ES2283795T3

ES2283795T3 - Derivado de la piridina opticamente activo y un medicamento que lo contiene.

Info

Publication number: ES2283795T3
Application number: ES03743829T
Authority: ES
Inventors: Toshiki Murata; Sachiko Sakakibara; Takashi Yoshino; Hiroki Sato; Yuji Koriyama; Noriko Nunami; Megumi Yamauchi; Keiko Fukushima; Rolf Grosser; Kinji Fuchikami; Kevin Bacon; Timothy Lowinger
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2002-03-14
Filing date: 2003-03-03
Publication date: 2007-11-01
Anticipated expiration: 2023-03-03
Also published as: DE60312494D1; PE20040242A1; JP2003277383A; UY27719A1; US20050215547A1; WO2003076447A1; AR038950A1; HN2003000098A; EP1487842B1; AU2003215624A1; CA2478942A1; US20090054424A1; JP2005526074A; US7375103B2; TW200403247A; DE60312494T2; EP1487842A1

Abstract

Una (-)-7-[2-(ciclopropilmetoxi)-6-hidroxifenil]-5-[(3S)-3-piperidinil]-1, 4-dihidro-2H-pirido[2, 3-d][1, 3]oxazin-2-ona ópticamente activa de fórmula (I): o una sal del mismo.

Description

Un derivado de piridina ópticamente activo y un medicamento que lo contiene.

Descripción detallada de la invención Campo técnico

La presente invención se refiere a (-)-7-[2-ciclopropilmetoxi)-6-hidroxifenil]-5-[(3S)-3-piperidinil]-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-2-ona, a una de sus sales, y a preparaciones farmacéuticas que las contienen. La (-)-7-[2-(ciclopropilmetoxi)-6-hidroxifenil]-5-[(3S)-3-piperidinil]-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-2-ona de la presente invención inhibe la actividad I\kappaB cinasa \beta (IKK-\beta o IKK-beta), inhibiendo así la actividad del factor nuclear kappa B (NF-\kappaB), y se puede usar para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades asociadas a la actividad NF-\kappaB, en particular para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

Técnica anterior

El factor nuclear kappa B (NF-\kappaB) pertenece a una familia de complejos del factor de trascripción homo- y hetero-diméricos muy relacionados compuesta de diversas combinaciones de la familia de polipéptidos Rel/NF-\kappaB. El NF-\kappaB y miembros relacionados de la familia están involucrados en la regulación de más de 50 genes relacionados con las respuestas inmunitaria e inflamatoria ((Barnes P. J., Karin M (1997) N Engl J Med 336, 1066-1071) y (Baeuerle P. A., Baichwal V. R. (1997) Adv Immunol 65, 111-137)). En la mayoría de tipos celulares, el NF-\kappaB está presente como un heterodímero que comprende una subunidad de 50 kDa y de 65 kDa (p50/RelA). El heterodímero está secuestrado en el citoplasma en asociación con el inhibidor de la familia de proteínas del NF-\kappaB (I\kappaB) para mantenerse en estado inactivo. La familia de proteínas I\kappaB enmascara la señal de traslocación nuclear del NF-\kappaB. Tras la estimulación de las células con diversas citocinas (por ejemplo, TNF-\alpha, IL-1), ligando de CD40, lipopolisacárido (LPS), oxidantes, mitógenos (por ejemplo, éster de forbol), virus y muchos otros, las proteínas I\kappaB se fosforilan en restos de serina específicos, poli-ubiquitinados, y a continuación se degradan a través de la vía dependiente del proteasoma. Liberado del I\kappaB, el NF-\kappaB es capaz de traslocarse hacia el núcleo donde se une de manera selectiva a secuencias génicas potenciadoras específicas. Entre los genes regulados por el NF-\kappaB están muchos que codifican para mediadores pro-inflamatorios, citocinas, moléculas de adhesión celular, y proteínas de fase aguda. La expresión de varias de estas citocinas y mediadores, en cambio, puede dar lugar a una activación adicional del NF-\kappaB a través de mecanismos autocrinos y paracrinos.

Hay una amplia evidencia disponible que sugiere un papel central del NF-\kappaB en muchos trastornos inflamatorios incluyendo la inflamación de las vías respiratorias y el asma ((Yang L. y col., J Exp Med 188 (1998), 1739-1750), (Hart L. A. y col., Am J Respir Crit Care Med 158 (1998), 1585-1592), (Stacey M. A. y col., Biochem Biophys Res Commun 236 (1997), 522-526) (Barnes P. y Adcock I. M., Trends Pharmacol Sci 18 (1997), 46-50)).

Además, se ha demostrado que los glucocorticoides, que son con mucho el tratamiento más eficaz para el asma, inhiben la inflamación de las vías respiratorias interactuando directamente con e inhibiendo la actividad de los factores de trascripción NF-\kappaB y del péptido activante-1 (AP-1) ((Barnes P. (1997) Pulmon Pharmacol Therapeut 10, 3-19) y (Dumont A. y col., (1998) Trends Biochem Sci 23, 233-235)).

En general, la inhibición de la activación del NF-\kappaB da como resultado unos efectos antiinflamatorios potentes similares o superiores a aquellos obtenidos con esteroides. En consecuencia, la inhibición del NF-\kappaB debe mejorar los síntomas inflamatorios típicos del asma; rinitis alérgica; dermatitis atópica; urticaria; conjuntivitis; catarro primaveral; artritis reumatoide; lupus eritematoso sistémico; psoriasis; colitis diabrótica; síndrome de respuesta inflamatoria sistémica; sepsis; polimiositis; dermatomiositis; poliarteritis nodosa; enfermedad del tejido conjuntivo mixto; síndrome de Sjoegren; gota, y similares.

Además, varios estudios insinúan que el NF-\kappaB desempeña un papel esencial en la transformación neoplástica. Por ejemplo, el NF-\kappaB está asociado con la transformación celular in vitro e in vivo como resultado de la sobreexpresión, amplificación, reordenamiento, o traslocación de genes (Mercurio, F., y Manning, A. M. (1999) Oncogene, 18: 6163-6171). En ciertas células tumorales linfoides humanas, los genes de los miembros de la familia NF-\kappaB se reordenan o amplifican. Su posible implicación en la patología del cáncer también se describe en Mayo, M. W., Baldwin A. S. (2000) Biochemica et Biophysica Acta 1470 M55-M62. Mayo M. W. y col., describe la inhibición del
NF-\kappaB que da como resultado el bloqueo de la iniciación y/o progresión de ciertos cánceres, particularmente el cáncer
colorrectal.

Por último, el NF-\kappaB también puede estar involucrado en la regulación de la muerte de células neuronales. Se ha demostrado que el NF-\kappaB se activa y promueve la muerte celular en isquemia cerebral focal (Nature medicine Vol. 5 Nº 5, May 1999).

Investigaciones exhaustivas durante los últimos años condujeron a la identificación de un complejo I\kappaB cinasa (IKK) como el responsable de la fosforilación de la I\kappaB inducida por señales ((Mercurio, F., y Manning, A. M. (1999) Current Opinion in Cell Biology, 11: 226-232), (Mercurio, F., y Manning, A. M. (1999) Oncogene, 18: 6163-6171), (Barnkett, M., y Gilmore T. D. (1999) Oncogene 18, 6910-6924), (Zandi, E., y Karin, M., (1999) 19: 4547-4551), (Israel, A., (2000) Trends in CELL BIOLOGY. 10: 129-133), y (Hatada, E. N, y col., (2000) Current Opinion in Immunology, 12: 52-58)). Este complejo es lo más probablemente el sitio de integración de todos los estímulos diferentes que conducen a la activación del NF-\kappaB. El complejo IKK (peso molecular 700-900 kDa) está compuesto de diversas proteínas incluyendo dos cinasas del I\kappaB homólogas, denominadas IKK-\alpha e IKK-\beta, una cinasa aguas arriba, la NIK que induce el NF-\kappaB, una proteína de andamiaje denominada IKAP, que se une junto a las tres cinasas, y una subunidad reguladora IKK-\gamma, que preferentemente interactúa con la IKK-\beta.

