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ES2274983T3 - Procedimiento para la purificacion de celulas bacterianas y componentes celulares. - Google Patents

Procedimiento para la purificacion de celulas bacterianas y componentes celulares. Download PDF

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ES2274983T3
ES2274983T3 ES02750798T ES02750798T ES2274983T3 ES 2274983 T3 ES2274983 T3 ES 2274983T3 ES 02750798 T ES02750798 T ES 02750798T ES 02750798 T ES02750798 T ES 02750798T ES 2274983 T3 ES2274983 T3 ES 2274983T3
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ES
Spain
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bacteriophage
proteins
protein
tail
bacteriophages
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ES02750798T
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Michael Schutz
Renate Grassl
Roman Meyer
Sibylle Frick
Ingrid Robl
Thomas Zander
Stefan Miller
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Profos AG
Original Assignee
Profos AG
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Abstract

Procedimiento para la purificación selectiva de células bacterianas o componentes celulares bacterianos, que incluye las siguientes etapas: a) poner en contacto una muestra que contiene células bacterianas o componentes celulares con proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o proteínas de cola de bacteriófagos; b) a continuación, incubar la muestra que contiene las células bacterianas o componentes celulares y las proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o proteínas de cola de bacteriófagos con un vehículo sólido, presentando el vehículo sólido uno o varios grupos de acoplamiento distintos sobre su superficie para la unión de bacterias y/o proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o proteínas de cola de bacteriófagos; c) separar el vehículo sólido con las células bacterianas o componentes celulares bacterianos unidos a él mediante las proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o proteínas de cola de bacteriófagos de la muestra.

Description

Procedimiento para la purificación de células bacterianas y componentes celulares.
La presente invención se refiere a un procedimiento para la purificación selectiva de células bacterianas y/o componentes celulares, en el que la purificación se lleva a cabo mediante un vehículo sólido.
El punto de partida de casi cada procesamiento posterior, análisis o aislamiento de componentes celulares es el enriquecimiento de las células, la "recolección celular". Ésta se lleva a cabo habitualmente mediante centrifugación. Esta etapa de centrifugación representa el problema principal en la automatización completa de procedimientos como la purificación de plásmidos, ya que además del alto coste técnico para la integración de una centrífuga en un robot de procesamiento correspondiente, es necesaria una precisión extremadamente alta en la posición de inicio y paro del proceso de centrifugación. Por tanto, los procedimientos automáticos de procesamiento posterior, análisis o aislamiento de componentes celulares empiezan generalmente con células ya enriquecidas, centrifugadas o sedimentadas fuera del robot de procesamiento. Así, por ejemplo, para un análisis rápido de genomas o proteomas completos, o también una rápida dilucidación de estructura y función en procedimientos de alto caudal, es esencial una automatización lo más completa posible de los procedimientos relevantes para ello. A este respecto, la automatización está ya ampliamente avanzada, por ejemplo, en el análisis de genoma: tanto el cultivo de bacterias como el aislamiento de plásmidos pueden llevarse a cabo automáticamente. Sin embargo, hasta ahora no se puede realizar una automatización completa del procedimiento incluyendo la recolección celular. No es posible especialmente una recolección celular selectiva, concretamente, el enriquecimiento específico de determinadas células a partir de una mezcla celular, con el procedimiento de recolección actualmente habitual.
Habitualmente, la recolección celular se lleva a cabo con el siguiente procedimiento: el procedimiento convencional de recolección celular es la centrifugación inespecífica de cultivos bacterianos. Para ello es necesaria precisamente una centrífuga de placa de microvaloración en procedimientos que deben diseñarse para un mayor caudal. Sin embargo, la centrifugación como tal no es adecuada para automatización.
Si bien la filtración de las células cultivadas a través de membranas de filtro correspondientes es posible como tal, sin embargo ésta posibilita también sólo un enriquecimiento inespecífico de las células. Además, el procedimiento está muy sujeto a averías en lo referente a obstrucciones en suspensiones celulares altamente enriquecidas y la alta viscosidad que presentan las disoluciones resultantes.
La clasificación celular activada por fluorescencia es un procedimiento en el que se utiliza una corriente líquida muy fina que posibilita una clasificación y enriquecimiento de células marcadas fluorescentes individuales mediante láser. Si bien mediante el uso del marcaje fluorescente correspondiente es posible una especificidad conocida del enriquecimiento, el procedimiento está limitado a volúmenes bajos y por tanto bajo caudal a causa de la fina corriente líquida. En consecuencia, sólo podrían enriquecerse bajas cantidades de células, lo que no es suficiente para el procesamiento posterior o análisis de componentes celulares. Los altos costes del equipamiento de aparatos reducen además una alta difusión de la técnica y frenan la paralelización que es necesaria para una recolección celular de alto
caudal.
En la separación celular magnética, se unen las células directamente mediante intercambiadores iónicos a partículas magnéticas y se concentran mediante la aplicación local de un campo magnético. Dichos procedimientos se comercializan desde hace poco para concentración inespecífica de bacterias por Chemagen (documento EP 1.118.676), Genpoint (documentos WO 01/53525, WO 98/51693), Merck (documento WO 00/29562), así como Promega (documento US 6.284.470) o Amersham (documento WO 91/12079) para automatización completa del reacondicionamiento de ADN de plásmidos genómicos incluida la recolección celular. Sin embargo, estas partículas magnéticas tienen la desventaja de que por un lado se unen a las bacterias de forma inespecífica, pero por otro lado no se unen a cada especie bacteriana igualmente bien. Debido a la inespecificidad de la unión, se observan incluso eficiencias de unión diferentes en distintas cepas de una especie (Merck, documento WO 00/29562).
Sun y col. (Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 25, 2000, páginas 273-275) dan a conocer partículas magnéticas recubiertas con estreptavidina sobre cuyas superficies se aplican bacteriófagos completamente biotinilados. Este sistema representa un bioabsorbente basado en bacteriófagos que puede usarse directamente para el enriquecimiento de bacterias de la especie S. enteritidis. Es una desventaja de este procedimiento que usa bacteriófagos completos que todavía podrían lisar en ciertas condiciones las células bacterianas que se van a purificar.
Por tanto, la invención se basa en el objetivo de proporcionar un procedimiento con el que puedan enriquecerse células bacterianas y componentes celulares de modo selectivo y totalmente automático, y que pueda incorporarse a un procedimiento de análisis o aislamiento automatizado, así como proporcionar vehículos sólidos para el enriquecimiento selectivo de células bacterianas o componentes celulares.
El objetivo se consigue mediante el objeto definido en las reivindicaciones.
Las siguientes figuras ilustran la invención.
La Figura 1 muestra en una gráfica la dependencia temporal de la unión dependiente de p12 de E. coli a perlas magnéticas. Los valores señalan la actividad \beta-galactosidasa de células inmovilizadas en unidades relativas. VIK (símbolos rombales) significa: procedimiento de dos etapas (preincubación de células y p12, unión posterior a perlas magnéticas). VC (cuadrados) significa: procedimiento de una etapa (prerrecubrimiento de p12 en perlas magnéticas, posterior inmovilización de células). -p12 (triángulos) significa: fondo (unión celular inespecífica a perlas sin p12).
La Figura 2 muestra en una gráfica la unión de E. coli a perlas magnéticas mediante el bacteriófago T4. Los valores señalan la actividad \beta-galactosidasa de células inmovilizadas en unidades relativas. VIK significa: procedimiento de dos etapas (preincubación de células y T4, unión posterior a perlas magnéticas). VC significa: procedimiento de una etapa (prerrecubrimiento de T4 en perlas magnéticas, posterior inmovilización de células). K significa: fondo (unión celular inespecífica a perlas sin T4).
La Figura 3 muestra en una comparativa gráfica los rendimientos de células de E. coli a partir de diferentes medios. -p12 caracteriza los resultados sin N-Strep-p12. +p12 caracteriza los resultados con N-Strep-p12. Las barras sombreadas muestran los resultados con la cepa LE392 de E. coli, las barras rellenas caracterizan los resultados con la cepa JM83 de E. coli, LB, SOB, SOC, TB e YT 2x designan los medios respectivos en los que se ha llevado a cabo el ensayo. Los valores se dan en forma de rendimientos en % de las células utilizadas, determinados mediante la dispersión del sobrenadante a 600 nm después de sedimentación de las células unidas mediante un imán.
