ES2276929T3 - Compuestos intermedios para la obtencion de espinosinas. - Google Patents
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Abstract
Compuestos de la fórmula (I) (Ver fórmula) en la que R 1 significa metilo o etilo, y A-B significa uno de los grupos siguientes: -HC=CH-, -HC=C(CH3)-, -H2C-CH2-, -H2C-CH(CH3)-.
Description
Compuestos intermedios para la obtención de
espinosinas.
La presente invención se refiere a compuestos
intermedios para la obtención de espinosinas, a diversos
procedimientos para su obtención, así como al empleo de estos
productos intermedios para la obtención de derivados de la
espinosina.
Las espinosinas están constituidas por
compuestos conocidos. Las espinosinas son productos de
fermentación, que se preparan por cultivo del actinomiceto
Saccharopolyspora spinosa. Las espinosinas naturales están
constituidas por una estructura de base tetracíclica poliencadenada
(aglicón) con un anillo macrólido de 12 miembros y un triciclo
5,6,5-cis-anti-trans,
así como por una parte sacárica D-forosamina y por
una parte sacárica
2,3,4-tri-O-metil-L-ramnosa
(Kirst et al. (1991), Tetrahedron Letters, 32:4839). Hasta
el presente se han descrito más de 20 espinosinas naturales
diferentes, el denominado complejo A83543 (véanse las publicaciones
WO 97/00265, WO 94/20518 y WO 93/09126). Estos compuestos varían en
la substitución de uno o de algunos grupos metilo sobre la
estructura básica de tetraciclina, en la parte sacárica de
forosamina o en la parte sacárica de
tri-metil-ramnosa. Del mismo modo,
ha sido aislado un 17-pseudoaglicón, en el que falta
la parte sacárica de forosamina, a partir de caldos de cultivo de
S. spinosa.
Los componentes principales del complejo A83543,
formado por S. spinosa, representan las variantes de
espinosina A y de espinosina D, que representan las partes
integrantes esenciales del producto Spinosad (véanse las
publicaciones Pesticide Manual, British Crop Protection Council,
11^{th} Ed., 1997, página 1272 y Dow Elanco trade maganzine Down
to Earth, Vol. 52, NO:. 1, 1997 y la literatura allí citada).
Cuando no está presente el aminoazúcar, se
designan los compuestos como 17-pseudoaglicón de la
espinosina A, D, etc.; cuando no está presente el azúcar neutro, se
designarán los compuestos como 9-pseudoaglicón de la
espinosina A, D, o etc. Las espinosinas sin los dos restos sacáricos
se denominan como aglicón de la espinosina.
Las espinosinas son adecuadas para la lucha
contra arácnidos, nematodos e insectos, especialmente contra
lepidópteros y contra dípteros. Puede esperarse que las pestes de
las plantas, que son combatidas actualmente con espinosinas, puedan
generar una resistencia contra estos productos activos que se
encuentran en el mercado. Por lo tanto es importante preparar
nuevos derivados de las espinosinas, biológicamente activos, que
puedan reemplazar a las espinosinas actualmente utilizadas para la
lucha contra las pestes. Se han descrito conjeturas sobre la
síntesis para la obtención de derivados de la espinosina por los
autores Martynow, J. G. y Kirst, H. A. en J. Org. Chem. 1994, 59,
1548. En esta publicación se cita la 9,17-dicetona
del aglicón de la espinosina así como el derivado
17-ceto del aglicón de la espinosina. Se han
divulgado el 17-pseudoaglicón de la espinosina y el
9-pseudoaglicón de la espinosina en las
publicaciones WO 97/00265 y US-A 6 001 981. En
dichas publicaciones se describe también la obtención de otros
derivados, que pueden ser obtenidos mediante procedimientos
semisintéticos a partir de productos naturales. El
9-pseudoaglicón de la espinosina, que está oxidado
en la posición C9, es conocido como compuesto insecticida, que se
obtiene mediante derivación química. El aglicón de la
9-ceto-espinosina es nuevo en lo que
se refiere al estado de la técnica.
La tarea de la presente invención consiste en
poner a disposición nuevos compuestos intermedios, que sean
adecuados para la obtención de derivados de la espinosina.
La tarea se resolvió mediante la puesta a
disposición de compuestos de la fórmula (I)
en la
que
- R^{1}
- significa metilo o etilo, y
- A-B
- significa uno de los grupos siguientes: -HC=CH-, -HC=C(CH_{3})-, -H_{2}C-CH_{2}-, -H_{2}C-CH(CH_{3})-.
- \quad
- Preferentemente,
- R^{1}
- significa etilo.
- \quad
- Preferentemente,
- A-B
- significa el grupo -HC=CH-.
Los compuestos de la formula (I), según la
invención, pueden existir en formas estereoisómeras, que se
comportan bien como un objeto y su imagen en el espejo
(enantiómeros), o que no se comportan como un objeto y su imagen en
el espejo (diastereómeros). La invención se refiere tanto a los
enantiómeros o a los diastereómeros o a sus mezclas
correspondientes. Las formas racémicas pueden separarse, del mismo
modo que los diastereómeros, de manera conocida, en los componentes
estereoisómeros unitarios. En caso dado pueden transformarse los
isómeros entre sí por medio de procedimientos conocidos.
El objeto de la presente invención consiste,
también, en procedimientos químicos y bioquímicos/microbiológicos
para la obtención de los compuestos citados de la fórmula general
(I).
Se obtienen los compuestos de la fórmula (I), si
se hacen reaccionar compuestos de la fórmula (II)
en la que R^{1} y
A-B tienen los significados anteriormente
indicados,
con un agente oxidante, en caso
dado en presencia de un
diluyente.
El aglicón de la espinosina, empleable como
compuesto de partida para el procedimiento según la invención, es
conocido y puede prepararse según el procedimiento descrito en la
publicación WO 01/16303. De manera análoga pueden obtenerse los
compuestos de partida, empleables para el procedimiento según la
invención, a partir de las espinosinas naturales
correspondientes.
Se conoce una pluralidad de agentes oxidantes
diversos para la oxidación de grupos alcohólicos (véase por ejemplo
reactivos de oxidación en la publicación: Organic Synthesis by
Oxidation with Metal Compounds (Síntesis orgánica por oxidación de
compuestos con metales); Mijs, de Jonge; Plenum Verlag: New York,
1986; Manganese Compounds as Oxidizing Agents in Organic Chemistry
(Compuestos de manganeso como agentes oxidantes en la química
orgánica); Arndt, Open Court Publishing Company: La Salle, IL,
1981; The Oxidation of Organic Compounds by Permanganate Ion and
Hexavalent Chromium (La oxidación de los compuestos orgánicos por
el ión permanganato y por el ión cromo hexavalente); Lee, Open
Court Publishing Company: La Salle, IL, 1980). Según estas
publicaciones puede llevarse a cabo una oxidación, por ejemplo, en
presencia de permanganatos, tal como el permanganato de potasio, de
halógenos, tales como el cloro o el bromo, de óxidos metálicos,
tales como el dióxido de manganeso o el tetróxido de rutenio y
similares.
Del mismo modo, se ha descrito en la literatura
un gran número de agentes oxidantes diversos especialmente sólo
para la oxidación de los alcoholes secundarios, tal como, por
ejemplo, el empleo de dicromatos ácidos (véanse las publicaciones
Chromium Oxidations in Organic Chemistry (Oxidación del cromo en
química orgánica); Cainelli, Cardillo, Springer Verlag: New York,
1984; Reagents for Organic Synthesis (Reactivos para síntesis
orgánica); Fieser, Vol. 1, Wiley: New York, 1967, páginas
142-147, 1059-1064 y otros volúmenes
de esta colección). Se conoce como reactivo de Jones una solución
constituida por ácido crómico y por ácido sulfúrico en agua (Bowden
et al. (1946), J. Chem. Soc.: 39; Bowers et al.
(1953), J. Chem. Soc.: 2548). Del mismo modo se emplean, como se
sabe, otros tres reactivos del cromo (VI) (véase la comunicación
sobre un estudio comparativo del reactivo de Jones, del reactivo de
Collins y del reactivo de Corey en la publicación Warrener et
al. (1978), Aust. J. Chem., 31: 1113); por ejemplo óxido de
piridina-cromo (VI) (reactivo de Collins) (véase por
ejemplo la publicación Collins et al. (1968), Tetrahedron
Lett.: 3363), clorocromato de piridinium (reactivo de Corey) (véase
por ejemplo la publicación Review: Luzzio and Guziec (1988), Org.