La IKK-\beta es una serina-treonina cinasa de 756 aminoácidos que presenta una identidad del 52% a, y el mismo dominio estructural que, la IKK-\alpha ((Mercurio F. y col., (1997) Science 278, 860-866), (Woronicz J. D. y col., (1997) Science 278, 866-869), (Zandi E. y col., (1997) Cell 91, 243-252). La IKK-\beta forma homodímeros y heterodímeros con la IKK-\alpha in vitro y en células, respectivamente. La IKK-\beta también interactúa con la IKK-\gamma, IKAP, NIK e I\kappaB\alpha. La IKK-\beta fosforila a la I\kappaB\alpha y a la I\kappaB\beta en restos de serina específicos con la misma eficacia (Li J. y col., (1998) J Biol Chem 273, 30736-30741), (Zandi E., Chen Y., Karin M. (1998) Science 281, 1360-1363). La IKK-\beta muestra una actividad cinasa constitutiva superior comparada con la IKK-\alpha. Esto es coherente con los datos que sugieren que la sobreexpresión de la IKK-\beta activa la trascripción de un gen informador dependiente del NF-\kappaB con una mayor eficacia comparada con la IKK-\alpha. Se ha demostrado que la IKK-\beta se activa en diversas líneas celulares o células humanas frescas en respuesta a diversos estímulos incluyendo el TNF-\alpha, IL-1\beta, IL-1\beta, LPS, la co-estimulación de anti-CD3/anti-CD28, la proteína cinasa C y la calcineurina, la estimulación del receptor de células B/ligando de CD40, y vanadato. La IKK-\beta se activa en sinoviocitos del tipo fibroblasto (FLS) aislados a partir del sinovio de pacientes que padecen artritis reumatoide o artrosis (Zandi E. y col., (1997) Cell 91, 243-252), (O'Connell M. A. y col., (1998) J Biol Chem 273, 30410-30414), (Kempiak S. J. y col., (1999) J Immunol 162, 3176-3187). Además, la IKK-\beta se puede activar mediante las cinasas aguas arriba estructuralmente relacionadas MEKK-1 y NIK, más probablemente a través de la fosforilación de restos de serina específicos dentro del bucle T (bucle de activación) y mediante ciertas isoformas de la proteína cinasa C ((Nakano H. y col., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 3537-3542), (Lee F. S. y col., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 9319-9324), (Nemoto S. y col., (1998) Mol Cell Biol 18, 7336-7343), (Lallena M. J. y col., (1999) Mol Cell Biol 19, 2180-2188)). Se ha demostrado que un mutante catalíticamente inactivo de la IKK-\beta inhibe la activación del NF-\kappaB mediante el TNF-\alpha, IL-1\beta, LPS, estimulación del anti-CD3/anti-CD28 ((Mercurio F. y col., (1997) Science 278, 860-866), (Woronicz J. D. y col., (1997) Science 278, 866-869)). Se observaron los mismos efectos cuando se sobreexpresó la MEKK1 o la NIK. Adicionalmente, mutaciones de la IKK-\beta en el bucle de activación inhibieron la señalización de la IL-1 y el TNF-\alpha (Delhase M. y col., (1999) Science 284, 309-313). Basándose en los resultados experimentales descritos anteriormente, hay una evidencia clara de una implicación fundamental de la IKK-\beta en diversas vías que dan lugar a la activación del NF-\kappaB.

En resumen, la inhibición específica de la IKK-\beta debe dar como resultado un potente efecto antiinflamatorio e inmuno-modulador in vivo con el potencial de mejorar las causas subyacentes del asma y otras enfermedades. Además, de un inhibidor de la IKK-\beta se pueden esperar efectos anti-tumorales y anti-isquémicos.

Manna y col., describen 3-ciano-2-aminopiridinas 4,6-disustituidas representadas por la fórmula general:

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1

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en la que

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(R', R'') representan (OCH_{3}, OCH_{3}), (Cl, Cl), (H, Cl), (H, Br), (H, CH_{3}), (H, OCH_{3}), (H, NO_{2}), o (H, N(CH_{3})_{2}), o

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como un agente antiinflamatorio, analgésico, y antipirético general (Eur J. Med. Chem. 34, 245-254 (1999)).

Manna y col., no describen derivados de piridina con grupos alifáticos en posición 4 del anillo piridina, ni sugiere la actividad inhibidora de los derivados de piridina conocidos anteriores sobre la IKK-\beta cinasa o el NF-\kappaB.

Se ha deseado el desarrollo de un nuevo compuesto que tenga actividades antiinflamatorias eficaces basado en una actividad inhibitoria específica y selectiva sobre la IKK-\beta cinasa.

Resumen de la invención

Como resultado de estudios exhaustivos sobre la modificación química de derivados de piridina, los autores de la presente invención han descubierto que los compuestos con la nueva estructura química relacionados con la presente invención tienen una actividad inhibitoria inesperada de la IKK-\beta cinasa excelente. Esta invención es para proporcionar la (-)-7-[2-(ciclopropilmetoxi)-6-hidroxi-fenil]-5-[(3S)-3-piperidinil]-1,4-hidro-2H-pirido [2,3-d][1,3]oxazin-2-ona con la fórmula (I):

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y sus sales.

El compuesto de la presente invención es ópticamente activo y sorprendentemente presenta una actividad inhibitoria de la IKK-\beta cinasa, actividad inhibitoria de citocinas, y actividad antiinflamatoria excelentes in vivo, incluso más potente que la modificación racémica correspondiente o su enantiómero (+)-7-[2-(ciclopropilmetoxi)-6-hidroxifenil]-5-[(3R)-3-piperidinil]-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3d][1,3]oxazin-2-ona. Por tanto, es especialmente adecuado como reactivo para inhibir la activación del NF-\kappaB y en particular para la producción de un medicamento o composición médica, que pueda ser útil para el tratamiento de enfermedades dependientes del NF-\kappaB.

Más específicamente, puesto que la (-)-7-[2-(ciclopropilmetoxi)-6-hidroxifenil]-5-[(3S)-3-piperidinil]-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-2-ona de la presente invención inhibe la actividad IKK-\beta cinasa, es útil para el tratamiento y profilaxis de enfermedades que implican la actividad del NF-\kappaB, como siguen: síntomas inflamatorios incluyendo asma; rinitis alérgica; dermatitis atópica; urticaria; conjuntivitis; catarro primaveral; artrorreumatismo crónico; lupus eritematoso sistémico; psoriasis; colitis diabrótica; síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS); sepsis; polimiositis; dermatomiositis (DM); poliarteritis nodosa (PN); enfermedad del tejido conjuntivo mixto; síndrome de Sjoegren; gota, y similares.

El compuesto de la presente invención también es útil para el tratamiento y profilaxis de enfermedades como la isquemia y tumores, puesto que son enfermedades que también están relacionadas con la actividad IKK-\beta cinasa y del NF-\kappaB.

El compuesto de la presente invención se puede preparar combinando diversos procedimientos conocidos. En algunas formas de realización, uno o más de los sustituyentes, tales como el grupo amino, grupo carboxilo, y grupo hidroxilo de los compuestos usados como materiales de partida o intermedios se protegen de manera ventajosa mediante un grupo protector conocido por aquellos expertos en la materia. Los ejemplos de grupos protectores se describen en "Protective Groups in Organic Synthesis (2ª Edición)" de Greene y Wuts.

El compuesto con la fórmula (II):

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(en la que -OX representa un grupo hidroxilo o un grupo hidroxi protegido por un grupo protector apropiado (por ejemplo, bencilo, metoxibencilo, y sililo)) se hace reaccionar con un aldehído con la fórmula (III):

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(en la que X' representa H o un grupo protector incluyendo, por ejemplo, un alcoxicarbonilo tal como etoxicarbonilo, butoxicarbonilo terciario o similares: u otros sustituyentes que se pueden convertir fácilmente a H mediante procedimientos convencionales)

(IV)CNCH_{2}COOR^{1}

(en la que R^{1} es CR^{11}R^{12}R^{13}, en la que R^{11}, R^{12} y R^{13} son cada uno independientemente alquilo C_{1-6} o arilo),

y una sal de amonio tal como acetato de amonio para obtener el compuesto representado mediante la fórmula (V):

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en la que

X, X', y R^{1} son como se ha definido anteriormente.

