ES2279514T3

ES2279514T3 - Uso de enzimas de bacterias, p. ej., heparinasas, condroitinasas para modular los eventos del proceso de curacion de heridas.

Info

Publication number: ES2279514T3
Application number: ES95926645T
Authority: ES
Inventors: Joseph Zimmermann; Israel Vlodavsky; D. Clark Bennett; Pamela Danagher; Richard Broughton
Original assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc
Current assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc
Priority date: 1994-07-08
Filing date: 1995-07-07
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2015-07-07
Also published as: EP0769961A1; CA2194370A1; DE69535282D1; WO1996001648A1; DE69535282T2; AU3094995A; US5997863A; ATE344051T1; JP4152433B2; JPH10506609A; AU707007B2; CA2194370C; EP0769961B1

Abstract

LOS GLICOSAMINOGLICANES, INCLUYENDO LAS HEPARINASAS 1, 2 Y 3, ASI COMO CONDROITINASAS AC Y B DE LA BACTERIA GRAM NEGATIVA DE FLAVOBACTERIUM HEPARINUM, PUEDEN USARSE BIEN DE FORMA SEPARADA O EN COMBINACION PARA MANIPULAR LA PROLIFERACION CELULAR. EN UNA VERSION, LAS HEPARANISAS SE ADMINISTRAN PARA DEGRADAR LOS COMPONENTES DE SULFATO DE HEPARANO DE LA MATRIZ EXTRACELULAR, PERMITIENDOSE ASI QUE LOS FACTORES DE CRECIMIENTO DEL ENLACE DE HEPARINA QUE SE ALMACENAN EN LA MATRIZ EXTRACELULAR EMIGREN A CELULAS ADYACENTES. LA MOVILIDAD DE AGENTES QUIMIOATRACTIVOS, FACTORES DE CRECIMIENTO Y CELULAS TAMBIEN PUEDE INCREMENTARSE TRATANDO TEJIDOS CON ENZIMAS DE DEGRADACION DE GLICOSAMINOGLICANES, TANTO CONDROITINASAS COMO HEPARINASAS. LA RETIRADA ENZIMATICA DE LOS SULFATOS DE CONDROITINA DE LAS SUPERFICIES DE LAS CELULAS INCREMENTA EFECTIVAMENTE LA CAPACIDAD DE LOS RECEPTORES DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EN LA SUPERFICIE EN LA SUPERFICIE DE LAS CELULAS. LA RETIRADA SELECTIVA DE SULFATO DE HEPARANO DE LAS SUPERFICIES CELULARES MIENTRAS MANTIENEN INTACTA LA MATRIZ EXTRACELULAR, DE FORMA CONVERSIVA, INHIBE LA PROLIFERACION CELULAR MEDIANTE LA REGULACION A NIVELES BAJOS DE LA RESPUESTA CELULAR A LOS FACTORES DE CRECIMIENTO. ESTO SE CONSIGUE ENVIANDO LAS ACTIVIDADES DE DEGRADACION DE HEPARINA O SULFATO DE HEPARANO A LA SUPERFICIE CELULAR. EL ENVIO DE LA ACTIVIDAD DE DEGRADACION DE HEPARINA PUEDE CONSEGUIRSE MEDIANTE LA CONFIGURACION GENETICA DE UNA FUNCIONALIDAD DE ENLACE DE UNION DENTRO DE LAS PROTEINAS DE HEPARINASA, O MEDIANTE EL CONTROL FISICO DE LA CONCENTRACION LOCALIZADA DE ENZIMA A TRAVES DEL METODO DE ADMINISTRACION.

Description

Uso de enzimas de bacterias, p. ej., heparinasas, condroitinasas para modular los eventos del proceso de curación de heridas.

La presente invención describe el uso de enzimas degradantes de glucosaminoglucano de bacteria para modular los eventos del proceso de curación de heridas.

Los factores de crecimiento son polipéptidos que se producen naturalmente y produce como respuesta modulación de un tipo de hormonas de diferenciación y proliferación celular. El mecanismo por el cual estos eventos ocurren es iniciado por el factor de crecimiento al ponerse en contacto con receptores específicos o sistemas de receptores que están ubicados sobre la superficie celular. La secuencia de los eventos intracelulares que ocurren posteriores a la interacción del receptor - factor de crecimiento son responsables de las respuestas a la diferenciación y la mitogénesis por la célula. Estos mecanismos no son comprendidos completamente pero podrían incluir la activación de tirosina quinasa, el metabolismo de nucleótidos y las diferencias en los niveles de electrólitos en la célula (Burgess and Macaig, Ann. Rev. Biochem, 58: 575-606, 1989).

Para la mayoría de los tipos de células, los eventos de mitogénesis y diferenciación son ejecutados en el animal adulto normal. Estos eventos mediados por factores de crecimientos están más relacionados con los organismos en desarrollo, durante los procesos de curación de heridas o en los estadíos de varias enfermedades incluyendo el cáncer y la enfermedad vascular. Por ejemplo, la producción normal de células de endotelio, incluyendo el recubrimiento de microvasos y arterias, se mide en miles de días. Sin embargo, durante la curación de la herida normal, estas células de endotelio proliferan rápidamente, con una producción aproximadamente en cinco días (Folkman and Shing, J Biol. Chem. 267 (16): 10931-10934, 1992). El aumento en la proliferación que ocurre durante la curación de la herida parece ser el resultado de un aumento en la concentración local de varias moléculas angiogénicas, que incluyen los factores de crecimiento.

La familia de factores de crecimiento de fibroblastos incluyen al menos siete polipéptidos que han sido demostrados que estimulan la proliferación en varias líneas de célula incluyendo células de endotelio, fibroblastos, células de músculos liso y células epidérmicas. Se incluyen en este grupo el factor de crecimiento acídico de fibroblastos (FGF - 1), factor de crecimiento básico de fibroblastos (FGF - 2), int - 2 (FGF - 3), factor de crecimiento Sarcoma de Kaposi (FGF - 4), hst - 1 (FGF - 5), hst - 2 (FGF - 6) y factor de crecimiento de queratinocitos; (FGF - 7) (Baird and Klagsbrun, Ann. N.Y. Acad. Sci. 638:xiv, 1991). Estas moléculas, y otras citoquinas incluyen el factor de crecimiento de tejido, TGF\alpha y TGF\beta y el factor de crecimiento derivado de plaqueta, PDGF, factor estimulador de colonia macrófago de granulocito, GM-CSF, interleuquina 3, IL - 3, y el factor de plaqueta 4, PF4, que como característica común comparten su afinidad por heparina (Clark, Dermatol. Clin. 11: 647-666, 1993). Las respuestas del tipo de células específicas también han sido relacionadas con los factores en particular. EGF y TGF\alpha estimulan la proliferación de queratinocitos, estimula TGF\beta la síntesis de colágeno y fibronectina, PDGF estimula angiogénesis y la formación de tejido de granulación y FGF-7 estimula la proliferación de célula epiteliales (Staiano-Coico et al., J Exp. Med. 178: 865-878, 1993). PDGF, FGF-2 y recientemente un factor de crecimiento epidérmico ligado a heparina HB-EGF son descritos (Higashiyama, et. al., 251: 936-939, Science, 1991) esta involucrado en la proliferación y la migración de células del músculo liso vascular y células de endotelio vascular.

El cambio en el estado metabólico de una célula de inactivo a prolifelativo o migratorio implica una disponibilidad mejorada de las moléculas señales apropiadas en las inmediaciones de la célula. En principio esto podría resultar de un aumento en la síntesis de factor de crecimiento o la liberación de factor de crecimiento de los reservorios de almacenamiento. En la naturaleza, ambos mecanismos han sido observados. La expresión de FGF-1, FGF-2, FGF-5 y FGF-7 esta regulada hacia arriba después del grosor total epidérmico de la herida (Werner, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 6896) mientras TGF\beta, FGF-2 y la síntesis de PDGF aumentan las células del músculo liso en respuesta a la lesión vascular. Los factores de crecimiento también han sido detectados en la mayoría de los tejidos sólidos extraídos desde muestras de adultos normales no heridos. A pesar de la presencia de los factores de crecimiento en estas áreas, las células que los comprenden no están en un estado prolifelativo. Aparentemente, los factores de crecimiento son guardados fuera de la célula en la membrana y en la matriz extracelular respectiva donde se previene el hacer contacto con sus receptores de la superficie celular. En este modo sirven de un suministro de emergencia para la reparación de las funciones de formación de los vasos sanguíneos de la herida (Vlodavsky, et. al. TIBS 16: 268-271, 1991).

Un evento inicial en una lesión de tejido o de una herida en los vasos puede involucrar un desplazamiento mecánico de factores de crecimiento desde el espacio extracelular, haciéndose esto disponibles para los receptores de la superficie celular donde se estimula la proliferación. Alternadamente, las células bajo el estrés podrían segregar moléculas que reemplazan los factores de crecimiento extracelulares de estos reservorios de almacenamiento. Las células de tumores han sido demostradas que segregan enzimas degradativas, que incluyen proteoglucanasa, colagenasa y metaloproteínasa, coincidentemente con la metastasis (Nicolson Curr. Opinión Cell Biol. 1: 1009-1019, 1989). Además de facilitar la migración del tumor a través de los vasos sanguíneos, la destrucción de los componentes de la matriz extracelular descarga factores de crecimiento, por esa razón promueven la nueva formación de vaso sanguíneos que alimentan el crecimiento de la masa del tumor (Folkman, et al., Am. J. Pathol 130:393-400, 1988).

Las matrices extracelulares (ECM) son estructuras multi-componentees sintetizadas por varios tipos de células de alrededor que incluyen endotelio, epiteliales, epidérmicas y células de músculos. La ECM esta formada en gran parte de colágeno y sulfato de heparan proteoglucano. También contiene fibronectina, sulfato de condroitina proteoglucano y proteínas más pequeñas. Los factores de crecimiento están aislados de estas matrices por asociación con la porción de glucosaminoglucano de proteoglucano de sulfato de heparan. Heparina y sulfato de heparan son polisacáridos formados de alternar el hexorónico, D-glucorónico ó L-idorónico, y glucosamina, N-acetilado ó N-sulfatado, residuos con diferentes grados de sulfonación. Heparina extraída de intestinos porcinos, pulmones bovinos o células de verga humanas demuestran un alto grado de sulfonación, hasta 2,6 sulfatos por unidad de disacárido, y un ácido idorónico de mayor contenido que el sulfato de heparan. A la inversa, el sulfato de heparan tiene un grado más bajo de sulfonación y contiene preferentemente ácido glucorónico en la posición alternante del sacárido. Regiones "como heparina" de alto ácido idorónico y alto grado de sulfonación han sido relacionadas con la región bFGF ligada de sulfato de heparan desde fibroblastos humanos (Turnbull, et al., J Biol. Chem. 267 (15) 10337-10341, 1992). Sin embargo, la composición de sulfato de heparan en la matriz extracelular no ha sido completamente caracterizada.

La estimulación de la proliferación celular y la migración de los factores de crecimiento constituyen uno de los eventos en el proceso de curación de heridas es un proceso multifactorial interactivo que involucra a mediadores bioquímicos, la matriz extracelular y células de tejido. El proceso de curación de herida es en general dividido en tres fases temporalmente que se superponen: la inflamación, la proliferación y remodelación. Durante la inflamación las células sanguíneas sostenidas se infiltran en el sitio de la herida y liberan varias moléculas mediadoras que incluyen factor de crecimiento derivado de plaqueta, factor von Willibrand, trombospondina, fibronectina, fibronógeno, 5 - hidroxitriptofano, tromboxano-A2 y difosfato de adenosina (Kirsner y Eaglstein, J. Dermatol. 151: 629-640, 1993). Un obturador de plaqueta y trombos son formados y proporcionan una matriz para monocitos, fibroblastos y queratinocitos. Las moléculas quimostáticas atraen a los monocitos que se transforman en macrófagos y secretan factores de crecimiento adicionales (Nathan and Sporn, J. Cell Biol. 113: 981-986, 1991). Neutrófilos pueden asistir con este proceso secretando las enzimas degradativas elastasa y colagenasa que aumentan la entrada de células a través de las membranas.

Los queratinocitos y células epidérmicas, que están involucradas en el cierre de la herida dérmica, pasan al sitio de la herida durante la fase prolifelativa. Angiogenesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos en respuesta a y señales angiogénicas y quimoatrayente (Folkman y Klagsbrun, Science 235:442-447, 1987), y fibroplasia, la acumulación de fibroblastos y la formación de tejido de granulación, también ocurre durante la fase prolifelativa. El tejido remodelado es acompañado por la secreción de componentes de la matriz, incluyendo fibronectina, colágeno y proteoglucano que sirven como un andamio para la migración celular y el soporte de tejido. Colágeno Tipo III, se sintetiza en las etapas más tempranas de la curación de la herida, se reemplaza por el Tipo I más permanente que se forma través de un proceso de producción proteolítica.

La isquemia se refiere a una condición patológica debido a la disfunción localizada del sistema vascular resultando en el suministro inadecuado de sangre con el siguiente daño de tejido. En este caso revascularización, tanto a través del estímulo de la angiogénesis o por los métodos quirúrgicos, debe preceder al curso normal de la curación de la herida del tejido dañado.

La acción de enzimas que degradan componentes de la matriz extracelular y membranas de asentamiento pueden facilitar los eventos de la reparación de los tejidos por una variedad de mecanismos que incluyen el liberar citoquinas atadas por atropamiento de sulfato heparan y aumentan la permeabilidad de la matriz, aumentando la movilidad de las moléculas mediadoras, los factores de crecimiento y los agentes quimostáticos, tanto a las células involucradas en el proceso de curación. Glucosaminoglucano son sometidos a la degradación junto a una variedad de eucariotas y enzimas procarioticas. La actividad degradante del sulfato heparan ha sido detectado en plaquetas (Oldberg et al. Biochemistry, 19: 5755-5762, 1980), células tumorales (Nakajima, et al. J. Biol. Chem. 259: 2283-2290, 1984) y células de endotelio (Gaal et al. Biochem. Biophys. Resol. Comm., 161: 604-614, 1989). Estas enzimas heparinasa actúan catalizando la hidrólisis del nodo central de los carbohidratos de sulfato heparan en la conexión de glucosamina y ácido hexorónico (1 -> 4) (Nakajima et al., J. Cell. Biochem., 36: 157-167, 1988). Heparinasa de mamíferos típicamente son inhibidas por la forma de heparina altamente sulfatada de la familia de sulfato heparan - heparina. Sin embargo las caracterizaciones bioquímicas exactas de estas enzimas hasta ahora han sido prevenidas por la falta de un método para obtener preparaciones homogéneas de las moléculas.