Prep. Proced. Int., 20: 533-584) y el dicromato de
piridinium (véanse las publicaciones de Coates (1969), Corrigan
Chem. Ind. (Londres): 1594; Corey, Schmidt (1979), Tetrahedron
Lett.: 399). Para substratos sensibles a los ácidos se conoce, por
ejemplo, también el empleo de óxido de cromo(VI) en
hexametil-fósforotriamida (HMPA) (véase la
publicación Cardillo et al. (1976), Synthesis: 394),
igualmente se ha descrito un complejo de óxido de cromo(VI)
(véase la publicación de Poos et al. (1953), J. Am. Chem.
Soc., 75: 422) o cromatos de trimetilsililo (Moiseenkov et
al. (1987), J. Org. Chem. USSR, 23: 1646). Se ha citado el
hipoclorito de sodio en ácido acético para la oxidación de una
alcohol secundario en grandes cantidades (véanse las publicaciones
de Stevens et al. (1980), J. Org. Chem., 45: 2030; Schneider
et al. (1982), J. Org. Chem., 47: 364). Los reactivos
oxidantes pueden presentarse también enlazados con polímeros
(véanse las publicaciones Review: McKillop, Young (1979),
Synthesis: 401-422). De este modo, se han empleado
como agentes oxidantes tanto los ácidos crómicos como también los
permanganatos. Del mismo modo se conoce un gran número de
reacciones con transferencia de fases con permanganatos (véase la
publicación Review: Lee, en Trahanovsky, Ref. 2, pt. D, páginas
147-206), con ácidos crómicos (Hutchins et
al. (1977), Tetrahedron Lett.: 4167; Landini et al.
(1979), Synthesis: 134) y con tetróxido de rutenio (Monis, Kiely J.
Org. Chem. (1987), 52: 1149). Pueden imaginarse incluso reacciones
de oxidación inducidas por ultrasonidos - de este modo se ha citado
el empleo de permanganato de potasio (Yamawaki et al.
(1983), Chem. Lett.: 379).
Además, la mayoría de los agentes oxidantes, que
pueden oxidar los alcoholes primarios para dar aldehídos, son
adecuados, también, para la oxidación correspondiente de los
alcoholes secundarios. Tales agentes oxidantes para alcoholes
primarios son, por ejemplo, el dicromato de piridinium, el
per-rutenato de tetrapropilamonio
(Pr_{4}N^{+}RuO_{4}^{-}), el nitrato de
cerio-amonio (CAN), el carbonato de plata sobre
celita (Fetizon et al. (1968), Acad. Sci., Ser. C, 267: 900),
Na_{2}Cr_{2}O_{7} en agua (Lee et al. (1970), J. Org.
Chem., 35: 3589), el tetraacetato de plomo-piridina,
el dibromuro de benzoilperóxido-níquel o el
dimetilsulfóxido en presencia de cloruro de oxalilo (oxidación de
Swern), el pentahidrato de sulfato de cobre(II) en piridina,
el acetato de cobre(II) en ácido acético al 70%, el cloruro
de hierro en agua, el óxido de cromo(VI) en ácido acético o
el trióxido de dicromo en piridina. A los reactivos, que pueden
oxidar de manera específica un grupo hidroxi secundario incluso en
presencia de un grupo hidroxi primario, pertenecen, por ejemplo, el
peróxido de hidrógeno-molibdato de amonio (Trost
et al. (1984), Isr. J. Chem., 24: 134), el borato de sodio
(NaBrO_{3})-CAN (Tomioka et al.,
Tetrahedron Lett. 23: 539). También pueden emplearse las
N-halógeno-succinimidas (halógeno =
cloro, bromo, yodo) como agentes oxidantes para grupos hidroxi,
incluso en presencia de otros grupos oxidables (variante según los
autores Corey y Khim (1972), J. Am. Chem. Soc., 94:7586; Review:
Filler (1963), Chem. Rev., 63: 21-43, páginas
22-28). De manera ejemplificativa, la combinación
de
N-yodo-succinimida-yoduro
de tetrabutilamonio es adecuada para la oxidación de alcoholes
secundarios en rendimientos elevados (Hanessian et al.
(1981), Synthesis: 394).
A otros métodos de oxidación, conocidos,
pertenece también la deshidrogenación por oxidación, por ejemplo en
presencia de catalizadores tales como la plata o los catalizadores
de cobre (M. Muhler en: Handbook of Heterogenous Catalysis (Manual
de catálisis heterogénea), VCH, Weinheim, 1997). e conocen otros
procedimientos para la oxidación catalítica, suave, con empleo de
catalizadores de platino-carbono o de
paladio-carbono, que permiten la oxidación incluso
de clases de substancia sensibles, por ejemplo los hidratos de
carbono (M. Besson et al. (1995), J. Catal. 152:
116-122) o esteroides (T. Akihisa et al.
(1986), Bull. Chem. Soc. Jpn. 59: 680-685). Se ha
descrito como el catalizador comercial más eficiente, para la
oxidación, por ejemplo el catalizador inorgánico
TS-1 (óxidos de titanio silicalita), que
posibilitan la oxidación catalítica de alcoholes primarios y de
alcoholes secundarios (30% p/p) (R. Murugawel et al. (1997),
Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36: 477-479).
Preferentemente se emplearán como agentes
oxidantes las N-halógenosuccinimidas, especialmente
la N-clorosuccinimida, en presencia de
dimetilsulfóxido (oxidación de Swern), o de dicromato de
piridinium.
El procedimiento, según la invención, para la
obtención de los nuevos compuestos se llevará a cabo,
preferentemente, con empleo de diluyentes. Los diluyentes se
emplearán, preferentemente, en cantidades tales, que la mezcla de la
reacción permanezca perfectamente agitable durante todo el
procedimiento.
En función del agente oxidante, precedentemente
citado, entrarán en consideración como agentes diluyentes, además
del agua o del peróxido de hidrógeno acuoso, también lo diluyentes
ácidos, tal como, por ejemplo, el ácido acético concentrado o
parcialmente diluido, y los diluyentes básicos tal como, por
ejemplo, la piridina.
Además, entran en consideración prácticamente
todos los disolventes orgánicos inertes. A éstos pertenecen,
especialmente, los hidrocarburos alifáticos, alicíclicos o
aromáticos, en caso dado halogenados, tales como por ejemplo la
bencina, el benceno, el tolueno, el xileno, el anisol, el
clorobenceno, el diclorobenceno, el éter de petróleo, el hexano, el
ciclohexano, el diclorometano, el 1,2-dicloroetano,
el cloroformo, el tetracloruro de carbono, los éteres, tales como el
dietiléter, el dioxano, el tetrahidrofurano o el
etilenglicoldimetiléter o el etilenglicoldietiléter, las cetonas,
tales como la acetona o la butanona, los nitrilos, tales como el
acetonitrilo o el propionitrilo, las amidas, tales como la
dimetilformamida, la dimetilacetamida, la
N-metilformanilida, la
N-metilpirrolidona o la hexametilfósforotriamida,
los ésteres, tal como el acetato de etilo, los sulfóxidos, tal como
el dimetilsulfóxido o el sulfolano.
Evidentemente podrá llevarse a cabo también el
procedimiento según la invención en mezclas de los disolventes
citados. De manera especialmente preferente se empleará el
diclorometano como agente diluyente. Además, se llevará a cabo
preferentemente la reacción según el procedimiento de acuerdo con la
invención, bajo gases inertes. Las temperaturas de la reacción
pueden variar, en el procedimiento según la invención, dentro de
amplios límites. En general se trabaja a temperaturas comprendidas
entre -100ºC y +150ºC, preferentemente a temperaturas comprendidas
entre -20ºC y +50ºC.
El procedimiento, según la invención, se llevará
a cabo, en general, bajo presión normal. No obstante es posible
también trabajar bajo presión más elevada o a presión más
reducida.
Para la realización del procedimiento según la
invención se emplearán los compuestos de partida, necesarios en
cada caso, en general, en cantidades aproximadamente equimolares.
No obstante es posible también emplear el agente oxidante en
exceso.
La elaboración se lleva a cabo según métodos
usuales.
Los nuevos compuestos de la fórmula (I) pueden
prepararse también mediante bioconversión a partir de compuestos de
la fórmula general (II).
Las oxidaciones selectivas y/o
estereoespecíficas de los grupos hidroxilo de los productos
naturales y de los compuestos sintéticos por medio de bioconversión,
mediante el empleo de microorganismos o de sus enzimas, han sido
descritos en la literatura. Especialmente se han empleado células
y/o enzimas de actinomicetos (Nocardia, Streptomyces) y otras
bacterias gram-positivas (Bacillus, Clostridium) o
bacterias gram-negativas para la oxidación
específica de los compuestos esteroides, cuya accesibilidad química
está limitada. Ejemplos, que se refieren especialmente a clases de
enzimas tales como a las
hidroxiesteroide-deshidrogenadas o a las
colesterina-oxidasas, se han enumerado en la tabla
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Según la invención pueden ponerse en contacto
compuestos de la fórmula (II)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1} y
A-B tienen los significados anteriormente indicados,
con un microorganismo en un medio acuoso bajo condiciones aerobias
y, a continuación, aislarse los compuestos de la fórmula
(I).
