ES2275647T3

ES2275647T3 - Diantraquinonas policiclicas como agentes anti-cancerosos y anti-angiogenicos.

Info

Publication number: ES2275647T3
Application number: ES01902613T
Authority: ES
Inventors: Yehuda Mazur; Gad Lavie
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd; New York University NYU
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd; New York University NYU
Priority date: 2000-01-31
Filing date: 2001-01-31
Publication date: 2007-06-16
Anticipated expiration: 2021-01-31
Also published as: EP1313459A1; CA2396704A1; AU3047001A; WO2001056558A1; DE60125048T2; DE60125048D1; US20030105357A1; EP1313459B1; US20050038115A1; US6867235B2; ATE347355T1; IL150457A0

Abstract

Uso de un compuesto de heliantrona o de un derivado del mismo para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos oftalmológicos asociados con la angiogénesis y para la prevención o inhibición de la reestenosis, compuesto que tiene la fórmula general (I): en la que R es seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxilo C1-C10, NH-alquilo C1-C10 y NH-hidroxialquilo (C1-C10); R'' es seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo y alcoxilo C1-C10; y R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, cloro, bromo, alquilo C1-C10, alcoxilo C1-C10 y alcoxicarbonilo C1-C10.

Description

Diantraquinonas policíclicas como agentes anti-cancerosos y anti-angiogénicos.

El presente invento se refiere a ciertas aplicaciones terapéuticas de compuestos de helioantrona.

El descubrimiento de las vías de transducción de señales que activan la proliferación celular en respuesta a interacciones entre factores de crecimiento y los correspondientes receptores celulares desencadenó una amplia búsqueda de inhibidores que pudieran interferir en esta cascada en malignidades en que células malignas experimentan una proliferación descontrolada. Las señales químicas de esta cascada han sido identificadas como fosforilación de proteínas en restos de tirosina, catalizada por un grupo de enzimas colectivamente denominadas proteína tirosina quinasas (PTK; del inglés, protein tyrosine kinases), o en restos de serina/treonina por las proteína quinasas A, B y C. La proteína quinasa C (PKC) es además un importante transductor de señales celulares que contiene un dominio catalítico que fosforila sustratos y un dominio regulador que controla su actividad. Flavonas polihidroxiladas tales como la genisteína y la quercetina fueron identificadas como inhibidores de las quinasas de fosforilación (Losiewicz et al., 1.994).

Las perilenoquinonas son un grupo único de inhibidores de quinasas (Diwu et al., 1.994). El primero de estos compuestos que fue evaluado a fondo fue la hipericina, un potente agente fotodinámico del que los presentes inventores descubrieron inicialmente que era virucida para retrovirus (Lavie et al., 1.989; Meruelo et al., 1.988), y posteriormente se descubrió que lo era para todos los virus con envoltura lipídica (Tang et al., 1.990). Estudios adicionales permitieron identificar la hipericina como un inhibidor dependiente de la luz, potente e irreversible de la proteína quinasa C (PKC), particularmente cuando la PKC está translocada a la membrana celular después de una activación celular, actividad inhibidora de PKC de la hipericina que está posiblemente relacionada con su actividad antirretrovírica (Takahashi et al., 1.989).

La hipericina es capaz de actuar en sistemas biológicos en la oscuridad, posiblemente a causa de un bajo potencial redox, y esto parece permitir la captura electrónica de reacciones de transferencia fisiológicas (Lavie et al., 1.994). La combinación única de propiedades de la hipericina impulsó su actual evaluación clínica en pruebas clínicas de fase II como un agente antitumoral en el tratamiento del glioma maligno (Couldwell et al., 1.994). Esta neoplasia depende de la señalización de PKC para la proliferación celular. La hipericina es además un potente agente fotosensibilizador capaz de generar oxígeno singlete y radicales libres (Hadjur et al., 1.994). Estas propiedades también la hacen útil en la terapia fotodinámica (PDT; del inglés, photodynamic therapy) de tumores superficiales accesibles a la irradiación lumínica.

Desafortunadamente, la hipericina sólo es activa en la mitad de los casos y, además, puede causar graves efectos secundarios, tal como una prolongada sensibilidad a la luz después del tratamiento, un estado médicamente conocido como hipericismo, Sería deseable obtener agentes fotosensibilizadores e inhibidores de la transducción de señales implicadas en la proliferación celular adicionales que pudieran provocar su efecto citotóxico con mayor eficacia en comparación con los agentes existentes y, potencialmente, con menos efectos secundarios y de menor gravedad.

Los presentes inventores han descrito previamente que ciertos derivados de heliantrona pueden ser útiles en la terapia fotodinámica (PDT) de tumores para, junto con irradiación lumínica, provocar la destrucción de los tumores (Publicación PCT WO 99/06347).

Aunque las propiedades fotodinámicas han sido implicadas en el mecanismo de las actividades biológicas de la hipericina, muchas de estas actividades tienen también lugar en la oscuridad. Efectos tales como la inhibición del crecimiento de células de glioma maligno son independientes de la luz (Couldwell et al., 1.994); la actividad virucida de la hipericina frente al citomegalovirus murino, aunque muy potenciada por la luz, ha sido también documentada en la oscuridad (Hudson et al., 1.991).

En ninguna parte de la técnica fundamental se enseña ni sugiere que diantraquinonas policíclicas perihidroxiladas sean útiles para la inhibición de metástasis tumorales y la prevención de la angiogénesis. Por lo tanto, existe la necesidad insatisfecha y muy reconocida de inhibidores de la angiogénesis que bloqueen específicamente la proliferación de estructuras vasculares, sustancialmente sin afectar a otros procesos fisiológicos, incluyendo la inhibición de la angiogénesis asociada con el crecimiento o el desarrollo tumoral, la reestenosis y trastornos oftalmológicos.

El presente invento se basa en el sorprendente hallazgo de que ciertos derivados de heliantrona son capaces, en concentraciones micromolares, de inhibir la transducción de señales para la proliferación celular y el desarrollo celular a través del ciclo de replicación celular, lo que indica que pueden ser utilizados como agentes antineoplásicos para el tratamiento del cáncer en ausencia de irradiación lumínica.

Se basa además en el sorprendente hallazgo de que las heliantronas interfieren en el proceso de la angiogénesis (formación de nuevos vasos sanguíneos) tanto en el ojo como en la formación de tumores primarios y, particularmente, de metástasis, lo que indica que pueden ser utilizadas para el tratamiento de trastornos oftalmológicos asociados con la angiogénesis y para el tratamiento de tumores primarios en ausencia de irradiación lumínica.