Enzimas que degradan heparina también han sido encontradas en microorganismos incluyendo Flavobacterium heparinum (Lohse y Linhardt, J. Biol. Chem. 267: 2437-24355, 1992),cepas Bacteroides (Saylers, et al., Appl. Environ. Microbiol. 33:319-322, 1977; Nakamura, et al., J. Clin. Microbiol. 26: 1070-1071, 1988), Flavobacterium Hp206 (Yoshida, et al., 10th annual Symposium Glyconjugates, Jerusalén 1989) y especies Citophagia (Bohn, et al., Drug Res. 41 (I), Nr. 4: 456-460, 1991). Enzimas que degradan el sulfato de Corondoitina han sido aisladas desde algunos microorganismos incluyendo Flavobacterium heparinum (Michaleacci, et al., Biochem. J. 151: 123, 1975), especies Bacteroides (Saylers, et al. J. Bacteriol. 143: 781, 1980; Linn, et al., J. Bacteriol. 156: 859, 1983; Steffen, et al., J. Clin. Microbiol. 14: 153, 1981), Proteus vulgaris (Uamagata, et al., J. Biol. Chem. 243: 1523, 1968, Suzuki, Meth. Enzymol. 28: 911, 1972), especies Vibrio y Microcossus Beneckea, y (Kitamikada y Lee, Appl. Microbiol. 29: 414, 1975) y Arthrobacter aurescens (Hiyam and Okada, J. Biol. Chem. 250: 1824-1828, 1975).

F. heparinum produce tres formas de heparinasa, heparinasa 1, heparinasa 2 y heparinasa 3 (heparitinasa) (Lohse y Linhardt, J Biol. Chem. 267: 24347-24355, 1992). Estas tres enzimas cortan a la glucosamina (1 -> 4) unida al ácido hexorónico con diferentes grados de especificidad dependiendo de los patrones de sulfonación y en residuo particular de ácido hexorónico, idorónico o glucorónico, en un sitio de corte (Desai, et al., Arch. Biochem. Biophys. 306: 461-468, 1993). F. heparinum también produce dos enzimas que degradan a miembros de la familia de sulfato dermatan/sulfato de condroitina. Éstas son la liasa de condroitina AC, que degrada ambos sulfato de condroitina A como sulfato de condroitina C por corte de la unión de la galactosamina (1 -> 4) y ácido glucorónico en el nodo central del polisacárido y liasa de condroitina B en que degrada sulfato de dermatan (sulfato de condroitina B) por corte de la unión de galactosamina (1 -> 4) con el ácido idorónico en el nodo central del polisacárido. El mecanismo enzimático de las enzimas de F. heparinum es a través de una reacción de eliminación, así diferenciando, las enzimas degradantes de glucosaminoglucano de mamífero. Además, ninguna de las enzimas de liasa de F. heparinum aparecen inhibidas por moléculas de glucosaminoglucano como son las enzimas de mamíferos.

Heparinasa de mamífero, purificado parcialmente desdes extractos de líneas celulares de tumores, tanto como heparinasa 1 y heparinasa 3 de Flavobacterium heparinum, ha sido mostrada con FGF-2 radiomarcado con ^{125}I y ha sido pre-adsorbido a una matriz extracelular sintetizada in vitro por células de endotelio de la aorta de bovinos (Bashkin, et al. J. Cell. Physiol. 167: 126-137, 1992). Sin embargo, desde que heparina de bajo peso molecular no fraccionada produce una respuesta de liberación similar en forma de FGF-2 radiomarcado con ^{125}I absorbido exógenamente, no está claro de estos reportes que tanto lo liberado medido fue debido a la degradación enzimática del sulfato heparan en la ECM o un desplazamiento electrolítico del tipo de intercambio iónico de FGF-2 desde el sulfato heparan cargado negativamente. El mismo grupo de investigación reporta sobre la liberación de actividad promotora del crecimiento desde células del músculo liso vascular por tratamiento con heparinasa 3 y desde la matriz extracelular por la exposición de fragmentos de células de neutrófilos o linfoma. Sin embargo, no existe demostración de que la liberación desde la matriz extracelular de actividad promotora del crecimiento que por el contacto con enzimas degradantes de glucosaminoglucano de bacteria no tienen estas enzimas siendo revelador que promociona la reparación del tejido o el crecimiento de vasos nuevos in vivo.

Resumen de la invención

Glucosaminoglucano, incluyen heparinasa 1, 2 y 3 tanto como condroitinasa AC y B desde bacteria gram negativa Flavobacterium heparinum, pueden ser usado por separado o en combinación para manipular la proliferación celular. En una realización, heparinasa se administra para degradar componentes del sulfato de heparan de la matriz extracelular, por esa razón son permitidos factores de crecimiento ligado a heparina, los que son almacenados en la matriz extracelular para migrar a las células adyacentes. La movilidad de agentes quimoatrayentes, factores de crecimiento y células también pueden ser incrementados por tratamiento de tejido con enzimas degradantes de glucosaminoglucano, tanto heparinasas como condroitinasas. La eliminación enzimática de sulfatos de condroitina de la superficie celular efectivamente incrementa la disponibilidad de receptores de factor de crecimiento sobre la superficie celular. Sulfato heparan eliminado selectivamente de la superficie celular mientras lo que queda en la matriz extracelular intacta, al contrario inhibe la proliferación celular regulando abajo la respuesta celular por los factores de crecimiento. Este objetivo es alcanzado por la actividad degradante de sulfato heparan ó heparina en la superficie celular. Objetivamente la actividad degradante de heparina puede ser conseguida creando por ingeniería genética la funcionalidad de unión al ligando de las proteínas de heparinasa, o controlando físicamente la concentración de enzima localizada a través del método de administración.

Los métodos para preparar enzimas glucosaminoglucano y derivados por ingeniería genética son descritos y son tan bueno como los métodos para producir las preparaciones farmacéuticas de glucosaminoglucano altamente purificado de enzimas degradantes. Los métodos son relevados para producir enzimas degradantes de derivados de la heparina que incluyen las propiedades de otras proteínas. Estas moléculas pueden ser usadas para centrar actividad degradante de la heparina a la superficie celular que inhibe la respuesta celular para los factores de crecimiento
endógenos.

Los ejemplos demuestran la liberación de actividad promotora de factores de crecimiento desde la ECM, las células intactas y los tejidos que usan glucosaminogluconasa, aumentando la proliferación celular in vitro por tratamiento con glucosaminogluconasa, especialmente heparinasa 3, la actividad promotora del crecimiento de fragmentos de sulfato de heparan liberado por células tratadas con glucosaminogluconasa y la eficacia de heparinasa 3 en la estimulación de la curación de la herida in vivo en modelos animales.

De acuerdo a la invención se proporciona el uso de una composición farmaceútica en la fabricación de un medicamento que aumenta la curación de la herida por liberación de heparina ligada a factores de crecimiento y moléculas desde la matriz extracelular, que elimina sulfato de condroitina desde los receptores de la superficie celular que y/o eliminan el componente sulfato de heparan del complejo receptor - factor crecimiento, en el que la composición consta de una enzima degradante de glucosaminoglucano de bacteria seleccionada desde el Grupo que consta de heparinasa 1 desde Flovobacterium heparinum, heparinasa 2 desde Flovobacterium heparinum, heparinasa 3 desde Flavobacterium heparinum, condroitinasa AC desde Flovobacterium heparinum, and condroitinasa B desde Flavobacterium heparinum, heparinasa desde cepas Bacteroides, heparinasa desde Flavobacterium Hp206, heparinasa desde especies Cytophagia, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde especies Bacteroides, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde Proteus vulgaris, enzima degradante sulfato de condroitina desde Microcossus, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde especies Vibrio, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde
Arthrobacter aurescens, estas enzimas expresadas desde secuencias de nucleótido recombinante es expresadas en bacteria, y combinación de las mismas, en combinación con un portador farmaceúticamente adecuado para la administración localizada.

La invención también proporciona:

A) un vehículo de entrega para la entrega de, y consta, de la enzima en combinación con el portador en una dosis eficaz para aumentar la curación de la herida por liberar heparina ligada a factores de crecimiento y moléculas desde la matriz extracelular, eliminación del sulfato de condroitina desde receptores de superficie celular y/o eliminación del componente de sulfato heparan y complejo receptor - factor de crecimiento, en el que la enzima es una enzima degradante glucosaminoglucano de bacteria seleccionado desde el Grupo que consiste de heparinasa 1 desde Flavobacterium heparinum, heparinasa 2 desde Flovobacterium heparinum, heparinasa 3 desde Flavobacterium heparinum, condroitinasa AC desde Flavobacterium heparinum, y condroitinasa B desde Flavobacterium heparinum, heparinasa desde cepas Bacteroides, heparinasa desde Flavobacterium Hp206, heparinasa desde especies Cylophagia, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde especies Bacteroides, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde Proteus vulgaris, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde Microcossus, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde especies Vibrio, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde Arthrobacter aurescens, estas enzimas expresadas desde secuencias de nucleótido recombinantes expresadas en bacterias, y combinación de la misma, en combinación con un portador farmaceúticamente adecuado en el que la enzima es heparinasa 1, 2 o 3 desde Flavobacterium heparinum, la composición no consta de una cantidad eficaz de heparinasa en un portador farmaceúticamente adecuado para inhibir Angiogénesis a un lado seleccionado en un paciente no heparinasado.

- El uso de un vehículo de entrega de la invención en la fabricación de un dispositivo para aumentar la curación de herida por la liberación de heparina unida a factores de crecimiento y moléculas de la matriz extracelular, elimina sulfato de condroitina desde receptores de superficie celular y/o eliminación del componente de sulfato de heparan de su complejo receptor - factor de crecimiento;

- Una composición que consta de una enzima degradante glucosaminoglucano de bacteria como se describe arriba en que, si la enzima es heparinasa 1, 2 o 3 de Flavobacterium heparinum, la composición no comprende un cantidad eficaz de heparinasa en un portador farmaceúticamente aceptable para inhibir la Angiogénesis en un sitio seleccionado en un paciente no heparinisado.

- Una composición que consta de una enzima degradante glucosaminoglucano de bacteria como se describe arriba en el que el portador está seleccionado entre el grupo que consta de películas poliméricas, microparticulas, microcapsulas, protesomas, liposomas, parches transdérmico y vendas.

Descripción breve de los dibujos

Figuras 1a, 1b y 1c son diagramas esquemáticos que retratan la función de glucosaminoglucano en la matriz de extracelular (ECM - la parte superior) y sobre superficies celular (la mitad inferior).

La Figura 1a muestra que el componente (la línea garabateada lisa) de sulfato de heparan proteoglucano (HSPG) unida a heparina ligada a factores de crecimiento (HBGF) en ambos la matriz extracelular y la superficie celular. Factores de crecimiento no unidos al sulfato heparan no son capaces de unir su receptor de superficie celular. A Sulfato de heparan o fragmentos de sulfato heparan que se enlazan a los factores de crecimiento y produce como respuesta un cambio conformacional que le permite la unión al receptor. Sulfato de condroitina proteoglucano (la línea sombreada garabateada) (CSPG) está también ubicada en la matriz extracelular y sobre la superficie celular. En la superficie celular las moléculas de sulfato de condroitina pueden dificultar el acceso de heparina que se une a receptores de factor de crecimiento estéricamente. Figura 1b muestra que el tratamiento con enzimas degradantes de sulfato de condroitina permite mayor acceso a los receptores de superficie celular e incrementa la movilidad de moléculas quimoatrayentes, los factores de crecimiento y las células a través de la matriz extracelular. Figura 1c indica el tratamiento con heparina o enzimas degradantes de sulfato de heparan que abandona fragmentos de sulfato heparan y heparina uniendo los factores de crecimiento de la matriz extracelular, así se incrementa su disponibilidad a los receptores de superficie celular adyacentes, e incrementa la movilidad de moléculas quimoatrayentes, los factores de crecimiento y las células a través de la matriz extracelular.

Figura 2 es un gráfico de la desorción (la penetración respecto a agarosa (mm) con el tiempo (minutos) de heparinasa en geles de semisólidos para medir la cantidad presente de enzima.

Figura 3 es un gráfico de crecimiento relativo que promociona la actividad liberada desde cuestión de enzima tratada extracelular (control de x) para sin tratar, heparinasa 1, heparinasa 2, heparinasa 3, condroitinasa AC y condroitinasa B. Los resultados son expresados como la proporción de incorporación de tiamidina por fibroblastos Balb/c 3T3 que se exponen en un sobrenadante de la matriz tratada con la enzima a ese sobrenadantes de la matriz sin tratar.

Figura 4 es un gráfico de la actividad promotora del crecimiento relativo liberada desde enzima tratadas con córneas bovinas (control de x) para los sin tratar, heparinasa 1, heparinasa 2, y heparinasa 3. Los resultados son expresados como la proporción de la constitución de tiamidina por fibroblastos Balb/c 3T3 que exponen sobrenadantes córneos a enzima tratadas a sobrenadantes de córneas sin tratar.

Figura 5 es un gráfico de la liberación de ^{35}S desde la matriz extracelular (cpm) sin tratar, heparinasa 1, heparinasa 2, heparinasa 3, condroitinasa AC, condroitinasa B.

Figura 6 es un gráfico de la absorción relativa de FGF-2 por células de músculo liso bovinos tratadas con enzima (% del control) para los sin tratar, heparinasa 1, heparinasa 2, y condroitinasa AC.

Figura 7 es un gráfico de la respuesta prolifelativa relativa de fibroblastos Balb/C 3T3 para el tratamiento enzimático de la matriz extracelular, superficie celular, o de ambos. La proliferación fue determinada por la incorporación de ^{3}H - tiamidina y es expresada como la proporción de la incorporación observada en las condiciones tratadas del control (células sin tratar expuestas a sobrenadantes de la matriz sin tratar).

Figura 8 es un gráfico de la respuesta prolifelativa de fibroblastos balb/C 3T3 inactivos para material soluble liberado desde la matriz extracelular tratada con enzima heparinasa 1, 2, 3, condroitinasa AC (barras sombreadas). La respuesta prolifelativa de células tratadas con heparinasa 1, 2, 3, o la condroitinasa AC es demostrada antes de su exposición a sobrenadantes de la matriz de enzima (barras sólidas). Estos resultados son expresados como la cantidad por minuto de ^{3}H-tiamidina incorporado por fibroblastos balb/C 3T3 expuestos a sobrenadantes desde la matriz no tratada. El control negativo "células sin tratar" representa la respuesta prolifelativa de las células expuestas a sobrenadante de la matriz sin tratar.

Figura 9 es un gráfico de la respuesta proliferativa de fibroblastos balb/C 3T3 inactivos, tanto pretratados con heparinasa 3 como sin tratar, al material soluble liberado desde la matriz extracelular de la enzima tratada heparinasa 3. La respuesta proliferativa de fibroblastos de balb/C 3T3 inactivos es presentada, tanto pretratados con heparinasa 3 como sin tratar, para el material liberado espontáneamente de la matriz extracelular. Estos resultados son expresados como la cantidad por minuto de ^{3}H - tiamidina incluido por fibroblastos balb/C 3T3 expuestos a sobrenadantes de la matriz tratado con enzima. Las células sin tratar son células expuestas a sobrenadante de la matriz sin tratar; células + hep 3 son células pretratados con heparinasa 3 antes de la exposición para sobrenadante de la matriz sin tratar; ECM + hep 3 del que las células son expuestas a sobrenadante matriz tratada heparinasa 3; y ECM + hep 3 células + hep 3 son células tratadas con heparinasa 3 expuestas a sobrenadante desde matriz tratada heparinasa 3.

