ES2282599T3

ES2282599T3 - Metodo para detectar arnm del virus del papiloma humano.

Info

Publication number: ES2282599T3
Application number: ES03700338T
Authority: ES
Inventors: Frank Karlsen
Original assignee: Norchip AS
Current assignee: Norchip AS
Priority date: 2002-01-07
Filing date: 2003-01-07
Publication date: 2007-10-16
Anticipated expiration: 2023-01-07
Also published as: EP2267155B1; WO2003057914A3; US8420314B2; CY1106621T1; IL162722A; MXPA04006440A; WO2003057914A2; CN1639357A; EP2267155A3; US7553623B2; PT1463839E; NZ533703A; CN100422342C; US20090253124A1; ES2654909T3; US20130309658A1; EA200400919A1; ATE354677T1; BR0306723A; JP2005514038A

Abstract

Un método in vitro para el cribado de sujetos humanos con el fin de determinar su riesgo de desarrollar carcinoma cervical, método que comprende la selección del sujeto por la expresión de transcritos de ARNm del gen E6 de cada uno, y únicamente, de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 y 45 utilizando una técnica de amplificación y clasificando al sujeto en una de dos categorías de riesgo de desarrollar carcinoma cervical sobre la base de la expresión del ARNm de E6 de al menos uno de dichos tipos de HPV, en el que los individuos positivos para la expresión de dicho ARNm de E6 de al menos uno de dichos tipos de HPV son calificados como portadores de HPV integrado y son por tanto clasificados como de alto riesgo de desarrollar carcinoma cervical, mientras que los individuos negativos para la expresión de todos los ARNm de E6 son calificados como no portadores de HPV integrado y son por tanto clasificados como sin riesgo detectable de desarrollar carcinoma cervical.

Description

Método para detectar ARNm del virus del papiloma humano.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos in vitro para el cribado de sujetos humanos con el fin de determinar su riesgo de desarrollar carcinoma cervical.

Antecedentes de la invención

El carcinoma cervical es una de las enfermedades malignas más comunes en todo el mundo y es una de las causas principales de morbilidad y mortalidad entre las mujeres (Parkin, D.M., Pisani, P., Ferlay, J. (1993) Int. J. Cancer, 54: 594-606; Pisani, P., Parkin, D.M., Ferlay, J. (1993) Int. J. Cancer, 55: 891-903). En 1996 se pronosticaron 15.700 nuevos casos de cáncer cervical invasivo en Estados Unidos, y la Organización Mundial de la Salud ha calculado que la incidencia mundial anual es de 450.000 (1990). La tasa de incidencia anual difiere en las diferentes partes del mundo, variando de 7,6 por 100.000 en el Asia occidental a 46,8 por 100.000 en África del Sur (Parkin y col., 1993, ibid.).

El concepto actual del carcinoma cervical es que el mismo es una enfermedad de múltiples etapas, desarrollándose a menudo a lo largo de un periodo de 10-25 años. El carcinoma del cérvix invasivo de células escamosas está representado por penetración a través de la lámina basal e invasión del estroma o la lámina propia epitelial. El curso clínico del carcinoma cervical presenta una variación considerable. El pronostico ha sido relacionado con la etapa clínica, la implicación de nódulos linfáticos, la masa tumoral primaria, el tipo histológico, la profundidad de la invasión y la permeación linfática (Delgado, G. y col., (1990) Gynecol. Oncol., 38: 352-357). Algunas pacientes con características tumorales menos favorales tienen un desenlace relativamente bueno, mientras que otras sufren un desenlace fatal de una enfermedad inicialmente limitada. Esto muestra una clara necesidad de marcadores adicionales para caracterizar adicionalmente carcinomas cervicales recién diagnosticados, con el fin de administrar una terapia adaptada al riesgo (Ikenberg, H. y col., Int. J. Cancer, 59: 322-6, 1994).

La epidemiología del cáncer cervical ha mostrado una fuerte asociación con patrones religiosos, maritales y sexuales. Casi 100 estudios caso-control han examinado la relación entre el HPV y la neoplasia cervical y casi todos han encontrado asociaciones positivas (monografías de la IARC, 1995). La asociación es potente, consistente y específica para un número limitado de tipos víricos (Muñoz, N., Bosch, F.X. (1992) HPV and cervical neoplasia: review of case-control and cohort studies. IARC Sci. Publ., 251-261). Entre los estudios más informativos, se han observado fuertes asociaciones con el ADN de HPV 16 con una consistencia notable para cáncer invasivo y lesiones CIN de grado alto, descartando la posibilidad de que esta asociación pueda ser explicada por el azar, sesgo o confusión (monografías de la IARC, 1995). Pruebas indirectas sugerían que el ADN de HPV detectado en las células cancerosas es un buen marcador del papel de la infección por HPV en las etapas tempranas de la carcinogénesis. Se ha descrito una relación dosis-respuesta entre un incremento de la carga vírica y el riesgo de carcinoma cervical (Muñoz y Bosch, 1992, ibid.). En algunas series más grandes hasta un 100% de los tumores eran positivos para HPV, pero la existencia de carcinomas cervicales negativos para el virus está todavía en debate (Meijer, C.J. y col. (1992) Detection of human papillomavirus in cervical scrapes by the polymerase chain reaction in relation to cytology: possible implications for cervical cancer screening. IARC Sci. Publ., 271-281; Das, B.C. y col., (1993) Cancer, 72: 147-153).

Los tipos de HPV más frecuentes encontrados en carcinomas cervicales de células escamosas son HPV 16 (41%-86%) y 18 (2%-22%). Además, se han encontrado también HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 54, 56, 58, 59, 61, 66 y 68 (monografías de la IARC, 1995). En la Conferencia Internacional HPV2000 de Barcelona, se definieron HPV 16, 18, 31 y 45 como de alto riesgo, mientras que HPV 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59, 68 fueron definidos como de riesgo intermedio (Keerti, V., Shah. P71). Los 13 HPVs de alto riesgo más los de riesgo intermedio son a menudo referidos todos juntos como tipos de HPV asociados a cáncer.

Varios estudios han explorado el papel potencial del análisis de HPV en el cribado de cáncer cervical (ver Cuzick y col., A systematic review of the role of human papillomavirus testing withing a cervical screening programme. Health Tecnol. Assess., 3: 14, 1999).

Reid y col. (Reid, R. y col. (1991) Am. J. Obstet. Gynecol., 164: 1461-1469) fueron los primeros en demostrar un papel para el análisis de HPV en un contexto de cribado. Este estudio se llevó a cabo en mujeres de alto riesgo procedentes de clínicas de enfermedades transmitidas sexualmente y de ginecólogos especialistas, y utilizó una hibridación de transferencia Southern (de baja rigurosidad) sensible para la detección del HPV. Participaron un total de 1012 mujeres y la cervicografía se consideró también como un posible auxiliar para la citología. Se encontraron en total 23 lesiones CIN II/III, pero solamente 12 fueron detectadas por citología (sensibilidad 52%, especificidad 92%). El análisis de HPV encontró 16 lesiones de grado alto.

Bauer y col. (Bauer, H.M. y col. (1991) JAMA, 265: 472-477) describen un estudio temprano basado en PCR utilizando cebadores MY09/11 (Manos, M. y col. (1990) Lancet, 335: 734) en mujeres jóvenes que acudieron para que les fueran realizados frotis rutinarios (estudiantes universitarias). Encontraron una tasa positiva del 46% en 467 mujeres, que era mucho más elevada que para el ensayo de transferencia de manchas (11%).

En un estudio utilizando PCR con cebadores GP5/6 (van der Brule, A.J. y col. (1990) J. Clin. Microbiol., 28: 2739-2743) van der Brule y col. (van der Brule, A.J. y col. (1991) Int. J. Cancer, 48: 404-408) mostraron una correlación muy potente entre la positividad para HPV y la neoplasia cervical según se determinó por citología. En mujeres mayores (35-55 años de edad) con citología negativa la tasa de positividad para HPV era únicamente del 3,5%, y ésta se redujo al 1,5% si se consideraban únicamente los tipos 16, 18, 31 y 33, mientras que las mujeres con carcinoma histológico in situ eran todas positivas para HPV y el 90% tenía uno de los cuatro tipos anteriores. Las mujeres con anormalidades citológicas menos graves tenían menores tasas de positividad para HPV de manera gradual, mostrándose una clara tendencia.

Roda Housman y col. (Roda Housman, A.M. y col. (1994) Int. J. Cancer, 56: 802-806) extendieron todas estas observaciones examinando a 1373 mujeres más con frotis anormales. Este estudio confirmó también una tasa de positividad creciente con la gravedad creciente de los resultados de los frotis. Observaron también que el nivel de heterogeneidad del HPV disminuía desde 22 tipos para los frotis de grado bajo hasta diez tipos de "alto riesgo" para los frotis de grado alto. Este artículo no incluía mujeres citológicamente negativas, ni tampoco ninguna enfermedad citológica confirmada histológicamente.

Cuzick y col. (Cuzick, J. y col. (1992) Lancet, 340: 112-113; Cuzick, J. y col. (1994) Br. J. Cancer, 69: 167-171) fueron los primeros en describir que el análisis del HPV proporcionaba una información útil para la clasificación de anormalidades citológicas detectadas durante un cribado aleatorio. En un estudio de 133 mujeres, remitidas para colposcopia, encontraron un valor predictivo positivo del 42%, que era similar al de la discariosis moderada. Los resultados fueron más sorprendentes para HPV 16, donde se encontró que 39 de 42 mujeres positivas para HPV 16 tenían un CIN de grado alto en la biopsia. Este estudio resaltaba la importancia de la determinación de la carga vírica y consideraba únicamente como positivos los niveles elevados de los tipos de alto riesgo.

Cox y col. (Cox, J.T. y col. (1995) Am. J. Obstet. Gynecol., 172: 946-954) demostraron un papel del análisis de HPV utilizando el sistema de Captura Híbrida (Hybrid Capture™) (DIGENE Corporation, Gaithersburg, MD, EE.UU.) para la clasificación de mujeres con frotis dudosos. Este ensayo fue realizado en 217 mujeres procedentes de un servicio de remisión universitario y se encontró una sensibilidad del 93% para CIN II/III en comparación con un 73% para citología repetida. Se encontró que una carga vírica elevada mejoraba además el funcionamiento del ensayo reduciendo los falsos positivos. Cuando se tomó como valor de corte 5 RLU, se encontró un PPV del 24% aproximadamente sin pérdida de la sensibilidad.

Cuzick y col. (Cuzick, J. y col. (1995) Lancet, 345: 1533-1536) evaluaron el análisis de HPV en el contexto de un cribado primario en 1985 mujeres que acudieron a un cribado rutinario en una clínica de planificación familiar. La sensibilidad utilizando PCR específica de tipo para los cuatro tipos comunes de HPV (75%) era superior a la de la citología (46%), y el PPV para un ensayo de HPV positivo (42%) era similar al obtenido para una discariosis moderada (43%).

WO 91/08312 describe métodos para determinar el pronóstico de individuos infectados con HPV que comprenden la medida del nivel de actividad HPV mediante la detección de transcritos de todos o de una porción de los genes E6 y/o E7 de HPV en una muestra y la comparación de las medidas de la actividad HPV con una relación previamente establecida entre la actividad y el riesgo de progresión hacia una displasia cervical grave o hacia carcinoma cervical.

WO 99/29890 describe métodos para determinar la infección por HPV basados en la medida y en el análisis de los niveles de expresión génica. En particular, WO 99/29890 describe métodos que están basados en la medida de los niveles de expresión de dos o más genes del HPV (por ejemplo E6, E7, L1 y E2 del HPV) y la comparación posterior de la tasa de expresión de combinaciones de estos genes para proporcionar una indicación de la etapa de la enfermedad basada en HPV en una paciente.

EP-A-0 662 518 (AMOCO Corp.; 12.07.1995) describe un método para detectar transcritos de ARNm de E6/E7 que son "indicadores o predictores del riesgo de progresión hacia displasia grave o carcinoma cervical" (página 2, líneas 23-32). El método de pronóstico está basado "en la asociación entre la actividad transcripcional del HPV y el riesgo de desarrollo de displasia cervical grave o carcinoma cervical" (página 2, línea 58). Este documento explica que "la expresión de los genes E6 y/o E7 de HPV 16 y 18 es importante para la transformación celular y puede ser importante para el desarrollo de CIS" (página 4, línea 40) y que "los transcritos de E6* pueden estar relacionados con el potencial oncogénico de los tipos de HPV" (página 5, línea 4). Además, describe que patrones de expresión específicos "proporcionan la base mediante la cual se utiliza el presente método para determinar el riesgo de progresión de anormalidades cervicales" (página 5, líneas 11-14).

EP-A-0 373 352 (BEHRINGWERKE AG; 20.06.1990) describe un método para la detección de ARNm de E6/E7 del HPV (Ejemplos 1-4) como indicación del potencial maligno del HPV (página 2, líneas 16-21) y proporciona una explicación sobre la asociación entre HPV y carcinoma cervical, el impacto de la integración en el genoma de E6/E7 sobre la transformación maligna y la intensa transcripción de E6/E7 en células transformadas (página 2). El método está dirigido a la detección de transcritos de E6/E7 con fin pronóstico (página 5, línea 7 y línea 34). Además, describe cebadores para amplificar el ARNm de E6/E7 (Ejemplos 4a y 4b).

WO 94 26934 A (Brown Janice, T.; Baxter Diagnostics Inc. (EE.UU.); 24.11.1994) describe un ensayo específico para determinar infecciones por HPV asociadas con displasia cervical y transformación celular a malignidad mediante la detección de transcritos de ARNm de E6/E7 de tipos de HPV de alto riesgo (página 2, líneas 23-31). El documento explica que "la expresión de E6/E7 es un diagnóstico de cáncer cervical o de estados premalignos".

Smits, H.L. y col. ("Application of the NASBA nucleic acid amplification method for the detection of human papillomavirus type 16 E6-E7 transcripts", Journal of Virological Methods, Amsterdam, Países Bajos, vol. 54, nº 1, 1995, páginas 75-81) describe un método para detectar la expresión de transcritos de ARNm de E6 de HPV en frotis cervicales mediante amplificación isotérmica por NASBA (ver el Resumen y las páginas 76-80). En ella se explica que "la detección rápida de ARN de HPV 16 podría ser potencialmente valiosa en estudios epidemiológicos o como herramienta de diagnóstico", que "la detección específica de ARN (E6/E7) permitiría la detección de infecciones víricas transcripcionalmente activas" y que "la expresión de E6 y E7 parece ser requerida para inducir y mantener el estado maligno" (página 76). El documento describe también pares de cebadores para amplificar el ARNm de E6/E7 del HPV 16.

Los presentes inventores han determinado que es posible llevar a cabo una determinación clínicamente útil de la enfermedad asociada al HPV basada únicamente en una simple determinación positiva/negativa de la expresión de transcritos de ARNm de L1 y E6 del HPV, sin requerir medidas cuantitativas precisas de los niveles de expresión ni la determinación de diferencias en los niveles de expresión de los dos transcritos. Este método es técnicamente sencillo y, en una realización preferida, es susceptible de automatización en un formato de rendimiento medio a elevado. Además, sobre la base de los resultados obtenidos, los inventores han definido un nuevo esquema de clasificación de pacientes sobre la base del riesgo de desarrollar carcinoma cervical que está relacionado con cambios moleculares relevantes para la enfermedad en el patrón de la expresión de genes del HPV y que es independiente de la clasificación CIN.

Este método comprende un método in vitro de cribado de sujetos humanos para determinar su riesgo de desarrollar carcinoma cervical, que comprende la selección por la expresión de transcritos de ARNm del gen L1 y del gen E6 del virus del papiloma humano, en el que los sujetos positivos para la expresión de ARNm de L1 y/o de E6 de longitud completa son clasificados como con riesgo de desarrollar carcinoma cervical.

Un resultado positivo en el cribado con el método está indicado por la expresión positiva de ARNm de L1 y/o ARNm de E6 en células del cérvix. La expresión positiva de cada uno de estos ARNms o de ambos ARNms es considerada como una indicación de que el sujeto tiene "riesgo" de desarrollar carcinoma cervical. Las mujeres que expresan ARNm de E6 tienen un riesgo elevado de desarrollar cambios celulares, ya que los E6 y E7 oncogénicos se unen a proteínas reguladoras del ciclo celular y actúan como activadores de la proliferación celular. La expresión clara de ARNm de E6 proporciona una indicación directa de cambios celulares en el cérvix. La expresión de ARNm de L1, con o sin la expresión de ARNm de E6, es también indicativa de la presencia de un HPV activo.

En el contexto más amplio del cribado cervical, las mujeres identificadas como positivas para la expresión de ARNm de L1 y/o E6, pueden ser seleccionadas para una investigación posterior, utilizando por ejemplo citología. Por tanto, en un nivel, el método puede proporcionar un medio técnicamente sencillo de precribado de una población de mujeres con el fin de identificar a aquellos sujetos positivos para HPV que pueden ser seleccionados para una investigación posterior.

En una realización específica, el método puede ser utilizado para clasificar sujetos en cuatro clases diferentes de riesgo de desarrollar carcinoma cervical sobre la base de la valoración positiva/negativa de la expresión del ARNm de L1 y E6.

En un aspecto adicional, el método comprende un método in vitro para el cribado de sujetos humanos con el fin de determinar su riesgo de desarrollar carcinoma cervical, que comprende la selección del sujeto por la expresión de transcritos de ARNm del gen L1 del HPV y de transcritos de ARNm del gen E6 del HPV, y la clasificación del sujeto en una de cuatro categorías de riesgo de desarrollar carcinoma cervical sobre la base de la expresión de ARNm de L1 y/o E6 de acuerdo con la clasificación siguiente:

Categoría de riesgo 1: sujetos negativos para la expresión de ARNm de L1 pero positivos para la expresión de ARNm de E6 de al menos uno de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 ó 68. Aquellos individuos positivos para la expresión de ARNm de E6 de al menos uno de los tipos de HPV 16, 18, 31 ó 33 son clasificados como de riesgo más elevado, en comparación por ejemplo con los individuos negativos para estos tipos pero positivos para la expresión de ARNm de E6 de al menos uno de los tipos de HPV 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 ó 68.

Categoría de riesgo 2: sujetos positivos para la expresión de ARNm de L1 y positivos para la expresión de ARNm de E6 de al menos uno de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 ó 68. Aquellos individuos positivos para la expresión de ARNm de E6 de al menos uno de los tipos de HPV 16, 18, 31 ó 33 son clasificados como de riesgo más elevado, en comparación por ejemplo con los individuos negativos para estos tipos pero positivos para la expresión de ARNm de E6 de al menos uno de los tipos de HPV 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 ó 68.

Categoría de riesgo 3: sujetos positivos para la expresión de ARNm de L1 pero negativos para la expresión de ARNm de E6 de los tipos de HPV asociados con cáncer (por ejemplo negativos para la expresión de ARNm de E6 de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 y 68).

Categoría de riesgo 4: sujetos negativos para la expresión de ARNm de L1 y negativos para la expresión de ARNm de E6.