La Figura 4 muestra gráficamente el resultado del aislamiento de plásmidos después de recolección de E. coli con p12 según el procedimiento de dos etapas. Cepa DH10b con plásmido pUC19: 1: aislamiento de ADN a partir de células centrifugadas mediante extracción en fase sólida, 2: aislamiento de ADN de células recogidas con el procedimiento de dos etapas según la invención mediante extracción en fase sólida, 3: aislamiento de ADN de células centrifugadas mediante perlas magnéticas, 4: aislamiento de ADN de células recogidas con el procedimiento de dos etapas según la invención mediante perlas magnéticas; 5: patrón.
La Figura 5 muestra en una representación gráfica el enriquecimiento de células de E. coli a partir de 10 ml de volumen de cultivo, partiendo de suspensiones celulares de distintas densidades celulares (10^{9}-10^{7} UFC/ml). Gráfica A: las barras rellenas señalan la actividad \beta-galactosidasa de las células unidas mediante N-Strep-p12, las barras sombreadas muestran el fondo sin p12. Gráfica B: las barras rellenas señalan la actividad \beta-galactosidasa de las células unidas mediante T4-bio, las barras sombreadas muestran el fondo sin T4.
La Figura 6 muestra esquemáticamente la recolección in vivo de E. coli mediante p12 biotinilada y perlas de estreptavidina. Las barras rellenas señalan la dispersión a 600 nm después de 2 h de crecimiento. Las barras sombreadas marcan la actividad \beta-galactosidasa de las células. Las abreviaturas significan: P12: determinaciones de las células inmovilizadas en las perlas, P12-EDTA: determinaciones de las células liberadas de las perlas después de la unión (sobrenadante después de tratamiento con EDTA), EDTA-p12: la inmovilización de las células en las perlas se redujo por la presencia de EDTA; determinaciones de células inespecíficas en las perlas, K: ensayo de control sin P12; determinaciones en las perlas.
La Figura 7 muestra tabularmente la unión selectiva de p12 a células bacterianas. La Tabla A enumera la unión dependiente de p12 de distintas cepas de E. coli. La Tabla B señala la especificidad de la unión dependiente de p12. La abreviatura n.d. representa no determinado, + significa unión de p12 a las bacterias dadas, - significa sin unión de p12 a las células.
La Figura 8 muestra representada gráficamente la especificidad de unión dependiente de p12. Los valores señalan los rendimientos de células inmovilizadas, determinados mediante la dispersión en el sobrenadante a 600 nm. Las barras sombreadas señalan los valores para unión celular mediante N-Strep-p12 (=unión específica). Las barras rellenas oscuras muestran los controles sin p12 (=adsorción inespecífica). Las barras rellenas claras señalan los valores para unión celular con p12, pero en presencia de EDTA 10 mM (= adsorción inespecífica).
La Figura 9 muestra fotos de microscopía de luz y microscopía de fluorescencia de la unión selectiva de E. coli a perlas magnéticas mediante T4-bio en un cultivo mixto de E. coli y Serratia marrescens. Las células de E. coli se marcaron fluorescentemente con T4-p12 marcado con FITC. Las imágenes de la izquierda muestran fotos de microscopía de luz, las imágenes de la derecha muestran fotos de microscopía de fluorescencia. Las imágenes superiores muestran fotos de un ensayo sin T4-bio, las imágenes inferiores muestran fotos de un ensayo con T4-bio.
La Figura 10 muestra en una representación gráfica el resultado de la recolección celular después del procedimiento de dos etapas con N-Strep-p12 a partir de disoluciones con distinto número de células. La relación S/N designa la relación señal/ruido (señal con N-Strep-p12 dividida entre señal sin N-Strep-p12) de la reacción de \beta-galactosidasa de las células de E. coli unidas, UFC/ml señala las células utilizadas (unidades formadoras de célula) por ml. Los cuadrados caracterizan los resultados de actividad \beta-galactosidasa mediante la medida con un sustrato luminiscente. Los rombos caracterizan los resultados de la actividad \beta-galactosidasa mediante medida con un sustrato fluores-
cente.
La Figura 11 muestra en una representación gráfica el resultado de recolección de células de E. coli después del procedimiento de una etapa con T4p12 unidas covalentemente a perlas EM2-100/49 magnéticas (Merck Eurolab). +p12 designa los resultados con perlas con T4p12, -p12 designa los resultados con perlas sin T4p12, DSMZ 613 designa los resultados con la cepa de E. coli DSMZ 613, DSMZ 13127 designa los resultados con la cepa de E. coli DSMZ 13127.
La Figura 12 muestra en una representación gráfica el resultado de recolección de células de E. coli después del procedimiento de una etapa con T4p12 adsorbido sobre perlas magnéticas de PVA. Los rombos caracterizan los resultados con las perlas PVA-011 (Chemagen). Los cuadrados caracterizan los resultados con las perlas PVA-012. Las líneas continuas designan los resultados con perlas sobre las que se ha adsorbido T4p12, las líneas discontinuas perlas sin T4p12. Los valores de DO600 señalan el % de células recogidas en % de la dispersión del sobrenadante después de sedimentación de las células unidas mediante un imán.
La expresión "proteínas de fagos" o "proteínas de bacteriófagos" usada en el presente documento designa todas las proteínas de bacteriófagos que participan en el reconocimiento y unión de células bacterianas o componentes celulares. Éstas pueden estar localizadas según el carácter morfológico de los fagos, por ejemplo, directamente en la cubierta de los fagos o bien en estructuras de reconocimiento especiales de las fibras de la cola. Como resultado, la expresión "proteínas de cola de bacteriófagos" designa las proteínas de fagos que representan la cola de bacteriófagos o parte de la cola de bacteriófagos.
La expresión "especificidad" aquí usada significa que los bacteriófagos o proteínas de fagos no sólo reconocen y se unen a un género o especie individual, o también a subespecies de células bacterianas o componentes celulares, sino también que muchos bacteriófagos o proteínas de fagos reconocen y se unen también a determinados grupos de bacterias.
La expresión "purificación" o "enriquecimiento" aquí usada significa la separación específica de células bacterianas o componentes de celulares de la disolución acuosa, por ejemplo, del medio de cultivo, en el que se encuentran las células bacterianas o componentes celulares. La purificación o enriquecimiento se lleva a cabo a este respecto con ayuda de vehículos sólidos, por ejemplo, partículas magnéticas, partículas de vidrio, partículas de agarosa, recipientes de reacción o placas de microvaloración.
Un aspecto de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para la purificación selectiva de células bacterianas o componentes celulares que incluye las siguientes etapas: (procedimiento de dos etapas)
a) poner en contacto una muestra que contiene células bacterianas o componentes celulares con proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o proteínas de cola de bacteriófagos, preferiblemente con una incubación de aproximadamente tres a cinco minutos;
b) posterior incubación de la muestra que contiene las células bacterianas o componentes celulares y las proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o proteínas de cola de bacteriófagos con un vehículo sólido, preferiblemente durante aproximadamente tres a treinta minutos;
c) separación del vehículo sólido con las células bacterianas o componentes celulares de la muestra unidos a él mediante las proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o proteínas de cola de bacteriófagos.
Con el procedimiento según la invención, pueden enriquecerse selectivamente células bacterianas o componentes celulares, por ejemplo, a partir de cultivos mixtos de distintas especies o de un cultivo de una especie. Los componentes celulares que se van a enriquecer pueden ser, por ejemplo, endotoxinas, proteínas, ácidos nucleicos o sacáridos. La selectividad del procedimiento se posibilita mediante la elección de las proteínas de bacteriófagos adecuadas. Las proteínas de bacteriófagos son especialmente adecuadas para el procedimiento según la invención para un enriquecimiento selectivo de bacterias o de componentes celulares, ya que los sistemas fagos-bacterias han evolucionado en la naturaleza durante largos periodos de tiempo, de modo que los fagos reconocen sus bacterias hospedadoras de forma altamente específica y con alta afinidad de unión. Para el procedimiento según la invención, se usan preferiblemente proteínas de bacteriófagos que son específicas de las bacterias que se desean detectar. Los bacteriófagos, como también las proteínas de bacteriófagos, se han desarrollado en condiciones ambientales adversas, de modo que son estables frente a influencias como variaciones de temperatura, pH (Burda y col., Biological Chemistry 2000, 381, 255-258) entre otras, y por consiguiente pueden utilizarse en los tampones de purificación más distintos.