Figura 10 es un gráfico de la respuesta proliferativa de fibroblastos balb/C 3T3 inactivos para el material soluble liberado desde córneas bovinas tratadas a la enzima para tres concentraciones de heparinasa 3, 0,1 0,01, y 1,0 IU/ml. El valor de control negativo "células sin tratar" representa la respuesta proliferativa de células expuestas del sobrenadante de las córneas sin tratar.

Figura 11 es un gráfico que describe la liberación de bFGF desde células de endotelio bovinas (barras sombreadas), células de músculo liso bovinas (barras sólidas), y la matriz extracelular (barras grises) expuestas para heparinasa 1, 2, o 3.

Figura 12 es un gráfico de la inhibición de la proliferación de célula de músculo liso por tratamiento de las células con heparinasa 1, heparinasa 2, y heparinasa 3. Los resultados son expresados como el por ciento de la proliferación celular después del tratamiento con enzima comparados con las células sin tratar como control. Las células sin tratar tienen un nivel de proliferación de 100%. Las barras con líneas diagonales son los tratamientos con 0,1 UI/ml de enzima. Las barras sólidas son de los tratamientos con 0,5 UI/ml de enzima.

Figura 13A es un gráfico de la degradación de sulfato marcado ECM por heparinasa 1, 2 o 3. Sulfato metabólicamente marcada con ECM cubre placas de cultivo de tejido 4 pocillos fue incubado por 18 h a 37ºC con 0,1 U/ml heparinasa 1 (o), heparinasa 2 (\Delta) o heparinasa 3 (\Box). Material marcado con sulfato el liberado en el medio de incubación fue analizado por l filtración de gel sobre Sepharosa 6B.

Figura 13B es un gráfico en la liberación de la actividad mitogénica atada a ECM. Alícuotas del medio de incubación sobre plástico (línea diagonal sombreada) o ECM (cruces garabateado sombreado) fueron probados por la estimulación de crecimiento de la incorporación de ^{3}H - tiamidina en fibroblastos de 3T3.

Figura 13C es un gráfico de la degradación de sulfato marcado ECM por heparinasa 1, 2 y 3. Sulfato marcado ECM fue incubado por 18 h a 37ºC con 0,1 U/ml heparinasa 1, 2 o 3. La cantidad total de material marcado con sulfato liberado fue cuantificado en el medio de incubación (línea diagonal sombreado). El ECM permanente fue digerido por una hora a 37ºC) con tripsina (5 \mug/ml) y la radiactividad solubilizada (cruces sombreadas) contadas en un contador de centelleo.

Figuras 14A, 14B, 14C y 14D son gráficos de la estimulación de la proliferación de célula de linfoide F32 por fragmentos de sulfato de heparan liberados desde las células y expuesto a la ECM heparinasa 1, 2 o 3 sobre diferentes superficies. Regular (plástico) (figura14B) y la ECM cubierta (figura 14A) placas 4 pocillos tanto como cultivos confluentes de células de endotelio vasculares (EC) (figura 14C) y células de músculo liso (SMC) (figura 14D) fueron incubadas por 1 h a 37ºC con 0,1 U/ml heparinasa 1 (\Box), de heparinasa 2 (e) o heparinasa 3 (s). Alícuotas (1-40 ml) de los medios de de incubación fue añadidos a células F32 preseleccionadas en placas de 96 pocillos luego en presencia de 5 ng/ml de bFGF. ^{3}H - tiamidina (1 \muCi/pocillo) era 48 horas adicionales después de sembradas y 6 h después las células fueron cosechadas y medidas para la incorporación de ^{3}H - tiamidina. Cada punto de datos representa la media \pm S.D. de seis pocillos de cultivo.

Figura 15A y 15B son gráficos de la estimulación de la proliferación celular de F32 linfoide por Heparinasa 3. Figura 15A es un gráfico de la incubación de células linfoide F32 en placas de 96 pocillos con 5 ng/ml de bFGF 3 de heparinasa en ausencia y presencia de 0,1 U/ml natural (no sombreado) o calor inactivado (10 minutos, 95ºC) (línea diagonal sombreada). La enzima heparinasa 3 (0,1 U/ml) es también aplicada sobre DEAE celulosa (0,5 ml) y ambos cargados (no sombreado) y flujo a través de material (línea diagonal sombreado) fue añadido a las células linfoide F32. Figura 15B es un gráfico de la incubación de células de linfoide F - 32 en placas de 96 pocillos con 5 ng/ml de bFGF de 1 mg/ml natural (no sombreado) o el calor inactivado (10 minutos, 95ºC) (línea diagonal sombreado) en ausencia y presencia de heparina. La heparina es también aplicada sobre DEAE celulosa (0,5 ml) y tanto la carga (no sombreado) como el flujo a través del material (línea diagonal sombreado) se añadió a las células linfoide F32. ^{3}H - tiamidina (1 \muCi/pocillos) fue añadido cada 48 h después de sembrados por 6 h, después las células fueron cosechadas y medidas por incorporación de ^{3}H - tiamidina. Cada punto de datos representa la media \pm S.D. de seis pocillos de
cultivo.

Figura 16 es un gráfico de la fuerza (tensión, g/mm^{2}) de piel que contiene un sitio de herida tomado de seis grupos de ratas luego de la siguiente prueba in vivo de la habilidad de heparinasa de estimular la curación de herida, comparando el efecto de vehículo, lo heparinasa (1 día), y afectado (calor inactivado) heparinasa a 1, 3 y 7 días.

Figura 17 es un gráfico de la fuerza (tensión, g/mm^{2}) de piel que contiene un sitio de herida tomado de seis grupos de ratas luego de la prueba in vivo de heparinasa en las dosis de 0,02, 0,2, y 2,0 IU heparinasa 3 estimula la curación de herida.

Descripción detallada de la invención

Una metodología para controlar los eventos involucrados en los procesos de curación de herida por el uso enzima degradante de glucosaminoglucano altamente purificado obtenidos de los genes de Flavobacterium heparinum se revela. Glucosaminoglucano, incluye sulfato de heparan, sulfato de condroitina y sulfato de dermatan, son los componentes de polisacárido sulfatados de proteoglucano localizados sobre la superficie celular, donde actúan como receptores de citoquinas y en el espacio extracelular donde forman la estructura de la matriz extracelular y sirven como un reservorio de almacenamiento para los factores de crecimiento. Glucosaminoglucano de enzimas degradantes desde F. heparinum: heparinasa 1 (EC 4.2.2.7), heparinasa 2, heparinasa 3 (EC 4.2.2.8), condroitinasa AC (EC 4.2.2.5) y condroitinasa B modula las interacciones involucradas en proliferación celular y la migración por:

i) liberación de heparina ligada a factores de crecimiento y moléculas desde la matriz extracelular, por esa razón aumenta su disponibilidad para células adyacentes para la estimulación de proliferación y migración, ii) componentes degradante de la matriz extracelular, por esa razón facilitando la mobilidad de citoquinas, quimoatrayentes y celular, iii) eliminando sulfato de condroitina desde superficie celular, por esa razón aumenta accesos para receptores superficie celular y iv) inhibición de la respuesta de proliferación celular para factores de crecimiento por eliminación de componente de sulfato de heparan del complejo receptor - factor de crecimiento.

Las interacciones de receptor - factor de crecimiento ligada a heparina requiere la presencia de un tercer componente: sulfato de heparan, que está presente sobre la superficie celular, o puede ser añadido a las células, o líticamente la liberación como un fragmento de sulfato heparan de la matriz extracelular. La adición de heparina o enzima degradante de sulfato heparan que en el rango entre 0,001 y 5 IU/ml promociona la proliferación celular co-liberando heparina ligada a factores de crecimiento y fragmentos de sulfato heparan de la matriz extracelular e incrementa su disponibilidad en las células adyacentes.

De forma selectiva se elimina sulfato heparan de la superficie celular mientras lo que queda en la matriz extracelular intacta, a la inversa, inhibe la proliferación celular regulando abajo la reacción para los factores de crecimiento de la célula. Esto es alcanzado centrando la actividad degradante de heparina o sulfato heparan a la superficie celular. Se centra en la actividad degradante de heparina, la puede ser alcanzado creando por ingeniería genética una funcionalidad unida a ligando de las proteínas de heparinasa, o controlando la concentración de enzima localizada físicamente a través del método de administración. Por ejemplo, los catéteres de globo de doble permeables pueden dirigir heparinasa, de forma preferencial, a células del músculo liso vascular expuestos en vasos lesionados. Preparación de de enzimas degradantes Glucosaminoglucano.

Enzimas lisasa de Glucosaminoglucano pueden ser preparadas por aislamientos de células bacterianas o mamíferas, aquellas que naturalmente produce la enzima o ha sido creada por ingeniería genética para producir la enzima.

Aislamiento de enzimas producidas naturalmente

Las enzimas liasa Glucosaminoglucano pueden ser purificadas de los cultivos de Flavobacterium heparinum, de la siguiente manera. F. heparinum es cultivada en fermentadores de 15 L controlado por computadora, en una variación de medio nutriente definido y descrito por Galliher et al., Appl Environ. Microbiol. 41 (2): 360-365, 1981. Para las fermentaciones diseñadas producir liasa de heparina, heparina semi - purificada (Celsus Laboratories) se incluye en la media de la concentración de 1,0 g/L como el inductor de la síntesis de heparinasa. Para las fermentaciones diseñadas producir liasa de condroitina, sulfato de condroitina A (Sigma) se incluye en la media a una concentración de 1,0 g/L como el inductor de condroitinasa AC y la síntesis de condroitinasa B. Para ambos tipos de la fermentación, las células son cosechadas por centrifugación y las enzimas deseadas se liberan del espacio periplasmático por un procedimiento de shock osmótico descrito por patente de los EE.UU. 5,169,772 Zimmermann, et al. (1992).

Proteínas desde el crudo osmolatado se adsorbe en una resina de intercambio catiónico (CBX, J.T. Baker) a una conductividad entre uno y siete \mumho. Las proteínas no unidas desde el extracto son descartadas y la resina empacada en una columna de cromatografía (i.d. 5,0 cm x 100). Las proteínas unidas al eluato a una velocidad de flujo lineal de 3,75 cm^{-1} - minutos con un gradiente de paso de 0,01 M fosfato/0,1 M de cloruro de sodio, 0,01 M de fosfato/0,25 M cloruro de sodio, 0,01 M de fosfato/1 M cloruro de sodio, todos a pH, 7,0 \pm 0,1. Eluatos de heparinasa 2 en la fracción de 0,1 M de NaCl mientras eluatos de heparinasa 1 y 3 en la fracción 0,25 M. Alternadamente, el paso de cloruro de sodio 0,1 M se elimina y las tres heparinasas co-eluyen con cloruro de sodio 0,25 M. Las fracciones de heparinasa son cargadas directamente a una columna que contiene sulfato de celufina (i.d. 5.0 cm; x 30 cm, Amicon) y eluye a velocidad de flujo lineal de 2,50 cm^{-1}- minutos con gradientes de paso de 0,01 M fosfato, 0,01 M de fosfato/0,2 M cloruro de sodio, 0,01 M fosfato/0,4 M cloruro de sodio y 0,01 M fosfato/1 M de cloruro de sodio, todo a pH, 7,0 \pm 0,1. Eluato de heparinasa 2 y 3 en la fracción de 0,2 M cloruro de sodio mientras eluatos de heparinasa 1 en la fracción de 0.4 M. La fracción de 0,2 M de cloruro de sodio de columna sulfato de celufina es diluida con fosfato de sodio 0,01 M para dar una conductancia menor de 5 mmhos. La solución es purificada después cargando el material a una columna hidroxilapatita (i.d. 2.6 cm; x 20 cm) y eluyendo la proteína unida a una velocidad de flujo lineal de 1,0 cm^{-1}- minutos con gradientes de paso de 0,01 M fosfato, 0,01 M de fosfato/0,35 M cloruro de sodio, 0,01 M de fosfato/0,45 M de cloruro de sodio, 0,01 M de fosfato/0,65 M cloruro de sodio, 0,01 M de fosfato/1 M cloruro de sodio, todos a pH, 7,0 \pm 0,1. Eluatos de heparinasa 3 en un pico de una sola proteína en la fracción de cloruro de sodio 0,45 M mientras que el eluato de heparinasa 3 en una sola proteína alcanza el máximo en la fracción de cloruro de sodio 0,65 M. Heparinasa 1 es purificado después cargando el material a la columna de sulfato de celufina, diluido a una conductividad menor de 5 mmhos, en una columna de hidroxilapatita (i.d. 2.6 cm; x 20 cm) y eluye la proteína unida a una velocidad de flujo lineal de 1,0 cm^{-1}- minutos con un gradiente lineal de fosfato (0,01 a 0,25 M) y cloruro de sodio (0,0 a 0,5 M). Eluatos de heparinasa 1 en un pico de una sola proteína aproximadamente a medio camino a través del gradiente.

Las enzimas heparinasa obtenidas por este método son mayores que el 98,5% puro como estimado por análisis HPLC - fase reversa (BioCad, II de POROS). Resultados de purificación para las enzimas heparinasa son mostradas en la Tabla 1.