De esta manera, un objeto del presente invento es proporcionar composiciones farmacéuticas que comprendan derivados de heliantrona eficaces como inhibidores de la angiogénesis y adecuados para el tratamiento de trastornos oftalmológicos asociados con la angiogénesis y para la inhibición de la reestenosis. Otro objeto del presente invento es proporcionar dichas composiciones farmacéuticas que comprenden dichos derivados de heliantrona eficaces como agentes anticancerosos en ausencia de irradiación lumínica.

Se revela ahora que composiciones que comprenden los derivados de heliantrona de los que, en el Documento WO 99/06347, se describe previamente que actúan como agentes anticancerosos junto con luz en terapia fotodinámica, son inesperadamente eficaces también en ausencia de irradiación lumínica. Se revela ahora que las composiciones poseen una actividad antiangiogénica hasta ahora desconocida.

Se revela ahora que la heliantrona y derivados de la misma interfieren en el proceso de la angiogénesis tumoral. Este descubrimiento hace a estos compuestos útiles como modalidades de tratamiento para pacientes de cáncer que son sometidos a la extirpación quirúrgica de tumores primarios para evitar el crecimiento de metástasis incurables. Se ha establecido que la cirugía estimula el crecimiento de micrometástasis que eran mantenidas latentes por inhibidores de factores de crecimiento secretados por los tumores primarios. Estos compuestos pueden evitar el crecimiento metastásico al interferir en la producción o actividad del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF; del inglés, vascular endothelial growth factor) o de otros factores angiogénicos. Se sabe que el VEGF, un potente agente aumentador de la permeabilidad vascular, ejerce in vivo un papel esencial en la neovascularización patológica asociada con muchas enfermedades, incluyendo la neovascularización tumoral, la artritis reumatoide y la retinopatía diabética.

El presente invento proporciona, en un aspecto, el uso de un compuesto de heliantrona o de un derivado del mismo para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos oftalmológicos asociados con la angiogénesis y para la prevención o inhibición de la reestenosis, compuesto que tiene la fórmula general (I):

1

en la que R es seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxilo C_{1}-C_{10}, NH-alquilo C_{1}-C_{10} y NH-hidroxialquilo (C_{1}-C_{10}); R' es seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo y alcoxilo C_{1}-C_{10}; y R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} son independientemente seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, cloro, bromo, alquilo C_{1}-C_{10}, alcoxilo C_{1}-C_{10} y alcoxicarbonilo C_{1}-C_{10}.

En un segundo aspecto, el presente invento se refiere al uso del compuesto de heliantrona de fórmula general (I) para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la proliferación de células endoteliales o musculares lisas vasculares asociada con la reestenosis.

En un tercer aspecto, el presente invento se refiere al uso del compuesto de heliantrona de fórmula general (I) para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores en ausencia de irradiación lumínica.

Son ejemplos de dichos compuestos, como las realizaciones actualmente más preferidas del presente invento, la 10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona y la 10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona, de las fórmulas A y B siguientes:

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\hskip2,5cm A. Dimetil-tetrahidroxiheliantrona \hskip0,5cm B. Dimetil-tetrametoxiheliantrona

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En una realización, los trastornos oftalmológicos asociados con la angiogénesis son, pero no se limitan a, retinopatías, incluyendo, pero sin limitarse a, la retinopatía diabética, degeneración macular e infecciones oculares, particularmente bacterianas.

En una realización preferida, la prevención de la reestenosis es particularmente tras una angioplastia coronaria trasluminal percutánea.

La Figura 1 muestra los efectos de diversas concentraciones de 10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrametoxi-heliantrona (dimetil-TMH) e hipericina sobre la viabilidad de células de glioblastoma humano U251 en oscuridad completa.

La Figura 2 muestra los efectos de diversas concentraciones de dimetil-TMH sobre la viabilidad de células de neuroblastoma LAN5 en oscuridad completa.

La Figura 3 muestra los efectos de diversas concentraciones de dimetil-TMH e hipericina sobre la viabilidad de células de glioblastoma U87MG en oscuridad completa.

La Figura 4 muestra los efectos de diversas concentraciones de dimetil-TMH y TMH sobre la viabilidad de células de glioblastoma U87MG en oscuridad completa durante 48 horas.

La Figura 5 muestra los efectos fotodinámicos, dependientes de la luz, de la dimetil-TMH sobre la viabilidad de linfocitos de sangre periférica (PBL; del inglés, peripheral blood lymphocytes) humanos posmitóticos primarios en la oscuridad y conjuntamente con luz.

Las Figuras 6A-D muestran los efectos de dimetil-TMH 10 \muM sobre células de glioblastoma humano U251 en cultivo sin tratamiento (6A) y después de un tratamiento durante 24 horas (6B), 48 horas (6C) y 72 horas (6D).

Las Figuras 7A-C muestran los efectos de dosis-respuesta de dimetil-TMH 10 \muM (7B) y 20 \muM (7C) sobre células de glioblastoma humano U251 en cultivo. El testigo (7A) corresponde a células sin tratamiento.

La Figura 8 muestra el porcentaje de supervivencia de ratones BALB/c a los que se habían inoculado células de carcinoma de células escamosas, después de un tratamiento con dimetil-TMH.

Las Figuras 9A-C muestran el porcentaje de supervivencia de ratones BALB/c a los que se habían inoculado células de adenocarcinoma de mama inducido con DA-3^{HI}, después de un tratamiento con hipericina, los días 89 (9A) y 100 (9B) después de la cirugía.

Las Figuras 10A-B son fotografías de ojos de ratas después de una angiogénesis inducida con heparanasa, sin tratamiento alguno (10A, testigo) y después de un tratamiento con hipericina (10B).

Las hasta ahora desconocidas características de los compuestos de heliantrona fueron detectadas mientras se estudiaban los efectos de la hipericina y de derivados de heliantrona sobre tumores de adenocarcinoma de mama inducidos en ratones con la línea celular DA-3^{HI} y sobre tumores de carcinoma escamoso anaplásico murino inducidos con la línea celular SQ-2. Ambos tumores son muy metastásicos y, si son quirúrgicamente resecados una vez que han alcanzado un diámetro superior a 5 mm, los ratones pasarán a desarrollar metástasis en los pulmones y el hígado. Las metástasis causan la muerte de los animales en un periodo de aproximadamente dos meses después de la cirugía. Aunque el uso de hipericina no es acorde con el invento, será discutido a continuación a modo de comparación.

Aunque estos dos tipos de tumores no son inhibidos por la hipericina, se descubrió inesperadamente que, si los tumores son quirúrgicamente extirpados cuando alcanzan un diámetro de 8-10 mm, 2-4 inyecciones de hipericina en el peritoneo protegen a los ratones de una muerte debida a metástasis. Por lo tanto, la hipericina evita el desarrollo de metástasis.

