ES2276948T3 - Ensayos pcr de hp multiplex fluorescente que usan fluoforos multiples. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para detectar la presencia de un subtipo de papilomavirus humano (HPV) en una muestra que contiene ácido nucleico que comprende: (a) amplificar el ácido nucleico en presencia de una polimerasa de ácido nucleico y tres series de oligonucleótidos; en el que cada serie de oligonucleótidos está constituida por (i) un cebador directo discriminatorio de PCR que hibrida con una primera región de un subtipo de HPV, (ii) un cebador inverso discriminatorio de PCR que hibrida una segunda región del subtipo de HPV secuencia abajo de la primera región, (iii) una sonda fluorescente marcada con una molécula extintor y un fluoróforo que emite energía a una única emisión máxima; dicha sonda hibridando una región del subtipo de HPV entre la primera y la segunda región; en el que cada serie de oligonucleótidos hibrida específicamente con un amplicón diferente de HPV derivado del mismo subtipo de HPV; (b) permitir a dicha polimerasa de ácido nucleico digerir cada sonda fluorescente durante laamplificación para disociar dicho fluoróforo de dicha molécula extintor; (c) detectar un cambio de fluorescencia tras la disociación del fluoróforo y la molécula extintor, correspondiendo el cambio de fluorescencia a la existencia de amplificación del ácido nucleico; y (d) determinar que la muestra es positiva para el subtipo de HPV si se detecta un cambio de fluorescencia en al menos dos emisiones máximas.

Description

Ensayos PCR de HPV múltiplex fluorescente que usan fluoróforos múltiples.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a ensayos basados en PCR para detectar la presencia de subtipos de papilomavirus humano (HPV) en muestras clínicas. Más específicamente, se refiere a un ensayo PCR múltiplex fluorescente, en el que se usan múltiples fluoróforos para detectar simultáneamente una pluralidad de loci de HPV en un único tubo de reacción de PCR.

Antecedentes de la invención

Existen más de 80 tipos de papilomavirus humanos (HPV) que causan una diversidad de fenotipos biológicos, desde verrugas proliferativas benignas hasta carcinomas malignos (para una revisión, ver McMurray y col., Int. J. Exp. Pathol. 82(1): 15-33 (2001)). Los tipos HPV6 y HPV11 son los más comúnmente asociados con verrugas benignas, mientras que HPV16 y HPV18 son los tipos de alto riesgo más frecuentemente asociados con lesiones malignas. Por lo tanto, la determinación del tipo específico de HPV en una muestra clínica es crítica para predecir el riesgo de desarrollar una enfermedad asociada con HPV.

Se han usado diversos procedimientos basados en ácidos nucleicos para identificar y cuantificar tipos específicos de HPV en muestras clínicas, tales como la detección de ácido nucleico viral por hibridación in situ, análisis por transferencia Southern, captura de híbridos o reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los procedimientos basados en PCR frecuentemente incluyen la amplificación de una secuencia diana de HPV específica seguida por la transferencia del amplicón resultante a una membrana y la detección con una sonda de oligonucleótidos marcada radiactivamente.

Otros procedimientos explotan la gran homología existente entre genes específicos de HPV de diferentes subtipos por medio del uso de cebadores de consenso disponibles comercialmente capaces de amplificar por PCR numerosos subtipos de HPV presentes en la muestra. La presencia de un subtipo específico de HPV es posteriormente identificada usando una sonda de oligonucleótidos específica de subtipo. Ver, por ejemplo, Kleter y col., Journal of Clinical Microbiology 37(8): 2508-2517 (1999); Gravitt y col., Journal of Clinical Microbiology 38(1): 357-361 (2000). De manera similar, los ensayos que usan cebadores degenerados de PCR toman ventaja de la homología entre subtipos de HPV, permitiendo la detección de un número mayor de tipos de HPV que los procedimientos que usan series de cebadores específicos. Ver, por ejemplo Harwood y col., Journal of Clinical Microbiology 37(11): 3545-3555 (1999). Tales ensayos también requieren experimentación adicional para identificar subtipos específicos de HPV.

Los procedimientos de PCR descritos anteriormente pueden estar asociados con diversos problemas. Por ejemplo, las diferencias en la eficacia de reacción entre subtipos de HPV pueden dar como resultado la amplificación desproporcionada de algunos subtipos en relación a otros. Además, el equilibrio de amplificación se inclinará hacia aquellos subtipos que existen en mayor cantidad de copias en una muestra, lo que consumirá los componentes de reacción de PCR, haciendo de esta manera menos probable la amplificación de los subtipos de HPV que se encuentran en menor proporción.

En la técnica también está descrito un procedimiento con 5' exonucleasa fluorogénica basado en PCR (Taq-Man PCR) que permite la detección de productos de PCR en tiempo real y elimina la necesidad de radiactividad. Ver por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 5.538.848; Holland y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 88: 7276-7280 (1991). Este procedimiento usa una sonda marcada que comprende un indicador de fluorescencia (fluoróforo) y un extintor, que hibrida con el ADN diana entre los cebadores de PCR. La excitación del fuoróforo de como resultado la liberación de una señal fluorescente por el fluoróforo que es extinguida por el extintor. Los amplicones pueden detectarse por la actividad de exonucleasa 5'-3' de la TAQ ADN polimerasa, que degrada el ADN de doble hebra que encuentra durante la extensión del cebador de PCR, liberando así al fluoróforo de la sonda. A continuación, la señal fluorescente no se extingue más y la acumulación de señal fluorescente, que está directamente correlacionada con la cantidad de ADN diana, puede detectarse en tiempo real con un fluorómetro automático.

Los ensayos Taq-Man PCR han sido adaptados para la detección de subtipos de HPV. Swan y col. (Journal of Clinical Microbiology 35(4): 886-891 (1997)) describen un ensayo con sonda fluorogénica que usa cebadores de HPV específicos de tipo que amplifican una porción del gen L1 en conjunción con sondas específicas de tipo. El ensayo de Swan y col. mide la señal fluorescente al final de una cantidad de ciclos de PCR (lectura de punto final) y no en tiempo real.

Josefsson y col. (Journal of Clinical Microbiology 37(3): 490-496 (1999)) informaron un ensayo Taq-Man que tiene como diana una porción altamente conservada del gen E1 en conjunción con sondas específicas de tipo marcadas con diferentes colorantes fluorescentes. Se amplificó una cantidad de tipos de HPV usando una mezcla de cebadores específicos y degenerados. Josefsson y col. usaron hasta tres sondas específicas de tipo por ensayo, que se diseñaron para detectar una poción del gen E1 de diferentes subtipos de HPV. A diferencia del ensayo de Swan y col., con el de Josefsson y col. se midió la acumulación de fluorescencia en tiempo real.

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Tucker y col. (Molecular Diagnosis 6(1): 39-47 (2001)) describen un ensayo que tiene como diana una región conservada que abarca la unión E6/E7. Al igual que el ensayo de Josefsson, Tucker y col. usan la detección en tiempo real y sondas fluorescentes específicas de tipo. Tucker y col. también usan PCR múltiplex para detectar simultáneamente las secuencias diana de HPV y los loci celulares de actina o globina en el mismo tubo de reacción.

Los procedimientos descritos anteriormente incluyen típicamente probar la presencia de un locus viral único en una muestra de ADN tal como el locus L1. Una desventaja de los ensayos de un único locus es que la gran homología entre genes específicos de HPV de un tipo de HPV con otro lleva a una aparición excesiva de resultados positivos falsos. Este nivel de homología hace difícil diseñar un ensayo de PCR que sea específico para un único tipo de HPV. Es necesario por lo tanto confirmar los resultados positivos realizando pruebas para detectar la presencia de varios loci de un único tipo de HPV. La experimentación adicional necesaria para verificar los resultados positivos es engorrosa y consume tiempo. Establecer el estatus de HPV de una muestra clínica para cuatro tipos diferentes de HPV consume típicamente 26-30 horas-persona.

Los ensayos de un único locus pueden también llevar a resultados negativos falsos. Está bien establecido que la relación entre el genoma de HPV y el ADN cromosómico del huésped puede cambiar durante el proceso tumorigénico de múltiples etapas (para una revisión, ver McMurray y col., Int. J. Exp. Path. 82: 15-33 (2001)). Las lesiones premalignas están frecuentemente asociadas con formas episómicas de ADN de HPV mientras que los tumores de estadíos tardíos tienen típicamente secuencias de HPV integradas. Como resultado de la integración correlacionada con estadíos avanzados de progresión de la enfermedad, el marco de lectura abierto de genes específicos de HPV, tal como el gen L1, puede afectarse. Tal trastorno en las secuencias de genes de HPV puede llevar a resultados negativos falsos en ensayos que tienen como diana la secuencia afectada.

A pesar del desarrollo de los ensayos de HPV anteriores, sería ventajoso desarrollar un ensayo altamente sensible y reproducible y que requiera pocas horas-persona en comparación con los procedimientos descritos en la técnica.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un ensayo PCR múltiplex fluorescente para detectar la presencia de un subtipo de HPV en una muestra que usa múltiples fluoróforos para detectar simultáneamente una pluralidad de loci de HPV del mismo subtipo de HPV.

Más específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de un subtipo de papilomavirus humano (HPV) en una muestra que contiene ácido nucleico que comprende:

amplificar el ácido nucleico en presencia de una polimerasa de ácido nucleico y una pluralidad de series de oligonucleótidos para producir una pluralidad de amplicones de PCR;

en el que cada serie de oligonucleótidos está constituida por (a) un cebador directo discriminatorio de PCR que hibrida con una primera región de un subtipo de HPV, (b) un cebador inverso discriminatorio de PCR que hibrida con una segunda región del subtipo de HPV secuencia abajo de la primera región, y (c) una sonda fluorescente marcada con una molécula extintor y un fluoróforo que emite energía a una única emisión máxima; dicha sonda hibridando con una región del subtipo de HPV entre la primera y la segunda región;

en el que cada serie de oligonucleótidos hibrida específicamente con un amplicón diferente de HPV derivado del mismo subtipo de HPV;

permitir a dicha polimerasa de ácido nucleico digerir cada sonda fluorescente durante la amplificación para disociar dicho fluoróforo de dicha molécula extintor;

detectar un cambio de fluorescencia tras la disociación del fluoróforo y el extintor, correspondiendo el cambio de fluorescencia a la existencia de amplificación del ácido nucleico; y

determinar que la muestra es positiva para el subtipo de HPV si se detecta un cambio de fluorescencia en al menos dos emisiones máximas.

