nucleicos y/o PNA para el ensayo de ácidos nucleicos;

(d)

moléculas de ácidos nucleicos y/o PNA para la asociación de fármacos con diana; o

(e)

moléculas de ácidos nucleicos y/o PNA para el para farmacogenómica.

Se entenderá que las moléculas de información 7 no se limitan a de (a) a (e) anteriores y pueden comprender un amplio rango de compuestos capaces de ser diferenciados e identificados de manera única. Un ejemplo de un compuesto adecuado es un fragmento de unión a ADN y más preferiblemente una proteína de unión a cadena única. Todas las moléculas de este amplio rango y/o sondas se pueden unir a soportes fabricados mediante las etapas (1) a (5) anteriores antes o después de realizar las operaciones fotolitográficas o la liberación de los soportes 1 del sustrato plano. Las moléculas de información 7 se unen preferiblemente a sólo una cara del soporte 1; alternativamente, las moléculas 7 cubren preferiblemente el soporte 1 de manera total o parcial.

Las moléculas 7 se pueden disponer para unirse sólo débilmente a los soportes 1; dicha unión débil se consigue mediante la disposición de la superficie de aluminio (11) en un estado no tratado cuando se incuba en una solución líquida, por ejemplo una solución acuosa. Mediante la modificación de la superficie 11 de los soportes 1 o las moléculas de información 7, dicha unión se puede mejorar selectivamente. La anodización de la superficie de unión 11 de los soportes 1 es una manera de proporcionar dicha mejora. Los procedimientos de desarrollo de superficies porosas en el aluminio son conocidos en la técnica. Asimismo, los procesos para sellar dichas superficies porosas también son conocidos. El Solicitante ha explotado dicho conocimiento para desarrollar un proceso relativamente sencillo para desarrollar una superficie absorbente que tiene una porosidad y profundidad controladas con bastante precisión. Dichas superficies porosas son capaces de unirse de forma óptima a las moléculas de ácidos nucleicos o PNA. La utilización de un sistema avidina-biotina es otro enfoque para mejorar la unión entre los soportes 1 y sus moléculas de información 7 asociadas. La superficie 11 del soporte 1 también se puede tratar con un material polimérico, tal como silano y/o biotina, para mejorar adicionalmente las propiedades de unión. Los soportes 1 tienen preferiblemente silano unido mediante calor a sus superficies 11. La unión de moléculas enlazadoras, por ejemplo sistema sándwich de avidina-biotina, a las moléculas de información 7 mejora adicionalmente sus propiedades químicas de unión
molecular.

Dicha unión mejorada es importante, ya que permite que las moléculas de sondas 7 se unan fuertemente a la superficie 11 de los soportes durante la fabricación a la vez que se mantiene la unión débil no específica de moléculas diana fluorescentes 8 durante las pruebas. Además, dicha unión mejorada se consigue preferiblemente mediante enlaces covalentes entre la superficie de unión 11 del soporte 1 y la molécula de información 7. Los enlaces covalentes evitan que las moléculas de información 7 se desenganchen de los soportes 1 y provoquen un ruido de fondo molesto en el bioensayo 6 durante el análisis. Se ha hallado que es importante lavar los soportes activos 1, teniendo dichos soportes moléculas de información 7 unidas a los mismos, después de la unión para eliminar cualquier exceso de moléculas de información 7 que podría aumentar el ruido en el bioensayo 6 durante el análisis. La discriminación de las pruebas se mejora por tanto a través de una mejor proporción de la señal con respecto al ruido.

Tal y como se ha descrito anteriormente, cada código de barras diferente 2 fabricado sobre los soportes 1 se asocia con una correspondiente molécula de información 7 única. El código de barras 2 se almacena preferiblemente en los soportes 1 como una serie de agujeros que utilizan esquemas de codificación similares a los que se encuentran en sistemas de códigos de barras convencionales, por ejemplo tal y como se utiliza para marcar productos en almacenes comerciales al detalle. Dicho código permite la utilización de la tecnología de lectura existente para identificar los códigos de barras 2 de los soportes 1, disminuyendo de este modo la inversión inicial al adoptar la tecnología según la presente invención.