Las proteínas de bacteriófagos que se usan dependen de qué tipos de bacterias se deban purificar. Para una purificación posterior de plásmidos, se prefieren proteínas de bacteriófagos que puedan unirse selectivamente a bacterias E. coli, ya que estas bacterias son actualmente convencionales para la preparación de plásmidos. Ahora está ya a disposición un gran número de bacteriófagos conocidos para la mayoría de las bacterias descritas hasta ahora, y pueden ser útiles para el enriquecimiento selectivo de bacterias. La siguiente tabla proporciona una revisión de bacterias y de los bacteriófagos específicos para ellas sin pretensión de cubrir la totalidad. Los fagos y las correspondientes bacterias hospedadoras se pueden obtener, entre otros, de las siguientes colecciones de cepas: ATCC (EE.UU.), DSMZ (Alemania), UKNCC (Reino Unido), NCCB (Holand) y MAFF (Japón). Además, pueden aislarse fácilmente bacteriófagos contra las correspondientes bacterias en caso necesario, por ejemplo, a partir de muestras ambientales mediante procedimientos estándar (Seeley, N.D. y Primrose, S.B., 1982, J. Appl. Bacteriol. 53, 1-17).
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Si se usan proteínas de fagos individuales, éstas ofrecen la ventaja de que aquí pueden aprovecharse las propiedades de una proteína individual, en lugar de un complejo de proteínas y ácidos nucleicos. Las proteínas de fago son muy estables (Burda y col., Biological Chemistry 2000, 381, 255-258); la estabilidad de una proteína individual es esencialmente más sencilla de controlar que de un complejo proteico. Es también importante la capacidad de ser más fácilmente modificadas a diferencia de los fagos completos (por ingeniería genética, pero también química), por ejemplo, por incorporación de "marcadores". Además, el uso de proteínas de fagos ofrece ventajas en determinados procedimientos posteriores como, por ejemplo, el aislamiento de ácidos nucleicos (ADN, ARN de plásmido, ADN genómico), ya que a diferencia del uso de fagos completos, es posible no tener ninguna impureza de ácido nucleico.
Se prefieren proteínas de cola de fago de la familia de Myoviridae, Poroviridae y Siphoviridae, especialmente proteínas de cola de fago cortas, especialmente las proteínas de cola de fago cortas de los "fagos T pares", por ejemplo, de T4, T2 o K3, especialmente la proteína de cola de bacteriófagos p12 de T4, p12 de T2 (número de acceso a GenBank X56555), p12 de K3 (véase Burda y col., 2000, Biol. Chem., vol. 381, pág. 256-258) o las proteínas de cola de bacteriófagos de los fagos Felix 01, P1 o PB1. A este respecto, las proteínas de cola de bacteriófagos cortas del fago T4 (p12) y de P1 se unen, por ejemplo, a Coliforme, la proteína de cola de fagos corta de Felix 01 a Salmonella, y la proteína de cola de fagos corta de PB1 a Pseudomonas.
Las proteínas de cola de fagos como p12 o la proteína de punta de cola P22 presentan una alta estabilidad frente a proteasas, detergentes, agentes caotrópicos, por ejemplo urea o clorhidrato de guanidina, o temperatura elevada (Goldenberg, D. y King, J.; "Temperature-sensitive mutants blocked in the folding or subunit assembly of the bacteriophage P22 tail spike protein, II. Active mutant proteins matured at 30ºC", 1981, J. Mol. Biol. 145, 633-651. Miller, S., Schuler, B. y Seckler, R. "Phage P22 tailspike protein: Removal of headbinding domain unmasks effects of folding mutations on native-state thermal stability", 1988, Prot. Sci. 7, 2223-2232; Miller, S., Schuler, B. y Seckler, R.; "A reversibly unfolding fragment of P22 tailspike protein with native structure: The isolated \beta-helix domain", 1998, Biochemistry 37, 9160-9168; Burda y col., 2000, Biol. Chem., vol, 381, pág. 256-258). La separación de la región de unión a la cabeza o a la placa base del fago de estas proteínas puede reducir una sensibilidad a la agregación eventualmente existente. De forma interesante, los dominios o subunidades individuales de estas proteínas son claramente menos estables que los trímeros intactos o sólo insignificantemente acortados (Miller y col., Prot. Sci., 1998; 7: 2223-2232. "Phage P22 tailspike protein: Removal of headbinding domain unmasks effects of folding mutations on native-state thermal stability"; Miller S. y col., Biochemistry 1998, 37: 9160-9168 "A reversibly unfolding fragment of P22 tailspike protein with native structure: The isolated \beta-helix domain"), o debido a su estructura tridimensional, probablemente apenas estables y funcionalmente expresables: los trabajos cristalográficos habían mostrado además que las proteínas de cola de fagos y proteínas de receptor de virus a menudo se presentan en forma de trímeros fuertemente enrollados en los que el extremo C terminal puede replegarse, un mecanismo que probablemente garantiza una protección adicional ante proteasas (Mitraki A., Miller S., van Raaij M.J., "Review: conformation and folding of novel Beta-structural elements in viral fiber proteins: the triple Beta-spiral and triple Beta-helix", J. Struct. Biol. 2002, 137 (1-2): 236-247). Además, estas proteínas se presentan en estado nativo en forma de homotrímeros. Con tres sitios de unión, los trímeros contribuyen mediante una elevación de la avidez a una unión más fuerte de las bacterias.
Debe aclararse aquí cómo las proteínas de cola de bacteriófagos se unen a bacterias individuales, por ejemplo, con los "fagos T pares" (por ejemplo, T4, T2, K3). En este grupo, hay por parte del hospedador dos componentes que son reconocidos por los fagos: en primer lugar, una proteína de superficie que es específica para fagos individuales, en segundo lugar el lipopolisacárido (LPS) que poseen todas las bacterias gram-negativas en forma modificada sobre su lado externo expuesto al ambiente. Las largas fibras de cola de los "fagos T pares" desempeñan un papel en el reconocimiento específico de las bacterias hospedadoras, mientras que el LPS sirve como receptor para las fibras cortas de cola. En el fago T4 de E. coli, es conocido que la interacción específica mediada por las fibras largas de cola con la bacteria hospedadora se hace irreversible en cuanto que las fibras cortas de cola se hayan unido también a la superficie bacteriana. La fibra corta de cola no es responsable de la especificidad exacta dentro del grupo de bacterias hospedadoras, y por tanto puede intercambiarse entre los distintos "fagos T pares".
Las proteínas de cola de bacteriófagos pueden producirse fácilmente de forma recombinante en grandes cantidades y purificarse usando marcadores adecuados o mediante procedimientos de separación estándar cromatográficos sencillos. Tanto los fagos como las cepas hospedadoras pueden obtenerse comercialmente en su mayoría a partir de colecciones de cepas, o pueden aislarse con medios sencillos. Sin embargo, para el procedimiento según la invención no se usan sólo las proteínas de cola de bacteriófagos de origen natural, sino también sus variantes. Variantes significa en el sentido de la presente invención que las proteínas de cola de bacteriófagos presentan una secuencia de aminoácidos modificada. Éstas pueden obtenerse mediante examen de las variantes de origen natural, o mediante mutagénesis aleatoria o mutagénesis dirigida, pero también mediante modificación química. Las proteínas de cola de bacteriófagos usadas para el procedimiento según la invención pueden adaptarse mediante una mutagénesis dirigida o aleatoria en su especificidad de hospedador o sus propiedades de unión a las estructuras vehículo. Mediante la mutagénesis, se introducen mutaciones que pueden ser adiciones, deleciones, sustituciones o modificaciones químicas de aminoácidos. Estas mutaciones causan un cambio de la secuencia de aminoácidos en la región de unión de los fagos o las proteínas de fago, con el objetivo de adaptar la especificidad y afinidad de unión a los requisitos de ensayo, por ejemplo, para aumentar o hacer irreversible la unión de bacterias a las proteínas de fagos aisladas para mejorar las posibilidades de lavado. Además, puede llevarse a cabo una modificación por ingeniería genética o bioquímica de las proteínas de fagos con el objetivo de eliminar la actividad enzimática presente dado el caso, para mejorar así la unión o hacerla irreversible.