En una forma de realización de esta invención, cada serie de oligonucleótidos de la pluralidad de series de oligonucleótidos es específica para un único gen del subtipo de HPV a detectar. En otras palabras, cada serie de oligonucleótidos del procedimiento de la presente invención hibrida con las secuencias de nucleótidos derivadas de un único gen de HPV del mismo subtipo. Por ejemplo, los cebadores y sondas de oligonucleótidos de una primera serie de oligonucleótidos hibridan con el gen E6, los cebadores y sondas de oligonucleótidos de una segunda serie de oligonucleótidos se hibridan con el gen E7 y los cebadores y sondas de oligonucleótidos de una tercera serie de oligonucleótidos hibridan con el gen L1. Como resultado, se crea una pluralidad de amplicones de PCR en el que cada amplicón de PCR es específico para un único gen de HPV del subtipo de HPV a detectar.

En una forma de realización alternativa de esta invención, el cebador directo discriminatorio de PCR y el cebador inverso discriminatorio de PCR de al menos una serie de oligonucleótidos son específicos para un gen diferente del mismo subtipo de HPV. Por ejemplo, un cebador directo discriminatorio hibrida con el gen E6 y un cebador inverso discriminatorio hibrida con el gen E7. Como resultado, al menos un amplicón de PCR comprende una secuencia de nucleótidos derivada de más de un gen. La sonda de oligonucleótidos específica para dicho amplicón puede hibridar, por ejemplo, con una secuencia de oligonucleótidos derivada del gen E6, una secuencia de nucleótidos derivada del gen E7, o una secuencia de nucleótidos que cruza el límite E6/E7.

En una forma de realización de preferencia de esta invención, se selecciona el subtipo de HPV del grupo constituido por: HPV6, HPV11, HPV16 y HPV18.

En otra forma de realización de preferencia del procedimiento de la presente invención, la cantidad de series de oligonucléotidos es tres y las series de oligonucleótidos hibridan específicamente con los genes E6, E7 y L1 de HPV. Una muestra es positiva para el subtipo de HPV para el que se prueba si se detectan dos o tres genes de entre E6, E7 y L1.

Otra forma de realización de esta invención usa una sonda de oligonucleótidos que comprende una secuencia de oligonucleótidos específica para un único tipo de HPV. Dicha sonda de oligonucleótidos puede unirse a amplicones específicos de HPV resultantes de la amplificación por PCR de ADN viral usando cebadores de oligonucleótidos específicos. En otra forma de realización de esta invención, dicha sonda de oligonucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID Nº 3, SEQ ID Nº 6, SEQ ID Nº 9, SEQ ID Nº 12, SEQ ID Nº 12, SEQ ID Nº 15, SEQ ID Nº 18, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 24, SEQ ID Nº 27, SEQ ID Nº 30, SEQ ID Nº 33 y SEQ ID Nº 36.

La presente invención también usa dichas sondas de oligonucleótidos que además comprenden un fluoróforo y una molécula extintor. En una forma de realización de esta invención, el fluoróforo se selecciona del grupo constituido por: FAM, JOE y TET y el extintor no es fluorescente. En una forma de realización especialmente de preferencia de esta invención, el extintor es BHQ1.

La presente invención también usa un par de cebadores para la amplificación por PCR de ácido nucleico de HPV, en la que ambos cebadores de PCR, directo e inverso, son discriminatorios. En una forma de realización de preferencia de la invención, las secuencias de nucleótidos del par de cebadores se seleccionan del grupo constituido por: SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº 5, SEQ ID Nº 7 y SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 10 y SEQ ID Nº 11, SEQ ID Nº 13 y SEQ ID Nº 14, SEQ ID Nº 16 y SEQ ID Nº 17, SEQ ID Nº 19 y SEQ ID Nº 20, SEQ ID Nº 22 y SEQ ID Nº 23, SEQ ID Nº 25 y SEQ ID Nº 26, SEQ ID Nº 28 y SEQ ID Nº 29, SEQ ID Nº 31 y SEQ ID Nº 32, y SEQ ID Nº 34 y SEQ ID Nº 35.

Como se usa en este documento, el término "oligonucleótido" se refiere a oligómeros lineales de monómeros naturales o modificados o conectores, incluyendo desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos, y similares, capaces de unirse específicamente a un polinucleótido diana mediante un patrón regular de interacciones monómero a monómero, tal como el apareamiento de bases de tipo Watson-Crick. Para los objetivos de esta invención, el término oligonucleótido incluye sondas de oligonucleótidos y cebadores de oligonucleótidos.

Como se usa en este documento, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido que es capaz de actuar como punto de inicio de síntesis a lo largo de una hebra complementaria cuando se coloca bajo condiciones en las que está catalizada la síntesis de un producto de extensión por cebador que es complementario a una hebra de ácido nucleico. Tales condiciones incluyen la presencia de cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato diferentes y un agente inductor de la polimerización tal como ADN polimerasa o transcriptasa inversa, en un tampón adecuado ("tampón" incluye componentes que son cofactores, o que afectan la fuerza iónica, pH, etc.) y a una temperatura adecuada. Como se usa en este documento, un cebador de oligonucleótidos puede presentarse en la naturaleza, como en una digestión por restricción purificada, o puede producirse sintéticamente. El cebador es de preferencia de hebra única para mayor eficacia en la amplificación.

Como se usa en este documento, "par de cebadores" se refiere a dos cebadores, un cebador directo y un cebador inverso, que son capaces de participar en la amplificación por PCR de un segmento de ácido nucleico en presencia de una polimerasa de ácido nucleico para producir un amplicón de PCR. Los cebadores que comprenden un par de cebadores pueden ser específicos para el mismo gen de HPV, dando como resultado un amplicón que está constituido por una secuencia de nucleótidos derivada de un único gen de HPV. Como alternativa, los cebadores que comprenden un par de cebadores pueden ser específicos para diferentes genes de HPV que residen dentro del genoma de HPV muy próximos el uno al otro, por lo tanto producen amplicones constituidos por una secuencia de nucleótidos derivada de más de un gen.

Como se usa en este documento, "único", en referencia a los fluoróforos de la presente invención, significa que cada fluoróforo emite energía a una emisión máxima diferente con relación a todos los demás fluoróforos usados en un ensayo en particular. El uso de fluoróforos con emisión máxima única permite la detección simultánea de energía fluorescente emitida por cada uno de una pluralidad de fluoróforos usados en el ensayo en particular.

Como se usa en este documento, el término "discriminatorio", usado en referencia a los cebadores y sondas de oligonucleótidos de la presente invención, significa que dichos cebadores y sondas son específicos para un único subtipo de HPV. Incluye cebadores y sondas de HPV específicos para un único subtipo de HPV, pero comparte cierta homología con otros subtipos de HPV. Los cebadores y sondas "discriminatorios" de la presente invención incluyen aquellos oligonucleótidos que no tienen homología 3' con otros subtipos de HPV en al menos un nucleótido o más. Se denomina a tal resto que es único para el subtipo específico de HPV en la posición específica y que actúa discriminando el subtipo de HPV de los otros en la alineación, como una "base discriminatoria". El término "discriminatorio", en referencia a oligonucleótidos, no incluye cebadores y sondas que son específicos para más de un subtipo de HPV, es decir aquellos que comparten homología total con más de un subtipo de HPV.

Como se usa en este documento, "amplicón" se refiere a un producto específico de una reacción de PCR, que se produce por amplificación por PCR de una muestra que comprende ácido nucleico en presencia de una polimerasa de ácido nucleico y un par de cebadores específicos. Un amplicón puede estar constituido por una secuencia de nucleótidos derivada de un único gen de un único subtipo de HPV o un amplicón puede estar constituido por una secuencia de nucleótidos derivada de más de un gen de un único subtipo de HPV.

Como se usa en este documento, "serie de oligonucleótidos" se refiere a una agrupación de un par de cebarores de oligonucleótidos y una sonda de oligonucleótidos que hibridan con una secuencia de nucleótidos específica para un único subtipo de HPV. Dicha serie de oligonucleótidos está constituida por: (a) un cebador directo discriminatorio que hibrida con una primera región de un subtipo de HPV; (b) un cebador inverso discriminatorio que hibrida con una segunda región del subtipo de HPV secuencia abajo de la primera región y (c) una sonda fluorescente marcada con un fluoróforo y un extintor, que hibrida con una región del subtipo de HPV entre los cebadores. En otras palabras, una serie de oligonucleótidos está constituida por una serie de cebadores de PCR específicos capaces de iniciar la síntesis de un amplicón específico para un único subtipo de HPV, y una sonda fluorescente que hibrida con el amplicón.

Como se usa en este documento, "pluralidad" significa dos o más.

Como se usa en este documento, "hibrida específicamente", en referencia a las series de oligonucleótidos, cebadores de oligonucleótidos o sondas de oligonucleótidos, significa que dichas series de oligonucleótidos, cebadores o sondas hibridan con un único subtipo de HPV.

Como se usa en este documento, "gen" significa un segmento de ácido nucleico involucrado en la producción de una cadena de polipéptidos. Incluye secuencias traducidas (región codificadora) y secuencias 5' y 3' no traducidas (regiones no codificadoras) así como también secuencias intervinientes (intrones) entre segmentos codificadores individuales (exones). Para los objetivos de esta invención, el genoma de HPV tiene nueve genes: L1, L2, y E1-E7.

Como se usa en este documento, "locus" se refiere a la posición en un cromosoma en el que reside el gen para una característica. El término locus incluye cualquiera de los alelos de un gen específico. También incluye genes homólogos de diferentes subtipos de HPV. Por ejemplo, los ensayos de PCR que detectan el gen L1 en HPV16 y HPV6 son ensayos de locus único, a pesar de la detección de secuencias de diferentes subtipos de HPV. Por el contrario, por ejemplo, los ensayos que detectan el gen L1 y el gen E1 de un único tipo de HPV son ensayos de locus múltiple, aunque se detecta un único subtipo de HPV.