A continuación se describirán los sistemas de lectura para usar con el bioensayo 6 y soportes asociados.

El Solicitante ha desarrollado dos clases de sistemas de lectura. Éstos se basan en células de flujo para el manejo de los soportes 1 y en el desarrollo de la imagen de soportes 1 depositados.

Se puede utilizar un sistema de lectura basado en flujos, similar en la construcción a un citómetro de flujo, para aspirar miles de soportes 1 por segundo, leyendo de este modo y de manera simultánea el código de barras 2 de cada soporte 1 y los resultados de su resultado de prueba asociado. El resultado de prueba se mide como un resultado binario de sí/no o mediante el grado de fluorescencia 10. Alternativamente, se puede utilizar un sistema de lectura plano, en el que:

(a)

los soportes 1 están depositados sobre un sustrato plano; y a continuación

(b)

se utilizan microscopía de fluorescencia y el procesado de imágenes asociado para leer los códigos de barras de los soportes y los resultados de sus pruebas asociadas.

Las realizaciones de los sistemas de lectura basados en flujo y el sistema de lectura plano se describirán a continuación con mayor detalle haciendo referencia a las figuras 3, 4, 5 y 6.

En referencia a la figura 3, se muestra un lector de células de flujo indicado generalmente por 30. El lector 30 comprende un tubo de flujo 31 que tiene un extremo contracorriente y un extremo corriente abajo. En el extremo contracorriente, se incluye en el tubo 31 una boquilla de inyección 33 en comunicación de fluidos con una zona de focalización asociada 32, estando la zona 32 situada fuera del tubo 31. La zona 32 se estrecha donde contacta con la boquilla 33. Además, la boquilla 33 comprende en su extremo remoto en el tubo 31 una abertura de salida 43.

En el extremo corriente abajo, el lector 30 comprende una unidad de medición indicada por 35 para soportes de lectura 1 comunicados en la operación en un flujo de fluidos desde la boquilla 33 en el extremo contracorriente hasta el aparato de medida 35 en el extremo corriente abajo. El aparato 35 incluye una zona de lectura 34, una unidad de lectura 37, una fuente de luz 38, una unidad de detección 40, una unidad de emisión de señales 39 y una unidad de procesamiento 36. La unidad de emisión de señales 39 es preferiblemente una fuente fluorescente.

La operación del lector 30 se describirá inicialmente como una visión general.

Se introduce en la zona de focalización 32 un bioensayo 6, por ejemplo un líquido que comprende una pluralidad de soportes 1 dispersados en el mismo. Además, se genera un flujo de fluido 45, por ejemplo agua filtrada, a lo largo del tubo 31 en una dirección desde el extremo contracorriente hacia el extremo corriente abajo. Los soportes 1 en la zona de focalización 32 son forzados, por el perfil de estrechamiento de la zona 32, a alinearse en una formación de filas tal y como se ilustra en la figura. Los soportes 1 se expulsan desde la abertura de salida 43 y se arrastran por el fluido 45 a lo largo del tubo 31 hasta la zona de lectura 34 y finalmente la sobrepasan. Cuando uno o más de los soportes 1 entran en la zona de lectura 34, la luz de la fuente 38 ilumina los mencionados uno o más soportes 1, de manera que aparece la visión de una silueta en la unidad de lectura 37. La unidad de lectura 37 genera una correspondiente señal de silueta que se comunica a la unidad de procesamiento 36 para el posterior procesado de la imagen para determinar el código de barras 2 de los soportes 1. La unidad emisora de señales 39 también ilumina la zona 34 con radiación que tiene una longitud de onda seleccionada para inducir fluorescencia en uno o más de los soportes activos 1. La unidad de detección 39 detecta cualquier fluorescencia producida en la zona 34 y genera una correspondiente señal de fluorescencia que es recibida posteriormente por la unidad de procesamiento 36. Para cada soporte 1 transportado a través de la zona 34, la unidad de procesamiento 36 está programada para determinar el código de barras 2 del soporte 1 con su correspondiente magnitud de fluorescencia. Además, la unidad de procesamiento 36 también está conectada a una base de datos asociada que relaciona el código de barras 2 con una prueba proporcionada por sus moléculas de información asociadas 7.