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Además, al intentar entender por qué los tumores primarios resultan menos afectados por la hipericina mientras las metástasis son potentemente inhibidas, se descubrió inesperadamente que la hipericina y también la 10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona y su derivado 10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona evitaban la neovascularización (capacidad del tumor para inducir la formación de nuevos vasos sanguíneos con objeto de proporcionar un suministro de sangre y nutrientes a los tumores en crecimiento). Al evitarse el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos para suministro a la metástasis en crecimiento, el foco metastásico en rápido crecimiento es privado de nutrientes y oxígeno para sus células en rápida multiplicación y la lesión degenera.

Los mecanismos por los que las células cancerosas inducen la formación de nuevos vasos sanguíneos y los dirigen hacia el tumor han sido ampliamente investigados, y se sabe que están implicados mecanismos complejos. Las células cancerosas secretan factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), factor que dirige el crecimiento de vasos sanguíneos recién formados en la dirección del gradiente de concentraciones de VEGF hacia la mayor concentración de VEGF, para finalmente alcanzar el tumor (J. Folkman, 1.985; J. Folkman et al., 1.989).

En los compuestos de fórmula (I) usados en el presente invento, R es seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxilo C_{1}-C_{10}, NH-alquilo C_{1}-C_{10} y NH-hidroxialquilo (C_{1}-C_{10}); R' es seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo y alcoxilo C_{1}-C_{10}; y R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} son independientemente seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, cloro, bromo, alquilo C_{1}-C_{10}, alcoxilo C_{1}-C_{10} y alcoxicarbonilo C_{1}-C_{10}.

Como se usan aquí, "alquilo C_{1}-C_{10}", "alcoxilo C_{1}-C_{10}" y "alcoxicarbonilo C_{1}-C_{10}" se refieren a radicales lineales o ramificados que tienen de 1 a 10 átomos de carbono. Son ejemplos de tales radicales alquilo, pero sin limitación, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, hexilo y octilo. Son ejemplos de tales radicales alcoxilo, pero sin limitación, metoxilo, etoxilo, propiloxilo, isopropiloxilo, butoxilo, hexiloxilo y octiloxilo. Son ejemplos de tales radicales alcoxicarbonilo, pero sin limitación, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo y propiloxicarbonilo. En una realización preferida, R, R' y de R_{1} a R_{6} son metilo, pero cadenas alifáticas más largas previstas en esas posiciones en lugar del grupo metilo pueden tener ventajas tales como la prolongación de la actividad biológica a causa de una mejor retención por las células, y el requerimiento de una administración menos frecuente.

Los compuestos preferidos utilizados en el invento son heliantrona y derivados de la misma de fórmula (I) en que los dos R de las posiciones 1 y 6 son hidroxilo, metoxilo, butilamino o hidroxietilamino, los dos R' de las posiciones 3 y 4 son hidroxilo o metoxicarbonilo, R_{2} y R_{5} de las posiciones 14 y 9 son hidrógeno, y R_{3} y R_{6} de las posiciones 2 y 5 son hidrógeno o bromo. Son ejemplos de dichos compuestos preferidos: 1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona, 1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona, 10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona, 10,13-di(metoxicarbonil)-1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona, 1,6-di-N-butilamino-3,4-dimetoxiheliantrona, 1,6-di-N-butilamino-3,4-dimetoxi-10,13-dimetilheliantrona, 1,6-di-(N-hidroxietilamino)-3,4-dimetoxiheliantrona, 2,5-dibromo-1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona, 2,5-dibromo-10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona y, muy preferiblemente, 10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona.

Los compuestos de fórmula (I) de acuerdo con el invento en que cada uno de R_{2} y R_{4} es alquilo inferior pueden ser preparados mediante el método descrito en la Patente de EE.UU. nº 5.120.412 al utilizar, como material de partida, una 1,3-dihidroxi-6-(alquilo inferior)-antraquinona de fórmula (II):

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en la que R' es alquilo inferior. El compuesto II es reducido hasta la correspondiente antrona de fórmula (III)

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en la que R' es como se definió anteriormente, y el compuesto III es condensado para obtener compuestos deseados de fórmula (I) en que R es alcoxilo inferior.

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Otros compuestos de fórmula (I) pueden ser preparados de modo análogo usando 1,3-dihidroxi-antraquinonas apropiadamente sustituidas.

Los compuestos de fórmula (I) de acuerdo con el invento en que cada uno de R_{2} y R_{4} es alcoxicarbonilo inferior pueden ser preparados a partir de los derivados diacetilados del compuesto de la fórmula (II) anterior en que R' es metilo, por oxidación con CrO_{3} para formar el compuesto de fórmula (IV):

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el cual es luego dimerizado mediante el método de Spitzner [Angew. Chem. Int. Ed., 16, 46 (1.977)] para formar un compuesto de fórmula (I) en que R es carboxilo, el cual es luego esterificado con un alcanol inferior para obtener el deseado producto de fórmula (I) en que R_{2} y R_{4} son alcoxicarbonilo inferior.

Los compuestos de fórmula (I) en que cada R de las posiciones 1 y 6 es alquilamino o hidroxialquilamino pueden ser obtenidos por aminación del correspondiente compuesto de fórmula I en que cada R es alcoxilo, con una alquilamina tal como butilamina o con una hidroxialquilamina tal como etanolamina.

De acuerdo con el presente invento, se proporcionan compuestos que inhiben la proliferación celular a través del ciclo mitótico. Resultó sorprendente descubrir que estos compuestos, y particularmente la 10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona (aquí denominada "dimetil-TMH"), son muy potentes en cuanto a desregular varios controles relacionados con el ciclo celular que coordinan el paso ordenado de las células a través de las diferentes fases del ciclo mitótico. En este ciclo, las células en fase G0 de reposo pasan a la fase G1 de acumulación de proteína y RNA. Las células entran luego en la fase S, en la que se duplica el DNA genómico. Una vez completada la duplicación del DNA, las células están en la fase G2 con el doble de cantidad de DNA, listas para la división, y avanzan a la fase M de división celular (mitosis), en la cual la célula se divide en dos células hijas. De esta manera, se halló que la dimetil-TMH posee una actividad inhibidora básica de la transducción de señales de proliferación celular y detiene células malignas, incluyendo células de glioblastoma y neuroblastoma, en las fases medias S y G2 del ciclo de replicación celular. En ratones que portaban tumores de carcinoma de células escamosas, la dimetil-TMH inhibía completamente la propagación del tumor en focos múltiples, y los tumores se endurecían, se volvían necróticos y decaían después de un tratamiento prolongado.