La reacción se puede llevar a cabo sin disolvente o en un disolvente, incluyendo por ejemplo, éteres, tales como dioxano, y tetrahidrofurano; hidrocarburos aromáticos tales como benceno, tolueno y xileno; nitrilos tales como acetonitrilo; amidas tales como dimetilformamida (DMF) y dimetilacetamida; sulfóxidos tales como dimetilsulfóxido, y otros. La temperatura de reacción normalmente es, pero no limitada, de 50ºC aproximadamente a 200ºC aproximadamente. La reacción se puede llevar a cabo durante, normalmente, 30 minutos a 48 horas y preferentemente de 1 a 24 horas. Los compuestos con la fórmula general (II), (III), (IV), y una sal de amonio tal como acetato de amonio pueden estar disponibles comercialmente, o se pueden preparar mediante el uso de técnicas conocidas.

A continuación, el resto -COO-R^{1} del compuesto (V) se convierte en -CH_{2}-OH con el uso de un procedimiento de reducción de ésteres convencional usando un agente reductor tal como hidruro de litio y aluminio, borohidruro de litio, e hidruro de bis(2-metoxietoxi)aluminio y sodio (etapa 1). A continuación el compuesto (VI) se convierte en el compuesto (VII) mediante procedimientos de ciclación convencionales usando por ejemplo, fosgeno, difosgeno y trifosgeno (etapa 2). Los grupos protectores en -OX y -NX' en el compuesto (VII) se pueden retirar mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, tratamiento con ácidos para dar el compuesto (VIII) (etapa 3). La separación del isómero quiral del compuesto (VIII) dio el compuesto (I). Esta separación del isómero quiral se lleva a cabo, por ejemplo, mediante cromatografía líquida usando una columna quiral constituida por un aminoácido ópticamente activo, un azúcar u otros, preferentemente con HPLC o un procedimiento de recristalización usando un ácido orgánico ópticamente activo tal como ácido (-)-di-p-toluoil-L-tartárico.

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El compuesto (I) también se puede obtener cuando la etapa de separación quiral se realiza antes de cualquiera de la etapa 1, etapa 2 o etapa 3

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Las sales típicas de los compuestos presentados mediante la fórmula (I) incluyen sales preparadas mediante la reacción de los compuestos de la presente invención con un ácido mineral u orgánico, o una base orgánica o inorgánica. Tales sales son conocidas como sales de adición de ácido y sales de adición de base, respectivamente.

Los ácidos que forman las sales de adición de ácido incluyen ácidos inorgánicos tales como, sin limitación, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico y similares, y ácidos orgánicos, tales como, sin limitación, ácido p-toluensulfónico, ácido metanosulfónico, ácido oxálico, ácido p-bromofenilsulfónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido acético, y similares.

Las sales de adición de base incluyen aquellas procedentes de bases inorgánicas, tales como, sin limitación, hidróxido de amonio, hidróxidos de metales alcalinos, hidróxidos de metales alcalino-térreos, carbonatos, bicarbonatos, y similares, y bases orgánicas, tales como, sin limitación, etanolamina, trietilamina, tris(hidroximetil)aminometano, y similares. Los ejemplos de bases inorgánicas incluyen, hidróxido sódico, hidróxido de potasio, carbonato de potasio, carbonato sódico, bicarbonato sódico, bicarbonato de potasio, hidróxido de calcio, carbonato de calcio, y
similares.

El compuesto de la presente invención o una de sus sales, se puede modificar para formar alquilésteres inferiores u otros ésteres conocidos; y/o hidratos u otros solvatos. Esos ésteres, hidratos, y solvatos están incluidos en el alcance de la presente invención.

El compuesto de la presente invención se puede administrar en forma oral, tales como, sin limitación, comprimidos recubiertos normales y entéricos, cápsulas, píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, disoluciones, suspensiones, jarabes, aerosoles sólidos y líquidos y emulsiones. También se pueden administrar en formas parenterales, tales como, sin limitación, formas intravenosas, intraperitoneales, subcutáneas, intramusculares, y similares, muy conocidas por aquellos con conocimientos ordinarios en materia farmacéutica. Los compuestos de la presente invención se pueden administrar en forma intranasal mediante el uso tópico de vehículos intranasales adecuados, o a través de vías transdérmicas, usando dispositivos de administración transdérmica muy conocidos por aquellos con conocimientos ordinarios en la materia.

El régimen de dosificación con el uso del compuesto de la presente invención se selecciona por alguien con conocimientos ordinarios en la materia, en vista de una variedad de factores, incluyendo, sin limitación, la edad, peso, sexo, y condición clínica del receptor, la gravedad de la dolencia tratada, la vía de administración, el nivel de función metabólica y excretora del receptor, la forma de dosificación empleada, y el compuesto particular empleado y su sal.

El compuesto de la presente invención preferentemente se formula antes de la administración junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes son sustancias inertes tales como, sin limitación, vehículos, diluyentes, agentes aromatizantes, edulcorantes, lubricantes, solubilizantes, agentes de suspensión, aglutinantes, agentes desagregantes de comprimidos y material encapsulante.

Aún, otra forma de realización de la presente invención es una formulación farmacéutica que comprende el compuesto de la invención y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables que son compatibles con los otros principios de la formulación y no son nocivos para el receptor. Las formulaciones farmacéuticas de la invención se preparan combinando una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de la invención junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En la preparación de las composiciones de la presente invención, el ingrediente activo se puede mezclar con un diluyente, o se puede encerrar dentro de un vehículo, que puede estar en forma de cápsula, sobre, papel, u otro contenedor. El vehículo puede servir como diluyente, que puede ser un material sólido, semi-sólido, o líquido que actúa como vehículo, o puede estar en forma de comprimidos, píldoras, polvos, caramelos, elixires, suspensiones, emulsiones, disoluciones, jarabes, aerosoles, ungüentos, que contienen, por ejemplo, hasta el 10% en peso del compuesto activo, cápsulas de gelatina dura y blanda, supositorios, soluciones inyectables estériles y polvos empaquetados estériles.

Para la administración por vía oral, el ingrediente activo se puede combinar con un vehículo oral no tóxico farmacéuticamente aceptable tal como, sin limitación, lactosa, fécula, sacarosa, glucosa, carbonato sódico, manitol, sorbitol, carbonato de calcio, fosfato de calcio, sulfato de calcio, metilcelulosa, y similares; junto con, opcionalmente, agentes desagregantes tales como, sin limitación, maíz, fécula, metilcelulosa, agar, bentonita, goma de xantano, ácido algínico, y similares; y opcionalmente, agentes aglutinantes, por ejemplo, sin limitación, gelatina, goma arábiga, azúcares naturales, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, goma arábiga, tragacanto, alginato sódico, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, ceras, y similares; y, opcionalmente, agentes lubricantes, por ejemplo, sin limitación, estearato de magnesio, estearato sódico, ácido esteárico, oleato sódico, benzoato sódico, acetato sódico, cloruro sódico, talco, y similares.

En formas en polvo, el vehículo puede ser un sólido finamente dividido, que está en mezcla con el ingrediente activo finamente dividido. El ingrediente activo se puede mezclar con un vehículo que tiene propiedades aglutinantes en las proporciones adecuadas y se puede compactar en la forma y tamaño deseados para producir comprimidos. Los polvos y comprimidos preferentemente contienen entre el 1 aproximadamente y el 99% en peso aproximadamente del ingrediente activo que es la nueva composición de la presente invención. Los vehículos sólidos adecuados son carboximetilcelulosa de magnesio, ceras de bajo punto de fusión, y manteca de cacao.

Las formulaciones líquidas estériles incluyen suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires. El ingrediente activo se puede disolver o suspender en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril, un disolvente orgánico estéril, o una mezcla de agua estéril y un disolvente orgánico estéril.

El ingrediente activo también se puede disolver en un disolvente orgánico adecuado, por ejemplo, propilenglicol acuoso. Se pueden preparar otras composiciones dispersando el ingrediente activo finamente dividido en fécula acuosa o una disolución de carboximetilcelulosa sódica o en un aceite adecuado.

La formulación puede estar en una forma farmacéutica unitaria, que es una unidad físicamente discreta que contiene una monodosis, adecuada para la administración a humanos u otros mamíferos. Una forma farmacéutica unitaria puede ser una cápsula o comprimido, o una serie de cápsulas o comprimidos. Una "monodosis" es una cantidad predeterminada del compuesto activo de la presente invención, calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con uno o más excipientes. La cantidad de ingrediente activo en una monodosis se puede variar o ajustar entre 0,1 aproximadamente y 1000 mg aproximadamente o más según el tratamiento particular implicado.

