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ES2281529T3 - Peptidos eficaces en el tratamiento de tumores y otras afecciones que requieren la eliminacion o destruccion de celulas. - Google Patents

Peptidos eficaces en el tratamiento de tumores y otras afecciones que requieren la eliminacion o destruccion de celulas. Download PDF

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ES2281529T3
ES2281529T3 ES02748517T ES02748517T ES2281529T3 ES 2281529 T3 ES2281529 T3 ES 2281529T3 ES 02748517 T ES02748517 T ES 02748517T ES 02748517 T ES02748517 T ES 02748517T ES 2281529 T3 ES2281529 T3 ES 2281529T3
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ES
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homo sapiens
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Paul A. Averback
Jack Gemmell
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Nymox Corp
Original Assignee
Nymox Corp Canada
Nymox Corp
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Abstract

Un péptido NTP que consiste en una secuencia de amino ácido seleccionado de un grupo constituido por: (Ver secuencias)

Description

Péptidos eficaces en el tratamiento de tumores y otras afecciones que requieren la eliminación o destrucción de células.
Campo de la invención
La presente invención se dirige al uso de los péptidos que consisten en la SEQ Nº 11-16 para tratar afecciones que requieren la eliminación o destrucción de los elementos celulares, tales como tumores benignos o malignos en humanos.
Antecedentes de la invención
La esencia de muchos tratamientos y procedimientos médicos implican la eliminación o destrucción del tejido perjudicial o no deseado. Ejemplos de dichos tratamientos importantes incluyen a eliminación quirúrgica del crecimiento canceroso, la destrucción de tumores metastáticos a través de quimioterapia y la reducción de la hiperplasia glandular (por ejemplo la próstata). Otros ejemplos incluyen la eliminación de pelo facial no deseado, verrugas, tejidos subcutáneos, tejido linfático o tejido graso.
Hay una necesidad de un agente efectivo que pueda destruir y por tanto facilitar la eliminación o inhibición del crecimiento adicional de las células y tejidos perjudiciales o no deseados, pero con principalmente ausencia de efectos locales de toxicidad sistémica o mínima. Las proteínas de filamento neural y sus moléculas relacionadas son una clase de dichos agentes según se describe en el documento 2003/0054990 de Estados Unidos titulado: Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins, presentado el 8 de Marzo de 2002. Los péptidos que contienen secuencias de amino ácidos que corresponden a una parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína de filamento neural, el AD7c-NTP son también dichos agentes. Estos péptidos se describen en el documento 2003/0096350, titulado: Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removel or Destruction of Cells, presentado el 24 de Mayo de 2002.
El cáncer es una anormalidad en los mecanismos reguladores internos de las células que dan como resultado en el crecimiento y reproducción incontrolados de la célula. Las células normales hacen los tejidos y cuando esas células pierden su capacidad para comportarse como una unidad específica, controlada y coordinada (de diferenciación), el defecto conduce a un desorden entre la población de la célula. Cuando esto ocurre, se forma un tumor.
Los sobrecrecimientos benignos de tejidos son anormalidades en las cuales es deseable eliminar células de un organismo. Los tumores benignos son proliferaciones celulares no metastáticos por todo el cuerpo pero tienen, sin embargo, síntomas que causan la enfermedad. Dichos tumores pueden ser letales si se localizan en áreas inaccesibles en órganos tales como el cerebro. Hay tumores benignos de órganos que incluyen pulmón, cerebro, piel, pituitaria, tiroides, corteza y médula suprarrenal, ovario, útero, testículos, tejido conectivo, músculo, intestinos, oreja, nariz, garganta, amígdala, boca, hígado, vesícula biliar, páncreas, próstata, corazón y otros órganos.
A menudo la cirugía es la primera etapa en el tratamiento del cáncer. El objetivo de la cirugía varía. Algunas veces se usa para eliminar la evidencia del tumor tanto como sea posible, o al menos "debulk" (eliminar la mayor masa(s) de tumor para que haya una menor necesidad de ser tratado por otros medios). Dependiendo del tipo y la ubicación del cáncer, la cirugía también puede proporcionar algún alivio sintomático al paciente. Por ejemplo, si un cirujano puede eliminar una gran parte de un tumor cerebral extendido, la presión disminuirá en el interior del cráneo, llevando a cabo una mejora en los síntomas del paciente.
No todos los tumores son susceptibles de cirugía. Algunos se localizan en partes del cuerpo que hacen que sea imposible su eliminación completa. Ejemplos de estos serían los tumores en el tronco del encéfalo (una parte del cerebro que controla la respiración) o un tumor que tiene un mayor crecimiento alrededor de los vasos sanguíneos. En estos casos, el papel de la cirugía se limita debido al alto riesgo asociado con la eliminación del tumor.
En algunos casos, la cirugía no se usa para eliminar el tumor porque no es necesario. Un ejemplo es el linfoma de Hodgkin, un cáncer de nódulos linfáticos que responde muy bien a las combinaciones de quimioterapia y terapia de radiación. En el linfoma de Hodgkin, la cirugía es raramente necesaria para lograr la cura, pero casi siempre se usa para establecer un diagnóstico.
La quimioterapia es una forma común de tratamiento del cáncer que implica el uso de medicamentos (normalmente administrados por la boca o por inyección) que específicamente ataca rápidamente a la división de las células (tal como se encuentran en el tumor) por todo el cuerpo. Esto hace útil la quimioterapia en el tratamiento de los cánceres que ya tienen metástasis, así como los tumores que tienen una alta posibilidad de propagación a través de la sangre y los sistemas linfáticos pero no son evidentes más allá del tumor primario. La quimioterapia también se puede usar para aumentar la respuesta para tumores localizados para cirugía y terapia de radiación. Éste es el caso, por ejemplo, para algunos cánceres de la cabeza y cuello.
Desafortunadamente, hay otras células en el cuerpo humano que normalmente tienen una rápida división (tal como el recubrimiento del estómago y cabello) que también están afectadas por quimioterapia. Por esta razón, muchos agentes de quimioterapia provocan efectos secundarios indeseables tales como nauseas, vómitos, anemia, pérdida de pelo u otros síntomas. Estos efectos secundarios son temporales y existen medicamentos que pueden ayudar a aliviar muchos de estos efectos secundarios. A medida que nuestro conocimiento continua creciendo, los investigadores han ideado nuevos agentes quimioterapéuticos que no sólo son mejores para la muerte de las células del cáncer, sino que también tienen pocos efectos secundarios para el paciente.
La quimioterapia se administra a pacientes en una variedad de formas. Algunas en forma de píldoras y otras se administran por inyección intravenosa o de otra forma. Para la quimioterapia inyectable, un paciente va a la consulta del médico o al hospital para el tratamiento. Otros agentes quimioterapéuticos requieren una solución continua en la corriente sanguínea, 24 horas al día. Para estos tipos de quimioterapia, un procedimiento quirúrgico leve se lleva a cabo para implantar una pequeña bomba usada por el paciente. Entonces la bomba administra lentamente la medicación. En muchos casos, un implante permanente se coloca en la vena del paciente para eliminar el requisito de repetidos pinchazos con aguja.
La terapia de radiación es otra terapia comúnmente usada como arma en la lucha contra el cáncer. La radiación mata el cáncer dañando el ADN dentro de las células tumorales. La radiación se desarrolla por diferentes vías, la más común implica hacer incidir un haz de radiación al paciente de una manera altamente precisa, enfocando sobre el tumor. Para hacer esto, un paciente se tumba sobre una mesa y el haz se mueve alrededor de él/ella. El procedimiento dura minutos, pero puede hacerse diariamente durante varias semanas (dependiendo del tipo de tumor), para lograr una particular dosis prescrita total.
Otro procedimiento de radiación empleado algunas veces, llamado braquiterapia, implica tomar gránulos radiactivos (semillas) o alambres e implantarlos en el cuerpo en el área del tumor. Los implantes pueden ser temporales o permanentes. Para implantes permanentes, la radiación en las semillas se desintegra durante un periodo de días o semanas de modo que el paciente no es radiactivo. Para implantes temporales, las dosis enteras de radiación se desarrollan normalmente en pocos días, y el paciente debe quedarse en el hospital durante ese tiempo. Para ambos tipos de braquiterapia, la radiación se desarrolla generalmente en un área orientada a obtener un control local del cáncer (tan opuesto para tratar el cuerpo entero, como hacer quimioterapia).
Algunos pacientes se pueden elegir para transplantes de médula ósea. Este procedimiento se realiza normalmente o porque un paciente tiene un cáncer que es particularmente agresivo o porque tiene un cáncer que ha recaído después de ser tratado con la terapia convencional. El transplante de médula ósea es un procedimiento complicado. Hay muchos tipos y varían en su potencial para causar efectos secundarios y curar. Se realizan más transplantes en centros especiales y en muchos casos, su uso se considera de investigación.
Existen un número de otras terapias, aunque muchas de ellas todavía se están explorando en ensayos clínicos y aún no han llegado a ser de uso estándar. Los ejemplos incluyen el uso de inmunoterapia, anticuerpos monoclonales, factores anti-angiogénesis y terapia de gen.
Inmunoterapia: Hay varias técnicas diseñadas para ayudar al sistema inmune propio del paciente en la lucha contra el cáncer, bastante separado de la radiación o quimioterapia. A menudo, para lograr el objetivo de los investigadores se inyecta al paciente con una vacuna especialmente derivada. Anticuerpos monoclonales: Estos son anticuerpos diseñados para atacar a las células cancerosas (y no a las células normales) para sacar ventaja de las diferencias entre las células cancerosas y no cancerosas en sus antígenos y/o otras características. Los anticuerpos se pueden administrar al paciente sólo o conjugado a varios compuestos citotóxicos o en forma radioactiva, tal que el anticuerpo origina preferiblemente las células cancerosas, de ese modo desarrolla el agente tóxico o radioactividad para las células deseadas.
Factores anti-angiogénesis: Tan rápidamente como las células de cáncer se dividen y los tumores crecen, pueden hacer que los suministros de sangre sean pequeños. Para compensar esto, algunos tumores secretan una sustancia creada para ayudar a inducir el crecimiento de los vasos sanguíneos en sus proximidades, así proporcionan las células de cáncer con una fuente vascular de nutrientes. Las terapias experimentales se han diseñado para frenar el crecimiento de los vasos sanguíneos a tumores.