Como se usa en este documento, "HPV" significa papilomavirus humano. "HPV" es un término general usado para referirse a cualquier subtipo de HPV, ya sea actualmente conocido o descrito posteriormente.

Como se usa en este documento, "fluoróforo" se refiere a una molécula indicadora de fluorescencia que, tras la excitación con una lámpara de tungsteno, mercurio, xenón o un láser, o un diodo emisor de luz, libera energía en forma de luz con un espectro definido. A través del procedimiento de fluorescencia tras transferencia de energía por resonancia (FRET), la luz emitida desde el fluoróforo puede excitar una segunda molécula cuya espectro de excitación se superpone con espectro de emisión del fluoróforo. La transferencia de energía de emisión del fluoróforo a otra molécula extingue la emisión del fluoróforo. Se conoce a la segunda molécula como molécula extintor. El término "fluoróforo" se usa indistintamente en este documento con el término "indicador de fluorescencia".

Como se usa en este documento, "extintor" o "molécula extintor" se refiere a una molécula que, cuando está unida a una sonda fluorescente que comprende un fluoróforo, es capaz de aceptar la energía emitida por el fluoróforo, extinguiendo de esta manera la emisión del fluoróforo. Un extintor puede ser fluorescente, que libera la energía aceptada como luz, o no fluorescente, que libera la energía aceptada como calor, y puede estar unido a cualquier región a lo largo de la sonda.

Como se usa en este documento, "extintor oscuro" se refiere a un extintor no fluorescente.

Como se usa en este documento, "sonda" se refiere a un oligonucleótido que es capaz de formar una estructura dúplex con una secuencia en un ácido nucleico diana, debido a la complementariedad de al menos una secuencia de la sonda con una secuencia en la región diana, o región a detectar. El término "sonda" incluye un oligonucleótido como se describió anteriormente, con o sin un fluoróforo y una molécula extintor unida. El término "sonda fluorescente" se refiere a una sonda que comprende un fluoróforo y una molécula extintor.

Como se usa en este documento, "FAM" se refiere al fluoróforo 6-carboxi-fluoresceína.

Como se usa en este documento, "JOE" se refiere al fluoróforo 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína.

Como se usa en este documento, "TET" se refiere al fluoróforo 5-tetracloro-fluoresceína.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de los cebadores y sondas de oligonucleótidos usadas en las reacciones de PCR TaqMan múltiplex, sus posiciones dentro del marco de lectura abierto (A del codon de inicio = 1), y la concentración final de cada oligo en la reacción de PCR múltiplex. Los seis cebadores para cada tipo de HPV se concentraron (100 veces) en una agregación de hexa-cebadores. Cada sonda se conservó como una agregación concentrada (100 veces).

La Figura 2 muestra una curva de concentración de sonda doblemente marcada TaqMan HPV16L1-FAM. Se determinó el ciclo de umbral medio (n = 3) \pm DE para concentraciones crecientes de sonda HPV16L1 en una reacción de PCR TaqMan de 50 \mul usando 100 copias de plásmido HPV16L1 como ADN molde. Las columnas con la misma letra no son significativamente diferentes (p>0,05) en base a los análisis ANOVA de una vía y de Tukey de comparación múltiple post-prueba.

La Figura 3 muestra una curva de concentración de sonda doblemente marcada TaqMan HPV16L1-FAM. Se determinó el \DeltaRn medio (Rn de la línea de base) (n = 3) \pm DE para concentraciones crecientes de sonda HPV16L1 en una reacción de PCR TaqMan de 50 \mul usando 100 copias de plásmido HPV16L1 como ADN molde. Las columnas con la misma letra no son significativamente diferentes (p>0,05) en base a los análisis ANOVA de una vía y de Tukey de comparación múltiple post-prueba.

La Figura 4 representa el ciclo de umbral de diferentes concentraciones de cebador HPV16L1. Se probaron tanto los cebadores sentido como los antisentido en combinación a diferentes concentraciones usando 10 copias de plásmido HPV16L1 como ADN molde.

La Figura 5 muestra el \DeltaRn de concentraciones diferentes de cebador HPV16L1. Se probaron tanto los cebadores sentido como los antisentido en combinación a diferentes concentraciones usando 10 copias de plásmido HPV16L1 como ADN molde.

La Figura 6 muestra la sensibilidad del ensayo de PCR múltiplex para HPV6. Los resultados (media \pm DE, n = 3) obtenidos con cada sonda específica están representados por diferentes símbolos: los cuadrados representan la sonda HPV6L1-FAM, los círculos representan la sonda HPV6E6-JOE y los triángulos representan la sonda HPV6E7-TET.

La Figura 7 muestra la sensibilidad del ensayo de PCR múltiplex para HPV11. Los resultados (media \pm DE, n = 3) obtenidos con cada sonda específica están representados por diferentes símbolos: los cuadrados representan la sonda HPV11L1-FAM, los círculos representan la sonda HPV11E6-JOE y los triángulos representan la sonda HPV11E7-TET.

La Figura 8 muestra la sensibilidad del ensayo de PCR múltiplex para HPV16. Los resultados (media \pm DE, n = 3) obtenidos con cada sonda específica están representados por diferentes símbolos: los cuadrados representan la sonda HPV16L1-FAM, los círculos representan la sonda HPV16E6-JOE y los triángulos representan la sonda HPV16E7-TET.

La Figura 9 muestra la sensibilidad del ensayo de PCR múltiplex para HPV18. Los resultados (media \pm DE, n = 3) obtenidos con cada sonda específica están representados por diferentes símbolos: los cuadrados representan la sonda HPV18L1-FAM, los círculos representan la sonda HPV18E6-JOE y los triángulos representan la sonda HPV18E7-TET.

La Figura 10 muestra la sensibilidad del ensayo de PCR múltiplex para HPV6 usando una dilución en serie de ADN viral purificado de un espécimen clínico humano. Los resultados (media \pm DE, n = 3) obtenidos con cada sonda específica están representados por diferentes símbolos: los cuadrados representan la sonda HPV6L1-FAM, los círculos representan la sonda HPV6E6-JOE y los triángulos representan la sonda HPV6E7-TET.

La Figura 11 muestra la sensibilidad del ensayo de PCR múltiplex para HPV11 usando una dilución en serie de ADN viral purificado de un espécimen clínico humano. Los resultados (media \pm DE, n = 3) obtenidos con cada sonda específica están representados por diferentes símbolos: los cuadrados representan la sonda HPV11L1-FAM, los círculos representan la sonda HPV11E6-JOE y los triángulos representan la sonda HPV11E7-TET.

La Figura 12 muestra la sensibilidad del ensayo de PCR múltiplex para HPV16 usando una dilución en serie de ADN viral purificado de un espécimen clínico humano. Los resultados (media \pm DE, n = 3) obtenidos con cada sonda específica están representados por diferentes símbolos: los cuadrados representan la sonda HPV16L1-FAM, los círculos representan la sonda HPV16E6-JOE y los triángulos representan la sonda HPV16E7-TET.

La Figura 13 muestra la sensibilidad del ensayo de PCR múltiplex para HPV18 usando una dilución en serie de ADN viral purificado de un espécimen clínico humano. Los resultados (media \pm DE, n = 3) obtenidos con cada sonda específica están representados por diferentes símbolos: los cuadrados representan la sonda HPV18L1-FAM, los círculos representan la sonda HPV18E6-JOE y los triángulos representan la sonda HPV18E7-TET.

Descripción detallada de la invención

Esta invención se refiere a un ensayo para detección de subtipos de HPV en una muestra clínica que reduce sustancialmente el riesgo de resultados negativos falsos en comparación con otros ensayos conocidos en la técnica.

Se conoce muy bien que la relación entre el genoma de HPV y el ADN cromosómico del huésped puede cambiar durante el proceso tumorigénico de múltiples etapas (para una revisión, ver McMurray y col., Int. J. Exp. Path. 82: 15-33 (2001)). Las lesiones premalignas están frecuentemente asociadas con formas episómicas de ADN de HPV mientras que los tumores de estadíos tardíos tienen típicamente secuencias de HPV integradas. Como resultado de la integración correlacionada con estadíos avanzados de progresión de la enfermedad, el marco de lectura abierto de genes específicos de HPV, tal como el locus L1, puede afectarse. Tal trastorno en las secuencias de genes de HPV puede llevar a resultados negativos falsos en ensayos que tienen como diana la secuencia afectada.

Por lo tanto, una forma de realización de preferencia de la invención provee un procedimiento para identificar la presencia de un subtipo específico de HPV en una muestra, en el que dicho procedimiento comprende simultáneamente la detección y amplificación de una pluralidad de genes de HPV de un único subtipo de HPV. Se considera que una muestra es positiva para el subtipo de HPV si se detectan la mayoría de la pluralidad de genes de HPV por medio de los procedimientos de la presente invención. Otra forma de realización de preferencia de la presente invención provee un ensayo para la presencia de un subtipo específico de HPV, en el que dicho ensayo comprende simultáneamente la detección y amplificación de tres genes de HPV de un único subtipo de HPV. Se considera que una muestra es positiva para el subtipo de HPV si se detectan al menos dos de los tres genes y es negativa para HPV si no se detecta ninguno de los tres genes por medio de los procedimientos de la presente invención. Dicho ensayo reduce el riesgo de obtener resultados negativos falsos asociados con ensayos que prueban un único locus de HPV. El procedimiento de la presente invención es altamente específico y reproducible.

El procedimiento de la presente invención para detectar subtipos de HPV en una muestra clínica también reduce sustancialmente el riesgo de obtener resultados positivos falsos en comparación con otros ensayos conocidos en la técnica. Tales resultados positivos falsos son causados por el alto grado de homología entre genes específicos de HPV comparados con los mismos genes de HPV de diferentes subtipos de HPV. Este nivel de homología hace difícil diseñar un ensayo de PCR que sea específico para un único subtipo de HPV. Cuando se usan otros procedimientos conocidos en la técnica que detectan loci únicos, por lo tanto, es necesario confirmar los resultados positivos probando en serie la presencia de varios loci de un único tipo de HPV. La experimentación adicional necesaria para verificar los resultados positivos es engorrosa y consume tiempo. Establecer el estatus de HPV de una muestra clínica para cuatro tipos diferentes de HPV consume típicamente 26-30 horas-persona.