En líneas celulares de glioblastoma maligno humano, el bloqueo del progreso ordenado de las células a través de las diferentes fases del ciclo culminaba con la muerte celular (Figura 1), identificándose a la dimetil-TMH como más potente que la hipericina a la hora de matar las células tumorales en cultivo en oscuridad completa. La muerte celular por dimetil-TMH se producía con dosis con las que la hipericina no ejercía efecto alguno sobre los cultivos. Sorprendentemente, la dimetil-TMH era igualmente más potente que la hipericina en la inducción fotodinámica de la muerte celular cuando los tratamientos fueron llevados a cabo junto con luz. Los mecanismos que actúan en la oscuridad eran muy diferentes de los que median en la fotosensibilización inducida por luz. En la oscuridad, la muerte celular tiene lugar aproximadamente cuatro días después de que se administra el compuesto mientras que, con luz, las células morían en 2-3 horas.

La dimetil-TMH no ejercía efecto alguno sobre la viabilidad de células mononucleares normales de sangre periférica humana. Además, la administración intraperitoneal diaria del compuesto a ratones BALB/c durante una semana no tenía efecto negativo alguno sobre los animales. En ratones BALB/c que portaban tumores de carcinoma anaplásico de células escamosas, los tratamientos con 200 \mug/ratón un día sí y otro no daban lugar a una inhibición significativa del crecimiento tumoral en comparación con ratones testigo no tratados que portaban el tumor.

Las composiciones farmacéuticas preparadas de acuerdo con el invento se administrarán al paciente mediante procedimientos estándares. La cantidad de compuesto que hay que administrar y la vía de administración serán determinadas de acuerdo con la clase de tumor, la fase de la enfermedad, y la edad y el estado de salud del paciente. Las vías preferibles de administración son la inyección intravenosa o la inyección directa, en el tumor sólido, de la disolución acuosa del compuesto activo que comprende vehículos y aditivos farmacéuticamente aceptables convencionales, y el tratamiento tópico de los tumores cutáneos con composiciones tópicas adecuadas. En tumores diseminados con metástasis o en cánceres sistémicos tales como leucemias y linfomas, las vías preferentes son las vías sistémicas, prefiriéndose la vía intravenosa o la oral.

Los compuestos de heliantrona útiles en el presente invento pueden ser utilizados para tratar diversos tipos de cánceres y sus metástasis, incluyendo, pero sin limitarse a, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, melanoma, sarcoma de Kaposi, carcinoma de mama, carcinoma de próstata, hemangioma, meningioma, astrocitoma, neuroblastoma, carcinoma del páncreas, carcinoma gástrico, carcinoma colorrectal, carcinoma de colon, carcinoma de células de transición de la vejiga y carcinoma de la laringe, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica aguda, leucemia promielocítica aguda, mieloma múltiple, linfoma de células T y linfomas de células B.

El compuesto de heliantrona útil en el invento puede ser formulado mediante cualquier método necesario para obtener composiciones farmacéuticas adecuadas para administración a un paciente.

Además del ingrediente activo, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos, agentes diluyentes y similares farmacéuticamente aceptables convencionales. Las composiciones sólidas para administración oral, tales como tabletas, píldoras, cápsulas y similares, pueden ser preparadas mezclando el ingrediente activo con ingredientes farmacéuticamente aceptables convencionales, tales como almidón de maíz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato magnésico, fosfato dicálcico y gomas, y con agentes diluyentes farmacéuticamente aceptables. Las tabletas o las píldoras pueden ser revestidas o, de lo contrario, compuestas con materiales farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica para obtener una forma de dosificación que proporcione una acción prolongada o una liberación continua. Otras composiciones sólidas pueden ser preparadas en forma de microcápsulas para administración parenteral. Pueden prepararse formas líquidas para administración oral o para inyección, expresión que incluye las vías subcutánea, intramuscular e intravenosa y otras vías parenterales de administración. Las composiciones líquidas incluyen disoluciones acuosas, con o sin codisolventes orgánicos, suspensiones acuosas u oleosas, emulsiones con aceites comestibles, así como vehículos farmacéuticos similares. Además, las composiciones farmacéuticas pueden ser formadas como glóbulos encapsulados o como otros depósitos para distribución continua.

La dosis activa para seres humanos está generalmente en el intervalo de 0,1 microgramos a aproximadamente 1 mg por kg de peso corporal, en un régimen de una o más veces al día. Sin embargo, para compuestos o formulaciones que tienen una acción prolongada, puede ser también posible una administración en intervalos más largos.

En general, el intervalo preferido de dosificación es de 1 a 200 microgramos por kg de peso corporal. Para un experto en la técnica, es evidente que la forma y el régimen de dosificación serán determinados por el médico que atiende al paciente de acuerdo con la enfermedad que se trata, el método de administración y el estado general del paciente. Se apreciará que la administración más apropiada de las composiciones farmacéuticas del presente invento dependerá ante todo del estado clínico que se trata. El tratamiento profiláctico de un individuo sano que presenta alto riesgo de angiogénesis patológica necesitará un régimen de dosificación para mantenimiento continuo, suficiente para inhibir la angiogénesis. Este tipo de tratamiento podría ser aplicado a individuos que presentan riesgo de retinopatía diabética, retinopatía de carácter prematuro, degeneración macular y otros estados de los que se sabe que afectan a grupos particulares de pacientes. Por contraste, el tratamiento de una enfermedad existente podría requerir dosis mayores en intervalos más frecuentes. Se prevé además que el tratamiento de ciertos estados en los que se sabe que está implicada una proliferación anormal de células de músculo liso vascular, incluyendo la reestenosis, será llevado provechosamente a cabo con composiciones farmacéuticas en una cantidad suficiente para inhibir la proliferación de células de músculo liso vascular.

El técnico experto apreciará que, en algunos casos, los tratamientos pueden incluir provechosamente la administración de las composiciones junto con un depósito o dispositivo médico. De esta manera, a modo de ejemplo, el tratamiento de la angiogénesis en el ojo puede necesitar un implante intraocular. Similarmente, el tratamiento de la reestenosis asociada con proliferación de células endoteliales puede necesitar la aplicación de la composición junto con una angioplastia, por ejemplo, como un revestimiento sobre un "stent" o un dispositivo similar.

El invento será ahora ilustrado mediante los siguientes ejemplos no restrictivos.

Ejemplos

Todos los compuestos utilizados en el presente invento son compuestos conocidos, y los métodos para su preparación se describen en la bibliografía y, con detalle, en la Publicación PCT 99/06347 de los presentes solicitantes.