TABLA 1 Purificación de enzima de heparinasa desde fermentaciones Flavobacterium heparinum

1

Osmolatos obtenidos desde fermentaciones de F. heparinum inducidas con sulfato de condroitina A se somete a la centrifugación para eliminar células y debris celular y el sobrenadante aplicado a una columna de intercambio catiónico (5,0 cm x 30 cm; Sepharosa™, S Big Vedas, Pharmacia) a velocidad de flujo lineal de 10 cm^{-1}-minutos. Las proteínas unidas son eluida a una velocidad de flujo lineal de 5,1 cm^{-1}-minutos con gradientes de pasos de 0,01 M fosfato/0,25 M de cloruro de sodio, 0,01 M fosfato/1.0 M cloruro de sodio, todo a pH, 7,0 \pm 0,1. Eluatos de actividad de condroitinasa en la fracción de cloruro de sodio a 0,25 M la que es purificada después de diluir la fracción que contiene condroitinasa dos veces con 0,01 M fosfato de sodio y aplicar el material a una columna que contiene sulfato de celufina (i.d. 2,6 cm; x 100 cm, AMICON) y eluimos a una velocidad de flujo lineal de 1,88 cm^{-1}-minutos con un gradiente lineal de cloruro de sodio, 0,0 a 0,4 M. Eluatos principalmente de Condroitinasa AC en cloruro de sodio de 0,23 a 0,26 M mientras condroitinasa B eluida en cloruro de sodio 0,27 a 0,3 M. Cada fracción fue diluida dos veces con fosfato de sodio 0,01 M y aplicada a una columna de hidroxilapatita (i.d. 2.6 cm; x 30 cm). Las proteínas unidas son eluida con un gradiente de paso de cloruro de sodio 0,25 M seguida por un gradiente lineal de cloruro de sodio 0,25 a 1,0 M toda en fosfato de sodio 0,025 M a pH 7,0 \pm 0,1. Eluatos de condroitinasa B en el paso de cloruro de sodio 0,25 M mientras eluatos de condroitinasa AC en cloruro de sodio 0,85 a 0,95 M. La fracción de condroitinasa B es diluida dos veces en fosfato de sodio 0,01 M y aplicada a una columna de intercambio catiónico fuerte (CBX - s, J. T. Baker i.d. 1.6 cm; x 10 cm). El material unido se eluye a una velocidad de flujo de 1.0 cm^{-1}-minutos con un gradiente lineal de 0,125 a 0,325 M en fosfato de sodio de 0,025 M a 7.0 \pm 0.1. Eluatos de Condroitinasa B en un pico de proteína a 0,175 a 0,225 M de cloruro de sodio proteína y contiene una minoría de proteína contaminante de peso molecular 20,000 D. Esta proteína se elimina por cromatografía de gel filtración cargando la muestra de condroitinasa B en una columna Superdex™ 200 (1,0 x 30 cm; Pharmacia) y eluido con 0,05 M de fosfato de sodio, pH 7,2 a velocidad de flujo lineal de 1,25 cm - minutos^{-1} y colectar las fracciones que contiene la proteína. La fracción de condroitinasa AC colectada desde cromatografía de hidroxilapatita es diluida tres veces en fosfato de sodio 0,01 M y aplicada a una columna de intercambio catiónico fuerte (CBX - s, J. T. Baker i.d. 1.6 cm; x 10 cm). El material unido es eluido a una velocidad de flujo de 1,0 cm^{-1}-minutos con un gradiente lineal de cloruro de sodio 0,125 a 0,325 M en 0,025 M de fosfato de sodio a pH 7,0 \pm 0,1. Eluatos de condroitinasa AC es un solo pico de proteína solo a cloruro de sodio de 0,175 a 0,225 M. Resultados de purificación de las enzimas de condroitinasa son mostradas en Tabla 2.

TABLA 2 Purificación de enzimas condroitinasa desde fermentaciones de Flavobacterium heparinum

2

Aislamiento de enzimas de recombinante

Enzimas degradantes Glucosaminoglucano también pueden ser aisladas desde sistemas de expresión recombinantes tales como el sistema de expresión de heparinasa 1 descrito por Sasisekharan, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8660-8664, 1993; el sistema de expresión de heparinasa 2 y 3 que se descubre en el número de serie de la solicitud de patente de los EE.UU. No. 08/258,639 "Nucleic Acid Sequences and Expression Systems for Heparinase 2 y Heparinase 3 derived From Flavobacterium heparinum" por Su, et al., Filed June 10, 1994; o los sistemas de expresión condroitinasa B y AC que se revela en el número de serie de la solicitud de patente de los EE.UU. 08/272,247 "Condroitin Lyase Enzyme" por Bennett, et al., Filed July 8, 1994, las enseñanzas que son incluidas en este. En estos sistemas de expresión, los genes de F. heparinum son aislados y clonados en plásmidos hacia abajo desde un promotor inducible. Los plásmidos son introducidos dentro de E. coli y la expresión de la enzima deseada es dirigida por un método inducible apropiado tales como elevación de la temperatura y adición de IPTG al medio.

Las enzimas pueden ser recuperadas en una forma purificada por una modificación de los métodos descritos aquí. La ruptura de la célula se alcanza por homogenización, sonicación o el tratamiento enzimático que rompe la pared celular y libera componentes cistoplasmático. Si la síntesis de enzima resulta en agregación, el agregado puede ser disuelto por un agente desnaturalizante, 3 a 6 M de Guanidio - HCl o Urea 4 a 8 M y la proteína se refoldea por la eliminación del agente desnaturalizante a través de la diálisis o la dilución. La enzima refoldeada puede ser purificada usando los métodos cromatográficos descritos arriba.

Construcción de proteínas de fusión

Las proteínas de fusión incluyen enzimas degradantes glucosaminoglucano ligada a proteínas con las propiedades de unión específicas y pueden ser creadas por las técnicas recombinante de biología molecular. Seleccionando una proteína de unión apropiada, la actividad degradante de glucosaminoglucano puede ser dirigido a sitios específicos in vivo. Por ejemplo, epidérmico las líneas de enlace de factor de crecimiento que receptores de célula expresaron de forma preferencial aparentemente de células de músculo liso como se describe por Pickering, et al., Clin Invest de J, 91: 724-729, 1993. Proteínas de fusión contienen una mitad ligada a la proteína heparinasa directa, actividad degradante de heparina o sulfato de heparan a la superficie celular de músculo liso, disminuyendo su respuesta a citoquinas disponibles. Este tipo de proteína de fusión es valiosa para combatir estadíos de las enfermedades que resultan desde un sobrecrecimiento de células del músculo liso tales como las afecciones vasculares de aterosclerosis y la re-obstrucción de vasos siguientes angioplasticidad coronaria transluminal percutánea.

Las proteínas de fusión de Heparinasa creadas por ingeniería genética conservan la unión y las propiedades catalíticas de heparinasa y de la proteína a la que se une. Por ejemplo, el gen para heparinasa 1 fue aislado desde F. heparinum como fue descrito por Sasisekharan, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 3660-3664, 1993, y un sitio de restricción de EcoR1 fue insertado 5' al codon codificando el residuo glutamina - 21 por la reacción en cadena de polimerasa. Un fragmento que contiene el gen de heparinasa 1 fue preparado por la digestión con endonucleasa de restricción; EcoR1 y Bam H1, y ligado a Eco R1/Bam H1 cortando el plásmido pMALc2 (Biolabs de New England). El plámido resultante contiene un gen híbrido que codifica para una proteína de 62,000 - 85,000 que incluye la proteína unida a maltosa (MalB) fusionada en 5' al gen de heparinasa 1.

Este plámido fue insertado en células de Esherichia coli HB101 usando el método mediado de cloruro de calcio descrito por Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110-211. Estas células presentan actividad heparinasa bajo el control del promotor lac, permitiendo síntesis de la proteína de fusión por adición de 0.1 mM del agente inductor IPTG al medio de crecimiento.

Las células de HB101 (pMALc2 - HEP1Q21) fueron crecidas a una densidad celular de 1,0 g/L peso base seca en 500 ml, medio M9 que contiene 0,1 mM IPTG a 37ºC y concentrado por centrifugación, 10,000 g x 10 minutos. El pellet celular se resuspende en 10 ml de 0,025 M de Tris, pH 7,7, y las células rotas por sonicación usando un Modelo de Sistemas de Calor XL2020, 4,5 minutos, nivel 3 de energía, 30 segundos sobre 30 ciclos. El debris celular fue eliminado por la centrifugación, 10,000 g x 10 minutos, y el sobrenadante aplicado a una columna de resina de afinidad de amilosa (i.d. 1,0 x 2 cm, Biolabs New England). La proteína unida fue eluida con un gradiente de paso de 0,025 M de Tris contiene maltosa 0,01 M a pH de 7,5. La proteína de fusión eluida en un pico de proteína que muestra una actividad específica de 23,77 IU/mg.

La proteína de fusión unida heparinasa - maltosa también puede ser purificada por las técnica de separación de proteína estándar basadas en las propiedades de la heparinasa. Células Sonicadas fueron fraccionadas por la precipitación con sulfato de amonio. Proteínas no específicas fueron eliminadas con un paso de precipitación a sulfato de amonio de 1,7 M y el sobrenadante se precipitó subiendo la concentración de sulfato de amonio a 3,2 M. El material precipitado contiene la proteína de fusión y es resuspendida en 0,025 M de fosfato de sodio, pH de 6,5. El material fue aplicado a una columna de intercambio catiónico débil (i.d., 1,6 cm x 10 cm CBX, J.T. Baker) y se eluye con gradientes de paso secuenciales de 0,0 de cloruro de sodio, 0,01 M de cloruro de sodio, 0,25 M de cloruro de sodio y 1,0 M de cloruro de sodio, todas en 0,025 M de fosfato de sodio. La proteína de fusión eluida en la fracción de elución de 0,25M de cloruro de sodio y muestra una actividad específica de 29,95 IU/ml de heparinasa. Estos dos procedimientos de purificación demuestran que heparinasa funcional de las proteínas de fusión pueden estar hecho por conexión genética una proteína con las propiedades de unión deseadas al extremo N - terminal de la proteína de heparinasa y la proteína de fusión resultante conserva la funcionalidad tanto de la heparinasa como la proteína que es unida. Los ejemplos de otras moléculas apuntan que se unen específicamente a receptores tales como moléculas a la ECM incluyen fibronectina, laminina, tenascina, trombospondina, y colágenos.

Durante las dos décadas anteriores, los conocimientos de adherencia y migración celular en las matrices extracelular (ECMs) a nivel molecular han crecido rápidamente. Los esfuerzos tempranos en esta área de investigación se concentran en la proteína de adhesión promotora de ECM fibronectina (FN). Los análisis de secuencia por mapeo péptido de FN y el dominio de unión celular rinden una secuencia mínima que mantiene la actividad de unión celular en el tetrapéptido Arg - Gly - Asp - Ser (RGDS). La interacción biológica de la secuencia RGDS con receptores de superficie celular de fibronectina fue revelada demostrando que los péptidos que contienen RGDS sintéticos en solución pueden inhibir competitivamente las células de fibroblastos y se dispersan sobre sustratos cubiertos con fibronectina. Después de adherirse RGD a la célula se identifica el sitio de reconocimiento en fibronectina, las secuencias de otras proteínas con adherencia a la célula se examinan las señales afines. Las otras proteínas conocidas traen las secuencias de RGD funcionales que incluyen proteínas de adherencia a plaquetas, que fibronógeno y factor de von Willebrand, osteopontina, y laminina. Estos descubrimientos implican que RGD es una señal de adhesión celular ubicua. El uso de fibronectina como ligando de afinidad produce un receptor que es un heterodímero con una subunidad \alpha - 160 kD y una subunidad \beta - 140 kD. Experimentos similares de cromatografía de afinidad han producido receptores específicos heterodiméricos RGD - dirigidos por vitronectina y un receptor de plaqueta con afinidad por fibronógeno y fibronectina. Estos receptores de RGD, conocidos como lo integrinos, tienen como característica una estructura heterodimérica de receptores RGD - dirigidos, con \alpha - subunidades en el rango entre 140 y 160 kD y \beta - subunidades en el rango entre 90 y 140 kD. Integrinas son membranas que se extiende a lo largo de características de complejos de proteína heterodiméricos que constan de una \alpha - subunidad y una \beta - subunidad. Complejos de integrina que contienen subunidades \beta_{1} y \beta_{3} generalmente están involucrados en la adherencia celular a la matriz extracelular, mientras que las integrinas \beta_{2} están involucrados en la adherencia célula - célula.

Otras proteínas de unión pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que reconocen los marcadores celulares específicos, hormonas o otras moléculas que son unidas por receptores a la superficie celular. Un ejemplo de una hormona unida por ciertos tipos de célula es el estrógeno, que está comprometida en un mayor grado por cierto tipo de células cancerígenas. Otro ejemplo es melanina, que está también presente a altas concentraciones de células cancerígenas. Los anticuerpos para muchos marcadores de superficie celular específicos son conocidos.

Protección de proteínas in vivo

Los métodos para extender el tiempo de vida in vivo se conoce y usa con regularidad, especialmente en el caso de las enzimas. Ejemplos de los métodos adecuados que usando como anexo polietileno y la mitad del glicol de la proteína, inhiben el consumo por el sistema reticuloendotelio. Preparación y caracterización de proteínas "Peglidadas" son descritos por Lu, et al., Pept. Res. 6(3), 140-146, 1993; Delgado, et al., Critical Rev. Ther Drug Carrier Syst. 9(3-4), 249-304, 1992, las que son incluidas aquí.

Preparaciones de compuestos farmacéuticos

Las enzimas pueden ser administradas tópicamente, a nivel local o sistemáticamente. Administración local o tópica es preferida para mayor control. Las enzimas, a solas o en combinación, son mezcladas con un portador farmacéutico apropiado, luego administrado en una cantidad eficaz para causar el efecto deseado sobre las células tratadas que usa métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, para la aplicación tópica, por la aplicación directa al sitio, o para la aplicación local, por medio de inyección o catéter.

Como objetivo una concentración de dosis eficaz puede ser alcanzada por la preparación de enzimas blancos como se describe arriba, o por el uso de vehículos dirigidos, como un catéter o el sistema de entrega polimérico, se alcanza entrega controlada de la enzima en el sitio específico.

Preparación de geles de Heparinasa

Enzimas degradantes glucosaminoglucano pueden ser mezclada con una variedad de geles comunes, crema o ungüentos para facilitar su aplicación para el tratamiento de heridas dérmicas. Estos geles o ungüentos pueden ser administrados a solas o en un parche transdérmico o venda para facilitar la penetración de una cantidad eficaz de la enzima a las células que son son tratadas.

Administración de enzimas vía las matrices de liberación controlada o inyección

Las enzimas también pueden ser formuladas en un portador para su administración por inyección, por ejemplo, en un tampón acuoso ó salino, usando la metodología estándar, o encapsulado en una matriz polimérica.

La encapsulación de enzimas en formulaciones de liberación controlada es bien conocida; los materiales que incluyen no están limitado a los liposomas, a liposferas, a matrices poliméricas biodegradables, y vesículas. Estos encapsulados son micropartículas típicamente que tienen un diámetro de 60 nm a 100 micras, pero preferentemente menos de diez micras, y más preferentemente una micra o menos en diámetro.

Los proteosomas son preparados desde proteínas exterior de membranas de la bacteria Meningococcal y se ha reportado unir proteínas que contienen un amarre hidrofóbico por Lowell, et al., Science, 240: 800 (1988). Las proteínas proteosomas son altamente hidrofóbicos, reflejando su papel como proteínas de transmembranas y porinas. Cuando se aislan, sus interacciones hidrofóbicas proteína - proteína provocan la formación multimolecular natural, vesículos de 60 a 1000 nm de membranas o fragmentos de vesículos de membrana, que dependen de la fortaleza del detergente usado en su aislamiento. La enzima también puede ser encapsulada dentro de un proteoliposoma como se describe por Miller et al., J Exp. Med. 176: 1739-1744 (1992) y se incluye en referencia aquí, como se describe arriba con las referencias para proteosomas.

Por otra parte, la enzima puede ser encapsulada en vesículos de lípido tales como vesículos de lípido Novasome™ (Micro Vescular System Inc., Nashua, NH).

Otro portador es descrito en PCT US90/06590 por Nova Pharmaceuticals, las enseñanzas de que son incluidas aquí, lo que es referido como liposfera, que tiene un núcleo sólido y una coraza en la capa exterior formada por fosfolípidos.