En una realización preferida, la expresión positiva está indicada por la presencia de más de 50 copias del transcrito por ml (o volumen total de la muestra) y la expresión negativa está indicada por la presencia de menos de 1 copia del transcrito por ml (o volumen total de la muestra).

La clasificación anterior está basada en acontecimientos moleculares que son relevantes para el riesgo de desarrollar carcinoma cervical y es independiente del estatus CIN de los sujetos. Por tanto, este método de clasificación puede proporcionar una alternativa a la utilización de citología en el cribado rutinario de mujeres para identificar aquéllas con riesgo potencial de desarrollar carcinoma cervical. El método puede ser también utilizado como auxiliar de la citología, por ejemplo como un ensayo de confirmación para confirmar la determinación del riesgo realizada sobre la base de la citología.

Las mujeres positivas para la expresión del ARNm de E6 de alto riesgo de uno de los tipos de HPV 16, 18, 31 ó 33, pero negativas para la expresión de L1, están dentro del nivel de riesgo más elevado de desarrollar cambios celulares y anormalidades celulares graves. Esto es debido al hecho de que un resultado negativo para la expresión de ARNm de L1 es indicativo directamente de un HPV integrado, y por tanto de una mayor probabilidad de una expresión elevada y constante de E6 y E7. La integración de un virus en el genoma humano tiene también un impacto directo sobre la estabilidad de las células. La integración del HPV reduce también la posibilidad de regresión de los cambios celulares.

Las mujeres positivas para la expresión de ARNm de E6 de uno de los tipos de HPV 16, 18, 31 ó 33 y positivas para la expresión de ARNm de L1, tienen una expresión de HPV de "alto riesgo" y todavía es posible que el HPV se haya integrado. Sin embargo, el riesgo de estas mujeres no es clasificado como tan elevado como el de las mujeres que son negativas para L1 y positivas para E6, ya que existe una probabilidad razonable de que no tengan HPV integrado.

Las mujeres negativas para la expresión de ARNm de E6 de los tipos de HPV 16, 18, 31 ó 33 pero positivas para la expresión de ARNm de E6 de otro tipo de HPV, por ejemplo 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 y 68, son todavía consideradas como de "riesgo" y pueden ser por tanto situadas en las categorías de riesgo 1 ó 2 (según se definieron anteriormente) dependiendo de si son positivas o negativas para la expresión de ARNm de L1.

Las mujeres positivas para ARNm de L1 pero negativas para ARNm de E6 son clasificadas como de riesgo moderado. Puede haber tipos de HPV de alto riesgo en la muestra y la expresión de L1 es indicativa de actividad lítica. Puede haber también tipos de HPV integrados pero únicamente con virus que son poco frecuentes. Sin embargo, la detección de actividad lítica puede mostrar que la célula podrá desarrollar pronto ciertos cambios.

En el contexto más amplio del cribado cervical, el método puede ser utilizado para clasificar mujeres de acuerdo con el riesgo de desarrollar carcinoma cervical y proporcionar por tanto una base para tomar decisiones concernientes al tratamiento y/o al cribado posterior. A manera de ejemplo: mujeres dentro de la categoría de riesgo 1, particularmente las que presentan expresión positiva de ARNm de E6 de al menos uno de los tipos de HPV 16, 18, 31 ó 33, podrían ser identificadas como requeridoras de una "acción inmediata", significando conización o colposcopia, incluyendo una biopsia e histología.

Las mujeres dentro de la categoría de riesgo 2, según se definió anteriormente, podrían ser clasificadas como requeridoras de atención inmediata, significando colposcopia sola o colposcopia incluyendo una biopsia e histología.

Las mujeres dentro de la categoría de riesgo 3, según se definió anteriormente, podrían ser clasificadas como requeridoras de un nuevo análisis inmediato, significando que deben ser convocadas de nuevo para un análisis adicional con el fin de determinar la expresión de HPV ya sea inmediatamente o después de un intervalo relativamente corto, por ejemplo seis meses.

Las mujeres dentro de la categoría de riesgo 4, según se definió anteriormente, podrían ser devueltas al programa de cribado, con el fin de ser analizadas de nuevo para determinar la expresión de HPV en una fecha posterior.

En una realización adicional, el método proporciona un método in vitro para el cribado de sujetos humanos por la presencia de HPV integrado o de un genoma de HPV episómico modificado, método que comprende la selección del sujeto por la expresión de transcritos de ARNm del gen L1 y del gen E6 del virus del papiloma humano, en el cual los sujetos negativos para la expresión de ARNm de L1 pero positivos para la expresión de ARNm de E6 son clasificados como portadores de HPV integrado.

El término "HPV integrado" se refiere a un genoma de HPV que está integrado en el genoma humano.

El término "genoma de HPV episómico modificado" significa un genoma de HPV que está retenido en una célula del sujeto humano como un episoma, esto es que no está integrado en el genoma humano, y que lleva una modificación en comparación con el genoma de HPV de tipo salvaje equivalente, modificación que da lugar a la expresión constitutiva o persistente de transcritos de los genes E6 y/o E7. La "modificación" será típicamente una deleción, una multimerización o concatemerización del episoma, una reordenación del episoma, etc., que afecte a la regulación de la expresión de E6/E7.

Según se mencionó anteriormente, la presencia de HPV integrado o de un genoma de HPV episómico modificado está indicada por un resultado negativo para la expresión de ARNm de L1, junto con un resultado positivo para la expresión de ARNm de E6 en células del cérvix. Por tanto, la capacidad para predecir la presencia de HPV integrado o de un genoma de HPV episómico modificado en este ensayo, depende críticamente de la capacidad para valorar un resultado negativo para la expresión de ARNm de L1. Esto requiere una técnica de detección que tenga una sensibilidad máxima y que produzca además mínimos resultados negativos falsos. En una realización preferida, esto se consigue utilizando una técnica de amplificación y de detección en tiempo real sensible para seleccionar por la presencia o ausencia de ARNm de L1. La técnica más preferida es la amplificación por NASBA en tiempo real utilizando sondas moleculares fluorescentes ("beacons"), según está descrito por Leone y col., Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, 2150-2155. Debido a la sensibilidad de esta técnica, se minimiza la aparición de resultados falsos negativos y puede valorarse un resultado de "expresión negativa de L1" con una mayor confianza.

De acuerdo con la invención, un método de cribado de sujetos humanos por la presencia de HPV integrado o de un genoma de HPV episómico modificado puede estar basado en el cribado por la expresión de ARNm de E6 solo. Por tanto, la invención se refiere a un método in vitro para el cribado de sujetos humanos por la presencia de HPV integrado, método que comprende la selección del sujeto por la expresión de transcritos de ARNm del gen E6 del virus del papiloma humano, en particular de cada uno, y únicamente, de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 y 45 utilizando una técnica de amplificación, en el que los sujetos positivos para la expresión de ARNm de E6 de al menos de uno de dichos tipos de HPV son clasificados como portadores de HPV integrado.

Además, los individuos son clasificados como pertenecientes a una de dos categorías de riesgo de desarrollar carcinoma cervical sobre la base de una determinación "si/no" de la expresión del ARNm de E6 solo. Por tanto, en particular, la invención proporciona un método in vitro para el cribado de sujetos humanos con el fin de determinar su riesgo de desarrollar carcinoma cervical, método que comprende la selección del sujeto por la expresión de transcritos de ARNm del gen E6 de cada uno, y únicamente, de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 y 45 utilizando una técnica de amplificación, y la clasificación del sujeto en una de dos categorías de riesgo de desarrollar carcinoma cervical sobre la base de la expresión del ARNm de E6 de al menos de dichos tipos de HPV, en el cual los individuos positivos para la expresión de dicho ARNm de E6 son clasificados como portadores de HPV integrado y son por tanto clasificados como de "alto riesgo" de desarrollar carcinoma cervical, mientras que los individuos negativos para la expresión de dicho ARNm de E6 son calificados como no portadores de HPV integrado y son por tanto clasificados como "sin riesgo detectable" de desarrollar carcinoma cervical.

Los sujetos son clasificados en una de dos categorías de riesgo de desarrollar carcinoma cervical sobre la base de una determinación "si/no" de la expresión de dicho ARNm de E6 en células del cérvix. Los individuos positivos para la expresión de ARNm de E6 de al menos uno de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 y 45 son clasificados como portadores de HPV integrado o de un genoma de HPV episómico modificado y son por tanto clasificados como de "alto riesgo" de desarrollar carcinoma cervical, mientras que los individuos negativos para la expresión de dicho ARNm de E6 son calificados como no portadores de HPV integrado ni de un genoma de HPV episómico modificado y son por tanto clasificados como "sin riesgo detectable" de desarrollar carcinoma cervical.

En el contexto del cribado cervical, la clasificación de los sujetos en los dos grupos con "alto riesgo" o "sin riesgo detectable" de desarrollar carcinoma cervical proporciona una base para tomar decisiones concernientes al tratamiento y/o a un cribado posterior. Por ejemplo, los sujetos en la categoría de alto riesgo pueden ser clasificados como requeridores de un análisis adicional inmediato, por ejemplo mediante colposcopia histológica, mientras que los que están en la categoría de riesgo no detectable pueden ser remitidos de nuevo al programa de cribado a intervalos de tres o cinco años. Estos métodos son particularmente útiles para determinar el riesgo de desarrollar carcinoma en sujetos que se sabe que están infectados con HPV, por ejemplo los que dan positivo para ADN de HPV, o en sujetos que han manifestado previamente una anormalidad cervical por citología o frotis Pap. Los sujetos colocados en la categoría de "sin riesgo detectable" sobre la base de la expresión de ARNm de E6, pueden tener presente ADN de HPV, pero el resultado negativo de la expresión de E6 indica que el HPV no está relacionado con actividad oncogénica en el momento del análisis.

La presencia de HPV integrado, según indica un resultado positivo para la expresión de ARNm de E6, es en sí misma indicativa de que el sujeto tiene cambios celulares anormales en el cérvix. Por tanto, se proporciona un método que es un método in vitro para identificar sujetos humanos que tengan cambios celulares anormales en el cérvix, método que comprende la selección del sujeto por la expresión de transcritos de ARNm del gen E6 de un HPV de los enumerados anteriormente, en el que los individuos positivos para la expresión de ARNm de E6 son identificados como portadores de cambios celulares anormales en el cérvix.

El término "cambios celulares anormales en el cérvix", incluye cambios celulares que son característicos de una enfermedad más grave que las lesiones cervicales de grado bajo o que las lesiones intraepiteliales escamosas de grado bajo; incluye cambios celulares que son característicos de enfermedades de igual o mayor gravedad que la CIN de alto grado (definida como una expansión neoplásica de células transformadas), CIN (neoplasia intraepitelial cervical) III o neoplasia intraepitelial escamosa de alto grado (HSIL), incluyendo lesiones con un perfil de ADN multiploide y lesiones CIN "malignas" con valores incrementados del índice medio de ADN, un elevado porcentaje de aneuploidia de ADN y tasas que exceden 2,5c (Hanselaar y col., 1992, Anal. Cell. Pathol., 4: 315-324; Rihet y col., 1996, J. Clin. Pathol., 49: 892-896; y McDermott y col., 1997, Br. J. Obstet. Gynaecol., 104: 623-625).

La Neoplasia Intraepitelial Cervical (abreviada "CIN"), denominada también Displasia Cervical, es una condición cervical causada por el Virus del Papiloma Humano. La CIN es clasificada como I, II o III dependiendo de su gravedad. Se considera una anormalidad precancerosa, pero no un cáncer real. La forma más leve, CIN I, remite normalmente por sí misma, aunque raramente puede progresar a cáncer. Las formas más graves, CIN II y CIN III, muy a menudo permanecen igual o empeoran con el tiempo. Pueden convertirse en cáncer, pero casi nunca lo hacen si son tratadas adecuadamente.

EL HPV ha sido identificado como un agente causante del desarrollo de cambios celulares en el cérvix, que pueden dar lugar al desarrollo de cáncer cervical. Estos cambios celulares están asociados con la expresión constitutiva o persistente de las proteínas E6/E7 del genoma vírico de HPV. Por tanto, es posible concluir que aquellos sujetos en los que puede ser detectada la expresión de ARNm de E6, particularmente aquellos sujetos que presentan una expresión de E6 persistente cuando se determina a lo largo de un periodo de tiempo, manifiestan ya cambios celulares en el cérvix. Estos cambios celulares pueden tener lugar solamente en unas pocas células del cérvix y pueden no ser detectables mediante citología convencional. No obstante, con la utilización de métodos sensibles, específicos y precisos para la detección de ARNm de E6, es posible identificar a aquellos sujetos que presentan ya cambios celulares en el cérvix en un estado mucho más temprano del que sería posible utilizando el cribado citológico convencional. Esto permitirá una intervención más temprana con tratamientos encaminados a prevenir el desarrollo de carcinoma cervical.

Como resultado de la integración de HPV en el genoma o como resultado de la "modificación" en un genoma de HPV episómico modificado, se pierde el control normal de la transcripción de los oncogenes E6/E7 víricos (Durst y col., 1985, J. Gen. Virol., 66 (Pt 7): 1515-1522; Pater y Pater, 1985, Virology, 145: 313-318; Schwarz y col., 1985, Nature, 314: 111-114; Park y col., 1997, ibid.). En contraste, en lesiones premalignas y en epitelio normal infectado con HPV, los virus del papiloma predominan en formas episómicas "sin modificar" y por tanto la transcripción del oncogén puede estar ausente o estar regulada por disminución eficazmente (Johnson y col., 1990, J. Gen. Virol., 71 (Pt 7): 1473-1479; Falcinelli y col., 1993, J. Med. Virol., 40: 261-265). Se ha observado que la integración de ADN del virus del papiloma humano de tipo 16 en el genoma humano da lugar a una actividad celular/genoma más inestable, y a una estabilidad incrementada de los ARNms de E6 y E7 (Jeon y Lambert, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1654-1658). Por tanto, la integración del HPV, encontrada típicamente en cánceres cervicales pero encontrada solamente de manera poco frecuente en lesiones CIN (Carmody y col., 1996, Mol. Cell. Probes, 10: 107-116), parece ser un acontecimiento importante en la carcinogénesis cervical.

El presente método detecta la expresión de ARNm vírico de E6/E7 en el cérvix en lugar de ADN. La expresión vírica de E6/E7 en células cervicales es una determinación del riesgo de desarrollar cáncer mucho más precisa que demostrar simplemente que el virus HPV está presente. Además, la detección de transcritos de oncogenes del HPV puede ser un indicador más sensible de la implicación directa de oncogenes víricos en la carcinogénesis (Rose y col., 1994, Gynecol. Oncol., 52: 212-217; Rose y col., 1995, Gynecol. Oncol., 56: 239-244). La detección de transcritos de E6/E7 por amplificación y detección es una herramienta de diagnóstico útil para las evaluaciones del riesgo relacionado con el desarrollo de CIN y su progresión a cáncer cervical, especialmente en las pacientes infectadas por tipos de HPV de alto riesgo con ASCUS y CIN I (Sotlar y col., 1998, Gynecol. Oncol., 69: 114-121; Selinka y col., 1998, Lab. Invest., 78: 9-18).

La expresión de transcritos de E6/E7 de HPV 16/18 está correlacionada uniformemente con el estatus físico de los ADNs del HPV (Park y col., 1997, Gynecol. Oncol., Vol. 65(1), 121-9). En la mayoría de las células de carcinoma cervical, los genes E6 y E7 de virus del papiloma humano específicos son transcritos a partir de secuencias víricas integradas en los cromosomas de las células huésped (von Kleben Doeberitz y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88(4), 1411-5). La carga y la integración víricas han sido evaluadas en una serie grande de lesiones CIN (Pietsaro y col., 2002, J. Clin. Microbiol., Vol. 40(3), 886-91). Solamente una muestra contenía exclusivamente ADN de HPV 16 episómico, y esta lesión regresó espontáneamente. Se identificaron previamente 17 de 37 muestras de carcinoma cervical invasivo como contenedoras del genoma de HPV 16 completamente integrado mediante la utilización de una PCR que cubría el gen E1/E2 completo, y esto fue confirmado mediante rliPCR en 16 casos. Un caso, sin embargo, mostró un bajo nivel de ácido desoxirribonucleico episómico además de la forma integrada predominante. De las 20 muestras de carcinoma restantes que presentaban formas episómicas en los análisis previos, se encontraron 14 que contenían formas integradas utilizando rliPCR, y 4 contenían formas episómicas multiméricas (modificadas). Por tanto, en total, 31 de 37 de los carcinomas (84%) presentaban el genoma de HPV 16 integrado, mientras que no pudo detectarse la ausencia de integración (Kalantari y col., 2001, Diagn. Mol. Pathol., Vol. 10(1), 46-54).

No ha habido virtualmente ninguna observación de que existan células de carcinoma cervical sin ADN de HPV integrado o sin ADN de HPV episómico modificado (Kalantari y col., 2001; Pietsaro y col., 2002, ibid.). Se ha demostrado además que E6 y E7 pueden ser transcritos únicamente a partir de ADN de HPV integrado o episómico modificado (von Kleben Doeberitz y col., 1991, ibid.). Por tanto, los inventores suponen que la detección de la expresión de E6/E7 proporciona una indicación directa de HPV integrado o HPV episómico modificado y de una elevada actividad oncogénica, y concluyen que en un contexto clínico la detección de la expresión de E6 (E6/E7) sola es suficiente para identificar sujetos con "riesgo elevado" de desarrollar carcinoma cervical. En otras palabras, si puede detectarse la expresión de ARNm de E6/E7 en una muestra cervical, esto es indicativo directamente de anormalidades celulares en el cérvix y existe un riesgo muy elevado de desarrollar carcinoma cervical debido a la actividad persistente de los oncogenes del HPV. Por tanto, la detección de ARNm de E6/E7 en un sujeto humano indica que el sujeto tiene un riesgo muy elevado de desarrollar carcinoma cervical y debería ser sometido a un cribado adicional inmediato, por ejemplo mediante colposcopia.

Si no se detecta la expresión de ARNm de E6/E7 de HPV, el sujeto puede aún tener una infección por HPV. Sin embargo, debido a la ausencia de integración y de actividad oncogénica, puede remitir espontáneamente (según ha sido observado por Pietsaro y col., 2002, ibid.).

En un contexto clínico, la realización de métodos que se basan en el cribado por la expresión de ARNm de E6 solo, depende de manera crítica de la capacidad para calificar con confianza un resultado negativo para la expresión de ARNm de E6. Esto requiere de nuevo una técnica de detección que tenga una sensibilidad máxima, a la vez que produzca resultados falsos negativos mínimos. En una realización preferida, esto se consigue mediante la utilización de una técnica de amplificación y detección en tiempo real sensible para seleccionar por la presencia o ausencia de ARNm de E6. La técnica más preferida es la amplificación mediante NASBA en tiempo real utilizando sondas moleculares fluorescentes, según está descrito por Leone y col., Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, 2150-2155. Debido a la sensibilidad de esta técnica, la aparición de resultados falsos negativos está minimizada y un resultado de "expresión negativa de E6" puede ser calificado con mayor confianza. Esto es extremadamente importante si los ensayos van a ser utilizados en el contexto de un programa de cribado clínico.