Preferiblemente, el fluido 45 que fluye en la operación a lo largo del tubo 31 es un líquido. Alternativamente, el fluido 45 puede ser un gas a presión reducida en relación a la boquilla 33, de manera que el líquido que transporta los soportes 1 a la abertura de salida 43 se vaporiza en la abertura 43, ayudando de esta manera a lanzar los soportes 1 en el tubo 31. Aunque es más fácil establecer un régimen de flujo laminar en el tubo 31 cuando el fluido que fluye por el mismo es un líquido, el flujo gaseoso a través del tubo 31 ofrece potencialmente un rendimiento de los soportes 1 extremadamente rápido e interrogación asociada en la zona 34.

A continuación se describirá con detalle el diseño y la operación del lector 30.

El lector 30 está diseñado para provocar que los soportes 1, concretamente micro-marcadores, fluyan a lo largo de una región central de un tubo 31 a través de la zona de interrogación definida 34. Mediante la utilización de una configuración de fluido envolvente 41 acelerado y la boquilla de inyección 33, los soportes 1 inyectados en la región central del tubo 31 se someten a un efecto de focalización hidrodinámica 42 que provoca que todos los soportes 1 se alineen longitudinalmente, concretamente axialmente, y pasen a través de un punto focal bien definido 44 en la zona de interrogación 34 corriente abajo desde una abertura de salida 43. En el tubo 31, existe un flujo laminar de un fluido de lectura 45 que se mezcla con la solución de bioensayo 6 que entra en el tubo 31 a través de la boquilla de inyección 33. La distancia entre la abertura de salida 43 y la zona de interrogación 34 debe ser suficientemente larga para disipar cualquier turbulencia provocada por la boquilla de inyección 33. Esta longitud suficiente permite un flujo sustancialmente laminar del flujo de lectura 45 y, por tanto, proporciona a los soportes 1 un movimiento no oscilante pasado el punto focal 44. Si es necesario, la boquilla 33 puede estar dispuesta con una disposición radialmente simétrica de tubos metálicos de alimentación de la zona de focalización 32 para obtener un perfil de velocidad más simétrico en el interior del tubo 31. Un perfil de velocidad 61 incluido en la figura 3 proporciona una ilustración de la velocidad del flujo de fluido sustancialmente laminar en el tubo 31; la velocidad de fluido aumenta desde una región central del tubo 31 hacia las superficies periféricas interiores del tubo 31. En una región de superficie de contacto próxima a las superficies periféricas del tubo 31, la velocidad del fluido se reduce progresivamente hasta sustancialmente cero en la superficie interior del tubo 31.

Antes de entrar en el tubo 31, los soportes 1 pasan a través de la zona de focalización 32 que está operativa para disponer los soportes 1 para la inyección en el tubo 31. Los soportes 1 se transportan a través del tubo 31 a la zona de interrogación 34 donde son interrogados por la unidad de medición 45 cuando están en el punto focal 44. Preferiblemente, los soportes 1 utilizados en el sistema de lectura basado en flujo 30 tienen moléculas de información 7 unidas a por lo menos dos superficies principales opuestas 11 de los soportes 1.