A diferencia de los procedimientos disponibles en la técnica, la presente invención provee un procedimiento para detectar y amplificar simultáneamente una pluralidad de genes distintos de HPV de un único subtipo de HPV, reduciendo de esta manera sustancialmente la aparición de resultados positivos falsos asociados con los ensayos de un único locus. Además, el ensayo de la presente invención no requiere experimentación en serie para confirmar los resultados positivos y reduce en gran medida las horas-persona necesarias para determinar el estatus de HPV de una muestra. Los procedimientos de la presente invención son, por lo tanto, adaptables a selecciones de alto rendimiento de muestras clínicas para el ácido nucleico de subtipos específicos de HPV. Dichos procedimientos permiten seleccionar numerosas muestras simultáneamente, por ejemplo, utilizando un formato de PCR de 96 pocillos, pero mantienen una alta especificidad y precisión.

En la técnica se describió otro ensayo TaqMan para HPV que usa un formato de fluoróforos múltiples (Josefsson y col., Journal of Clinical Microbiology 37(3): 490-496 (1999)). Este procedimiento usa una mezcla de cebadores específicos y degenerados para amplificar una porción del gen E1 en un número de subtipos de HPV. Se usaron hasta tres sondas por ensayo, cada sonda comprendiendo un fluoróforo diferente y cada sonda detectando el gen E1 de un subtipo de HPV diferente. Se probó la sensibilidad del ensayo usando plásmidos conteniendo ADN de HPV y no en muestras clínicas.

Josefsson y col. describieron una sensibilidad sustancialmente reducida en la detección de ADN de HPV18 cuando se usaron simultáneamente sondas fluorescentes múltiples, cada una específica de un subtipo diferente de HPV, en comparación con un ensayo con una única sonda. De manera similar, se redujo un tanto la detección de HPV35 cuando se usó una mezcla de sondas para HPV16, HPV33 y HPV35, en comparación con una única sonda para HPV35. Además, se observó una sensibilidad algo reducida con número alto de copias cuando se usó un ensayo de sondas múltiples para detectar HPV16 y HPV31.

El procedimiento de la presente invención usa una pluralidad de sondas fluorescentes, cada sonda comprendiendo un fluoróforo que emite energía a una única emisión máxima con relación a otro fluoróforo usado en el ensayo en particular. Los ensayos provistos en este documento son altamente específicos y capaces de detectar menos de diez copias de ADN genómico de HPV en tres loci.

La linealidad y sensibilidad de cada ensayo de PCR de la presente invención se confirmó usando plásmidos específicos de loci en varias concentraciones desde 10 hasta 10^{6} copias/reacción. Los ensayos de PCR múltiplex para HPV6 (Fig. 6), HPV11 (Fig. 7), HPV16 (Fig. 8) y HPV18 (Fig. 9) fueron lineales dentro del intervalo de 10 a 10^{6} copias. La sensibilidad de los ensayos de PCR múltiplex para HPV para HPV6 (Fig. 10), HPV11 (Fig. 11), HPV16 (Fig. 12), y HPV18 (Fig. 13) se confirmó también usando ADN viral aislado a partir de muestras clínicas humanas.

La gran sensibilidad del ensayo, como exhiben los procedimientos de la presente invención, es crítica en la selección de muestras clínicas donde el número de copias de HPV puede ser bajo. Dado que las manifestaciones físicas de la infección por HPV están frecuentemente encubiertas y el período de latencia es prolongado, la infección por HPV puede no detectarse hasta que el paciente tenga un diagnóstico de neoplasia cervical intraepitelial (CIN), que si se deja sin tratamiento, puede progresar a carcinoma. Típicamente, las lesiones de grado más alto (CIN2, CIN3 y carcinoma) están asociadas con un número alto de copias de HPV, que pueden detectarse por medio de los procedimientos tradicionales conocidos en la técnica. Sin embargo, muchos ensayos actualmente en uso no son suficientemente sensibles o específicos para detectar un número bajo de copias de HPV. La gran sensibilidad es crítica, por lo tanto, para la detección temprana de HPV cuando el número de copias de HPV es bajo y la intervención terapéutica tiene más probabilidad de ser eficaz.

La presente invención se refiere más específicamente a un procedimiento para detectar la presencia de un subtipo de papilomavirus humano (HPV) en una muestra que contiene ácido nucleico que comprende:

amplificar el ácido nucleico en presencia de una polimerasa de ácido nucleico y una pluralidad de series de oligonucleótidos para producir una pluralidad de amplicones de PCR;

en el que cada serie de oligonucleótidos está constituida por (a) un cebador directo discriminatorio de PCR que hibrida con una primera región de un subtipo de HPV, (b) un cebador inverso discriminatorio de PCR que se hibrida con una segunda región del subtipo de HPV secuencia abajo del primer sitio, y (c) una sonda fluorescente marcada con una molécula extintor y un fluoróforo que emite energía a una única emisión máxima; dicha sonda hibridando con una región del subtipo de HPV entre la primera y la segunda región;

en el que cada serie de oligonucleótidos hibrida específicamente con un amplicón diferente de HPV derivado del mismo subtipo de HPV;

permitir a dicha polimerasa de ácido nucleico digerir cada sonda fluorescente durante la amplificación para disociar dicho fluoróforo de dicha molécula extintor;

detectar un cambio de fluorescencia tras la disociación del fluoróforo y el extintor, correspondiendo el cambio de fluorescencia a la existencia de amplificación del ácido nucleico; y

determinar que la muestra es positiva para el subtipo de HPV si se detecta un cambio de fluorescencia en al menos dos emisiones máximas.

En una forma de realización preferida de esta invención, cada serie de oligonucleótidos de la pluralidad de series de oligonucleótidos es específica para un único gen del subtipo de HPV a detectar. En otras palabras, cada serie de oligonucleótidos del procedimiento de la presente invención hibrida con las secuencias de nucleótidos derivadas de un único gen de HPV del mismo subtipo. Por ejemplo, los cebadores y sondas de oligonucleótidos de una primera serie de oligonucleótidos hibrida con el gen E6, los cebadores y sondas de oligonucleótidos de una segunda serie de oligonucleótidos hibridan con el gen E7 y los cebadores y sondas de oligonucleótidos de una tercera serie de oligonucleótidos hibridan con el gen L1. Como resultado, se crea una pluralidad de amplicones de PCR en el que cada amplicón de PCR es específico para un único gen de HPV del subtipo de HPV a detectar.

En una forma de realización alternativa de esta invención, el cebador directo discriminatorio de PCR y el cebador inverso discriminatorio de PCR de al menos una serie de oligonucleótidos son específicos para un gen diferente del mismo subtipo de HPV. Por ejemplo, un cebador directo discriminatorio hibrida con el gen E6 y un cebador inverso discriminatorio hibrida con el gen E7. Como resultado, al menos un amplicón de PCR comprende una secuencia de nucleótidos derivada de más de un gen. La sonda de oligonucleótidos específica para dicho amplicón puede hibridar, por ejemplo, con una secuencia de oligonucleótidos derivada del gen E6, una secuencia de nucleótidos derivada del gen E7, o una secuencia de nucleótidos que cruza el límite E6/E7.

El cambio en la fluorescencia puede detectarse por medio de un fluorómetro diseñado para realizar PCR Taq-Man con las siguientes características: un procedimiento de excitación para excitar el fluoróforo de la sonda fluorescente, un medio para calentar y enfriar las mezclas de reacción de PCR y un medio para detectar un cambio en la fluorescencia. Esta combinación de características, cuando se realiza por medio de un único instrumento de PCR Taq-Man, permite la detección en tiempo real de amplicones de PCR, lo que permite confirmar la presencia del producto de amplificación por PCR a través del examen de la cinética del aumento de fluorescencia en tiempo real. Los fluorómetros automatizados para realizar reacciones PCR Taq-Man se conocen en la técnica y pueden adaptarse para uso en este ensayo específico, por ejemplo, el iCycler de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA) y el Mx4000 de Stratagene (La Jolla, CA).

Los procedimientos de la presente invención se realizaron con un Instrumento de Detección de Secuencias ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Este instrumento usa un espectrógrafo para separar la emisión fluorescente (en base a la longitud de onda) en un patrón espaciado predecible a través de una cámara con dispositivo de carga acoplado (CCD). Una aplicación del Sistema de Detección de Secuencias del ABI PRISM® 7700 recoge las señales fluorescentes desde la cámara CCD y aplica algoritmos de análisis de datos.

Las polimerasas de ácido nucleico para uso en los procedimientos de la presente invención deben tener actividad exonucleasa 5'-3'. En la técnica se conocen varias polimerasas adecuadas, por ejemplo, polimerasas Taq (Thermus aquaticus), Tbr (Thermus brockianus) y Tth (Thermus thermophilus). La ADN polimerasa TAQ es la polimerasa de preferencia de la presente invención. La actividad exonucleasa 5'-3' está caracterizada por la degradación de ADN de doble hebra que se encuentra durante la extensión del cebador de PCR. De manera similar se degradará una sonda fluorescente hibridada con el amplicón, liberando de esta manera el fluoróforo del oligonucleótido. Tras la disociación del fluororóforo y el extintor, la fluorescencia emitida por el fluoróforo ya no se extingue, lo que da como resultado un cambio detectable en la fluorescencia. Durante el crecimiento exponencial del producto de PCR, la fluorescencia específica del amplicón aumenta hasta un punto en el que la aplicación de detección de secuencia, tras aplicar un algoritmo de múltiples componentes para generar un espectro, puede distinguirlo de la fluorescencia de base de las muestras sin amplificar. El Instrumento de Detección de Secuencias ABI PRISM® 7700 también comprende una aplicación informática, que determina el ciclo de umbral (Ct) para las muestras (ciclo en el que esta fluorescencia aumenta por encima de un umbral predeterminado). Las muestras negativas por PCR tienen un Ct igual al número total de ciclos realizados y las muestras positivas por PCR tienen un Ct menor que el número total de ciclos realizados.