En los métodos de la invención basados en la detección de ARNm de E6 solo, es necesario detectar únicamente HPV 16, 18, 31, 33 y 45. Se ha detectado ADN de los tipos de HPV 16, 18, 31 y 33 en más de un 87% de muestras de carcinoma cervical (Karlsen y col., 1996, J. Clin. Microbiol., 34: 2095-2100). Otros estudios han demostrado que E6 y E7 son conservados casi invariablemente en los cánceres cervicales, ya que es probable que su expresión sea necesaria para la conversión en, y el mantenimiento de, el estado maligno (Choo y col., 1987, J. Med. Virol., 21: 101-107; Durst y col., 1995, Cancer Genet. Cytogenet., 85: 105-112). En contraste con los sistemas de detección de HPV que están basados en la detección del genoma no dañado o de la secuencia del gen L1, la detección del ARNm de HPV expresado a partir del área E6/E7 puede detectar más de un 90% de las pacientes relacionadas directamente con un riesgo de desarrollar carcinoma cervical.

En la clínica, se prefieren los métodos basados en la detección del ARNm de E6 para utilización en el post-cribado, esto es en un análisis posterior de individuos que tengan un diagnóstico previo de ASCUS, CIN I o condiloma. El método puede ser utilizado para seleccionar a aquellos sujetos con un riesgo elevado de desarrollar carcinoma cervical de entre el grupo de individuos con un diagnóstico previo de ASCUS, CIN I o condiloma. ASCUS, condiloma y CIN I pueden ser se definidos como más o menos el mismo diagnóstico, debido a una reproducibilidad muy baja entre diferentes citólogos y diferentes departamentos de citología. Östör (Int. J. Gyn. Path., 12: 186-192, 1993) encontró que solamente alrededor del 1% de los casos de CIN I puede progresar a carcinoma cervical. Por tanto, existe la necesidad genuina de un método eficaz para identificar el subgrupo de individuos con ASCUS, condiloma o CIN I con un riesgo sustancial de desarrollar carcinoma cervical. Uno de los tipos de HPV 16, 18, 31 ó 33 fue detectado en el 87% de los casos de carcinoma cervical estudiados por Karlsen y col., 1996. Mediante la inclusión del HPV 45, se ha encontrado que casi el 90% de las muestras de carcinoma cervical están relacionadas con estos cinco tipos de HPV. Por tanto, calculado a partir de los datos proporcionados por Östör (Int. J. Gyn. Path., 12: 186-192, 1993) más de un 99,9% son casos detectados con ASCUS, CIN I o condiloma pasados por alto por nuestro kit HPV-Proofer.

En los métodos de la invención, se considera que la "expresión positiva" de un ARNm indica una expresión por encima del fondo. No existe un requisito absoluto de determinación cuantitativa precisa del nivel de expresión de ARNm o de una determinación precisa de los niveles relativos de expresión del ARNm de L1 y E6.

En ciertas realizaciones, los métodos de la invención pueden comprender una determinación cuantitativa de los niveles de expresión de ARNm. En una realización preferida, con el fin de proporcionar una distinción clara entre "expresión positiva" y "expresión negativa", una determinación de la "expresión positiva" puede requerir la presencia de más de 50 copias del ARNm relevante (por ml de muestra o por volumen total de muestra), mientras que una determinación de la "expresión negativa" puede requerir la presencia de menos de 1 copia del ARNm relevante (por ml de muestra o por volumen total de muestra).

Los métodos de la invención implican la selección por ARNm de E6 utilizando una técnica que sea capaz de detectar específicamente ARNm de E6 de tipos de HPV asociados al cáncer, más preferiblemente de tipos de HPV asociados al cáncer de "alto riesgo". Los métodos implican la selección por ARNm de E6 utilizando una técnica que sea capaz de detectar ARNm de E6 de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 y 45. El método detectará específicamente la expresión de ARNm de E6 de los cinco tipos. Sin embargo, las mujeres positivas para la expresión de E6 de otros tipos distintos de 16, 18, 31, 33 y 45, por ejemplo de 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 y 68 pueden tener aún "riesgo" de desarrollar carcinoma cervical. Puede llevarse a cabo la selección por la expresión de ARNm de E6 de uno o más de estos tipos de HPV, muy preferiblemente además de la selección por ARNm de E6 de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 y 45. Ciertos tipos de HPV presentan una notable distribución geográfica/poblacional.

Para evitar dudas, a no ser que se indique de otro modo, el término "ARNm de E6", según se utiliza en la presente, incluye todos los transcritos de ARNm existentes de manera natural que contienen todo o parte del marco de lectura abierto de E6, incluyendo las variantes por ayuste que tienen lugar de forma natural, e incluye por tanto transcritos que contienen adicionalmente todo o parte del marco de lectura abierto de E7 (y además marcos de lectura abiertos adicionales). Los términos "ARNm de E6/E7", "transcritos de E6/E7", etc., son utilizados indistintamente con los términos "ARNm de E6", "transcritos de E6" e incluyen también los transcritos de ARNm existentes de manera natural que contienen todo o parte del marco de lectura abierto de E6, incluyendo las variantes por ayuste existentes de forma natural, y transcritos que contienen todo o parte del marco de lectura abierto de E7. El término "expresión de oncogenes", a no ser que se indique de otro modo, se refiere también a transcritos de ARNm existentes de forma natural que contienen todo o parte del marco de lectura abierto de E6, incluyendo variantes por ayuste que tienen lugar de forma natural, y transcritos que contienen todo o parte del marco de lectura abierto de E7.

Se han descrito hasta ahora cuatro especies de ARNm de E6/E7 en células infectadas con HPV 16, a saber un transcrito de E6 no ayustado y tres transcritos ayustados denominados E6*I, E6*II y E6*III (Smotkin, D. y col., J. Virol., Marzo 1989, 63(3): 1441-7; Smotkin, D., Wettstein, F.O., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Julio 1986, 83(13): 4680-4; Doorbar, J. y col., Virology, Septiembre 1990, 178(1): 254-62; Cornelissen, M.T. y col., J. Gen. Virology, Mayo 1990, 71 (Pt 5): 1243-6; Johnson, M.A. y col., J. Gen. Virol., Julio 1990, 71 (Pt 7): 1473-9; Schneider-Maunoury, S. y col., J. Virol., Octubre 1987, 61(10): 3295-8; Sherman, L. y col., Int. J. Cancer, Febrero 1992, 50(3): 356-64). Los cuatro transcritos son todos transcritos a partir de un único promotor (p97) situado justo corriente arriba del segundo ATG del ORF de E6.

En una realización, los métodos pueden comprender la selección por transcritos de E6 que contienen todo o parte del marco de lectura abierto de E7. Esto puede ser realizado, por ejemplo, utilizando cebadores o sondas específicos para la región codificadora de E7.

En una realización adicional, los métodos pueden comprender la selección por la presencia de transcritos de E6 de "longitud completa". En el caso de HPV 16, el término "transcritos de E6 de longitud completa" se refiere a transcritos que contienen toda la región desde el nucleótido (nt) 97 al nt 880 del ORF de E6, los nt 97 y 880 inclusive. Las posiciones de los nucleótidos están numeradas de acuerdo con la nomenclatura estándar del HPV (ver Human Papillomavirus Compendium OnLine, disponible en internet o en forma impresa en la base de datos de HV, Mail Stop K710, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM 87545, EE.UU.). La detección específica de transcritos de longitud completa puede ser realizada, por ejemplo, utilizando cebadores o sondas que sean específicos para la región que está presente únicamente en los transcritos de E6 de longitud completa, y no en las variantes por ayuste. Tipos diferentes de HPV presentan patrones diferentes de expresión del ARNm de E6/E7. Los mapas de transcritos para varios tipos de HPV, incluyendo los tipos de HPV 16 y 31, que pueden ser utilizados para facilitar el diseño de sondas o cebadores para la detección de transcritos de E6/E7, están disponibles públicamente a través del Human Papillomavirus Compendium (igual que anteriormente).

En la presente se describen cebadores oligonucleotídicos de E6 que son adecuados para ser utilizados en la amplificación de regiones del ARNm de E6 de varios tipos de HPV mediante NASBA o PCR.

Los métodos que implican la selección por la expresión de ARNm de L1 pueden comprender la selección por la expresión del ARNm de L1 utilizando una técnica que sea capaz de detectar ARNm de L1 de sustancialmente todos los tipos conocidos de HPV o de al menos los tipos de HPV asociados al cáncer principales (por ejemplo, preferiblemente todos los tipos de HPV 16, 18, 31 y 33). En la presente se describen cebadores y sondas de L1 que son capaces de detectar ARNm de L1 de los tipos de HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35 y 51 en muestras cervicales.

Puede decirse que la detección de los transcritos de L1 detecta la "virulencia" del HPV, significando la presencia de actividad lítica del HPV. Puede decirse que la detección de los transcritos de E6/E7 detecta la "patogénesis" del HPV, ya que la expresión de estos ARNms es indicativa de acontecimientos moleculares asociados con el riesgo de desarrollar carcinoma.

En un estudio con 4589 mujeres fue posible detectar todos los casos excepto uno de lesiones CIN III o cáncer utilizando un método basado en el cribado por la expresión de ARNm de E6 y L1 (ver los Ejemplos acompañantes).

Los métodos anteriormente descritos pueden comprender el cribado por la expresión de transcritos de ARNm del gen p16^{ink4a} humano, además del cribado por la expresión de transcritos de L1 y/o E6 de HPV.

Un resultado positivo para la expresión del ARNm de p16^{ink4a} es considerado como una indicación adicional de riesgo de desarrollar carcinoma cervical.

El p16^{ink4a}, y los miembros de la familia relacionados, puede funcionar regulando la fosforilación y la actividad supresora del crecimiento del producto del gen del restinoblastoma (RB). Como apoyo de esto, se ha encontrado que existe una relación inversa entre la expresión de la proteína p16^{ink4a} y la presencia de RB normal en líneas de células cancerosas seleccionadas; la proteína p16^{ink4a} es detectable cuando RB es mutante, se ha eliminado o inactivado, y está notablemente reducida o ausente en líneas celulares que contienen un RB normal. Kheif y col. (Kheif, S.N. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 4350-4354, 1996), encontraron que la proteína p16^{ink4a} se expresa en células de carcinoma cervical humano que contienen un RB mutante o un RB de tipo salvaje que está inactivado funcionalmente por E7. Demostraron también que la inactivación de RB se correlaciona con una regulación por incremento de p16^{ink4a}, confirmando un bucle de retroalimentación que implica a p16^{ink4a} y RB. Milde-Langosch y col. (Milde-Langosch, K. y col. (2001) Virchows Arch., 439: 55-61) encontraron que existían correlaciones significativas entre una potente expresión de p16 y la infección por HPV 16/18 y entre una potente expresión de p16 y la expresión de los oncogenes E6/E7 de HPV 16/18. Klaes y col. (Klaes, R. y col. (2001) Int. J. Cancer, 92: 276-284) observaron una potente sobreexpresión del producto del gen p16^{ink4a} en 150 de 152 lesiones cervicales displásicas de grado alto (CIN II a cáncer invasivo), mientras que epitelio cervical normal o lesiones inflamatorias o metaplásicas no se teñían con el anticuerpo monoclonal E6H4 específico para p16^{ink4a}. Todas las lesiones clasificadas como CIN I asociadas con los tipos LR-HPV no presentaban ninguna reactividad o únicamente una reactividad focal o esporádica, mientras que todas las lesiones clasificadas como CIN I, excepto dos de las mismas, asociadas con los tipos HR-HPV presentaban una tinción potente y difusa para p16^{ink4a}.

Los métodos de selección descritos pueden ser llevados a cabo en una preparación de ácido nucleico aislado de una muestra clínica o de una biopsia conteniendo células cervicales tomadas del sujeto bajo ensayo. Las muestras adecuadas que pueden ser utilizadas como fuente de ácido nucleico incluyen (pero no exclusivamente) muestras cervicales recogidas con un bastoncillo, biopsias cervicales, rascados cervicales, biopsias/verrugas cutáneas, también tejidos incluidos en parafina y células fijadas con formalina o metanol.

La preparación de ácido nucleico para ser sometida a selección utilizando el método descrito debe incluir ARNm, sin embargo no necesita ser una preparación de ARNm poli A+ purificado, y preparaciones de ARN total o preparaciones brutas de ácido nucleico total conteniendo ARN y ADN genómico, o incluso lisados celulares brutos, son también adecuadas como material de partida para una reacción de NASBA. Esencialmente, cualquier técnica conocida en el oficio para el aislamiento de una preparación de ácido nucleico que incluya ARNm puede ser utilizada para aislar ácido nucleico de una muestra de ensayo. Una técnica preferida es el método de aislamiento de "Boom" descrito en US-A-5.234.809 y EP-B-0389.063. Esyte método, que puede ser utilizado para aislar una preparación de ácido nucleico conteniendo ARN y ADN, está basado en las propiedades de las partículas de dióxido de silicio para unirse a ácidos nucleicos en presencia del agente caotrópico tiocianato de guanidina (GuSCN).

Los métodos de la invención están basados en la determinación de transcripción activa del genoma del HPV en células cervicales. Los métodos no están limitados con respecto a la técnica de amplificación precisa utilizada para detectar la expresión del ARNm. Se conocen en el oficio muchas técnicas para la detección de secuencias específicas de ARNm y pueden ser utilizadas de acuerdo con la invención.

La expresión del ARNm es detectada por medio de una técnica de amplificación, muy preferiblemente una amplificación isotérmica tal como NASBA, la amplificación mediada por transcripción, la amplificación mediada por una señal de la tecnología del ARN, la amplificación en fase de solución isotérmica, etc. Todos estos métodos son bien conocidos en la técnica. Más preferiblemente la expresión de ARNm es detectada mediante una amplificación isotérmica en combinación con la detección del producto de amplificación en tiempo real. La combinación más preferida es la amplificación mediante NASBA, acoplada con la detección en tiempo real del producto de amplificación utilizando la tecnología de sondas moleculares fluorescentes ("beacons"), según está descrito por Leone y col., Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, 2150-2155.

Los métodos para la detección de HPV en una muestra de ensayo utilizando la técnica NASBA comprenderán generalmente las etapas siguientes:

(a) la preparación de un medio de reacción conteniendo pares de cebadores adecuados, una ADN polimerasa dirigida por ARN, una ribonucleasa que hidrolice la hebra de ARN de un híbrido ARN-ADN sin hidrolizar ARN o ADN de hebra sencilla o de doble hebra, una ARN polimerasa que reconozca dicho promotor y trifosfatos de ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos;

(b) la incubación del medio de reacción con una preparación de ácido nucleico aislado de una muestra de ensayo sospechosa de contener HPV, bajo condiciones de reacción que permitan una reacción de amplificación mediante NASBA; y

(c) la detección y/o la medida cuantitativa de cualquier producto específico del HPV de la reacción de amplificación por NASBA.

La detección del(los) producto(s) específico(s) de la reacción del NASBA (esto es copias sentido y/o antisentido del ARN diana) puede ser llevada a cabo de varias maneras diferentes. En un procedimiento, el(los) producto(s) del NASBA puede(n) ser detectado(s) con la utilización de una sonda de hibridación específica del HPV capaz de hibridar específicamente con el producto del NASBA. La sonda de hibridación puede estar ligada a una marca reveladora, por ejemplo un compuesto fluorescente, luminiscente, radiactivo o quimioluminiscente o a una marca enzimática o a cualquier otro tipo de marca conocida por las personas con experiencia habitual en la técnica. La naturaleza exacta de la marca no es crítica, pero debe ser capaz de producir una señal detectable por un medio externo, ya sea por sí misma o junto con una o más sustancias adicionales (por ejemplo el sustrato de un enzima).

Un método de detección preferido es el denominado "NASBA en tiempo real" que permite la monitorización continua de la formación del producto de la reacción del NASBA a lo largo del curso de la reacción. En una realización preferida, esto puede ser conseguido utilizando una sonda "molecular fluorescente" ("beacon") que contenga una secuencia específica del HPV capaz de hibridarse con el producto del NASBA, una secuencia oligonucleotídica que forme un dúplice troncal y un par de restos fluorescentes/amortiguadores, según se conoce en la técnica y se describe en la presente. Si la sonda fluorescente molecular es añadida a la mezcla de reacción antes de la amplificación, puede ser posible monitorizar la formación del producto del NASBA en tiempo real (Leone y col., Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, 2150-2155). Hay kits de reactivos e instrumentación disponibles comercialmente para llevar a cabo la detección mediante NASBA en tiempo real (por ejemplo NucliSens™ EasyQ System, de Organon Teknika).

En un procedimiento adicional, la tecnología de sondas fluorescentes moleculares ("beacons") puede ser incorporada al oligonucleótido cebador 2, permitiendo la monitorización en tiempo real de la reacción del NASBA sin la necesidad de una sonda de hibridación separada.

En un procedimiento adicional más, los productos de la reacción del NASBA pueden ser monitorizados utilizando una sonda de detección genérica marcada que hibride con una secuencia de nucleótidos del extremo 5' del oligonucleótido cebador 2. Esto es equivalente al sistema de detección "NucliSens™" suministrado por Organon Teknika. En este sistema, la especificidad para los productos del NASBA derivados del ARNm del HPV diana puede ser conferida por la utilización de sondas de captura específicas para el HPV que contengan oligonucleótidos sonda, según se describe en la presente, unidos a un soporte sólido tal como una microesfera magnética. Muy preferiblemente, la sonda de detección genérica marcada es la sonda de detección ECL™ suministrada por Organon Teknika. Los amplicones del NASBA son hibridados a las sondas de captura específicas para el HPV y a la sonda ECL genérica (a través de una secuencia complementaria en el cebador 2). Después de la hibridación, los complejos esfera/amplicón/sonda ECL pueden ser capturados en el electrodo magnético de un lector de ECL automático (por ejemplo el lector NucliSens™ suministrado por Organon Teknika). Posteriormente, un pulso de voltaje desencadena la reacción de ECL™.

La detección de ARNm del HPV tiene también relevancia clínica en cánceres distintos del carcinoma cervical incluyendo, por ejemplo, el carcinoma de cabeza y cuello, el carcinoma oral y de lengua, el carcinoma cutáneo y el carcinoma anal y vaginal. La detección del ARNm de HPV puede ser también muy útil en el diagnóstico de micrometástasis en los nódulos linfáticos de la parte inferior del organismo.

Los kits para utilización en la detección de transcritos de los genes L1 y E6 del HPV contienen al menos un par de cebadores adecuado para ser utilizado en la amplificación de una región de los transcritos de L1 de al menos los tipos de HPV 16, 18, 31 y 33, y preferiblemente también del HPV 45, y uno o más pares de cebadores que permitan la amplificación de una región de los transcritos de E6 de los tipos de HPV 16, 18, 31 y 33, y preferiblemente también de HPV 45.

Un "par de cebadores" significa un par de cebadores que pueden ser utilizados en combinación para amplificar una región específica del ARNm de L1 o E6 utilizando cualquier técnica conocida de amplificación de ácidos nucleicos. En las realizaciones preferidas, los pares de cebadores incluidos en el kit serán adecuados para su utilización en la técnica de amplificación mediante NASBA o en técnicas de amplificación isotérmicas similares.