La fuente de luz 38 emite luz que pasa a través de la zona de lectura 34 e ilumina el soporte 1 en el punto focal 44. Preferiblemente, la fuente de luz 38 emite luz en un plano A-A que es sustancialmente perpendicular a la dirección del flujo de bioensayo 45 y de dos direcciones radiales diferentes, teniendo las direcciones radiales preferiblemente una separación angular entre ellas, por ejemplo con una separación angular entre ellas de aproximadamente 45º. Dicha disposición de iluminación del soporte 1 en el punto focal 44 permite la identificación de los soportes 1 independientemente de su posición rotacional a lo largo de su eje longitudinal. La unidad de lectura 37, localizada sustancialmente en una cara opuesta de la zona de interrogación 34 en relación a la fuente de luz 38, lee la luz que pasa a través de uno o más soportes 1 en el punto focal 44. La unidad de lectura 37 está en comunicación óptica con los soportes cuando pasan a través de la zona de interrogación 34. Se utiliza una característica en forma de calificación en un extremo de cada soporte 1 para indicar a la unidad de lectura 37 cómo interpretar la información de lectura. Esto permite la lectura del soporte 1 desde cualquier dirección a lo largo de su eje longitudinal. La calificación también es susceptible de ser utilizada para aumentar el número de posibles códigos de barras en un soporte 1 para que supere ampliamente los 100.000. Por ejemplo, la utilización de cuatro calificaciones diferentes en grupos de soportes 1 separados es capaz de aumentar el número de combinaciones de identificación de soportes hasta aproximadamente 400.000. Una característica alternativa para indicar cómo deben leerse los códigos de información es empezar cada bloque con ceros y finalizar los bloques con unos o viceversa. Las alternativas adicionales de estas características preferiblemente datos de corrección de errores, comprobaciones del bit de paridad y/o corrección de errores posteriores, mejoran de esta manera la fiabilidad de la prueba.

En la operación, la unidad emisora de señales 39 emite radiación, por ejemplo luz fluorescente, que provoca que los soportes 1 que han reaccionado con las moléculas de muestra 8 y el marcador emisor de señales 9 emitan la radiación fluorescente correspondiente 10. La unidad de detección 40 mide la magnitud de la intensidad de la radiación fluorescente 10 que es emitida por los marcadores de señales activados 9 en los soportes 1. Esta intensidad indica el grado de reacción que se puede extrapolar para determinar la cantidad de molécula de muestra reactiva 8 presente en la muestra de bioensayo 6 con características genéticas. A continuación, la unidad de procesamiento 36 evalúa la información del código de barras 2 detectado de los soportes 1 medidos por la unidad de lectura 37 y hasta qué punto los soportes 1 han emitido una señal 10 detectada por la unidad de detección 40. A continuación, la información se verifica con la información correspondiente en una base de datos que comprende una información preprogramada que une los códigos de barras 2 específicos y las moléculas de información específicas 7.

Una vez se ha leído un número suficiente de soportes 1, la unidad de procesamiento 36 de la unidad de medición 35 calcula los resultados de las pruebas asociadas con los soportes 1. Este número suficiente está preferiblemente entre 10 y 100 copias de cada tipo de soporte 1; este número es preferible para llevar a cabo un análisis estadístico sobre los resultados de la prueba. Por ejemplo, un análisis estadístico, tal como el cálculo de medias y el cálculo de desviaciones estándar se puede llevar a cabo para la fluorescencia 10 asociada con cada tipo de molécula de información 8 presente. La unidad de procesamiento 36 también controla las unidades de lectura y detección 37, 40, de manera que cada soporte individual 1 sólo es analizado una vez. También podría ser posible analizar sólo los soportes 1 fluorescentes 10 que pasan a través del lector de flujos 30 para disminuir la cantidad de información procesada.

En la figura 4, se muestra un proceso de incubación 46 que comprende las etapas de:

(a)

colocación de los soportes 1 en un sustrato plano 49, por ejemplo un chip, portaobjetos o micromatriz de vidrio, para proporcionar un sustrato 48 cargado con el correspondiente soporte, e

(b)

interrogación del sustrato 48 cargado con el soporte utilizando una unidad de medición plana 35 tal como se ilustra en la figura 3 y se ha descrito previamente.

El proceso de incubación 46 implica la mezcla de los soportes 1, que llevan moléculas de información 7 adheridas, con una muestra que comprende moléculas 8 con características genéticas en una solución de bioensayo líquida 6. A continuación, los soportes 1 se depositan en el sustrato plano 49 y se pueden secar posteriormente para generar el sustrato 48 cargado con el soporte. A continuación, la unidad de medición 35 mide el nivel de fluorescencia 10 y también el código de barras 2 de los diferentes soportes 1 del sustrato 48 cargado con el soporte. Normalmente, todos los soportes 1 sobre los sustratos 48 cargados se analizan para verificar la calidad total del experimento. En los casos en los que podría haber un interés en ahorrar tiempo y/o capacidad de procesamiento, el software de la unidad de procesamiento 36 se puede configurar preferiblemente para analizar sólo los soportes 1 que emiten una señal 10, por ejemplo a través de un marcador de señal fluorescente 9, indicando que ha tenido lugar una interacción con las moléculas con características genéticas 8. El análisis del sustrato 48 cargado utilizando la unidad de medición plana 35 tiene una buena relación coste-efectividad, es fácil de llevar a cabo y es una manera adecuada de multiplicar la capacidad de análisis para un número de muestras de bajo a medio en el intervalo de, por ejemplo, menos de una decena a varios miles de soportes en cada sustrato 48.

En la figura 5 se ilustra un sistema de lectura plano e indicado en general por 62. En el lector 62, los soportes 1 se depositan, concretamente se depositan de manera fija o se depositan en un líquido, sobre el sustrato 49 plano transmisivo de la luz. Preferiblemente, el sustrato plano 49 está fabricado de un polímero, material basado en vidrio o en silicio, por ejemplo un portaobjetos de microscopio, y más preferiblemente está en forma de una micromatriz. A continuación, se utiliza la unidad de medición 35, dispuesta para llevar a acabo microscopía de fluorescencia convencional, para analizar de forma sistemática el sustrato 49 placado sobre el soporte. Los trayectos preferidos 60 para la interrogación sistemática del sustrato 49 se muestran en la figura 6a y 6b. La figura 6a es una representación de un régimen de interrogación de tipo meandro, mientras que la figura 6b es una representación de un régimen de interrogación de tipo espiral. Existen naturalmente muchos otros trayectos 60 posibles evidentes para un experto en la materia, por ejemplo el movimiento del sustrato 49 en una dirección opuesta a la del trayecto 60, o el movimiento del sustrato en un trayecto diagonal con meandros. Sin embargo, los regímenes de las figuras 6a, 6b son eficaces para conseguir una mayor velocidad de lectura del soporte 1. Preferiblemente, una placa base 50 accionada por un motor de paso que soporta y transporta el sustrato 49 se utiliza para mover el sustrato 49 mientras la unidad de medición 35 se mantiene estacionaria. Se rastrean las posiciones de los soportes 1 de manera que sólo se analizan una vez.

La unidad de lectura 37 de la unidad de medición plana 35 para el procesado de imágenes se utiliza para capturar imágenes digitales de cada campo del sustrato 49 al que los soportes 1 se han fijado. Las imágenes digitales obtenidas de esta manera corresponden a la luz transmitida a través del sustrato 49 y la placa base 50 y, a continuación, a través de los soportes 1 se obtienen con los soportes 1 una visión de silueta; dichas imágenes de silueta de los soportes 1 se analizan mediante la unidad de lectura 37 en combinación con una unidad de procesamiento 55. El código de barras 2 asociado con cada soporte 1 se identifica, por tanto, a partir de su perfil de luz transmitida por la unidad de lectura 37. La unidad emisora de señales 39 genera una señal fluorescente, la cual hace que los marcadores 9 en los soportes 1 que han interaccionado con las moléculas con características genéticas 8 tengan fluorescencia 10. Una unidad de detección 40 detecta la magnitud de la fluorescencia 10 de soportes 1 activados para identificar el grado de reacción. La señal fluorescente 10 integrada sobre la superficie 11 de los soportes 1 activados se registra en asociación con el código de barras 2 de identificación para construir grupos de datos susceptibles de un análisis estadístico.

La unidad de procesamiento 55 está conectada a la fuente de luz 38, la unidad de señales 39, la unidad de lectura 37, y la unidad de detección 40 y a una pantalla 56. Además, la unidad de procesamiento 55 comprende un sistema de control para controlar la fuente de luz 38 y la unidad de señal 39. La silueta de luz y las señales fluorescentes 10 de los soportes 1 pasan a través de un montaje óptico 51, por ejemplo un montaje que comprende una o más lentes y/o uno o más espejos, hacia la unidad de detección 40 y la unidad de lectura 37. Se utiliza un espejo 52 para dividir las señales ópticas en dos trayectos y se utilizan filtros ópticos 53, 54 para filtrar las señales ópticas no deseadas en base a su longitud de onda. Alternativamente, la fuente de luz 38 y la unidad de señales 39 se pueden conectar y desconectar a intervalos, por ejemplo de forma alternada entre ellas. Las señales se reciben de la unidad de lectura 37 y la unidad de detección 40, se procesan y se presentan los resultados de los correspondientes análisis estadísticos en una pantalla 56. Se requieren cantidades similares de cada tipo de soporte 1 para obtener un análisis estadístico óptimo de los experimentos. Dicho análisis estadístico es bien conocido en la técnica.

La realización preferida del procedimiento bioquímico de detección de una o más características genéticas utiliza los soportes 1 con los códigos de barras 2 descritos previamente. El procedimiento comprende varias etapas que se pueden llevar a cabo en diversos órdenes diferentes y se describirán a continuación con más detalle.

Las moléculas de información 7 se unen a por lo menos una superficie principal 11 de los soportes 1 para permitir la detección de materia potencial con características genéticas 8 en una muestra. A continuación, los soportes 1 con por lo menos un tipo de código de barras 2 se suspenden en un fluido 6 para obtener una matriz tridimensional en la que los soportes 1 están sumergidos en el fluido 6. La matriz tridimensional permite una muy buena cinética de reacción. La cantidad de los diferentes tipos de soportes 1 suspendidos en el fluido 6 depende del rendimiento requerido de las pruebas, pero podrían ser cientos, miles o incluso millones. La cantidad de los mismos tipos de soportes 1 suspendidos en el fluido 6 depende entre otras cosas de la calidad del análisis estadístico y la facilidad del análisis.

La muestra a analizar, que potencialmente contiene la materia con características genéticas 8, se añade al fluido 6 antes o después de que los soportes 1 se hayan suspendido en el fluido. Los marcadores emisores de señales 9 también se añaden al fluido 6. Estos marcadores emisores de señales 9 se utilizan para indicar la interacción, por ejemplo, el enlace entre las moléculas de información 7 en los soportes 1 y la materia con características genéticas 8 buscada en la muestra analizada. Existen muchas maneras diferentes de añadir los marcadores emisores de señales 9 al fluido 6. Por ejemplo, se pueden añadir al fluido 6 por separado, se pueden unir a la materia con características genéticas 8 a analizar antes de añadir la muestra al fluido 6, o pueden unirse a la molécula de información 7 antes o después de su unión a los soportes 1. Existen muchas maneras diferentes de que los marcadores emisores de señales 9 indiquen la interacción entre las moléculas de información 7 y la materia con características genéticas 8 en la muestra analizada.