Terapia de gen: el cáncer es el producto de una serie de mutaciones que últimamente se dirige a la producción de una célula de cáncer y su excesiva proliferación. Los cánceres se pueden tratar mediante la introducción de genes a las células de cáncer que actúa o para comprobar o parar la proliferación del cáncer, apagar los mecanismos de células programadas de células para destruir la célula, aumentar el reconocimiento inmune de la célula o expresar un profármaco que convierta a un metalito tóxico o una citoquina que inhibe el crecimiento del tumor.
También se pueden tratar los tumores benignos y malformaciones mediante una variedad de procedimientos que incluyen cirugía, radioterapia, terapia de fármaco, ablación térmica o eléctrica, ciroterapia y otros. Aunque los tumores benignos no se metastatizan pueden crecer grande y pueden repetirse. La extirpación quirúrgica de los tumores benignos tiene todas las dificultades y efectos secundarios de la cirugía en general y a menudo puede realizarse repetidamente para algunos tumores benignos, tal como para adenomas de pituitaria, meningeomas del cerebro, hiperplasia prostática y otras.
Aún hay otras afecciones que implican elementos celulares no deseados que existen donde se desea la eliminación celular. Por ejemplo, la enfermedad del corazón y apoplejías comúnmente se provocan por aterosclerosis, que es una lesión proliferativa de fibrograsa y modifican los músculos de la boca elementos que deforman la pared de los vasos sanguíneos, estrechan el lumen, estrangulan el riego sanguíneo, predisponen para coágulos de sangre focal y últimamente se dirige a bloqueo e infarto. Hay varios tratamientos para la aterosclerosis tales como injertos de bypass; injertos artificiales; angioplastia con recanalización, legrado, radiación, láser u otra eliminación; la farmacoterapia inhibe la aterosclerosis a través de la reducción de los lípidos; terapias anti-coagulantes; y medidas generales de dieta, ejercicio y estilo de vida. Es necesario un procedimiento para eliminar las lesiones ateroscleróticas sin el riesgo y efectos secundarios de los procedimientos quirúrgicos.
Otros ejemplos de elementos celulares no deseados donde se emplea la eliminación celular selectiva incluye el crecimiento vírico, tales como verrugas. Otro ejemplo es la masa inflamatoria hipertrófica encontrada en afecciones inflamatorias y cicatrices hipertróficas o queloides. Otros ejemplos se encuentran a un en los contextos de cosmética tales como la eliminación del pelo deseado, por ejemplo, pelo de la cara, o para la constricción de áreas de tejido no deseado para fines cosméticos, tales como en la dermis facial y los tejidos conectivos o en los tejidos de dermis y conectivos de las extremidades.
Otros ejemplos serán todavía más obvios para los expertos con habilidad habitual en la técnica. Existe en todos o la mayoría de los ejemplos la necesidad de tratamientos en los que se pueden eliminar o destruir los elementos celulares no deseados sin los riesgos y efectos secundarios de las terapias convencionales o eliminar los elementos celulares no deseados con mayor precisión.
Las proteínas de filamento neural (NTP) son una familia de proteínas del cerebro caracterizadas recientemente. Un miembro de esta familia, AD7c-NTP, es una membrana \sim41 kD asociada a una fosfoproteína con funciones asociadas con brotes neuróticos (de la Monte y col., J. Clin. Invest., 100:3093-3104(1997); de la Monte y col., Alz., Rep., 2:327-332 (1999); de la Monte SM and Wands JR, Journal of Alzheimer's Disease, 3:345-353 (2001)). El gen que codifica. Se ha identificado y descrito el gen que codifica la AD7c-NTP y predice la secuencia de la proteína para la AD7c-NTD (de la Monte y col., J. Clin. Invest., 100:3093-3104(1997)). Además de las especies \sim41kD, se han identificado y asociado otras especies de proteínas de filamentos neurales (\sim26 kD, \sim21 kD, \sim17kD y \sim15 kD) con tumores neuroectodérmico, astrocitomas y glioblastomas y con lesión debida a hipoxia, esquema o infarto cerebral (Xu y col., Cancer Research, 53:3823-3829); de la Monte y col., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50 (1996), de la Monte y col., J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35 (1996); de la Monte y col., J. Neurol. Sci., 135(2):118-25 (1996); de la Monte y col., J. Clin. Invest, 100:3039-3104 (1997); y de la Monte y col., Alz. Rep., 2:327-332 (1999)).
Las especies de proteína de filamento neural se han descrito y reivindicado en las Patentes de Estados Unidos números 5.948.634; 5.948.888; y 5.830.670, todo por "Neural Thread Protein Gene Expresión and Detection of Alzheimer's Disease" y en la Patente de Estados Unidos número 6.071.705 "Method of Detecting Neurogical Disease or Dysfunction". Como se describe en el presente documento, la NTP se regulariza por incremento y se produce durante la muerta de la célula. Así, las células muertas y agonizantes del nervio se describen como una sobreproducción de la NTP, y por consiguiente, su presencia indica la muerte de las células del nervio y el comienzo de la enfermedad de Alzheimer (AD).
Otras especies de la proteína de filamento se han identificado según otros productos del gen AD7c-NTP (por ejemplo, un aminoácido 112 descrito en el número de acceso a la base de datos de proteínas a través de ENTREZ del NUBIL XP_032307 PID g 15928971) o ser parecida a las proteínas neurales tratadas (por ejemplo aminoácido 106 proteico descrito en el número de acceso a la base de datos de proteínas a través de ENTREZ del NUBIL AAH14951 PID g15928971, otro aminoácido 106 proteico descrito en el número de acceso a la base de datos de proteína a través de ENTREZ del NUBIL XP_039102 PID g18599339 y un aminoácido 61 proteico descrito en el número de acceso a la base de datos de proteína a través AAH02534 PID g12803421).
La proteína de filamento neural está asociada con AD y NTP está regulada por el incremento en la asociación con la muerte de la célula en AD.
La AD7c-NTP mARN se regula por incremento en el cerebro AD comparado para controles, los niveles de proteína de AD7c-NTP en el cerebro en CSF son más altos en AD que en los controles; y la inmunoreactividad de AD7c-NTP se encuentra en las placas seniles, en las marañas neofibrilares (NFT), en las neuronas degenerativas, filamentos de neuropilema y brotes neurótico distrófico en cerebros en AD y Síndrome de Down (Ozturk y col., prox. Natl. Acad. Sci. USA, 96:419-423 (1989); de la Monte y col., J. Clin. Invest., 86(3):1004-13 (1990); de la Monte y col., J Neurol. Sci., 113(2): 152-64 (1992); de la Monte y col., Ann. Neurol., 32(6):733-42 (1992); de la Monte y col., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50(1996), de la Monte y col., J. Neurol. Sc., 138 (1-2):26-35 (1996); de la Monte y col., J. Neurol. Sci., 135(2):118-25 (1996); de la Monte y col., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); y de la Monte y col., Alz., Rep., 2:327-332 (1999)). La NTP se localiza dentro de las células, dentro de los buenos procedimientos dentro de la neuropilema o es extracelular en ambos cerebros AD y Síndrome de Down. De la Monte y col., Ann. Neurol., 32(6):733-42 (1992).
Se han encontrados niveles elevados de la proteína AD7c-NTP en ambos pacientes de CSF y orina de la AD (de la Monte and Wands, Front Biosci 7. 989-96 (2002); de la Monte and Wands, Journal of Alzheimer's Disease 3:345-353 (2001); Munzar y col., Alzheimer's Reports 4:61-65 (2001); Kahle y col., Neurology 54: 1498-1504 (2000); Munzar y col., Alzheimer Reports 3:155-159 (2000); de la Monte y col., Alzheimer's Report 2:327-332 (1999); y de la Monte y col., J Clin Invest 100: 3093-3104 (1997).
La sobreexpresión de la NTP también se ha unido al procedimiento de la muerte celular en la enfermedad del Alzheimer (de la Monte and Wands, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 60:195-207 (2001); de la Monte and Wands, Cell Mol Life Sci 58:844-49 (2001). También se ha identificado la AD7c-NTP en el tejido cerebral del Síndrome de Down (Wands y col., Internacional Patent Publication no. WO 90/06993; de la Monte y col., J Neurol Sci 135:118-25 (1996); de la Monte y col., Alz. Rep., 2:327-332 (1999)). Hay alguna evidencia de que la sobre expresión de NTP también
puede asociarse con glaucoma de tensión normal (Golubnitschaja-Labudova y col, Curr Eye Res 21:867-76 (2000)).
La NTP ha probado ser un agente efectivo para causar la muerte celular tanto en cultivos de células de glioma y neuroblastoma in Vitro y tejidos de músculo de un roedor normal in vivo, tejidos conectivos subcutáneos y dermis, y en una variedad de diferentes tumores de origen humano y no-humano, incluyendo carcinoma mamario, carcinoma de piel y papiloma, carcinoma de colon, glioma de cerebro y otros modelos en roedores. Véase el documento 2003/0054990 de Estados Unidos titulado Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins, presentado el 8 de Marzo de 2002.
Se ha descrito un pequeño péptido, SSWDYITV, y su uso potencial en las estrategias en la vacunación contra tumores por Feltkamp y col., Molecular Immunology 1994;31;1391-1401.
El documento WO 00/58495 describe un polipéptido 47-mer que comprende la secuencia GAISAHRNLRL (correspondiente a la secuencia SEQ ID Nº:12 descrita en el presente documento) y su uso potencial para el tratamiento de un amplio intervalo de enfermedades.
El documento WO 02/097030 se dirige a péptidos derivados de NTP y su uso para tratar enfermedades que requieren la eliminación o destrucción de las células, tales como el cáncer.
Así permanece la necesidad en la técnica de nuevos tratamientos menos tóxicos para tratar los elementos celulares no deseados. La presente invención satisface esta necesidad.
Sumario de la invención
La presente invención incluye en parte el descubrimiento de las secuencias de péptidos contenidas en AD7c-NTP que los científicos han encontrado ser agentes efectivos para la destrucción o eliminación de células perjudiciales o no deseadas y variantes y homólogas del mismo, también se encontraron en otras proteínas en otros organismos, incluyendo seres humanos y otros mamíferos. Una vez que las secuencias del péptido se han descubierto, estas proteínas las puede encontrar un experto habitual en la técnica a través del uso de una base de datos comercial y pública ampliamente disponible tal como the Nacional Center Biotechnology Information's Protein database y en programas tales como BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool). Véase Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Millar y David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.