En lugar de los microorganismos pueden
emplearse, también, extractos enzimáticos y enzimas purificadas, en
caso dado tras adición o bajo regeneración de los cofactores
necesarios, que pueden obtenerse a partir de estos microorganismos
según los procedimientos usuales.
Preferentemente, se empleará para el
procedimiento, según la invención, un microorganismo del género
Bacillus o elegido entre el grupo formado por los actinomicetos,
especialmente del género Streptomyces, o un hongo, especialmente de
la clase de los cigomicetos, y en este caso preferentemente de los
géneros Zygorhynchus o Mucor -o bien a partir de los extractos
enzimáticos preparados a partir de los mismos o de los enzimas
purificados-.
De manera especialmente preferente se empleará
para el procedimiento según la invención una cepa procedente de la
especie Bacillus simplex, Bacillus megaterium, Streptomyces
argillaceus, Streptomyces scabies, Streptomyces mirabilis,
Streptomyces pseudovenecuelae, Zygorhynchus moelleri o Mucor
circinelloides.
De una manera muy especialmente preferente, se
empleará para el procedimiento, según la invención, una cepa con
las propiedades características de las cepas siguientes:
Las cepas, citadas en la tabla, han sido
depositadas en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen (Colección alemana de microorganismos y de cultivos
celulares GmbH) GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b,
D-38124 Braunschweig, Alemania, de acuerdo con las
normas del tratado de Budapest.
Las cepas han sido descritas con mayor detalle
en el ejemplo 9. Pueden emplearse, no solamente las cepas
depositadas como tales, sino también mutantes de las mismas, en
tanto en cuanto estos mutantes tengan las propiedades
características de las cepas depositadas. Esto significa que los
mutantes deben tener todavía la capacidad de poder llevar a cabo la
bioconversión, según la invención.
Preferentemente, el medio acuoso contiene una
fuente asimilable de carbono y una fuente asimilable de
nitrógeno.
Los compuestos de la fórmula (I) se producirán,
por ejemplo, cuando se fermente una cepa procedente de los tipos
citados en la tabla, en un medio acuoso nutriente bajo condiciones
aerobias, en presencia de compuestos de la fórmula (II). De manera
típica se fermentarán los microorganismos en un medio, que contenga
una fuente de carbono y, en caso dado, un material de tipo
proteínico. Las fuentes de carbono preferentes abarcan la glucosa,
el azúcar marrón, la sacarosa, la glicerina, los almidones, el
almidón de maíz, la lactosa, la dextrina, las malazas, etc. Las
fuentes de nitrógeno, preferentes, abarcan el harina de semillas de
algodón, las levaduras, las levaduras para panadería autolisadas,
los componentes sólidos de la leche, el harina de semillas de soja,
el harina de maíz, los productos de disociación de la caseína
digeridos de manera pancreática o papaínica, los componentes sólidos
de la destilación, los caldos constituidos por peptona animal,
trozos de carne y de hueso, etc. Preferentemente se emplearán
combinaciones de estas fuentes de carbono y de nitrógeno. Los
elementos en trazas, tales como por ejemplo el cinc, el magnesio,
el manganeso, el cobalto, el hierro, etc., no tienen que ser
añadidos al medio de fermentación en tanto en cuanto se utilice
agua de la cañería y componentes no purificados como componentes
del medio.
La obtención de los compuestos de la fórmula
general (I) puede inducirse a cualquier temperatura, que garantice
un crecimiento suficiente de los microorganismos. Preferentemente
la temperatura está comprendida entre 21ºC y 32ºC, de forma
especialmente preferente desde 28ºC aproximadamente.
En general se obtendrá una producción óptima de
los compuestos de la fórmula (I) en el transcurso de 1 hasta 10
días tras adición de los compuestos de la fórmula (II) al cultivo,
preferentemente en 2 hasta 6 días aproximadamente. Los caldos de
fermentación permanecen, normalmente, ligeramente básicos durante la
fermentación (pH 7,4 hasta pH 8,0). El pH final depende, en parte,
del tampón empleado en caso dado y, en parte, del pH inicial del
medio de cultivo. Preferentemente se establecerá el pH a un valor
aproximado desde 6,5 hasta 7,5 como paso previo a la
esterilización, de forma especialmente preferente a pH 7,2.
La producción de los compuestos según la
invención tiene lugar tanto en botellas sometidas a sacudidas como
también en fermentadores con agitador. Cuando el cultivo tenga
lugar en botellas sometidas a sacudidas o en cubas y tanques de gran
tamaño, se empleará preferentemente la forma vegetativa en lugar de
la forma de esporas de los microorganismos para la inoculación con
el fin de evitar una clara fase de incubación latente durante la
producción de los metabolitos y, por lo tanto, un aprovechamiento
ineficaz de las instalaciones. Por lo tanto, es ventajosa un
inoculación vegetativa en un medio acuoso mediante inoculación de
este medio con una parte alícuota de un cultivo realizado en platos
o en tubitos inclinados. Una vez que se ha preparado un inoculum
vegetativo fresco, activo, de este modo, éste se transferirá, de
manera aséptica, a otras botellas sometidas a sacudidas o a otras
instalaciones adecuadas para la fermentación de los microorganismos.
El medio, en el que se prepara el inoculum vegetativo, puede ser
idéntico o diferente al medio empleado para la obtención de los
compuestos según la invención, en tanto en cuanto garantice un
crecimiento suficiente de los microorganismos.
En general se llevará a cabo la obtención de los
compuestos, según la invención, con empleo de los microorganismos
precedentemente citados, bajo condiciones aerobias en fermentadores
con agitador. Sin embargo, la obtención es independiente de los
fermentadores y de los cultivos de partida empleados. Los
compuestos según la invención pueden obtenerse también mediante
cultivos sometidos a sacudidas. Para las fermentaciones a gran
volumen se empleará, preferentemente, un inoculum vegetativo. El
inoculum vegetativo se preparará mediante inoculación de un pequeño
volumen de un medio de cultivo con las formas de esporas, con
fragmentos de micelio o con un pellet liofilizado del
microorganismo. El inoculum vegetativo se transferirá a continuación
hasta una cuba de fermentación, en la que se producirán los
compuestos según la invención con un rendimiento óptimo al cabo de
un tiempo de incubación adecuado en presencia de los compuestos de
la fórmula general (II). Usualmente se hará pasar a través del medio
de cultivo aire estéril en el caso de un procedimiento de
fermentación aerobia sumergido. Para el crecimiento eficiente de
los microorganismos, el volumen de aire empleado se encuentra en el
intervalo desde aproximadamente 0,25 hasta aproximadamente 0,5
volúmenes de aire por volumen de medio de cultivo por minuto (vvm).
Una relación óptima en una cuba de 10 litros es, aproximadamente, de
0,3 vvm con movimiento, que es generado por medio de una hélice
convencional que gira aproximadamente a 200 hasta 500
revoluciones/min, preferentemente que gira a 300 revoluciones/min.
Cuando la formación de espuma represente un problema, será
necesaria la adición al medio de fermentación de una pequeña
cantidad, tal como por ejemplo de 1 ml/l, de un agente represor de
la espuma, tal como
silicona.
silicona.
Las condiciones y los medios preferentes para la
fermentación han sido descritos en los ejemplos.
La biotransformación de los compuestos de la
fórmula (II) para dar los compuestos según la invención comienza,
en general, aproximadamente al cabo de 48 horas y tiene lugar al
menos a lo largo de 6 días durante el período de fermentación. La
producción máxima se alcanza aproximadamente entre los días quinto
hasta séptimo del tiempo de fermentación, en el caso del empleo de
cepas de Bacillus se alcanza ya al cabo de 3 hasta 4 días.
Los compuestos según la invención como producto
de biotransformación, pueden aislarse a partir del medio de
fermentación por medio de los procedimientos usuales.
Los procedimientos, según la invención, están
presentes, ante todo, en la biomasa de los microorganismos
fermentadores, sin embargo pueden llevarse a cabo también en
pequeñas cantidades en el filtrado de cultivo del caldo de
fermentación. El caldo de cultivo puede separarse, en el caso más
sencillo, mediante filtración a través de un filtro prensa.