Los cebadores individuales que constituyen cada par de cebadores incluido en el kit pueden ser suministrados separadamente (por ejemplo un recipiente separado para cada cebador) o, más preferiblemente, pueden ser suministrados mezclados en un único recipiente. Combinaciones de dos o más pares de cebadores pueden ser suministradas ya mezcladas en un único recipiente del kit. Puede ser conveniente suministrar dos o más pares de cebadores en un único recipiente cuando las dos o más reacciones de amplificación van a ser "multiplexadas", lo que significa realizadas simultáneamente en un único recipiente de reacción.

El(los) par(es) de cebadores adecuado(s) para ser utilizado(s) en la amplificación de una región de transcritos de E6 debería(n) facilitar la amplificación de una región del ARNm de E6 de los principales tipos de HPV asociados con cáncer 16, 18, 31, 33 y también de HPV 45. Existen varias formas diferentes mediante las cuales puede conseguirse esto.

El kit puede contener pares de cebadores separados específicos para cada uno de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 y 45. Estos pares de cebadores pueden ser suministrados en el kit en recipientes separados, o pueden ser suministrados como mezclas de dos o más pares de cebadores en un único recipiente, por ejemplo para permitir la "simultaneidad" de las reacciones de amplificación.

El kit puede contener un solo par de cebadores capaces de amplificar una región del gen E6 de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 y también del HPV 45, que permita de este modo la amplificación de los cinco tipos en una sola reacción de amplificación. Esto podría conseguirse, por ejemplo, con la utilización de un par de cebadores degenerados o por la selección de una región del ARNm de E6 que esté muy conservada entre los tipos de HPV.

El par de cebadores para E6 puede corresponder a cualquier región del ARNm de E6, y puede permitir la amplificación de todo o de parte del marco de lectura abierto de E6 y/o del marco de lectura abierto de E7.

El(los) par(es) de cebadores adecuado(s) para ser utilizado(s) en la amplificación de una región de los transcritos de L1 debería(n) ser capaz(ces) de amplificar una región del ARNm de L1 de al menos los tipos de HPV asociados con cáncer principales 16, 18, 31 y 33, y preferible también de HPV 45, y preferiblemente será(n) adecuado(s) para ser utilizado(s) en la amplificación de una región de los ARNms de L1 de sustancialmente todos los tipos conocidos de HPV. Con la utilización de tales cebadores es posible analizar la transcripción activa del ARNm de L1 de múltiples tipos de HPV en una única reacción de amplificación.

Es posible diseñar cebadores capaces de detectar transcritos de L1 de múltiples tipos de HPV mediante la selección de regiones del transcrito de L1 que estén muy conservadas.

\newpage

En un procedimiento adicional, puede conseguirse la especificidad para múltiples tipos de HPV mediante la utilización de cebadores oligonucleotídicos degenerados o de mezclas complejas de polinucleótidos que presenten pequeñas variaciones de la secuencia, correspondientes preferiblemente a sitios de variación de la secuencia entre genotipos de HPV. La razón fundamental para la utilización de tales cebadores degenerados o mezclas es que la mezcla puede contener al menos un par de cebadores capaz de detectar cada tipo de HPV.

En un procedimiento adicional más, la especificidad para múltiples tipos de HPV puede ser conseguida mediante la incorporación en los cebadores de uno o más nucleótidos de inosina, preferiblemente en los lugares de variación de las secuencias entre los genotipos de HPV.

Los pares de cebadores para E6 y L1 pueden ser suministrados en recipientes separados dentro del kit, o el(los) par(es) de cebador(es) para L1 puede(n) ser suministrado(s) como una mezcla con uno o más pares de cebadores para E6 en un único recipiente.

Los kits pueden contener además una o más sondas adecuadas para ser utilizadas en la detección de los productos de las reacciones de amplificación llevadas a cabo utilizando los pares de cebadores incluidos en el kit. La(s) sonda(s)
puede(n) ser suministrada(s) como un reactivo separado en el kit. Alternativamente, la(s) sonda(s) puede(n) ser suministrada(s) como una mezcla con uno o más pares de cebadores.

Los cebadores y las sondas incluidos en el kit son preferiblemente moléculas de ADN de hebra sencilla. Pueden utilizarse también polinucleótidos sintéticos no naturales que conserven la capacidad de apareamiento de bases con una molécula de ácido nucleico complementaria, incluyendo oligonucleótidos sintéticos que incorporen bases modificadas y oligonucleótidos sintéticos en los que los enlaces entre los nucleósidos individuales incluyan enlaces distintos de los enlaces fosfodiéster. Los cebadores y las sondas pueden ser producidos de acuerdo con técnicas bien conocidas en el oficio, tal como mediante síntesis química utilizando aparatos y protocolos estándar para la síntesis de oligonucleótidos.

Los cebadores y las sondas serán típicamente polinucleótidos de hebra sencilla aislados de no más de 100 bases de longitud, más típicamente de menos de 55 bases de longitud. Para evitar dudas, se manifiesta en la presente que los términos "cebador" y "sonda" excluyen genomas de HPV de longitud completa existentes de forma natural.

Pueden incluirse en el kit varios tipos generales de cebadores y sondas oligonucleotídicos que incorporen secuencias específicas del HPV. Típicamente, tales cebadores y sondas pueden contener secuencias adicionales que no sean del HPV, por ejemplo secuencias que sean requeridas para una reacción de amplificación o que faciliten la detección de los productos de la reacción de amplificación.

El primer tipo de cebadores son los oligonucleótidos cebadores 1 (referidos también en la presente como cebadores P1 del NASBA), que son oligonucleótidos de generalmente 50 bases de longitud aproximadamente, que contienen una media de 20 bases aproximadamente en el extremo 3' y que son complementarios a una región del ARNm diana. Los oligonucleótidos adecuados para ser utilizados como cebadores P1 del NASBA son denominados "P1/PCR" en la Tabla 1. Los oligonucleótidos cebadores P1 tienen la estructura general X_{1}-SEQ, en la cual SEQ representa una secuencia específica para HPV y X_{1} es una secuencia que contiene un promotor que es reconocido por una ARN polimerasa específica. Se prefiere la utilización en los oligonucleótidos de la invención de promotores de bacteriófagos, por ejemplo los promotores de T7, T3 y SP6, ya que proporcionan las ventajas de un elevado nivel de transcripción que depende únicamente de la unión de la ARN polimerasa apropiada. En una realización preferida, la secuencia "X_{1}" puede comprender la secuencia AATTCTAATACGACTCACTATAGGG o la secuencia AATTCTAATACGACTCACTA
TAGGGAGAAGG. Estas secuencias contienen un promotor de T7, que incluye el sitio de inicio de la transcripción para la ARN polimerasa de T7. Las secuencias específicas para HPV en los cebadores denominados en la Tabla 1 como "P1/PCR" pueden ser también adaptadas para utilización en cebadores estándar de PCR. Cuando estas secuencias son utilizadas como la base de los cebadores P1 del NASBA, tienen la estructura general X_{1}-SEQ, según se definió anteriormente. La secuencia del promotor X_{1} es esencial en un cebador P1 del NASBA. Sin embargo, cuando se utilizan las mismas secuencias como la base de cebadores de PCR estándar, no es necesario incluir X_{1}.

Un segundo tipo de cebadores son los oligonucleótidos cebadores 2 del NASBA (referidos también en la presente como cebadores P2 del NASBA) que contienen generalmente una secuencia de 20 bases aproximadamente sustancialmente idéntica a una región del ARNm diana. Las secuencias oligonucleotídicas denominadas en la Tabla 1 como "P2/PCR" son adecuadas para ser utilizadas en cebadores P2 del NASBA y en cebadores estándar para PCR.

Los oligonucleótidos destinados a ser utilizados como cebadores P2 del NASBA pueden contener además, en una realización particular pero no limitante, una secuencia de nucleótidos en el extremo 5' que no esté relacionada con el ARNm diana pero que sea capaz de hibridar con una sonda de detección genérica. La sonda de detección estará preferiblemente marcada con, por ejemplo, una marca fluorescentes, luminiscente o enzimática. En una realización, la sonda de detección está marcada con una marca que permite la detección utilizando la tecnología ECL™, aunque se apreciará que la invención no está limitada de ninguna manera a este método de detección particular. En una realización preferida, el extremo 5' de los oligonucleótidos cebadores 2 puede contener la secuencia GATGCAAGGTCGCATAT
GAG. Esta secuencia es capaz de hibridar con una sonda genérica ECL™ disponible comercialmente en Organon Teknika que tiene la estructura siguiente:

\global\parskip0.870000\baselineskip

Ru(bpy)_{3}^{2+}-GAT GCA AGG TCG CAT ATG AG-3'

En una realización diferente, el oligonucleótido cebador 2 puede incorporar la tecnología de "sondas moleculares fluorescentes" ("beacons"), que es conocida en la técnica y está descrita en, por ejemplo, WO 95/13399 por Tyagi y Kramer, Nature Biotechnology, 14: 303-308, 1996, para permitir la monitorización en tiempo real de la reacción del NASBA.

Pueden estar también incluidos en el kit oligonucleótidos sonda específicos de la diana. Los oligonucleótidos sonda contienen generalmente una secuencia de 20-25 bases aproximadamente sustancialmente idéntica a una región del ARNm diana, o al complemento de la misma. Ejemplos de secuencias oligonucleotídicas específicas para el HPV que son adecuadas para ser utilizadas como sondas están designadas como "PO" en la Tabla 1. Los oligonucleótidos sonda pueden ser utilizados como sondas de hibridación específicas de la diana para la detección de los productos de una reacción de NASBA o PCR. A este respecto, los oligonucleótidos sonda pueden ser acoplados a un soporte sólido, tal como esferas paramagnéticas, para formar una sonda de captura (ver más adelante). En una realización preferida, el extremo 5' del oligonucleótido sonda puede estar marcado con biotina. La adición de una marca de biotina facilita la unión de la sonda a un soporte sólido a través de un enlace biotina/estreptavidina o biotina/avidina.

Las sondas específicas de la diana que permiten la detección en tiempo real de los productos de amplificación pueden incorporar la tecnología de las "sondas moleculares fluorescentes" ("beacons") que es conocida en la técnica y está descrita, por ejemplo, por Tyagi y Kramer, Nature Biotechnology, 14: 303-308, 1996 y en WO 95/13399. Ejemplos de secuencias oligonucleotídicas específicas para el HPV adecuadas para ser utilizadas como sondas moleculares fluorescentes son denominadas "MB" en la Tabla 1.

El término "sondas moleculares fluorescentes" ("beacons"), según es utilizado en la presente, quiere indicar moléculas que tienen la estructura:

X_{2}-brazo_{1}-diana-brazo_{2}-X_{3}

en la cual "diana" representa una secuencia de nucleótidos específica de la diana, "X_{2}" y "X_{3}" representan un resto fluorescente y un resto amortiguador capaz de amortiguar sustancialmente o completamente la fluorescencia procedente del resto fluorescente cuando los dos son mantenidos juntos en una estrecha proximidad y "brazo_{1}" y "brazo_{2}" representan secuencias complementarias capaces de formar un dúplice troncal.

Las combinaciones preferidas de las secuencias "brazo_{1}" y "brazo_{2}" son según sigue, aunque éstas tienen la intención de ser ilustrativas más que de limitantes de la invención:

cgcatg-SEQ-catgcg

ccagct-SEQ-agctgg

cacgc-SEQ-gcgtg

cgatcg-SEQ-cgatcg

ccgtcg-SEQ-cgacgg

cggacc-SEQ-ggtccg

ccgaagg-SEQ-ccttcgg

cacgtcg-SEQ-cgacgtg

cgcagc-SEQ-gctgcg

ccaagc-SEQ-gcttgg

ccaagcg-SEQ-cgcttgg

cccagc-SEQ-gctggg

ccaaagc-SEQ-gctttgg

cctgc-SEQ-gcagg

ccaccc-SEQ-gggtgg

ccaagcc-SEQ-ggcttgg

ccagcg-SEQ-cgctgg

cgcatg-SEQ-catgcg

\global\parskip1.000000\baselineskip

La utilización de la tecnología de sondas moleculares fluorescentes ("beacons") permite la monitorización en tiempo real de las reacciones de amplificación, por ejemplo la amplificación mediante NASBA (ver Leone y col., Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, pp. 2150-2155). Las sondas moleculares fluorescentes ("beacons") incluyen generalmente secuencias complementarias que flanquean a la secuencia específica para el HPV, representadas en la presente por la notación brazo_{1} y brazo_{2}, que son capaces de hibridar entre sí para formar una estructura de dúplice troncal. Las secuencias exactas del brazo_{1} y el brazo_{2} no son material de la invención, excepto por el requisito de que estas secuencias deben ser capaces de formar un dúplice troncal cuando la sonda no está unida a una secuencia del HPV diana.

Las sondas moleculares fluorescentes ("beacons") incluyen también un resto fluorescente y un resto amortiguador, estando representados en la presente los restos fluorescente y amortiguador por la notación X_{2} y X_{3}. Como apreciará el lector experto, los restos fluorescente y amortiguador son seleccionados de tal manera que el resto amortiguador sea capaz de amortiguar sustancialmente o completamente la fluorescencia procedente del resto fluorescente cuando los dos restos estén muy próximos, por ejemplo cuando la sonda esté en la conformación "cerrada" de horquilla en ausencia de la secuencia diana. Después de la unión a la secuencia diana, los restos fluorescente y amortiguador se mantienen separados, de tal manera que la fluorescencia procedente del resto fluorescente ya no resulta amortiguada.

Muchos ejemplos de pares de restos amortiguador/fluorescente adecuados que pueden ser utilizados de acuerdo con la invención son conocidos en la técnica (ver WO 95/13399, Tyagi y Kramer, ibid.). Puede utilizarse un amplio rango de fluoróforos de muchos colores diferentes, incluyendo por ejemplo el ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico (EDANS), fluoresceína, FAM y Rojo Texas (ver Tyagi, Bratu y Kramer, 1998, Nature Biotechnology, 16, 49-53). La utilización de sondas marcadas con diferentes fluoróforos coloreados permite la detección "simultánea" de dos o más sondas diferentes en un único recipiente de reacción. Un amortiguador preferido es el ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL), un cromóforo no fluorescente, que sirve como amortiguador "universal" para un amplio rango de fluoróforos. Los restos fluorescente y amortiguador pueden estar unidos covalentemente a la sonda en cualquier orientación, ya sea con el fluorescente en o cerca del extremo 5' y el amortiguador en o cerca del extremo 3', o viceversa. Los protocolos para la síntesis de sondas moleculares fluorescentes ("beacons") son conocidos en la técnica. Un protocolo detallado para la síntesis está proporcionado en una publicación titulada "Molecular Beacons: Hybridization Probes for Detection of Nucleic Acids in Homogenous Solutions" de Sanjay Tyagi y col., Department of Molecular Genetics, Public Health Research Institute, 455 First Avenue New York, NY 10016, EE.UU., que está disponible "on line" a través de la página web del PHRI (en www.phri.nyu.edu o en www.molecular-beacons.org).

Pueden utilizarse combinaciones adecuadas de los cebadores P1 del NASBA y P2 del NASBA para dirigir una reacción de amplificación mediante NASBA. Para dirigir una reacción de amplificación mediante NASBA, los oligonucleótidos cebador 1 y cebador 2 deben ser capaces de estimular la síntesis de un ADN de doble hebra a partir de una región diana del ARNm. Para que esto ocurra, los oligonucleótidos cebador 1 y cebador 2 deben contener secuencias específicas de la diana que sean complementarias a regiones de la hebra sentido y antisentido del ARNm diana, respectivamente.

En la primera fase del ciclo de amplificación mediante NASBA, la denominada fase "no cíclica", el oligonucleótido cebador 1 se hibrida a una secuencia complementaria en el ARNm diana y su extremo 3' es extendido por la acción de una ADN polimerasa dependiente de ARN (por ejemplo una transcriptasa inversa) para dar lugar a la síntesis de una primera hebra de ADNc. La hebra de ARN del híbrido ARN:ADN resultante es posteriormente digerida, por ejemplo mediante la acción de ARNasa H, para dejar un ADN de hebra sencilla. El oligonucleótido cebador 2 se hibrida a una secuencia complementaria hacia el extremo 3' de este ADN de hebra sencilla y su extremo 3' es extendido (por la acción de la transcriptasa inversa), formando un ADN de doble hebra. La ARN polimerasa es luego capa de transcribir múltiples copias de ARN a partir de la secuencia promotora ahora transcripcionalmente activa dentro del ADN de doble hebra. Este transcrito de ARN, que es antisentido respecto al ARNm diana original, puede actuar como molde para una ronda posterior de reacciones de NASBA, con el cebador 2 hibridándose al ARN y cebando la síntesis de la primera hebra de ADNc y el cebador 1 estimulando la síntesis de la segunda hebra de ADNc. Los principios generales de la reacción del NASBA son bien conocidos en la técnica (ver Compton, J., Nature, 350: 91-92).

Los oligonucleótidos sonda específicos de la diana descritos en la presente pueden ser también unidos a un soporte sólido, tal como microesferas magnéticas, y ser utilizados como "sondas de captura" para inmovilizar el producto de la reacción de amplificación mediante NASBA (un ARN de hebra sencilla). Las sondas "moleculares fluorescentes" ("beacons") específicas de la diana descritas en la presente pueden ser utilizadas para la monitorización en tiempo real de la reacción del NASBA.

Los kits pueden incluir también un control positivo que contenga ARNm de E6 y/o L1 de un tipo de HPV conocido. Controles adecuados incluyen, por ejemplo, extractos de ácido nucleico preparados a partir de líneas celulares infectadas con tipos conocidos de HPV (por ejemplo HeLa, CaSki).

Los kits pueden contener además cebadores de amplificación para control interno, por ejemplo cebadores específicos para ARN de U1A humano.

Los kits que contienen los cebadores (y opcionalmente sondas) adecuados para ser utilizados en la amplificación mediante NASBA pueden contener además una mezcla de enzimas requeridos para la reacción del NASBA, por ejemplo una mezcla enzimática conteniendo una ADN polimerasa dirigida por ARN (por ejemplo una transcriptasa inversa), una ribonucleasa que hidrolice la hebra de ARN de un híbrido ARN-ADN sin hidrolizar ARN o ADN de hebra sencilla o de doble hebra (por ejemplo ARNasa H) y una ARN polimerasa. La ARN polimerasa debe ser una que reconozca la secuencia promotora presente en la región 5' terminal de los cebadores P1 del NASBA suministrados en el kit de reactivos. El kit puede contener también un suministro de tampón para NASBA que contenga los ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos requeridos para la síntesis de ARN y ADN. La composición de un tampón estándar para la reacción del NASBA será bien conocida por los expertos en la técnica (ver también Leone y col., ibid.).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Secuencias específicas de E6 para ser incluidas en los cebadores y sondas de NASBA/PCR

1

2

3

4

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Secuencias específicas de L1 para ser incluidas en los cebadores y sondas de NASBA/PCR

7

\newpage

Los cebadores preferidos adecuados para ser utilizados en la detección del ARNm de L1 y E6 del HPV mediante NASBA están enumerados en las tablas siguientes. Sin embargo, éstos son meramente ilustrativos y no se desea que el ámbito de la invención deba estar limitado a estas moléculas específicas.