Procedimientos experimentales A. Líneas celulares

Se cultivaron células leucémicas HL-60 humanas en medio RPMI-1640 complementado con suero de ternera fetal al 15%, glutamina 100 mM y 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina. Se cultivaron células de eritroleucemia K-562 humana (obtenidas de un paciente con leucemia mieloide crónica) en el mismo medio complementado con suero de ternera fetal al 10%. Estas células y las células de glioblastoma U251 humano, glioblastoma U87MG y neuroblastoma LAN5 usadas en los experimentos son asequibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC; del inglés, American Type Culture Collection). Todas las líneas celulares fueron cultivadas en una atmósfera humidificada de aire al 95%/CO_{2} al 5%, a 37ºC.

B. Viabilidad celular

La viabilidad celular fue determinada mediante el ensayo del MTT, con el que se mide la reducción del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio hasta formazán por mitocondrias de células viables, como describe T. Mossman, J. Immunogen., 21, 235-248 (1.983). Las células son incubadas con MTT durante cuatro horas a 37ºC y son analizadas en un aparato lector de placas para ELISA, a 560 nm. La densidad óptica (DO) del formazán degenerado por cultivos de células no tratadas (DO_{testigo}) es definida como una unidad de MTT. El número de unidades de MTT de las muestras de cultivo que han experimentado tratamientos es calculado mediante la relación (DO_{muestra} - DO_{blanco})/(DO_{testigo}).

C. Tensión fotodinámica

La tensión fotodinámica (PD; del inglés, photodynamic) es el nivel de la fototoxicidad infligida a células diana por compuestos fotodinámicos y exposición a luz. La irradiación lumínica fue llevada a cabo mediante una fuente fluorescente de dos tubos paralelos de 40 vatios situados a una distancia fija de 16 cm, fuente de la que se había medido una emisión de incidencia de 4 mW/cm^{2}. Las intensidades lumínicas fueron cuantificadas utilizando el Radiómetro/Fotómetro IL 1350 de International Light Inc., EE.UU.

D. Determinación del porcentaje de células apoptóticas

El porcentaje de células apoptóticas fue determinado mediante microscopía lumínica sobre preparaciones celulares en centrífuga Cytospin, teñidas con May-Grunwald-Giemsa. Un total de 400 células fueron contadas independientemente por dos individuos, y los datos se presentan como la media de las cuentas. Las células apoptóticas fueron reconocidas por su menor tamaño y por núcleos que estaban fragmentados en cuerpos de cromatina condensada.

E. Análisis por citometría de flujo

Células recolectadas 5 horas después de la aplicación de la tensión fotodinámica fueron enjuagadas con disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés, phosphate buffered saline) y fueron fijadas con etanol acuoso al 70%. Las células fueron luego resuspendidas en un tampón de fosfato-citrato (PC; del inglés, phosphate-citrate) que tenía un pH de 7,8 (192 partes de Na_{2}HPO_{4} 0,2 M y 8 partes de ácido cítrico 0,1 M) a temperatura ambiental durante 30 minutos y fueron teñidas con yoduro de propidio en tampón de PC que contenía 10 \mug/ml de RNasa A. Las células fueron luego analizadas en un citómetro de flujo Coulter EPICS XL-MCL con el campo entero seleccionado para incluir los diversos cambios que afectaban a las células.

F. Ensayo de fragmentación de DNA

La fragmentación de DNA en células que experimentan apoptosis fue analizada del modo previamente descrito [J. Lotem y L. Sachs, Cell Growth and Differ., 6, 647-653 (1.995)]. 2 x 10^{6} células recogidas como sedimento de centrifugación en tubos Eppendorf fueron lisadas en 0,5 ml de tampón de lisis que contenía Tris-HCl 10 mM, pH de 7,5, SDS al 0,6%, EDTA 10 mM y 15 \mug/ml de mezcla de RNA (Ambion Corp., Austin, Texas, EE.UU.). Después de una incubación a 37ºC durante 10 minutos, se añadió NaCl hasta 1 M y se mantuvo la mezcla a 4ºC durante la noche. La preparación fue centrifugada a 14.000 g durante 30 minutos a 4ºC, el sobrenadante fue recogido y sometido a extracción con fenol, y el DNA fue hecho precipitar durante la noche a -20ºC mediante la adición de 1 ml de etanol. El sedimento de DNA fue dejado secar al aire, dejado disolver en 20 \mul de tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 10 mM, pH de 7,5) a 4ºC durante 24 horas, sometido a electroforesis durante 4 horas a 2 V/cm en un gel de agarosa al 1,5% que contenía 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio, y fotografiado bajo luz UV.

Ejemplo 1 Muerte de células tumorales malignas en cultivo por dimetil-TMH y TMH en la oscuridad

Se evaluaron tres líneas celulares malignas humanas en cuanto a su sensibilidad a dimetil-TMH in vitro. Se sembraron células de glioblastoma U251 humano, glioblastoma U87MG y neuroblastoma LAN5 (2 x 10^{5} células por pocillo) en placas de microcultivo de 96 pocillos de fondo plano, y se trataron con dimetil-TMH (acorde con el invento) e hipericina (no acorde con el invento) en dosis que variaban de 0 (testigo) a 0,1-20 \muM en oscuridad completa durante un periodo de 72 horas. Se aspiró el medio, se lavó la monocapa adherente con disolución salina tamponada con fosfato y se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo del MTT.

Las Figuras 1, 2 y 3 muestran los resultados para las células de glioblastoma U251, neuroblastoma LAN5 y glioblastoma U87MG, respectivamente, mostrándose en las Figuras 1 y 3 una comparación de la actividad citotóxica con hipericina. La viabilidad celular se perdió en los tres casos después de una exposición a dimetil-TMH durante al menos 72 horas, según se midió en los ensayos de viabilidad con MTT. La pérdida de la viabilidad celular después del tratamiento de las células de los dos glioblastomas con dimetil-TMH en la oscuridad fue más eficaz que el tratamiento con hipericina.

Luego se repitió el experimento con células de glioblastoma U251 tratadas con dimetil-TMH o tetrametoxi-heliantrona (TMH) en dosis que variaban de 0,1 a 12 \muM en oscuridad completa. Se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo del MTT. Los resultados, expuestos en la Figura 4, muestran que tanto la dimetil-TMH como la TMH presentaban actividades citotóxicas comparables sobre células U251.