Pueden emplearse diversos procedimientos para el
aislamiento y la purificación de los compuestos según la invención
a partir de los caldos de fermentación, tal como, por ejemplo,
mediante procedimientos de adsorción cromatográfica (por ejemplo
mediante cromatografía en columna, cromatografía de reparto
líquido-líquido, cromatografía de permeación de gel)
seguido de elución con un disolvente adecuado, y cristalización en
disolventes, así como combinación de los mismos. En un
procedimiento preferente para la purificación se extraen los
compuestos, según la invención, a partir de la biomasa, a partir de
los micelios o a partir de los extractos del sobrenadante. Estos
últimos pueden prepararse mediante el empleo de resinas adsorbentes
tales como por ejemplo XAD, HP20 o Lewapol. Los métodos de
cromatografía en columna, preferentemente a través de gel de sílice
o de geles de sílices modificados, se emplearán para la realización
de una purificación inicial. La purificación definitiva de los
compuestos según la invención se consigue preferentemente mediante
cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC),
preparativa.
preparativa.
Los compuestos, según la invención, pueden
emplearse para la obtención de derivados de espinosina
biológicamente activos, especialmente insecticidas.
Si se emplea, por ejemplo, para la glicosidación
de los compuestos de la fórmula (Ia), según la invención, una
forosamina activada (D-forosamina: véase la
publicación EP-A 0 375 316) como aminoazúcar de la
fórmula (III), en la que LG puede significar un grupo disociable
conocido, adecuado (LG = leaving group), tal como por ejemplo el
bromo o el 2,2,2-tricloroetanimidato (=
tricloroacetimidato) se obtendrá el 9-pseudoaglicón
de la 9-ceto-espinosina A, conocido
por las publicaciones WO 97/00265 y US-A 6 001981,
de la fórmula (IVa) (véase el esquema 1).
\newpage
Esquema
1
Reacción de
glicosidación
\vskip1.000000\baselineskip
La obtención de una forosamina activada como
aminoazúcar de la fórmula (III), por ejemplo del hidrobromuro del
bromuro de \alpha-D-forosaminilo o
bien del bromuro de
\alpha-L-N-Fmoc-forosaminilo
(LG = bromo), y su reacción de glicosidación se conocen por las
publicaciones WO 97/00265 y US-A 6 001 981 o bien
por la publicación D. A. Evans et al. (1993), J. Am. Chem.
Soc. 115: 4497-4513. Además se conoce la obtención
de un aminoazúcar activado de la fórmula (III), por ejemplo del
1-(2,2,2-tricloroetanimidato)-4,6-didesoxi-4-(dimetilamino)-5-C-metil-\beta-D-ribo-hexopiranosa-2,3-diacetato
(LG = 2,2,2-tricloroetanimidato), y su reacción de
glicosidación estereoselectiva (véase la publicación de I. Sato
et al. (1999), Chem. Lett. 9: 867-868;
véase, además, también el empleo de los tricloroacetimidatos para
la obtención de los glucoespingolípidos: G. R. Duffin et al.
(2000), J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1: 223
7-2242).
Se ha descrito ya la actividad biológica del
9-pseudoaglicón de la
9-ceto-espinosina A de la fórmula
(IVa) contra Stomoxys calcitrans (mosca de los establos
-stable fly-) y Phorbia regina (moscón -blow fly-) en las
publicaciones WO 97/00265 y US-A 6 001 981.
Además, se conocen por las publicaciones WO
97/00265 y US-A 6 001 981 dos reacciones
secundarias (vía a y b) con el 9-pseudoaglicón de la
9-ceto-espinosina A de la fórmula
(IVa), en las cuales se aprovecha la reactividad del grupo carbonilo
en la posición 9 (véase el esquema 2).
A modo de ejemplo, es posible convertir el
9-pseudoaglicón de la
9-ceto-espinosina A de la fórmula
(IVa) con el reactivo de Grignard constituido por el cloruro de
metilmagnesio (V) para dar una mezcla, que puede ser separada por
cromatografía, del 9-pseudoaglicón de la (9S)- y de
la
(9R)-9-metil-espinosina
A de las fórmulas (VIa) y (VIb) (vía a). En otro ejemplo de
realización conocido se explica la reacción del
9-pseudoaglicón de la
9-ceto-espinosina A de la fórmula
(IVa) con morfolina (VII) en presencia de cianoborohidruro de sodio
con formación del 9-pseudoaglicón de la
9-desoxi-9-(N-morfolinil)-espinosina
A de la fórmula (VIII) (véase el esquema 2, vía b).
\newpage
Esquema
2
Reacciones de carbonilo con el
9-pseudoaglicón de la
9-ceto-espinosina
A
\vskip1.000000\baselineskip
Vía
a
Vía
b
Se ha descrito ya una actividad biológica,
especialmente insecticida, para el 9-pseudoaglicón
de la (9S)- y de la
(9R)-9-metil-espinosina
A de las fórmulas (VIa) y (VIb), contra Aphis gossipii
(afido del algodón -cotton aphid-), Heliothis virescens
(gusano bellotero -tobacco budworm-) y Stomoxys calcitrans
(mosca de los estables -stable fly-)
en las publicaciones WO 97/00265 y US-A 6 001 981. Del mismo modo, se ha indicado una actividad biológica correspondiente, especialmente insecticida, del A-9-pseudoaglicón de la 9-desoxi-9-(N-morfolinil)-espinosina de la fórmula (III) contra Stomoxys calcitrans (mosca de los establos -stable fly-) en las publicaciones WO 97/00265 y US-A 6 001981.
en las publicaciones WO 97/00265 y US-A 6 001 981. Del mismo modo, se ha indicado una actividad biológica correspondiente, especialmente insecticida, del A-9-pseudoaglicón de la 9-desoxi-9-(N-morfolinil)-espinosina de la fórmula (III) contra Stomoxys calcitrans (mosca de los establos -stable fly-) en las publicaciones WO 97/00265 y US-A 6 001981.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se preparó el compuesto de la fórmula (II), en
la que R^{1} significa etilo y A-B significa el
grupo -HC=CH- (denominado a continuación compuesto (2)), como se ha
descrito en la publicación WO 01/16303.
\newpage
Ejemplo
1a)
Se preparó el compuesto de la fórmula (II), en
la que R^{1} significa etilo y A-B significa el
grupo -H_{2}C-CH_{2}- (aglicón de la
5,6-dihidroespinosina, denominado a continuación
compuesto (4)), de manera análoga a la de la publicación WO 01/16303
a partir de la 5,6-dihidroespinosina A. La
obtención de la 5,6-dihidroespinosina A, a partir
de la espinosina A, es conocida por las publicaciones WO 97/00265 y
US-A 6 001 981. Por su parte, se preparó la
espinosina A, a partir de Tracer®, como se ha descrito en la
publicación WO 01/16303.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Protocolo ejemplificativo de la
biotransformación para la obtención del compuesto (1) a partir del
compuesto (2).
\newpage
Ejemplo
3a)
Para la obtención de los cultivos previos se
cultivaron las cepas Streptomyces argillaceus DSM 14030,
Streptomyces scabies DSM 14029, Streptomyces spec.
DSM 14077, Streptomyces mirabilis DSM 14078, Streptomyces
pseudovenecuelae DSM 14079, Zygorhynchus moelleri DSM
14198 o de Mucor circinelloides DSM 14199 en los medios
siguientes: medio 1: medio de levadura-malta:
D-glucosa 0,4%, extracto de levadura 0,4%, extracto
de malta 1,0%, agua de la cañería hasta 1 litro (el pH se ajustó
con HCl acuoso a 6,5 en el caso de los hongos y con NaOH acuoso a
7,2 en el caso de las bacterias) o medio TSB (medio 2): Trypticase
Soy Broth (Difco) (30 g/l), agua de la cañería hasta 1 litro. El
valor del pH del medio se ajustó con NaOH acuoso hasta 7,2. Los
medios se esterilizaron, respectivamente, a 121ºC y a una
sobrepresión de 1,1 bares durante 20 minutos.
Se aplicaron, respectivamente, 2 ml de una
suspensión micelar en glicerina al 50% como inoculum para 2 x 150
ml de medio 1 en un matraz Erlenmeyer de 1.000 ml y se incubaron
durante 72 horas a 240 revoluciones por minuto (rpm) en una máquina
sacudidora circular. Estos cultivos se utilizaron para la obtención
de nuevas conservas de glicerina, que se conservaron a -20ºC, o
bien sirvieron como inoculum para cultivos de producción (véase
3b).