Las dosificaciones orales típicas de la presente invención, cuando se usan para los efectos indicados, abarcarán entre 0,01 mg/kg/día aproximadamente y 100 mg/kg/día aproximadamente, preferentemente entre 0,1 mg/kg/día y 30 mg/kg/día, y lo más preferentemente entre 0,5 mg/kg/día y 10 mg/kg/día aproximadamente. En el caso de la administración por vía parenteral, generalmente se ha demostrado que es ventajoso administrar cantidades de 0,001 a 100 mg/kg/día aproximadamente, preferentemente de 0,01 mg/kg/día a 1 mg/kg/día. Los compuestos de la presente invención se pueden administrar en una única dosis diaria, o la dosis diaria total se puede administrar en dosis divididas, dos, tres, o más veces al día. Cuando la administración es a través de formas transdérmicas, naturalmente la administración es continua.

El efecto del presente compuesto se examinó mediante los siguientes ensayos y pruebas farmacológicas.

Ensayo inhibidor de la IKK-\beta cinasa (1) Preparación de la proteína IKK-\beta cinasa

Se generó un fragmento de ADNc que codifica el marco de lectura abierto de la IKK-\beta humana por PCR con el uso de un par de cebadores diseñados a partir de la secuencia publicada (Woronicz J. D. y col., (1997) Science 278, 866-869). Se obtuvo un molde de Quickclone cDNA (Clontech) usando el kit Elongase™ Amplification (Life Technologies). Los fragmentos de ADN generados por PCR se purificaron en gel y se subclonaron en pBluescript. El fragmento de ADNc clonado en el pBluescript se insertó en pcDNA3.1/His C KpnI/NotI, y se transfirió al pVL1393 SmaI/XbaI (Pharmingen) para construir un vector de transfección de baculovirus. A continuación, el vector junto con el baculovirus linealizado (BaculoGold™, Pharmingen) se usó para transfectar células Sf21 (Invitrogen, San Diego, Calif.). El baculovirus recombinante generado se clonó y se amplificó en las células Sf21, se cultivó en medio celular de insecto TNM-FH (Life Technologies, Inc.) suplementado con FCS al 10%, 50 g/ml de Gentamicina, Pluronic F68 al 0,1% (Life Technologies, Inc.) en forma de cultivo en suspensión (200 ml en un matraz Erlenmeyer de 1 L; 27ºC; 130 rpm). Las células Sf21 se infectaron con este virus amplificado con una multiplicidad de infección de 5 siguiendo protocolos clásicos (Crossen R, Gruenwald S (1997) Baculovirus Expression Vector System Instruction Manual, Pharmingen Corporation) y se recogieron 48 horas después. Las células se lisaron para obtener la proteína quimérica producida de la IKK-\beta cinasa fusionada con histidina (IKK-beta marcada con His).

(2) Preparación de proteínas de fusión GST-I\kappaB\alpha purificadas

Se construyó un vector de expresión que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión de GST con los restos de los aminoácidos 1 a 54 de I\kappaB\alpha bajo el control de un promotor inducible por IPTG. El vector de expresión se introdujo en E. coli y el transformante se cultivó y se lisó para obtener una proteína de fusión GST-I\kappaB\alpha. A continuación la proteína de fusión GST-I\kappaB\alpha resultante se purificó y se biotiniló para el ensayo de la cinasa.

(3) Medición de la actividad de la IKK-\beta cinasa

Se llevó a cabo el ensayo de la cinasa de IKK-\beta en un formato de 96 pocillos para probar la actividad inhibitoria de los compuestos de la presente invención. En primer lugar, se pusieron 5 \mul de un compuesto de prueba en presencia de dimetilsulfóxido al 2,5% (DMSO) en cada pocillo en una placa de 96 pocillos con fondo en U (Falcon). Para los pocillos control del ruido (BG) y la fosforilación total (TP), se pusieron 5 \mul de DMSO al 2,5%. Se diluyeron IKK-\beta recombinante (0,6 \mug/ml finales) y bio-GST-I\kappaB\alpha (1-54) (0,2 \muM final) en 25 \mul de tampón \beta de la cinasa 2X (Tris-HCl 40 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 40 mM, \beta-glicerofosfato 40 mM, p-nitro-fenilfosfato 40 mM, EDTA 2 mM, fosfato de creatina 40 mM, DTT 2 mM, Na_{3}VO_{4} 2 mM, 0,2 mg/ml de BSA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,8 mM) y se transfirieron a la placa de 96 pocillos. El bio-GST-I\kappaB\alpha (1-54) en 25 \mul de tampón \beta de la cinasa 2X sin IKK-\beta se transfirió a los pocillos BG. A continuación se añadieron 20 \mul de ATP 12,5 \muM, 62,5 \muCi/ml de [\gamma-^{33}P] ATP (Amersham Pharmacia Biotech) y la mezcla resultante se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Las reacciones de la cinasa se detuvieron mediante la adición de 150 \mul de tampón de terminación (EDTA 100 mM, 1 mg/ml de BSA, 0,2 mg de NaN_{3}). Se transfirieron 150 \mul de la muestra a una MTP blanca recubierta con estreptavidina (Steffens Biotechniche Analysen GmbH #08114E14.FWD) para capturar los sustratos biotinilados. Después de 1 hora de incubación, la radiactividad no unida se eliminó lavando los pocillos cinco veces con 300 \mul de tampón de lavado que incluye NaCl al 0,9% y Tween-20 al 0,1% (p/v) con el uso de una lavadora de placas MW-96 (BioTec). La radiactividad unida se determinó después de la adición de 170 \mul de cóctel de centelleo MicroScint-PS (Packard) usando un contador de centelleo TopCount.

Ensayo inhibidor de la Syk tirosina cinasa para la selectividad (1) Preparación de la proteína Syk

Se clonó un fragmento de ADNc que codifica el marco de lectura abierto de la Syk humana a partir del ARN total de líneas de células B de linfoma de Burkitt humanas, Raji (American Type Culture Collection), con el uso de RT-PCR. El fragmento de ADNc se insertó en pAcG2T (Pharmingen, San Diego, Calif.) para construir un vector de transferencia de baculovirus. A continuación el vector, junto con el baculovirus linealizado (BaculoGold™, Pharmingen), se usó para transfectar células Sf21 (Invitrogen, San Diego, Calif.).

El baculovirus recombinante generado se clonó y se amplificó en las células Sf21. Las células Sf21 se infectaron con este virus amplificado de titulación elevada para producir una proteína quimérica de la Syk cinasa fusionada con glutatión-S-transferasa (GST). La GST-Syk resultante se purificó con el uso de una columna de glutatión (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) según las instrucciones del fabricante. La pureza de la proteína se confirmó que era superior al 90% por SDS-PAGE.

(2) Síntesis de un péptido

A continuación, con un sintetizador de péptidos se sintetizó un fragmento peptídico de 30 restos que incluye dos restos tirosina, KISDFGLSKALRADENYYKAQTHGKWPVKW. A continuación el N-término del fragmento se biotiniló para obtener el bucle de activación (AL) del péptido biotinilado.

(3) Medición de la actividad Syk tirosina cinasa

Todos los reactivos se diluyeron con el tampón de ensayo Syk cinasa (Tris-HCl (pH 8,0) 50 mM, MgCl_{2} 10 mM, Na_{3}VO_{4} 0,1 mM, BSA al 0,1%, DTT 1 mM). Primero, se puso una mezcla (35 \mul) que incluye 3,2 \mug de GST-Syk y 0,5 \mug de AL en cada pocillo en placas de 96 pocillos. A continuación se añadió a cada pocillo 5 \mul de un compuesto de prueba en presencia de dimetilsulfóxido (DMSO) al 2,5%. A esta mezcla se le añadió ATP 300 \muM (10 \mul) para iniciar la reacción de la cinasa. La mezcla de reacción final (50 \mul) consistía en GST-Syk 0,65 nM, AL 3 \muM, ATP 30 \muM, un compuesto de prueba, DMSO al 0,25%, y un tampón de ensayo de la Syk cinasa.