Para la unión de las bacterias y/o componentes celulares que se van a purificar a las proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o proteínas de cola de bacteriófagos en el procedimiento de dos etapas, se pone la muestra en contacto, por ejemplo, un cultivo de una noche, con las proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o proteínas de cola de bacteriófagos, y preferiblemente se incuban. La incubación se realiza a una temperatura en el intervalo de 4 a 90ºC, preferiblemente a una temperatura en el intervalo de 4 a 45ºC, de forma especialmente preferida a una temperatura en el intervalo de 15 a 37ºC, de forma especialmente preferida a una temperatura en el intervalo de 20 a 37ºC, especialmente a TA, durante hasta 6 horas, preferiblemente hasta 4 horas, de forma especialmente preferida 2 horas, especialmente 1 hora, de forma especialmente preferida 1 a 20 minutos, de forma muy especialmente preferida 3 a 5 minutos. Por ejemplo, la incubación puede realizarse durante 2 a 120 min a 4 a 37ºC, preferiblemente durante 20 a 30 min a 25 o 37ºC, de forma especialmente preferida durante 3 a 5 min a 37ºC.
A continuación, se pone en contacto la muestra con vehículos sólidos y se incuba. Los vehículos sólidos pueden ser, por ejemplo, partículas magnéticas (paramagnéticas o ferromagnéticas), partículas de vidrio, partículas de agarosa, partículas de Luminex, recipientes de reacción o placas de microvaloración.
Si se usan partículas magnéticas, se añaden éstas a continuación a la muestra. Las partículas magnéticas se unen al complejo proteínas de bacteriófagos-bacterias/componente celular, que después puede separarse fácilmente mediante un dispositivo magnético de la muestra y purificarse. El dispositivo magnético puede estar colocado a este respecto en la parte externa del recipiente y activarse para enriquecimiento, de modo que las partículas magnéticas se reúnan en la pared del recipiente, o deslizarse a lo largo de la parte externa del recipiente, de modo que las partículas magnéticas se reúnan en el fondo del recipiente. Se prefiere el enriquecimiento con un imán permanente. El dispositivo magnético puede sumergirse también en el recipiente y en la muestra, de modo que las partículas magnéticas precipiten sobre el dispositivo magnético (el dispositivo magnético puede estar recubierto a este respecto con una punta de pipeta o un producto desechable comparable). En contraposición con las técnicas de centrifugación o filtración, las bacterias experimentan sólo fuerzas de cizalladura mínimas y por consiguiente pueden enriquecerse con altos rendimientos en caso necesario también activas/vivas. El sencillo manejo manual facilita un sencillo intercambio rápido de tampón/disolución, y puede llevarse a cabo tanto a gran escala como bien automatizado.
Las partículas magnéticas tienen un diámetro que permite unir una cantidad suficiente de células o componentes celulares a cada partícula. Preferiblemente, las partículas magnéticas tienen un diámetro en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 4 \mum, especialmente en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2 \mum, de forma especialmente preferida en el intervalo de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 1,8 \mum, de forma muy especialmente preferida de aproximadamente 1 \mum.
La unión del complejo de proteína de bacteriófagos-bacterias/componentes celulares al vehículo sólido, por ejemplo, partículas magnéticas, se realiza preferiblemente mediante grupos de acoplamiento adecuados, especialmente polipéptidos y/o sustancias de bajo peso molecular. Sin embargo, estos polipéptidos pueden ser también anticuerpos, lectinas, receptores o anticalinas específicos de proteínas de bacteriófagos. Además, las proteínas de bacteriófagos pueden estar ligadas a sustancias de bajo peso molecular, por ejemplo, biotina, para unirse mediante estas sustancias de bajo peso molecular a polipéptidos, por ejemplo, estreptavidina, que a su vez se han inmovilizado sobre el vehículo. En lugar de biotina, puede usarse el denominado marcador Strep (Skerra, A. y Schmidt, T.G.M., Biomolecular Engineering 16 (1999), 79-86), que es una secuencia corta de aminoácidos y se une a estreptavidina. Además, puede usarse el marcador His, que puede unirse mediante iones divalentes (cinc o níquel) o un anticuerpo específico del mismo (Qiaten GmbH, Hilden) a un material vehículo. El marcador Strep, así como el marcador His, se unen preferiblemente mediante tecnología de ADN recombinante a proteínas de bacteriófagos preparadas recombinantemente. Este acoplamiento puede realizarse dirigido, por ejemplo, a las terminaciones N o C. Ya que una alta constante de unión es esencial para un enriquecimiento eficaz, especialmente en el procedimiento de dos etapas, se prefiere especialmente la combinación de acoplamiento de biotina/estreptavidina con una kD de \sim10^{-15} M (Gonzales y col., J. Biol. Chem., 1997, 272 (17), pág. 11288-11294). Se ha mostrado que esta combinación de unión no covalente es mejor que la puesta a disposición por anticuerpos, anticalinas, receptores y lectinas.
Para la unión del complejo, se ponen en contacto las partículas magnéticas con el complejo de proteína de bacteriófagos-bacterias/componente celular y preferiblemente se incuban. La incubación se realiza a una temperatura en el intervalo de 4 a 90ºC, preferiblemente a una temperatura en el intervalo de 4 a 45ºC, de forma especialmente preferida a una temperatura en el intervalo de 15 a 37ºC, de forma especialmente preferida a una temperatura en el intervalo de 20 a 37ºC, especialmente a TA, durante hasta 6 horas, preferiblemente hasta 4 horas, de forma especialmente preferida 2 horas, especialmente 1 hora, de forma especialmente preferida 1 a 20 minutos, de forma muy especialmente preferida 3 a 5 minutos. Por ejemplo, la incubación puede realizarse durante 2 a 120 min a 4 a 37ºC, preferiblemente durante 20 a 30 min a 25 ó 37ºC, de forma especialmente preferida durante 3 a 5 min a 37ºC.
El procedimiento según la invención se lleva a cabo correspondientemente con otros vehículos sólidos que pueden añadirse a la muestra. Las condiciones de incubación y etapas de separación individuales deben adaptarse para los distintos vehículos sólidos correspondientes. Esto puede llevarse a cabo fácilmente mediante una serie de ensayos, y no el experto en la materia no necesita ninguna ilustración adicional en este sentido.
Como alternativa, el procedimiento de dos etapas puede llevarse a cabo también en vehículos sólidos recubiertos correspondientes, que no se añaden a la muestra sino que es la muestra la que se añade sobre o a los vehículos sólidos, por ejemplo, una placa de microvaloración o un recipiente de reacción. A este respecto, la muestra se añade después de la etapa a), por ejemplo, a las correspondientes depresiones de las placas de microvaloración, y allí se incuban, preferiblemente durante aproximadamente 20 a 30 minutos en condiciones por lo demás iguales a como se han descrito anteriormente. Las depresiones de una placa de microvaloración o las paredes internas de un recipiente de reacción pueden presentar los mismos recubrimientos que se describen anteriormente para las partículas magnéticas.
Los procedimientos según la invención (procedimientos de dos etapas) pueden usarse, por ejemplo, como sustitución de centrifugación, y por consiguiente posibilitan por primera vez la purificación automática de células bacterianas. Por tanto, es posible por primera vez una automatización completa, por ejemplo, del análisis de genoma, es decir, desde la inoculación de cultivos bacterianos hasta la determinación de la secuencia. Además, los procedimientos según la invención pueden usarse, por ejemplo, para el aislamiento de componentes celulares, especialmente de lipopolisacáridos, endotoxinas o exopolisacáridos.
Las realizaciones siguientes mediante acoplamiento o inmovilización de proteínas de bacteriófagos a partículas magnéticas son válidas correspondientemente también para el acoplamiento o inmovilización de proteínas de bacteriófagos y polipéptidos a vehículos sólidos (procedimiento de dos etapas). El recubrimiento de los vehículos sólidos con los polipéptidos o proteínas de bacteriófagos descritos anteriormente puede realizarse de distintos modos.