El transportador podría ser también un sistema de liberación retardado polimérico. Los polímeros sintéticos biodegradables son particularmente efectivos para provocar la liberación controlada de enzimas. Microencapsulación ha sido aplicada a la inyección de fármacos microencapsulados que dan liberación controlada. Varios factores colaboran en la selección de un polímero especial para microencapsulación. La reproducibilidad de la síntesis de polímero y el proceso de microencapsulación, el coste de los materiales de microencapsulación y el proceso, el perfil toxicológico, los requisitos para cinética de lanzamiento variable y la compatibilidad fisicoquímica del polímero y los antígenos son todos factores que deben ser considerados. Los ejemplos de polímeros útiles son policarbonatos, poliesteres, poliuretanos, poliortoesteres y poliamidas, particularmente aquellos que son biodegradables.

Una selección frecuente de un transportador para fármacos son los poli (d, l -lactido - co - glucolido) (PLGA). Éste es un poliéster biodegradable que tiene una historia larga de uso médico en suturas erosionables, placas de hueso y otras prótesis temporales, donde no ha presentado ninguna toxicidad. Una gran variedad de fármacos incluyen péptidos y antígenos que han sido formulados en microcapsulas de PLGA. El proceso de microencapsulación de PLGA usa una separación de fase de una emulsión de agua - en - aceite. El compuesto de interés es preparado como una solución acuosa y el PLGA es disuelto en unos solventes apropiados orgánicos como cloruro de metileno y acetato de etilo. Estas dos soluciones inmiscibles son co-emulsionadas por agitación a alta velocidad. Un no solvente para el polímero es añadido, causando la precipitación del polímero alrededor de gotitas acuosas que forman microcapsulas en estado embrionario. Las microcapsulas son colectadas, y estabilizadas con una variedad de agentes (alcohol de polivinilo (PVA), gelatina, alginato, polivinilpirrolidona (PVP), celulosa de metilo) y el solvente eliminado por cualquier secado en vacío o extracción de solvente.

Los otros medios para la encapsulación incluyen secado por aerosol, la co-precipitación, y la extracción de solvente.

Enzimas también pueden ser aplicadas como películas o implantes, por ejemplo, cubrir un tejido fino donde el crecimiento esta inhibido.

Los ejemplos de materiales usados para la liberación controlada que son administrados como geles o películas que incluyen al agente que sera liberado Pluronics™ (BASF), copolímeros de óxido de polietileno y polipropilenglicol.

Medios para la administración

Las enzimas pueden ser administradas tópicamente, como se describe arriba, o por inyección. Típicamente, la inyección es llevada a cabo usando una jeringa o un catéter. La ventaja del catéter es que el material puede ser aplicado a superficies como el interior de vasos sanguíneos durante un procedimiento como angioplasti, donde el objetivo es impedir restinosis por inhibición de la proliferación anormal de células que sigue frecuentemente un procedimiento quirúrgico. Enzimas que también pueden ser administrados simultáneamente con la cirugía, para que se aumente la curación de la herida. Enzimas que también podían ser administrados durante la cirugía para acelerar la curación de la herida quirúrgica. Esto podía estar acompañado por la formulación de la enzima en un gel biocompatible o ungüento que sería aplicado directamente al sitio de la herida en la conclusión del procedimiento correctivo.

Enzimas degradantes glucosaminoglucano pueden ser aplicadas intra- dérmicamente para producir como respuesta una formación acelerada de nuevos vasos en regiones isquémicas. Mecánicamente, esto es alcanzado por el desplazamiento de los factores de crecimiento desde sus reservorios de almacenamiento extracelular donde son apropiados por proteoglucano de sulfato de heparan y por aumento de la movilidad de citoquinas y quimoatrayantes por el área de tejido afectada.

La presente invención será comprendida más adelante por referencia no limitados a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Preparación de composiciones de enzima tópicas

Una solución de 0,5 ml de 0,01 M de fosfato de sodio y 0,4 M cloruro de sodio y 200 IU de heparinasa 1, purificada como se describe aquí, fue mezclada con 9,5 ml de gel que contiene 1% de carboximetilcelulosa (Sigma) 40% de glicerina USP y agua Nanaopure™ o 9,5 ml de un gel basado en carbomero (carbomero™ 950 Keystone Laboratories).

Una parte de cada mezcla fue analizada por actividad de heparinasa usando el método espectrofotométrico descrito por Yang, et al., J Biol Chem. 260 (3): 1849-1857, 1985. Una modificación del sistema de ensayo placa de azarosa para el monitoreo de la degradación de heparina descrita por Zimmermann, et al. Appl Environ. Microbiol, 56 (11): 3593-3594, 1990, fue incluido para monitorear la desorción de heparinasa desde varios transportadores. Una solución que contiene 0,5% de heparina de sodio USP (Celsus Laboratories) y 1,0% agarosa purificada (Bio - Rad) en 0,25 M de acetato de sodio y 0,0025 M de acetato de calcio a pH; 7,0 \pm 0,5, fue mezclada a 95 - 100ºC, y se enfría a 45 - 60ºC, se vierte en porciones de 3 ml en cubetas desechables de 5 ml de plástico y se le permite solidificarse por enfriamiento a temperatura ambiente. Soluciones de heparinasa (0,5 ml, 20 IU/ml) y geles que contienen heparinasa (0,3 - 0,7 ml) que fueron aplicada a la parte superior de los geles de heparina/agarose y se incubaron a 37ºC por 1 h. Las formulaciones de heparinasa fueron apartadas, una sección transversal cilíndrica de los geles y se eliminó de una pipeta Pasteur y los cilindros se colocaron en una solución de 2% de sulfato de protamina (Sigma). Después de 4 - 12 h, una precipitación de heparina - protamina fue observado como una sustancia blanca opaca. La extensión de desorción de heparinasa fue determinada por la profundidad de la zona clara localizada en la parte superior de los geles cilíndricos extirpados.

Este experimento fue repetido en la formulación de carboximetil celulosa/glicerina que usaba cualquiera de condroitinasa AC 20 IU/ml o 20 IU/ml condroitinasa B como ingrediente activo y de sulfato de condroitina A o sufato de dermatan B como el reactivo de prueba. Los resultados son mostrados en el Tabla 3.

TABLA 3 Actividad Enzimática y desorción de heparinasa 1 desde las formulaciones de geles farmacéuticos

3

Ejemplo 2 Preparación de apósitos de heparinasa o condroitinasa

Las tres heparinasas bacterianas y dos condroitinasa, purificada como se describe aquí, fueron colocados en soluciones que contienen en 0,01 M fosfato de sodio, 0,2 M de cloruro de sodio, pH 7,0 y 35 IU/ml de enzima. Geles semi-sólido que contienen 4% óxido de polietileno (7,5 cm x 5 cm; x 0.3 cm) fueron colocado en contacto con 6 ml de la solución de enzima por 3 h, durante este tiempo más del 70% de la solución de enzima es absorbida en la matriz del gel.

Los geles que contienen la enzima fueron probados por biodisponibilidad (desorción) por la precipitación de protamina de geles de glucosaminoglucano - agarosa como se describe aquí. Parches que contienen enzimas fueron permitidos absorber a geles de agarosa - glucosaminoglucano durante 90 minutos a 37ºC antes de ser trasladados a un gel de agarosa fresco. El procedimiento fue repetido para un período total de 7,5 horas. Geles semi-sólido que contienen 4% óxido de polietileno (7,5 x 5 x 0,3 cm;) fue humedecido en 6 a 8 ml de heparinasa 1 a una concentración entre 35 y 60 IU/ml durante tres horas tiempo en el que fue absorbida la enzima en la matriz. Las matrices fueron aplicadas a geles de agarosa 1% que contienen 0,05% heparina e incubada a 37ºC. Geles que contienen enzima fueron transferidos a geles de agarosa frescos cada 90 minutos por un total de 7,5 horas. Después de la incubación los geles de agarosa se ponen en contacto con 2,0% de sulfato de protamina para precipitar glucosaminoglucano no fraccionados. La penetración de la enzima fue observada por medición de la profundidad de la zona clara en el gel de agarosa precipitado. Los resultados son ilustrados en la Figura 2.

Ejemplo 3 Liberación de la actividad promotora del crecimiento desde matriz extracelular

Enzimas degradantes de heparina de matriz Flavobacterial pueden ser desplazadas por sustancias que presentan actividad promotora del crecimiento desde las matrices extracelular. Células de endotelio primarias fueron aisladas desde tejido de córnea bovino y mantenidas en DMEM que contiene 5% y 10% de suero fetal de ternera. Células desde placas petri confluentes están diluidas 10 veces y crecidas en DMEM que contiene 10% suero fetal de ternera, 4% dextran y 5% suero ternera, en placas de 96 pocillos durante 12 a 14 días y fueron complementadas con FGF - 2 a una razón de 0,5 ng/ml - día. Las células de endotelio fueron eliminadas por el tratamiento con una solución que contiene 0,5% Triton y 0,02 M de hidróxido de sodio en tampón de fosfato salino durante 0,5 a 5, seguidos por tres lavados con tampón de fosfato salino. Este procedimiento produce placas cubiertas con una capa de matriz extracelular que es estable durante dos años cuando se almacena a 4ºC en tampón de fosfato salino.

Cantidades variables de enzimas degradantes de glucosaminoglucano, purificadas como se describir aquí, fueron añadidas a la matriz extracelular en 0,2 ml/pocillo que contienen 0,16% de suero fetal de ternera - DMEM. En contacto con enzimas degradantes de glucosaminoglucano se permite llevar a cabo durante 1 hora a 37ºC. Los sobrenadantes de estas mezclas de reacción de la matriz extracelular - enzima fueron examinadas por la actividad mitogénica determinada a la incorporación de ^{3}H-tiamidina por fibroblastos inactivos de balb/c 3T3 como se describe por Vlodavsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 2292-2296, 1987.

Las matrices extracelulares formadas in vitro de una línea de célula de endotelio primario fueron tratadas con cualquier heparinasa 1, 2 ó 3 a una concentración de 0,1 IU/ml, condroitinasa AC a una concentración de 1,0 IU/ml o condroitinasa B a una concentración de 0,5 IU/ml durante 60 minutos. Sobrenadantes de reacción fueron examinados por la presencia de la actividad mitogénica por el ensayo de incorporación de tiamidina. Los resultados son mostrados en la Figura 3.

Ejemplo 4 Enzima degradante de heparina y sulfato de heparan que también pueden ser usado para liberar la actividad promotora del crecimiento desde tejidos de animal intactos

Las córneas bovinas fueron cosechadas de vacas al momento del sacrificio. Cada córnea es cortada en pedazos en dos secciones iguales y cada sección colocada en 0,4 ml, DMEM. Heparinasa en 0,1 IU/ml fueron añadido a una de las secciones córneas e incubadas a 37ºC durante 20 minutos. La sección que resta de la misma córnea sirve de control. Una alícuota de 20 \mul desde cada reacción es transferida hasta placas de 96 pocillos que contienen fibroblastos 3T3 en estado de inanición en un volumen total de 200 \mul en DMEM que contienen 0,2% de suero fetal ternera. ^{3}H - tiamidina fue adicionado a cada pocillo y las células se incuban durante 48 horas a 37ºC.

Córneas bovinas que fueron cosechadas, se cortan en dos partes iguales y tratados con cualquiera heparinasa 1, 2 o 3 a una concentración de 0,1 IU/ml. Sobrenadantes de la reacción fueron examinados por presencia de actividad mitogénica por la incorporación de ^{3}H - tiamidina determinada por el método de Vlodavsky, et al. Los resultados son demostrados en Figura 4.

Ejemplo 5 Tratamiento de la matriz extracelular por Liasa Glucosaminoglucano

Enzimas degradantes de glucosaminoglucano modifican la matriz extracelular cortando los componentes de glucosaminoglucano y de proteoglucano de la matriz extracelular. La preparación de la matriz extracelular con ^{35}S - sulfato que contiene proteoglucano y la digestión siguiente de esta matriz radiomarcada con enzimas degradantes de glucosaminoglucano Flavobacterianos que permiten una valoración cuantitativa del efecto de la enzima. La matriz extracelular que contiene ^{35}S - sulfato fue producida por siembra en placas con células de endotelio de córneas bovinas primarias crecidas y concentradas en DMEM con 10% suero fetal de ternera y 5% suero de ternera diluido 10 veces en medio Fisher complementado con 10% suero fetal de ternera, 5% suero de ternera, 4% dextrana, y 25 \muCi/ml de Na_{2} ^{35}SO4 y cultivado durante 12 a 14 días con la adición de 0,5 ng/ml-día de FGF - 2. Las células de endotelio fueron eliminadas de la matriz extracelular radiomarcada por tratamiento con una solución que contiene Triton, 0,02 M de hidróxido de sodio en tampón de fosfato salino durante 0,5 a 5 minutos, seguido por tres lavados con tampón de 0,5% fosfato salino.

La matriz extracelular que contiene ^{35}S - sulfato en la parte de glucosaminoglucano fue tratada con tampón de fosfato ó heparinasa 1, 2 o 3, ó condroitinasa AC ó B a una concentración de 0,1 IU/ml en 1 ml/pocillo en placas que contienen tampón de fosfato salino, y la digestión se permite seguida por 0,5 h a 37ºC. La cantidad de glucosaminoglucano liberado fue determinado midiendo el sulfato radiomarcado liberado al sobrenadante con un contador de centelleo Packard 1600 TR. Un estimado aproximado de 80,000 cpm fue la cantidad total de sulfato radiomarcado contenido en cada reacción. Los resultados son mostrados en Figura 5.

La acción de las enzimas degradantes Flavobacterianas de heparina son sumamente rápida, y la generación de material marcado con ^{35}S - sulfato ocurre segundos después de su adición a la matriz extracelular radiomarcada como se describe arriba. Por contraste, una cantidad igual de heparinasa mamífera aislada desde placenta humana muestra un intervalo de atraso de 15 a 20 minutos después de la adición a la matriz radiomarcada, antes de que cualquier aumento medible fuera detectado en el material en el nivel ^{35}S - sulfato soluble marcado. Esta observación adicional diferencia las enzimas mamíferas y las bacterianas.

Mientras el tratamiento de la matriz extracelular con enzima degradante de glucosaminoglucano modifica el componente de glucosaminoglucano del proteoglucano de la matriz extracelular, la integridad estructural en conjunto de la matriz se queda igual como se ve por microscopio electrónico. Aunque estructuralmente intacta la matriz extracelular tratada enzimáticamente exhibe aumento de la permeabilidad a macromoléculas. Esta permeabilidad aumentada puede ser demostrada revisando la capacidad de la enzima degradante de glucosaminoglucano Flavobacteriana para facilitar la entrada de 25 bases de nucleótido hasta fragmentos de nucleótidos de 2 Kb cruzando una membrana de poro de 0,45 micra teraftalato de polietileno (PET) cubierto con la matriz extracelular. Células de endotelio de córneas bovinas primarias mantenidas como se describe arriba son diluidas 1:10 desde placas concentradas y sembradas en membrana PET de poro 0,45 micra de insertos de cultivo de tejido (Falcon) en DMEM complementado con 10% suero fetal de ternera, 5% suero de ternera, 4% dextrana, y cultivadas durante 12 a 14 días con la adición de FGF - 2 a razón de 0,5 ng/ml - día. Las células de endotelio son eliminadas como se describe arriba, y la matriz extracelular cubierta de PET, insertos tratada con cualquier heparinasa 1, 2, o 3 a una concentración de 0,1 IU/ml, condroitinasa AC o B a una concentración de 1 IU/ml en tampón fosfato salino a 37ºC durante 1 hora y lavada tres veces con tampón de fosfato salino.

La matriz extracelular tratada enzimáticamente cubierta con insertos PET, a lo largo con una matriz extracelular no tratada cubierta con inserto PET y un inserto no tratado con PET, son colocados en 12 placas de pocillos y se adicionan a cada pocillo 2 ml de tampón fosfato salino. Macromoléculas radiomarcadas se adicionan dentro de cada inserto PET, y una alícuotas de 100 ml tampón de fosfato salino en el pocillo alrededor del inserto PET toma después una incubación de 15 minutos a 37ºC. Alícuotas son ensayados por material que contiene ^{32}P - por centelleo en un contador de centelleo Packard 1600 TR.

Ejemplo 6 Tratamiento de la superficie celular con liasa glucosaminoglucano

Enzimas degradantes de glucosaminoglucano pueden atenuar la respuesta para los factores de crecimiento de una célula cortando el componente glucosaminoglucano de la superficie celular proteoglucano. Células vasculares de músculo liso son crecidas en placas de 96 pocillos en DMEM complementado con 10% suero fetal hasta concentrarse. Las células fueron tratadas por heparinasa 1, 2 o 3 o la condroitinasa AC a una concentración de 0,1 IU/ml durante 1 hora a 37ºC, luego enfriadas sobre hielo y lavada dos veces con un medio de incubación comprendido de 0,025 M HEPES, 0,002 M de Tris y 0.1% BSA en DMEM en pH de 7,5. Las células son resuspendidas en 0,25 ml de tampón de incubación que contiene 5 ng de ^{125}I - FGF - 2 (0,5 \muCi) e incubada a 4ºC durante 2 horas. La adsorción de FGF - 2 a la superficie celular de glucosaminoglucano fue determinado por lavado de las células con un tampón de elución que contiene 0,025 M de HEPES y 2 M de cloruro de sodio a pH de 7,4, y medición del ^{125}I recuperado con un contador gamma (Wallac, Model 1740).

Fibroblastos Balb/C de 3T3 fueron tratados con 0,1 IU/ml de heparinasa 1, 2 o 3, o la condroitinasa AC y expuesto a ^{125}I - FGF - 2. La cantidad de FGF - 2 adsorbido a la superficie celular del glucosaminoglucano fue determinado extrayendo la fracción unida al glucosaminoglucano en 0,025 M de HEPES, 2,0 M cloruro de sodio y mediciones de FGF - 2 usando un contador gamma y se expresa como un porcentaje del FGF - 2 unido a las células sin tratar. Los resultados son mostrados en Figura 6.

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Ejemplo 7

Control de la proliferación células de endotelio usando tratamiento de glucosaminoglucano

El tratamiento de enzima degradante de glucosaminoglucano de la superficie celular puede aumentar la unión al factor de crecimiento como en el caso de enzima degradante de condroitina, o inhibir la unión de factor de crecimiento como en el caso de enzimas degradantes de heparina y sulfato de heparan. La eliminación de sulfato de heparan de la superficie celular puede ser compensada por fragmentos de heparina o sulfato de heparan liberados desde la matriz extracelular por tratamiento enzimático.

Células vasculares de músculo liso tratadas fueron expuestas a 0,1 IU/ml de heparinasa 2 a 37ºC durante 20 minutos. La matriz tratada fue expuesta a 0,1 IU/ml heparinasa 2 a 37ºC durante 20 minutos. Después del tratamiento enzimático, las células fueron lavadas con 0,1 ml de PBS y expuesta a 50 ml sobrenadante de matriz.

^{3}H - tiamidina fue incluido en la incubación y la proliferación determinada como se describe por Vlodavsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 2292-6 (1987), Trends Biochem. Sci. 16: 268-271 (1991). La proliferación de células vasculares de músculo liso se monitorea por el ensayo de incorporación de tiamidina y se expresa como una proporción de las células expuestas al material liberado de una enzima a las matrices sin tratar a) células de ECM sin tratar, b) ECM tratada con heparinasa 2, sin tratar, y c) ECM tratada con heparinasa 2, células sin tratar. Los resultados son mostrados en Figura 7.

Los resultados muestran que si uno separa la matriz celular de la superficie celular, uno golpeará el receptor por tratamiento de la superficie y libera la actividad promotora del crecimiento tratando la matriz, y esto si uno trata la matriz y la superficie celular, la promoción del crecimiento se observa desde la matriz y libera el factor de crecimiento que se compensa por la pérdida de heparina unida al receptor.

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Ejemplo 8

Evaluación de la administración local de heparinasa para aumentar revascularización

Un modelo isquémico de amputación de un miembro inferior en conejo descrito por Pu, et al., Circulation 88 de: 208-215, 1993, fue usado para valorar la efectividad de restituir vascularización con heparinasa 1. Tres grupos de tratamientos fueron estudiados (n = 4). Los conejos en cada grupo reciben cualquier control salino, FGF - 2 a 100 mg - día^{-1}, o heparinasa 1 a 100 IU - día^{-1}. La isquemia fue producida quirúrgicamente en el miembro trasero izquierdo y los compuestos fueron administrados durante 10 días a partir del onceno día siguiente de la cirugía. Velocidades de vascularización fueron monitoreadas midiendo la presión sanguínea en ambos miembros con un flujómetro Doppler y calculada la proporción del flujo de sangre en el miembro isquémico para control (miembro sin tratar).

Heparinasa 1 y FGF - 2 aceleraron ambos el aumento de la proporción de presión sanguínea tanto como la extensión de la proporción de la presión sanguínea alcanzada 30 días después del tratamiento. A 40 días post - operatorio, angiogramas fueron ejecutados para determinar la formación de nuevos vasos. Los resultados son mostrados en el Tabla 4.

TABLA 4 Tratamiento de isquemia de amputación de un miembro inferior

4

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Los datos indican la utilidad potencial de composiciones que contienen uno o una combinación de enzima degradante glucosaminoglucano derivado de Flavobacterium heparinum para acelerar la reparación de tejido en seres humanos.

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Ejemplo 9

Liberar actividad promotora del crecimiento desde la matriz extracelular

Matrices extracelular (ECM), preparadas como se describe en Ejemplo 3, fueron tratados con cualquier heparinasa 1, 2, o 3 a una concentración de 0,1 IU/ml o condroitinasa AC a una concentración de 1,0 IU/ml, durante 10 minutos a 37ºC. Muestras control sin tratar fueron tratadas con una solución control que no contenía la enzima. Un volumen de 0,01 ml de cada sobrenadante de reacción fue ensayado por presencia de actividad mitogénica por la transferencia de fibroblastos inactivos balb/C 3T3 usando el ensayo de proliferación descrito en Ejemplo 7. Los resultados son presentados en la Figura 8.

Cada uno de los tratamientos probados, heparinasa 1, 2, 3, o condroitinasa, AC, material soluble liberado desde el ECM que estimula la proliferación de fibroblastos de arriba al nivel obtenido con ECM sin tratar.

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Ejemplo 10

Tratamiento de la superficie celular y matriz extracelular con heparinasa

Heparinasa administrado a una herida in vivo actuará no sólo sobre la matriz extracelular sino también sobre los glucosaminoglucano de la superficie celular de las células que participan en el proceso de curación de la herida. Para hacer modelar este efecto in vitro fibroblastos inactivos de balb/C 3T3 fueron tratados con heparinasa 3 de la misma manera como la matriz extracelular antes de recibir el sobrenadante de la reacción de la matriz extracelular. Tantos las matrices extracelular como fibroblastos inactivos de de balb/C 3T3 fueron tratados con heparinasa 3 a una concentración de 0,1 IU/ml durante 10 minutos a 37ºC, después de la cual el tiempo de la enzima que contiene sobrenadante fue eliminada de las células y reemplazada con DMEM que contiene 0.2% suero fetal de ternera. Luego de este tratamiento, la proliferación de fibroblastos de 3T3 fue determinado por monitoreo de incorporación de ^{3}H - tiamidina de. Los resultados son presentados en Figura 9.

Las respuestas de proliferación mayores fueron vistas cuando los fibroblastos fueron tratados con enzima antes de recibir la ECM tratada. Los resultados respaldan el uso de heparinasa 3 en el sitio de herida para estimular la curación de herida.

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Ejemplo 11

Liberar Heparinasa mediada de actividad promotora del crecimiento desde tejidos de animal intactos

Las córneas bovinas fueron cosechadas desde vacas al momento del sacrificio tratadas con varias concentraciones de heparinasa 3. Usando 3 córneas bovinas para cada concentración, las córneas fueron colocadas en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos estériles de forma que solamente la membrana interior (Descemet's) fue expuesta, y 0,2 ml de tampón de fosfato salino añadido a cada córnea. Heparinasa 3 fue añadido a una concentración final de 0,01, 0,1 o 1,0 IU/ml, y la digestión permite proceder por 5 minutos a 37ºC. Un control de las 3 córneas no recibe ninguna enzima. Alícuotas de sobrenadante de reacción 0,045 ml fue trasferida luego de cada córnea a fibroblastos inactivos de balb/c 3T3. La proliferación de los fibroblastos fue determinada usando el ensayo de la proliferación descrita en Ejemplo 7. Los resultados son presentados en Figura 10.

Las tres concentraciones de heparinasa 3 provocan liberación de los compuestos que estimulan proliferación de la córnea bovina, con el efecto mayor resulta del tratamiento con 0,1 IU heparinasa 3/ml.

Ejemplo 12 Liberar heparinasa mediada de bFGF desde células y matriz Extracelular in vitro

Para determinar la efectividad relativa de heparinasa 1, 2, y 3 de liberar factores de crecimiento unido a heparina desde tejidos y matrices extracelulares, sobrenadantes de heparinasa 1, 2, o 3 células digeridas o la matriz fueron ensayadas por la presencia de bFGF. Células de endotelio bovino concentradas y del músculo liso mantenida en placas de 10 cm de cultivo de tejido y fueron incubados 1 hora a 37ºC en 2 ml de tampón fosfato salino conteniendo 0,1 IU/ml de heparinasa 1, 2, o 3. La matriz extracelular, preparada como se describe en Ejemplo 3, fue tratada de forma idéntica. Alícuotas fueron retiradas para determinación de la concentración de bFGF usando el ELISA Quantikine™ (R&D system) para bFGF humano. Los resultados son presentados en la Figura 11.

Heparinasa 3 causó la mayor cantidad de bFGF liberado de los tres tipos de células, seguida por heparinasa 2, y luego heparinasa 1. Liberar la ECM más bFGF que las células de endotelio bovinas y las células de músculo liso bovinas con las tres enzimas evaluadas.

Ejemplo 13 Liberar Heparinasa mediada de bFGF desde células y matriz extracelular in vitro

Células del músculo liso aorta bovinos (pasajes 1-8) son crecidas cercano a la confluencia en DMEM (glucosa alta - DMHG) complementada con 10% suero fetal y 100 unidades/ml de penicilina/estreptomicina, en placas de 96 pocillos, a 37ºC, en un ambiente de 7,5% CO_{2}. Las células fueron privadas por 3,5 a 4 días cambiando el medio de crecimiento por DMHG y 2% BSA. Después del período de hambre, las células fueron tratadas con una solución de DMHG y 0,5% de BSA que contienen heparinasa, 1, 2 o 3, en 0,1 o 0,5 IU/ml, a 37ºC, durante 10 minutos. La solución de enzima fue eliminada y los pocillos fueron lavados tres veces con tampón fosfato salino con calcio y magnesio, (PBS + Ca + Mg). 180 \mul de DMHG 0,5% BSA y 1,1 \muCi/ml ^{3}H - tiamidina fue añadido a cada uno de los pocillos. Además, 20 \mul de 20 ng/ml de bFGF en DMHG y 0,5% BSA fue añadido a los pocillos inducidos, y 20 \mul de DMHG y 0,5% BSA fue añadido a los pocillos del control. Las células fueron incubadas durante 48 horas, como se describe arriba. Después de 48 horas, el medio fue eliminado y los pocillos fueron lavados una vez con PBS + Ca + Mg, una vez con 200 \mul de metanol 100%, dos veces con 5% TCA, y dos veces con agua. Después de estos pasos de lavado, 100 ul de 0,2 N de NaOH fue añadida a cada pocillo. Después de 5 minutos a temperatura ambiente, los contenidos de los pocillos fueron añadidos a los viales que contienen centelleo y la cantidad de incorporar ^{3}H fue medida. Los resultados de dos experimentos separados fueron determinados el promedio y se muestran en la Figura 12.

Ejemplo 14 Activación del receptor FGF básico por fragmentos de degradación de sulfato heparan liberado desde células y matriz extracelular Materiales y métodos

El bFGF recombinante humano fue proporcionado por Takeda Chemical Industries (Osaka, Japón). Sepharose™ 6B es de Pharmacia (Uppsala, Suecia). Heparina de sodio desde mucosa intestinal porcina (heparina - PM - el Mr. 14,000 anti-FXa 165 IU/mg) fue obtenida de Industries Hepar (Franklin, Ohio). Bacteria (Flavobacterium heparinum) heparinasa I (EC 4.2.2.7), 2 y 3 fue producida por IBEX Technologies, (Montreal, Canadá). Sulfato de heparan que degrada endoglucosidasa (heparanasa) fue purificada de placenta humana. La purificación de enzima involucró la precipitación de sulfato de amonio y cromatografías secuenciales sobre carboximetil Sepharosa, Sepharosa de heparina y Sepharosa Con A.

Células. Células de músculo liso (SMC) fueron aislados desde el medio de aórtico bovinos como se describe por Castellot, J.J., et al., J. Cell Biol. 102, 1979-1984 (1986); Schmidt, A, et al., J. Biol. Chem. 267, 19242-19247 (1992). Brevemente, el segmento abdominal de la aorta fue eliminada y la imposta limpiada bajo un corte en pedazo al microscopio. La aorta se corta longitudinalmente, y pequeñas piezas del medio fueron cuidadosamente desvestido de la pared del vaso. Dos o tres de tales tiras con las dimensiones medias de 2 a 3 mm fueron colocadas en placas de cultivo de tejido de 100 mm que contienen DMEM (4,5 g glucosa/litro) complementadas con 10% FCS, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml estreptomicina. Dentro de 7-14 días grandes parches de células multicapas migran desde los explantes. Aproximadamente 1 semana después, las células son subcultivadas sobre placas de cultivo de tejidos de 100 mm (4-6 x 10^{5} células/placa). Los cultivos (pasillo 38) presentan las típicas características morfológicas SMC vascular y las células fueron específicamente teñidas con los anticuerpos monoclonales que reconocen la forma muscular de actina (HS - 35). Este anticuerpo no reconoce células de endotelio o fibroblastos.

Los cultivos de células de endotelio córneas bovinas fueron establecidas de ojos de novillos como se describe por Gospodarowicz, D, et al., Exp. Eye Res. 25, 75-89 (1977). Cultivo stock fueron mantenidos en DMEM (1 g - glucosa/litro) suplementado por 10% de suero ternera recién nacido, 5% FCS, 50 U/ml penicilina, y 50 mg/ml estreptomicina a 37ºC en 10% CO_{2} incubadoras humedecidos. Células de endotelio aórticas bovinas fueron clonadas y cultivadas como esta descrito por Gospodarowicz, D, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 4120-4124 (1976). El bFGF recombinante (1 ng/ml) fue añadido cada día, hasta que las células están casi concentradas. Clon F32 de células BaF3 (Ornitz, D.M., et al., Mol. Cell Biol. 12, 240-247 (1992)) es suministrada por Dr. D Ornitz (Departamento de Biología molecular, Washington University en St. Louis). Las células fueron crecidas en medio RPM1 1640 complementado con 10% suero de ternera nacido, medio condicionado de 10% interleuquina - 3 producida por células de X63 - lL3, L - glutamina y antibióticos. Células F32 fueron obtenidas luego de la transferencia de células BAF3 con vector de expresión Mo/mFR1/SV y selección de medio que contiene bFGF mas heparina, produciendo colonias que expresan el mRNA de receptor de FGF de ratón 1 (mFR1) como describe Ornitz, D.M., et al.., Mol. Cell Bio. 12, 240-247 (1992).

Proliferación celular. Células F32 fueron lavadas dos veces con medio RPM1 1640. Células (2x10^{4}/pocillo/0,2 ml) fueron plaqueadas en placas de microtitulación de 96 pocillos en ausencia y presencia de 5 ng/ml de bFGF y concentraciones crecientes de fragmentos de degradación de HS librado desde células y ECM por heparinasa 1, 2 o 3. 48 horas después, 1 \muCi de ^{3}H - tiamidina fue añadida por pocillos, las células fueron incubadas por otras 6 h y luego colectadas con cosechador de célula PHD™. La incorporación de Tiamidina fue determinada por conteo líquido de centelleo.

Preparación de placas cubiertas con ECM. Células de endotelio de córneas bovinas fueron disociadas desde cultivos stock (dos a cinco pases) con STV y plaqueadas en placas de 4 pocillo a una densidad inicial de células de 2 x 10^{5}/ml. Células fueron mantenidas como se describe arriba excepto que 5% dextrana T - 40 fue incluida en el medio de crecimiento y las células fueron mantenidas sin la adición de bFGF durante 12 días. La ECM de subendotelio fue expuesta a disolución por 5 minutos a temperatura ambiente de la capa celular con PBS que contiene 0,5% Triton X - 100 y 20 mM NH_{4}OH en PBS. La ECM que queda intacta, libre de debris celular y firmemente anexada al área entera de la placa de cultivo de tejido. Para preparación de la ECM marcada con sulfato de células de endotelio de córneas fueron plaqueadas en placas de 4 pocillos y cultivadas como se describe arriba. Na_{2} [^{35}S] O_{4} (540-590 \muCi/mmol) fue añadido (40 \muCi/ml) un día y 5 días después de sembradas con el marcaje y los cultivos fueron incubados sin el cambio del medio. Diez a doce días después de sembradas, la monocapa celular fue disuelto y la ECM expuesta, como se describe arriba. La degradación de la ECM marcada con sulfato por heparinasa bacterianas fue determinada como se describe. Ishai - Michaeli, R, et al., Cell Reg. 1, 833-842 (1990); Bar - Ner, M. et al., Blood 70, 551-557 (1987); Vlodavsky, I, et al., Cáncer Res. 43, 2704-2711 (1983). Brevemente, la ECM fue incubada por 24 h, a 37ºC, pH de 6,2, con heparinasa 1, 2 o 3 y el material sulfato marcado liberado en el medio de incubación fue analizado por filtración de gel con una columna de Sepharosa 6B. Proteoglucano de Sulfato heparan intactos (HSPG) fueron eluidos después del volumen vacío (Kav < 0,2) y fragmentos de degradación de HS eluido con 0.5 < Kav < 0.8.

Resultados

Degradación de ECM marcado sulfato y el liberación de actividad mitogénica de ECM unida por heparinasa 1,2 y 3. La degradación de HS en la ECM fue estudiada incubando por 1 h a 37ºC heparinasa 1, 2 o 3 (0,1 U/ml) con la ECM marcada sulfato metabólicamente producida por células endotelios de córneas y bovinas cultivadas. Productos de degradación sulfato marcada liberan al medio de incubación y fueron analizado por filtración de gel Sepharosa™ 6B. Mientras HSPG intacta es eluida junto a el volumen vacío de la columna, cadenas laterales de fragmentos de degradación marcada HS fueron eluida más hacia el volumen Vt de la columna (0,5 < Kav < 0,8). Como se demuestra en la Figura 13A, la incubación de la ECM con cada enzima bacteriana da como resultado el liberar productos de degradación sulfato marcada bajo Mr (pico 11, fracciones 20-30). La naturaleza de HS de estos fragmentos fue verificada por su susceptibilidad para deaminación con ácido nitroso y resistencia posterior a la deaminación con papaina o condroitinasa ABC. Las tres enzimas producen patrones de elución diferentes reflejando diferentes tamaños de fragmentos de degradación. Heparinasa 1 produce una amplia distribución de fragmentos (0,4 < Kav < 0,6) con un promedio MW más alto que los fragmentos liberados por heparinasa 3 (Kav - 0,65) y heparinasa 2 (Kav - 0,8) (Figura 13). Heparinasa 2 degrada ECM HS a fragmentos pequeños que contienen tan poco como 2-6 unidades de azúcar emigrando cerca del Vt de la columna.

El material liberado desde la ECM por heparinasa 1, 2 y 3 fue añadido a fibroblastos 3T3 y probados por su capacidad de estimular la síntesis de ADN en estas células. Como se demuestra en la Figura 13B, el material liberado de ECM por heparinasa 2 y, extiende algo así baja, por heparinasa3, fue altamente mitogénica para fibroblastos 3T3 comparado con lo que se libera bajo las mismas condiciones por heparinasa1. De hecho, la actividad mitogénica liberada por heparinasa 1 es solo ligeramente más alta que la liberada durante la incubación ECM con PBS. La liberación espontánea de ambos HSPG y la actividad mitogénica de ECM incubado con PBS a solas se atribuye a enzimas proteolíticas como activador de plasminógeno de tejido (tPA), uroquinasa, y gelatinasa A, residiendo en la ECM. Heparinasa 1, 2 y 3 esta carente de cualquier actividad mitogénica como indicada por la falta de la actividad promotora del crecimiento cuando las enzimas fueron incubadas sobre placas de cultivo de tejido regulares en vez de ECM.

La diferencia en la actividad mitogénica liberada desde ECM por heparinasa 1, 2 y 3 no era debido a una diferencia en su capacidad de degradar el sustrato ECM hasta más grande del 90% del material ECM marcado sulfato fue liberado por cada una de las enzimas menores del 10% de la radiactividad remanente relacionada con ECM, como es mostrado por Figura13C. De forma semejante, cada uno de las tres enzimas liberadas mayores del 90% de ^{125}I - bFGF que estaba primero unida a ECM. Además, una incubación simultánea de ECM marcada sulfato con heparinasa 1 y 3, o adiciones secuenciales de una segunda dosis de la mismo u otra enzima producida solamente un aumento leve (menor que 15%) en la cantidad de fragmentos de degradación de HS y actividad mitogénica.

Actividad que promociona crecimiento de fragmentos HS liberados de células y ECM por heparinasa 1, 2 y 3

Unas citoquinas dependiente de célula linfoide creada por ingeniería para expresar el receptor 1 de FGF de ratón (Ornitz, D.M., et al., Mol. Cell Biol. 12, 240-247 (1992)) fue aplicada a las células para investigar si los fragmentos de degradación de HS liberados desde células y ECM por heparinasa 1, 2 & 3 y pueden reemplazar la necesidad por heparina o sulfato de heparan en facilitar mitogénesis bFGF inducidas en este sistema celular. Ha sido previamente demostrado que las células de BaF_{3} transfectada para expresar mFR1 demuestran una respuesta dependiente a la dosis para bFGF con un requerimiento total para heparina. Las células F32 en estos experimentos fueron incubadas con bFGF recombinante en exceso (5 ng/ml) es decir cualquier efecto promotor del crecimiento inducido por productos de degradación de la ECM podría ser atribuido a fragmentos de sulfato de heparan más bien que a la cantidad relativamente insignificante (menor que 0,5 ng/ml) de la ECM unido a bFGF liberado bajo las mismas condiciones. Endotelio vascular y células de músculo liso (EC y SMC, respectivamente) tanto como la ECM subendotelio intacto fueron incubadas (1 h, 37ºC) con 0,1 U/ml de heparinasa 1, 2 o 3. Las cantidades crecientes de medios de incubación fueron añadidos a células F32 y luego en presencia de 5 ng/ml de bFGF. Cuarenta y ocho horas después, ^{3}H - tiamidina fue añadido por 6 h, seguido por cosecha celular y medición de la incorporación de ^{3}H -
tiamidina.

Pretratamiento de endotelio vascular y células de músculo liso con heparinasa 3 resultaron en liberarse de fragmentos de degradación de HS. Por contraste, los fragmentos liberados por heparinasa 1 o 2 no tenía o efecto muy pequeño, respectivamente, como se indica por Figura 14. Estudios similares se llevan a cabo con ECM poco revelado o no estimulación de proliferación celular mediada por bFGF por fragmentos liberados por heparinasa 1, 2 o 3, encima la incorporación ^{3}H - tiamidina obtenida en presencia de bFGF y cada una de las enzimas bacterianas
sola.

En la ejecución de estos experimentos control, un estímulo leve de la proliferación celular de F32 inducida solo por heparinasa 3, pero no heparinasa 1 o 2, en placas de cultivo de tejido regulares fueron observados en la ausencia de células o la ECM. Como se demuestra en la Figura 15, esta estimulación es 3-4 veces más bajo que los inducidos por medio tomados desde heparinasa 3 SMC tratada vascular. Diferente el efecto de heparina mostrada en Figura 14A y la superficie celular derivada de fragmentos de degradación HS, el efecto de heparinasa 3 fue abolido por la inactivación por calor durante 10 minutos a 95ºC antes de su adición a las células linfoide F32 (Figura 14B) y sin considerar si la enzima heparinasa 3 fue incubada en cultivo de tejido regular plástico o ECM. Este resultado indica que la enzima debe estar activa y/o conservar su configuración nativa para inducir una respuesta mitogénica. En un intento de dilucidar ya sea que la enzima heparinasa 3 está liberando fragmentos como HS desde la superficie celular de F32, células F32 fueron tratadas primero con heparinasa 3 (30 minutos, 0,1 U/ml, 37ºC) y el sobrenadante con o sin la inactivación de calor probadas por el efecto estimulatorio sobre células linfoide F32 frescas, sin tratar. Otra vez, incorporando ^{3}H - tiamidina fue estimulado por heparinasa 3, sin considerar que la enzima fue incubada primero con células F32, y su estímulo fue abolido por la inactivación de calor. En los otros experimentos, la enzima heparinasa 3 fue aplicada en DEAE celulosa para eliminar las trazas de heparina que pueden haber contaminado la enzima. Como se demuestra en Figura 14B, este tratamiento no tenía ningún efecto en la actividad estimulatoria de heparinasa 3, pero abolió el efecto de heparina usual (Figura 14A) totalmente. En general, estos experimentos de control indican que la enzima de heparinasa 3 originaria misma es capaz de la unión de receptor de bFGF estimulante y activación en el sistema de célula de F32.

Liberación de ECM y superficie celular atada a bFGF

Como se demuestra en la Figura13B, la exposición de ECM a heparinasa 2 y 3 y en menor grado a heparinasa 1, resulta en que se libera la actividad promotora del crecimiento hacia fibroblastos 3T3. Las cantidades reales de bFGF liberado de las células y ECM heparinasa 1, 2 y 3 fueron determinadas por un ensayo inmunológico (R&D Quantikine™ bFGF humano). Como se muestra en la Tabla 5, la cantidad de bFGF liberada de ECM por heparinasa 3 es aproximadamente 2,5 y 15 veces mayor que el liberado por heparinasa 1, 2 respectivamente, en correlación con la actividad mitogénica ejercida por el medio de incubación respectivo (Figura 13B). La cantidad de bFGF unido a ECM propenso a liberar por heparinasa 3 y fue 6-7 veces mayor que el disponible sobre la superficie del endotelio vascular y células de músculo liso (Tabla 5). Las cantidades de bFGF liberado desde EC vascular por heparinasa 1 y 2 mayores que aquellos que se liberaron desde SMC vascular.

La capacidad de las tres enzimas degradantes de heparina/HS bacterianas tanto de liberar ambos desde las células y desde la ECM como de liberar bFGF unido a HS y fragmentos de degradación de HS que promocionan la actividad mitogénica de bFGF ha sido comparada. Mediciones reales de bFGF liberado y estimulación de incorporación de ^{3}H - tiamidina en el crecimiento detenido de fibroblastos 3T3 y en en las células linfoide F32 deficientes HS, claramente indica que heparinasa 3 fue la enzima más activa promocionando el crecimiento. La superioridad de heparinasa 3 fue demostrada mejor en el sistema de célula de F32. En este sistema los fragmentos de degradación de HS son evaluados por su capacidad de unir y presentar bFGF a su receptor de alta afinidad de tirosina quinasa, resultando en la activación del receptor y la proliferación celular. Fue descubierto que fragmentos de HS liberados de la superficie celular por heparinasa 3, pero no heparinasa 1 o 2, fueron capaces de servir como receptores accesorios participando en un mecanismo de receptor doble característico del bFGF y otros miembros de heparina que unidos a la familia de factores que promocionan el crecimiento. En contraposición poco o nada de tal actividad fue asociada con fragmentos HS liberado por heparinasa 3 desde el ECM de subendotelio. Este resultado prueba que las observaciones previas indican que mientras HS en la ECM proporciona un depósito de almacenamiento algo inerte para bFGF en las inmediaciones de las células sensibles, HS sobre la superficie celular puede tener un papel más activo en el desplazamiento real unido a bFGF y su presentación siguiente para sitios de receptores de la superficie celular de alta afinidad (Bernfield, M., et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 638, 182-194 (1991)).