La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de un subtipo de papilomavirus humano (HPV) en una muestra que contiene ácido nucleico. En una forma de realización de preferencia de esta invención, el subtipo de HPV se selecciona del grupo constituido por: HPV6, HPV11, HPV16 y HPV18.

En otra forma de realización de preferencia del procedimiento de la presente invención, el número de series de oligonucleótidos es impar y la muestra es positiva para el subtipo de HPV probado si se detecta un cambio de fluorescencia en la mayoría de los fluoróforos.

En aún otra forma de realización de preferencia del procedimiento de la presente invención para identificar la presencia de un subtipo específico de HPV en una muestra, el número de oligonucleótidos es tres. Se determina que una muestra es positiva para el subtipo de HPV si se detecta un cambio en al menos dos fluoróforos. Las muestras que son negativas para cada una de las tres emisiones máximas asociadas con cada fluoróforo son negativas para el subtipo de HPV. Esta invención provee un procedimiento para detectar la presencia de un papilomavirus humano en una muestra que contiene ácido nucleico donde el número de series de oligonucleótidos es tres y el subtipo de HPV se selecciona del grupo constituido por: HPV6, HPV11, HPV16 y HPV18.

En aún otra forma de realización de preferencia del procedimiento de la presente invención, el número de series de oligonucleótidos es tres, y las series de oligonucleótidos específicamente con los genes E6, E7 y L1 de HPV. Una muestra es positiva para el subtipo de HPV que se está ensayando si se detectan dos o tres de los genes E6, E7 o L1.

Las sondas y cebadores de oligonucleótidos usados en la presente invención pueden sintetizarse por medio de una cantidad de procedimientos. Ver, por ejemplo, Ozaki y col., Nucleic Acids Research 20: 5205-5214 (1992); Agrawal y col., Nucleic Acids Research 18: 5419-5423 (1990). Por ejemplo, las sondas de oligonucleótidos pueden sintetizarse en un sintetizador de ADN automatizado tal como el ABI 3900 DNA Synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA). También pueden usarse químicas alternativas, por ejemplo dando como resultado grupos de esqueleto no naturales, tales como fosforotioato, fosforoamidato, y similares, a condición de que no se vea afectada le eficacia de hibridación de los oligonucleótidos resultantes.

La etapa de amplificación por PCR usada en la presente invención puede realizarse por medio de técnicas convencionales bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); la Patente de EEUU Nº 4.683.202; y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis y col., eds., Academic Press, Inc., San Diego (1990) que están incorporados en este documento por referencia). Las condiciones de ciclización de PCR típicamente están constituidas por una etapa inicial de desnaturalización, que puede realizarse calentando la mezcla de reacción de PCR hasta una temperatura que varía desde aproximadamente 80ºC hasta aproximadamente 105ºC durante tiempos desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 minutos. A la desnaturalización por calor le sigue típicamente un número de ciclos, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 ciclos, cada ciclo usualmente comprende una etapa inicial de desnaturalización, seguida por una primera etapa de hibridación y finalizando con una primera etapa de extensión. La extensión enzimática de los cebadores por la polimerasa de ácido nucleico, por ejemplo polimerasa TAQ, produce copias del molde que pueden usarse como molde en ciclos posteriores.

Pueden usarse reacciones de PCR de "inicio en caliente" en conjunción con los procedimientos de la presente invención para eliminar el cebado falso y la generación de amplicones no específicos. Para tal fin, en una forma de realización de preferencia de esta invención, la polimerasa de ácido nucleico es ADN polimerasa AmpliTaq Gold y las condiciones de ciclización de PCR incluyen una reacción de PCR de "inicio en caliente". Dicha polimerasa es inactiva hasta su activación, que puede realizarse incubando los componentes de reacción de PCR a 95ºC durante aproximadamente 10 minutos previo a la ciclización por PCR. Los procedimientos de PCR que comprenden una etapa de incubación inicial similar son conocidos en la técnica como ensayos de PCR de "inicio en caliente".

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De preferencia, las sondas de oligonucleótidos usadas en la presente invención tienen una longitud en el intervalo desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 40 nucleótidos. De más preferencia, la sonda de oligonucleótidos tiene una longitud en el intervalo desde aproximadamente 18 hasta aproximadamente 30 nucleótidos. De mayor preferencia, la sonda de oligonucleótidos tiene una longitud en el intervalo desde aproximadamente 24 hasta aproximadamente 30 nucleótidos. La secuencia y longitud precisas de una sonda de oligonucleótidos usada en la invención depende en parte de la naturaleza del polinucleótido diana al que se une. La región de unión y la longitud pueden variarse para lograr propiedades de hibridación y fusión adecuadas para una forma de realización en particular.

De preferencia, el nucleótido 3' terminal de la sonda de oligonucleótidos se bloquea o se convierte en incapaz de extensión por medio de una polimerasa de ácido nucleico. Tal bloqueo se lleva a cabo convenientemente por medio de fosforilación del nucleótido 3' terminal, ya que la ADN polimerasa sólo puede agregar nucleótidos a un hidroxilo 3' y no a un fosfato 3'.

Resulta de preferencia que los cebadores y sondas de HPV usados en la presente invención no compartan homología total con otros subtipos de HPV. Debería diseñarse cada cebador usado en la presente invención de manera que no tengan homología 3' en al menos un nucleótido o más. Tal diseño de cebadores debería reducir sustancialmente la probabilidad de hibridación del cebador con el subtipo erróneo de HPV y prevenir la extensión del cebador si se produce la hibridación con el tipo de HPV para el que no se planificó ya que la ADN polimerasa TAQ sólo extiende un cebador a partir del extremo 3' y necesita que el extremo 3' esté adecuadamente hibridado.

Resulta también de preferencia que cada sonda contenga acoplamientos erróneos a lo largo del oligonucleótido que desestabilicen la unión del oligonucleótido a dianas no específicas de HPV. Sólo un acoplamiento erróneo a lo largo de la sonda de oligonucleótidos es necesario para discriminar entre loci. Dado que la sonda usada en la presente invención sólo se hidroliza y detecta cuando está unida al segmento de ADN que está amplificándose, la unión no específica de la sonda a un ADN secuenciado que no está siendo amplificado no se detecta.

Para este fin, la presente invención usa un par de cebadores para la amplificación por PCR de ácido nucleico de HPV, en el que ambos cebadores de PCR, directo e inverso, son discriminatorios. En una forma de realización de preferencia de la invención, las secuencias de nucleótidos del par de cebadores se seleccionan del grupo constituido por: SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº 5, SEQ ID Nº 7 y SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 10 y SEQ ID Nº 11, SEQ ID Nº 13 y SEQ ID Nº 14, SEQ ID Nº 16 y SEQ ID Nº 17, SEQ ID Nº 19 y SEQ ID Nº 20, SEQ ID Nº 22 y SEQ ID Nº 23, SEQ ID Nº 25 y SEQ ID Nº 26, SEQ ID Nº 28 y SEQ ID Nº 29, SEQ ID Nº 31 y SEQ ID Nº 32, y SEQ ID Nº 34 y SEQ ID Nº 35.

Resulta fácilmente evidente para aquellos expertos en la técnica que pueden diseñarse otros cebadores de oligonucleótidos discriminatorios que amplifiquen selectivamente genes de HPV de un subtipo específico. Dichos cebadores de oligonucleótidos pueden tener la misma longitud que aquellos descritos en este documento o pueden tener entre 12 y 45 nucleótidos. De más preferencia, la longitud de los cebadores de oligonucleótidos de la presente invención está en el intervalo de 18 a 30 nucleótidos. De mayor preferencia, la longitud de los cebadores de oligonucleótidos de la presente invención está en el intervalo de 19 a 29 nucleótidos.

Resulta también de preferencia que cada sonda Taq-Man contenga acoplamientos erróneos a lo largo del oligonucleótido que desestabilicen la unión del oligonucleótido a dianas no específicas de HPV. Sólo un acoplamiento erróneo a lo largo de la sonda de oligonucleótidos es necesario para discriminar entre loci. Dado que las sondas usadas en la presente invención sólo se hidrolizan y detectan cuando están unidas al segmento de ADN que está amplificándose, la unión no específica de la sonda a un ADN secuenciado que no está siendo amplificado no se detecta.

Para este fin, una forma de realización de preferencia de la presente invención usa una sonda de oligonucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos específica para un único tipo de HPV. Dicha sonda de oligonucleótidos puede unirse a amplicones específicos de HPV que resultan de la amplificación por PCR de ADN viral usando cebadores de oligonucleótidos específicos. En otra forma de realización de esta invención, dichas sondas de oligonucleótidos comprenden una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID Nº 3, SEQ ID Nº 6, SEQ ID Nº 9, SEQ ID Nº 12, SEQ ID Nº 12, SEQ ID Nº 15, SEQ ID Nº 18, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 24, SEQ ID Nº 27, SEQ ID Nº 30, SEQ ID Nº 33 y SEQ ID Nº 36. La presente invención también se refiere a dichas sondas de oligonucleótidos que además comprenden un fluoróforo y una molécula extintor.

Los fluoróforos usados en la presente invención pueden estar unidos a la sonda en cualquier región de la sonda, incluyendo el extremo 5', el extremo 3' o internamente entre ambos extremos, es decir dicho fluoróforo puede estar unido a cualquiera de los nucleótidos que comprenden la secuencia específica de nucleótidos capaz de hibridar con el gen específico de HPV para cuya detección se diseñó la sonda. En una forma de realización de preferencia de esta invención, el fluoróforo está unido a un nucleótido 5' terminal de la secuencia específica de nucleótidos y el extintor está unido al nucleótido 3' terminal de la secuencia específica de nucleótidos.