En las tablas siguientes, los cebadores P2 del NASBA (p2) incluyen la secuencia GATGCAAGGTCGCATATGAG en el extremo 5'; los cebadores P1 del NASBA (p1) incluyen la secuencia AATTCTAATACGACTCACTATAGGGA
GAAGG en el extremo 5'. Los oligonucleótidos adecuados para ser utilizados como sondas están identificados por "po". Los cebadores P2 contienen generalmente secuencias del HPV procedentes de la hebra positiva, mientras que los cebadores p1 contienen generalmente secuencias del HPV procedentes de la hebra negativa. nt se refiere a la posición de los nucleótidos en la secuencia genómica del HPV relevante.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Cebadores y sondas preferidos para el NASBA de E6

8

9

10

11

12

13

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

Los pares de cebadores P1 y P2 que tienen el mismo prefijo (por ejemplo HAe6701p1 y HAe6701p2) están destinados a ser utilizados en combinación. Sin embargo, pueden utilizarse también otras combinaciones, según se resume a continuación, para los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 y 45.

\vskip1.000000\baselineskip

Pares de cebadores adecuados para la amplificación del ARNm de E6 del HPV 16 son según sigue:

HAe6701p2 o HAe6702p2 (ambos 116 nt) con HAe6701p1 o HAe6702p1 (ambos 368 nt).

HAe6701p2 o HAe6702p2 (ambos 116 nt) con HPV16p1 (258 nt).

H16e6702Ap2 (142 nt), H16e6702Bp2 (182 nt), H16e6702Cp2 (185 nt) o H16e6702Dp2 (188 nt) con HAe6701p1 o HAe6702p1 (ambos 368 nt).

HAe6701p2 o HAe6702p2 (ambos 116 nt) con HAe6702Ap1 (208 nt), HAe6702Bp1 (191 nt), HAe6702Cp1 (186 nt) o HAe6702Dp1 (185 nt). Estas combinaciones son adecuadas para la amplificación de todas las variantes por ayuste de E6.

HAe6703p2 o HAe6704p2 (ambos 656 nt) con HAe6703p1 o HAe6704p1 (ambos 741 nt). Estas combinaciones son adecuadas para la amplificación de todos los transcritos que contienen la región codificadora de E7 (al menos hasta el nt 741).

\vskip1.000000\baselineskip

Se prefieren los pares de cebadores siguientes para la amplificación del ARNm de E6 del HPV 18:

H18e6701p2 (702 nt)o H18e6702p2 (698 nt) con H18e6701p1 o H18e6702p1 (ambos 869 nt).

H18e6703p2 (651 nt) con H18e6703p1 (817 nt).

H18e6704p2 (179 nt) con H18e6704p1 (379 nt).

\vskip1.000000\baselineskip

Se prefieren los pares de cebadores siguientes para la amplificación del ARNm de E6 del HPV 31:

H31e6701p2 o H31e6702p2 (ambos 164 nt) con H31e6701p1 o H31e6702p1 (ambos 423 nt).

H31e6703p2 (617 nt), H31e6704p2 (619 nt) o H31e6705p2 (617 nt) con H31e6703p1 (766 nt), H31e6704p1 (766 nt) o H31e6705p1 (809 nt).

\vskip1.000000\baselineskip

Se prefieren los pares de cebadores siguientes para la amplificación del ARNm de E6 del HPV 33:

H33e6701p2 (618 nt) o H33e6703p2 (620 nt) con H33e6701p1 (763 nt) o H33e6703p1 (807 nt).

H33e6702p2 (431 nt) con H33e6702p1 (618 nt).

\vskip1.000000\baselineskip

Se prefiere el par de cebadores siguiente para la amplificación de HPV 45:

HPV45p2 (430 nt) con HPV45p1 (527 nt).

TABLA 4 Cebadores para la PCR de E6

16

17

18

\newpage

Los pares de cebadores para PCR preferidos para los tipos de HPV 16, 18, 31 y 33 son análogos a los pares de cebadores para el NASBA.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5 Cebadores y sondas preferidos para el NASBA de L1

19

TABLA 6 Cebadores preferidos para la PCR de L1

20

Las secuencias específicas del HPV en las SEC ID N^{os}: 149 y 150 (cebadores Onc2A2/Onc2A1-PCR y Onc2A1/
Onc2A2-PCR) son idénticas a fragmentos de la secuencia genómica del HPV de tipo 16 desde la posición 6596 a la 6615 (SEC ID Nº: 149; Onc2A2/Onc2A1-PCR) y desde la posición 6729 a la 6747 (SEC ID Nº:150; Onc2A1/Onc2A2-PCR).

Las secuencias específicas del HPV SEC ID N^{os}: 152 y 153 (Onc2B2/Onc2B1-PCR y Onc2B1/Onc2B2-PCR) son variantes de las secuencias anteriores, respectivamente, que incluyen varias bases degeneradas. Las representaciones de las secuencias de moléculas de oligonucleótidos degenerados proporcionados en la presente utilizan el código estándar IUB para los sitios de bases mixtos: N= G, A, T, C; V= G, A, C; B= G, T, C; H= A, T, C; D= G, A, T; K= G, T; S= G, C; W= A, T; M= A, C; Y= C, T; R= A, G.

Es también posible utilizar variantes de las secuencias específicas del HPV SEC ID Nº: 152 (Onc2B2/Onc2B1-PCR) y SEC ID Nº: 153 (Onc2B1/Onc2B2-PCR) en las que cualquiera de dos de los nucleótidos "SRH" hacia el extremo 3' de la secuencia estén sustituidos por inosina (I), según sigue:

5' AATGGCATTTGTTGGIIHAA 3'

5' AATGGCATTTGTTGGSIIAA 3'

5' AATGGCATTTGTTGGIRIAA 3'

Las secuencias específicas del HPV SEC ID N^{os}: 156-163 (presentes en los cebadores Onc2C2, Onc2D2, Onc2E2, Onc2F2, Onc2G2, Onc2H2, Onc2I2, Onc2J2, Onc2C1-PCR, Onc2D1-PCR, Onc2E1-PCR, Onc2F1-PCR, Onc2G1-PCR, Onc2H1-PCR, Onc2I1-PCR y Onc2J1-PCR) son variantes basadas en la secuencia específica del HPV SEC ID Nº: 152 (Onc2B2/Onc2B1-PCR), mientras que las secuencias específicas del HPV SEC ID N^{os}: 164-169 (presentes en los cebadores Onc2K1, Onc2L1, Onc2M1, Onc2N1, Onc2O1, Onc2P1, Onc2K2-PCR, Onc2L2-PCR, Onc2M2-PCR, Onc2N2-PCR, Onc2O2-PCR y Onc2P2-PCR) son variantes basadas en la secuencia específica del HPV SEC ID Nº: 153 (Onc2B1/Onc2B2-PCR). Estas variantes incluyen bases degeneradas y también residuos de inosina (I). Esta variación de secuencias permite que los oligonucleótidos que incorporan las secuencias variantes se unan a múltiples tipos de HPV. Las bases inosina no interfieren con la hibridación y por tanto pueden ser incluidas en los lugares de variación entre los tipos de HPV con el fin de construir un cebador "consenso" capaz de unirse a múltiples tipos de HPV.

Uno o más de los cebadores Onc2A2, Onc2B2, Onc2C2, Onc2D2, Onc2E2, Onc2F2, Onc2G2, Onc2H2, Onc2I2 y Onc2J2, pueden ser utilizados en combinación con uno o más de los cebadores Onc2A1, Onc2B1, Onc2K1, Onc2L1, Onc2M1, Onc2N1, Onc2O1 y Onc2P1, para la amplificación mediante NASBA del ARNm de L1 del HPV.

Uno o más de los cebadores Onc2A1-PCR, Onc2B1-PCR, Onc2C1-PCR, Onc2D1-PCR, Onc2E1-PCR, Onc2F1-PCR, Onc2G1-PCR, Onc2H1-PCR, Onc2I1-PCR y Onc2J1-PCR, pueden ser utilizados en combinación con uno o más de los cebadores Onc2A2-PCR, Onc2B2-PCR, Onc2K2-PCR, Onc2L2-PCR, Onc2M2-PCR, Onc2N2-PCR, Onc2O2-PCR y Onc2P2-PCR para la amplificación mediante PCR del ARNm de L1 del HPV.

La invención será comprendida adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos experimentales y figuras en las cuales:

la Figura 1A muestra los resultados de un ensayo de NASBA en tiempo real de una única reacción utilizando una sonda molecular fluorescente FAM para HPV 16 en un muestra de una paciente, mientras que la Figura 1B muestra un ensayo de NASBA en tiempo real múltiple (simultáneo) utilizando la sonda molecular fluorescente FAM de la Figura 1A y una sonda molecular fluorescente marcada con Rojo Texas para U1A,

la Figura 2A muestra un NASBA en tiempo real de una sola reacción con la sonda molecular fluorescente FAM para HPV 18 en la muestra de una paciente, mientras que la Figura 2B muestra una versión múltiple (simultánea) con una sonda molecular fluorescente marcada con Rojo Texas para HPV 18 y una sonda molecular fluorescente marcada con FAM para HPV 33,

la Figura 3A muestra un NASBA en tiempo real de una sola reacción con una sonda molecular fluorescente marcada con FAM para HPV 31, mientras que la Figura 3B muestra la versión múltiple (simultánea) incluyendo una sonda molecular fluorescente marcada con Rojo Texas para HPV 45,

la Figura 4A muestra un NASBA en tiempo real de una sola reacción con una sonda molecular fluorescente marcada con FAM para HPV 33, mientras que la Figura 4B es una versión múltiple (simultánea) que incluye una sonda molecular fluorescente para HPV 18 marcada con Rojo Texas,

la Figura 5A muestra un NASBA en tiempo real de una sola reacción con una sonda molecular fluorescente marcada con FAM para HPV 45, mientras que la Figura 5B muestra la versión múltiple (simultánea) que incluye una sonda molecular fluorescente marcada con Rojo Texas para HPV 45 y una sonda molecular fluorescente para HPV 31 marcada con FAM, y

la Figura 6 muestra HPV detectado por PreTect HPV-Proofer y PCR en comparación con citología o histología.

Ejemplo 1 Detección de ARNm de HPV mediante la amplificación de ácidos nucleicos basada en NASBA y detección en tiempo real Recogida y preparación de muestras clínicas

Frotis Pap y muestras de HPV fueron recogidas de 5970 mujeres en el programa de cribado cervical en Oslo, Noruega. Las muestras destinadas a la extracción de ARN/ADN fueron tratadas según sigue:

Se recogieron muestras cervicales de cada una de las mujeres asistentes al programa de cribado cervical utilizando un citocepillo (Rovers Medical Devices, Países Bajos). El citocepillo fue sumergido posteriormente en 9 ml de tampón de lisis (tiocianato de guanidina 5 M). Como el ARN está mejor protegido en el tiocianato de guanidina 5 M a -70ºC, se utilizó únicamente 1 ml del volumen total de muestra para cada ciclo de extracción. Las muestras en tampón de lisis fueron almacenadas a -20ºC durante no más de una semana, posteriormente a -70ºC hasta el aislamiento de ADN/ARN.

El ARN y el ADN fueron aislados automáticamente de 5300 mujeres en el primer ciclo de extracción, utilizando 1 ml de la muestra total de 9 ml en tampón de lisis. El ARN y el ADN fueron extraídos de acuerdo con el método de aislamiento "Boom" de Organon Teknika (Organon Teknika B.V., Boselind 15, P.O. Box 84, 5280 AB Baxtel, Países Bajos; actualmente Biomérieux, 69280 Marcy l'Etoile, Francia) utilizando el extractor Nuclisens™ siguiendo el protocolo para extracción automatizada.

Líneas celulares

ADN y ARN de las líneas celulares HeLa (HPV 18), SiHa (HPV 16) y CaSki (HPV 16) fueron utilizadas como controles positivos para las reacciones de PCR y NASBA. Estas células fueron utilizadas también como material de muestra en el estudio de sensibilidad (Ejemplo 2). Las células SiHa tienen 1-2 copias de HPV 16 integradas por célula, mientras que las células CaSki tienen entre 60-600 copias de HPV 16, integradas y en estado episómico. Las células HeLa tienen 10-50 copias de HPV 18 por célula aproximadamente.

Detección y tipificación del HPV mediante PCR

ADN aislado de rascados cervicales fue sometido a PCR utilizando los cebadores consenso GP5+/6+ (EP-B-0 517 704). La PCR se llevó a cabo en un volumen de reacción de 50 \mul que contenía Tris-HCl 75 mM (pH 8,8 a 25ºC), (NH_{4})_{2}
SO_{4} 20 mM, Tween 20™ 0,01%, 200 mM de cada dNTP, MgCl_{2} 1,5 mM, 1 U de ADN polimerasa Taq recombinante (MBI Fermentas), 3 \mul de muestra de ADN y 50 pmoles de cada uno de los cebadores GP5+ y GP6+. Una etapa de desnaturalización de 2 minutos a 94ºC fue seguida por 40 ciclos de amplificación con un procesador de PCR (Primus 96, HPL Block, MWG, Alemania). Cada ciclo incluía una etapa de desnaturalización de 1 minuto, una etapa de hibridación de los cebadores a 40ºC durante 2 minutos y una etapa de alargamiento de la cadena a 72ºC durante 1,5 minutos. La última etapa de alargamiento fue prolongada en 4 minutos para asegurar una extensión completa del ADN amplificado.

Las muestras positivas con GP5+/6+ fueron sometidas a protocolos de PCR para el HPV de tipo 16, 31 y 33 según sigue:

HPV 16, 31 y 33: La PCR se llevó a cabo en 50 \mul que contenían Tris-HCl 75 mM (pH 8,8 a 25ºC), 200 mM de cada dNTP, MgCl_{2} 1,5 mM, 2,5 U de ADN polimerasa Taq recombinante (MBI Fermentas), 3 \mul de muestra de ADN y 25 pmoles de cada cebador. Una etapa de desnaturalización de 2 minutos a 94ºC fue seguida por 35 ciclos de amplificación con un procesador de PCR (Primus 96, HPL Block, MWG, Alemania). Cada ciclo incluía una etapa de desnaturalización de 30 segundos, una etapa de hibridación de los cebadores a 57ºC durante 30 segundos y una etapa de alargamiento de la cadena a 72ºC durante 1 minuto. La última etapa de alargamiento fue prolongada en 10 minutos para asegurar una extensión completa del ADN amplificado. El protocolo para HPV 33 tenía una etapa de hibridación de los cebadores a 52ºC. Protocolo para el HPV 18: Se diseñaron cebadores para identificar HPV de tipo 18. La PCR se llevó a cabo en 50 \mul que contenían Tris-HCl 75 mM (pH 8,8 a 25ºC), (NH_{4})_{2}SO_{4} 20 mM, Tween 20 0,01%, 200 mM de cada dNTP, MgCl_{2} 2,0 mM, 2,5 U de ADN polimerasa Taq recombinante (MBI Fermentas), 3 \mul de muestra de ADN y 25 pmoles de cada cebador. Una etapa de desnaturalización de 2 minutos a 94ºC fue seguida por 35 ciclos de amplificación en un procesador de PCR (Primus 96, HPL Block, MWG, Alemania). Cada ciclo incluía una etapa de desnaturalización de 30 segundos, una etapa de hibridación de los cebadores a 57ºC durante 30 segundos y una etapa de alargamiento de la cadena a 72ºC durante 1 minuto. La última etapa de alargamiento fue prolongada en 10 minutos para asegurar una extensión completa del ADN amplificado.

Se utilizó un conjunto de cebadores dirigidos contra el gen de la \beta-globina humana como control de la calidad del ADN (Procedimiento de trabajo, University Hospital Vrije Universiteit, Amsterdam, Países Bajos). La PCR se llevó a cabo en 50 \mul que contenían Tris-HCl 75 mM (pH 8,8 a 25ºC), 200 mM de cada dNTP, MgCl_{2} 1,5 mM, 1 U de ADN polimerasa Taq recombinante (MBI Fermentas), 3 \mul de muestra de ADN y 25 pmoles de cada cebador. Una etapa de desnaturalización de 2 minutos a 94ºC fue seguida por 35 ciclos de amplificación en un procesador de PCR (Primus 96, HPL Block, MWG, Alemania). Cada ciclo incluía una etapa de desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto, una etapa de hibridación de los cebadores a 55ºC durante 1 ½ minutos y una etapa de alargamiento de la cadena a 72ºC durante 2 minutos. La última etapa de alargamiento fue prolongada en 4 minutos para asegurar una extensión completa del ADN amplificado. Se utilizó HeLa como control positivo para HPV 18, mientras que se utilizaron SiHa o CaSki como control positivo para HPV 16. Se utilizó agua como control negativo.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

\newpage

Cebadores utilizados para la PCR del HPV

21

\vskip1.000000\baselineskip

La visualización de los productos de la PCR se realizó en un chip de ADN 500 (Agilent Technologies, EE.UU.) según su manual. El chip de ADN utiliza electroforesis en gel a microescala con un límite de detección óptimo de 0,5-50 ng/ml. Los resultados fueron interpretados utilizando el programa de ordenador Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, EE.UU.).

La tabla siguiente confirma los cebadores utilizados para la PCR del HPV en muestras de pacientes e indica cebadores de PCR adicionales útiles para HPV 35, 39, 45, 51, 52, 58 y HPV 6/11.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

\newpage

Cebadores de PCR para la detección de HPV

22

Amplificación de ARN mediante NASBA

Precauciones para evitar contaminación:

1. Llevar a cabo la liberación, el aislamiento y la amplificación/detección de los ácidos nucleicos en áreas del laboratorio separadas.

2. Almacenar y preparar los reactivos para la liberación, el aislamiento y la amplificación/detección de los ácidos nucleicos en las áreas del laboratorio en las que vayan a realizarse la liberación, el aislamiento y la amplificación/detección de los ácidos nucleicos, respectivamente.

3. Mantener todos los tubos y viales cerrados cuando no se estén utilizando.

4. Las pipetas y cualquier otro equipamiento que hayan sido utilizados en un área del laboratorio no deben ser utilizados en las demás áreas.

5. Utilizar una pipeta o una punta de pipeta nueva para cada pipeteo.

6. Utilizar pipetas con puntas resistentes a aerosoles para los fluidos que es posible que contengan ácido nucleico. El pipeteo de las soluciones debe ser realizado siempre fuera o dentro de un tubo aislado que se abra y cierre exclusivamente para esta acción. Todos los demás tubos y viales deben mantenerse cerrados y separados del que se está manejando.

7. Utilizar guantes desechables cuando se trabaje con material clínico que es posible que contenga ARN diana o material amplificado. Si es posible, cambiar los guantes después de cada etapa de pipeteo en el procedimiento de ensayo, especialmente después de entrar en contacto con material posiblemente contaminado.

8. Recoger el material desechable utilizado en un recipiente. Cerrar y retirar el recipiente después de cada ensayo.

9. Sumergir las gradillas de los tubos utilizadas durante el aislamiento o la amplificación/detección del ácido nucleico en un detergente (por ejemplo Extran MA01 alcalino de Merck) durante al menos una hora después de cada ensayo.