Una de dichas maneras es que una señal, tal como fluorescencia o luz de otra longitud de onda (color), se active por el marcador emisor de señales 9 si existe interacción entre una molécula de información 7, una materia con características genéticas 8 que se complementa, y el marcador emisor de señales 9. Alternativamente, los marcadores emisores de señales 9 se activan antes de cualquier interacción con la materia con características genéticas 8. Cuando existe una interacción entre la molécula de información 7 y la materia con características genéticas 8 el marcador emisor de señales 9 activo se libera de otras moléculas que desactivan su señal. Esto daría lugar a una detección que es opuesta a las descritas anteriormente, es decir, la ausencia de una señal indica que ha tenido lugar una reacción en un soporte en, por ejemplo, un experimento de sí/no. De forma similar, un descenso en la señal fluorescente 10 puede ser un indicador de la cantidad de la materia con características genéticas 8 presente en la muestra analizada introducida en el fluido 6.

Se analiza el fluido 6 que contiene los soportes 1 con las moléculas de información 7, la muestra a analizar 8 y los marcadores emisores de señales 9 utilizando una unidad de detección 40 y una unidad de lectura 37. La unidad de lectura 37 lee el código de barras 2 de por los menos aquellos soportes 1 con moléculas de información 7 que han reaccionado con la materia con características genéticas 8 en la muestra analizada. También puede ser preferible leer los códigos de barras 2 de todos los soportes 1 como un control de calidad de un experimento múltiple. La unidad de detección 40 detecta la ausencia o presencia de señales de interacción 10 de los marcadores emisores de señales 9. En un tipo alternativo de procedimiento de ensayo bioquímico se puede utilizar más de una señal en cada soporte indicando la presencia de dos o más características genéticas 8 en la muestra analizada. Esto significaría que dos o más moléculas de información 7 diferentes se unieron al mismo soporte 1. En tal caso, los marcadores emisores de señales 9 emitirían una señal diferente 10 dependiendo de la materia con características genéticas 8 que se une a las moléculas de información 7. Otra metodología preferida utilizada para la detección de características genéticas, tal como genotipos diferentes, es utilizar la señal combinada de dos o más soportes 1 con diferentes códigos de barras 2 para indicar la presencia de la característica genética. Las combinaciones de señales podrían ser, por ejemplo, un soporte activo A y un soporte pasivo B, soportes A y B activos, o un soporte B pasivo y un soporte A activo, indicando cada combinación diferente de soportes qué tipo de característica genética se detecta en el fluido.

Entre los usos a los que se dirige el ensayo bioquímico para detectar una o más características genéticas se incluyen la expresión de genes, análisis de SNPs y ensayos de ácido nucleicos. Estos usos de los procedimientos de bioensayo son adecuados para su uso en el campo de la asociación de fármacos con diana, farmacogenómica y el diagnóstico.

Se entenderá que se pueden llevar a cabo modificaciones en las realizaciones de la presente invención descritas anteriormente sin apartarse del alcance de la invención tal y como se define en las reivindicaciones que se acompañan.

Claims (17)

1. Procedimiento bioquímico de detección de una o más características genéticas, utilizando dicho procedimiento soportes (1) cuya dimensión más grande (3) es inferior a 250 \mum y en el que cada soporte (1) incorpora un medio de identificación secuencial (2), comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(a) unir una molécula de información (7) a una superficie principal (11) de cada soporte (1);

(b) suspender los soportes (1) con la molécula de información asociada (7) en un fluido;

(c) añadir una muestra (8) a analizar al fluido;

(d) colocar el fluido que comprende sus soportes (1) asociados y la muestra (8) sobre un sustrato (49) para su posterior interrogación;

(e) detectar las señales de interacción de por lo menos uno de los soportes (1) en el fluido utilizando un medio de detección de señales (40); y

(f) leer el medio de identificación secuencial (2) de los soportes (1) que tienen una señal de interacción utilizando un medio de lectura (3), detectando de este modo por lo menos una de dichas una o más características genéticas (8),

caracterizado por el hecho de que

(g) la molécula de información (7) es capaz de interaccionar con por lo menos una de dichas una o más características genéticas; y

(h) el medio de identificación secuencial (2) es un código de barras e incorpora totalmente por lo menos una de las características de orientación espacial y características de corrección de errores para ayudar al medio de lectura (3) a determinar las identidades de los soportes (1).