De preferencia, los fluoróforos son colorantes orgánicos fluorescentes derivatizados para unirse al carbono 3' o al carbono 5' terminal de la sonda por medio de un fragmento de enlace. De preferencia, las moléculas extintor son también colorantes orgánicos, que pueden o no ser fluorescentes, dependiendo de la forma de realización de la invención. Por ejemplo, en una forma de realización de preferencia de la invención, la molécula extintor no es fluorescente. Generalmente, aunque la molécula extintor sea fluorescente o simplemente libere la energía transferida desde el indicador por descomposición no radiactiva, la banda de absorción del extintor debería superponerse sustancialmente con la banda de emisión fluorescente de la molécula indicadora. En este documento, se refiere a las moléculas extintor no fluorescentes que absorben energía de moléculas indicadoras excitadas, pero que no liberan la energía radiactivamente, como "extintores oscuros", "moléculas extintores oscuros", "extintores no fluorescentes" o "moléculas extintor no fluorescentes".

En la técnica se describen varios pares de fluoróforos-extintor. Ver, por ejemplo Pesce y col., editores, Fluorescence Spectroscopy, Marcel Dekker, Nueva York, (1971); White y col., Fluorescence Analysis: A Practical Approach, Marcel Dekker, Nueva York, (1970); y similares. La bibliografía también incluye referencias que proveen listas exhaustivas de moléculas fluorescentes y no fluorescentes y sus propiedades ópticas relevantes, por ejemplo Berlman, Handbook of Fluorescence Sprectra of Aromatic Molecules, 2º Edición, Academic Press, Nueva York, (1971). Además, en la bibliografía hay gran cantidad de consejos para derivatizar moléculas indicadoras y extintor para la unión covalente por medio de grupos reactivos comunes que pueden agregarse a un oligonucleótido. Ver, por ejemplo las Patentes de EEUU Nº 3.996.345 y Nº 4.351.760.

Ejemplos de pares fluoróforo-extintor pueden seleccionarse de colorantes de xanteno, incluyendo fluoresceínas, y colorantes de rodamina. Muchas formas adecuadas de estos compuestos están ampliamente disponibles comercialmente con sustituyentes en sus restos fenilo que pueden usarse como sitio de unión o como funcionalidad de unión para unirse a un oligonucleótido. Otro grupo de compuestos fluorescentes son las naftilaminas, que tienen un grupo amino en posición alfa o beta. Dentro de tales compuestos naftilamino se incluyen 1-dimetilaminonaftil-5-sulfonato, 1-anilino-8-naftalensulfonato y 2-p-touidinil-6-naftalensulfonato. Otros colorantes incluyen 3-fenil-7-isocianatocumarina, acridinas, tales como 9-isotiocianatoacridina y naranja de acridina; N-(p-(2-benzoxazolil)fenil)maleimida; benzoxadiazoles, estilbenos, pirenos, y similares.

De preferencia, el fluoróforo y las moléculas extintor se seleccionan de colorantes de fluoresceína y rodamina. En la técnica se conocen estos colorantes y los procedimientos para unirlos a oligonucleótidos. Ver, por ejemplo Marshall, Histochemical J. 7: 299-303 (1975); y la Patente de EEUU Nº 5.188.934. En una forma de realización de preferencia de la invención, los fluoróforos se seleccionan del grupo constituido por: 6-carboxifluoresceína (FAM), 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína (JOE) y 5-tetraclorofluoresceína (TET).

En una forma de realización de preferencia de la invención, la molécula extintor no es fluorescente. Una molécula extintor de preferencia de la presente invención es Black Hole Quencher^{TM} 1 (BHQ1), un extintor no fluorescente desarrollado por Biosearch Technologies (Novato, CA). En otra forma de realización de preferencia, los fluoróforos se seleccionan del grupo constituido por: FAM, JOE, y TET y la molécula extintor es BHQ1.

De preferencia, se usan en restos de enlace comercialmente disponibles que pueden unirse a un oligonucleótido durante la síntesis, por ejemplo disponible en Clontech Laboratories (Palo Alto, CA).

La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de HPV6 en una muestra que contiene ácido nucleico que comprende:

amplificar el ácido nucleico en presencia de una polimerasa de ácido nucleico y tres series de oligonucleótidos;

la primera serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 1, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 2, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 3, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

la segunda serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 4, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 5, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 6, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

la tercera serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 7, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 8, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 9, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

permitir a dicha polimerasa de ácido nucleico digerir cada sonda durante la amplificación para disociar dicho fluoróforo de dicha molécula extintor;

detectar un cambio de fluorescencia tras la disociación del fluoróforo y el extintor, correspondiendo el cambio de fluorescencia a la existencia de amplificación de ácido nucleico; y

determinar que la muestra es positiva para el subtipo HPV6 si se detecta un cambio a la fluorescencia con al menos dos sondas.

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En una forma de realización de preferencia del procedimiento para detectar la presencia de HPV6 en una muestra descrito anteriormente, el fluoróforo de la primera serie de oligonucleótidos es FAM, el fluoróforo de la segunda serie de oligonucleótidos es JOE y el fluoróforo de la tercera serie de oligonucleótidos es TET.

La presente invención además se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de HPV11 en una muestra que contiene ácido nucleico que comprende:

amplificar el ácido nucleico en presencia de una polimerasa de ácido nucleico y tres series de oligonucleótidos;

la primera serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 10, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 11, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 12, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

la segunda serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 13, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 14, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 15, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

la tercera serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 16, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 17, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 18, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

permitir a dicha polimerasa de ácido nucleico digerir cada sonda durante la amplificación para disociar dicho fluoróforo de dicha molécula extintor;

detectar un cambio de fluorescencia tras la disociación del fluoróforo y el extintor, correspondiendo el cambio de fluorescencia a la existencia de amplificación de ácido nucleico; y

determinar que la muestra es positiva para el subtipo HPV11 si se detecta un cambio en la fluorescencia con al menos dos sondas.

En una forma de realización de preferencia del procedimiento para detectar la presencia de HPV11 en una muestra descrito anteriormente, el fluoróforo de la primera serie de oligonucleótidos es FAM, el fluoróforo de la segunda serie de oligonucleótidos es JOE y el fluoróforo de la tercera serie de oligonucleótidos es TET.

La presente invención además se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de HPV16 en una muestra que contiene ácido nucleico que comprende:

amplificar el ácido nucleico en presencia de una polimerasa de ácido nucleico y tres series de oligonucleótidos;

la primera serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 19, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 20, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 21, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

la segunda serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 22, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 23, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 24, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

la tercera serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 25, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 26, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 27, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

permitir a dicha polimerasa de ácido nucleico digerir cada sonda durante la amplificación para disociar dicho fluoróforo de dicha molécula extintor;

detectar un cambio de fluorescencia tras la disociación del fluoróforo y el extintor, correspondiendo el cambio de fluorescencia a la existencia de amplificación de ácido nucleico; y

determinar que la muestra es positiva para el subtipo HPV16 si se detecta un cambio en la fluorescencia con al menos dos sondas.

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En una forma de realización de preferencia del procedimiento para detectar la presencia de HPV16 en una muestra descrito anteriormente, el fluoróforo de la primera serie de oligonucleótidos es FAM, el fluoróforo de la segunda serie de oligonucleótidos es JOE y el fluoróforo de la tercera serie de oligonucleótidos es TET.

La presente invención además se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de HPV18 en una muestra que contiene ácido nucleico que comprende:

amplificar el ácido nucleico en presencia de una polimerasa de ácido nucleico y tres series de oligonucleótidos;

la primera serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 28, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 29, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 30, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

la segunda serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 31, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 32, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 33, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

la tercera serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 34, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 35, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 36, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

permitir a dicha polimerasa de ácido nucleico digerir cada sonda durante la amplificación para disociar dicho fluoróforo de dicha molécula extintor;

detectar un cambio de fluorescencia tras la disociación del fluoróforo y el extintor, correspondiendo el cambio de fluorescencia a la existencia de amplificación de ácido nucleico; y

determinar que la muestra es positiva para el subtipo HPV18 si se detecta un cambio en la fluorescencia con al menos dos sondas.

En una forma de realización de preferencia del procedimiento para detectar la presencia de HPV18 en una muestra descrito anteriormente, el fluoróforo de la primera serie de oligonucleótidos es FAM, el fluoróforo de la segunda serie de oligonucleótidos es JOE y el fluoróforo de la tercera serie de oligonucleótidos es TET.

Habiendo descrito las formas de realización de preferencia de la invención con referencia a los dibujos que acompañan, debe entenderse que la invención no está limitada a aquellas formas de realización precisas y que un experto en la técnica puede realizar diversos cambios y modificaciones en las mismas sin apartarse del alcance de la invención como está definido en las reivindicaciones.

Los siguientes ejemplos ilustran, pero no limitan la invención.

Ejemplo 1 Diseño del Cebador Discriminatorio de HPV

Se diseñaron cebadores de PCR para cada subtipo de HPV usando Primer Express versión 1.0 (PE Applied
Biosystems, Foster City, CA). Se alinearon las secuencias de nucleótidos específicas del gen de los marcos de lectura abiertos de los loci L1, E6 y E7 de los subtipos HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33 y HPV45 usando ClustalW versión 1.7 (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Alemania) y un ordenador personal Power Macintosh G4 (Apple Computer). Posteriormente se importó el archivo de alineación en formato Phylip dentro del módulo Allelic Discrimination de la aplicación Primer Express y se marcó el subtipo específico de HPV.

Se seleccionaron los pares de cebadores que cumplen con los siguientes criterios: T_{m} = 59-61ºC, tamaño de amplicón: 100-250 pb, contenido de GC entre 20 y 80%, un resto guanosina o citosina en la posición 3' terminal y la base discriminatoria dentro de las tres bases del extremo 3' terminal. La base discriminatoria es el resto que es único para el subtipo específico de HPV en la posición específica y actúa para discriminar el subtipo de HPV de otros en la alineación. Se seleccionaron varios pares de cebadores de manera que tanto el cebador sentido como el antisentido fueran discriminatorios (ver Figura 1).

Se analizaron las secuencias de los cebadores para verificar que fueran únicos y la formación de dímeros por medio de Amplify versión 1.2 para Macintosh (William Engels, Genetics Department, Universidad de Wisconsin). Se seleccionó un par de cebadores óptimo para cada loci en el que no había formación aparente de dímeros y, se predijo la hibridación de cada cebador a una y sólo una región del loci diana. Una vez que se definió un amplicón por un par de cebadores, se diseñó una sonda de oligonucleótidos doblemente marcada que cumple con los siguientes criterios: T_{m}= 68-70ºC, longitud \leq30 nt, no más de tres del mismo nucleótido, sin resto guanosina en el extremo 5' terminal y más restos citosina que restos guanosina (ver Figura 1).

La reactividad cruzada predicha para cada cebador y sonda con otros subtipos conocidos de HPV se evaluó por medio de selección BLAST de cada secuencia contra la base de datos NCBI Genbank. La mayoría de los cebadores y sondas devolvieron aciertos para el HPV específico para el que se diseñaron y no comparten ninguna homología con otros subtipos de HPV. El cebador antisentido HPV6L1 comparte alguna homología con HPV3, HPV26, HPV28 y HPV70. La sonda HPV6L1 TaqMan comparte alguna homología con HPV45, HPV54, HPV59, HPV66 y HPV83. El cebador antisentido HPV6E6 comparte homología con HPV11. El cebador antisentido HPV6E7 comparte alguna homología con HPV2. La sonda HPV6E7 TaqMan comparte alguna homología con HPV11, HPV42, HPV44, HPV55 y HPV74. El cebador sentido HPV11L1 comparte alguna homología con HPV6. La sonda HPV11L1 TaqMan comparte alguna homología con HPVAE8, HPV6, HPV27, HPV31, HPV34, HPV55, HPV64, y HPV71. El cebador antisentido HPV11E6 comparte alguna homología con HPV57. La sonda HPV11E6 TaqMan comparte alguna homología con HPV6. El cebador sentido HPV11E7 comparte alguna homología con HPV6, HPV13, HPV44, HPV55, y HPV74. La sonda HPV11E7 TaqMan comparte alguna homología con HPV6 y HPV13. El cebador sentido HPV16L1 comparte alguna homología con HPV68. El cebador antisentido HPV16L1 comparte alguna homología con HPV35, HPV35H, HPV42 y HPV52. La sonda HPV16L1 TaqMan comparte alguna homología con HPV7, HPV10, HPV35, y HPV35H. El cebador antisentido HPV18E6 comparte alguna homología con HPV85. El cebador sentido HPV18E7 comparte alguna homología con HPV6, HPV39 y HPV39. La sonda HPV18E7 TaqMan comparte alguna homología con HPV59.

Ninguno de los cebadores y sondas de HPV diseñados comparten homología total con otros subtipos de HPV. En cada cebador falta homología 3' en al menos un nucleótido o más lo que sugiere que aunque hibridara con el subtipo erróneo de HPV, no sería extendido ya que la ADN polimerasa TAQ sólo extiende un cebador desde el extremo 3' y requiere que el extremo 3' esté adecuadamente hibridado. Cada sonda TaqMan contiene acoplamientos erróneos a lo largo del oligonucleótido que desestabilizan la unión del oligonucleótido a dianas no específicas. Es necesario sólo un acoplamiento erróneo a lo largo de la sonda de oligonucleótidos para discriminar entre loci. Además la sonda sólo se hidroliza y detecta cuando está unida al segmento de ADN que está amplificándose. La unión no específica de la sonda a un ADN secuenciado que no está siendo amplificado no se detecta.

Ejemplo 2 Síntesis y Marcado de Cebadores y Sondas de Oligonucleótidos

Los cebadores de oligonucleótidos se sintetizaron de la manera usual y se purificaron por HPLC en fase inversa Sigma Genosys (The Woodlands, TX). Las sondas de oligonucleótidos doblemente marcadas se sintetizaron de la manera usual y se purificaron por HPLC en fase inversa Biosearch Technologies (Novato, CA). Las sondas fluorescentes de oligonucleótidos para los loci L1 se marcaron en 5' con 6-carboxifluoresceína (FAM), las sondas fluorescentes de oligonucleótidos para los loci E6 se marcaron en 5' con 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína (JOE) y las sondas fluorescentes de oligonucleótidos para los loci E7 se marcaron en 5' con 5-tetraclorofluoresceína (TET), disponible en Molecular Probes (Eugene, OR). Todas las sondas de oligonucleótidos se marcaron en 3' con BHQ1, un extintor no fluorescente desarrollado por Biosearch Technologies (Novato, CA). Los cebadores y sondas liofilizados se reconstituyeron en 1X tampón TE pH 8,0 (Roche Molecular Biochemicals) y se determinó la concentración midiendo la D.O. a 260 nm en un espectrofotómetro Beckman 600DU y calculando la concentración usando un coeficiente de extinción molar específico de oligonucleótido.

Ejemplo 3 Optimización de la Reacción Múltiplex

Se optimizaron las concentraciones de cebadores y sondas de manera tal que pudieran detectarse y amplificarse simultáneamente tres loci separados en un único tubo de PCR sin favorecer una reacción sobre otra. Las concentraciones de sondas fluorescentes de oligonucleótidos se optimizaron por separado calculando el ciclo de umbral (Ct) y \DeltaRn de concentraciones crecientes de sonda usando 100 copias de molde de ADN (cada locus clonado en un plásmido) con el instrumento de Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM® 7700.

Se amplificaron las muestras en una mezcla de reacción de 50 \mul conteniendo 25 \mul de TaqMan Universal PCR 2X PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), concentración final de cada cebador 200 nM, 100 copias de moldes de ADN de plásmido, agua tratada con DEPC (Ambion) y una variedad de concentraciones (25-200 nM) de sondas de oligonucleótidos marcadas fluorescentemente. Las condiciones de ciclización están constituidas por una etapa inicial de 50ºC durante 2 minutos seguida por 95ºC durante 10 minutos y 45 ciclos de 94ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto.

En la mezcla TaqMan Universal PCR Master Mix está incluido dUTP (en vez de dTTP) y uracil-N-glicosilasa (UNG), una enzima que se activa a 50ºC y escinde los ácidos nucleicos que contienen uracilo. Ver Longo y col., Gene 93: 125-128 (1990). UNG previene la reamplificación de productos de PCR que permanecen de una etapa a otra en los experimentos subsiguientes.

Se seleccionó una concentración de cada sonda que exhibe el Ct más bajo (por ejemplo HPV16L1; Figura 2 y un \DeltaRn de aproximadamente 1 (por ejemplo HPV16L1; Figura 3). Se optimizaron las concentraciones de cebadores para cada locus calculando el Ct y \DeltaRn de cada combinación de concentraciones de cebadores en un ensayo de matrices usando la concentración previamente determinada de sonda de oligonucleótidos específicas de loci y diez copias de moldes de ADN de plásmido. Se seleccionaron las concentraciones de los cebadores con sentido y antisentido que exhibieron el Ct más bajo (por ejemplo HPV16L1; Figura 4) y \DeltaRn máximo (por ejemplo HPV16L1; Figura 5).

Posteriormente se probaron los cebadores y las sondas juntos con el agregado de ADN polimerasa AmpliTaq Gold extra (0,75 U/pocillo, Applied Biosystems, Foster City, CA). Se agregó la ADN polimerasa adicional porque la mezcla TaqMan Universal 2X PCR Master Mix, que ya contiene ADN polimerasa AmpliTaq Gold, se optimizó para reacciones dobles y no para reacciones triples. La ADN polimerasa adicional suplementa la ADN polimerasa en la mezcla maestra 2 veces y refuerza la reacción.

Se confirmó la linealidad y sensibilidad de cada ensayo de PCR usando plásmidos específicos de loci en concentraciones variables desde 10 hasta 10^{6} copias/reacción. Los ensayos PCR múltiplex de HPV6 (Figura 6), HPV11 (Figura 7), HPV16 (Figura 8) y HPV18 (Figura 9) fueron lineales dentro del intervalo de 10 a 10^{6} copias. También se confirmó la sensibilidad de los ensayos PCR múltiplex para HPV6 (Figura 10), HPV11 (Figura 11), HPV16 (Figura 12) y HPV18 (Figura 13) usando diluciones seriales de ADN viral de HPV aislado de especímenes clínicos humanos (ver Ejemplo 5).

Ejemplo 4 Aislamiento de ADN

Se aisló el ADN de especímenes clínicos humanos usando el Equipo QIAamp de 96-pocillos DNA Spin Blood Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante con las siguientes modificaciones: la cantidad de proteasa Qiagen se aumentó hasta 0,5 mg/pocillo en vez de los 0,4 mg/pocillo recomendados, la placa de filtro QIAmp se centrifugó en seco en un cabezal de centrífuga "square-well block" limpio en una Centrífuga Sigma (Qiagen Inc, Valencia, CA) durante 10 min. a 6000 RPM y se eluyó el ADN con tampón de elución precalentado (70ºC).

Ejemplo 5 Selección de Muestras Clínicas Humanas

Se preparó una mezcla maestra conteniendo todos los componentes de reacción de PCR excepto el ADN molde y se cargó en placas de reacción ópticas de 96 pocillos (46 \mul/pocillo, Applied Biosystems, Foster City, CA) para cada tipo de HPV a probar. Se agregaron cuatro \mul de ADN purificado a cada pocillo conteniendo la mezcla maestra Múltiplex PCR y se cubrieron los pocillos con cubiertas ópticas para PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA). Tras la centrifugación a 3000 RPM durante 2 minutos en una centrífuga Sigma, se transfirió la placa de PCR de 96 pocillos al ABI PRISMS 7700 Sequence Detection Systems Instrument (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Se inició la ciclización por PCR y la recogida de datos y se controló por medio de un molde prediseñado específico para cada subtipo de HPV. Cuando se completó la ciclización por PCR, se guardaron los datos electrónicamente y se descartó la placa de amplificación. Posteriormente se analizaron los datos usando la aplicación Sequence Detection Systems (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se establecieron manualmente los umbrales para cada capa de colorante; el umbral para el colorante FAM se estableció en 0,05, el umbral del colorante JOE se estableció en 0,03 y el del colorante TET se estableció en 0,04. Posteriormente se exportaron los datos electrónicamente a un archivo de texto delimitado por tabulaciones. Posteriormente se importaron el archivo de texto y el archivo conteniendo los nombres de las muestras a una hoja de cálculo Microsoft EXCEL específica de subtipo de HPV mediante una macro que controla la seguridad de que los datos están en el tipo correcto. Las fórmulas surgidas de las hojas de cálculo cerradas calculan la positividad de PCR de las capas de colorantes en base al ciclo de umbral de cada muestra. Posteriormente se compilaron los datos de las tres capas de colorantes por hoja de cálculo, lo que calcula un consenso de positividad de PCR para HPV de cada muestra en base a las reglas establecidas anteriormente.

Las Figuras 10-13 muestran la sensibilidad de los ensayos de PCR múltiplex de HPV para HPV6, HPV11, HPV16 y HPV18, respectivamente, usando ADN viral de HPV aislado de especímenes clínicos humanos en diluciones en serie. Se hicieron diluciones en serie de concentraciones altas de ADN viral de muestras clínicas 10 veces en un estado basal de ADN genómico humano y se procesaron en el ensayo de PCR múltiplex adecuado. Tras una dilución de 100.000 a 1.000.000 (número de copias aproximado de 1-10), el ADN viral fue aún detectable. La detección viral con número bajo de copias fue lineal en todo el intervalo de diluciones.

<110> Merck & Co., Inc.

\hskip1cm Jansen, Kathrin

\hskip1cm Taddeo, Frank J.

\hskip1cm Li, Weili

\hskip1cm DiCello, Anthony C.

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<120> Ensayos de PCR MÚLTIPLEX FLUORESCENTES PARA HPV USANDO MÚLTIPLES FLUORÓFOROS

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<130> 20847-PCT

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<150> US 60/314.383

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<151> 23-08-2001

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<160> 36

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR HPV6 L1

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gactcgtctc tttttgatcc caca

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24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Cebador de PCR HPV6 L1

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<400> 2

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taggaaagga tgtccactta caccc

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25

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Sonda HPV6 L1

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caacgtttgg tatgggcatg cacaggccta

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30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Cebador de PCR HPV6 E6

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taaaggtcct gtttcgaggc g

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21

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR HPV6 E6

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<400> 5

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tgacacaggt agcaccgaat tag

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23

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Sonda HPV6 E6

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atccatatgc agcctgcgcg tgctgcc

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27

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR HPV6 E7

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acgaagtgga cggacaagat tc

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR HPV6 E7

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tcccaacaga agctgttgca ct

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Sonda HPV6 E7

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ctgtacactg cacaaccagt cgaacgttgc

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR HPV11 L1

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cctccaccaa atggtacact ggag

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR HPV11 L1

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<400> 11

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cctccaccaa atggtacact ggag

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24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Sonda HPV11 L1

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29

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR HPV11 E6

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tttgcacact ctgcaaattc agtgc

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25

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR HPV11 E6

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26

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Sonda HPV11 E6

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30

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR HPV611 E7

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<400> 16

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agctcagaag atgaggtgga caag

\hfill

24

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR HPV11 E7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcccagcaa aaggtcttgt ag

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda HPV11 E7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cactccacaa ccagtcggac gttgct

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR HPV16 L1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccagataca cagcggctgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR HPV16 L1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aataaaggat ggccactaat gccc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda PCR HPV16 L1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatggctgac cacgacctac ctcaaca

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR HPV16 E6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgacccaga aagttaccac ag

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR HPV16 E6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatctctat atactatgca taaatcccg

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda HPV16 E6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacctcacgt cgcagtaact gttgcttg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR HPV16 E7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaaccggac agagcccatt ac

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR HPV16 E7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcccattaac aggtcttcca aag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda HPV16 E7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcacaaccg aagcgtagag tcacactt

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR HPV18 L1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggttcagg ctggattgc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR HPV18 L1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcttggcagg tttagaagac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda HPV18 L1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctcgcaaac gttctgctcc atctgccac

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR HPV18 E6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agctgggcac tatagaggc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR HPV18 E6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgtttctc tgcgtcgttg g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda HPV18 E6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccattcgtgc tgcaaccgag cacgac

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR HPV18 E7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaccacaac gtcacacaat g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR HPV18 E7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagaaacagc tgctggaatg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda HPV18 E7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctgctgagc tttctactac tagctcaatt ctg

\hfill

33

Claims (13)

1. Un procedimiento para detectar la presencia de un subtipo de papilomavirus humano (HPV) en una muestra que contiene ácido nucleico que comprende:

(a) amplificar el ácido nucleico en presencia de una polimerasa de ácido nucleico y tres series de oligonucleótidos;

en el que cada serie de oligonucleótidos está constituida por

(i)

un cebador directo discriminatorio de PCR que hibrida con una primera región de un subtipo de HPV,

(ii)

un cebador inverso discriminatorio de PCR que hibrida una segunda región del subtipo de HPV secuencia abajo de la primera región,

(iii)

una sonda fluorescente marcada con una molécula extintor y un fluoróforo que emite energía a una única emisión máxima; dicha sonda hibridando una región del subtipo de HPV entre la primera y la segunda región;

en el que cada serie de oligonucleótidos hibrida específicamente con un amplicón diferente de HPV derivado del mismo subtipo de HPV;

(b) permitir a dicha polimerasa de ácido nucleico digerir cada sonda fluorescente durante la amplificación para disociar dicho fluoróforo de dicha molécula extintor;

(c) detectar un cambio de fluorescencia tras la disociación del fluoróforo y la molécula extintor, correspondiendo el cambio de fluorescencia a la existencia de amplificación del ácido nucleico; y

(d) determinar que la muestra es positiva para el subtipo de HPV si se detecta un cambio de fluorescencia en al menos dos emisiones máximas.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el número de series de oligonucleótidos es impar y en el que la muestra es positiva para el subtipo de HPV si se detecta un cambio de fluorescencia en la mayoría de emisiones máximas.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el número de series de oligonucleótidos es tres.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que las series de oligonucleótidos hibridan específicamente con los genes E6, E7 y L1.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el extintor no es fluorescente.

6. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que los fluoróforos son FAM, JOE y TET y el extintor es BHQ1.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el subtipo de HPV se selecciona del grupo constituido por: HPV6, HPV11, HPV16 y HPV18.

8. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el subtipo de HPV se selecciona del grupo constituido por HPV6, HPV11, HPV16 y HPV18.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para detectar la presencia de HPV6 en una muestra que contiene ácido nucleico que comprende:

(a) amplificar el ácido nucleico en presencia de una polimerasa de ácido nucleico y tres series de oligonucleótidos;

la primera serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 1, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 2, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 3, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

la segunda serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 4, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 5, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 6, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

la tercera serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 7, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 8, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 9, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

(b) permitir a dicha polimerasa de ácido nucleico digerir cada sonda durante la amplificación para disociar dicho fluoróforo de dicha molécula extintor;

(c) detectar un cambio de fluorescencia tras la disociación del fluoróforo y el extintor, correspondiendo el cambio de fluorescencia a la existencia de amplificación de ácido nucleico; y

(d) determinar que la muestra es positiva para el subtipo HPV6 si se detecta un cambio de fluorescencia con al menos dos sondas.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para detectar la presencia de HPV11 en una muestra que contiene ácido nucleico que comprende:

(a) amplificar el ácido nucleico en presencia de una polimerasa de ácido nucleico y tres series de oligonucleótidos;

la primera serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 10, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 11, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 12, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

la segunda serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 13, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 14, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 15, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

la tercera serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 16, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 17, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 18, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

(b) permitir a dicha polimerasa de ácido nucleico digerir cada sonda durante la amplificación para disociar dicho fluoróforo de dicha molécula extintor;

(c) detectar un cambio de fluorescencia tras la disociación del fluoróforo y el extintor, correspondiendo el cambio de fluorescencia a la existencia de amplificación de ácido nucleico; y

(d) determinar que la muestra es positiva para el subtipo HPV11 si se detecta un cambio de fluorescencia con al menos dos sondas.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para detectar la presencia de HPV16 en una muestra que contiene ácido nucleico que comprende:

(a) amplificar el ácido nucleico en presencia de una polimerasa de ácido nucleico y tres series de oligonucleótidos;

la primera serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 19, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 20, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 21, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

la segunda serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 22, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 23, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 24, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

la tercera serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 25, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 26, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 27, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

(b) permitir a dicha polimerasa de ácido nucleico digerir cada sonda durante la amplificación para disociar dicho fluoróforo de dicha molécula extintor;

(c) detectar un cambio de fluorescencia tras la disociación del fluoróforo y el extintor, correspondiendo el cambio de fluorescencia a la existencia de amplificación de ácido nucleico; y

(d) determinar que la muestra es positiva para el subtipo HPV16 si se detecta un cambio de fluorescencia con al menos dos sondas.

\newpage

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para detectar la presencia de HPV18 en una muestra que contiene ácido nucleico que comprende:

(a) amplificar el ácido nucleico en presencia de una polimerasa de ácido nucleico y tres series de oligonucleótidos;

la primera serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 28, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 29, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 30, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

la segunda serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 31, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 32, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 33, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

la tercera serie de oligonucleótidos constituida por un cebador de PCR directo discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 34, un cebador de PCR inverso discriminatorio como se establece en SEQ ID Nº 35, y una sonda como se establece en SEQ ID Nº 36, dicha sonda marcada con BHQ1 en el extremo 3' y un fluoróforo en el extremo 5', dicho fluoróforo seleccionado del grupo constituido por FAM, JOE y TET;

(b) permitir a dicha polimerasa de ácido nucleico digerir cada sonda durante la amplificación para disociar dicho fluoróforo de dicha molécula extintor;

(c) detectar un cambio de fluorescencia tras la disociación del fluoróforo y el extintor, correspondiendo el cambio de fluorescencia a la existencia de amplificación de ácido nucleico; y

(d) determinar que la muestra es positiva para el subtipo HPV18 si se detecta un cambio de fluorescencia con al menos dos sondas.

13. El procedimiento de la reivindicación 9, 10, 11 ó 12 en el que el fluoróforo de la primera serie de oligonucleótidos es FAM, el fluoróforo de la segunda serie de oligonucleótidos es JOE y el fluoróforo de la tercera serie de oligonucleótidos es TET.