El procedimiento siguiente se llevó a cabo utilizando los reactivos del kit Nuclisens™ Basic Kit, suministrado por Organon Teknika.

\vskip1.000000\baselineskip

Procedimiento para n=10 muestras:

1. Preparar la solución enzimática

Añadir 55 \mul de diluyente enzimático (del Nuclisens™ Basic Kit; contiene sorbitol en solución acuosa) a cada una de tres esferas enzimáticas liofilizadas (del Nuclisens™ Basic Kit; contiene AMV-RT, ARNasa H, ARN polimerasa de T7 y BSA). Dejar esta solución enzimática al menos durante 20 minutos a temperatura ambiente. Juntar las soluciones enzimáticas en un tubo, mezclar bien golpeando el tubo con los dedos, agitar en vórtex brevemente y utilizar en 1 hora. Las concentraciones finales en la mezcla enzimática son sorbitol 375 mM, 2,5 \mug de BSA, 0,08 U de ARNasa H, 32 U de ARN polimerasa de T7 y 6,4 U de transcriptasa inversa de AMV.

2. Preparar la solución de esferas reactivas/KCl

Para 10 muestras: añadir 80 \mul del diluyente para las esferas reactivas (procedente del Nuclisens™ Basic Kit; contiene Tris/HCl (pH 8,5), 45% de DMSO) a la esfera reactiva liofilizada (procedente del Nuclisens™ Basic Kit; contiene nucleótidos, ditiotreitol y MgCl_{2}) e inmediatamente agitar bien en vórtex. Hacer esto con 3 esferas reactivas y mezclar las soluciones en un tubo.

Añadir 3 \mul de agua para NASBA (procedente del Nuclisens™ Basic Kit) a la solución de esferas reactivas reconstituidas y mezclar bien.

Añadir 56 \mul de solución madre de KCl (procedente del Nuclisens™ Basic Kit) y mezclar bien. La utilización de esta mezcla KCl/agua tendrá como resultado reacciones de NASBA con una concentración final de KCl de 70 mM. Las concentraciones finales en la solución reactivo/KCl son 1 mM de cada dNTP, 2 mM de ATP, UTP y CTP, GTP 1,5 mM y ITP 0,5 mM, ditiotreitol 0,5 mM, KCl 70 mM, MgCl_{2} 12 mM, Tris-HCl 40 mM (pH 8,5).

3. Preparar una solución de cebadores/sondas conteniendo cebadores específicos de la diana y una sonda molecular fluorescente

Para cada reacción de la diana transferir 91 \mul de la solución de esferas reactivas/KCl (preparada en la etapa 2) a un tubo nuevo. Añadir 25 \mul de la solución de cebadores/sonda molecular fluorescente (para dar una concentración final de \sim0,1-0,5 \muM de cada uno de los cebadores sentido y antisentido y \sim15-70 pmoles de la sonda molecular fluorescente por reacción). Mezclar bien en vórtex. No centrifugar.

En el caso de que se vayan a realizar menos de 10 amplificaciones del ARN diana, referirse a la tabla siguiente para obtener las cantidades apropiadas de la solución de esferas reactivas, de la solución de KCl/agua y de los cebadores a utilizar. Las soluciones de los cebadores deben ser utilizadas dentro de los 30 minutos siguientes a su preparación.

24

\vskip1.000000\baselineskip

4. Adición de las muestras

Para cada reacción de ARN diana:

En una placa de microvaloración de 96 pocillos pipetear 10 \mul de la solución de cebadores/sonda (preparada en la etapa 3) en cada uno de 10 pocillos. Añadir 5 \mul de extracto de ácido nucleico a cada pocillo. Incubar la placa de microvaloración durante 4 minutos a 65 \pm 1ºC. Enfriar a 41 \pm 0,5ºC durante 4 minutos. Añadir posteriormente a cada pocillo 5 \mul de solución enzimática. Colocar inmediatamente la placa de microvaloración en un instrumento de detección de fluorescencia (por ejemplo NucliSens™ EasyQ Analyzer) y comenzar la amplificación.

Resultados de un estudio clínico

La Tabla 7 muestra la distribución de casos positivos para HPV (expresión de L1 y/o E6) mediante NASBA en tiempo real y de casos positivos para HPV mediante PCR relacionados con los resultados de la citología. La amplificación mediante PCR se llevó a cabo según está descrito por Karlsen y col., J. Clin. Microbiol., 34: 2095-2100, 1996. Los números para la histología esperada están basados en los resultados medios de un estudio similar en lesiones CIN III (Clavel y col., Br. J. Cancer, 84: 1616-1623, 2001). Los resultados de varios casos ejemplares están enumerados en la Tabla 8.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 7

25

TABLA 8

26

Ejemplo 2 Sensibilidad del NASBA en tiempo real en líneas celulares control

Las líneas celulares de cáncer cervical CaSki, SiHa y HeLa fueron diluidas en tampón de lisis antes de la extracción automatizada de ácidos nucleicos utilizando el método de extracción Boom de Organon Teknika/bioMerieux (paralelos 1 y 3), o después de la extracción de los ácidos nucleicos (paralelo 2). El NASBA en tiempo real fue realizado utilizando sondas moleculares fluorescentes ("beacons") marcadas con Rojo Texas (16, L1 y 18) o FAM (U1A, 33 y 31) siguiendo el protocolo anteriormente descrito.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 9

27

\newpage

Por tanto, es posible detectar ARNm de E6 de HPV en menos de 1 célula utilizando NASBA en tiempo real.

El NASBA en tiempo real fue ensayado como un ensayo múltiple simultáneo y como reacciones individuales. Los resultados del siguiente estudio de sensibilidad están basados en procesos simultáneos de las líneas celulares CaSki, SiHa y Hela, y en tres procesos simultáneos en oligos de ADN sintéticos para HPV de tipo 16, 18, 31 y 33. La definición del límite de detección es que las dos muestras del paralelo sean positivas. El número entre paréntesis (x) indica que la cantidad especificada de células ha sido también detectada en algunos procesos. Se define sensibilidad como la cantidad de células necesaria para la detección de HPV en dos procesos simultáneos. Los tipos de HPV son determinados a partir de la PCR y la especificidad está basada en el NASBA en comparación con la PCR.

Sensibilidad

PCR: La PCR consenso para HPV utilizando Gp5+/6+ detectó únicamente hasta 10^{4} células SiHa y Hela, y hasta 10^{3} células CaSki. Sin embargo, los conjuntos de cebadores de PCR específicos de tipo fueron más sensibles, detectando 10^{3} (10^{2}) células SiHa y 0,1 células CaSki para el conjunto de cebadores de PCR específicos de HPV de tipo 16, mientras que el conjunto de cebadores de PCR específicos para HPV de tipo 18 detectó 10^{2} células HeLa.

NASBA en tiempo real: El NASBA en tiempo real con cebadores específicos para U1A, detectó 10 (1) células SiHa y CaSki y 1 célula HeLa en la mezcla de reacción. Para los cebadores específicos de HPV 16, el límite de detección inferior fue de (10) (10^{2}, 1) células SiHa y 10 (1) células CaSki y para los cebadores específicos de HPV 18 el límite de detección fue de 1 (0,1) célula HeLa. Los cebadores universales de L1 detectaron 10 células CaSki. Las células HeLa y las células SiHa no fueron detectadas con los cebadores universales de L1.

El NASBA múltiple simultáneo en tiempo real con los cebadores específicos de U1A, tuvo un límite de detección inferior de 10^{2} (10) células SiHa y 10 (1) células CaSki cuando se combinaron con los cebadores específicos de HPV 16, que tuvieron un límite de detección inferior de 10 (1) células SiHa y 10 (1) células CaSki. Los cebadores específicos de L1 en combinación con los cebadores específicos de HPV 33 detectaron 10^{3} (10^{2}) células CaSki. No había ninguna muestra de HPV 33 competidora en la reacción. Para los cebadores específicos de HPV 18, el límite de detección inferior fue de 1 (0,1) célula HeLa cuando se combinaron con los cebadores específicos de HPV 31. No había ninguna muestra de HPV 31 competidora en la reacción. La sensibilidad de los cebadores específicos de HPV 31 y HPV 33 no fue analizada, debido a la falta de líneas celulares que albergaran estos tipos de HPV. Fueron ensayados frente a muestras que contenían HPV 31 y HPV 33, pero no se conocía la cantidad de células ni el número de copias de HPV 31 y HPV 33 en estas células y muy probablemente variaba en las diferentes muestras.

TABLA 10 Sensibilidad del NASBA en tiempo real en comparación con la PCR

28

El NASBA en tiempo real se llevó a cabo en muestras procedentes de mujeres admitidas en el Østfold Central Hospital para el tratamiento de CIN en el periodo de 1999-2001 (ver el Ejemplo 3). Se utilizaron sondas moleculares fluorescentes marcadas con FAM o Rojo Texas junto con los protocolos de extracción de ácidos nucleicos y de NASBA descritos anteriormente. Los resultados están mostrados en las Figuras 1A y 1B (HPV 16 - muestra de la paciente 205), en las Figuras 2A y 2B (HPV 18 - muestra de la paciente 146), en las Figuras 3A y 3B (HPV 31 - muestra de la paciente 236), en las Figuras 4A y 4B (HPV 33 - muestra de la paciente 218) y en las Figuras 5A y 5B (HPV 45 - muestra de la paciente 343). En cada caso, la Figura "A" es una única reacción mientras que la Figura "B" es el ensayo múltiple simultáneo.

Especificidad: Reactividad cruzada del NASBA en tiempo real

Se ensayaron combinaciones de cebadores de NASBA en tiempo real frente a 490 muestras cervicales procedentes del estudio de Oslo positivas con PCR para HPV 6/11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 58 o para HPV X con el fin de comprobar la reactividad cruzada entre los tipos de HPV utilizando NASBA. Todas las muestras habían sido tipificadas mediante PCR consenso y mediante PCR específica de tipo para los tipos respectivos de HPV, excepto para HPV de tipo 39 (2), 52 (1) y 58 (2). Estas muestras son añadidas para el análisis frente a PreTect HPV-Proofer. HPV X son positivas para la PCR consenso con Gp5+/6+ pero negativas para HPV 6/11, 16, 18, 31, 33, 35, 45 y 51 mediante PCR específica de tipo. Los resultados están mostrados en la Tabla 14. No se demostró reactividad cruzada. La confirmación de la secuencia de un número seleccionado de casos de la Tabla 14 está mostrada en la Tabla 14a.

PCR: Se analizaron un total de 773 muestras cervicales con PCR y con PreTect HPV-Proofer (NASBA múltiple simultáneo en tiempo real), y un total de 24,6% (190/773) muestras fueron positivas con los cebadores de PCR consenso Gp5+/6+. El 74,1% (83/112) fueron tipificadas como HPV 16, el 13% (15/112) HPV 18, el 17% (19/112) HPV 31 y el 12% (13/112) HPV 33 incluyendo infecciones por múltiples HPV. Un total de 103 muestras tenían infecciones por un único HPV o por múltiples HPV, y el 91,3% (94/103) tenían únicamente infección por un sólo HPV. Las infecciones por dos HPV tenían lugar en el 8,7% (9/103) de las muestras. Todas las muestras fueron analizadas primeramente con los cebadores de PCR consenso Gp5+/6+. Las muestras negativas en la PCR para HPV procedentes de la PCR consenso con Gp5+/6+ fueron analizadas posteriormente con los cebadores control de \beta-globina para la verificación de ADN intacto. Las muestras positivas en la PCR para HPV no fueron sometidas a este control de ADN. Las muestras negativas para HPV en este estudio fueron todas positivas con los cebadores de PCR de \beta-globina control. Únicamente las muestras de ADN positivas en la PCR con Gp5+/6+ fueron sometidas a una PCR específica de tipo. Los tipos de HPV de interés fueron HPV 16, 18, 31 y 33.

NASBA múltiple simultáneo en tiempo real: Para las reacciones de NASBA en tiempo real, se utilizaron los cebadores y sondas para el producto del gen U1A como control de funcionamiento para ARN intacto. Las muestras negativas para U1A fueron rechazadas. Un total de 14,2% (110/773) de las muestras fueron positivas con al menos uno de los cebadores de NASBA específicos para un tipo de HPV incluyendo las muestras que presentaban infecciones por múltiples HPV. De estas muestras, el 54,5% (60/110) fueron positivas con los cebadores de NASBA para HPV 16, el 13,6% (15/110) con los cebadores para HPV 18, el 21,8% (24/110) con los cebadores para HPV 31 y el 13,6% (15/110) con los cebadores para HPV 33. Un total de 45 muestras fueron positivas con los cebadores consenso para L1 y normalmente junto con la expresión de los oncogenes E6/E7 del HPV 16 82,2% (13/45). El L1 consenso fue detectado en el 2,2% (1/45) junto con HPV 18, 31 y 33, respectivamente. L1 fue también detectado solo en el 8,9% (4/45) de los casos, y todos fueron positivos en la PCR con los cebadores Gp5+/6+. Un total de 108 muestras tenían infecciones por un único HPV o por múltiples HPV, y el 98,1% (106/108) tenían únicamente infecciones por un solo HPV. La doble expresión de ARNm tuvo lugar en el 1,9% (2/108) de las muestras.

NASBA múltiple simultáneo en tiempo real comparado con la PCR: Un total de 87 muestras mostró la presencia de ADN o ARN de HPV 16 con PCR para HPV 16 o con PreTect HPV-Proofer. Se determinó que el 64,4% (56/87) eran positivas para HPV 16 con PCR y con NASBA en tiempo real. El 39,1% (34/87) eran sólo positivas con PCR y el 3,4% (3/87) eran sólo positivas con NASBA en tiempo real. Para HPV 18, un total de 20 muestras mostraron la presencia de ADN o ARN de HPV 18 con PCR o con NASBA en tiempo real. De estas 20 muestras, el 50% (10/20) fueron positivas con ambos ensayos y el 35% (7/20) fueron positivas únicamente con PCR y el 15% (3/20) fueron sólo positivas con NASBA en tiempo real. Un total de 27 muestras mostraron la presencia de ADN o ARN de HPV 31 con PCR o NASBA en tiempo real. De estas 27 muestras, el 59,3% (16/27) fueron positivas con ambos ensayos y el 11,1% (3/27) fueron positivas únicamente con el ensayo de PCR y el 18,5% (5/27) fueron únicamente positivas con el ensayo de NASBA en tiempo real. Para HPV 33, un total de 18 muestras mostraron la presencia de ADN o ARN de HPV con PCR o con PreTect HPV-Proofer, y el 55,6% (10/18) de las muestras dieron positivo con ambos ensayos. El 16,7% (13/18) fueron únicamente positivas con PCR y el 22,2% (4/18) fueron únicamente positivas con el NASBA en tiempo real.

TABLA 11 Distribución estadística de HPV en las muestras con PCR y con NASBA en tiempo real

29

TABLA 12 Correspondencia entre PCR y NASBA en tiempo real

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 13 Resultados del NASBA en tiempo real para L1

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 14 Especificidad genética del NASBA múltiple simultáneo en tiempo real en comparación con la PCR

32

TABLA 14a Secuenciación del ADN a partir de los cebadores de PCR Gp5+ (no será incluido en el artículo)

33

Discusión

La sensibilidad del NASBA en tiempo real fue en general mejor que la sensibilidad de la PCR. La sensibilidad general del NASBA en tiempo real para todos los marcadores estaba entre 1 y 10^{2} células, la cual es considerablemente mejor que para la reacción de PCR con un rango de sensibilidad de 10^{2} a 10^{4}. Según se esperaba, la sensibilidad de los cebadores y sondas específicos era mejor que la sensibilidad de los cebadores y sondas universales. El NASBA en tiempo real era tan sensible o más sensible que el NASBA múltiple simultáneo en tiempo real.

Se utilizaron cebadores de NASBA en tiempo real y la sonda molecular fluorescente dirigida hacia U1A (un gen constitutivo humano) como control de funcionamiento del material de muestra en la reacción de NASBA en tiempo real con el fin de asegurar que el ARN del material de la muestra estaba intacto. Una señal positiva procedente de esta reacción era necesaria para la validación de la reacción de NASBA en tiempo real.

La sensibilidad del NASBA en tiempo real universal con L1 (la principal proteína de la cápsida de HPV) era mucho mejor que para la PCR con Gp5+/6+ universal, dirigida también contra L1, con una sensibilidad de 10 células en comparación con 10^{3} (10^{2}) células CaSki. Estos dos conjuntos de cebadores (PCR y NASBA) tenían sus dianas en la misma región del gen L1 conservado de diferentes tipos de HPV. Las diferencias en sensibilidad pueden ser debidas al hecho de que hay normalmente una copia de cada gen por célula, mientras que el número de copias de ARNm puede ser de varios cientos. Los cebadores de L1 del NASBA en tiempo real no detectaron células SiHa ni HeLa como lo hicieron los cebadores de PCR Gp5+/6+, indicando la ausencia de expresión de L1 en estas líneas celulares. Los cebadores de PCR Gp5+/6+ detectaron 10^{4} células SiHa o HeLa. Considerando la cantidad de copias de HPV en cada célula, tiene sentido el que se detectaran células CaSki en 1/10 de la cantidad de células SiHa y HeLa, ya que las células CaSki tienen 60-600 copias de HPV por célula, integradas y episómicas, mientras que las células SiHa tienen 1-2 copias de HPV integradas por célula y las células HeLa tienen 10-50 copias de HPV integradas por célula. El conjunto de cebadores para L1 detectó únicamente células CaSki, con las formas integradas y episómicas de HPV, y no células SiHa ni HeLa, únicamente con formas integradas de HPV. Esto podría indicar que el gen L1 es el único expresado en los estados episómicos de la infección por HPV, y por tanto L1 puede ser un marcador valioso de la integración y la persistencia de la infección por HPV.

Los cebadores de NASBA específicos para un tipo de HPV están dirigidos contra el transcrito de E6/E7 de longitud completa, que se expresa en gran cantidad en las células cancerosas debido a la ausencia del producto del gen E2. Los 16 cebadores específicos de tipo del NASBA en tiempo real detectaron 10 (1) células SiHa y 10 (1) células CaSki, en comparación con los cebadores de PCR para HPV 16 que detectaron 10^{3} (10^{2}) células SiHa. La explicación de esto podría ser la diferente cantidad de copias de HPV en cada línea celular. Las células CaSki tienen formas integradas y formas episómicas de HPV, mientras que SiHa tiene únicamente formas integradas del HPV. Esto puede ser debido a la elevada expresión de ARNm de los genes E6/E7. Para la detección de células CaSki, el límite de detección para los cebadores del NASBA para HPV 16 era de 10 (1) células CaSki en comparación con 0,1 células CaSki para los cebadores de PCR de HPV 16. Esto es peculiar, pero una explicación puede ser que las células CaSki contienen de 60-600 copias de ADN de HPV 16, por lo que es posible detectar 0,1 células CaSki con 6-60 copias de ADN de HPV 16. La menor sensibilidad del NASBA en tiempo real en comparación con la PCR, puede indicar que la expresión de E6/E7 en las células CaSki es moderada/baja. La degradación del ARNm inestable puede ser también una explicación. La cantidad de copias de HPV en las células CaSki puede ser del orden de 60-600 veces mayor que en las células SiHa, lo cual está mostrado por la detección más sensible de células CaSki.

Los cebadores de PCR específicos de tipo para HPV 18 detectaron 10^{2} células HeLa. Esta es una magnitud 100 veces mejor que la de los cebadores Gp5+/6+ consenso para HPV e indica que los cebadores específicos son en general más sensibles que los cebadores consenso. La sensibilidad de los cebadores de NASBA específicos de tipo para HPV 18 fue de 1 (0,1) células HeLa, indicando una elevada expresión de E6/E7 en las células HeLa.

La sensibilidad de los cebadores de NASBA para U1A fue de 10 células SiHa o CaSki. La diana para el conjunto de cebadores de U1A es un gen constitutivo humano que se expresa en todas las células humanas.

La sensibilidad de la PCR y del NASBA varía para los diferentes conjuntos de cebadores y materiales de muestra, y en general los cebadores específicos de tipo son más sensibles que los cebadores consenso debido al desacoplamiento de pares de bases en los conjuntos de cebadores consenso. La temperatura de hibridación para los cebadores en la reacción de PCR puede ser optimizada, dando condiciones de reacción óptimas para los cebadores. En contraste con la temperatura de hibridación en la PCR, la temperatura de hibridación para los cebadores del NASBA debe ser fijada a 41ºC. Esta falta de flexibilidad de la temperatura puede hacer que los cebadores del NASBA sean menos sensibles y menos específicos que los cebadores de PCR.

La PCR amplifica ADN de doble hebra y la diana está normalmente presente como una copia por célula, y esto la hace vulnerable al número de células en el material de muestra. La diana para la reacción de NASBA es ARN, y el ARNm puede estar presente como múltiples copias por célula, dependiendo de la expresión de los genes. Eligiendo un gen que se exprese mucho, el número de copias de ARNm puede ser de varios cientos por célula y por tanto más fácil de detectar.

El ADN de doble hebra es relativamente estable en la célula y el material permanece intacto durante mucho tiempo. En contraste con el ADN de doble hebra, el ARNm no es en general muy estable y la degradación del ARNm es rápida, dependiendo de la célula. No se detecta actividad ADNasa o ARNasa en el tampón de lisis, por lo que el ADN de doble hebra y el ARN de hebra sencilla deben ser estables. La actividad autocatalítica puede degradar el ADN y el ARN. El ADN/ARN de la muestra de cérvix debe permanecer intacto cuando se almacena en el tampón de lisis durante 24 horas a 15-30ºC, durante 7 días a 2-8ºC o a -70ºC para un almacenamiento de larga duración.

Una limitación de la reacción de NASBA en tiempo real es la concentración de las sondas moleculares fluorescentes ("beacons"). La cantidad de los productos superará a la concentración de las sondas moleculares fluorescentes y por tanto no será detectada debido a que una elevada concentración de las sondas moleculares fluorescente hará que la mezcla de reacción sea más compleja e inhibirá la reacción de amplificación. Los nucleótidos pueden ser también una limitación para la cantidad final del producto de amplificación, tanto en la reacción de PCR como en la reacción del NASBA. La concentración final del producto amplificado puede inhibir por sí misma la amplificación posterior debido a la cantidad de producto y a la complejidad de la mezcla de reacción. Durante una reacción de NASBA en presencia de sondas moleculares fluorescentes, la sonda podría competir con la amplificación hibridándose al molde, haciendo que el mismo no esté disponible para la síntesis de ARN posterior. De esta forma, el ARN es eliminado como sustrato para las etapas de transcripción inversa y para la síntesis posterior de ARN mediante la ARN polimerasa de T7. Esta competición no es significativa con pequeñas cantidades de sonda molecular fluorescente, y con una elevada cantidad de sonda molecular fluorescente esta inhibición puede ser superada por un número mayor de copias del ARN inicial.

La relación lineal entre la cantidad de ARN inicial y el tiempo hasta obtener una señal positiva fue analizada en diluciones seriadas de 10 veces de diferentes líneas celulares con HPV. Existía una clara indicación de que una señal positiva era dependiente de la cantidad de ARN inicial y del tiempo. La reacción múltiple simultánea necesitaba más tiempo que la reacción única para mostrar una señal positiva. Esto podría ser debido a una competición en la mezcla más compleja en el recipiente de la reacción múltiple y también al hecho de que la reacción múltiple tiene una concentración diferente y menor de cebador y sonda. La relación entre la cantidad de ARN diana y el tiempo hasta obtener una señal positiva revela la posibilidad de una reacción de amplificación cuantitativa múltiple simultánea en tiempo real con estándares internos de ARN en cada recipiente de reacción.

NASBA en tiempo real: individual frente a múltiple. El NASBA en tiempo real era en general más sensible que el NASBA múltiple simultáneo en tiempo real. Esto era según se esperaba debido a la competición entre los cebadores y sondas en la reacción múltiple simultánea. La concentración final de cebadores y de sondas moleculares fluorescentes fue optimizada en la reacción múltiple de tal manera que para al menos uno de los conjuntos de cebadores y sondas la concentración era menor que en la reacción individual. A partir de esto se deduce que con una concentración menor de cebadores, menos sensible sería la reacción, o al menos menos rápida. Se tardará más tiempo en alcanzar la etapa exponencial de la reacción de amplificación y por tanto más tiempo en detectar los productos. La concentración de los cebadores no será una limitación para la concentración final del producto en la reacción de NASBA, ya que el ADN de doble hebra creado a partir de los cebadores continuará sirviendo como molde para la ARN polimerasa una y otra vez de nuevo en un bucle. La sensibilidad del NASBA múltiple simultáneo en tiempo real era la misma para HPV 16 y HPV 18 en comparación con el NASBA individual en tiempo real, pero la sensibilidad para L1 disminuyó drásticamente desde un límite de detección de 10 (1) en la reacción individual hasta 10^{3} (10^{2}) células CaSki en la reacción múltiple. Para los cebadores de NASBA para U1A, la sensibilidad disminuyó desde 10 (1) a 10^{2} (10) células SiHa, mientras que el límite de detección permanecía igual para las células CaSki. Esta disminución del límite de detección puede ser debida a una competición más compleja de los cebadores y sondas moleculares fluorescentes en la reacción múltiple. La concentración final de cebadores y sondas moleculares fluorescentes puede no ser la mejor y los diferentes cebadores y sondas moleculares fluorescentes en la reacción múltiple pueden interferir entre sí. Los cebadores de NASBA para U1A detectaron 1 célula HeLa. Podría esperarse el mismo nivel de detección en todas las líneas celulares, pero la sensibilidad de las células HeLa era 1/10 del nivel de detección de las células SiHa y CaSki. Estas líneas celulares son células cancerosas y podrían tener diferente impacto en las células de tal manera que la expresión de U1A fuera diferente. Las diferencias pueden ser también debidas a la diferente cantidad de células en cada reacción, debido a errores de contaje durante la recogida de las células.

El NASBA en tiempo real no mostró reactividad cruzada entre HPV 16, 18, 31 y 33 o con HPV 6/11, 35, 39, 45, 51, 52, 58 o HPV X.

La especificidad de la reacción de PCR puede ser mejor que la especificidad de la reacción de NASBA en tiempo real debido a que la reacción de NASBA es una reacción isotérmica a 41ºC, sin posibilidad de cambiar la temperatura de hibridación de los cebadores. Los cebadores son diseñados básicamente de la misma forma que los cebadores de PCR. En una reacción de PCR se tiene la posibilidad de cambiar la temperatura de hibridación, en contraste con la reacción de NASBA, y por tanto elegir una temperatura de hibridación que sea óptima para los dos cebadores. Esto hace que la hibridación de los cebadores sea más específica. Los resultados de la PCR fueron visualizados mediante electroforesis en gel. Pero las sondas moleculares fluorescentes en la reacción de NASBA en tiempo real son un parámetro adicional en comparación con la PCR, y por tanto pueden conferir a la reacción de NASBA total una mejor especificidad. Es también más fácil encontrar dos regiones diferentes en la secuencia del ADN para la hibridación de los cebadores, ya que existe una flexibilidad en la longitud del producto de la PCR mucho mayor que para el producto del NASBA, que debe ser menor de 250 pb. Para la especificidad de la reacción del NASBA es importante elegir un área única que no esté conservada entre los diferentes tipos de HPV. Un par de desacoplamientos de pares de bases puede dar todavía una amplificación o hibridación de la diana.

La detección de células CaSki (con estado integrado y episómico) con los cebadores de NASBA para L1 universales y no de células SiHa o Hela (ambas con el estado integrado) puede dar una indicación de que el HPV integrado no presenta expresión de L1, mientras que el HPV en estado episómico puede tener expresión de L1.

En resumen, se ha desarrollado un ensayo de identificación para HPV de tipo 16, 18, 31 y 33 que puede identificar de manera precisa la expresión de los oncogenes E6/E7 de estos tipos de HPV. El ensayo puede identificar también la expresión de la proteína principal de la cápsida, L1.

Ejemplo 3 Estudio clínico adicional en 190 pacientes Pacientes/muestras clínicas

Biopsias procedentes de 190 mujeres admitidas en el Hospital Central de Østfold para tratamiento de CIN en el periodo de 1999-2001. La edad media de las 190 mujeres incluidas en el estudio fue de 37,4 años (rango 22-74 años). Las biopsias fueron congeladas a -80ºC inmediatamente después de su recogida.

Examen citológico de las muestras

Se utilizaron los informes citológicos de rutina para registrar los hallazgos citológicos. No se intentó volver a evaluar los portas. Cada uno de ellos indicaba una condición CIN II-III, esto es una displasia de grado elevado o HSIL, que era la base para la admisión en el hospital, la colposcopia y la biopsia.

Examen histológico de las muestras

Se tomó una biopsia, denominada en la presente biopsia 1, después de un informe citológico de alto grado. Si confirmaba una lesión de alto grado (CIN II o III), la paciente era admitida de nuevo en el hospital, esta vez para una conización guiada colposcópicamente. Antes de la conización, pero después de aplicar anestesia local, se tomó una segunda biopsia (biopsia 2) de un área de una porción en la que era muy probable que se localizara una displasia, según se estimó a partir de los hallazgos macroscópicos. Esta biopsia (2 x 2 mm) fue congelada dentro de los 2 minutos siguientes en un congelador de -80ºC.

\newpage

La biopsia 2 fue dividida en dos cuando fue congelada y la mitad se utilizó para la extracción de ADN/ARN. La otra mitad fue fijada en formaldehído tamponado al 10% y procesada para el examen histopatológico. Algunas lesiones no estaban orientadas correctamente en el bloque de parafina y tuvieron que ser reorientadas o seccionadas serialmente para mostrar el epitelio superficial relevante. En consecuencia, no pudo garantizarse que se hubiera utilizado exactamente el mismo tejido para la extracción y para la evaluación histopatológica. El espécimen cónico, finalmente, fue evaluado por el patólogo local que en todos los casos pudo confirmar la presencia de displasia. No era siempre el mismo grado que en la biopsia original y, en muchos casos, no era el mismo que en la biopsia 2.

Extracción de ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos fueron aislados utilizando el Nuclisens Extractor automatizado según se describió previamente (Boom y col., 1990). Cada biopsia fue cortada en dos fragmentos, uno destinado al examen histológico y la otra mitad para el análisis de ARN. El material destinado al análisis de ARN fue dividido en fragmentos más pequeños mientras se mantenía en nieve carbónica (-80ºC) y se puso en 1 ml de tampón de lisis (igual que anteriormente) seguido por 20 segundos de homogenización utilizando trituradores desechables. Cien mililitros de la muestra fueron diluidos posteriormente 10 veces en tampón de lisis y luego 100 ml fueron extraídos para determinar ADN/ARN. El ADN/ARN extraído fue diluido con \sim40 ml de tampón de elución (Organon Teknika) y almacenado a -70ºC.

Todas las sondas moleculares fluorescentes ("beacons") utilizadas en este estudio emplean el fluoróforo FAM (6-carboxifluoresceína) en el extremo 5' de la estructura. Éste fue unido a una secuencia variable del bucle troncal acoplada al amortiguador universal ácido 4-(4'-diametilaminofenilazo)benzoico (DABCYL) en el extremo 3'. Las sondas fueron suministradas por Eurogentec, Bélgica. La concentración final de sondas moleculares fluorescentes utilizada en la reacción fue de 2,5 mM. Para el NASBA en tiempo real utilizamos el kit Nuclisens Basic Kit (Organon Teknika, Países Bajos), destinado al desarrollo de ensayos de amplificación de ARN definidos por el usuario. La amplificación mediante NASBA se llevó a cabo en un volumen de 20 \mul. Los conjuntos de cebadores y las sondas estaban dirigidos contra el ARNm de E6/E7 de longitud completa de los HPV de alto riesgo 16, 18, 31 y 33. Como control de funcionamiento, para evitar resultados negativos falsos debido a la degradación del ácido nucleico, utilizamos un conjunto de cebadores y una sonda dirigidos contra la proteína A específica de la ribonucleoproteína nuclear pequeña (snRNP) U1 humana (ARNm de U1A) (Nelissen y col., 1991). Todas las muestras fueron procesadas por duplicado en máquinas separadas (lectores de microplacas para medir la fluorescencia y la absorbancia, Bio-tek FL-600 FA de MWG). El ARNm aislado de células CaSki/SiHa o HeLa sirvió como control positivo para los transcritos de HPV 16 y HPV 18, respectivamente. Los controles negativos, incluidos para cada reacción 7, consistían en una reacción que contenía todos los reactivos excepto ARNm.

Análisis del ADN del HPV; Reacción en Cadena de la Polimerasa

Se utilizaron para la PCR los mismos extractos y las mismas cantidades que las utilizadas en la reacción de NASBA. Se utilizaron los cebadores Gp5+/Gp6+ consenso para L1 con el fin de detectar todas las muestras que contenían ADN de HPV. La amplificación por PCR se llevó a cabo según se describió anteriormente. La primera desnaturalización del ADN se realizó durante 2 minutos a 94ºC, posteriormente se realizaron 40 ciclos de PCR: desnaturalización durante 1 minuto a 94ºC, hibridación durante 2 minutos a 40ºC, extensión durante 1,5 minutos a 72ºC, seguido por una extensión final durante 4 minutos a 72ºC. La tipificación del HPV se realizó utilizando cebadores de PCR específicos de tipo frente a HPV 16, 18, 31 y 33 (6/11, 35, 45, 51, 52, 58), según se describió anteriormente.

Resultados

Originalmente se sometieron a biopsia 190 pacientes después de haber sido diagnosticadas de CIN I, CIN II o CIN III mediante citología. Una lesión de alto grado fue confirmada por examen histológico, 150 muestras diagnosticadas como CIN III (78,9%). La biopsia 2, tomada antes de la conización, fue utilizada para el análisis de ARN. Sin embargo, el examen histológico de esta biopsia diagnosticó solamente 53 muestras de las 150 originales como CIN III [a 54 no se les dio ningún diagnóstico, 24 fueron diagnosticadas como CIN II, 18 como CIN I y 4 como HPV/condiloma]. El número de muestras con CIN II aumentó de 16 (8,4%) a 30 (15,8%) [por la Histología I, 24 fueron diagnosticadas como CIN III, 4 como CIN II, 1 como carcinoma y 1 como CIN I. A 12 casos de CIN II de la Histología I se les dio un diagnóstico inferior en la Histología II]. El grado de CIN I aumentó de 6 muestras (3,2%) a 32 muestras (16,8%). Los 2 carcinomas de células escamosas fueron diagnosticados en la Histología II como CIN III, el adenocarcinoma como CIN II. En 71 muestras (38,4%), no se detectaron lesiones de grado alto.

ARN oncogénico de HPV fue detectado en 69 (36%) de las 190 pacientes. De las 53 muestras (28%) diagnosticadas como CIN III en la Histología II, encontramos 40 casos (76%) que presentaban la expresión oncogénica de HPV 16, 18, 31 ó 33. Además, encontramos expresión oncogénica en 9 de 30 casos (30%) de CIN II, en 4 de 32 casos (13%) de CIN I, en 14 de 71 casos (20%) que no presentaban anormalidades celulares y en 2 de 4 muestras (50%) diagnosticadas como HPV/condiloma.

Se encontró ARN de HPV 16 en 42 de las 190 pacientes, se encontró HPV 18 en 7 (3,7%), HPV 31 en 15 (7,9%) y HPV 33 en 8 (4,2%). Una paciente tenía una infección mixta con HPV 16 y HPV 18, y una con HPV 16 y HPV 31.

\newpage

Utilizando los cebadores consenso Gp5+/Gp6+ dirigidos contra el gen L1, que codifica la proteína principal de la cápsida, la PCR detectó HPV en 81 de las 190 biopsias cervicales (43%). De los 119 casos a los que se dio un diagnóstico en el segundo examen histológico (115 diagnosticados como CIN, 4 como HPV/condiloma), se encontraron 63 que contenían ADN de HPV. A los 18 casos adicionales detectados no se les dio ningún diagnóstico histológico. De los 81 casos, 20 no fueron detectados por NASBA; a 7 de éstos se les dio el diagnóstico de CIN III, 2 fueron diagnosticados como CIN II, 4 diagnosticados como CIN I y a 7 no se les dio ningún diagnóstico.

La PCR específica de tipo detectó 85 casos que contenían HPV; 66 que tenían HPV 16, 10 HPV 18, 14 HPV 31 y 7 HPV 33. Doce casos tenían infección múltiple: 3 con HPV 16+18, 4 con HPV 16+33, 5 con HPV 16+31. Hubo 20 sin diagnóstico.

Ejemplo 4 HPV detectado por PreTect HPV-Proofer y PCR en comparación con la citología y la Histología

Se determinaron por citología muestras normales y con ASCUS (incluyendo frotis dudosos). Todas las muestras fueron analizadas con PCR consenso y PreTect HPV-Proofer, pero únicamente las muestras positivas para el consenso fueron tipificadas por PCR. Las muestras con CIN III y cáncer fueron determinadas por histología y todas las muestras fueron analizadas con los tres métodos. Los resultados están mostrados en la Figura 6. La concordancia entre el NASBA múltiple simultáneo en tiempo real y la PCR en comparación con la citología o la histología está mostrada en la Tabla 15 siguiente.

TABLA 15 Concordancia entre el NASBA múltiple en tiempo real y la PCR en comparación con la citología o la histología

34

Solamente se han tipificado las muestras positivas por la PCR con Gp5+/6+.

^{a} Incluyendo muestras positivas y negativas en PCR y NASBA múltiple simultáneo en tiempo real. ^{b} Incluyendo solamente las muestras positivas en PCR y/o en NASBA múltiple simultáneo en tiempo real. ^{c} ASCUS excluyendo los frotis dudosos.

Ejemplo 5

Se proporciona un kit para la detección de transcritos de ARNm del(los) gen(es) E6 de HPV, conteniendo el kit uno o más de, dos o más de, y preferiblemente todos, los pares de cebadores siguientes y las sondas de identificación acompañantes.