Así pues una persona con habilidad habitual en la técnica puede proteger estas proteínas mediante el uso del procedimiento de ensayo descrito en el presente documento para determinar su efectividad como agentes para la destrucción o eliminación de las células perjudiciales o no deseadas. Una persona de habilidad habitual en la técnica, habiendo encontrado uno o más de dichos agentes efectivos, puede determinar que porciones de estos agentes contienen secuencias homólogas o parecidas con las secuencias de péptidos AD7c-NTP descritas en el presente documento, o en el documento US 2003/0096350, titulado: Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Renoval or Destruction of Cells, presentado el 24 de Mayo de 2002, tiene esas porciones de aquellos agentes sintetizados usando los procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, y probar los agentes sintetizados respecto a su efectividad como agentes para la destrucción o eliminación de células perjudiciales o no deseadas. Además, una persona experta habitual en la técnica también podría usar las secuencias de aminoácido de cualquiera de dichas proteínas encontradas para determinar otras secuencias de péptidos no homólogas o no parecidas con las secuencias de péptidos AD7c-NTP homólogos o parecidos a los descritos en el presente documento y se describe en el presente documento US 2003/0096350, titulado: Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Renoval or Destruction of Cells, presentado el 24 de Mayo de 2002. Entonces estas nuevas secuencias sintetizadas podrían ser probadas por su efectividad como agentes para la destrucción o eliminación de células perjudiciales o no deseadas.
La invención se dirige a péptidos NTP, que consiste en las secuencias de aminoácido SEQ ID Nº : 11-16, composiciones del mismo y el uso de dichos péptidos para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección que requiere la eliminación o destrucción de células seleccionadas por el grupo que consiste de un tumor maligno o benigno de un tejido; un hiperplasia, hipertrofia o sobre crecimiento de un tejido; un tejido alterado viralmente, bacterialmente o parasitariamente; una malformación de un tejido; hipertrofia de amigdala; hiperplasia prostática; soriasis; eczema; dermatosis; una modificación cosmética de un tejido; una enfermedad vascular; hemorroides, venas varicosas, aterosclerosis; enfermedad inflamatoria; enfermedad autoinmune; enfermedad metabólica; enfermedad hereditaria/genética; enfermedad traumática o lesión física; enfermedad de deficiencia nutricional, enfermedad infecciosa, enfermedad amiloide, enfermedad fibrosis; enfermedad de almacenamiento; malformación congénita; enfermedad de deficiencia enzimática; envenenamiento; intoxicación; enfermedad medioambiental; enfermedad de radiación; enfermedad endocrina; y enfermedad degenerativa. Los términos "Proteína relacionada", "Péptido relacionado" y "Péptido NTP" se definen a continuación.
Los péptidos de la presente invención tienen al menos una secuencia de aminoácido correspondiente a la parte de la secuencia de aminoácido de unas especies de la proteína de filamento neural. Las composiciones de la invención incluyen lo péptidos y vehículo farmacéuticamente aceptable. Los péptidos o proteínas ("célula de péptido muertas") de la invención se pueden administrar sólos o conjugado a un vehículo y formularlo en un composición. Los péptidos de células muertas se pueden administrar intramuscularmente, oralmente, intravenosamente, intraperitonealmente, intracerebralmente (intraparenquimalmente), intracerebroventricularmente, intratumoralmente, intralesionalmente, intradérmicamente, intratecalmente, intranasalmente, intraocularmente, intraarterialmente, tópicamente, transdérmicamente, mediante un aerosol, infusión, inyección de píldoras, instrumento de implantación, sistema de liberación sostenida, etc., o sólo o conjugado a un vehículo.
Además, péptidos de células muertas se pueden usar en conjunción con otras terapias para tratar tumores malignos y benignos y otros crecimientos celulares perjudiciales o no deseados.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Muestra la secuencia de aminoácido y secuencias de ácido nucleico del gen AD7c-NTP y el producto de proteína AD7c-NTP de ese gen (secuencias 120 y 121 de las Patentes de Estados Unidos números 5,830,670, 5,948,634 y 5,948,888; de la Monte y col., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); número de acceso a la base de datos de la proteína a través de Entrez del NCBI AAC08737; PID g3002527) [SEQ ID Nº1].
Figura 2: Muestra las secuencias de aminoácidos completa de los 122 aminoácidos de la proteína de filamento neural (secuencia 40 de las Patentes de Estados Unidos números 5,830,670, 5,948,634 y 5,948,888; número de acceso a la base de datos de la proteína a través de Entrez del NCBI AAE25447 PID g10048540) [SEQ ID Nº. 2] ("NTP-122").
Figura 3: Muestra las secuencias de aminoácido completas de los 112 aminoácidos de la proteína neural (número de acceso a la base de datos de la proteína a través de Entrez del NCBI XP_032307 PID g 15928971) [SEQ ID Nº. 3] ("NTP-112").
Figura 4: Muestra las secuencias de aminoácido completa de 106 aminoácidos de proteína de filamento neural como proteína (número de acceso a la base de datos de la proteína a través de Entrez del NCBI AAH14951 PID g15928971) [SEQ ID Nº. 4] ("NTP-106A")
Figura 5: Muestra las secuencia de aminoácido completa de 106 aminoácidos de proteína de filamento neural como proteína (número de acceso a la base de datos de la proteína a través de Entrez del NCBI XP_039102 PID g18599339) [SEQ ID Nº.5] ("NTP-106B").
Figura 6: Muestra las secuencias completas de aminoácidos de los 98 aminoácidos de proteína de filamento neural (secuencia 30 de las Patentes de Estados Unidos números 5,830,670, 5,948,634 y 5,948,888; número de acceso a la base de datos de la proteína a través de Entrez del NCBI AAE25445, PID g10048538) [SEQ ID Nº.6] ("NTP-98").
Figura 7: Muestra las secuencias de aminoácidos completa de los 75 aminoácidos de proteína de filamento neural (Secuencia 48 de las Patentes de Estados Unidos Números 5,830,670, 5,948,634 y 5,948,888; número de acceso a la base de datos de la proteína a través de Entrez del NCBI AAE25448, PID g10048541) [SEQ ID Nº. 7] ("NTP-75").
Figura 8: Muestra las secuencias de aminoácidos completa de los 68 aminoácidos de proteína de filamento neural (Secuencia 36 de las Patentes de Estados Unidos números 5,830,670, 5,948,634 y 5,948,888; número de acceso a la base de datos de la proteína a través de Entrez del NCBI AAE25446, PID g10048539) [SEQ ID Nº.8] ("NTP-66").
Figura 9: Muestra las secuencias de aminoácidos de los 61 aminoácidos de proteína de filamento neural como proteína (número de acceso a la base de datos de la proteína a través de Entrez del NCBI AAH02534, PID g12803421) [SEQ ID Nº. 9] ("NTP-61").
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Los términos y expresiones usadas en el presente documento se definen tal como se exponen a continuación al menos de un modo específico.
La expresión "AD7c-NTP" se refiere a la proteína \sim41 kD y el gen y las secuencias de ácido nucleico codificado descrito por de la Monte y col., J. Clin. Invest., 100:3093-104 (1997), en la secuencias 120 y 121 de las Patentes de Estados Unidos números 5,948,634, 5,948,888 y 5,830,670 y GenBank AF010144, las secuencias de ácido nucleico y aminoácido las cuales se ilustran en la Figura 1.
El término "NTP" o "proteína de filamento neural" se refiere a las proteínas de filamento neural y moléculas relacionadas (incluyendo la proteína de filamento pancreático) y las secuencias de ácido nucleico codificado para esas proteínas e incluye (pero no se limita a) las siguientes proteínas y las secuencias de ácido nucleicos codificando las secuencias de aminoácido de esas proteínas:
(a) AD7c-NTP;
(b) las especies \sim42, \sim26, \sim21, \sim17, \sim14, y \sim8kD de proteína de filamento neural descrito en las Patentes de Estados Unidos Números 5,948,634, 5,948,888, 5,830,670 y 6,071,705 y en de la Monte y col., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50 (1996), de la Monte y col., J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35 (1996); de la Monte y col., J. Neurol. Sci., 135(2): 118-25 (1996), de la Monte y col., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997) y de la Monte y col., Alz. Rep.,2:327-332 (1999).
(c) las proteínas específicamente reconocidas por anticuerpos monoclonales #2 en depósito con la American Type Culture Collection, Manassas, Va., con un número de acceso HB-12546 o anticuerpo monoclonal #5 en deposito en la American Type Culture Collection, Manassas, Va, bajo el número de acceso HB-12545;
(d) proteínas codificas por el gen AD7c-NTP;
(e) la proteína de filamento neural de 122 aminoácidos en la secuencia de 40 de las Patentes de Estados Unidos números 5,830,670, 5,948,634 y 5,948,888 y se enumeró en el número de acceso a la base de datos de proteínas a través de Entrez del NCBI AAE25447, PID g10048540, las secuencias de aminoácidos para las que se ilustra en la Figura 2 ("NTP-122");
(f) la proteína de filamento neural de 112 aminoácido enumerado en el número de acceso a la base de datos de proteínas a través de Entrez del NCBI XP_032307, PID g14725132, las secuencias de aminoácidos para las que se ilustra en la Figura 3 ("NTP-112").
(g) una proteína de filamento neural de 106 aminoácidos como proteína enumerado en el número de acceso a la base de datos de proteínas a través de Entrez del NCBI AAH14951 PId g15928971, las secuencias de aminoácidos para la cual se ilustra en la Figura 4 ("NTP-106A").
(h) una proteína de filamento neural de 106 aminoácidos como proteína enumerado en el número de acceso a la base de datos de proteína a través de Entrez del NCBI XP_039102, PID g18599339, la secuencia de aminoácido para la cual se ilustra en la Figura 5.
(i) la proteína de filamento neural de 98 aminoácido descrito en la secuencia 30 de las Patentes de Estados Unidos números 5,830,670, 5,948,634 y 5,948,888 y se enumeró en el número de acceso a la base de datos de proteína a través de Entrez del NCBI AAE25445, PID g10048538, las secuencias de aminoácidos para la cual se ilustra en la Figura 6 ("NTP-98");
(j) la proteína de filamento neural de 75 aminoácido descrita en la secuencia 48 de las Patentes de Estados Unidos números 5,830,670, 5,948,634 y 5,948,888 y se enumeró en el número de acceso a la base de datos de proteína a través de Entrez del NCBI AAE25448, PID10048541, las secuencias de aminoácido para la cual se ilustra en la Figura 7 ("NTP-75").
(k) la proteína de filamento neural de 68 aminoácido descrito en la secuencia 36 de las Patentes de Estados Unidos números 5,830,670, 5,948,634 y 5,948,888 y se enumeró en el número de acceso a la base de datos de proteína a través de Entrez del NCBI AAE25446, PID g10048539, las secuencias de aminoácidos para la cual se ilustra en la Figura 8 ("NTP-68").
(l) la proteína de filamento neural de 61 aminoácidos como proteína se enumeró en el número de acceso a la base de datos de proteína a través de Entrez del NCBI AAH02534, PID g12803421, las secuencias de aminoácidos para la cual se ilustra en la Figura 9 ("NTP-61");
(m) proteína de filamento pancreático;
(n) la proteína de filamento pancreático neural (nPTP) descrita en la Patente de Estados Unidos Números 6,071,705; y
(o) las proteínas específicamente reconocidas por los anticuerpos producido por un hibridoma del cuerpo del grupo que consiste de HB 9934, HB 9935 y HB 9936 depositado en la American Type Culture Collection.
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La expresión "péptido NTP" se refiere a las siguientes secuencias de aminoácidos de NTP:
(a) NTP péptido #2 [SEQ ID Nº.11], AD7c-NTP p31-39 PASASPVAG
\quad
Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly
\newpage
(b) NTP péptido #3 [SEQ ID Nº. 12], AD7c-NTP p14-24 GAISAHRNLRL
\quad
Gly-Ala-Ile-Ser-Ala-His-Arg-Asm-Leu-Arg-Leu
\vskip1.000000\baselineskip
(c) NTP péptido #4 [SEQ ID Nº.13], AD7c-NTP p53-58 FFLVEM
\quad
Phe-Phe-Leu-Val-Glu-Met
\vskip1.000000\baselineskip
(d) NTP péptido #5 [SEQ ID Nº.14], AD7c-NTP p204-216 SVTQAGVQW
\quad
Ser-Val-Thr-Gln-Ala-Gly-Val-Gln-Trp
\vskip1.000000\baselineskip
(e) NTP péptido #6 [SEQ ID Nº.15], NTP-122 p106-122 IDQQVLSRIKLEIKRCL
\quad
Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu
\vskip1.000000\baselineskip
(f) NTP péptido #7 [SEQ ID Nº.16], NTP-122 p111-119 LSRIKLEIK
\quad
Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
Los aminoácidos y residuos de aminoácido aquí descritos en el presente documento puede denominarse según se acepte un código de una o tres letras proporcionadas en la tabla dada más abajo.
TABLA 1
1
La presente invención se dirige a una composición que comprende péptidos de células muertas como se define anteriormente en este documento.
Un péptido NTP se puede preparar usando procedimientos de tecnología de ADN recombinantes bien conocidos, como aquellos que se expone por Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.[1989]) y/o Ausubel y col., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. y Wiley and Sons, N.Y. [1994].
Un gen o cDNA que codifica un péptido de NTP, puede obtenerse por ejemplo cribando una genoteca genómica o cADN, o por amplificación de PCR. Sondas y cebadores son útiles para cribar a la genoteca que puede generarse basándose en la secuencia de información para otros genes conocidos o fragmentos de gen de la misma o una familia relacionada de genes, tal como, por ejemplo, conservando los motivos encontrados en otras proteínas relacionadas. Además, cuando un gen codifica un péptido NTP, proteína relacionada o péptido relacionado se ha identificado a partir de unas especies, todas o una porción de ese gen puede usarse como una sonda para identificar genes homólogos a partir de otras especies. Las sondas o cebadores pueden usarse para someterse a bibliotecas de cADN de varias fuentes de tejidos pensado para expresar un gen de péptido de NTP. Normalmente, las afecciones de alto rigor se emplearían para cribar y minimizar el número de falsos positivos obtenidos de la criba.
Otros medios para preparar un gen codificado en péptido NTP es emplear la síntesis química usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica tal como se describe por Engels y col. (Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 [1989]). Estos procedimientos incluyen, entre otros, los procedimientos fosfotriester, fosforamidita y H-fosfonato para la síntesis de los ácidos nucleícos. Un procedimiento preferido para dicha síntesis química es la síntesis de un polímero sostenido usando la química estándar de la fosforamidita. Normalmente, el ADN que codifica un péptido NTP sería de varios cientos de nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleícos grandes de aproximadamente 100 nucleótidos pueden sintetizarse como varios fragmentos usando estos procedimientos. Luego los fragmentos pueden unirse juntos para formar la longitud del péptido NTP. Normalmente, el fragmento de ADN que codifica el amino terminal de la proteína tendría un ATG, que codifica un residuo de metionina. Esta metionina puede o no puede estar presente en la forma madura del péptido NTP, dependiendo de si la proteína producida en la célula huésped se diseña para secretarse a esa célula.
El gen, cADN, que codifica al péptido NTP se puede insertar en una expresión o vector de amplificación adecuada usando las técnicas de unión estándar. El vector se selecciona normalmente para ser funcional en el empleo de la célula huésped particular empleada (es decir, el vector es compatible con la célula huésped tal que la amplificación del gen y/o expresión del gen puede ocurrir). El gen, cADN codifica el péptido NTP puede amplificarse/expresarse en células huésped procarióticas, levaduras, insectos (sistemas de baculovirus) y/o células huésped eucarióticas. La selección de las células huésped dependería en parte de si el péptido NTP está para ser glicosilado y/o fosforilatado. Si es así, se prefieren células huésped de levadura, insectos o mamíferos.
Normalmente, los vectores usados en cualquiera de las células huésped contarían al menos con una secuencia de 5' flecos (también referido como un promotor) y otros elementos reguladores, tales como un amplificador(s), un elemento de replicación original, un elemento de terminación transcripcional, una secuencia de intrón completa que contiene un sitios de unión aceptor y donador, una secuencia de señal del péptido, elemento de sitio de unión de ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región de poliligador para insertar el ácido nucleico codificando el polipéptido para ser expresado y un elemento marcador seleccionable. Cada uno de estos elementos se discute más abajo. Opcionalmente, el vector puede contar con una secuencia de etiqueta, es decir, una molécula de oligonucleótido localizado en el 5'o 3' del final de la secuencia codificada del péptido NTP; la molécula de oligonucleotido codifica poliHis (tal como hexaHis), u otra etiqueta tal como FLAG, HA(virus influenza hemaglutina) o myc para la cual existe anticuerpos comercialmente adecuados. Esta etiqueta se fusiona al polipéptido en la expresión del polipéptido y puede servir como un medio para la afinidad purificadora del péptido NTP de la célula huésped. La afinidad purificadora puede acoplarse, por ejemplo, mediante una columna de cromatografía usando anticuerpos contra las etiquetas como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta puede seguidamente eliminarse desde la proteína NTP purificada o el péptido NTP por diversos medios tales como usar ciertas peptidasas.
La bisagra de inmunoglobulina humana y la región Fc se fusionarán junto a la N-terminal o C-terminal del péptido NTP por uno de los expertos en la técnica. La siguiente proteína de fusión Fc se purificará por el uso de una columna de afinidad de proteína A. La Fc se conoce por exhibir una semivida de farmacocinética larga in vivo y se han encontrado que las proteínas fusionadas para Fc se exhiben en una semivida más mayor sustancialmente in vivo que el no fusionado homólogo. También, la fusión a la región Fc seguida de dimerización/multimerización de la molécula que puede ser útil para la bioactividad de algunas moléculas.
La secuencia de extremo 5' puede ser homóloga (es decir, a partir de las mismas especies y/o cepa de la célula huésped), heteróloga (es decir, a partir de otras especies que las de las especies o cepas de la célula huésped), híbrido (es decir, una combinación de la secuencia de extremo 5' a partir de más de una fuente), sintético o puede ser el gen de péptido NTP nativo de la secuencia de extremo 5'. Así como el origen de la secuencia de extremo 5' puede ser cualquier organismo eucariótico o procariótico unicelular, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre que la secuencia de extremo 5' sea funcional en, y se puede activar por, la maquinaria de la célula huésped.
Las secuencias de extremo 5' útiles en los vectores se pueden obtener por cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica. Normalmente, las secuencias de extremo 5' útiles en el presente documento aparte de la secuencia del extremo del gen del péptido NTP se identificarán previamente por la digestión de endonucleasa de cartografía y/o restricción, y así se puede aislar desde la fuente de tejido propia usando las endonucleasas de restricción adecuada. En algunos casos, puede conocerse la secuencia de nucleótido completa de la secuencia de extremo 5'. Aquí, la secuencia de extremo 5' se puede sintetizar usando los procedimientos descritos arriba para la síntesis del ácido nucleico o un clon.
Cuando se conocen todos o solamente una porción de la secuencia de extremo 5', puede obtenerse usando PCR y/o por exploración de la genoteca genómica con oligonucleotidos adecuados y/o fragmentos de la secuencia de extremo 5' de la misma u otras especies.
Cuando no se conoce la secuencia de extremo 5', un fragmento de ADN que contiene una secuencia de extremo 5' se puede aislar a partir de una pieza grande de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia de codificación o incluso otro gen o genes. El aislamiento se puede acoplar por digestión de endonucleasa de restricción usando una o más enzimas seleccionadas cuidadosamente para aislar el propio fragmento de ADN. Después de la digestión, el fragmento deseado se puede aislar por purificación del gel de agarosa, columna Qiagen® u otros procedimientos conocidos por los expertos artesanos. La selección de las enzimas adecuadas para acoplarse a este propósito sería aparentemente fácil para un experto en la técnica.
El origen del elemento de replicación es normalmente una parte de los vectores de expresión procariótica comprados comercialmente y ayuda en la amplificación del vector en la célula huésped. La amplificación del vector para un número de copia seguro puede, en algunos casos ser importante para la expresión óptima del péptido NTP.
Si el vector elegido no contiene un lugar de origen de replicación uno se puede sintetizar químicamente basándose en una secuencia conocida y unirse en el vector. El elemento de terminación de transcripción del péptido NTP se localiza normalmente en el 3' del final del péptido codificando la secuencia y sirve para la transcripción terminal del péptido NTP.
Normalmente, el elemento de terminación de transcripción en las células procarióticas es un fragmento rico en G-C seguido por la secuencia poliT. Mientras los elementos pueden clonarse a partir de una biblioteca o comprado comercialmente como parte de un vector, también se puede sintetizar fácilmente usando procedimientos para la síntesis del ácido nucleico tales como aquellos descritos más arriba.
Un elemento de gen marcado seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento del crecimiento de la célula huésped en un medio de cultivo selectivo. Los genes normales del marcador de selección codifican las proteínas que (a) otorgan resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina o kanamicina para células huésped procarióticas, (b) complemento autotrófico de las deficiencias de la célula, (c) suministra nutrientes críticos no adecuados de la media del complejo. Los marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia de kanamicina, el gen de resistencia de la ampicilina y el gen de resistencia a la tetraciclina.
El elemento de unión de ribosoma, comúnmente llamado secuencia Shine-Dalgarno (procariotas) o la secuencia de Kozak (eucariotas), normalmente es necesario para la iniciación de la traslación de mARN. El elemento normalmente se localiza en el 3' al promotor y 5' a la secuencia de codificación del péptido para sintetizarse. La secuencia Shine-Dalgarmo varía pero normalmente es una polipurina (es decir, tienen un alto contenido en A-G). Se han identificado muchas secuencias de Shine-Dalgarno, cada una de las cuales puede ser fácilmente sintetizada por una persona que tiene una experiencia habitual en la técnica usando procedimientos que se exponen en el presente documento y se usa en un vector procariótico.
En estos casos donde se desea que el péptido NTP sea secretado a partir de la célula huésped, se puede usar una secuencia de señal para dirigir el péptido NTP fuera de la célula huésped donde se sintetiza, y la parte terminal del carboxilo de la proteína se puede suprimir para prevenir el anclaje de la membrana. Normalmente, la secuencia de señal se posiciona en la región codificada del gen del péptido NTP o cADN o directamente al 5' del final del gen péptido NTP que codifica la región. Se han identificado muchas secuencias de señal y cualquiera de ellas es funcional en la célula huésped seleccionada se puede usar en conjunción con el gen del péptido NTP cADN. Así mismo, la secuencia de señal puede ser homóloga o heteróloga al gen del péptido NTP o cADN y puede ser homóloga o heteróloga al gen del péptido NTP o cADN y puede ser homólogo o heterólogo al gen del péptido NTP o cADN. Adicionalmente, la secuencia de señal se puede sintetizar químicamente usando los procedimientos que se exponen arriba. En muchos casos, la secreción del polipéptido a partir de la célula huésped mediante la presencia de un péptido de señal resultará en la eliminación de la metionina terminal del amino del polipéptido.
En muchos casos, la transcripción del gen del péptido NTP o cADN puede aumentar por la presencia de uno o más intrones en el vector. Esto es particularmente cierto donde el péptido NTP se produce en las células huésped eucariota, especialmente en las células huésped de mamíferos. Los intrones usados pueden ocurrir naturalmente dentro del gen de péptido NTP, especialmente donde el gen usado es una secuencia genómica de longitud completa o un fragmento del mismo. Donde el intrón no ocurre naturalmente dentro del gen (como la mayoría de cADNs), el intrón se puede obtener a partir de otra fuente. La posición del intrón con respecto a la secuencia de extremo y el gen del péptido de NTP generalmente es importante, como el intrón debe trascribirse para ser efectivo. Como tal, donde el gen del péptido NTP insertado en la expresión del vector es una molécula de cADN, la posición preferida para el intrón es 3' al lugar del comienzo de la transcripción y 5' a la secuencia de terminación de transcripción del poli A. Preferiblemente para el péptido NTP cADN, el intrón o intrones se localiza en un lado o el otro (es decir, 5' o 3') del cADN tal que no interrumpe esta secuencia de codificación. Cualquier intrón a partir de cualquier fuente, incluyendo cualquier organismo (planta o animal) procariótico o eucariótico vírico se pueden usar para la práctica de esta invención, siempre que sea compatible con la(s) célula(s) huésped en la que se inserta. También se incluye en el presente documento intrones sintéticos. Opcionalmente, se puede usar más de un intrón en el vector.
Cuando uno o mas de los elementos que se exponen arriba ya no está presente en el vector que va a usarse, se pueden obtener individualmente y ligados en el vector. Los procedimientos usados para obtener cada uno de los elementos se conocen bien por los expertos en la técnica y se comparan a los procedimientos expuestos arriba (es decir, la síntesis del ADN, exploración de la biblioteca y similares).
Los vectores finales usados para la práctica de esta invención se pueden construir típicamente a partir de los vectores de partida tal como un vector adecuado comercialmente. Tales vectores pueden o no contener alguno de los elementos que se incluyen en el vector completado. Si ninguno de los elementos deseados está presente en el vector de partida, cada elemento puede estar individualmente ligado al vector mediante el vector de corte con la endonucleasa(s)
de restricción adecuada así como los finales del elemento está ligado junto para obtener una unión satisfactoria. En algunos casos, puede ser necesario despuntar los finales están ligados juntos para obtener una unión satisfactoria. El despuntamiento se acopla mediante el primer relleno en "finales pejagosos" usando polimerasa Klenow ADN o polimerasa T4 ADN en la presencia de los cuatro nucleótidos. Este procedimiento se conoce bien en la técnica y se describe por ejemplo por Sambrook y col., supra. Alternativamente, dos o mas de los elementos que se insertan en el vector se pueden primero ligarse junto (si están para posicionarse junto a cada uno de los otros) y luego ligados al vector.
Un procedimiento adicional para construir el vector es dirigir todos los ligandos de varios elementos simultáneamente en una mezcla de reacción. Aquí, muchos vectores sin sentido o no funcionales se generarían debido a la ligadura incorrecta o inserción de los elementos. El vector funcional se puede identificar y seleccionar, sin embargo, por restricción de digestión de la endonucleasa.
Los vectores preferidos para practicar esta invención son aquellos que son compatibles con las células huésped de bacterias, insectos y mamíferos. Tales vectores incluyen, entre otros, pCRII, pCR3 y pcADN3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), pET15b (Novagen, MAdison, Wis), PGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Calif.), pETL (BlueBacII; Invitrogen), pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.).
Después se construye el vector y una molécula de ácido nucleico codifica al péptido NTP que se inserta en el propio sitio del vector, el vector completado se puede insertar en una célula huésped adecuada para la amplificación y/o expresión del polipéptido. La célula huésped, cuando se cultiva bajo condiciones adecuadas, puede sintetizarse el péptido de la NTP que puede seguidamente recogerse a partir del medio de cultivo (si la célula huésped lo secreta en el medio) o directamente desde la producción de la célula huésped (si no es secretada).
Después de la recogida, el péptido de la NTP se puede purificar usando procedimientos tales como cromatografía de malla molecular, cromatografía de afinidad y similares. La selección de la célula huésped para la producción del péptido NTP dependerá en parte si el péptido NTP es para ser glicosilatado o fosforilatado (en cuyo caso se prefieren las células eucarióticas) y la manera en la cual la célula huésped es capaz de plegarse la proteína en su estructura terciaria nativa (por ejemplo, la orientación propia de puentes de bisulfuro, etc.) tal que la proteína activa biológicamente se prepara mediante el péptido NTP que tiene actividad biológica. El péptido NTP se puede plegar después de la síntesis usando condiciones químicas adecuadas tan discutidas arriba. Células o líneas de células adecuadas útiles en la invención incluyen células mamíferas, tales como células de ovario de hamster chino (CHO), riñón embrionario humano (HEK) células 293 o 293T o células 3T3. La selección de células huésped de mamíferos apropiados y los procedimientos para la transformación, cultivo, amplificación, exploración y productos de producción y purificación conocidos en la técnica. Otras líneas de células de mamífero adecuadas incluyen las líneas celulares del mono COS-1 y COS-7 y la línea de célula CV-1. Además un ejemplo de célula huésped de mamífero incluye líneas de célula primate y líneas de células de roedores, incluyendo las líneas de célula transformada. También son adecuadas, las células diploide normales, cepas de células derivada a partir del cultivo in Vitro del tejido primario, tan bien como explantes primarios. Las células candidatas pueden ser deficiente genotipicamente en la selección del gen, o puede contener un gen de selección interino dominantemente. Otras líneas de células de mamífero adecuado incluyen pero no se limita a, células N2A neuroblastoma de ratón, HeLa, células L-929 de ratón, líneas 3T3 derivada de Swiss, ratones Balb-c o NIH, líneas de célula de hamster BHK o HaK.
Igualmente útiles como células huésped apropiadas para la presente invención son las células bacterianas. Por ejemplo, las cepas diversas de E. Coli (por ejemplo, HB101, DH5 alfa, DH10 y MC1061) son bien conocidas como células huésped en el campo de la biotecnología. También se pueden emplear diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp., otras Bacillus spp., Strptomyces spp., y similares en este procedimiento. Muchas cepas de las células de la levadura conocidas por los expertos en la técnica también son disponibles como células huésped para la expresión de los polipéptidos de la presente invención.
Adicionalmente, los sistemas de célula de insecto se pueden utilizar cuando se desee en los procedimientos de la presente invención. Dichos sistemas se describen por ejemplo in Kitts, y col.(Biotechniques, 14:810-817 [1993]), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol.,4:564-572[1993]) y Lucklow y col. (J. Virol., 67: 4566-4579 [1993]. Células de insectos preferidas son las Sf-9 y Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.).
La inserción (también se refiere como transformación o transfección) del vector en la célula huésped seleccionado se puede acoplar usando dichos procedimientos como cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección o el procedimiento de DEAE-dextrano. El procedimiento seleccionado en parte sería una función del tipo de célula huésped para ser usada. Estos procedimientos y otros procedimientos adecuados se conocen bien por los expertos artesanos y se exponen, por ejemplo, en Sambrook y col., supra.
Las células huésped que contienen el vector (es decir, transformada o transferida) se pueden cultivar usando el medio estándar bien conocido por los expertos artesano. El medio normalmente contiene todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y supervivencia de las células. El medio adecuado para el cultivo de las células de E. coli son por ejemplo, Luria Broth (LB) y/o Terrific Broth (TB). La media adecuada para el cultivo de las células eucarióticas es RPMI 1640, MEM DMEM, todos los que se pueden suplementar con suero y/o factores de crecimiento como se requieren por la línea de célula particular que se cultiva. Un medio adecuado para los cultivos de insectos es el medio de Grace suplementado con yeastolato, hidrolisato de lactalbumina y/o suero de cría fetal como necesarios. Normalmente, un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo de las células transformadas solamente se como un suplemento a la media. El compuesto que se puede usar será dictado por el elemento marcado seleccionable presente en el plásmido con el que se transforma la célula huésped. Por ejemplo, donde el elemento marcador seleccionable es la resistencia de kanamicina, el compuesto añadido al medio de cultivo será la kanamicina.
La cantidad del péptido NTP producido en la célula huésped se puede evaluar usando procedimientos estándar conocidos en la técnica. Dichos procedimientos incluyen, sin limitación, análisis de mancha Western, electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida, electroforesis de gel no desnaturalizante, separación de HPLC, espectroscopia de masa, inmuniprecipitación y/o ensayos de actividad tales como ensayos de cambio de gel de unión de ADN.
Si el péptido NTP se ha diseñado para secretarse a partir de las células huésped, la mayoría de los péptidos de la NTP se pueden encontrar en el medio de cultivo de la célula. Las proteínas preparadas de esta forma normalmente no poseerían un amino de metionina terminal, según se elimina durante la secreción a partir de la célula. Si el péptido NTP no es secretado a partir de las células huésped, sin embargo, se presentará en el citoplasma y/o núcleo (para las células de huésped eucarióticas) o en el citosol (para las células huésped de bacteria gram negativa) y puede tener un amino de metionina terminal.
Para el péptido NTP situado en el citoplasma de la célula huésped y/o núcleo, las células huésped normalmente se interrumpen primero mecánicamente o con detergente para la liberación de los contenidos intracelulares en una solución neutralizada. Luego el péptido NTP puede aislarse a partir de esta solución.
La purificación del péptido NTP a partir de la solución puede acoplarse usando una variedad de técnicas. Si la proteína se ha sintetizado de modo que contiene una etiqueta tal como hexaHistidina (por ejemplo, péptido de NTP/hexaHis) u otro pequeño péptido tal como FLAG (Sigma-Aldritch, St. Louis, MI) o un péptido unido a calmodulina (Stratagen E La Jolla, CA) o su carboxilo o amino terminal, puede esencialmente purificarse en un procedimiento de una etapa por el paso de la solución a través de una columna de afinidad donde la matriz de la columna tiene una afinidad para la etiqueta o para la proteína directamente. Por ejemplo, la unión de polihistidina con una gran afinidad y especificidad para níquel, cinc y cobalto; así la cromatografía de afinidad de ión metálico inmovilizado que emplea una resina de afinidad basada en níquel (tan usada en el sistema Aiangen's QIAexpress o Invitrogen's Xpress System) o una resina de afinidad basada en cobalto (tan usada en el BD Biosciences-CLONTECH's Talon system) se puede usar para la purificación de péptido NTP/poliHis relacionada. (Véase por ejemplo, Ausubel y col., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993]).
Cuando el péptido NTP se prepara sin etiqueta adjunta y los anticuerpos no son adecuados, otros procedimientos bien conocidos se pueden usar para la purificación. Dichos procedimientos incluyen, sin limitación, la cromatografía de ión intercambiable, cromatografía hidroxiapatita, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de malla molecular, HPLC, electroforesis de gel nativo en combinación con el gel de elección y enfoque isoeléctrico preparativo (maquina Isoprime/técnica, Hoefer Scientific). En algunos casos, dos o más de estas técnicas se pueden combinar para lograr aumentar la pureza.
Si se anticipa que el péptido NTP se encontraría intracelularmente primariamente, el material intracelular (incluye los cuerpos de inclusión para la bacteria gram-negativa) se puede extraer a partir de la célula huésped usando cualquiera de las técnicas estándar conocidas por los expertos artesanos. Por ejemplo, las células huésped pueden estar lisadas para la liberación de los contenidos del periplasma/citoplasma por prensa French, homogeneización y/o sonicación seguida por centrifugación. Si el péptido NTP ha formado cuerpos de inclusión en el citosol, los cuerpos de inclusión pueden a menudo unirse a las membranas celulares internas o externas y así se encontrará primeramente en la centrifugación después del material de sedimentación. Luego el material de sedimentación se puede tratar a pH extremos o con un agente caotrópico tal como un detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea o derivados de urea en presencia de un agente reductor tal como ditiotreitol a pH alcalino o tris carboxietil fosfina a pH ácido para liberar, parte de la rotura y solubilizar los cuerpos de inclusión. El péptido NTP ahora en su forma soluble luego se puede analizar usando electrofóresis en gel, inmunoprecipitación o similares. Si se desea para aislar el péptido NTP, el aislamiento se puede acoplar usando procedimientos estándar tales como los expuestos anteriormente y en Marston y col. (Meth. Enz., 182:264-275 [1995]).
En algunos casos, el péptido NTP no se puede activar biológicamente sobre el aislamiento. Varios procedimientos para plegar de nuevo o convertir el polipéptido a su estructura terciaria y generar enlaces bisulfuro, pueden usarse para restaurarla actividad biológica. Dichos procedimientos incluyen la exposición del polipéptido solubilizado a un pH normalmente sobre 7 y en la presencia de una concentración particular de un caotropo. La selección de caotropo es muy parecida a la elección usada para la solibilización del cuerpo pero normalmente a una concentración más baja y no es necesariamente el mismo caotropo tan usado en la solubilidad. En más casos la solución que se vuelve a plegar/oxidación también contará con un agente reductor o su agente reductor positivo, la forma oxidada en una relación especifica para generar un potencial redox particular permite arrastra el bisulfuro para que se produzca en la formación de la cisteína de proteína puente(s). Algunas de las uniones redox comúnmente usadas incluye la cisteína/cistamina, glutationa (GSH)/ditiobis GSH, cloruro cúprico, ditiotreitol(DTT)/ditiane DTT, 2-mercaptoetanol(bME)/ditio-b(ME). En muchos casos es necesario un codisolvente para aumentar la eficiencia de volver a plegarse y los reactivos más comunes para este propósito incluyen glicerol, polietilenglicol de diversos pesos moleculares y arginina.
Si los cuerpos de inclusión del péptido NTP no están formados a un grado significativo en la célula huésped, el péptido NTP se puede encontrar ante todo en el sobrenadante después de la centrifugación de la homogeneización de la célula y el péptido se puede aislar a partir del sobrenandante usando procedimientos tales como aquellos que se exponen arriba.
En esas situaciones donde se prefiere aislar parcial o completamente el péptido NTP, la purificación se puede acoplar usando los procedimientos estándar bien conocidos por los expertos artesanos. Dichos procedimientos incluyen, sin limitación, la separación por electroforesis seguida por electroelucción, varios tipos de cromatografía (inmunoafinidad, malla molecular, y/o intercambio iónico), y/o cromatografía liquida de alta presión. En algunos casos, se puede preferir usar más de uno de estos procedimientos para la completa purificación.
Además para preparar y purificar péptidos NTP usando técnicas de recombinación ADN, los péptidos NTP pueden prepararse por procedimientos de síntesis química (tal como síntesis de péptido en fase sólida) usando las técnicas conocidas en la técnica tal como aquellas que se exponen por Merrifield y col. (J. Am. Chem. Soc., 85.2149 [1963]), Houghten y col. (Proc Natl Acad. Sci. USA, 82:5132 [1985]) y Stewart y Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, III. [1984]). Dichos polipéptidos se pueden sintetizar con o sin una metionina o un amino terminal.
La presente invención también se dirige al uso de los péptidos NTP para tratar las afecciones requeridas para la eliminación de células, tales como tumores malignos y benignos, hiperplasia glandular (por ejemplo próstata), pelo facial no deseado, verrugas y tejido graso no deseado. Dicho uso comprende la administración a un mamífero en necesidad en una cantidad efectiva terapéuticamente del péptido NTP.
La afección puede ser, por ejemplo, tumores de pulmón, mama, estómago, páncreas, próstata, vesícula, hueso, ovario, piel, riñón, seño, colon, intestino, estómago, recto, esófago, sangre, cerebro y sus coberturas, columna vertebral y sus coberturas, músculo, tejido conectivo, suprarrenal, paratiroide, tiroide, útero, testículo, pituitaria, órganos reproductivos, hígado, vesícula billiar, ojo, oreja, nariz, garganta, amígdala, boca, nódulos linfáticos y sistema linfático y otros órganos.
Como se usa en el presente documento, el término "tumor maligno" pretende abarcar todas las formas de carcinomas humanos, sarcomas y melanomas que pueden suceder en las formas pobremente diferenciada, moderadamente diferenciada y formas bien diferenciadas.
Esta invención satisface una necesidad en la técnica para tratamientos que pueden eliminar tumores benignos con menor riesgo y menos efectos secundarios indeseables en cirugía. Es particularmente necesario un procedimiento para eliminar los tumores benignos en áreas peligrosas quirúrgicamente tales como en localizaciones profundas en el cuerpo (por ejemplo, cerebro, corazón, pulmones y otros).
El uso de péptidos NTP para tratar de las afecciones donde las células que deben eliminarse se pueden usar en conjunción con los procedimientos convencionales para tratar tales afecciones, tal como la escisión quirúrquica, quimioterapia y radiación. El péptido NTP se puede administrar antes, durante o después de dichos tratamientos convencionales.
La afección a tratar puede ser también una hiperplasia, hipertrofia o sobrecrecimiento de un tejido seleccionado del grupo que consiste de pulmón, mama, estómago, páncreas, próstata, vesícula, hueso, ovario, piel, riñón, seno, colon, intestino, estomago, recto, esófago, sangre, cerebro y sus coberturas, columna vertebral y sus coberturas, músculo, tejido conectivo, suprarrenal, paratiroide, tiroide, útero, testículo, pituitaria, órganos reproductivos, hígado, vesícula biliar, ojo, oreja, nariz, garganta, amígdala, boca, nódulos linfáticos y sistema linfático.
Otras afecciones que se pueden tratar por los péptidos NTP de la invención son tejidos alterados viralmente, bacterialmente o parasiticalmente seleccionado del grupo que consiste de pulmón, mama, estómago, páncreas, próstata, vesícula, hueso, ovario, piel, riñón, seno, colon, intestino, estómago, recto, esófago, sangre, cerebro y sus coberturas, columna vertebral y sus coberturas, músculo, tejido conectivo, suprarrenal, paratiroide, tiroide, útero, testículo, pituitaria, órganos reproductivos, hígado, vesícula biliar, ojo, oreja, nariz, garganta, amígdala, boca, nódulos linfáticos y sistema linfático.
La afección a tratar también puede ser una malformación o desorden de un tejido seleccionado del grupo que consiste en estómago, páncreas, próstata, vesícula, hueso, ovario, piel, riñón, seno, colon, intestino, estomago, recto, esófago, sangre, cerebro y sus coberturas, columna vertebral y sus coberturas, músculo, tejido conectivo, suprarrenal, paratiroide, tiroide, útero, testículo, pituitaria, órganos reproductivos, hígado, vesícula biliar, ojo, oreja, nariz, garganta, amigdala, boca, nódulos linfáticos y sistema linfático.
En particular, la afección a tratar puede ser hipertrofia amigdala, hiperplasia prostática, soriasis, eczema, dermatosis o hemorroides. La afección a tratar puede ser una enfermedad vascular, tal como aterosclerosis o arteriosclerosis, o un desorden vascular, tal como las venas varicosas. La afección a tratar también puede ser una modificación cosmética para un tejido, tal como piel, ojo, oreja, nariz, garganta, boca, músculo, tejido conectivo, pelo o tejido de pecho.
Las composiciones terapéuticas de los péptidos de NTP están dentro del alcance de la presente invención. Dichas composiciones pueden comprender una cantidad efectiva terapéuticamente de un péptido NTP en la mezcla con un vehículo aceptable farmacéuticamente. El material del vehículo puede ser agua para la inyección, preferiblemente suplementada con otros materiales comunes en soluciones para la administración a mamíferos. Típicamente, un péptido NTP para el uso terapéutico se administrará en la forma de una composición que comprende el péptido NTP purificado en conjunción con uno o más vehículos fisiológicamente aceptables, excipientes o diluyentes. Salina neutralizada neutral o salina mezclada con suero de albúmina son ejemplos adecuados de vehículos. Preferiblemente, el producto se formula como un liofilizado usando excipientes adecuados (por ejemplo, sacarosa). Otros vehículos estándar, diluyentes y los excipientes se pueden incluir como se desee. Las composiciones incluyen neutralizadores conocidos para aquellos que tiene habilidad habitual técnica con un intervalo adecuado de valores de pH, incluyendo un neutralizador Tris que tiene un pH de aproximadamente 7,0-8,5, o un regulador de acetato que tiene un pH de aproximadamente 4,0-5,5, el cual puede además incluir sorbito o un sustituto adecuado del mismo.
Los péptidos NTP se pueden emplear sólos, juntos o en combinación con otras composiciones farmacéuticas tal como citoquinas, factores de crecimiento, antibióticos, agentes de inducción apoptosica, antiinflamatorio y/o agentes quimioterapéuticos como son adecuados para la indicación que se va a tratar.
Está invención también abarca las composiciones terapéuticas de los péptidos NTP empleando dendrímeros, fullerenos y otras moléculas sintéticas, polímeros y macromoléculas donde el péptido de NTP se conjuga con, aunido o encerrado en la molécula, polímero o macromolécula, o mediante el mismo o en conjunción con otras especies de moléculas tales como un marcador especifico del tumor. Por ejemplo, en la Patente de Estados Número 5,714,166, Bioactive and/or Targeted Dendimer Conjugates, proporciona un procedimiento de preparación y uso, entre otras cosas, compuesto de polímeros conjugados dendríticos de al menos un dendrimero con un dendrímero con un diana director(s) y al menos un agente bioactivo conjugado a él.
Esta invención también abarca las composiciones terapéuticas de péptidos NTP y vehículos de administración de fármaco tales como emulsiones de lípidos, polímeros de micela, polímero de microesferas, polímeros electroactivo, hidrogel y liposomas.
Las formas de dosificación sólida para la administración oral incluyen pero no se limita a, capsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En dichas formas de dosificación sólida, el compuesto activo preferiblemente se mezcla con al menos uno de los siguientes: (a) uno o más excipientes inerte (o vehículos), tales como citrato de sodio o fosfato de dicalcio; (b) cargas o diluyentes, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico; (c) aglutinantes, tales como carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arábiga; (d) humectantes, tales como glicerol; (e) agentes desintegrantes, tales como el agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido alginico, silicatos complejos y carbonato de sodio; (f) solución retardada, tal como parafina; (g) aceleradores de absorción, tal como compuestos de amonio cuaternario; (h) agentes humectantes, tales como alcohol de acetilo y monostereato de glicerol; (i) adsorbentes, tal como caolín y bentonita, y (j) lubricantes, tal como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, glicoles de polietileno sólido, sulfato lauril de sodio o mezclas de los mismos. Para cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes de neutralización.
Las formas de dosificación líquida para la administración oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires aceptables farmacéuticamente. Además de los compuestos activos, las formas de dosificación líquida puede comprender diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tal como agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsificadores. Ejemplos de emulsificadores son el alcohol etilico, alcohol isopropilo, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencilo, benzoato de bencilo, porpilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites, tales como aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de germen de maíz, aceite de oliva, aceite de ricino y aceite de sésamo, glicerol, alcohol de tetrahidfrofurfurilo, polietilenglicoles, esteres de ácido graso de sorbitan o mezclas de estas sustancias y similares.
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Además de dichos diluyentes inertes, la composición también puede incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes de suspensión, dulcificantes, aromatizantes y agentes perfumantes.
Los niveles de dosificación actuales de los ingredientes activos en las composiciones de la invención pueden variar para obtener una cantidad de péptido NTP que es efectivo para obtener una respuesta terapéutica deseada para una composición particular y procedimiento de administración. El nivel de dosificación seleccionada por tanto cuenta con los efectos terapéuticos deseados, la vía de administración, la duración deseada de tratamiento y otros factores.
Con los mamíferos, incluidos los seres humanos, las cantidades efectivas pueden administrarse sobre la base del área de superficie del cuerpo. La interrelación de las dosificaciones para animales de varios tamaños, especies y humanos (basado en mg/M^{2} de la superficie del cuerpo) se describe por E.J. Freireich y col., Cancer Chemother. Rep., 50(4):219 (1996). El área de superficie del cuerpo se puede determinar aproximadamente a partir de la altura y peso de un individuo (véase por ejemplo, Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N.Y. pp.537-538 (1970)).
La dosis diaria total del péptido NTP administrado a un huésped puede ser una dosis sencilla o dividida. Las composiciones de unidad de dosificación pueden contener tales cantidades de tales submúltiplos del mismo como puede usarse para compensar la dosis diaria. Se entendería, sin embargo, que el nivel de dosis específico para cualquier paciente particular contaría con una variedad de factores incluyendo el peso del cuerpo, la salud general, sexo, dieta, tiempo y vía de administración, potencia del fármaco administrado, índice de absorción y excreción, combinación con otros fármacos y la severidad de la enfermedad que va a ser tratada.
La composición del péptido NTP según la invención se puede administrar intramuscularmente, oralmente, intravenosamente, intraperitonealmente, intracerebalmente (intraparenquimalmente), intracerbroventricularmente, intratumoralmente, intralesionalmente, intradermalmente, intratecalmente, intranasalmente, intraocularmente, intraarterialmente, intranasalmente, intraocularmente, intraarterialmente, topicalmente, transdermicamente, mediante un aerosol, infusión, eyección en bolo, aparato de implantación, sistema de liberación sostenida, etc.
El péptido NTP de la invención también puede ser administrado por un vía transdermal o transcutanea. Un ejemplo de dicha realización es el uso de un parche. En particular, un parche puede prepararse con una fina suspensión de péptido NTP en, por ejemplo, dimetilsufóxido (DMSO), o una mezcla de DMSO con aceite de semilla de algodón y provocar en contacto con la piel del tumor llevado en mamíferos desde el lado de la localización del tumor al lado de una bolsa de piel. Otros medios o mezclas del mismo con otros solventes y soportes sólidos trabajarían igualmente bien. Los parches pueden contener un compuesto del péptido NTP en la forma de una solución o una suspensión. El parche luego se puede aplicar a la piel del paciente, por ejemplo, por medios de inserción en una bolsa de piel del paciente formado por doblar y fijar la piel junta mediante medios de sutura, clips u otros aparatos de sujeción. Estas bolsas se emplearían de tal manera que para contactos continuos con la piel se asegura sin la interferencia de mamíferos. Además de utilizar una bolsa de piel, cualquier instrumento se puede utilizar el cual asegura la colocación firme del parche en contacto con la piel. Por ejemplo, una venda adhesiva se usaría para fijar el parche en el lugar sobre la piel.
El péptido NTP se puede administrar en una formulación o preparación de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de las preparaciones de liberación sostenida incluye matrices de polímero semipermeables en la forma de cosas formadas, por ejemplo películas o microcapsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles, poliactidas (U.S. 3,773,919, EP 58,481), copolimeros de ácido L-glutámico y gama etil-L-glutamato (Sidman y col., Biopolymers, 22:547-556[1983], poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer y col., J.Biomed. Mater Res., 15:167-277 [1981] y Langer, Chem. Tech., 12:98-105[1982]), etilenvinilacetato (Langer y col., supra) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutirico (EP 133,988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, los cuales se pueden preparar mediante cualquiera de los diversos procedimientos conocidos en el arte (por ejemplo, Eppstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 [1985]; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949).
Otra vía de administración para un péptido NTP de la invención es mediante infusión directa o indirecta del péptido NTP en el tumor u otro tejido para ser tratado. Un ejemplo de dicha realización es la inyección directa del péptido NTP en el tumor u otro tejido para ser tratado. El tratamiento puede consistir de una inyección sencilla, inyecciones múltiple en una ocasión o unas series de inyecciones durante un periodo de horas, días o meses con la regresión o destrucción del tumor u otro tejido para ser tratando ser supervisada por medios de biopsia, formación de imágenes u otros procedimientos de para supervisar el crecimiento del tejido. La inyección en el tumor u otro tejido que se trata puede ser mediante un instrumento insertado en un orificio tal como la nariz, la boca, oreja, vagina, recto o uretra o a través de una incisión según el alcance del tumor o tejido in vivo y puede realizarse en conjunción con un sistema de formación de imágenes u óptico tal como ultrasonido o fibra óptica escape según se identifica el sitio adecuado para la inyección(s). Otro ejemplo de dicha realización es el uso de un instrumento que puede proporcionar una infusión constante del péptido NTP al tejido sobre el tiempo.
Otra vía de administración para un péptido NTP de la invención es una conjunción con una cirugía o procedimiento similar empleado para extirparlo físicamente, ablación o de lo contrario matar o destruir el tumor u otro tejido o elementos celulares no requeridos o deseados par eliminarse o destruirse en el que un péptido NTP de la invención se administra al área(s) inmediata circundante del área(s) donde el tumor u otro tejido se elimina según se destruye o impide el crecimiento de cualquiera de las células u otros elementos celulares no eliminados o destruidos mediante el procedimiento.
Otra vía de administración para un péptido NTP de la invención es mediante la implantación de un instrumento dentro del tumor u otro tejido a ser tratado. Un ejemplo de dicha realización es la implantación de un sello que contiene un péptido en el tumor u otro tejido para ser tratado. El sello libera una dosis terapéutica del péptido NTP en el tejido sobre el tiempo. Alternativamente o adicionalmente, la composición se puede administrar localmente mediante implantación sobre el área afectada de una membrana, esponja, u otro material adecuado en el que el péptido NTP se ha absorbido. Cuando se usa un instrumento de implantación, el instrumento se implanta sobre cualquier tejido adecuado u órgano, y la entrega del péptido NTP puede ser directamente a través del instrumento mediante bolo, o mediante administración continua, o mediante catéter usando infusión continua.
Ejemplo 1
El propósito de este ejemplo fue determinar el efecto del péptido NTP#6 en tejido a sitios de la inyección.
Ratas Sprague-Dawley macho (300 gramos de rango de peso) se anestesiaron con éter y se les administró péptido NTP #6 infusión intraprostático después de abrir la visualización quirúrgica de la próstata. Las inyecciones consisten en 300 \mul de péptido NTP #6, 1 mg/ml en PBS pH 7,4 (1,0 mg/kg) (n=8), inyecciones de control de PBS sólo (n=6) y controles con no inyección (n=2). Las ratas se sacrificaron sin causar dolor después de 72 horas, Las glándulas de próstata se diseccionaron, fijaron en 10% de formalin neutralizado durante 24 horas, incrustado en parafina, secionado, y teñida con H & E. Para cada uno de los animales las glándulas de próstata entera se incrustaron y seccionaron. Todas las secciones teñidas se examinaron histológicamente y se midieron. Para cada próstata al menos se examinaron 4 secciones histológicas, y para cada sección histológica dos diámetros transversales (D) a 90º se midió para cada uno (total de \geq 8 medidas por próstata). El diámetro medio de estas mediciones para cada próstata se uso para estimar el volumen según V = \frac{4}{3} \left(\frac{D}{2}\right)^{3}
Resultados: La reducción en el volumen de la próstata en el péptido NTP [122] #1 inyectado en ratas se estimó para ser un media de 45% comparada con los controles (había un diferencia no discernible entre inyecciones de control de PBS sólo, y controles con no inyecciones). La rata tratada de próstata mostró una menor extensión de glandular epitelial, achatamiento y atrofia. El péptido NTP[122]#1 en PBS pH 7,4 empiezan las infusiones de 1,0 mg/kg en la próstata de la rata producida en la reducción del volumen de próstata estimado de > 40% comparado con la no tratada o los controles tratados de PBS, a 72 horas.
Ejemplo 2
El propósito de este ejemplo fue para determinar el efecto del péptido NTP #7 en el tejido en el lugar de la inyección.
Cuatro ratas normales se inyectaron en la piel y subcutáneamente, cada uno en cuatro focos diferentes y en la extremidad del esqueleto muscular, cada uno en dos focos diferentes, con los péptidos #7 en salina en cantidades de 100 a 400 ml a concentraciones de 0,1-1 mg/ml entregado a partir de jeringuilla a través de 26 agujas de ancho de acero inoxidable.
Los animales se observaron durante 24 horas y se sacrificaron sin dolor a las 24 horas. El foco individual de infiltración se extirpó, fijó en formalin al 10%, incrustado en parafina y se manchó y examinó mediante procedimientos de histopatológica estándar.
Los controles recibieron solamente salino.
Resultados: La inyección de los péptidos NTP #7 produjo una necrosis aguda de tejido de un sitio de inyección. La necrosis fue evidente en los tejidos del músculo, tejido conectivo subcutáneo y dermis a los lugares donde se inyectó el péptido NTP #7. La necrosis se correlaciona con las áreas de inyección y no aparece para esparcir más allá del sitio de la inyección.
Aparte de las áreas leves de la inflamación, los controles mostrados no son una prueba de necrosis o de pérdida de célula. Los controles muestran cambios musculares mínimo o ausentes. Las inyecciones de control tienen una leve inflamación aguda mínima a los sitios de inyección y microhemorragias focales a partir de las agujas.
Ejemplo 3
El propósito de este ejemplo fue determinar el efecto del péptido #2 Relacionado en tejido a sitios de inyección.
Las ratas Sprague-Dawley macho (300 gramos de rango de peso) se anestesiaron con éter y se administró el péptido #2 relacionado por mediante la infusión intraprostatica después de abrir la visualización quirúrgica de la próstata. Las inyecciones consisten en 300 \mul de péptido #2 relacionado, 1 mg/ml en PBS pH 7,4. (1,0 mg/kg) (n=8), inyecciones de control de PBS sólo (n=6) y controles con no inyección (n=2). Las ratas se sacrificaron sin causar dolor después de 72 horas. Las glándulas de próstata se diseccionaron, fijaron en 10% de formalin neutralizado durante 24 horas, incrustado en parafina, seccionado y teñido con H&E. Para cada uno de los animales las glándulas de próstata entera se incrustaron y seccionaron. Todas las secciones teñidas se examinaron histológicamente y se midieron. Para cada próstata al menos se examinaron 4 secciones histológicas y para cada sección histológica dos diámetros transversales (D) a 90ºC se midió para cada uno (total de \geq8 mediciones por próstata). El diámetro medio de estas mediciones para cada próstata se usó para estimar el volumen según V = \frac{4}{3} \left(\frac{D}{2}\right)^{3}
Los controles fueron los mismos que en el ejemplo 1.
Resultados: Como en el ejemplo 1 anterior, la inyección del péptido NTP [122]#1 produce menos células significantes y atrofia en la próstata en las 72 horas. Los controles mostraron los cambios mínimos y ausentes, que consiste en la inflamación focal leve, a partir de la aguja.
Ejemplo 4
El propósito de este ejemplo fue determinar el efecto de péptido #3 relacionado en tejido a sitios de inyección.
Las ratas normales se inyectaron en la próstata como en los ejemplos 1 y 3 anteriores con el péptido #3 relacionado. Las ratas se sacrificaron sin causar dolor después de 72 horas y sus glándulas de próstata se examinaron como en los ejemplos anteriores 1 y 3.
Resultados: La pérdida de la célula significativa y la atrofia de la próstata se encontraron a 72 horas comparadas con controles donde había un cambio mínimo.
<110> NYMOX CORPORATION
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AVERBACK, PAUL A. 
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GEMMELL, JACK 
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<120> PÉPTIDOS EFECTIVOS EN EL TRATAMIENTO DE TUMORES Y OTRAS AFECCIONES QUE REQUIEREN LA ELIMINACIÓN O DESTRUCCIÓN DE CÉLULAS
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<130> 10107-44
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<151> 2001-07-19
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<150> US60/331,477
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<151> 2001-11-16
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<213> Organismo desconocido
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<212> PRT
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD-RES
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<213> Homo sapiens 
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<213> Homo sapiens 
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
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202
203
204 
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> PR7
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<213> Cavia porcellus 
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<400> 121
\vskip1.000000\baselineskip
205
206
207
208 
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<210> 122
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<211> 597
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<212> PRT
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<213> Cavia porcellus 
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<400> 122
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209
210 
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<210> 123
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<211> 815
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<212> PRT
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<213> Cavia porcellus 
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<400> 123
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212
213
214 
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<210> 124
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<211> 876
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 124
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215
216
217 
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<210> 125
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<211> 1442
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (15)..(1139)
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<400>125
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219
220

Claims (4)

1. Un péptido NTP que consiste en una secuencia de amino ácido seleccionado de un grupo constituido por:
300
2. Un péptido NTP según la reivindicación 1 para su uso como medicamento.
3. Una composición que comprende un péptido NTP según la reivindicación 1 y un vehículo para el mismo.
4. El uso de un péptido relacionado con NTP según la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección que requiere la eliminación o destrucción de células seleccionadas del grupo que constituido por un tumor maligno o benigno de un tejido; una hiperplasia, hipertrofia, o sobrecrecimiento de un tejido; un tejido viralmente, bacterialmente o parasiticalemente alterado; una malformación de un tejido; hipertrofia de tonsillar, hiperplasia prostática; soriasis; eczema; dermatosis; una modificación cosmética de un tejido; una enfermedad vascular; hemorroides; venas varicosas, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria; enfermedad autoinmune; enfermedad metabólica; enfermedad hereditaria/genética; enfermedad traumática o lesión física; enfermedad de deficiencia nutricional; enfermedad infecciosa; enfermedad amiloide; enfermedad fibrosis; enfermedad de almacenaje; malformación congénita; enfermedad de deficiencia enzimática; envenenamiento; intoxicación; enfermedad medioambiental; enfermedad de radiación; enfermedad endocrina y enfermedad degenerativa.
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