Estos estudios demuestran la ventaja de aplicar heparinasa 3 comparado con la heparinasa 1 y 2 soltada i) la cantidad mayor de bFGF unido a ECM, y ii) fragmentos de degradación de HS capaces de promover la unión al receptor de bFGF y la activación en células deficientes de HS. Sorprendentemente, experimentos de control que aplicaban cada una de las enzimas bacterianas solas revelan que heparinasa 3 mismo estimulando el crecimiento de la actividad promotora de bFGF en el sistema de célula F32. A diferencia del efecto de heparina y fragmentos de degradación de HS, este estímulo fue abolido luego de la desactivación por calor y no fue eliminado por DEAE celulosa, indicando inducción preferentemente por la proteína de heparinasa 3 entonces por moléculas como heparina que pueden ser asociadas con la preparación de heparinasa 3.

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Ejemplo 15

Curación de heridas en modelos de ratas normales y lisiadas

La efectividad de heparinasa 3 de estimular la curación de herida in vivo fue evaluada usando un modelo inmune de rata lisiada, Mustoe, et al., Science 237: 1333-1326 (1987). Ratas Sprague - Dawley estaban heridas haciendo una incisión lineal de 5,0 cm; sobre el grosor completo de la piel dorsal. 0,2 ml de vehículo o agentes de prueba fueron aplicados al sitio de la herida y la herida fue cerrada con cuatro (4) suturas de seda 3-0 a intervalos de 1 cm. Un collar Elizabethan fue colocado sobre las ratas aproximadamente 5 a 6 horas posterior a la herida durante los 5 a 7 días siguientes de la recuperación.

Gel carboximetilcelulosa (Carbopol) fue usado como vehículo. Heparinasa 3 fue añadido al vehículo como se describe arriba. La Tabla 5 proporciona el régimen de tratamiento usado para cada grupo de prueba.

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5

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N, modelo normal; I, modelo deteriorado (30 mg/kg metilprednisolona, Depo-Medrol^{R}; L, herida lateral izquierda; R, herida lateral derecho. *, tres aplicaciones (Día 1, Día 2 y Día 3); **, Siete aplicaciones (Día 0 hasta el día 6)

La curación de la herida fue valorada sobre la base de coaptación de los labios de la herida y sobre los aspectos físicos de la herida. Para la coaptación, 3 puntos/sección fueron dados para labios combinados, para coaptación inferior o igual a 2 mm 2 puntos/sección, y 1 un punto/sección para coapción igual o superior a 2 mm. Los aspectos físicos de la herida marcando puntos, 5 puntos/sección fue dado para la curación aparente y/o la desaparición de la postilla, 4 puntos/sección para la postilla seca, 3 puntos/sección para la postilla fresca, 2 punto/sección para herida húmeda y 1 punto/sección para la herida fresca. La evaluación de la herida fue notada todos los días desde el día 1 al día del sacrificio.

La curación fue valorada adicional sobre la base fuerza de tensión de la herida. Después del sacrificio, secciones de la piel que contienen el sitio de herida fueron eliminados desde los animales de prueba. Fuerza de tensión de la herida fue medido usando unos tensómetro de 55 MN mini Merlin™.

Una inyección intramuscular sola de metilprednisolona (30 mg/kg), dos días antes de la herida, resultó en una reducción (59%) importante de los procesos de curación de la herida como mediciones de la fuerza de tensión de las secciones de piel del grupo deteriorado (Grupo 2: lado izquierdo: 0,735 \pm 0.351 g/mm^{2}, lado derecho: 0,919 \pm 0,368 g/mm^{2}) comparado por grupo normal (Grupo 1: lado izquierdo: 2.007 \pm 0,888 g/mm^{2} lado derecho: 1,989 \pm 0,562 g/mm^{2}) (p = 0,0001) como se muestra en la Figura 16.

En el modelo de rata normal, una sola aplicación de heparinasa 3 sobre el día 0 (Grupo 3: lado derecho: 1,968 \pm 0,748 g/mm^{2}) no resultó en una mejora significativa de la media en las mediciones de resistencia de tensión de la herida comparado con una aplicación de una sola dosis de vehículo (Grupo 3: lado izquierdo 1,826 \pm 0,804 g/mm^{2}). En el modelo de rata lisiada, tratado con metilpredinisolona, una aplicación sola de vehículo en el día 0 (Grupo 4: lado izquierdo 0,774 \pm 0,265 g/mm^{2}) muestra una medición de resistencia de tensión de la herida de 40% en comparación con las ratas normales (1,941 \pm 0,752 g/mm^{2}, media de todas las mediciones de resistencia de tensión normal de la herida: lados izquierdos y derechos del Grupo 1 y lado izquierdo del Grupo 3). Una sola aplicación de heparinasa 3 sobre el día 0 (Grupo 4: lado derecho: 1,253 \pm 0,623 g/mm^{2}) muestra una medición de resistencia de tensión de la herida de 65% en comparación con las ratas normales.

En el modelo de rata deteriorado, tres aplicaciones del vehículo sobre días consecutivos (Grupo 5: lado izquierdo 0,682 \pm 0,301g/mm^{2}) resultando en una media de la medición de resistencia de tensión de la herida de 35% relativo de las ratas normales comparado con el 68% para tres aplicaciones de heparinasa 3 (Grupo 5: lado derecho 1,322 \pm 0,543 g/mm^{2}). En el modelo de rata lisiada, las siete aplicaciones de vehículo (Grupo 6: lado izquierdo 0,850 \pm 0,81 2) resultando en una medición de resistencia de tensión de la herida de 44% relativa con las ratas normales comparado con 62% para las siete aplicaciones de heparinasa 3 (Grupo 6: lado derecho: 1,206 \pm 0,655 g/mm^{2}).

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Ejemplo 16

Comparación de Heparinasa 3 y dosis - respuesta de Heparinasa 3 purificada en la curación de heridas en modelos de ratas normales y glucocortoideo inducidas

El estudio descrito en Ejemplo 15 fue repetido usando diferentes lotes de enzima de heparinasa 3 (lote hep3. 00123) a las concentraciones de 0,02, 0,2, ó 2,0 IU/herida. Además, PBS fue usado como vehículo en lugar del gel carboximetilcelulosa vehículo usado en Ejemplo 15. El tratamiento proporciona a cada animal fue como sigue:

6

N modelo normal; I, modelo deteriorado (30 mg/kg metilprednisolona, Depo - Medrol®); L, herida lado izquierdo; R herida lado derecho; WTS, Análisis de resistencia de tensión de la herida; Hep, Heparinasa 3; Hep - P, Heparinasa 3 - Purificada.

Una sola inyección de metilprednisolona (30 mg/kg), dos días antes de herirse, resultó en una reducción (46%) en el proceso curación de la herida medido por la media de la fuerza de tensión de la herida en secciones de piel del grupo deteriorado (Grupo 2 lado izquierdo: 0,70 \pm 0,09, \pm 0,28 g/mm^{2} de lado derecho: 0,99 \pm 0,09, \pm 0,28 (media \pm SE , \pm SD)) comparado con el grupo normal (Grupo 1 lado izquierdo: 1,52 \pm 0,12, \pm 0,57 g/mm^{2}, lado derecho: 1,59 \pm 0,13 \pm 0,64 g/mm^{2}), como muestra en la Figura 17, y la Tabla 6.

En el modelo de rata deteriorado, las tres aplicaciones de vehículo (Grupo 3, lado izquierdo 0,71 \pm 0,07, \pm 0,32 g/mm^{2}) muestran una media de la medida de resistencia de tensión de la herida representan una deterioro de 54% relativo con las ratas normales (media de las medidas de resistencia de tensión de todas las herida: lado izquierdo y derecho Grupo 1: 1,55 \pm 0,09, \pm 0,60 g/mm^{2}). Las tres aplicaciones de heparinasa (Heparinasa 3, lote HEPIII RH - 67) muestran una media de la medida de resistencia de tensión de la herida que representa una deficiencia del 47% en comparación con las ratas normales. La aplicación de heparinasa proporciona un efecto contrario del 7%, como se indica por la Figura 17 y la Tabla 6.

En el modelo de rata deteriorado, las tres aplicaciones del vehículo (Grupo 4 lado izquierdo, 0,89 \pm 0,09, \pm 0,42 g/mm^{2}) indican una media de la medida de resistencia de tensión de la herida y representa un deterioro del 43% en comparación con las ratas normales. Tres aplicaciones de Hep - P (Heparinasa 3, lote: HEPIII.001) Dosis 2 (0,02 IU/200 \mul) indica una medida de resistencia de tensión de la herida que representa un deterioro de 35% en comparación con las ratas normales. La aplicación de Dosis 1 de Hep - P proporciona un efecto contrario de deterioro de 8%, como se indica por Figura 17 y la Tabla 6.

En el modelo de rata deteriorado, las tres aplicaciones de vehículo (Grupo 5 lado izquierdo, 0,74 \pm 0,04, \pm 0,17 g/mm^{2}) indican una media de las medidas de resistencia de tensión de la herida y representa un deterioro de 53% en comparación con las ratas normales. Tres aplicaciones de Hep - P (Heparinasa 3, lote HEPIII.001) Dosis 2 (0,20 IU/200 \mul) indica una media de las medidas de resistencia de tensión de la herida que representa un deterioro de un 26% en comparación con las ratas normales. La aplicación de la Dosis 2 de Hep - P proporciona un efecto contrario de deterioro del 27%, como se indica por Figura 17 y la Tabla 6.

En el modelo de rata deteriorado, las tres aplicaciones de vehículo (Grupo 6 lado izquierdo: 0,72 \pm 0,10, \pm 0,30 g/mm^{2}) indican una media de las medidas de esfuerzo de tracción de la herida que representa un deterioro del 54% en comparación con las ratas normales. Tres aplicaciones de Hep-P (Heparinasa 3 lote:HEPIII.001) Dosis 3 (2,00 IU/200 \mul) indica las mediciones de esfuerzo de tracción de la herida que representa un deterioro de 4% en comparación con las ratas normales. La aplicación de Hep - P Dosis 3 proporciona un efecto contrario del deterioro en un 50%, como se indica por la Figura 17 y la Tabla 6.

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TABLA 6 Esfuerzo de tracción de la Herida (g/mm^{2})

7

Claims

1. Uso de una composición farmaceútica en la fabricación de un medicamento para aumento de la cura de lesiones por liberación de heparina ligada a factores de crecimiento y moléculas desde la matriz extracelular, eliminación de sulfato de condroitina desde receptores de la superficie celular y/o eliminación del componente de sulfato de heparan de su complejo receptor de factor de crecimiento, en el que la composición consta de una enzima degradante de glucosaminoglucano bacteriana seleccionada desde el Grupo consistente de heparinasa 1 desde Flavobacterium heparinum, heparinasa 2 desde Flavobacterium heparinum, heparinasa 3 desde Flavobacterium heparinum, condroitinasa AC desde Flavobacterium heparinum, y condroitinasa B desde Flavobacterium heparinum, heparinasa desde cepas Bacteroides, heparinasa desde Flavobacterium Hp206, heparinasa desde especies Cytophagia, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde especies Bacteroides, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde Proteus vulgaris, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde Microcossus, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde especies Vibrio, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde Arthrobacter aurescens, estas enzimas se expresan desde secuencias de nucleótidos recombinantes expresadas en bacterias, y combinaciones de ellas, en combinación con un portador farmacéutico adecuado para administración localizada.

2. El uso de la Reivindicación 1 en el que el portador es un portador farmaceúticamente adecuado para administración tópica.

3. El uso de la Reivindicación 2, en el que el portador es un ungüento, una película polimérica, un gel, una micropartícula, una microcápsula, un liposoma, un proteosoma, una liposfera, un implante, un parche transdérmico, o una venda.

4. El uso de la Reivindicación 3, en el que la enzima se incluye en una matriz polimérica.

5. Un vehículo de entrega para entregar, y consta de la enzima en combinación con el portador a una dosis eficaz que aumenta la curación de la herida por liberación de heparina ligada a factores de crecimiento y moléculas desde la matriz extracelular, eliminación del sulfato de condroitina desde los receptores de la superficie celular y/o eliminación del componente de sulfato de heparan de su complejo receptor - factor de crecimiento, en el que la enzima
es:

enzima degradante de glucosaminoglucano bacteriano seleccionado desde el Grupo consistente de heparinasa 1 desde Flavobacterium heparinum, heparinasa 2 desde Flavobacterium heparinum, heparinasa 3 desde Flavobacterium heparinum, condroitinasa AC desde Flavobacterium heparinum, y condroitinasa B desde Flavobacterium heparinum, heparinasa desde cepas Bacteroides, heparinasa desde Flavobacterium Hp206, heparinasa desde especies Cytophagia, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde especies Bacteroides, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde Proteus vulgaris, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde Microcossus, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde especies Vibrio, enzimas degradantes de sulfato de condroitina desde Arthrobacteraurescens, estas enzimas se expresan desde secuencias de nucleótido recombinantes expresadas en bacterias, y combinaciones de éstas, en combinación con un portador farmaceúticamente adecuado en que, si la enzima es heparinasa 1, 2 o 3 de Flavobacterium heparinum, entonces la composición no contiene una cantidad eficaz de heparinasa en un portador farmaceúticamente adecuado para inhibir la angiogénesis en un sitio seleccionado en un paciente no heparinizado.

6. El vehículo de entrega de la Reivindicación 5 en el que el vehículo de entrega es un catéter o endoscopio.

7. El uso de la Reivindicación 1 en el que la enzima degradante de glucosaminoglucano y es una proteína de fusión.

8. El uso de Reivindicación 1 que comprende además una molécula objetivo que se une específicamente a una célula blanco y que está restringida a la enzima que degrada glucosaminoglucano, en el que la molécula objetivo está seleccionada de proteínas, polisacáridos, ácidos nucléicos, o lípidos.

9. El uso de la Reivindicación 8, en el que la molécula objetivo está seleccionada entre hormonas, anticuerpos, integrinas, o matriz extracelular ligada a moléculas que se unen a las moléculas de la superficie celular.

10. El uso de la Reivindicación 1, en el que la enzima se expresa de una secuencia de nucleótidos recombinantes en la que un organismo es el que no hace que ocurre naturalmente y la enzima es procesada diferenciadamente en el organismo que no ocurre naturalmente.

11. El uso de la Reivindicación 1, en el que la composición aumenta la curación de heridas de la vasculatura para prevención de restinosis.

12. El uso de un vehículo de entrega de acuerdo con la Reivindicación 5 ó 6, en la fabricación de un dispositivo para aumentar la curación de heridas por liberación de factores de crecimiento ligados a heparina y a las moléculas de la matriz extracelular, la eliminación de sulfato de condroitina de receptores de la superficie celular y/o la eliminación del componente de sulfato de heparan del complejo receptor - factor de crecimiento.

13. Una composición como se define en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4 ó 7 a 10, en la que si la enzima es heparinasa 1, 2 ó 3 desde Flavobacterium heparinum, entonces la composición no contiene una cantidad eficaz de heparinasa en un portador farmaceúticamente adecuado para inhibir la angiogénesis en un sitio seleccionado en un paciente no heparinizado.

14. Una composición como está definida en la Reivindicación 13, en el que el portador es una película polimérica, una micropartícula, una microcápsula, una protesoma, una liposoma, un parche transdérmico o una venda.