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el procedimiento incluye además una etapa de oxidación de los soportes (1) antes de la unión de moléculas de información asociadas (7) a los mismos.

3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por el hecho de que uno de los soportes (1) con moléculas de información asociadas y la muestra (8) se añade al fluido antes, después o simultáneamente de que el fluido se coloque sobre el sustrato (49), en que la etapa (c) se lleva a cabo antes, después o simultáneamente con la etapa (b), y que la etapa (f) se lleva a cabo antes o después de la etapa (d).

4. Procedimiento según las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado por el hecho de que el procedimiento incluye además una etapa de utilización de una unidad de medición (35) para detectar las señales de interacción y para leer los códigos de barras (2), estando dispuesta la unidad de medición (35) para detectar las señales de interacción y para la lectura de los códigos de barras (2) sustancialmente de forma simultánea, comprendiendo la unidad de medición (35) el medio de detección y de lectura (37, 40) para interrogar los soportes (1).

5. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que los marcadores emisores de señales (9) se añaden al fluido, dispuestos dichos marcadores emisores (9) para emitir las señales de interacción cuando las moléculas de información (7) se unen a moléculas en la muestra que muestran una o más características genéticas.

6. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que el procedimiento comprende además una etapa de lectura del fluido a lo largo de un trayecto predeterminado (60) a lo largo del sustrato (49) utilizando una unidad de medición (35) dispuesta para detectar y leer los soportes (1), dispuesto dicho trayecto (60) para recibir sustancialmente todo el fluido.

7. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por el hecho de que el procedimiento comprende además una etapa de interrogación de soportes (1) individuales sólo
una vez.

8. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que el fluido, comprendiendo dicho fluido los soportes (1) con moléculas de información (7) asociadas y la muestra que incluye moléculas susceptibles de mostrar por lo menos una característica genética (8) potencial, se pasa a través de una zona de interrogación (34) de una unidad de medición (35) mediante un medio de focalización para alinear y separar los soportes (1) antes de la interrogación.

9. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por el hecho de que una unidad de medición (35) verifica la información de lectura y detección de los soportes (1) con una base de datos que incluye información preestablecida que une los códigos de barras específicos (2) con las moléculas de información específicas (7).

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de que los soportes (1) están recubiertos con un promotor de unión en una o más de sus superficies principales (11) para facilitar la unión de moléculas a los mismos.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado por el hecho de que el promotor de unión es por lo menos uno entre silano y avidina-biotina.

12. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por el hecho de que el fluido incluye una solución líquida.

13. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por el hecho de que una o más características genéticas que se detectan es el análisis de expresión de genes y los tipos específicos de moléculas de información (7) que se unen a los soportes (1) son moléculas de ácido nucleico y/o ácido nucleico de péptido.

14. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por el hecho de que una o más características genéticas que se detectan es la detección/evaluación de Polimorfismos de un Solo Nucleótido (SNPs) y los tipos específicos de moléculas de información (7) que se unen a los soportes (1) son moléculas de de ácido nucleico y/o ácido nucleico de péptido.

15. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por el hecho de que una o más características genéticas que se detectan es el ensayo de ácidos nucleicos y los tipos específicos de moléculas de información (7) que se unen a los soportes (1) son moléculas de información de ácido nucleico y/o PNA.

16. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por el hecho de que una o más características genéticas que se detectan es para el ensayo de asociación de fármacos con diana y los tipos específicos de moléculas de información (7) que se unen a los soportes (1) son moléculas de información de ácido nucleico y/o PNA.

17. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por el hecho de que una o más características genéticas que se detectan es para el ensayo de farmacogenómica y los tipos específicos de moléculas de información (7) que se unen a los soportes (1) son moléculas de información de ácido nucleico y/o PNA.