Las proteínas de bacteriófagos pueden fijarse mediante acoplamiento covalente a vehículos sólidos. La unión muy fuerte a los vehículos con ello factible posibilita el uso de condiciones de lavado más extremas para el lavado eventualmente necesario de las células para el procesamiento posterior de las células enriquecidas. El acoplamiento de las proteínas de bacteriófagos mediante adsorción es un procedimiento muy sencillo y económico. Mediante el acoplamiento de las proteínas de bacteriófagos mediante biotina/estreptavidina o sistemas de ligando/receptor comparables, es posible el procedimiento de dos etapas. La estreptavidina usada en esta preparación puede estar fijada tanto mediante adsorción como mediante acoplamiento químico. Es importante en el recubrimiento una inmovilización funcional, es decir, las proteínas de bacteriófago disponen de estructuras accesibles a las bacterias a pesar de la unión a los vehículos sólidos.
En el acoplamiento covalente, las proteínas de bacteriófagos pueden acoplarse, por ejemplo, mediante grupos amino primarios o grupos carboxilo a materiales vehículo ya activados por el fabricante, por ejemplo, partículas magnéticas de Merck, Estapor, etc., en condiciones habituales, por ejemplo, -NH_{2} mediante cloruro de cianurilo (Russian Chemical Rev. 1964, 33: 92-103), o -COO- mediante EDC (1-etil-3’-[3’-dimetilaminopropil]carbodiimida) (Anal. Biochem. 1990, 185: 131-135). Además, los vehículos sólidos pueden activarse directamente con procedimientos adecuados. Además, el acoplamiento puede realizarse mediante espaciador de maleimida o yodoacetilo dirigido, por ejemplo, a una cisteína introducida en el extremo N-terminal.
La inmovilización de las proteínas de bacteriófagos en material vehículo mediante adsorción puede llevarse a cabo mediante incubación de una disolución de proteínas de bacteriófagos en tampón acuoso, por ejemplo, Tris 100 mM, pH 7,3, o fosfato de sodio 100 mM, pH 7,5, PBS (fosfato de sodio 10 mM, pH 7,4, cloruro de sodio 150 mM), durante varias horas o durante toda la noche a 4 a 45ºC, preferiblemente a 15 a 37ºC, de forma especialmente preferida a 20 a 37ºC, de forma especialmente preferida a 37ºC o TA, de forma especialmente preferida a 30-65ºC durante 2-4 horas. Después de la adsorción, se retira la disolución de recubrimiento y se almacena la estructura vehículo en disolución acuosa, dado el caso tamponada.
Es otro aspecto de la invención un vehículo sólido, especialmente una partícula magnética o una placa de microvaloración, recubierta con proteínas de bacteriófagos o polipéptidos dirigidos contra proteínas de bacteriófagos. Estos polipéptidos pueden ser anticuerpos, lectinas, receptores o anticalinas específicos de proteínas de bacteriófagos.
Son otro aspecto de la invención proteínas de bacteriófagos con un marcador Strep, que presentan una cisteína expuesta en la superficie para biotinilización dirigida específica, por ejemplo, según las ID SEC Nº 5, 6 y 7. Es un ejemplo de p12 con marcador la secuencia de aminoácidos citada en la ID SEC Nº 8. Se prefiere una p12 con un marcador, especialmente con un marcador con una cisteína expuesta en la superficie, especialmente una p12 con un marcador según las ID SEC Nº 6 y 7. Esta biotinilización dirigida puede mediarse también mediante un espaciador o engarce adecuado. Es un aspecto adicional de la invención la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de bacteriófagos junto con el marcador Strep. Además, la presente invención se refiere a los aminoácidos con una secuencia según las ID SEC Nº 5, 6 y 7. Además, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos según las ID SEC Nº 5, 6 y 7.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a un kit para el enriquecimiento de células bacterianas y/o componentes celulares que incluye los vehículos sólidos según la invención, por ejemplo, partículas magnéticas, partículas de vidrio, partículas de agarosa, recipientes de reacción o placas de microvaloración, así como las disoluciones necesarias para el enriquecimiento de bacterias y/o componentes celulares con los reactivos de ensayo.
El kit para el enriquecimiento con partículas magnéticas contiene preferiblemente una disolución estabilizada de una variante de p12 con residuo de cisteína introducido N-terminal para biotinilización dirigida, o NS-T4p12 (o T4p12-bio) 1 mg/ml en TrisHCl 100 mM, pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,05% de Tween 20, suplementado con mezcla de inhibidores de proteasa (Sigma) en forma de disolución (preferiblemente, almacenamiento a 4ºC) o en forma de liofilizado. Además, una disolución de partículas compuesta por partículas magnéticas recubiertas con estreptavidina o estreptactina en disolución estabilizante (PBST con azida de sodio al 0,005%).
El kit para el enriquecimiento con placa de microvaloración contiene preferiblemente una disolución estabilizada de una variante de p12 con residuo de cisteína introducido N-terminal para biotinilización dirigida, o NS-T4p12 (o T4p12-bio) 1 mg/ml en TrisHCl 100 mM, pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,05% de Tween 20, suplementado con mezcla de inhibidores de proteasa (Sigma) en forma de disolución (preferiblemente, almacenamiento a 4ºC) o en forma de liofilizado. Además, una placa de microvaloración recubierta con estreptavidina o estreptactina.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no han de considerarse limitantes. A menos que se indique otra cosa, se usaron procedimientos convencionales de biología molecular como se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.
1. La purificación de T4p12 de tipo natural se realizó según las instrucciones descritas por Burda, M.R. y Miller, S., Eur. J. Biochem. 1999, 265 (2), 771-778.
2. Construcción de p12 con marcador Strep N-terminal (N-Strep-p-12): Mediante PCR se introdujo en el extremo 5’ del gen T4p12 la secuencia nucleotídica para el marcador Strep (patente de EE.UU. 5.506.121). Para ello, se construyó un cebador para el extremo 5’ del gen p12 (5’-GAA CGA ACT AGT CAT ATG GCT AGC TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC AGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3’ (ID SEC Nº 1) que contenía la secuencia nucleotídica del marcador Strep en su extremo 5’ (en cursiva en la secuencia) y que posee un sitio de corte de restricción (NdeI, subrayado en la secuencia), de modo que el gen puede utilizarse en un marco de lectura correcto en el plásmido de expresión. Para el extremo 3’ del gen p12, se construyó un cebador que introdujo detrás del gen p12 un sitio de corte de restricción BamHI (en cursiva en la secuencia) (5’-ACG CGC AAA GCT TGT CGA CGG ATC CTA TCA TTC TTT TAC CTT AAT TAT GTA GTT-3’) (ID SEC Nº 2). La PCR se llevó a cabo con 40 ciclos (1 min a 95ºC, 1 min a 45ºC y 1 min a 72ºC). Se cortó la preparación de PCR con las endonucleasas de restricción NdeI y BamHI y se utilizó el fragmento deseado después de fraccionamiento grueso mediante un gel de agarosa y elución del gel en el sitio NdeI y BamHI del plásmido de expresión pET21a (Novagen, Merck Eurolab, Darmstadt). Se comprobó la corrección de la secuencia del gen N-Strep-p12 mediante secuenciación de ADN. Las demás etapas hasta el plásmido pNS-T4p12pS7 se llevaron a cabo como se describe en Burda, M.R. y Miller, S. (Eur. J. Biochem., 1999, 265 (2), 771-778) para T4p12p57. Después, se transformó el plásmido pNS-T4p12p57 en la cepa de expresión BL21 (DE3) (Novagen, Merck Eurolab, Darmstadt).
3. Inserción de un resto de cisteína N-terminal en N-Strep-p12 (N-Strep-S3C-p12 y N-Strep-S14C-p12): la inserción de un resto de cisteína N-terminal (marcado en negrita) se llevó a cabo como se describe en 2, construyéndose para ello dos nuevos cebadores para el extremo 5’. Para N-Strep-S3C-p12, se usó el cebador 5’-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT TGT TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC AGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3 (ID SEC Nº 3), para el N-Strep-S14C-p12 se usó el cebador 5’-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT AGC TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC TGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3' (ID SEC Nº 4).