Ejemplo 2 Efectos fotodinámicos, dependientes de la luz, de la dimetil-TMH sobre linfocitos primarios normales de sangre periférica humana

Los linfocitos de sangre periférica (PBL) humanos son células no proliferativas en ausencia de estímulos mitogénicos. Se examinaron los efectos de diferentes dosis de dimetil-TMH sobre PBL en presencia (no acorde con el invento) o ausencia (acorde con el invento) de irradiación con luz blanca policromática. Se sembraron (2 x 10^{5} células/pocillo) PBL (posmitóticos) en dos diferentes placas de 96 pocillos de fondo redondo (por triplicado). Se añadió dimetil-TMH a los cultivos. Una placa fue mantenida en la oscuridad y la otra fue expuesta a luz blanca policromática con un índice de fluencia de 8 mW/cm^{2} durante 30 minutos (un total de 14,4 J/cm^{2}). Luego se cultivaron ambas placas a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 72 horas y se analizó la viabilidad celular mediante el ensayo del MTT. Los resultados, expuestos en la Figura 5, muestran que la dimetil-TMH no ejercía efecto alguno sobre la viabilidad de los PBL en ausencia de irradiación lumínica; sin embargo, la fotosensibilización con luz causaba la muerte celular con una dosis letal mediana (LD_{50}; del inglés, lethal dose 50) de aproximadamente 0,65 \muM de dimetil-TMH, lo que indica que la dimetil-TMH es un potente reactivo fotodinámico pero no actúa sobre células no proliferativas en ausencia de irradiación lumínica.

Ejemplo 3 Determinación de las fases del ciclo celular en que la dimetil-TMH detiene el crecimiento y la proliferación de células tumorales malignas en la oscuridad

Se llevaron a cabo análisis del ciclo celular y del contenido de DNA en células de glioblastoma U251 humano después de un tratamiento con 5 \mug/ml (10 \muM) de dimetil-TMH durante 24, 48 y 72 horas, y en células de neuroblastoma LAN5 después de 48 horas. Las células fueron luego teñidas con yoduro de propidio, lavadas con PBS y analizadas en un separador celular activado por fluorescencia (FACS; del inglés, fluorescence activated cell sorter). Un programa informático disponía la fluorescencia relacionada con DNA del modo siguiente: se considera que la cantidad mínima de fluorescencia es un conjunto entero de DNA celular relacionado con la fase G_{1} de reposo. Se considera que una cantidad doble de fluorescencia es la fase G_{2}, en la que el genoma entero está duplicado después de la síntesis completa de DNA, y se considera que las cantidades intermedias son la fase S sintética de DNA, en la que la síntesis total de DNA aún no se ha completado.

Los resultados, mostrados en las Figuras 6-7, revelan que la administración de dimetil-TMH 10 \muM a células de glioblastoma humano U251 producía una detención de la proliferación celular en la fase S media (6B). La proporción de células halladas en la fase S aumentaba continuamente con la duración de la exposición a dimetil-TMH (Figuras 6A, 6B y 6C). Cuando se aumentó la dosis de dimetil-TMH de 10 \muM a 20 \muM (Figuras 7B y 7C), se produjo una detención exclusiva en la fase S. Estudios de hibridación in situ con fluorescencia (FISH; del inglés, fluorescence in situ hybridization) confirmaron este desequilibrio en la replicación de DNA a nivel génico. Esta detención del ciclo celular causa los efectos tóxicos que provocan la muerte celular.

Ejemplo 4 Prevención de la formación de metástasis en ratones BALB/c que portan un carcinoma de células escamosas muy invasivo, con dimetil-tetrametoxiheliantrona

La eficaz actividad citocida de la dimetil-TMH in vitro fomentó la evaluación de su perfil de seguridad y de eficacia antitumoral en ratones portadores de tumores. Los experimentos se llevaron a cabo en ratones que portaban tumores derivados de la línea SQ2 de carcinoma de células escamosas (SCC; del inglés, squamous cell carcinoma) anaplásico y muy metastásico. Este tumor se desarrolla como centros multifocales que se propagan por las inmediaciones del tumor primario, y se desarrollan metástasis aproximadamente dos meses después de la inoculación de células. Cuando el diámetro de los tumores alcanzó 5-7 mm, se iniciaron tratamientos con dimetil-TMH 300-600 \muM/ratón, administrados dos veces o tres veces a la semana.

En la Tabla 1 se muestran los resultados de uno de los experimentos, en el que se inocularon intradérmicamente 5 x 10^{5} células de la línea SQ2 de carcinoma anaplásico de células escamosas en los lomos afeitados de ratones BALB/c (8 ratones por grupo). Cuando los tumores primarios alcanzaron un diámetro de 5 mm, se inició la terapia con dimetil-TMH 300 \muM/ratón, administrados intraperitonealmente dos veces por semana. Tres semanas después del inicio de la terapia, se registró el número de focos tumorales que se habían desarrollado en el sitio del tumor primario. El número de focos que se habían desarrollado 21 días después del inicio de la terapia resultó considerablemente reducido por la dimetil-TMH, administrada en dosis terapéuticas que eran atóxicas para los animales. Además de evitarse la propagación multifocal de este tumor, los tumores primarios se endurecían y decaían en 5 de los ratones tratados, lo que indica que se puede conseguir la curación completa de este tumor una vez que se hayan optimizado los regímenes de tratamiento.

TABLA 1 Número de focos tumorales observados 21 días después del inicio de la terapia con dimetil-TMH

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Ejemplo 5 Supervivencia de ratones que portan un carcinoma de células escamosas, tratados con dimetil-TMH

En otro experimento, se inocularon intradérmicamente 5 x 10^{5} células de la línea SQ2 de carcinoma anaplásico y muy metastásico de células escamosas en los lomos afeitados de ratones BALB/c. Cuando los tumores primarios alcanzaron un diámetro de 3-4 mm, se inició la administración intraperitoneal de 200 \mug de dimetil-TMH/ratón (400 \muM/ratón) el día 7 después de la inoculación de células tumorales y luego se continuó la administración a los ratones portadores de tumores dos veces a la semana durante seis semanas (12 dosis en total). Luego se siguió la supervivencia de los animales. Los resultados de la Figura 8 muestran que la supervivencia de los animales se prolongó aproximadamente un 40,3% en comparación con la supervivencia de los testigos no tratados. Hay que advertir que los tumores primarios continuaron creciendo durante el tratamiento y que, no obstante, se prolongó la supervivencia de los animales. Esto parece ser el resultado de un crecimiento metastásico reducido, como resulta evidente de la Tabla 1 del Ejemplo 4 anterior.