Ejemplo
3b)
Para la obtención de cultivos de producción se
emplearon, respectivamente, 2 ml de un cultivo previo como el que
se ha descrito bajo 3a), como inoculum para 100 x 150 ml de medio
GS (glucosa (20 g/l), harina de soja (20 g/l), almidón (20 g/l),
NaCl (2,5 g/l), CaCO_{3} (5 g/l), MgSO_{4} x 6 H_{2}O (0,5
g/l), KH_{2}PO_{4} (0,25 g/l). Como paso previo a la
inoculación se ajustó el valor del pH con KOH a 6,8 y se esterilizó
a 121ºC y a una sobrepresión de 1,1 bares durante 20 minutos. El
compuesto (2) se añadió en una concentración final de 50 hasta 500
mg/l de medio en solución metanólica (100 mg/ml de metanol) a
elección bien al principio de la fermentación o durante la
fermentación en cualquier momento hasta una duración de la
fermentación de 160 horas. La biotransformación se interrumpió al
cabo de 240 horas. Para seguir el proceso de biotransformación
sirvieron muestras diarias de 50 ml, que se tomaron de manera
estéril y que se ensayaron con ayuda de la HPLC analítica. Bajo
estas condiciones se alcanzaron proporciones de conversión de hasta
un 100% del compuesto (2) para dar el compuesto (1),
preferentemente con S. argillaceus DSM 14030.
Ejemplo
4
Protocolo ejemplificativo de la
biotransformación para la obtención del compuesto (1) a partir del
compuesto (2).
Ejemplo
4a)
Para la obtención de un cultivo previo,
primario, se cultivaron Bacillus simplex DSM 14028, B.
megaterium DSM 333 y B. megaterium DSM 339 en el medio
siguiente: medio TSB (medio 2): Trypticase Soy Broth (Difco) (30
g/l), agua de la cañería hasta 1 litro. El medio se esterilizó a
121ºC y a una sobrepresión de 1,1 bares durante 20 minutos.
Se utilizaron 2 ml de una suspensión bacteriana
en glicerina al 50% como inoculum para 150 ml de medio 2 en un
matraz de Erlenmeyer de 1.000 m1 y se incubaron durante 48 horas a
240 revoluciones/min en una máquina sacudidora circular. Este medio
se utilizó para la obtención de nuevas conservas de glicerina, que
se guardaron a 20ºC, o bien sirvieron como inoculum para los
cultivos de producción (véase 4b).
Ejemplo
4b)
Para la obtención del cultivo de producción se
empleó 1 x 150 ml de un cultivo previo descrito bajo 4a), a modo de
inoculum para 10 litros de medio 3 (LB Broth Medium, firma Sigma).
Como paso previo a la inoculación se añadió al medio 1 ml de
desespumante SAG 5693 (Union Carbide, USA) por litro, y se
esterilizó durante 30 minutos con vapor a 1,1 bares. Este cultivo
de producción se incubó durante 90 horas a 28ºC, con una velocidad
de agitación de 300 revoluciones/min y con una velocidad de
ventilación de 0,3 vvm en un fermentador con agitador (agitador de
paletas) Giovanola de 10 litros. El compuesto (2) se añadió en una
concentración de 50 hasta 250 mg/l de medio en solución metanólica
(2,5 g disueltos en 60 ml de metanol) al inicio de la fermentación.
Para seguir el proceso de la biotransformación sirvieron muestras
diarias de 50 ml, que se tomaron de manera estéril y que se
ensayaron con ayuda de la HPLC analítica. Bajo estas condiciones se
alcanzaron conversiones de hasta un 60% del compuesto (2) para dar
el compuesto (1), preferentemente con B. simplex
DSM14028.
Ejemplo
5
Para la detección durante la biotransformación
se emplearon métodos de HPLC analítica con UV/visual
(HPLC-UV/Vis) y se empleó con detección por
espectrometría de masas.
Como paso previo al análisis mediante HPLC se
disolvieron las muestras en MeOH y se filtraron de manera
estéril.
Los análisis por HPLC-MS se
llevaron a cabo en un sistema HP1100 HPLC, acoplado con un
espectrómetro de masas Micromass-LCT (Micromass,
Manchester, Gran Bretaña) en el modo ESI+. Los espectros de masas
se registraron en el intervalo comprendido entre 200 y 1.200. El
compuesto (1) tenía un tiempo de retención de 4,08 minutos. El
sistema HP1100 empleado operó con los parámetros siguientes: fase
estacionaria: Waters Symmetry C18, 3,5 columna de 2,1 x 50 mm, fase
móvil: gradiente de agua (A), acetonitrilo (B) + 0,1% de ácido
fórmico (0-1 minutos 100% de A; 1-5
minutos gradiente lineal hasta 10% A/90% B; 5-6
minutos A al 10%/B al 90%, 6-6,10 minutos B al 90%
- B al 100%). El compuesto (1) eluyó a los 4,08 minutos. La
detección se llevó a cabo por medio de los iones moleculares
protonizados (M + H)^{+}.
Los análisis mediante
HPLC-UV/Vis se llevaron a cabo con ayuda de un
sistema Hewlett Packard Series 1100 analytical HPLC (HP, Waldbronn,
Alemania), constituido por un sistema de bombeo binario G 1312A, un
detector con representación por medio de diodos G 1315A, un sistema
de termostatado de la columna G 1316A, un sistema desgasificador G
1322A y un autoinyector G 1313A. Como fase móvil se empleó
H_{3}PO_{4} al 0,01%: acetonitrilo (ACN) con un flujo de 1
ml/minuto, mientras que sirvió como fase estacionaria una columna
Merck (Darmstadt, Alemania) Lichrospher RP 18 (125 x 4 mm, tamaño
de las partículas 5 \mum). Las muestras se separaron con un
gradiente lineal continuo (0% de ACN hasta 100% de ACN en 10
minutos), seguido de una elución isocrática (5 minutos con ACN al
100%). Los cromatogramas de HPLC-UV se registraron a
210 nm (detección de las impurezas) y a 254 nm (detección óptima en
el máximo de UV de los derivados de la espinosina) con una longitud
de onda de referencia respectiva de 550 nm con una anchura de banda
de 80 nm. La detección mediante representación por medio de diodos
en el intervalo de 210 - 600 nm proporcionó los espectros de
HPLC/UV/Vis. El almacenamiento de los datos se llevó a cabo con
ayuda del programa de ordenador HP ChemStation. El compuesto (2)
tenía en este caso un tiempo de retención de 7,85 - 7,9 minutos,
mientras que el compuesto (1) se eluyó con un tiempo de retención
de 8,21 - 8,27
minutos.
minutos.
Para la detección analítica del compuesto (2) y
del compuesto (1) en las muestras de fermentación, se emplearon
patrones internos y externos de las substancias puras, y la
detección se llevó a cabo con tiempos de retención coincidentes en
los dos sistemas analíticos diferentes, con inclusión de los
correspondientes espectros de HPLC-UV/Vis y de
HPLC-MS. La figura 1 muestra un cromatograma por
HPLC-UV del extracto en bruto a 254 nm y espectros
de HPLC-/UV (representación por medio de diodos; Rt = tiempos de
retención) del compuesto (2) y del compuesto (1) a partir de una
muestra de fermentación de S. argillaceus (medio GS) al cabo
de un tiempo de fermentación de 146 horas.
Ejemplo
6a)
Se recolectaron diez cultivos con 50 mg/l del
compuestos (2) combinados con 150 ml de cultivos de la cepa (S.
argillaceus DSM 14030) en matraces de Erlenmeyer de 1.000 ml,
al cabo de 240 horas, y los caldos de cultivo se combinaron y se
secaron por liofilización. Los residuos, obtenidos tras el secado
mediante liofilización se extrajeron dos veces respectivamente
durante 30 minutos en el baño de ultrasonidos. Los sobrenadantes se
separaron por filtración, se combinaron y se concentraron por
evaporación en vacío en el evaporador rotativo hasta sequedad. Los
residuos se volvieron a disolver en 100 ml de agua: acetato de
etilo (EtOAc) 1:1. Las fases orgánicas de acetato de etilo se
separaron, se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron por
evaporación hasta sequedad en el evaporador rotativo. La fase
acuosa se combinó otras dos veces con 50 ml, respectivamente, de
acetato de etilo, las fases orgánicas se separaron y se combinaron
con la primera fase. A partir de las fases orgánicas de la
extracción, reunidas, se obtuvieron aproximadamente 300 mg de un
producto en bruto oleaginoso, que se disolvió en 2 ml de MeOH y se
filtró a través de un cartucho para la extracción de fases sólidas
de 1 ml Baker (Deventer, Países Bajos) Bond Elut C18. El filtrado
se empleó directamente para la HPLC preparativa.
La HPLC preparativa se llevó a cabo a 22ºC. El
sistema empleado de la firma Gilson Abimed (Ratingen, Alemania)
estaba constituido por el programa de ordenador Gilson Unipoint,
por un sistema de bombeo binario 306, un colector de fracciones 205,
un detector UV-Vis 119, un módulo manométrico 806 y
un mezclador dinámico 811C. Como fase estacionaria se utilizó una
columna Merck (Darmstadt, Alemania) LichroSorb RP18 (tamaño de la
partículas 7 \mum; dimensiones de la columna 250 x 25 mm). Como
fase móvil sirvió un gradiente desde 0,1% de ácido trifluoracético
acuoso contra acetonitrilo (ACN) con un flujo continuo de 10
ml/minuto, bajo el siguiente perfil de elución: gradiente lineal
desde 20% hasta 50% de ACN en 35 minutos; a continuación
condiciones isocráticas a 50% de ACN durante 25 minutos, seguido de
un gradiente lineal de 50% de ACN hasta 100% de ACN en 40 minutos.
Se fraccionaron alícuotas de 10 ml y se combinaron según la
adsorción UV a 210 nm. Los tiempos de retención (Rt) fueron de
77-82 minutos para el compuesto (2) y de
91-97 minutos para el compuesto (1).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6b)
Se separaron los micelios procedentes de
fermentaciones de la cepa B. simplex DSM 14028, a escala de 10
litros, mediante centrifugación (10 minutos a 1.000 x g) del
sobrenadante y se extrajeron directamente con 2 x 200 ml de metanol.
Los extractos metabólicos se concentraron por evaporación hasta
sequedad y proporcionaron un producto intermedio oleaginoso. Este
producto se elaboró adicionalmente, como se ha descrito más
adelante, mediante cromatografía flash sobre material de gel de
sílice.
El sobrenadante del cultivo, obtenido tras
centrifugación, se dispuso sobre una columna de resina adsorbente
de 6 x 18 cm Lewapol (500 ml) OC 1064 (Bayer AG, Leverkusen,
Alemania). Esta columna se lavó con 1 litro de agua y se eluyó,
sucesivamente, con 2 litros de metanol al 70% y con 1 litro de
acetona. Los eluatos orgánicos se concentraron por evaporación en
el evaporador rotativo hasta la obtención de un residuo acuoso. La
masa del producto se recuperó en la fracción de acetona, que se
elaboró adicionalmente a continuación mediante cromatografía flash
-como se ha descrito más adelante-.
Los productos oleaginosos intermedios
procedentes de las extracciones del micelio y del sobrenadante se
disolvieron en la menor cantidad posible de terc.-butilmetiléter
(TMBE) y se enlazaron sobre 400 ml de gel de sílice 60 (0,040 -
0,063 mm, Merck Darmstadt, Alemania). El TMBE se eliminó
cuidadosamente por evaporación en el evaporador rotativo. A
continuación se envasaron los productos intermedios, enlazados
sobre el material de soporte, en seco, sobre 100 ml de gel de
sílice en un modulo SIM de 500 ml (Biotage). Se eluyó sucesivamente,
de manera isocrática, con 2 litros de ciclohexano (CH), seguido de
1,6 litros de un gradiente lineal de ciclohexano contra TBME.
Las fracciones eluidas con CH:TBME contenían el
producto con la riqueza máxima además de cantidades residuales del
aglicón no convertido y de otros componentes. Estas fracciones se
concentraron por evaporación en el evaporador rotativo y se
enviaron a la HPLC preparativa para el aislamiento del compuesto
(1).
El aislamiento del compuesto (1) se llevó a cabo
con empleo del sistema HPLC preparativo descrito en el ejemplo 6a)
con empleo de una tecnología analítica MZ con columna de Kromasil
100 C8 (7 \mum, 250 x 40 mm) como fase estacionaria y 0,1% de
ácido trifluoracético : acetonitrilo (ACN) como fase móvil con un
flujo continuo de 10 ml/minuto con los gradientes siguientes: 30%
de ACN durante 20 minutos, seguido de un gradiente lineal (30% -
50% de ACN en 60 minutos), a continuación de nuevo gradiente lineal
desde 50% de ACN hasta 100% de ACN en 42 minutos.
Se fraccionaron alícuotas de 10 ml y se
reunieron ulteriormente según la absorción UV a 210 nm. Los tiempos
de retención (Rt) fueron de 105-111 minutos para el
compuesto (2) y de 115-119 minutos para el compuesto
(1).
La elaboración y el aislamiento a partir de las
fermentaciones a escala mayor se llevó a cabo de manera análoga a
la de este procedimiento, aumentándose correspondientemente los
volúmenes para la extracción, para la elución y para el lecho de la
columna (es decir adaptándose a los volúmenes de los cultivos de
producción) y los productos intermedios se subdividieron en
alícuotas en caso dado como paso previo a la separación mediante
HPLC subsi-
guiente.
guiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
La determinación de la estructura del compuesto
(1) se llevó a cabo con ayuda de la espectroscopia de resonancia
nuclear 1D y 2D (NMR) y por medio de la espectrometría de masas de
aerosol electrónico positivo (+ESI-MS). Los
espectros de NMR se midieron en un espectrómetro Bruker DMX500 a 302
K en DMSO. Los espectros de MS se midieron en un dispositivo LCT
ESI-TOF de la firma Micromass.
La masa, determinada por medio de
(ES+I)-MS fue de 400 (C_{24}H_{32}O_{5}) (lo
que corresponde a una masa molar medida de 401 (m/z+H)). La masa,
determinada por medio de MS de alta resolución (ESI+) fue de
401,2340 (calculado: 401,2328). Los datos de NMR se han reunido en
la tabla siguiente y en la figura 2 se ha representado el espectro
de los protones.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La determinación de la rotación óptica se llevó
a cabo con un polarímetro Perkin-Elmer, modelo 341
a 20ºC y a 589 nm (longitud de la cubeta 10 cm, disolvente
metanol). El ángulo de rotación óptica del compuesto (1): (NaD, 589
nm) fue con MeOH: -272,2º.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Esta cepa ha sido depositada como productora de
mitramicina y como cepa tipo de la nueva especie Streptomyces S.
argillaceus, en la American Type Culture Collection (Colección
americana de tipos de cultivo) bajo el número de referencia ATCC
12956 por la firma Pfizer Inc., New York, USA (S. argillaceus
ATCC 12956). La descripción de la cepa puede verse en la
publicación US-A 3 646 194. El cultivo fue
depositado de nuevo el 08.02.2001 bajo el número de depósito DSM
14030 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (Colección alemana de microorganismos y de cultivos celulares
GmbH) (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig, Alemania, de acuerdo con las normas del tratado de
Budapest.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa BS 2134 se aisló a partir de una muestra
de suelo recogida en Rheinland-Pfalz (Alemania). El
cultivo fue depositado el 08.02.2001 bajo el número de depósito DSM
14029 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig, Alemania, de acuerdo con las normas del tratado de
Budapest.
La cepa BS 2134 fue clasificada como
Streptomyces scabies. Los resultados están basados en la
comparación con Streptomyces scabies DSM 40478 con empleo de
métodos del proyecto internacional para Streptomyces (ISP) para la
caracterización y la identificación de especies de Streptomyces
(Küster E. (1972), Int. J. Syst. Bacteriology, 22: 139), así como
con ayuda de análisis secuencial del 16S rADN (Maidak et.
al. (1996), Nucleic Acids Res., 24: 82). Los resultados están
reunidos en la tabla siguiente. De acuerdo con el análisis
secuencial 16S rADN la cepa presenta un 100% de coincidencia con
S. annulatus, que se asocia al mismo grupo de especies que
S. scabies. Sin embargo, puesto que las características
morfológicas y fisiológicas coinciden según la descripción ISP mejor
con S. scabies, se identificó la cepa como S.
scabies.
Descripción ISP. Morfología de las cadenas de
esporas: Rectiflexibiles, cadenas de esporas cortas con 10 esporas
como máximo. El micelio aéreo pertenece a la serie gris, el micelio
del substrato es amarillo hasta gris-verdoso. No se
formaron pigmentos de melamina. No se utilizan ni sacarosa, ni
inositol ni rafinosa.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa BA 312 se aisló a partir de una muestra
de terreno recogida en Rheinland-Pfalz (Alemania).
El cultivo se depositó el 27.02.2001 bajo el número de depósito DSM
14077 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig, Alemania, de acuerdo con las normas del tratado de
Budapest.
La cepa BA 312 no pudo asociarse con una especie
conocida de Streptomyces ni desde el punto de vista biológico
molecular ni desde el punto de vista quimiotaxonómico. Los
resultados fisiológicos de los ensayos (con relación al consumo de
azúcar véase la tabla siguiente) muestran similitudes con S.
ochraceiscleroticus, las características morfológicas (micelio
aéreo gris, cadenas de esporas lineales, color del micelio del
substrato amarillo, ausencia de melanización) y los análisis por
16S rADN sin embargo no coinciden con las de S.
ochraceiscleroticus, de tal manera que la cepa tiene que
clasificarse como S. spec. (véase la tabla siguiente).
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa BA 579 se aisló a partir de una muestra
de suelo recogida en Rheinland-Pfalz (Alemania). El
cultivo se depositó el 27.02.2001 bajo el número de depósito DSM
14078 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig, Alemania, de acuerdo con las normas del tratado de
Budapest.
Debido a la elevada similitud con la secuencia
16S rADN y a las características morfológicas se clasificó esta
cepa como S. mirabilis. Sin embargo, la cepa se diferencia
en cuanto al consumo de azúcar ISP mediante el crecimiento con
sacarosa y rafinosa así como en la ausencia de la formación de
melanina (véase la tabla siguiente).
\newpage
Descripción ISP: micelio aéreo gris, morfología
de la cadena de las esporas: sección espiral, la esporulación está
marcada sólo débilmente. El color del micelio del substrato es
gris-amarillo y se vuelve verde oliva hasta pardo.
En agar de peptona-levadura-huevo
se forman pigmentos de melanina. No se emplean ni sacarosa ni
rafinosa.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa WS 2199 se aisló a partir de una muestra
acuosa (Alemania). El cultivo fue depositado el 27.02.2001 bajo el
número de depósito DSM 14079 en la Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b,
D-38124 Braunschweig, Alemania, de acuerdo con las
normas del tratado de Budapest.
Debido a la gran similitud con la secuencia 16S
r DNA, a las características morfológicas y a los resultados de los
ensayos fisiológicos pudo clasificarse la cepa como S.
pseudovenecuelae. El color del micelio aéreo constituye una
excepción, que no es rojo-grisáceo, sino únicamente
gris (véase la tabla siguiente).
Descripción ISP: color del micelio aéreo: serie
roja, también se ha descrito como gris, morfología de la cadena de
las esporas: sección Rectiflexibiles. Cadenas de las esporas muy
largas (hasta 50 esporas). Melanización. Se utilizan
D-glucosa, L-arabinosa, sacarosa,
D-xilosa, inositol, D-manitol,
fructosa, ramnosa y rafinosa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
El Bacillus simplex DSM 14028 fue
admitido como Bacillus megaterium NRS 610 en la colección de
cepas Collection of Nathan R Smith, U.S. Department of Agriculture,
Washington, D.C., USA y se describió de nuevo por los autores Priest
et al. como Bacillus simples. Se aceptó en la
colección de la Deutsche Sammlung fiir Mikroorganismen como DSM
1318 (Priest, F. G., Goodfellow, M., Todd, C., A numerical
classification of the genus Bacillus (Una clasificación numérica del
género bacillus). J. Gen. Microbiol. 134:
1847-1882, 1988). La cepa se depositó nuevamente el
08.02.2001 bajo el número de depósito DSM 14028 en la Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ),
Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania,
de acuerdo con las normas del tratado de Budapest.
El Bacillus megaterium DSM 333 ha sido
depositado por D. Claus bajo el número de depósito DSM 333 en la
Deutsche Sammlung fiir Mikroorganismen y ha sido descrito por los
autores Hunger et al. (Hunger, W., Claus, D.: Taxonomic
studies on Bacillus megaterium and on agarolytic Bacillus
strains, páginas (Estudios taxonómicos sobre cepas de
Bacillus megaterium y de Becillus agarolítico)
217-239, In Berkeley, R.C.W., Goodfellow, M (eds.)
The aerobic endospore-forming bacteria:
classification and identification (Las bacterias formadoras de
endoesporas aerobias: clasificación e identificación). Academic
Press, Londres 1981).
El Bacillus megaterium DSM 339 ha sido
depositado por el Institut für Mikrobiologie der Universitát
Göttingen (Instituto de microbiología de la Universidad de Gotinga)
bajo el número de depósito DSM 339 en la Deutsche Sammlung fiir
Mikroorganismen. La taxonomía de la cepa ha sido descrita por los
autores Hunger et al. (Hunger, W., Claus, D.: Taxonomic
studies on Bacillus megaterium and on agarolytic Bacillus
strains, páginas 217-239, In Berkeley, R.C.W.,
Goodfellow, M (eds.). The aerobic endospore-forming
bacteria: classification and identification. Academic Press,
Londres 1981).
La cepa ha sido aislada por el Dr. H.-G.
Wetzstein (Bayer AG) 1994 a partir de una muestra de suelo recogida
en Alemania y ha sido descrita morfológicamente por el Dr. P.
Hofmann (DSMZ). Se ha confirmado, por medio de un control
microscópico del cultivo, depositado en la DSMZ, esta taxonomía con
ayuda del código para la determinación correspondiente en la
publicación de K.H. Domsch et al. (1980), Compendium of soil
fungi (Compendio de los hongos del suelo) Vol. 2. ICW Verlag (en
Zygorrhynchus moelleri). El nombre del género actualmente
válido se reproducirá, desde luego, según los autores Hawksworth,
D.L. et al. (eds.): Ainsworth & Bisby's Dictionary of
the Fungi (Diccionario de los hongos), CAB International, Londres,
8^{th} edition (1996) como Zygorhynchus (en lugar de
Zygorrhynchus). El cultivo fue depositado el 21.03.2001 bajo el
número de depósito DSM 14198 en la Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b,
D-38124 Braunschweig, Alemania, de acuerdo con las
normas del tratado de Budapest.
La cepa se aisló por el Dr. H.-G. Wetzstein
(Bayer AG) 1994 a partir de una muestra de suelo recogida en
Alemania y ha sido caracterizada morfológicamente por el Dr. P.
Hofmann (DSMZ). Se confirmó, por medio de un control microscópico,
del cultivo depositado en la DSMZ esta taxonomía con ayuda del
código para la determinación correspondiente en la publicación de
K.H. Domsch et al. (1980) Compendium of soil fungi Vol. 2.
ICW Verlag (en Mucor circillenoides). El cultivo fue
depositado el 21.03.2001 bajo el número de depósito DSM 14199 en la
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ),
Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania,
de acuerdo con las normas del tratado de Budapest.
Ejemplo
10
El compuestos (1) se preparó mediante oxidación
con dicromato de piridinium a partir del compuesto (2): se
disolvieron 46,55 g (115,6 mmoles) del compuesto (2), bajo gas
inerte, en 1.100 ml de diclorometano absoluto y se combinaron con
43,51 g (115,6 mmoles) de dicromato de piridinium. Al cabo de 4
horas de agitación a 25ºC y adición de 900 ml de dietiléter se
separó por filtración la sal de cromo precipitada y el filtrado se
concentró por evaporación en vacío. La cromatografía en columna
sobre gel de sílice (eluyente: ciclohexano/acetato de etilo 1:1, a
continuación acetato de etilo al 100%) proporcionó 3,68 g del
aglicón de la 9,17-dicetoespinosina y 23,40 g de
una mezcla aproximadamente 9:1 del compuesto (2) y del aglicón de
la 17-cetoespinosina además de 11,74 g del compuesto
(2) recuperado. Mediante recristalización de la mezcla en
ciclohexano/acetato de etilo se purifica el compuesto (1) hasta
> 98%. Se obtienen 20,78 g del compuesto (1) como cristales
incoloros.
- Compuesto (1): DC: R_{f} (SiO_{2},
acetato de etilo) = 0,44 - ^{1}H-NMR: CDCl_{3},
\delta = 6,77 (s, 13-H); 5,97 (d,
6-H); 5,88 (m, 5-H); 4,72 (m,
21-H); 3,69 (m, 17-H) y similares -
LC/ESI-MS: m/z = 401 (25%) [M]^{+},
289 (100%).
El compuesto (1), obtenido de este modo, es
idéntico, con respecto a todos los datos espectroscópicos, con el
compuesto (1) obtenido mediante bioconversión.
- Aglicón de 17-cetoespinosina:
DC: R_{f} (SiO_{2}, acetato de etilo) = 0,40 -
^{1}H-NMR: CDCl_{3}, \delta = 6,97 (s,
13-1-1); 5,90 (d,
6-H); 5,79 (m, 5-H); 4,85 (m,
21-H); 4,45 (m, 9-H); 4,25 (q,
16-H) y similares - LC/ESI-MS:
m/z = 401 (100%) [M+H]^{+}, 273 (70%).