4. Purificación de proteína N-Strep-p12: Se llevó la cepa BL21 de E. coli (DE3) con el plásmido pNS-T4p12p57 en 2 l de cultivos agitados (medio LB con ampicilina 100 \mug/ml) hasta una DO600 de 0,5-0,7 a 37ºC, y se indujo la expresión de la proteína N-Strep-p12 mediante la adición de IPTG 1 mM (isopropil-\beta-tiogalactopiranósido). Después de incubación a 37ºC durante 4 h, se recogieron las células. Se suspendieron las células recogidas a partir de 10 l de cultivo en 50 ml de fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2, MgSO_{4} 2 mM, NaCl 0,1 M, se disgregaron mediante tratamiento con prensa French tres veces (137,9 MPa) y a continuación se centrifugaron durante 30 min a 15.000 rpm (SS34). Después de dos lavados con el mismo tampón, se extrajo la proteína N-Strep-p12 del sedimento mediante agitación durante 30 min en Tris-HCl 40 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, se centrifugó la preparación durante 30 min a 15.000 rpm (SS34) y se almacenó a 4ºC la NS-p12 disuelta en el sobrenadante. Se repitió la extracción dos veces, y se aplicaron los sobrenadantes purificados a una columna de afinidad de estreptactina (15 ml) equilibrada con tampón "W" (Tris-HCl 100 mM, pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM) (IBA GmbH, Gotinga). Después de lavar con 5 volúmenes de columna de tampón "W", se eluyó con 3 volúmenes de tampón "W" con destiobiotina 2,5 mM en tampón "W". Después de varias diálisis frente a tampón "W" y concentración, se determinó mediante PAGE-SDS y espectroscopía UV (Burda y col., 1999) la concentración y pureza de N-Strep-T4p12. A partir de 10 l de cultivo se purificaron así aproximadamente 100 mg de N-Strep-T4p12.
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5. Purificación alternativa de p12: Para ello, se suspendió el sedimento celular (a partir de 10 l de cultivo, BL21 (DE3) transformado con el plásmido pNS-T4p12p57 o pT4p12p57) en tampón 1 (fosfato de sodio 10 mM, pH 9, NaCl 500 mM, MgCl_{2} 4 mM) y se descompuso mediante prensa French (como se describe en 3). A continuación, se centrifugó el material a 20.000 rpm (SS-34) durante 45 minutos y se resuspendió (=se lavó) el sedimento en aproximadamente 25 ml de tampón 1. Se repitió dos veces esta etapa de lavado y se extrajo el sedimento con 25 ml de tampón 2 (NaPi 50 mM, pH 5, NaCl 100 mM, EDTA 25 mM). Para ello, se agitó el sedimento resuspendido para extracción durante 60 minutos a temperatura ambiente, y después se centrifugó (20.000 rpm (SS-34) durante 45 minutos). Se repitió dos veces esta extracción en caso necesario. Posteriormente, se combinaron los sobrenadantes de la extracción y se aplicaron directamente a una columna de intercambio aniónico (ResourceS, Pharmacia). Se usó como tampón móvil hidrogenofosfato de sodio 15 mM, formiato de sodio 15 mM, acetato de sodio 30 mM, pH 5,0, NaCl 50 mM. Se realizó la elución mediante un gradiente salino lineal de NaCl 50 mM a NaCl 600 mM en tampón móvil. Se dializó la p12 purificada, a continuación del almacenamiento, frente a Tris 50 mM, pH 8,5, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM o PBS, se congeló con N_{2} en alícuotas y se almacenó a -20ºC.
6. Biotinilización de p12: Para la biotinilización de la proteína p12 se usaron EZ-Link™-Sulfo-NHS-LC-LC-biotina o EZ-Link™-TFP-PEO-biotina de Pierce, EE.UU. y se llevó a cabo la biotinilización según las instrucciones dadas por el fabricante. A este respecto, se utilizaron para la biotinilización aproximadamente 30 moléculas de biotina por trímero de p12. A continuación, se comprobó y se cuantificó el acoplamiento de biotina con el ensayo HABA (Savage M.D., Mattson G., Desai S., Nielander G.W., Morgensen S. y Conklin E.J., 1992, "Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook", Pierce, Illinois). De media, se unieron finalmente 5-10 moléculas de biotina por trímero de p12.
7. Para la biotinilización de la cisteína introducida N-terminal, se utilizó EZ-Link™-PEO-maleimida-biotina y EZ-Link™-PEO-yodoacetilo-biotina de Pierce, EE.UU. según las instrucciones del fabricante. Se comprobó la reacción como se describe en 5.
8. Biotinilización del bacteriófago T4: Se purificó el bacteriófago según Bachrach U. y Friedmann A. (1971) "Practical procedures for the purification of bacterial viruses", Appl. Microbiol. 22: 706-715. Se dializó el fago purificado frente a PBS y se marcó con EZ-Link™-Sulfo-NHS-LC-LC-biotina o EZ-Link™-TFP-PEO-biotina de Pierce, EE.UU. según los datos del fabricante a una relación de 100-100.000 moléculas de biotina por fago.
9. Recolección dependiente de p12 de E. coli según el procedimiento de una etapa y el procedimiento de dos etapas (Fig. 1): En la unión según el procedimiento de una etapa (VC), se incubó la proteína N-Strep-p12 durante 1 h con las perlas magnéticas de estreptavidina (10 \mug de proteína/50 \mul de perlas al 1%) y a continuación se lavaron las perlas tres veces con PBST. Para la unión celular, se mezclaron 200 \mul de un cultivo de E. coli de una noche diluido 1 a 10 en LB (aproximadamente 1 x 10^{8} células/ml) por pocillo en una placa de microvaloración con 10 \mul de perlas recubiertas de N-Strep-p12, y se incubaron durante tiempos diferentes (Fig. 1) a TA. A continuación, se concentraron las perlas con las células unidas mediante un separador magnético (Bilatec AG, Mannheim) durante 3-5 min en la pared de los pocillos. Se lavaron las perlas tres veces con PBST y a continuación se determinó la actividad \beta-galactosidasa (Apte S.C. y col., 1995, Water Res., 29, 1803-1806) de las células restantes en las perlas. En la unión según el procedimiento de dos etapas, se incubó un cultivo de E. coli de una noche (aproximadamente 1 x 10^{8} células/ml) durante 1 h (en otros ensayos durante 1 min, 3 min, 10 min, 30 min) con la proteína N-Strep-p12 (10 \mug de proteína/ml de suspensión celular) a TA. A continuación, se añadieron 200 \mul de mezcla de proteína-célula a 10 \mul de perlas magnéticas de estreptavidina al 1% y se incubaron durante los tiempos dados en la Fig. 1 a TA. Para la determinación de las células unidas, se procedió a continuación como en el procedimiento de una etapa.
10. Unión dependiente de T4 de E. coli según el procedimiento de una etapa (VC) y según el procedimiento de dos etapas (VIK) (Fig. 2). En la unión según el procedimiento de una etapa (VC), se unió el fago T4 biotinilizado (100 moléculas de biotina/fago) durante 1 h a perlas de estreptavidina al 1% (10^{10} UFP/ml de perlas al 1%) y a continuación se lavaron las perlas tres veces con PBST. Después de la unión celular (25 \mul de perlas de fagos/ml de suspensión celular) durante 2 h, se lavaron las perlas y se detectaron las E. coli unidas mediante la actividad \beta-galactosidasa (datos en unidades relativas). En la unión según el procedimiento de dos etapas (VIK), se incubaron las células con los fagos biotinilizados durante 1 h (2,5 x 10^{8} UFP/ml de suspensión celular), y a continuación se incubó la mezcla durante 2 h con las perlas de estreptavidina (25 \mul de perlas al 1%/ml de suspensión celular). El proceso adicional fue como en el procedimiento de una etapa. Durante la incubación de fago y bacterias, se añadieron al medio los antibióticos rifampicina (25 \mug/ml), cloranfenicol (25 \mug/ml) y tetraciclina (2 \mug/ml).