100

1000

101

\newpage

Como alternativa a las sondas mostradas anteriormente, el kit puede incluir opcionalmente una o más de las sondas moleculares fluorescentes ("beacons") siguientes:

Sondas Moleculares Fluorescentes ("beacons"):

102

Preferiblemente, el kit incluye también los siguientes pares de cebadores y sondas:

103

La sonda de HPV 45 anterior puede ser sustituida por una sonda molecular fluorescente para HPV según sigue:

104

Además, el kit puede incluir uno o más de los pares de cebadores y sondas de identificación acompañantes siguientes, dependiendo del área geográfica de utilización del kit.

105

106

Las sondas anteriormente mostradas pueden ser sustituidas en el kit por las sondas moleculares fluorescentes ("beacons") siguientes:

107

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> NORCHIP A/S

\vskip0.400000\baselineskip

<120> MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE ARNm DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO

\vskip0.400000\baselineskip

<130> SCB/NLW/58858/001

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Versión 3.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccacaggagc gacccagaaa gtta

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acggtttgtt gtattgctgt tc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccacaggagc gacccagaaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtttgttgt attgctgttc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attcccatct ctatatacta

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcacgtcgca gtaactgt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgcttgcag tacacaca

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcagtacac acattcta

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagtacaca cattctaa

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acagttatgc acagagct

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atattagaat gtgtgtac

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttagaatgtg tgtactgc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaatgtgtgt actgcaag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acagttatgc acagagct

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atattagaat gtgtgtac

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttagaatgtg tgtactgc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaatgtgtgt actgcaag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctttgctttt cgggatttat gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatgactttg cttttcggga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatgactttg cttttcggga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagaggagga ggatgaaata gta

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcacaaccga agcgtagagt cacac

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggacaagca gaaccggaca gagc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagaggagga ggatgaaata ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcacaaccga agcgtagagt ca

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcagaaccg gacagagccc atta

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgatgaaat agatggagtt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacggacaca caaaggacag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agccgaacca caacgtcaca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaaacgatg aaatagatgg ag

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaccacgga cacacaaagg acag

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaccacaac gtcacacaat g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaccacaac gtcacacaat g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttccggttga ccttctatgt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtcgtctgc tgagctttct

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaagacata gaaataacct g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acccagtgtt agttagtt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcaagacag tattggaact

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaaataccc tacgatgaac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggacacaacg gtctttgaca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atagggacga cacaccacac ggag

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaaataccc tacgatgaac ta

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggacacaa cggtctttga ca

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tagggacgac acaccacacg ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actgacctcc actgttatga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatctacttg tgtgctctgt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacaagcaga accggacaca tc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgacctccac tgttatgagc aatt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcgaatatc tacttgtgtg ctctgt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggacaagcag aaccggacac atccaa

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggacaagcag aaccggacac atccaa

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actgacctcc actgttat

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacgattcca aatgagccca t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatcctgaac caactgacct at

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgacacata aacgaactg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagatggaca agcacaacc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcctgaacca actgacctat

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccataagta gttgctgtat

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggacaagcac aaccagccac agc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggacaagcac aaccagccac agc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacctttgtg tcctcaagaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggtcagttg gttcaggata

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaaactgca ctgtgacgtg t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attacagcgg agtgaggtat

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtctttgctt ttcaactgga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atagagaagg ccagccatat

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagaggagg aggaagatac ta

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gattatgctc tctgtgaaca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgaggcaa ctgacctata

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcaatgtgt gtgctctgta

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacaagcaaa accagacacc tccaa

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacaagcaaa accagacacc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgtgtgagg tgctggaaga at

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctctcttc taatgttt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgcctacgc tttttatcta

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgcctacgc tttttatcta

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggtctcca acactctgaa ca

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcaaacaag cgatttca

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcaggcgttg gagacatc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcaatcgta agcacact

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctgtgcatg aaatcgaa

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcacacttt acatactg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgaaatgcgt tgaatgca

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgcagcgat ctgaggtata tg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacactgctg gacaacat

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcatcttctg agctgtct

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacactgctg gacaacatgc a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcacatcca cagcaacagg tca

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtagggttac attgctatga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtagggttac attgctatga gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgacctgttg ctgtggatgt ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacctgaatc gtccgccat

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atwgtgtgtc ccatctgc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccataa atgtataga

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caccgcaggc accttattaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaattagag aattaaga

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagacgacc actacagcaa a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaccgagtc cgagtaata

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atagggacgg ggaaccact

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tattactcgg actcggtgt

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttgggtttc tcttcgtgtt a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaccacaaa acgggaggac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaatagatg aacccgacca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcacaccacg gacacacaaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tagccagacg ggatgaacca cagc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaccattgaa cccagcagaa a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctttcttgc cgtgcctggt ca

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaccgaggg cagtgtaata

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaccattgaa cccagcagaa a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctttcttgc cgtgcctggt ca

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaaccattg aacccagcag aaaa

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgctatact tgtgtttccc tacg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaccgaggg cagtgtaata

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggacaaacga agatttcaca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttgacctgt tgtgttacca gcaat

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caccacggac acacaaagga caag

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgttgacct gttgtgttac ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccacggacac acaaaggaca ag

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttgacctgt tgtgttacga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acggacacac aaaggacaag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagtcagagg aggaaaacga tg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggaaaacga tgaagcagat ggagt

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaactacca gcccgacgag ccgaa

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaggaggat gaagtagata

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcccattaac atctgctgta

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaggaggag gatgaagtag ata

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgggcaaac caggcttagt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaggtgttc aagtgtagta

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggcagtgga aagcagtgga gaca

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggggtgct ggagacaaac atct

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcatcctca tcctcatcct ctga

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggggtgctg gagacaaaca tc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catcctcatc ctcatcctct ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggggtgct ggagacaaac at

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccacaaactt acactcacaa ca

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaagtaccaa cgctgcaaga cgt

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaactaaca cctcaaacag aaat

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtaccaacg ctgcaagacg tt

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggacagct cagaggatga gg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gattttcctt atgcagtgtg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacatctgta gcaccttatt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactattcag tgtatggagc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caactgayct myactgttat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caactgayct myactgttat ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaamcaactg acctaywctg ctat

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaamcaactg acctaywctg ctat

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagacattat tcagactc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagacattat tcagactc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatggcattt gttggggtaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcatattcct ccccatgtc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgttactgt tgttgatact ac

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatggcattt gttggsrhaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcatattcct cmmcatgdc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgttactgt tgttgatacy ac

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgttactgt tgttgatacc ac

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatggcattt gttggsnnaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatggcattt gttggnnhaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatggcattt gttggnrnaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actggcattt gttggggtaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatggcattt gttggggaaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatggcattt gttggcataa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 162

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatggcattt gttggggcaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 163

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatggcattt gttggcacaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 164

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcatattcct cmncatgnc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 165

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcatattcct caacatgnc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 166

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcatattcct cnncatgtc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 167

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcatattcct cnncatggc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 168

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcatattcct cnncatgac

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 169

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcatattcct cnncatgcc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para ser incorporada en los cebadores del NASBA a fin de facilitar la hibridación con la sonda de detección universal ECL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia promotora para ser incorporada en los oligonucleótidos cebadores P1 del NASBA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta taggg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 172

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag ccacaggagc gacccagaaa gtta

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 174

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gacggtttgt tgtattgctg ttc

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 175

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag ccacaggagc gacccagaaa

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 176

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gggtttgttg tattgctgtt c

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gattcccatc tctatatact a

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 178

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtcacgtcgc agtaactgt

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gttgcttgca gtacacaca

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtgcagtaca cacattcta

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggcagtacac acattctaa

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag acagttatgc acagagct

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag atattagaat gtgtgtac

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag ttagaatgtg tgtactgc

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 185

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag gaatgtgtgt actgcaag

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 186

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcatgtatg actttgcttt tcgggacatg cg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 187

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagcttatg actttgcttt tcgggaagct gg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 188

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacgctatga ctttgctttt cgggagcgtg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 189

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatcgtatg actttgcttt tcgggacgat cg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 190

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 190

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag cagaggagga ggatgaaata gta

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 191

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggcacaaccg aagcgtagag tcacac

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 192

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag cagaggagga ggatgaaata ga

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 193

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggcacaaccg aagcgtagag tca

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 194

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag acgatgaaat agatggagtt

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gcacggacac acaaaggaca g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 196

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag gaaaacgatg aaatagatgg ag

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gacaccacgg acacacaaag gacag

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcatggaac cacaacgtca cacaatgcat gcg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 199

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 199

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgtcggaac cacaacgtca cacaatgcga cgg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 200

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggaccgaac cacaacgtca cacaatgggt ccg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 201

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatcggaac cacaacgtca cacaatgcga tcg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 202

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 202

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag ttccggttga ccttctatgt

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 203

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 203

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gggtcgtctg ctgagctttc

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 204

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag gcaagacata gaaataacct g

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 205

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 205

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gacccagtgt tagttagtt

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 206

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 206

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag ggaaataccc tacgatgaac

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 207

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 207

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gggacacaac ggtctttgac a

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 208

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 208

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag ggaaataccc tacgatgaac ta

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 209

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gctggacaca acggtctttg aca

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 210

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag actgacctcc actgttatga

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 211

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtatctactt gtgtgctctg t

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 212

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag tgacctccac tcttatgagc aatt

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtgcgaatat ctacttgtgt gctctgt

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 214

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaagggga caagcagaac cggacacatc caaccttcgg

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 215

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgtcgggac aagcagaacc ggacacatcc aacgacgg

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 216

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacgtcggga caagcagaac cggacacatc caacgacgtg

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 217

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 217

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcagcggac aagcagaacc ggacacatcc aagctgcg

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 218

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 218

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatcgggac aagcagaacc ggacacatcc aacgatcg

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 219

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 219

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag actgacctcc actgttat

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 220

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 220

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gcacgattcc aaatgagccc at

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 221

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag tatcctgaac caactgacct at

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 222

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gttgacacat aaacgaactg

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 223

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag tcctgaacca actgacctat

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 224

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 224

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gcccataagt agttgctgta t

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 225

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 225

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaagcggac aagcacaacc agccacagcg cttgg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 226

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaagcggga caagcacaac cagccacagc cgcttgg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 227

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccagcggac aagcacaacc agccacagcg ctggg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 228

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaaagcgga caagcacaac cagccacagc gctttgg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 229

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 229

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctgcggaca agcacaacca gccacagcgc agg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 230

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 230

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatcgggac aagcacaacc agccacagcc gatcg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag gacctttgtg tcctcaagaa

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 232

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gaggtcagtt ggttcaggat a

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 233

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag attacagcgg agtgaggtat

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 234

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggtctttgct tttcaactgg a

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 235

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 235

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag tcagaggagg aggaagatac ta

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 236

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 236

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggattatgct ctctgtgaac a

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 237

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 237

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag cccgaggcaa ctgacctata

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 238

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggtcaatgtg tgtgctctgt a

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 239

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag ttgtgtgagg tgctggaaga at

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gccctctctt ctaatgttt

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 241

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 241

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag gtgcctacgc tttttatcta

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 242

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gggggtctcc aacactctga aca

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 243

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 243

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag tcaggcgttg gagacatc

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 244

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gagcaatcgt aagcacact

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 245

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag tctgtgcatg aaatcgaa

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 246

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gagcacactt tacatactg

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 247

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag tacactgctg gacaacat

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 248

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtcatcttct gagctgtct

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 249

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag tacactgctg gacaacatgc a

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 250

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 250

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggtcacatcc acagcaacag gtca

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 251

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag tgacctgttg ctgtggatgt ga

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 252

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtacctgaat cgtccaccat

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 253

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 253

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag catgccataa atgtataga

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 254

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gcaccgcagg caccttatta a

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 255

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag gcagacgacc actacagcaa a

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 256

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gacaccgagt ccgagtaata

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 257

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag tattactcgg actcggtgt

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 258

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gcttgggttt ctcttcgtgt ta

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 259

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 259

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag gaaatagatg aacccgacca

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 260

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 260

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggcacaccac ggacacacaa a

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 261

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 261

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag aaccattgaa cccagcagaa a

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 262

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtctttcttg ccgtgcctgg tca

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 263

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 263

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag aaccattgaa cccagcagaa a

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 264

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtctttcttg ccgtgcctgg tca

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 265

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 265

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag gaaaccattg aacccagcag aaaa

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 266

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 266

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gttgctatac ttgtgtttcc ctacg

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 267

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag gttgacctgt tgtgttacca gcaat

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 268

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 268

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gcaccacgga cacacaaagg acaag

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 269

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag ctgttgacct gttgtgttac ga

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 270

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gccacggaca cacaaaggac aag

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 271

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 271

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag gttgacctgt tgtgttacga

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 272

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 272

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gacggacaca caaaggacaa g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 273

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 273

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag ggaggaggat gaagtagata

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 274

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggcccattaa catctgctgt a

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 275

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 275

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag agaggaggag gatgaagtag ata

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 276

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 276

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gacgggcaaa ccaggcttag t

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 277

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 277

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag ttggggtgct ggagacaaac atct

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 278

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 278

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gttcatcctc atcctcatcc tctga

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 279

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 279

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag tggggtgctg gagacaaaca tc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 280

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gcatcctcat cctcatcctc tga

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 281

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 281

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag ttggggtgct ggagacaaac at

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 282

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 282

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gccacaaact tacactcaca aca

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 283

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag gattttcctt atgcagtgtg

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 284

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 284

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggacatctgt agcaccttat t

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 285

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 285

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcatgcaac tgayctmyac tgttatgaca tgcg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 286

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 286

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgtcgcaac tgayctmyac tgttatgacg acgg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 287

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 287

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaccccaac tgayctmyac tgttatgagg gtgg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 288

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatcgcaac tgayctmyac tgttatgacg atcg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 289

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaagcgaam caactgacct aywctgctat gcttgg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 290

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 290

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaagccgaa mcaactgacc taywctgcta tggcttgg

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 291

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaagcggaa mcaactgacc taywctgcta tcgcttgg

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 292

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 292

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagcggaam caactgacct aywctgctat cgctgg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 293

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 293

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatcggaam caactgacct aywctgctat cgatcg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 294

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaagcaaga cattattcag actcgcttgg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 295

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 295

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcatgaaga cattattcag actccatgcg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 296

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 296

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccagcaaga cattattcag actcgctggg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 297

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 297

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatcgaaga cattattcag actccgatcg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 298

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 298

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag aatggcattt gttggggtaa

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 299

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 299

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtcatattcc tccccatgtc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 300

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 300

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag aatggcattt gttggsrhaa

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 301

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtcatattcc tcmmcatgdc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 302

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (37)..(37)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (38)..(38)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 302

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag aatggcattt gttggsnnaa

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 303

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (36)..(36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (37)..(37)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 303

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag aatggcattt gttggnnhaa

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 304

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (36)..(36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (38)..(38)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 304

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag aatggcattt gttggnrnaa

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 305

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 305

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag aatggcattt gttggggtaa

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 306

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag aatggcattt gttggggaaa

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 307

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 307

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag aatggcattt gttggcataa

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 308

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 308

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag aatggcattt gttggggcaa

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 309

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 309

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgcaaggt cgcatatgag aatggcattt gttggcacaa

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 310

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (44)..(44)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (49)..(49)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 310

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtcatattcc tcmncattgnc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 311

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (49)..(49)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 311

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtcatattcc tcaacatgnc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 312

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (43)..(43)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (44)..(44)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 312

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtcatattcc tcnncatgtc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 313

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (43)..(43)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (44)..(44)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 313

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtcatattcc tcnncatggc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 314

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (43)..(43)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (44)..(44)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 314

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtcatattcc tcnncatgac

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 315

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de NASBA para HPV

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (43)..(43)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (44)..(44)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" representa inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 315

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtcatattcc tcnncatgcc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 316

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 316

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacactgctg gacaacat

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 317

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 317

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcatcttctg agctgtct

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 318

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 318

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcaaaagcca ctgtgtcctg a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 319

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 319

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtgttcttg atgatctgca a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 320

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 320

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttccggttga ccttctatgt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 321

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtcgtctgc tgagctttct

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 322

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctacagtaag cattgtgcta tgc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 323

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 323

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgtaatgga gaggttgcaa taaccc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 324

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacgccatga gaggacacaa g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 325

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 325

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acacataaac gaactgtggt g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 326

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 326

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgaggcaa ctgacctata

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 327

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 327

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggcacact attccaaatg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 328

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 328

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagacgacc actacagcaa a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 329

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 329

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaccgagtc cgagtaata

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 330

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 330

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaaccattg aacccagcag aaaa

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 331

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 331

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgctatact tgtgtttccc tacg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 332

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 332

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaggaggat gaagtagata

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 333

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 333

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcccattaac atctgctgta

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 334

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 334

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgcctacgc tttttatcta

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 335

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 335

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggtctcca acactctgaa ca

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 336

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcaggcgttg gagacatc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 337

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 337

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcaatcgta agcacact

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 338

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 338

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttgttactg tggtagatac tac

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 339

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 339

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaaaataaa ctgtaaatca tattc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 340

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 340

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acacaactgt gttcactagc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 341

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 341

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaacccaag agtcttctct

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 342

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 342

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatcggtac cgagggcagt gtaatacgat cg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 343

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 343

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatcggtgc ctacgctttt tatctacgat cg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 344

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 344

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgtcgttgc agcgatctga ggtatatgcg acgg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda molecular fluorescente para HPV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 345

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatcgtggc agtggaaagc agtggagaca cgatcg

\hfill

36

Claims

1. Un método in vitro para el cribado de sujetos humanos con el fin de determinar su riesgo de desarrollar carcinoma cervical, método que comprende la selección del sujeto por la expresión de transcritos de ARNm del gen E6 de cada uno, y únicamente, de los tipos de HPV 16, 18, 31, 33 y 45 utilizando una técnica de amplificación y clasificando al sujeto en una de dos categorías de riesgo de desarrollar carcinoma cervical sobre la base de la expresión del ARNm de E6 de al menos uno de dichos tipos de HPV, en el que los individuos positivos para la expresión de dicho ARNm de E6 de al menos uno de dichos tipos de HPV son calificados como portadores de HPV integrado y son por tanto clasificados como de alto riesgo de desarrollar carcinoma cervical, mientras que los individuos negativos para la expresión de todos los ARNm de E6 son calificados como no portadores de HPV integrado y son por tanto clasificados como sin riesgo detectable de desarrollar carcinoma cervical.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la selección por dicha expresión del ARNm de E6 es llevada a cabo utilizando una amplificación isotérmica en combinación con la detección en tiempo real del producto de amplificación.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la amplificación isotérmica es NASBA, una amplificación mediada por la transcripción, una amplificación de ARN mediada por una señal o una amplificación isotérmica en fase de solución.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la selección por dicha expresión del ARNm de E6 es llevada a cabo utilizando NASBA en tiempo real.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los sujetos humanos son sujetos previamente identificados como infectados con ADN del virus del papiloma humano en células del cérvix.

6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los sujetos humanos son sujetos con un diagnóstico previo de ASCUS, lesiones CIN I o condiloma.