- Aglicón de la
9,17-dicetoespinosina: DC: R_{f}
(SiO_{2}, acetato de etilo) = 0,64. -
^{1}H-NMR: CDCl_{3}, \delta = 6,92 (s,
13-H); 5,97 (d, 6-H); 5,87 (m,
5-H); 4,85 (m, 21-H); 4,25 (q,
16-H) y similares - LC/ESI-MS:
m/z = 399 (100%) [M+H]^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10a)
El compuesto (1) se obtuvo, alternativamente,
mediante oxidación de Swern (variante según Corey y Khim (1972), J.
Am. Chem. Soc., 94: 7586) a partir del compuesto (2): 133 mg (1
mmol) de la N-clorosuccinimida, bajo gas inerte, en
10 ml de diclorometano absoluto y se combinaron, a -70ºC, con 66 mg
(1,07 mmoles) de sulfuro de dimetilo. Al cabo de 30 minutos de
agitación se añadió lentamente, gota a gota, una solución de 402 mg
(1 mmol) del compuesto (1) en 2 ml de diclorometano absoluto. Al
cabo de 2 horas de agitación a -70ºC se añadieron, gota a gota, 132
\mul (0,95 mmoles) de trietilamina y la mezcla de la reacción se
calentó hasta la temperatura ambiente en el transcurso de 16 horas.
Tras dilución con 100 ml de diclorometano se lavó sucesivamente con
100 ml de agua y con 100 ml de solución acuosa saturada de cloruro
de sodio, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró por
evaporación en vacío. La cromatografía en columna sobre gel de
sílice (eluyente: ciclohexano/acetato de etilo 2:1) proporcionó 246
mg del compuesto (1) además de 37 mg del aglicón de la
9,17-dicetoespinosina y 120 mg del compuesto (2)
recuperado. El compuesto (1), obtenido de este modo, es idéntico con
relación a todos los datos espectroscópicos con el compuesto (1)
obtenido mediante oxidación con dicromato de piridinium o bien
mediante bioconversión.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10b)
El compuesto (3) se obtuvo de manera análoga a
la del ejemplo 10a) mediante oxidación por medio de dicromato de
piridinium a partir del compuesto (4): se disolvieron 202 mg (0,5
mmoles) del compuesto (4), bajo gas inerte, en 5 ml de
diclorometano absoluto y se combinaron con 188 mg (0,5 mmoles) de
dicromato de piridinium. Al cabo de 4 horas de agitación a 25ºC y
adición de 5 ml de dietiléter se separó por filtración la sal de
cromo precipitada y el filtrado se concentró por evaporación en
vacío. La cromatografía en columna sobre gel de sílice (eluyente:
ciclohexano/acetato de etilo 1:1, a continuación acetato de etilo al
100%) proporcionó 24 mg del aglicón de la
5,6-dihidro-9,17-diceto-espinosina
y 103 mg del compuesto (3) además de 41 mg del educto recuperado
del compuesto (4).
- Compuesto (3): DC: R_{f} (SiO_{2},
acetato de etilo) = 0,44 - ^{1}H-NMR: CDCl_{3},
\delta = 6,83 (s, 13-H); 4,68 (m,
21-H); 3,69 (m, 17-H) y similares -
LC/ESI-MS: m/z = 403 (23%)
[M+H]^{+}, 291 (100%).
- Aglicón de la
5,6-dihidro-9,17-dicetoespinosina:
DC: R_{f} (SiO_{2}, acetato de etilo) = 0,64. -
^{1}H-NMR: CDCl_{3}, \delta = 6,99 (s,
13-H); 4,82 (m, 21-H); 4,23 (q,
16-H) y similares - LC/ESI-MS:
m/z = 423 (100%) [M+Na]^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Se agitaron 200 mg (1,256 mmoles) de la
\alpha-D-forosamina en 10 ml de
cloruro de metileno, se combinaron con 419,0 mg (2,902 mmoles) de
tricloroacetonitrilo y 108,5 mg (0,333 mmoles) de carbonato de
cesio y se agitaron durante aproximadamente dos horas a temperatura
ambiente. A continuación se diluyó la mezcla de la reacción con
cloruro de metileno, se lavó con solución acuosa de bicarbonato de
sodio, la fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio y el
disolvente se eliminó en vacío. Se obtienen 303 mg (79,5%) de
tricloroacetimidato, que puede emplearse directamente para la
reacción de glicosidación (b).
C_{10}H_{17}Cl_{3}N_{2}O_{2}
(303,6).
LC/MS: m/z = 303 (100%)
[M]^{+}.
Se agitaron 100 mg (0,250 mmoles) del compuesto
(1) en 2 ml de cloruro de metileno, se combinaron con 50 mg de
tamiz molecular 4 \ring{A} y 151 mg (0,500 mmoles) de
tricloroacetimidato fresco (a). A continuación se añadieron 49,4 mg
(0,348 mmoles) de eterato de trifluoruro de boro y la mezcla de la
reacción se agitó durante aproximadamente 18 horas a temperatura
ambiente. Tras la separación del tamiz molecular 4 \ring{A} se
diluyó el residuo con un poco de cloruro de metileno y se lavó con
solución acuosa de bicarbonato de sodio. La fase orgánica se secó
sobre sulfato de magnesio y el disolvente se eliminó en vacío.
C_{32}H_{47}NO_{6} (541,7).
LC/MS: m/z = 542 (100%) [M]^{+}
(véanse las publicaciones WO 97/00265 y US-A 6 001
981).
Claims (19)
1. Compuestos de la fórmula (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
- R^{1}
- significa metilo o etilo, y
- A-B
- significa uno de los grupos siguientes: -HC=CH-, -HC=C(CH_{3})-, -H_{2}C-CH_{2}-, -H_{2}C-CH(CH_{3})-.
2. Compuestos según la reivindicación 1,
caracterizados porque
- R^{1}
- significa etilo.
3. Compuestos según las reivindicaciones 1 o 2,
caracterizados porque
- A-B
- significa el grupo -HC=CH-.
4. Procedimiento para la obtención de los
compuestos según una de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque se hacen reaccionar compuestos de la
fórmula general (II)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
R^{1} y A-B
tienen los significados indicados en una de las reivindicaciones 1 a
3,
con un agente oxidante, en caso
dado en presencia de un
diluyente.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque como agente oxidante se emplea
dicromato de piridinium o N-halógenosuccinimida en
presencia de sulfuro de dimetilo.
6. Procedimiento según las reivindicaciones 4 o
5, caracterizado porque se emplea diclorometano como
diluyente.
\newpage
7. Procedimiento para la obtención de los
compuestos según una de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque se ponen en contacto compuestos de la
fórmula general (II)
en la
que
R^{1} y A-B
tienen los significados indicados en una de las reivindicaciones 1 a
3,
con un microorganismo en un medio
acuoso, bajo condiciones aerobias, o con un extracto enzimático,
preparado a partir del mismo, o con uno o varios enzimas, aislados
a partir del
mismo.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque como microorganismo se emplea un
microorganismo del género Bacillus, elegido entre el grupo formado
por actinomicetos o de la clase formada por los cigomicetos.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque se emplea una cepa procedente de la
especie Bacillus megaterium o Bacillus simplex.
10. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque la cepa presenta las propiedades
características de las cepas Bacillus megaterium DSM 339,
Bacillus megaterium DSM 333 o Bacillus simplex DSM
14028.
11. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque como microorganismo del grupo de los
actinomicetos se emplea un microorganismo del género
Streptomyces.
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque como microorganismo del género
Streptomyces se emplea una cepa de la especie Streptomyces
argillaceus, Streptomyces scabies, Streptomyces mirabilis o
Streptomyces pseudovenecuelae.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque la cepa presenta las propiedades
características de las cepas de Streptomyces argillaceus DSM
14030, Streptomyces scabies DSM 14029, Streptomyces
mirabilis DSM 14078 o de Streptomyces pseudovenecuelae
DSM 14079.
14. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque como microorganismo de la clase de los
cigomicetos se emplea un microorganismo del género Zygorhynchus,
especialmente una cepa de la especie Zygorhynchus
moelleri.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque la cepa presenta las propiedades
características de la cepa Zygorhynchus moelleri DSM
14198.
16. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque como microorganismos de la clase de los
cigomicetos se emplea un microorganismo del género Mucor,
especialmente una cepa de la especie Mucor
circinelloides.
17. Procedimiento según la reivindicación 16,
caracterizado porque la cepa presenta las propiedades
características de la cepa Mucor circinelloides DSM
14199.
18. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 4 a 17, caracterizado porque se aíslan los
compuestos según una de las reivindicaciones 1 a 3.
19. Empleo de los compuestos según una de las
reivindicaciones 1 a 3 para la obtención de derivados de
espinosina.
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