11. Recolección de células de E. coli según el procedimiento de dos etapas a partir de distintos medios de crecimiento (Fig. 3): Se cultivaron las cepas LE392 y JM83 de E. coli durante una noche en el medio respectivo. Se añadió a 200 \mul de suspensión celular N-Strep-p12 (10 \mug/ml de suspensión celular). Después de 5 minutos de incubación a TA, se añadieron 10 \mul de perlas de estreptavidina al 1%, se mezclaron mediante tres bombeos con pipeta y se incubaron 5 min adicionales a TA. A continuación, se retiraron los complejos bacterias-perlas mediante el separador magnético anteriormente citado durante 3-5 min y se determinó en las células restantes en el sobrenadante la dispersión del sobrenadante a 600 nm.
12. Aislamiento de plásmido de E. coli después de recolección celular mediante el procedimiento de dos etapas (Fig. 4). Se recolectaron 300 \mul de cada cultivo de una noche de E. coli que contenía el plásmido pUC19 según el procedimiento de dos etapas como se describe en 9. Después de la retirada de las células mediante el separador magnético anteriormente citado, se aisló el plásmido una vez a partir de las células mediante un procedimiento de extracción en fase sólida (QIAprep, Qiagen, Hilden) y también mediante un procedimiento con perlas magnéticas (Bilatec, Mannheim) según los datos del fabricante.
13. Enriquecimiento de células de E. coli a partir de 10 ml de volumen de cultivo mediante N-Strep-p12 y mediante bacteriófagos biotinilizados T4-bio según el procedimiento de dos etapas (Fig. 5): Para el enriquecimiento con N-Strep-p12, se mezclaron 10 ml de cultivos de E. coli con 10^{9}, 10^{8} y 10^{7} células por ml con 30 \mug, o respectivamente 6 \mug, de proteína, y se centrifugaron durante 1 h a 37ºC. Para el enriquecimiento con T4-bio, se mezclaron 10 ml de cultivos con 10^{9}, 10^{8} y 10^{7} células por ml respectivamente con 10^{10} fagos T4-bio y 10 \mug de rifampicina/ml y 2 \mug de tetraciclina/ml, y se centrifugó durante 1 h a 37ºC. A continuación, se añadieron a las preparaciones 100 \mul de perlas magnéticas de estreptavidina al 1% y se centrifugó durante una hora adicional. Mediante un imán (ABgene, Hamburgo) se separaron las células unidas a las perlas magnéticas, se lavaron tres veces con PBST y se detectó su actividad de \beta-galactosidasa.
14. Recolección in vivo de E. coli mediante el procedimiento de dos etapas con p12 biotinilizada (Fig. 6): Se recolectaron células de E. coli (200 \mul de un cultivo) según el procedimiento de dos etapas como en el ejemplo 9 (10 \mug de p12 biotinilizada/ml de cultivo celular y 10 \mul de perlas de estreptavidina al 1%/ml de cultivo celular) y se lavaron las perlas dos veces con PBST. A continuación, se determinó la actividad de \beta-galactosidasa y se determinó el crecimiento de las células después de 2 h mediante la dispersión a 600 nm en fotómetro.
15. Selectividad de la recolección dependiente de N-Strep-p12 (Fig. 7 y 8): Se recolectaron 200 \mul de cada cultivo de una noche de distintas cepas de E. coli (Fig. 7), así como de distintas cepas de bacterias (Fig. 8) según el procedimiento de dos etapas (como se describe en el ejemplo 9). Después de la concentración de las perlas en separador magnético, se determinó la cantidad de células recogidas mediante la dispersión del sobrenadante a 600 nm.
16. Unión selectiva de E. coli a perlas magnéticas de estreptavidina mediante T4-bio y detección de E. coli mediante p12 marcada con FITC (Fig. 9). Se marcó la proteína p12 con FITC (Molecular Probes, Leiden) según los datos del fabricante y se dializó frente a PBS. Se añadió a un cultivo mixto (aproximadamente 10^{8-9} células/ml de E. coli y Serratia marcescens p12 marcada con FITC (5 \mug/ml). Después de 5 minutos de incubación a TA a oscuras, se añadieron 10^{9} fagos T4-bio y rifampicina (10 \mug/ml), cloranfenicol (25 \mug/ml) y tetraciclina (2 \mug/ml). Como controles se utilizaron fagos T4 no biotinilizados. Después de la incubación durante 10 min, se añadieron perlas de estreptavidina al 1% (10 \mul/ml) y se examinaron las preparaciones bajo el microscopio (Fig. 9).
17. Determinación del límite de detección para el aislamiento dependiente de N-Strep-p12 de células de E. coli según el procedimiento de dos etapas (Fig. 10): Se incubaron 300 \mul de diluciones de un cultivo de una noche de E. coli (10^{2}-10^{5} células/ml) en cada placa de microvaloración con N-Strep-p12 (10 \mug de proteína/ml) durante 1 h. A continuación, se añadieron perlas magnéticas de estreptavidina (100 \mul de perlas al 1%/ml), se mezclaron y se sedimentaron las células unidas mediante un imán (Bilatek, Mannheim). Se lavaron las perlas tres veces con PBST. Se realizó la detección de células de E. coli mediante sustratos de fluorescencia y luminiscencia para la \beta-galactosidasa.
18. Acoplamiento químico de T4p12 a perlas magnéticas (Fig. 11): Se lavaron 150 \mul de perlas magnéticas al 1% (EM2-100/40, Merck Eurolab, Francia) tres veces con tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 6, y se suspendieron en 40 \mul del tampón. Después de la adición de 120 \mul de disolución de EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) (30 mg/ml) e incubación durante 5 min a TA, se añadieron con pipeta 160 \mul de disolución de T4p12 (0,7 mg de proteína/ml de tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 6), se mezclaron y se incubó la preparación durante 2 h a TA. Mediante mezclado de un volumen de Tris-HCl 0,2 M, pH 7, Tween 20 al 0,05%, se detuvo la reacción de una noche a 4ºC. A continuación, se lavaron las perlas cuatro veces con PBST y se ajustaron al 1% con PBST. Se ensayó el acoplamiento de p12 a las perlas mediante un antisuero específico de p12. Se determinó la actividad de unión de las perlas de p12 mediante la unión de células de E. coli según el procedimiento de una etapa. Para ello, se incubaron 3 \mul de perlas p12 al 1% con 200 \mul de un cultivo de una noche de E. coli diluido 100 veces (aproximadamente 1 x 10^{7} células/ml) durante 5 min, se lavó tres veces con PBST y se detectaron las células unidas mediante su actividad de \beta-galactosidasa (Fig. 11).
19. Adsorción de p12 a distintas perlas magnéticas de poli(alcohol vinílico) (PVA) (Fig. 12): Se incubaron 200 \mul de perlas PVA al 2% (Chemagen AG, Baesweiler) con distintas cantidades de T4p12 (0-5 \mug de proteína/mg de perlas) en Tris-HCl 100 mM, pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 200 mM durante una noche a 37ºC. A continuación, se lavaron las perlas dos veces con PBST y se suspendieron en PBS al 2%. Se determinó la unión funcional de T4p12 a las perlas mediante la unión de células de E. coli. Para ello, se mezclaron 200 \mul de un cultivo de una noche de E. coli con 10 \mul de perlas p12 y se incubaron durante 5 min a TA. Después de la retirada de las células unidas, se midió la dispersión del so-
brenadante a 600 nm, y se puso en relación con la dispersión del cultivo de E. coli antes de la adición de las perlas.