La mezcla se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, y la reacción se detuvo mediante la adición de 120 \mul de tampón de terminación (Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), EDTA 10 mM, NaCl 500 mM, BSA al 0,1%). La mezcla se transfirió a placas recubiertas con estreptavidina y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente para combinar la biotina-AL a las placas. Después de lavar las placas 3 veces con solución salina Tris tamponada (TBS) (Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 138 mM, KCl 2,7 mM) que contiene Tween-20 al 0,05%, se añadieron 100 \mul de una disolución de anticuerpo constituida por Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 138 mM, KCl 2,7 mM, BSA al 1%, 60 ng/ml de anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina, 4G10 (Upstate Biotechnology), que estaba marcado previamente con europio con el kit de Amersham Pharmacia, y se incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos. Después del lavado, se añadieron 100 \mul de disolución potenciadora (Amersham Pharmacia Biotech) y a continuación se midió la fluorescencia resuelta en el tiempo con un contador multi-marcador ARVO (Wallac Oy, Finlandia) a 340 nm para la excitación y 615 nm para la emisión con un retardo de 400 ms y 400 ms de ventana.

Medición de la producción de RANTES en respuesta al TNF-\alpha en células A549 (1) Preparación de células A549

La línea celular de epitelio pulmonar humana A549 (ATCC #CCL-885) se mantuvo en medio Eagle modificado de Dulbecco (D-MEM, Nikken Biomedical Institute) suplementado con FCS al 10% (Gibco), 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, y glutamina 2 mM (medio de cultivo). Se sembraron cuarenta mil células (4\times10^{4}) (80 \mul/pocillo) en cada uno de los pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo plano (Falcon #3072). La placa se dejó en reposo durante 2 horas, así las células se adhirieron al fondo de cada pocillo. A cada pocillo se le añadió 10 \mul de vehículo (DMSO al 1%), diluciones seriadas de los compuestos de prueba en DMSO al 1%, o dexametasona 5 nM en DMSO al 1% como referencia. La mezcla (90 \mul/pocillo) se incubó durante 1 hora a 37ºC. Después de 1 hora, se añadió 1 \mug/ml de TNF-\alpha (10 \mul) en medio de cultivo a la mezcla para obtener 100 \mul de mezcla de reacción. La mezcla de reacción se cultivó durante 24 horas para estimular las células con 100 ng/ml de TNF-\alpha. También se prepararon células con vehículo sin estimulación con TNF-\alpha.

(2) Medición de la producción de RANTES

A continuación se determinó la concentración de la RANTES liberada de las células en los sobrenadantes de cada pocillo usando una técnica cuantitativa de inmunoensayo enzimático en sándwich. Primero, se pusieron 2 \mug/ml de mAc anti-huRANTES de ratón (R&D Systems, #mAb678) en tampón PBS (pH 7,4, 100 \mul) en cada pocillo de una placa NUNC fluoro de 96 pocillos (Nalge Nunc, Nueva York, EE.UU.) (200 ng/pocillo finales) y la placa se dejó en reposo durante toda la noche a 4ºC para que se recubriese con el anticuerpo. A continuación cada pocillo de la placa se lavó tres veces con 350 \mul de tampón de lavado (Tween-20 al 0,05%, NaCl al 0,85%, y Tris/HCl 25 mM pH 7,4). Se añadió tampón de bloqueo (200 \mul) que contiene BSA al 1% (Sigma 99% puro, 100 g), sacarosa al 5% (Nacalai tesque, 99% pura, 500 g), y azida al 0,02% (Nacalai tesque, 100%, 500 g) a cada pocillo y a continuación la placa se dejó en reposo durante 4 horas para estabilizar el anticuerpo que recubre la placa. A continuación, se pusieron 50 \mul de los sobrenadantes del cultivo celular preparado en (1) anteriormente en cada pocillo de una placa NUNC fluoro de 96 pocillos con anticuerpo que recubre la placa. Se usó RANTES recombinante humana (Pepro Tech, Inc. #300-06) como patrón para la determinación de la producción de RANTES (intervalo lineal entre 1 y 10 ng/ml). Se añadió mAc anti-huRANTES de ratón marcado con Eu (60 ng/ml: R&D Systems, #mAb278) (50 \mul) en PBS suplementado con BSA al 1% y Tween 20 al 0,05% a cada pocillo. Las mezclas de reacción se incubaron a temperatura ambiente durante 4 horas. Después de lavar 5 veces con tampón de lavado (Tween-20 al 0,05%, NaCl al 0,85%, y Tris/HCl 25 mM pH 7,4, 350 \mul/pocillo) con el uso de un Sera Washer (Bio-Tech, #MW-96R), se añadió la disolución potenciadora (DELFIA, #1244-405, 100 \mul/pocillo) a cada pocillo. La placa se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación moderada. Se midió la intensidad de la fluorescencia usando un fluorímetro DELFIA (Wallac). La excitación se realizó a 340 nm y la emisión se midió a 615 nm.

Medición de la producción de TNF-\alpha en respuesta al LPS en células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) (1) Preparación de PBMC

Se prepararon PBMC humanas obteniendo primera sangre de donantes sanos y aislando las células de la sangre. El aislamiento se realizó mediante el procedimiento de centrifugación en gradiente de Ficoll usando Ficoll Pacque (Pharmacia #17-1440-02). En las tres horas siguientes a la donación, se usaron las PBMC aisladas. Después de lavar tres veces con PBS, las PBMC se resuspendieron en RPMI 1640 (Nikken BioMedical Institute) suplementado con FCS al 10% (Gibco), 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, y glutamina 2 mM (medio de cultivo). Las células se sembraron (1\times10^{5} en 150 \mul/pocillo) en cada uno de los pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo plano (Falcon #3072). A cada pocillo se le añadió 20 \mul de vehículo (DMSO al 1%), diluciones seriadas de los compuestos de prueba en DMSO al 1%, o dexametasona 250 nM en DMSO al 1% como referencia. La mezcla (170 \mul/pocillo) se incubó durante 1 hora a 37ºC. Después de 1 hora, se añadió 20 ng/ml de LPS (30 \mul) en medio de cultivo a la mezcla para obtener 200 \mul de mezcla de reacción. La mezcla de reacción se cultivó durante 7 horas para estimular las células con 3 ng/ml de LPS. También se prepararon células con vehículo sin la estimulación con LPS. A continuación se recogieron los sobrenadantes de la mezcla de reacción.

(2) Medición de la producción de TNF-\alpha

Se determinó la concentración de TNF-\alpha en los sobrenadantes usando un kit DuoSet™ ELISA Development Kit (GenzymeTechne, Minneapolis, EE.UU.) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Primero, se pusieron 4 \mug/ml de Ac de ratón anti-TNF-\alpha humano en tampón PBS (100 \mul) en cada uno de los pocillos de una placa de 96 pocillos (NUNC, Maxisorp™) y la placa se dejó en reposo durante toda la noche a 4ºC para de que se recubriese con el anticuerpo. A continuación cada pocillo de la placa se lavó 5 veces con 350 \mul de tampón de lavado que contiene PBS, Tween 20 al 0,05% (Nakalai tesque) usando un Sera Washer (Bio-Tech, #MW-96R). A cada pocillo se le añadieron 300 \mul de BSA al 1% (Sigma), y sacarosa al 5% en PBS. Después de dos horas de incubación a temperatura ambiente, el tampón se desechó, y se añadieron 50 \mul de medio de cultivo. A continuación, se pusieron 50 \mul de sobrenadante del cultivo celular estimulado preparado en (1) anteriormente en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Se usó TNF-\alpha recombinante humano (Genzyme Techne) como patrón para la determinación de la producción de TNF-\alpha (intervalo lineal entre 30 y 2000 pg/ml). Las mezclas de reacción se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar 5 veces, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de anticuerpo de cabra biotinilado anti-TNF-\alpha humano (Genzyme Techne, 300 ng/ml) en BSA al 0,1%, Tween al 0,05% en PBS (reactivo diluyente), y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar 5 veces, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de peroxidasa de rábano conjugada con estreptavidina (Genzyme Techne, 1/100 en diluyente de reacción). Después de 20 minutos, cada pocillo de la placa se lavó 5 veces con tampón de lavado (350 \mul/pocillo). Se añadieron el sustrato de la peroxidasa de rábano y H_{2}O_{2} (kit de detección de peroxidasa TMBZ, SUMILON #ML-1120T) a la mezcla y la mezcla se dejó en reposo a temperatura ambiente. La reacción se detuvo después de 10 minutos añadiendo H_{2}SO_{4} 2 N. Se midió la densidad óptica a 450 nm con el uso de un lector de microplacas (Labosystems, Multiscan Multisoft). Se llevó a cabo la cuantificación de la producción
de TNF-\alpha en cada muestra por comparación de las densidades ópticas entre cada muestra y la curva patrón.

Medición de la producción de IL-2 en células T de Jurkat en respuesta a la estimulación con anticuerpos

Se midió la producción de IL-2 en células T de Jurkat (clon E6-1; ATCC # TIB-152) en respuesta a la estimulación con anticuerpos anti-CD3/anti-CD28.

(1) Preparación de anticuerpos inmovilizados

Primero, se pusieron anticuerpos anti-CD3 (400 ng/pocillo Nichirei, NU-T3 4 \mug/ml en 100 \mul de PBS de Dulbecco) en cada uno de los pocillos de una placa de 96 pocillos (Falcon #3072) y la placa se dejó en reposo durante 2 horas a temperatura ambiente para que se recubriese con el anticuerpo. A continuación cada pocillo de la placa se lavó 3 veces con 250 \mul de PBS.

(2) Preparación del cultivo de células de Jurkat

Se cultivaron células T de Jurkat en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% inactivado por calor, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina G, y 100 \mug/ml de estreptomicina (medio de cultivo). Se sembraron doscientas mil células (2\times10^{5}) (190 \mul/pocillo) en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos con fondo en U (Falcon #3077). A cada pocillo se le añadió 10 \mul de vehículo (DMSO al 0,2%), diluciones seriadas de los compuestos en DMSO al 0,2%, o ciclosporina A 25 nM en DMSO al 0,2% como referencia. La mezcla (200 \mul) se incubó durante una hora a 37ºC en un entorno humidificado de CO_{2} al 5%.

(3) Estimulación de las células

La mezcla de reacción obtenida en (2) (100 \mul) se puso en cada uno de los pocillos de una placa con el anticuerpo inmovilizado preparada en (1). A estos pocillos se le añadió anticuerpos anti-CD28 (Nichirei, KOLT-2, 6 \mug/ml en medio de cultivo de células, 50 \mul/pocillo) y 2,5 \mug/ml de anticuerpos de cabra anti-cadena kappa de ratón (Betil Laboratories, (Cat#A90-119A) 10 \mug/ml en medio de cultivo, 50 \mul/pocillo). La mezcla de reacción en cada pocillo se incubó durante 24 horas a 37ºC para estimular las células con anticuerpos anti-CD3 inmovilizados (400 ng/pocillo) y anticuerpos anti-CD28 (1,5 \mug/ml), y a continuación para entrecruzar los receptores sobre las células con anticuerpos anti-cadena kappa de ratón (2,5 \mug/ml).

(4) Medición de la producción de IL-2

A continuación se recogieron los sobrenadantes de la mezcla de reacción. Se determinó la concentración de IL-2 en los sobrenadantes usando un kit DuoSet™ ELISA Development Kit (GenzymeTechne, Minneapolis, EE.UU.) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Primero, se pusieron 2 \mug/ml de Ac anti-huIL-2 de ratón en tampón PBS (100 \mul) en cada uno de los pocillos de una placa de 96 pocillos (NUNC, Maxisorp™) y la placa se dejó reposo durante toda noche a 4ºC para que se recubriese con el anticuerpo. A continuación cada pocillo de la placa se lavó 5 veces con 350 \mul de tampón de lavado que contenía PBS, Tween-20 al 0,05% (Nakalai tesque) usando un Sera Washer (Bio-Tech, #MW-96R). A cada pocillo se le añadió 250 \mul de BSA al 1% (Sigma) en PBS, Tween-20 al 0,05% (tampón de dilución). Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente, el tampón se desechó, y se añadieron 50 \mul de medio de cultivo. A continuación, se pusieron 50 \mul de sobrenadante del cultivo celular estimulado preparado en (3) anteriormente en cada uno de los pocillos de la placa de 96 pocillos recubierta con el anticuerpo anti-huIL-2 de ratón. Se usó IL-2 recombinante humana (Genzyme Techne) como patrón para la determinación de la producción de IL-2 (intervalo lineal entre 200 y 5400 pg/ml). Las mezclas de reacción se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar 5 veces, se añadieron 100 \mul de anticuerpo biotinilado de conejo anti-huIL-2 (Genzyme Techne, 1,25 \mug/ml) en tampón de dilución a cada pocillo, y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar 5 veces, se añadieron 100 \mul de peroxidasa de rábano conjugada con estreptavidina (Genzyme Techne, 1/1000 en tampón de dilución) a cada pocillo. Después de 20 minutos, cada uno de los pocillos de la placa se lavó 5 veces con tampón de lavado (350 \mul/pocillo). Se añadieron el sustrato y H_{2}O_{2} (kit de detección de peroxidasa TMBZ, SUMILON #ML-1120T) a la mezcla y la mezcla se dejó en reposo a temperatura ambiente. La reacción se detuvo después de 10 minutos añadiendo H_{2}SO_{4} 2 N. Se midió la densidad óptica a 450 nm con el uso de un lector de microplacas (Labosystems, Multiscan Multisoft). Se llevó a cabo la cuantificación de la producción de IL-2 en cada muestra por comparación de las densidades ópticas entre cada muestra y la curva
patrón.

Producción de TNF-\alpha inducida por LPS en ratón

Ratones hembra BALB/c de ocho semanas se pusieron en dos grupos, un grupo de control y un grupo tratado. Se administró una disolución que contenía 200 \mug/ratón de LPS en solución salina fisiológica al 0,9% mediante inyección intraperitoneal (ip) a los ratones de control. Se inyectaron primero ip a los ratones del grupo tratado los compuestos de la presente invención 30 minutos antes de la inyección de LPS. Bajo anestesia con pentobarbital (80 mg/kg, ip), se recogió sangre de la cavidad venosa posterior de los ratones tratados y control 90 minutos después de la inyección de LPS en una placa de 96 pocillos que contenía una disolución de EDTA al 2%. El plasma se separó por centrifugación a 1800 rpm durante 10 minutos a 4ºC y a continuación se diluyó con cuatro volúmenes de tampón fosfato salino (pH 7,4) que contiene seroalbúmina bovina al 1%. Se determinó la concentración de TNF-\alpha en la muestra usando un kit ELISA (Pharmingen, San Diego, Calif.).

Se determinó el nivel medio de TNF-\alpha en 5 ratones de cada grupo y se calculó el porcentaje de reducción en los niveles de TNF-\alpha. Los ratones tratados presentaron un descenso significativo en el nivel de TNF-\alpha comparado con los ratones control. El resultado indica que los compuestos de la presente invención pueden reducir la actividad citocina inducida por LPS.

Producción de TNF-\alpha inducida por LPS en rata

Se usaron ratas Wistar hembra de siete semanas. Se administró intraperitonealmente (ip) un mg de LPS (lipopolisacárido) disuelto en tampón fosfato salino (pH 7,4) a las ratas. Los compuestos se dieron oralmente 60 minutos antes de la inyección de LPS. Bajo anestesia con pentobarbital (80 mg/kg, ip), se recogió sangre de la cavidad venosa posterior de las ratas 120 minutos después de la inyección de LPS y se añadió a una placa de 96 pocillos que contenía una disolución de EDTA al 2%. El plasma se separó por centrifugación a 1800 rpm durante 10 minutos a 4ºC y a continuación se diluyó con cuatro volúmenes de tampón fosfato salino (pH 7,4) que contenía seroalbúmina bovina al 1%. Se determinó la concentración de TNF-\alpha en la muestra usando un kit ELISA (Endogen, Boston,
Mass.).

Se determinó el nivel medio de TNF-\alpha en 7-8 ratas de cada grupo y se calculó el porcentaje de reducción en los niveles de TNF-\alpha. Las ratas tratadas, administradas con el compuesto, presentaron un descenso significativo en el nivel de TNF-\alpha comparado con las ratas control. El resultado indica que los compuestos de la presente invención pueden reducir la actividad citocina inducida por LPS.

Los resultados de una prueba in vitro se muestran en los Ejemplos a continuación. Los datos corresponden a los compuestos producidos por síntesis en fase sólida y así a niveles de pureza del 40 al 90% aproximadamente. El compuesto de la presente invención también presenta una selectividad excelente y una potente actividad en ensayos celulares y en ensayos in vivo. Más concretamente, el compuesto de la presente invención presenta una actividad celular el doble de potente que la correspondiente modificación racémica. Además, el compuesto de la presente invención presenta una actividad antiinflamatoria el doble de potente que la correspondiente modificación racémica en rata. Adicionalmente, se confirmó que el compuesto no es mutagénico según el test de selección de Ames.

Ejemplos

La presente invención se describirá con detalle a continuación en forma de ejemplos, pero estos no deben interpretarse de ningún modo como si definieran las imposiciones y límites de la presente invención. En los ejemplos a continuación, todos los datos cuantitativos, si no se indica l contrario, se refieren a porcentajes en peso. El espectro de masas se obtuvo usando técnicas de ionización por electropulverización (ES) (micromass Platform LC). Los puntos de fusión están sin corregir. Los datos de cromatografía líquida-espectroscopia de masas (CL-EM) se registraron en un Micromass Platform LC con una columna Shimadzu Fenomenex ODS (4,6 mm \times 30 mm) pasando una mezcla de acetonitrilo-agua (9:1 a 1:9) a 1 ml/min de la velocidad de flujo. La TLC se llevó a cabo en una placa de gel de sílice prerrecubierta (gel de sílice Merck 60 F-254). Se usó gel de sílice (WAKO-gel C-200 (75-150 \mum)) para todas las separaciones de cromatografía en columna. Todos los productos químicos eran de calidad de reactivo y se adquirieron en Sigma-Aldrich, Wako pure chemical industries, Ltd., Tokyo kasei kogyo co. Ltd.

El espectro de resonancia magnética nuclear protónica (RMN ^{1}H) se registró a 300 ó 500 MHz en un Bruker DRX-300. 500 Bruker UltraShield™ y los desplazamientos químicos se presentan en partes por millón en relación al tetrametilsilano (TMS).

Ejemplo 1 1-{2-[(ciclopropilmetil)oxi]-hidroxifenil}etanona

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A una disolución agitada de 1-(2,6-dihidroxifenil)etanona (50,0 g, 328 mmol) en acetona (1000 ml) se le añadió carbonato de potasio (227 g, 1643 mmol) y (bromometil)ciclopropano (35,1 ml, 361 mmol). La mezcla se agitó a 50ºC durante 2 días. La mezcla de reacción se filtró sobre Celite®, y a continuación el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica separada se lavó con agua y salmuera, se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se suspendió en hexano. A continuación la suspensión se agitó a 80ºC durante 30 min. La disolución se filtró y el filtrado se dejó enfriar a temperatura ambiente. El sólido blanco resultante se recogió por filtración, se lavó con hexano, y se secó a presión reducida para dar 1-{2-[(ciclopropilmetil)oxi]-6-hidroxifenil}etanona como un sólido amarillo pálido (56,3 g, rendimiento; 83%).

1-{2-(ciclopropilmetoxi)-6-[(4-metoxibencil)oxi]fenil}etanona

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A una disolución agitada de 1-{2-[(ciclopropilmetil)oxi]-6-hidroxifenil}etanona (56,3 g, 272 mmol) en acetona (1000 ml) se le añadió carbonato de potasio (188 g, 1364 mmol), cloruro de 4-metoxibencilo (40,9 ml, 300 mmol) y yoduro de tetrabutilamonio (20,2 g, 54,6 mmol). La mezcla se agitó a temperatura de reflujo durante toda la noche. La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente, se filtró sobre Celite®, y a continuación el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica separada se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se concentró a presión reducida. A continuación el sólido blanco resultante se recristalizó en etanol, se recogió por filtración, se lavó con etanol, y se secó a presión reducida para dar 1-{2-(ciclopropilmetoxi)-6-[(4-metoxibencil)oxi]fenil}etanona como un sólido blanco (79,2 g, rendimiento; 89%).

2-amino-4-[1-(terc-butoxicarbonil)-3-piperidinil]-6-{2-(ciclopropil-metoxi)-6-[(4-metoxibencil)oxi]fenil}nicotinato de terc-butilo

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Una mezcla de 1-{2-(ciclopropilmetoxi)-6-[(4-metoxibencil)oxi]fenil}etanona (10,00 g, 30,638 mmol), 3-formil-1-piperidincarboxilato de terc-butilo (13,069 g, 61,275 mmol), terc-butilcianoacetato (8,650 g, 61,275 mmol), y acetato de amonio (6,902 g, 91,913 mmol) en dioxano (10 ml) se agitó a 90ºC durante toda la noche. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (100 ml). A la mezcla se le añadió cloranilo (1,507 g, 6,128 mmol), y se agitó a temperatura ambiente. Después de 1,5 horas, se añadió ácido ascórbico (1,079 g, 6,128 mmol) a la mezcla. Después de agitar durante 1,5 horas, la mezcla se repartió entre acetato de etilo y agua. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO_{4}, se filtró, y a continuación se concentró a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (hexano/acetato de etilo = 2/1) para dar 2-amino-4-[1-(terc-butoxicarbonil)-3-piperidinil]-6-{2-(ciclopropil-metoxi)-6-[(4-metoxibencil)oxi]fenil}nicotinato de terc-butilo como una forma parda pálida (4,9 g, 24%).

3-[2-amino-6-{2-(ciclopropilmetoxi)-6-[(4-metoxibencil)oxi]-fenil}-3-(hidroximetil)-4-piridinil]-1-piperidincarboxi- lato de terc-butilo

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A una disolución enfriada de 2-amino-4-[1-(terc-butoxicarbonil)-3-piperidinil]-6-{2-(ciclopropilmetoxi)-6-[(4-metoxibencil)oxi]fenil}nicotinato de terc-butilo (4,9 g, 7,426 mmol) en tetrahidrofurano (60 ml) se le añadió gota a gota Vitride® (10 ml) en atmósfera de argón. Se prosiguió con la agitación a 0ºC durante 1 hora. Después de inactivar con una disolución acuosa saturada de NH_{4}Cl, se añadió a la mezcla tartrato de sodio y potasio acuoso saturado, y a continuación la mezcla se agitó vigorosamente. La mezcla se extrajo con acetato de etilo, se lavó con agua y salmuera, se secó sobre MgSO_{4}, se filtró, y se concentró a presión reducida para dar 3-[2-amino-6-{2-(ciclopropilmetoxi)-6-[(4-metoxibencil)oxi]fenil}-3-(hidroximetil)-4-piridinil]-1-piperidincarboxilato de terc-butilo, que se usó para la siguiente etapa sin purificación adicional (4,38 g, rendimiento; cuantitativo).

3-(7-{2-(ciclopropilmetoxi)-6-[(4-metoxibencil)oxi]fenil}-2-oxo-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d[1,3]oxazin-5-il)-1-piperidincarboxilato de terc-butilo

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13

A una disolución enfriada (0ºC) de 3-[2-amino-6-{2-(ciclopropilmetoxi)-6-[(4-metoxibencil)oxi]fenil}-3-(hidroxi-
metil)-4-piridinil]-1-piperidin-carboxilato de terc-butilo (5,0 g, 8,478 mmol), que se obtuvo en la etapa (2) del Ejemplo 17-1, y diisopropiletilamina (4,12 ml, 25,435 mmol) en tetrahidrofurano (200 ml) en atmósfera de argón se añadió gota a gota a una disolución de trifosgeno (1,258 g, 4,239 mmol) en tetrahidrofurano (100 ml). La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente, y se prosiguió con la agitación durante 3 horas. Después de inactivar con agua, la mezcla se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica separada se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO_{4}, se filtró, y se concentró a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (hexano/acetato de etilo = 1/1) para dar 3-(7-{2-(ciclopropilmetoxi)-6-[(4-metoxibencil)oxi]fenil}-2-oxo-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-5-il)-1-piperidincarboxilato de terc-butilo como una forma blanca (3,2 g, rendimiento; 61%).

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Clorhidrato de 7-[2-(ciclopropilmetoxi)-6-hidroxifenil]-5-(3-piperidinil)-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-2-ona

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A una disolución de 3-(7-{2-(ciclopropilmetoxi)-6-[(4-metoxibencil)oxi]fenil}-2-oxo-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-5-il)-1-piperidin-carboxilato de terc-butilo (2,0 g, 3,248 mmol) en dioxano (15 ml) se le añadió HCl 4 N en dioxano (30 ml) a temperatura ambiente. Se prosiguió con la agitación durante 3 horas. Después de retirar el disolvente por evaporación, el sólido resultante se trituró con acetonitrilo, se recogió por filtración, y se lavó con acetonitrilo. El sólido se secó a presión reducida para dar clorhidrato de 7-[2-(ciclopropilmetoxi)-6-hidroxifenil]-5-(3-piperidinil)-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-2-ona como un sólido blanco (0,865 g, rendimiento; 62%).

Sal del ácido (-)-di-p-toluoil-L-tartárico de (-)-7-[2-ciclopropilmetoxi)-6-hidroxifenil]-5-[(3S)-3-piperidinil]-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-2-ona

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Una mezcla de 7-[2-(ciclopropilmetoxi)-6-hidroxifenil]-5-(3-piperidinil) 1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-2-ona (0,700 g, 1,770 mmol) y ácido (-)-di-p-toluoil-L-tartárico (0,684 g, 0,213 mmol) se disolvió en una mezcla de etanol (30 ml) y agua (3,0 ml) calentando. La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y en reposo durante toda la noche. El precipitado resultante se recogió por filtración y se lavó con etanol (85% de ee). El producto se recristalizó de nuevo en el mismo disolvente (agua al 10%/etanol) y se secó a presión reducida para dar la sal del ácido (-)-di-p-toluoil-L-tartárico de (-)-7-[2-(ciclopropilmetoxi)-6-hidroxifenil]-5-[(3S)-3-piperidinil]-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-2-ona (0,115 g, >98% de ee, rendimiento; 8%).

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Ejemplo 2 (3S)-(-)-3-(7-{2-(ciclopropilmetoxi)-6-[(4-metoxibencil)oxi]fenil}-2-oxo-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-5- il)-1-piperidincarboxilato de terc-butilo

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La separación quiral del 3-(7-{2-(ciclopropilmetoxi)-6[(4-metoxibencil)oxi]fenil}-2-oxo-1,4-dihidro-2H-pirido
[2,3-d][1,3]oxazin-5-il)-1-piperidin-carboxilato de terc-butilo se llevó a cabo usando HPLC en las siguientes condiciones: Columna: Daisel CHIRALPAK OD (Daicel Chemical Industries, Ltd.)

Tamaño de la columna: 250x20 mm ID

Eluyente: hexano/isopropanol, 60/40 (vol/vol)

Velocidad de flujo: 20 ml/min

Tiempo de retención: 31 min [isómero (+)], 45 min [isómero (-)]

El isómero (-) separado, (3S)-(-)-3-(7-{2-(ciclopropilmetoxi)-6-[(4-metoxibencil)oxi]fenil}-2-oxo-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-5-il)-1-piperidincarboxilato de terc-butilo, se obtuvo como una forma incolora.

Peso molecular: 615,73

Espectrometría de masas: 616

[\alpha]_{D} = -23,8º (CHCl_{3}, c = 1,035, 23ºC)

El isómero (+) separado, (3R)-(+)-3-(7-{2-(ciclopropilmetoxi)-6-[(4-metoxibencil)oxi]fenil}-2-oxo-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-5-il)-1-piperidincarboxilato de terc-butilo, se obtuvo como una forma incolora.

Peso molecular: 615,73

Espectrometría de masas: 616

[\alpha]_{D} = +22,50 (CHCl_{3}, c = 1,012, 22ºC).

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Clorhidrato de (-)-7-[2-(ciclopropilmetoxi)-6-hidroxifenil]-5-[(3S)-3-piperidinil]-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-2-ona

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A una disolución de (3S)-(-)-3-(7-{2-(ciclopropilmetoxi)-6-[(4-metoxi-bencil)oxi]fenil}-2-oxo-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-5-il)-1-piperidincarboxilato de terc-butilo (1,0 g, 1,624 mmol) en dioxano (15 ml) se le añadió HCl 4 N en dioxano (30 ml) a temperatura ambiente. Se prosiguió con la agitación durante 3 horas. Después de retirar el disolvente por evaporación, el sólido resultante se trituró con acetonitrilo, se recogió por filtración, y se lavó con acetonitrilo. El sólido se recristalizó en metanol para dar clorhidrato de (-)-7-[2-(ciclopropilmetoxi)-6-hidroxi-fenil]-5-[(3S)-3-piperidinil]-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-2-ona como un sólido blanco (0,502 g, rendimiento; 71%). La configuración absoluta para el átomo quiral se determinó con (S) mediante análisis por rayos X.

Peso molecular: 431,92

Espectrometría de masas: 396

Punto de fusión: 260ºC

[\alpha]_{D} = -21,1 (DMF, c = 0,908, 23ºC)

RMN ^{1}H (500 MHz, DMSO-d_{6}): 0,26-0,37 (2H, m), 0,51-0,63 (2H, m), 1,20-1,31 (1H, m), 1,72-1,95 (4H, m), 2,80-2,96 (2H, m), 3,17-3,37 (3H, m), 3,79-3,88 (2H, m), 5,48 (1H, d, J = 14,2 Hz), 5,53 (1H, d, J = 14,2 Hz), 6,54 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,17 (1H, t, J = 8,2 Hz), 7,77 (1H, s), 8,91 (1H, a), 9,11 (1H, a), 10,96 (1H, s), 11,62 (1H, s).

Actividad inhibitoria de la IKK-beta cinasa: CI_{50} = 4 Nm.

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Clorhidrato de (+)-7-[2-(ciclopropilmetoxi)-6-hidroxifenil]-5-[(3R)-3-piperidinil]-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-2-ona

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Según el procedimiento sintético similar anterior, se obtuvo el clorhidrato de (+)-7-[2-(ciclopropilmetoxi)-6-hidroxifenil]-5-[(3R)-3-piperidinil]-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxazin-2-ona como un sólido blanco.

Peso molecular: 431,92

Espectrometría de masas: 396

Punto de fusión: 260ºC

[\alpha]_{D} = +21,5º (DMF, c = 0,920, 25ºC)

Actividad inhibitoria de la IKK-beta cinasa: CI_{50} = 59 nM.

Claims

1. Una (-)-7-[2-(ciclopropilmetoxi)-6-hidroxifenil]-5-[(3S)-3-piperidinil]-1,4-dihidro-2H-pirido[2,3-d][1,3]oxa-
zin-2-ona ópticamente activa de fórmula (I):

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o una sal del mismo.

2. El compuesto o una sal según la reivindicación 1 que tiene una pureza óptica de al menos el 90% de exceso enantiomérico.

3. El compuesto o una sal según la reivindicación 1 que tiene una pureza óptica de al menos el 95% de exceso enantiomérico.

4. Un medicamento que comprende el compuesto, o una sal del mismo, según la reivindicación 1, 2 ó 3, como ingrediente activo.

5. Un medicamento que comprende el compuesto, o una sal del mismo, junto según la reivindicación 1, 2 ó 3, con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

6. Un inhibidor de la I\kappaB cinasa que comprende el compuesto, o una sal del mismo, según la reivindicación 1, 2 ó 3, como ingrediente activo.

7. Un agente antiinflamatorio que comprende el compuesto, o una sal del mismo, según la reivindicación 1, 2 ó 3, como ingrediente activo.

8. El agente antiinflamatorio según la reivindicación 7, siendo dicho agente eficaz para el tratamiento o la prevención de enfermedades seleccionadas del grupo constituido por asma; rinitis alérgica; dermatitis atópica; urticaria; conjuntivitis; catarro primaveral; artrorreumatismo crónico; lupus eritematoso sistémico; psoriasis; colitis diabrótica; síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS); sepsis; polimiositis; dermatomiositis (DM); poliarteritis nodosa (PN); enfermedad del tejido conjuntivo mixto; síndrome de Sjoegren; y gota.

9. Un agente inmunosupresor que comprende el compuesto, o una sal del mismo, según la reivindicación 1, 2 ó 3, como ingrediente activo.

10. Un agente para tratar la isquemia que comprende el compuesto, o una sal del mismo, según la reivindicación 1, 2 ó 3, como ingrediente activo.

11. Un agente antitumoral que comprende el compuesto, o una sal del mismo, como según la reivindicación 1, 2 ó 3, ingrediente activo.

12. Uso de un compuesto según la reivindicación 1, 2 ó 3 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.