Ejemplo 6 Utilización de dimetil-TMH en la terapia antineoplásica de tumores malignos en ratones

Los efectos antineoplásicos de la dimetil-TMH in vivo pueden ser examinados en diversos tumores experimentales murinos. Estos incluyen el linfoma murino ESb, el sarcoma MCA-105 y el melanoma B16, que son evaluados en ratones C57BL/6J. Células de carcinoma de mama murino DA3^{hi}, una variante muy metastásica de DA3 que genera adenocarcinoma metastásico de mama en ratones BALB/c, y células A431, que generan tumores epidermoides en ratones NIH Swiss, son evaluadas en cuanto a sensibilidades al tratamiento con dimetil-TMH o con TMH. Los tumores son propagados en ratones, 8-10 animales por grupo, mediante inoculaciones intradérmicas de células generadoras de tumores. Se examinan subidas de dosis de dimetil-TMH que varían entre 20 y 1.000 \muM (10-500 \mug/ratón). Las frecuencias de las administraciones varían de administraciones diarias a 3 veces por semana a 1 vez por semana, variando los periodos de administración de 2 a 12 semanas. Se comprueban las diferencias en el tamaño del tumor primario de los animales, en comparación con el de los ratones testigo portadores de tumor no tratados. Para analizar la propagación de metástasis, todos los ratones son sacrificados cuando muere el primer ratón del grupo testigo o en momentos designados para la terminación del experimento. Se aplican los puntos finales usados en ejemplos previos. Los pesos del bazo, el hígado y el pulmón son parámetros que aquí se usan para la determinación de la carga metastásica. El número total de focos metastásicos en cada uno de estos órganos es un segundo parámetro determinado después de una fijación en disolución Bouins. La supervivencia de los animales es otro punto final que se examina. Se determinan los tiempos de supervivencia medio y mediano después de la inoculación de células tumorales. La significación de la prolongación de la supervivencia es calculada por comparación con testigos correspondientes a animales portadores de tumor no tratados sin exposición a la luz (efectos de oscuridad del compuesto), en la prueba t de Student apareada.

En un experimento, la actividad antitumoral de la dimetil-TMH sobre tumores humanos en un modelo in vivo es evaluada en la cepa de ratón C.B-17 SCID (Fox Chase). Se inducen tumores epidermoides y de glioblastoma humanos en la piel de estos ratones por inoculación de las correspondientes líneas celulares humanas. Luego se someten los animales a diversos protocolos de tratamiento con dimetil-TMH, administrándose intraperitonealmente el compuesto. Se controlan los animales en cuanto al tamaño tumoral y a la supervivencia.

Ejemplo 7 Prevención de la formación de metástasis de tumores de adenocarcinoma de mama, inducidos con DA-3^{HI}, en ratones BALB/c con hipericina (no acorde con el invento)

El tamaño del tumor primario con el que se producen metástasis de tumores de adenocarcinoma de mama derivados de DA-3^{HI} fue inicialmente calibrado en ratones BALB/c a los que se habían inoculado intradérmicamente 5 x 10^{5} células tumorales DA-3^{HI}. Se halló que, si la extirpación quirúrgica de los tumores primarios era llevada a cabo cuando los tumores habían alcanzado un diámetro de 5 mm o menos, la resección del tumor primario curaba a los ratones. Si la resección era llevada a cabo sobre tumores con diámetros mayores, los ratones morían de metástasis. Parece que un diámetro de aproximadamente 5 mm es el punto de corte en que comienzan a propagarse las metástasis.

Se indujeron tumores DA-3^{HI} en hembras de ratón BALB/c de 12 semanas de edad, como se describió anteriormente. Una vez que los tumores hubieron alcanzado diámetros de 8-10 mm, se dividieron los ratones en cuatro grupos. Un grupo de 19 ratones fue dejado sin tratar y, en los otros tres grupos, los tumores fueron quirúrgicamente extirpados. Uno de los grupos sometidos a resección recibió dos inyecciones intraperitoneales (i.p.) de 200 \mug de hipericina (HY) cada una, separadas por 5 días, comenzando dos días antes de la cirugía (16 ratones). Otro grupo sometido a resección recibió cinco inyecciones i.p. de 200 \mug de hipericina cada una, separadas por 5 días, comenzando dos días antes de la cirugía (17 ratones). Un grupo sometido a resección no fue tratado con hipericina (16 ratones). Luego se siguió la supervivencia de los ratones. En la Figura 9A se muestra que no sobrevivió ninguno de los ratones portadores de tumor no tratados y que, además, el 20% de los ratones sometidos a cirugía sobrevivían el dia 89. Sin embargo, la administración de 2 inyecciones i.p. de hipericina aumentó el índice de supervivencia a 35% y la administración de 5 dosis de hipericina aumentó el índice de supervivencia a 60%.

En la Figura 9B se muestra la supervivencia acumulativa de los ratones que recibieron 2 y 5 dosis de hipericina (cada una de 200 \mug/ratón), a lo largo de 100 días después de la cirugía (estos valores persistieron durante 164 días después de la inoculación del tumor). Dichos valores sugieren una prevención completa de metástasis en los grupos de ratones supervivientes, particularmente en el grupo que recibió cinco dosis de hipericina. Estos resultados indican que la hipericina protege a los ratones del desarrollo de metástasis y, de esta manera, evita la muerte del animal como consecuencia de la diseminación sistémica de células desde el tumor primario.

Ejemplo 8 Prevención de la formación de metástasis en ratones BALB/c que portan una carcinoma de células escamosas muy invasivo, con hipericina (no acorde con el invento)

En otro conjunto de experimentos, se generaron tumores de carcinoma de células escamosas en ratones BALB/c inoculando 5 x 10^{5} células SQ2 por ratón. Una vez que los tumores hubieron alcanzado un diámetro de 1,0-1,2 cm, fueron extirpados por cirugía (resecados). Un grupo de 5 ratones también recibió tres inyecciones i.p. de 100 \mug de hipericina/ratón antes de la cirugía y dos regímenes de 50 \mug/ratón después de la cirugía a intervalos de 5 días entre cada administración. Otro grupo de 8 ratones recibió seis inyecciones i.p. de 100 \mug de hipericina/ratón antes de la cirugía y cinco regímenes de 50 \mug/ratón después de la cirugía a intervalos separados por 5 días. Un grupo testigo de 17 ratones sólo fue sometido a cirugía, sin tratamientos con hipericina, y otro grupo testigo quedó sin tratar (22 ratones), Luego se siguió la supervivencia de los animales. Se halló entonces que el 60% de los ratones que habían recibido tres inyecciones de hipericina permanecían vivos tras más de 240 días después de la inoculación de las células tumorales; de los ratones que habían recibido 6 inyecciones de hipericina, el 40% permanecían vivos, mientras que, de los ratones que sólo habían sido sometidos a cirugía, el 20% permanecían vivos. Estos resultados también muestran índices de protección de 20-40% debidos a la administración de hipericina.