<110> PROFOS AG
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<120> Procedimiento para la purificación de células bacterianas y componentes celulares
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<130> PRO-004 PCT
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<150> DE 10129815
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<151> 24-06-2001
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<160> 8
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<212> ADN
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<213> Secuencia preparada artificialmente
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<400> 1
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6 
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<211> 54
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\hskip-.1em\dddseqskip
acgcgcaaag cttgtcgacg gatcctatca ttcttttacc ttaattatgt agtt 
\hfill
54 
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\sa{Met Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ser Asn Asn}
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<400> 8
9
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Claims (16)

1. Procedimiento para la purificación selectiva de células bacterianas o componentes celulares bacterianos, que incluye las siguientes etapas:
a) poner en contacto una muestra que contiene células bacterianas o componentes celulares con proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o proteínas de cola de bacteriófagos;
b) a continuación, incubar la muestra que contiene las células bacterianas o componentes celulares y las proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o proteínas de cola de bacteriófagos con un vehículo sólido, presentando el vehículo sólido uno o varios grupos de acoplamiento distintos sobre su superficie para la unión de bacterias y/o proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o proteínas de cola de bacteriófagos;
c) separar el vehículo sólido con las células bacterianas o componentes celulares bacterianos unidos a él mediante las proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o proteínas de cola de bacteriófagos de la muestra.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el grupo de acoplamiento es una lectina, receptor o anticalina.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el grupo de acoplamiento es una estreptavidina o avidina y las proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o proteínas de cola de bacteriófagos están acopladas con biotina o un marcador Strep.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el vehículo sólido es una partícula magnética, partícula de agarosa, partícula de vidrio, partícula de Luminex, recipiente de reacción o una placa de microvaloración.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se añaden dos o más proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o proteínas de cola de bacteriófagos distintas.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el componente celular bacteriano que se va a purificar es endotoxina.
7. Partícula magnética recubierta con proteínas de cubierta de bacteriófagos y /o proteínas de cola de bacteriófagos aisladas.
8. Partícula magnética según la reivindicación 7, en la que las proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o proteínas de cola de bacteriófagos se seleccionan del grupo de
0c1r, 10tur, L2, L51, M1, MVG51, MV-L1, O1, SpV1, V1, V1, V2, V4, V5, 108/016, 119, 29, 37, 43, 51, 59.1, A1-Dat, Aeh2, Bir, M1, MSP8, \diameter115-A, \diameter150A, \diameter31C, P-a-1, PhiC, R1, R2, SK1, SV2, VP5, Ap3, AP4, Mm1, Mm3, Mm4, Mm5, phiUW 51, 43, 44RR2.8t, 65, Aeh1, PM1, PIIBNV6, PS8, psi, PT11, 8764, A5/A6, A6, PM2, W11, W2, W4, W7, 1A, alpha, AP50, BLE, F, G, GA-1, II, Py-1, mor1, MP13, MP15, \diameter105, \diameter29 (phi 29), \diameterNS11, PBP1, PBS1, SP10, SP15, SP3, SP8, SPP1, SP\beta, SPy-2, SST, tipo, 168, W23, SP50, W23, SP01, MAC-1, MAC-2, MAC-4, MAC5, MAC-7, Tb, \diameterCb12r, \diameterCb2, \diameterCb23r, \diameterCb4, \diameterCb8r, \diameterCb9, \diameterCP18, \diameterCP2, \diameterCr14, \diameterCr28, O11, O13, O2, O3, O5, O6, O8, 1, phi.CPG1, Ce\beta, F1, HM2, HM3, HM7, 7/26, A, A19, AN25S-1, Arp, AS-1, BL3, CONX, MT, N1, \diameterA8010, S-6(L), \beta, A-4(L), AC-1, LPP-1, S-2L, S-4L, SM-1, P1, T1, Tula, Tulb, Tull, 1\diameter3, 1\diameter7, 1o9, 2D/13, Ae2, alpha10, alpha3, BE/1, BF23, dA, delta1, delta6, d\diameter3, d\diameter4, d\diameter5, Ec9, eta8, f1, fd, G13, G14, G4, G6, HK022, HK97, HR, lambda, M13, M13mp18, M20, MM, MS2, Mu, O1, \diameter80, \diameterA, \diameterR, \diameterX174, PA-2, P1, P1D, P2, P22, Q\beta, R17, S13, St-1, T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7, WA/1, WF/1, WW/1, zeta3, ZG/2, ZJ/2, C21, omega 8, U3, chi, FC3-9, \mu2, 01, 11F, 121, 1412, 3, 3T+, 50, 5845, 66F, 7480b, 8893, 9, 9266, a1, alpha 15, b4, B6, B7, Beccles, BZ13, C-1, C16, C2, C-2, DdVI, Esc-7-11, f2, fcan, FI, Folac; fr, GA, H, H-19J, 12-2, lalpha, ID2, If1, If2, Ike, JP34, JP501, K19, KU1, M, M11, M12, MS2, NL95, \diameter92, \diameterl, \diameterii, omega8, pilHalpha, PR64FS, PRD1, PST, PTB, R, R17, R23, R34, sd, SF, SMB, SMP2, SP, \beta, ST, tau, tf-1, TH1, TW18, TW28, Vill, VK, W31, X, Y, ZG/1, ZIK/1, ZJ/1, ZU3, ZS/3, AP3, C3, 1b6, 223, fri, hv, hw222a, \diameterFSW, PL-1, y5, 1, 643, c2, kh, ml3, PO08, P127, 1358, 1483, 936, 949, BK5-T, c2, KSY1, P001, P008, P107, P335, P034, P087, pro2, 4211, psi M2 (\psiM2), N1, N5, Br1, C3, L3, I3, lacticola, Leo, \diameter17, R1-Myb, N13, N18, N24, N26, N36, N4, N5, X1, X10, X24, X3, X5, X6, D3, D4, 22, 32, AU, C-2, P1, P2, P3, P4, Phi CT, phi CTX, PB-1, 12S, 7s, D3, F116, gh-1, gh-1, Kf1, M6, \diameter1, \diameterKZ, \diameterW-14, Pf1, W3, 2, 16-2-12, 2, 317, 5, 7-7-7, CM1, CT4, m, NM1, NT2, \diameter2037/1, \diameter2042, \diametergal-1-R, WT1, Mp1, MP2, W1, épsilon15, Felix 01, 16-19, 7-11, H-19J, Jersey, N4, SasL1, Vil, ZG/3A, San21, A3, A4, P22, 4, C1/TS2, Sp1-, 107, 187, 2848A, 3A, 44AHJD, 6, 77, B11-M15, Twort, 182, 2BV, A25, A25-24, A25-omega8, A25-PE1, A25-VD13, CP-1, Cvir, H39, P23, P26, phi A.streptomycini III, phi8238, phiC31, S1, S2, S3, S4, S6, S7, SH10, Tb1, Tb2, Ts1, 06N-22P, 06N-58P, 06N-58P, 4996, alpha3alpha, I, II, III, IV, kappa, nt-1, OXN-100P, OXN-52P, v6, Vf12, Vf33, VP1, VP11, VP3, VP5, X29, Cf, Cf1t, RR66, 8/C239, phiYe03-12, YerA41.
9. Partícula magnética según la reivindicación 7 u 8 con un diámetro de aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 4 \mum o aproximadamente 0,8 \mum hasta aproximadamente 1,8 \mum.
\newpage
10. Proteína de cubierta de bacteriófagos o proteína de cola de bacteriófagos que incluye un marcador, presentando el marcador una secuencia de aminoácidos según la ID SEC Nº 5, 6 ó 7.
11. Proteína de cola de bacteriófagos según la reivindicación 10, en la que la proteína de cola de bacteriófagos es la proteína p12 del fago T4.
12. Proteína de cubierta de bacteriófagos o proteína de cola de bacteriófagos según una de las reivindicaciones 10 a 11, en la que la proteína de cubierta de bacteriófagos o la proteína de cola de bacteriófagos se prepara mediante la técnica de recombinación de ADN.
13. Ácido nucleico que codifica una proteína de cubierta de bacteriófagos o una proteína de cola de bacteriófagos según una de las reivindicaciones 10 a 12.
14. Aminoácido con una secuencia según las ID SEC Nº 6, 7 u 8.
15. Uso de partículas magnéticas según una de las reivindicaciones 7 a 9 o de proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o de proteínas de cola de bacteriófagos según una de las reivindicaciones 10 a 12 para el aislamiento de ácidos nucleicos, especialmente para la preparación de plásmidos, de componentes celulares bacterianos, especialmente de lipopolisacáridos, endotoxinas o exopolisacáridos.
16. Kit para la purificación de células bacterianas y/o componentes celulares bacterianos, que incluye las partículas magnéticas según una de las reivindicaciones 7 a 9 y/o las proteínas de cubierta de bacteriófagos y/o las proteínas de cola de bacteriófagos según una de las reivindicaciones 10 a 12.
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