En un esfuerzo por entender cómo la hipericina evita el crecimiento de metástasis, se repitió el experimento y luego se siguió la morfología de las lesiones metastásicas. Se indujeron tumores DA-3^{HI} primarios en ratones BALB/c. Se llevó a cabo una cirugía sobre los tumores cuando sus diámetros alcanzaron 8-10 mm. Estos ratones (17 animales) fueron divididos en dos grupos: uno fue tratado con 5 dosis de 200 \mug de hipericina/ratón a intervalos de 5 días como se describió previamente (9 animales) y otro grupo sirvió como testigo no tratado (8 ratones). Los animales fueron criados durante más de dos meses. Luego se sacrificaron los ratones y se examinaron los órganos internos en cuanto a lesiones metastásicas. El examen físico reveló numerosas lesiones metastásicas bien desarrolladas en los ratones no tratados, que estaban provistas de grandes vasos sanguíneos visibles. Las pocas lesiones que se desarrollaron en algunos de los ratones tratados con hipericina eran mucho más pequeñas, algo más necróticas y desprovistas de dicha vasculatura (vasos sanguíneos de alimentación). Esto sólo era evidente cuando las inyecciones de hipericina se iniciaron muy pronto, antes de la resección del tumor primario. Estas observaciones indican que la hipericina inhibe la angiogénesis (desarrollo de nueva vasculatura). Es probable que esta falta de suministro sanguíneo, y no los efectos anticancerosos directos, evitara el desarrollo de metástasis. Puesto que la angiogénesis es principalmente mediada por el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), la hipericina puede interferir en la formación o secreción de VEGF por las células tumorales o en su presentación a receptores inductores del crecimiento presentes en células del endotelio vascular. Sin pretender la vinculación a ningún mecanismo propuesto, se ha mostrado que la hipericina inhibe la proteína quinasa C, y ésta es esencial en la producción de VEGF. Una interferencia en la vía de transducción de señales que culmina en la producción de VEGF podría ser el mecanismo para la inhibición del efecto de VEGF, mediada por hipericina o por un derivado de heliantrona, que da lugar a la inhibición del desarrollo de lesiones metastásicas. Independientemente del mecanismo de acción propuesto, se demuestra ahora que estas composiciones son inhibidores muy potentes de la angiogénesis.

Ejemplo 9 Prevención de la vascularización (angiogénesis) de la cámara anterior del ojo mediante la administración sistémica de hipericina (no acorde con el invento)

Se administraron tres inyecciones intraperitoneales de hipericina (750 \mug por dosis en 5 ml de agua que contenía etanol al 3,5%) a cuatro ratas (de 250 g cada una) a intervalos de cuatro días. Al día siguiente, se anestesiaron los animales con xilazina-ketamina y se indujo una angiogénesis (formación de nuevos vasos sanguíneos) inoculando 2 \mul de heparanasa (30 \mug/ml) en el compartimento frontal del ojo, en la córnea de uno de los dos ojos de cada rata. Al día siguiente, se aplicó una cuarta inyección intraperitoneal de 750 \mug de hipericina. Dos animales testigo positivos sólo recibieron 2 \mul de heparanasa (30 \mug/ml) en el compartimento frontal del ojo. Luego se dejó que se desarrollara la angiogénesis durante 5 días, momento en que los animales fueron anestesiados con xilazina-ketamina y fueron examinados y fotografiados bajo un microscopio binocular en cuanto al desarrollo de vasos sanguíneos en la cámara anterior del ojo. La fotografía de la Figura 10A muestra los vasos sanguíneos en un ojo testigo de una rata después de la angiogénesis inducida con heparanasa y sin tratamiento con hipericina, mientras que la fotografía de la Figura 10B muestra la ausencia de vasos sanguíneos en el ojo de una rata tratada con hipericina. Se obtuvo una protección similar (datos no mostrados) cuando se indujo la angiogénesis en ojos de rata con factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF; del inglés, basic fibroblast growth factor).

Ejemplo 10 La hipericina interfiere en la angiogénesis

Se corta aorta de rata en anillos que son embebidos en geles de fibrina y cultivados en medio MCDB 131. Las células endoteliales que se separan de los anillos de aorta generan microvasos de ramificación de acuerdo con un método previamente descrito (R. F. Nicosia y A. Ottinetti, "Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta". Laboratory Investigation 63: 115, 1.990). La adición de hipericina (no acorde con el invento) en un intervalo de dosis de entre 0,1 y 10 \mug/ml (0,2-20 \muM) o de dimetil-tetrahidroxiheliantrona (acorde con el invento) en un intervalo de dosis de entre 0,1 y 10 \mug/ml (0,2-20 \muM) da lugar a la inhibición de la formación de los microvasos organizados.

La descripción precedente de las realizaciones específicas revelará así totalmente la naturaleza general del invento que otros, aplicando el conocimiento actual, pueden modificar y/o adaptar fácilmente para diversas aplicaciones, tales como realizaciones específicas, sin una experimentación excesiva y sin apartarse del concepto genérico, y, por lo tanto, dichas adaptaciones y modificaciones deberían ser y son consideradas comprendidas dentro del significado y el alcance de equivalentes de las realizaciones descritas. Ha de entenderse que la fraseología o la terminología aquí empleadas tiene el fin de descripción y no de limitación. Los medios, los materiales y las operaciones para llevar a cabo las diferentes funciones descritas pueden tomar una diversidad de formas alternativas sin apartarse del invento.

Referencias

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Claims

1. Uso de un compuesto de heliantrona o de un derivado del mismo para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos oftalmológicos asociados con la angiogénesis y para la prevención o inhibición de la reestenosis, compuesto que tiene la fórmula general (I):

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2. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicho trastorno oftalmológico asociado con la angiogénesis es retinopatía diabética, degeneración macular o infección ocular.

3. Uso de un compuesto de heliantrona para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la proliferación de células endoteliales o musculares lisas vasculares asociada con la reestenosis, compuesto de heliantrona que tiene la fórmula general (I):

8

\newpage

4. Uso de un compuesto de heliantrona para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores en ausencia de irradiación lumínica, compuesto de heliantrona que tiene la fórmula general (I):

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5. El uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho compuesto de heliantrona de fórmula (I) es 10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona o 10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona.

6. El uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho compuesto de fórmula (I) es seleccionado del grupo que consiste en:

1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona;

1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona;

10,13-di(metoxicarbonil)-1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona;

1,6-di-N-butilamino-3,4-dimetoxi-heliantrona;

1,6-di-N-butilamino-3,4-dimetoxi-10,13-dimetil-heliantrona;

1,6-di-(N-hidroxietilamino)-3,4-dimetoxi-heliantrona;

2,5-dibromo-1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona; y

2,5-dibromo-10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona.