ES2273680T3 - Conjugados de celulas de mamiferos con un hapteno y metodos de preparacion y utilizacion de los mismos. - Google Patents

Abstract

Una composición para inducir una respuesta anti-tumor, en un paciente humano que padece un tumor, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de células de tumor que: (i) se conjugan a un hapteno; (ii) son del mismo tipo de tumor que el tumor del paciente (iii) no son alogénicas al citado paciente donde la conjugación a hapteno hace a las células del tumor incapaces de crecimiento en el cuerpo del paciente, y donde las citadas células de tumor no son tratadas aparte para hacerlas incapaces de crecimiento en el cuerpo del paciente.

Description

Conjugados de células de mamíferos con un hapteno y métodos de preparación y utilización de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a conjugados de células de mamíferos con un hapteno, y a métodos para obtención y utilización de los mismos. La conjugación de hapteno a células de mamífero es una estrategia alternativa para evitar la proliferación de las células, que puede utilizarse en lugar del tratamiento de irradiación convencional. Las composiciones que comprenden células de tumor modificadas con hapteno y extractos de células de tumor, y los métodos de tratamiento de cáncer por administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende células de tumor o extracto de células de tumor a un sujeto que necesita tal tratamiento, entran también dentro del marco de la invención. La invención proporciona también un esquema de vacunación eficaz que es útil para inducir una respuesta antitumor en un paciente que padece cáncer.

Antecedentes de la invención Prevención del crecimiento de células de mamífero

En varios procedimientos in vitro e in vivo utilizando células de mamífero, existe la necesidad de evitar el crecimiento y división de las células del mamífero, es decir, su proliferación. Tradicionalmente, se ha utilizado la irradiación con este propósito. Por ejemplo, se ha utilizado la irradiación de las células de tumor de mamífero, previamente a la administración, como una vacuna para un paciente de melanoma (Berd y col. Cancer Res. 1986; 46; 2572-77. De manera similar, Mc Cune y col. (Cancer 1981; 47: 1984-87) describen la irradiación de células de carcinoma renal con propósitos terapéuticos. Sin embargo, en esta área, permanece la necesidad de una estrategia para prevenir la proliferación de las células que no suponga irradiación de las células.

Vacunas de células de tumor conjugadas a hapteno

Una vacuna de células completas autólogas modificadas con el hapteno dinitrofenilo (DNP) ha demostrado producir respuestas inflamatorias en lugares metastáticos de pacientes con melanoma La terapia coadyuvante post-quirúrgica con vacuna modificada con DNP produce tasas de supervivencia que son marcadamente más altas que las registradas para la cirugía sola. Para la vacuna son preferibles células intactas o viables.

La Patente estadounidense 5.290.551 para David Berd, describe y reivindica composiciones de vacuna que comprenden células de melanoma haptenizadas. Los pacientes de melanoma que han sido tratados con estas células han desarrollado una fuerte respuesta inmune. Esta respuesta podía ser detectada como una respuesta de hipersensibilidad tipo retardado (DTH) a células de tumor haptenizadas y no-haptenizadas. Más importante es que la respuesta inmune daba lugar a tasas de supervivencia incrementadas de pacientes de melanoma.

Las vacunas de células de tumor haptenizadas están descritas también para otros tipos de cáncer, que incluyen cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer de ovario y leucemia (véase Solicitud de Patente estadounidense No. 08/203.004, registrada el 28 de febrero de 1994; Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US96/09511; Solicitud de Patente U.S. No. 08/899.905, registrada el 24 de julio, 1997).

Aunque los estudios anteriores describen métodos de inmunoterapia utilizando células de tumor conjugadas con hapteno que han resultado con éxito, permanece aún la necesidad, en el tratamiento del cáncer, de métodos adicionales y mejorados para inducir una respuesta anti-tumor y células de tumor modificadas con hapteno mejoradas. Los solicitantes han descubierto ahora sorprendentemente un método simplificado para la preparación de células de tumor modificadas con hapteno que elimina la necesidad de irradiación, lo que ofrece ventajas de procedimiento y financieras en la producción de vacunas de células de tumor modificadas con hapteno.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a células de mamífero en composiciones en estado substancialmente no-proliferativo, que contienen células de tumor modificadas con hapteno para inducir una respuesta antitumor en un paciente que padece cáncer donde la conjugación de hapteno hace que las células de tumor sean incapaces de crecimiento en el cuerpo del paciente y donde las citadas células de tumor no se tratan aparte para hacerlas incapaces de crecimiento en el cuerpo del paciente.

En otro modo de realización, la presente invención se refiere a un método para poner una célula de mamífero in vitro en un estado substancialmente no proliferativo, que no comprende irradiación de la célula.

En aún otro modo de realización, la presente invención se refiere a una composición que comprende una célula de tumor de mamífero modificada con hapteno en un estado substancialmente no proliferativo.

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En aún otro modo de realización, la invención proporciona una composición de vacuna que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula de tumor de mamífero, preferiblemente humano, modificada con hapteno que está substancialmente en un estado no-proliferativo.

La presente solicitud describe un método de tratamiento de cáncer que comprende la administración a un mamífero, preferiblemente un humano, de una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula de tumor humano modificada con hapteno, que no ha sido expuesta a irradiación donde el citado mamífero sufre un tumor maligno del mismo tipo que la citada membrana celular del tumor.

La presente solicitud describe además un método de tratamiento de cáncer por vacunaciones semanales utilizando las composiciones de células de tumor modificadas con hapteno no proliferativas aquí descritas.

La invención se refiere a un método simplificado para obtener las composiciones de células de tumor modificadas con hapteno no proliferativas de la invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a células de mamífero conjugadas con un hapteno y métodos de obtención y utilización de las mismas. La conjugación del hapteno a las células de mamífero constituye una estrategia alternativa para evitar el crecimiento celular, es decir, la multiplicación, y se puede utilizar en lugar de un tratamiento de irradiación convencional. Según esto, la invención se refiere en general a células de mamífero, por ejemplo células humanas, que están substancialmente en un estado no-proliferativo y un método de colocación de células en tal estado por conjugación de las mismas con un hapteno. Además, las composiciones y métodos descritos en las siguientes solicitudes PCT se pueden modificar ventajosamente según la presente invención: PCT/US 96/09511 (WO 96/40173), PCT/US97/15741. (WO 98/14206), PCT/US98/20888, PCT/US98/16660, PCT/US99/27442, PCT/US99/07725 (WO99/52546) y
PCT/US99/31297.

La presente invención se refiere también a inmunoterapia de cáncer. En la solicitud se incluyen una composición de tumor y métodos de tratamiento de cáncer. La solicitud se refiere además a un método de inducción de una respuesta antitumor por vacunación semanal con composiciones de células de tumor conjugadas con hapteno no proliferativas producidas por el método simplificado de la invención.

Para los propósitos de la presente invención, una respuesta antitumor es una de las siguientes: necrosis de tumor, regresión de tumor, inflamación del tumor, infiltración de tumor por linfocitos T activados, respuesta de hipersensibilidad tipo retrasado y prolongación de la supervivencia del paciente. Las células de tumor y extractos de la invención y composiciones de las mismas son capaces de elicitar linfocitos T que tienen la propiedad de infiltrarse en un tumor de mamífero, elicitar una respuesta inmune inflamatoria a un tumor de mamífero, elicitar una respuesta de hipersensibilidad tipo retrasado a un tumor de mamífero y/o estimulación de linfocitos T in vitro.

Una respuesta antitumor resultante del tratamiento según la presente invención puede ser una regresión parcial o completa del tumor metastático o una enfermedad estable. Una regresión "completa" indica una regresión de aproximadamente un 100% durante un período de aproximadamente 1 mes, más preferiblemente durante un período de al menos tres meses. Una regresión "parcial" indica una regresión más de aproximadamente 50% de regresión durante un período de al menos un mes, más preferiblemente durante un período de al menos tres meses. Una enfermedad "estable" indica un estado en que no hay crecimiento significativo del tumor después del tratamiento de vacuna. Otra respuesta anti-tumor que puede observarse siguiendo el tratamiento de la invención es la prolongación de la supervivencia.

Cualquier tumor maligno puede tratarse según la presente invención incluyendo los cánceres primarios y metastáticos y los tumores no-sólidos. Entre los tumores sólidos se incluyen carcinomas, y los tumores no-sólidos incluyen malignancias hematológicas. Los carcinomas incluyen, sin que quede limitado a ellos, adenocarcinomas y carcinomas epiteliales. Las malignancias hematológicas incluyen leucemias, linfomas, y mielomas múltiples. Los siguientes son ejemplos no-limitativos de los cánceres tratables con membranas de células de tumor modificadas aisladas según los métodos de la presente invención: cáncer de ovario, que incluye cáncer de ovario avanzado, leucemia, que incluye sin limitarse solo a éste, leucemia mielógena aguda, cáncer de colon, que incluye cáncer de colon con metástasis a hígado, cáncer rectal, cáncer co-rectal, melanoma, cáncer de mama, de pulmón, de riñón y de próstata. Los cánceres de ovario pueden ser adenocarcinomas o carcinomas epiteliales. Los cánceres de colon y de próstata son adenocarcinomas. Las leucemias pueden originarse de médula de hueso mieloide o nódulos linfáticos. Las leucemias pueden ser agudas, que se presentan por detención de la maduración a un estado primitivo del desarrollo, y crónicas, exhibidas por exceso acumulativo de células linfoides maduras o mieloides. El cáncer de estadio I, II, III ó IV puede ser tratado según la presente invención, preferiblemente los estadios III y IV, incluso más o preferiblemente el estadio III. Cualquier mamífero, preferiblemente un humano, se puede tratar según la presente
invención.

Las composiciones de la presente invención se preparan a partir de una célula de tumor o un extracto de células de tumor. Una célula de tumor puede ser una célula maligna o pre-maligna de cualquier tipo de cáncer. Según la presente invención, pre-maligna se refiere a cualquier célula anormal que sugiere célula de cáncer que aún no es una célula cancerosa; tal como, y sin que se limite solo a ellos, cambios displásicos en células cervicales que en último caso conducen a cáncer cervical, y nevos displásicos que son células de piel anormales que conducen a
melanoma.

Las células tumorales y los extractos provienen preferiblemente del tipo de cáncer que ha de tratarse. Por ejemplo, para tratar cáncer del tipo melanoma se utilizan células o extracto de células de melanoma. Las células de tumor y los extractos pueden ser, sin que se limite a ellos, células autólogas y alogénicas disociadas de muestras de biopsia o cultivo de tejidos, así como células impulsoras, y extractos de estas fuentes. En un modo de realización preferido, las células y extractos son autólogos. Se puede, sin embargo, utilizar cualquier célula no alogénicas, incluyendo células de tumor producidas en cultivo de células autólogas aisladas del tumor del paciente Las células de tumor no necesitan ser completamente idénticas genéticamente (es decir, al 100%) a la célula de tumor o a la célula somática no tumoral del paciente tratado. Por lo general es suficiente la identidad genética de las moléculas de MHC entre la célula y el paciente. Además, puede haber identidad genética entre un antígeno particular en la célula del melanoma y un antígeno presente en las células de tumor del paciente. La identidad genética puede determinarse según los métodos conocidos en la técnica. Para los propósitos de la presente invención, una célula de tumor que ha sido alterada genéticamente (utilizando, por ejemplo, tecnología de ADN recombinante) para que se haga genéticamente idéntica con respecto a, por ejemplo, las moléculas MHC particulares del paciente y/o el antígeno particular en las células cancerosas del paciente entra dentro del significado "no alogénica" y dentro del marco de la presente invención. Estas células se pueden citar también como células "idénticas a MHC" o "compatibles con MHC"

Las células T son linfocitos que median dos tipos de funciones inmunológicas, efectoras y reguladoras, secretan proteinas (linfocinas), y matan otras células (citotoxicidad). Las funciones efectoras incluyen reactividad tal como hipersensibilidad retardada, rechazo de alo-injerto, inmunidad a tumor y reactividad de injerto-frente-a-huésped. La producción de linfocinas y la citotoxicidad se muestran por funciones efectoras de células T. Las funciones reguladoras de células T se representan por su capacidad de amplificar citotoxicidad mediada por células por otras células T y producción de inmunoglobulina por células B. Las funciones reguladoras requieren también la producción de linfocinas. Las células T producen gamma interferon (IFN\gamma) en respuesta a un estímulo de inducción que incluye, y no se limita solo, a mitógenos, antígenos o lectinas.

La proliferación de células T se puede observar por captación por las células T de ácidos nucleicos modificados tales como, y sin que quede limitado a ellos, ^{3}H-timidina, ^{125}I-UDR (yododesoxiuridina); y colorantes tales como bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol)-2-il-2,5-difeniltetrazolio (MTT) que tiñe las células vivas. Además, la producción de citocinas tales como IFN\gamma, factor de necrosis de tumor (TNF) e IL-2 (sin que quede limitado a ellos). La producción de citocinas se hace preferiblemente en una cantidad superior a 15 picogramos/ml, más preferiblemente aproximadamente 20 a aproximadamente 30 picogramos/ml, incluso más preferiblemente aproximadamente 50 picogramos/ml.

Las células de tumor de la presente invención pueden ser células vivas. De acuerdo con la invención, las células de tumor no pueden crecer en el cuerpo del paciente después de la inyección como consecuencia solamente de haptenización, por ejemplo, con DNP, en otras palabras, las células están "substancialmente en fase de no crecimiento"

Otros métodos de evitar el crecimiento de células son conocidos por los especialistas, por ejemplo, las células de tumor pueden ser irradiadas antes de su uso. En un modo de realización, se irradian las células o extractos a aproximadamente 2500 cG\gamma para evitar el crecimiento de las células después de inyección. La ventaja sorprendente de la invención es que las células de la invención no son irradiadas o tratadas separadamente de otra manera para evitar su crecimiento en el cuerpo de un humano porque la haptenización sola evita el crecimiento de las células tumorales después de la inyección como se muestra en el Ejemplo 1. Para los propósitos de la presente invención, la expresión "tratadas separadamente para hacer que las células de tumor (o células de mamífero en general) no puedan crecer en el cuerpo de un paciente" significa que el único medio para hacer que las células se vuelvan incapaces de crecimiento en un humano es el de la conjugación con hapteno, y no se utiliza ningún otro método (tal como irradiación) aparte de la haptenización para este propósito.

En un modo de realización de la invención, se conjuga una célula de mamífero con un hapteno para ponerla en una fase substancialmente de no crecimiento. Preferiblemente las células no se tratan aparte (es decir además de la haptenización) para hacerlas incapaces de crecimiento. Preferiblemente, las células no se tratan separadamente (es decir, además de la haptenización) para hacerlas incapaces de crecimiento. Estas células de mamífero son útiles, por ejemplo, en cualquier procedimiento, tratamiento o ensayo conocidos por los especialistas en el área en que tradicionalmente se utilizan las células irradiadas.

La composición de la invención se puede emplear, en el método de la invención, individualmente o en combinación con otros compuestos, que incluyen, sin que quede limitado solo a ellos, otras composiciones de la invención. Para los propósitos de la presente invención, la co-administración incluye la administración conjunta o sucesiva. Las células de cáncer pueden co-administrarse con otros compuestos que incluyen, sin que quede limitado solo a ellos, citocinas tales como interleucina-2, interleucina-4, gamma interferón, interleucina-12 y GM-CSF: Las células de tumor de la invención se pueden utilizar también en unión con otros tratamientos de cáncer que incluyen,sin limitarse solo a ellos, quimioterapia, radiación, anticuerpos, secuencias de oligonucleotidos y secuencias de oligonucleótidos
anti-sentido.

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Las composiciones de la invención se pueden administrar en mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable, que se selecciona dependiendo de la vía de administración y la práctica farmacéutica convencional. Las dosificaciones se pueden fijar dependiendo del peso y estado clínico del paciente. La relación proporcional de ingrediente activo a vehículo depende naturalmente de la naturaleza química, solubilidad, y estabilidad de las composiciones, así como de la dosificación contemplada. Se pueden emplear cantidades de células y extractos de células de la invención dependiendo de factores tales como la afinidad del compuesto para las células cancerosas, la cantidad de células cancerosas presentes y la solubilidad de la composición. La composición de la presente invención se puede mezclar con una substancia coadyuvante inmunológica y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se pueden emplear, según la presente invención, cualquiera de los vehículos acuosos conocidos útiles en la administración de fármacos, tales como, sin que quede limitado solo a ella, solución salina. Además, puede ser útil cualquier coadyuvante en la administración de la presente invención, de los conocidos por los especialistas. El coadyuvante tiene la propiedad de aumentar la respuesta inmune a preparaciones de células de tumor de la presente invención. Ejemplos representativos de coadyuvantes son BCG, o el coadyuvante sintético QS-21 que comprende una saponina homogénea purificada a partir de corteza de Quillaja saponaria, Corynebacterium parvum (McCune y col, Cancer; 1979; 43:1619), saponinas en general, endotoxina detoxificada y citocinas tales como interleucina-2, interleucina-4, gamma-interferon (IFN-\gamma), Interleucina-12, interleucina-15, GM-CSF y cualquier combinación de
ellos.

Alternativamente, las células de tumor se pueden añadir a células que presentan antígeno. La célula de tumor se puede utilizar para tratar cáncer junto con otro tipo de célula, una célula que presenta antígeno, seleccionada del grupo que consiste en macrofagos cultivados autólogos y células dendríticas cultivadas autólogas. Los macrofagos son cualquier célula mononuclear ameboide grande, independientemente de su origen, tal como, y sin que quede limitado solo a ellos, histocitos y monocitos, los cuales fagocitan, es decir engullen y destruyen, otras células, tejido muerto, células degeneradas. Los macrófagos son células que presentan antígeno, incluyendo los antígenos de tumor, para células que incluyen células T. Las células dendríticas son también células que presentan antígeno y parecen estrechamente relacionadas con los macrofagos, sin embargo, las células dendríticas son células que presentan antígenos más eficaces que los macrofagos. Estos son estimuladores potentes de células T y pueden aislarse a partir de una diversidad de órganos y tejidos del cuerpo, incluyendo, y sin que se limite solo a ellos, sangre, piel (donde las células dendríticas se conocen como células de Langerhans), y tejidos linfoides.

Las células que presentan antígeno con péptido o membrana unida a él, por ejemplo, se pueden utilizar, para inmunizar pacientes. Se obtiene sangre del paciente y se extraen de ella macrofagos o células dendríticas. Se incuban altas concentraciones del péptido (aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1 \mul/ml, preferiblemente aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml) o membrana (aproximadamente 10^{5} a aproximadamente 10^{7} equivalentes de células (e.c.), equivalentes de células con respecto al número de células de partida, es decir la cantidad de extracto de células obtenido del número de células indicado) con las células durante toda la noche o durante aproximadamente 8 horas. Cuando se incuban con membranas, las membranas son fagocitadas por los macrofagos o células dendríticas, Los macrofagos o células dendríticas que han fagocitado las membranas se utilizan entonces para inmunizar al paciente (Grabbe, S. y col. Immunology Today) 1995; 16-117-121)

La composición de vacuna de la invención puede contener, por ejemplo, al menos 10^{4} células de tumor por dosis, preferiblemente al menos 10^{5} células, y más preferiblemente al menos 10^{6} células. Una dosis es la cantidad de composición de vacuna que se administra en una sola administración. En un modo de realización, la composición de vacuna contiene de aproximadamente 10^{5} a aproximadamente 2,5x10^{7} extracto de células por dosis, más preferiblemente aproximadamente 5x10^{6} células. En un modo de realización preferido, la composición de vacuna contiene un máximo de 7,5 x 10^{6} de extracto de células. La cantidad de células de tumor de la invención que se utiliza depende generalmente de factores tales como la afinidad del compuesto para células de tumor, la cantidad de células de tumor, y la solubilidad de la composición. Las dosificaciones se pueden fijar, por ejemplo, con respecto al peso y al estado clínico del paciente.

La composición de vacuna de la invención puede estar empaquetada en forma de dosificación apropiada para administración intradérmica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular y subcutánea. Alternativamente, la forma de dosificación puede contener las preparaciones de la invención (por ejemplo células de tumor) que se reconstituye en el momento de la administración, por ejemplo, un diluyente adecuado.

Las células de tumor y las composiciones de las mismas se pueden administrar por cualquier vía adecuada, incluyendo inoculación e inyección, por ejemplo intradérmica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular y subcutánea. Los lugares de administración pueden ser múltiples por cada tratamiento de vacuna. Por ejemplo, la composición de vacuna se puede administrar por inyección intradérmica en al menos dos, y preferiblemente tres, lugares contiguos por administración. En un modo de administración de la invención, la composición de vacuna se administra en brazos o piernas.

Antes de la administración de la composición de la vacuna de la invención, el sujeto puede ser inmunizado con el hapteno que se va a utilizar para modificar las células de tumor y membranas por aplicación del mismo a la piel. Por ejemplo se puede emplear dinitrofluorobenceno (DNFB). En un modo de realización de la invención, el paciente no es inmunizado a hapteno antes de la administración de la vacuna. Subsiguientemente (aproximadamente dos semanas más tarde, por ejemplo), se le puede inyectar al sujeto una composición de células de tumor o extracto. La composición puede administrarse (tal como por re-inyección) durante un total de al menos tres, y preferiblemente al menos seis tratamientos. En un modo de realización, el número total de administraciones (que incluye la administración inicial) puede ser ocho, y en otro modo de realización puede ser diez. El esquema de vacunación puede ser diseñado por el médico que lleva el caso para adecuarlo al estado particular del sujeto. Las inyecciones de vacuna pueden administrarse, por ejemplo, cada cuatro semanas, preferiblemente cada dos semanas y, lo más preferiblemente, cada semana. En un modo de realización preferido, la vacuna se inyecta cada semana durante un total de seis tratamientos. Pueden alternarse la vacuna haptenizada y no-haptenizada. En un modo de realización preferido todas las vacunas contienen células de tumor modificadas con hapteno. Se puede administrar una vacuna de refuerzo. Preferiblemente se administran una o dos vacunas de refuerzo. La vacuna de refuerzo se puede administrar, por ejemplo, al cabo de aproximadamente seis meses o aproximadamente un año después de la administración
inicial.

El fármaco ciclofosfamida (CY) se puede administrar varios días (por ejemplo 3 días) antes de cada administración de vacuna para aumentar la respuesta inmune a las células de tumor. En un modo de realización preferido, CY se administra solamente antes de la primera inyección de vacuna.

La forma de la vacuna haptenizada, o unida químicamente, puede incluir una célula de tumor haptenizada con dinitrofenilo (DNP), por ejemplo. Otros haptenos incluye, sin que quede limitado solo a ellos, trinitrofenilo, N-yodoacetil-N'-(5-sulfónico 1-naftilo)etilendiamina, ácido trinitrobenceno-sulfónico, isotiocianato de fluoresceina, ácido arsénico benceno isotiocianato, ácido trinitrobencenosulfónico, ácido sulfanílico, ácido arsanílico, dinitrobenceno-S-mostaza. También se pueden emplear combinaciones de haptenos.

Los haptenos incluyen por lo general un grupo reactivo para conjugación a un substituyente sobre una cadena lateral de aminoácido de una proteína o polipéptido (por ejemplo, un grupo ácido carboxílico libre como en el caso de ácido aspártico o ácido glutámico; el grupo amino de lisina; la fracción tiol de cisteína; el grupo hidroxilo de serina o tirosina; la fracción imidazol de histidina; o los grupos arilo de triptofano, tirosina o fenilalanina). Tal como aquí se utiliza, el término "grupo reactivo" se refiere a un grupo funcional sobre el hapteno que reacciona con un grupo funcional sobre un péptido o proteína. El término "grupo funcional" tiene el significado que se le da convencionalmente en química orgánica. Estos grupos reactivos sobre un hapteno se designan aquí como "grupo reactivo de hapteno". Se conocen numerosos grupos reactivos de hapteno que interactúan con los substituyentes presentes en las cadenas laterales de aminoácidos que constituyen péptidos y proteínas. Los ejemplos preferidos de tales grupos reactivos para conjugación con substituyentes polipéptidos específicos son derivados de ácido carboxílico o ácido sulfónico (incluyendo cloruros de ácido, anhidridos, y ésteres carboxílicos reactivos tales como ésteres de N-hidroxisuccinimida), imidoésteres, sales de diazonio, isocianatos, isotiocianatos, halo nitrobencenos, compuestos de \alpha-halocarbonilo, maleimidas, mostazas de azufre, mostazas de nitrógeno, y aziridinas.

Los grupos reactivos de hapteno que forman un enlace covalente con aminas primarias presentes en cadenas laterales de aminoácido incluirán, sin que quede limitado solo a ellos, cloruros de ácido, anhidridos, ésteres reactivos, cetonas \alpha,\beta-insaturadas, imidoésteres y halonitrobencenos. Existen en el comercio varios ésteres reactivos con la capacidad de reaccionar con grupos nucleófilos tales como aminas primarias, por ejemplo de Pierce (Rocford,
Illinois).

Se pueden activar ácidos carboxílicos en presencia de carbodiimidas, tales como EDC, lo que permite la interacción con varios nucleófilos que incluyen aminas primarias y secundarias. La alquilación de ácidos carboxílicos para formar ésteres estables pueden puede conseguirse por interacción con mostazas de azufre o nitrógeno o haptenos que contienen fracción alquil o aril aziridina.

La interacción de fracciones aromáticas asociadas con determinados aminoácidos se puede conseguir por fotoactivación de compuesto de aril diazonio en presencia de la proteína o péptido. Según esto, se puede conseguir la modificación de las cadenas de arilo laterales de histidina, triptofano, tirosina y fenilalanina, particularmente histidina y triptofano, por utilización de tal funcionalidad reactiva.

Los grupos funcionales son reactivos con grupos sulfhidrilo. Hay varios grupos reactivos que se pueden utilizar para modificar grupos sulfhidrilo presentes sobre las cadenas laterales de amino ácidos. Los haptenos que contienen fracción cetona \alpha,\beta-insaturada o fracción éster, tal como maleimida, proporcionan una funcionalidad reactiva que puede interactuar con sulfhidrilo así como con grupos amino. Además, puede reaccionar también un grupo disulfuro reactivo, tal como grupo 2-piridilditio o un grupo 5,5'-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzoico). Algunos ejemplos de reactivos que contienen enlaces disulfuro reactivos incluyen 3-(2-piridil-ditio)propionato de N-succinimidilo (Carlsson y col Biochem. J., 173:723-737, 1978), S-4-succimidiloxicarbonil-alfa-metilbencil-sulfato de sodio y 4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-(2-piridilditio)-tolueno. Algunos ejemplos de reactivos que comprenden grupos reactivos que tienen un doble enlace que reacciona con un grupo tiol son 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo y m-maleimido-benzoato de succinimidilo.

Otras moléculas funcionales incluyen 3-maleimido)propionato de succinimidilo, 4-(p-maleimido-fenil)butirato de sulfosuccinimidilo, 4-(N-maleimidometil-ciclohexano)-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo, éster de maleimidobenzoil-N-hidroxi-succinimida. Muchos de los reactivos antes mencionados y sus sales sulfonato están comercializado por Pierce.

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Los haptenos incluyen también un grupo de reconocimiento de hapteno que interactúa con anticuerpo. El grupo de reconocimiento está asociado irreversiblemente con el grupo reactivo de hapteno. Según esto, cuando el grupo reactivo de hapteno se conjuga con un grupo funcional de la molécula diana, el grupo de reconocimiento de hapteno está disponible para unirse al anticuerpo. Por selección de un grupo reactivo de hapteno apropiado, se puede hacer reconocimiento de anticuerpo y unión a un grupo de reconocimiento de hapteno independiente del grupo funcional con el que se conjuga el hapteno. Cuando este es el caso, los haptenos son funcionalmente equivalentes y se dice que comparten las características de unión a anticuerpo. Este es el caso incluso aunque difieran químicamente los haptenos, de proporcionar conjugación con diferentes grupos funcionales.

Ejemplos de diferentes grupos de reconocimiento de hapteno incluyen, sin limitación, dinitrofenilo, trinitrofenilo, fluoresceína, otros aromáticos, fosforilcolina, péptidos, productos finales de glicosilación avanzada (AGE), hidratos de carbono, etc.

En un modo de realización específico, el mismo grupo de reconocimiento de hapteno se puede copular a diferentes aminoácidos a través de diferentes grupos reactivos de hapteno. Por ejemplo, los reactivos ácido dinitrobenceno sulfónico, dinitrofenil-diazonio, y dinitrobenceno-S-mostaza, todos forman hapteno dinitrofenilo copulado con grupos amino, grupos aromáticos, y grupos ácido carboxílico, respectivamente. De manera similar. un hapteno ácido arsénico se puede copular por reacción de ácido arsénico benceno isotiocianato a grupos amino o azobencenoarseniato a grupos aromáticos.

Un método de tratamiento de un paciente del que se sospecha que tiene cáncer, puede comprender la administración de una cantidad farmacéuticamente aceptable de ciclofosfamida y una cantidad farmacéuticamente aceptable de una composición que comprende células de tumor vivas o células de tumor substancialmente en un estado no-metabólico o mezcla de las. La composición puede mezclarse con un coadyuvante inmunológico y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable. A la vacuna haptenizada puede seguir, opcionalmente, la administración de una cantidad farmacéuticamente aceptable de una vacuna no haptenizada.

La composición de la invención se administra cada semana durante un período de al menos tres semanas, preferiblemente al menos seis semanas, y la primera administración va precedida por una cantidad farmacéuticamente aceptable de ciclofosfamida. Preferiblemente, la composición puede contener un máximo de aproximadamente 7,5 x 10^{6} células. El paciente no necesita ser inmunizado a hapteno antes de la administración de la vacuna.

Las células de tumor para utilizarlas en la presente invención se pueden preparar como sigue. Las masas de tumor son procesadas como han descrito Berd y col (1986) supra. Las células se extraen por disociación enzimática con colagenasa y ADNasa por disociación mecánica, congelación en un frigorífico de velocidad controlada, y almacenamiento en nitrógeno líquido hasta que se necesiten. El día que ha de examinarse o tratarse la piel de un paciente, las células se descongelan y lavan. Se lavan de nuevo y después se suspenden en solución salina de Hanks equilibrada sin rojo fenol. La conjugación de las células preparadas con DNP se lleva a cabo preferiblemente por el método de Miller y Claman (J. Immunol. 1976, 117, 1519)

Se puede utilizar el siguiente procedimiento para haptenización de células de tumor. Se disuelven aproximadamente 100 mg de DNFB (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) en aproximadamente 0,5 ml de etanol al 70%. Se añaden aproximadamente 99,5 ml de PBS. La concentración de DNFB deberá ser de aproximadamente 152 mg/0,1 ml. La solución se agita toda la noche en baño maría a 37ºC. La vida en depósito de la solución es de aproximadamente 4 semanas. Las células se descongelan y se vuelve a suspender el aglomerado en 5x10^{6} células/ml en solución salina de Hanks equilibrada. Se añade aproximadamente 0'1 ml de solución de DNFB a cada ml de células y se incuba durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. De manera similar, se pueden utilizar otros haptenos tales como, y sin que quede limitado solo a ellos, trinitrofenilo, N-yodoacetil-N'-(5-sulfónico 1-naftil)etilen diamina, ácido trinitrobencenosulfónico, isotiocianato de fluoresceina, ácido arsénico benceno isotiocianato, ácido triitrobencenosulfónico, ácido sulfanílico, ácido arsanílico, dinitrobenceno-S-mostaza y combinación de ellos. Se lavan entonces dos veces las células en solución salina de Hanks equilibrada. Se suspenden las células en aproximadamente 5 volúmenes de tampón bicarbonato de sodio aproximadamente 30 mM con fluoruro de fenil metil sulfonilo aproximadamente 1 mM y se desintegran con un homogeneizador de vidrio. Las células intactas residuales y los núcleos se separan por centrifugación a aproximadamente 1000 g. Las membranas se aglomeran por centrifugación a 100.000 g durante 90 minutos. Se vuelven a suspender las membranas en sacarosa al 8% aproximadamente y se congelan a aproximadamente -80ºC hasta que se necesitan.

Numerosas vacunas de cáncer humano han sido estudiadas y desarrolladas. Aunque estas vacunas convencionales inducen a veces una débil inmunidad a cáncer de paciente, raramente ha sido observada regresión del tumor. Se ha encontrado sorprendentemente el desarrollo de respuestas inflamatorias en tumores metastáticos con la vacuna de DNP de la presente invención. El tumor se enrojece, se hace caliente y tierno. Por último, en algunos casos, hay una regresión del tumor hasta desaparecer tanto a simple vista como a la observación microscópica. Se ha observado al microscopio una infiltración de linfocitos T en la masa del tumor. Por lo tanto, este método, que incrementa la respuesta inflamatoria y el número y capacidad de linfocitos que entran en el tumor es un avance significativo en la técnica.

La eficacia de la vacuna se puede mejorar por adición de varios modificadores de respuesta biológica. Estos agentes trabajan por estimulación directa o indirecta de la respuesta inmune. Los modificadores de respuesta biológica de la presente invención incluyen, sin que quede limitado a ellos, interleucina-12 y gamma-interferón. En este modo de realización, la IL12 se dará después de cada inyección de vacuna. La administración de IL12 a pacientes con respuesta inflamatoria se cree que hace proliferar los linfocitos T dentro de la masa del tumor proliferan y que se vuelvan más activos. Los números de células T incrementados y la capacidad funcional conduce a la destrucción inmunológica de los tumores. Las dosificaciones para IL12 se preparan de acuerdo con las indicaciones de dosificación señaladas
antes.

Los pacientes con melanoma metastático se pueden tratar empleando un régimen de inmunoterapia con los siguientes componentes: 1) vacuna que consiste en células de tumor autólogas conjugadas con DNP; y 2) baja dosis de pre-tratamiento de ciclofosfamida. Los pacientes se examinan para determinar si hay regresión del tumor, para hacer seguimiento de las respuestas inflamatorias al tumor y para medir la respuesta de hipersensibilidad tipo retardado a células de melanoma autólogas, DNFB (la forma de DNP utilizada para sensibilización de la piel), linfocitos autólogos conjugados con DNP, diluyente (solución de Hanks), derivado de proteína purificada (PPD), y antígenos de recuerdo (candida, tricofiton y paperas). Los pacientes que se consideran beneficiados (clínica o inmunológicamente) de la terapia se continúan con el régimen de inmunoterapia. A continuación pueden recibir la vacuna sin ciclofosfamida. En un experimento similar, no ha sido encontrada efectiva la interleucina 2 unida a polietilenglicol.

En otro modo de realización, se utiliza una vacuna que comprende células de cáncer conjugadas a un hapteno y mezcladas con un coadyuvante inmunológico tal como Bacillus Calmette-Guerin, BCG.

Se examinan biopsias de metástasis de melanoma humano en cuanto a expresión de ARNm de citocina empleando RT-PCR. Se encuentra ARNm para IFN-\gamma en metástasis inflamada, post-vacuna-DNP, pero solo raramente metástasis en pre-tratamiento, incluso las que contienen grandes números de linfocitos de nódulos linfáticos residuales. Además, la citocina Tipo II, IL10, se encuentra en casi todas las metástasis de melanoma y parece ser producida por las propias células de melanoma.

Los pacientes con melanoma metastático tratado con una vacuna modificada con DNP, autóloga, desarrollan respuestas inflamatorias de inflamabilidad en lugares del tumor. Histológicamente, estas lesiones inflamadas se caracterizan por infiltración de células T que va asociada a veces con la destrucción de la célula de tumor. En la presente invención, se ensayaron muestras de biopsia de 8 metástasis subcutáneas que habían desarrollado inflamación después del tratamiento de vacuna en cuanto a expresión de ARNm para IFN\gamma, IL4, TNF e IL10. Biopsias inflamadas post-vacuna contenían ARNm para IFN\gamma (5/8), IL4 (4/8) o ambos (3/8), y para TNF (4/7). En contraste con esto, se detectó ARNm de IFN\gamma en solo 1/17 y ARNm de TNF en 2/16 muestras de control (metástasis de nódulo linfático de pre-tratamiento o metástasis subcutáneas no inflamadas). Se detectó ARNm para IL10, una citocina con propiedades antiinflamatorias en 24/25 metástasis de melanoma y era independiente del contenido linfoide: la PCR in situ conformó que las células de melanoma eran la fuente principal. Estos hallazgos proporcionan un nuevo parámetro por el que medir los efectos de la inmunoterapia del cáncer.

La presente solicitud está dirigida al análisis de biopsias de melanoma recién obtenidas en cuanto a la presencia de ARNm de citocina que se corresponde con una respuesta inmune productiva en el lugar del tumor. La expresión ARNm de IFN\gamma o IL4 es característica de metástasis de melanoma que han desarrollado una respuesta inflamatoria después de la administración de vacuna autóloga modificada con DNP. Por otra parte, la expresión de ARNm de IL10 es independiente de una respuesta inflamatoria y se observa en casi todas las muestras de biopsia de melanoma. El examen de líneas celulares derivadas de biopsias de melanoma así como análisis de PCR in situ demostraron que la fuente de IL10 son las mismas células de melanoma en vez de los linfocitos asociados.

La presente solicitud incluye también un método de selección para producción de citocina por un tumor para determinar la eficacia de una composición de células autólogas conjugadas con hapteno, irradiadas, en un paciente del que se sospecha que tiene cáncer, comprendiendo el citado método la administración de dicha composición conjugada con hapteno al citado paciente; obtención de una muestra que comprende ácidos nucleicos de una muestra de tejido del paciente; amplificación de ácidos nucleicos específica para una citocina o amplificación de una señal generada por hibridación de una sonda específica a un ácido nucleico específico de citocina en la citada muestra de tejido; y detección de la presencia de ácidos nucleicos amplificados o señal amplificada donde la presencia de ácidos nucleicos amplificados o señal amplificada indica cáncer, donde la presencia de ácidos nucleicos amplificados o señal amplificada de la citada muestra de tejido del paciente indica la eficacia de la citada composición conjugada con
hapteno.

La muestra de tejido puede ser un tumor maligno o pre-maligno, por ejemplo un tumor de melanoma, o un melanoma metastático subcutáneo inflamatorio, por ejemplo. Además, la muestra de tejido puede ser una muestra de tejido sólido o líquido tal como, y sin que quede limitado solo a ellos, todo o parte de un tumor, saliva, esputo, mucus, médula ósea, suero, sangre, orina, linfa o una lágrima del paciente del que se sospecha que tiene
cáncer.

Se obtienen ácidos nucleicos, tales como ADN (incluyendo ADNc) y ARN (incluyendo ARNm) de la muestra de tejido de paciente. Preferiblemente, se obtiene ARN de una muestra de tejido. Se extrae ARN total por cualquiera de los métodos conocidos en la especialidad tal como el descrito por Sambrook y col. en el manual "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor, NY, 1989), incorporado.

La extracción de ácido nucléico va seguida de su amplificación por cualquier técnica conocida en la especialidad. La etapa de amplificación incluye el empleo de al menos una secuencia de cebador que es complementaria a una porción de una secuencia específica de citocina. Las secuencias específicas de citocina se definen, para los propósitos de la presente invención, como incluyendo (y no se limita solo a ellas) todas o parte de secuencias que codifican IFN\gamma, TNF, IL-2, IL-12 e IL-13. Generalmente, la secuencia de cebador es de aproximadamente 21 nucleotidos a aproximadamente 33 nucleotidos, preferiblemente aproximadamente 21 nucleotidos, a aproximadamente 31 nucleotidos, 32 nucleotidos, y aproximadamente 33 nucleotidos de longitud.

Las secuencias de cebador útiles en los métodos de amplificación incluyen y no se limita solo a ellas, actina \beta, SEQ ID Nos: 1 y 2; IFN\gamma, SEQ ID NOS: 3 y 4; IL4; SEQ ID NOS: 5 y 6; IL 10, SEQ ID NOS: 7 y 8; y TNF; SEQ ID NOS: 9 y 10.

Cuando un proceso de amplificación dependiente de molde utiliza un par de cebadores, un cebador del par puede comprender oligonucleotidos que son complementarios a secuencias de ácido nucleico que codifica proteínas específicas de citocina. Uno de los cebadores del par se puede seleccionar del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 1 a 10

Alternativamente, cada uno de los dos oligonucleotidos del par de cebadores puede ser específico para una secuencia de ácido nucleico que codifica una citocina. Los cebadores se pueden diseñar de manera que sean complementarios a regiones separadas de una secuencia de citocina, por ejemplo. Por regiones separadas se entiende que un primer cebador es complementario a una región 31 de una secuencia de citocina y un segundo cebador es complementario a una región 5' de una secuencia de citocina. Preferiblemente, los cebadores son complementarios de regiones claramente separadas y no son complementarios entre sí. Los cebadores de SEQ ID NOS: 1-10 son simples ejemplos de los cebadores que pueden ser útiles en la presente invención.

Cuando un método de amplificación incluye el empleo de dos cebadores, tal como la reacción de cadena de polimerasa, el primer cebador se selecciona del grupo que consiste en SECUENCIA ID NOS: 1, 3, 5, 7 y 9 y el segundo cebador puede seleccionarse del grupo que consiste en SECUENCIA ID NOS: 2, 4, 6, 8 y 10. Cualquier par de cebadores que transcribe ácidos nucleicos uno hacia otro y que son específicos para citocinas se puede utilizar de acuerdo con los métodos de la presente invención.

Preferiblemente, se lleva a cabo una extracción total de ARN. Tal como aquí se emplea, el término "amplificación" se refiere a procesos dependientes de molde y propagación mediada por vector, lo que da por resultado un incremento en la concentración de una molécula de ácido nucleico específica respecto a su concentración inicial, o a un incremento en la concentración de una señal detectable. Tal como aquí se emplea, la expresión proceso dependiente de molde se refiere a un proceso que supone la extensión dependiente de molde de una molécula de cebador. La expresión proceso dependiente de molde se refiere a síntesis de ácido nucleico de una molécula de ARN o ADN donde la secuencia de la hebra nuevamente sintetizada de ácido nucleico está dictada por reglas bien conocidas de emparejamiento de bases complementarias (véase, por ejemplo, Watson, J. D. y col. en "Molecular Biology of the Gene", 4ª Ed. W. A. Benjamin, Inc. Menlo Park, California (1987). Típicamente, las metodologías mediadas por vector suponen la introducción del fragmento de ácido nucleico en un vector de ADN o ARN, la amplificación clonal del vector, y la recuperación del fragmento de ácido nucleico amplificado. Ejemplos de tales metodologías son los dados por Cohen y col. (Patente estadounidense No. 4.237.224), Maniatis, T. y col. "Clonación molecular" ("Un Manual de Laboratorio"), Cold Spring Harbor Laboratory. 1982.

Existen disponibles una serie de procesos dependiente de molde para amplificar las secuencias de la diana de interés presentes en una muestra. Uno de los métodos de amplificación mejor conocidos es la reacción en cadena de polimerasa (PCR) que se describe con detalle en las Patentes estadounidenses 4.683.195, 4.683202 y 4.800.159 y en Innis y col.. "PCR Protocols", Academic Press, Inc., S. Diego CA, 1990. De forma breve: en PCR, se preparan dos secuencias de cebador que son complementarias para regiones en hebras complementarias opuestas de la secuencia diana. Se añade un exceso de trifosfatos de desoxidinucleosido a una mezcla de reacción junto con ADN polimerasa (por ejemplo Taq polimerasa). Si la secuencia diana está presente en una muestra, los cebadores se unirán a la diana y la polimerasa hará que los cebadores se extiendan junto con la secuencia diana por adición sobre nucleótidos. Por elevación y disminución de la temperatura de la mezcla de reacción, los cebadores extendidos se disociarán desde la diana para formar productos de reacción, el exceso de cebadores se unirán a la diana y a los productos de reacción y el proceso se repite. Preferiblemente, se puede realizar un procedimiento de amplificación por PCR de transcriptasa inversa con el fin de determinar cuantitativamente la cantidad de ARNm amplificado. Las metodologías de reacción en cadena de polimerasa son muy conocidas en la especialidad.

Otro método para amplificación es la reacción en cadena de ligasa (citada como LCR), descrito en la Patente EPA No. 320.308. En la LCR, se preparan dos pares de sondas complementarias y en presencia de la secuencia de la diana, cada par se unirá a las hebras complementarias opuestas de la diana de manera que quedan empalmadas, En presencia de una ligasa, se unirán los dos pares de sondas para formar una sola unidad. Por el ciclo de temperaturas, como en PCR, las unidades ligadas unidas se disocian de la diana y entonces sirven como "secuencias diana" para ligado de los pares de sonda en exceso. La Patente estadounidense 4.883.750 describe un método alternativo de amplificación similar a LCR para unión de los pares de sondas a una secuencia de la
diana.

Se puede utilizar también Qbeta Replicasa, descrita en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US87/00880 se puede como aún otro método de amplificación de la presente invención. En este método, se añade una secuencia replicante de ARN, que tiene una región complementaria a la de la diana, a una muestra en la presencia de una ARN polimerasa. La polimerasa copiará la secuencia replicante que puede entonces ser detectada.

También puede ser útil, en la amplificación de ácidos nucleicos de la presente invención, un método de amplificación isotérmica, en el que se utilizan ligasas y endonucleasas de restricción para conseguir la amplificación de las moléculas de la diana que contienen 5'-[alfa-tio] trifosfatos de nucleótido en una hebra de una sede de restricción (Walker, G.T. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89: 392-396).

La amplificación de desplazamiento de la hebra (SDA) es otro método de llevar a cabo la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que supone múltiples rondas de desplazamiento y síntesis de hebras, es decir, traslado de muesca: Un método similar llamado Reacción de Cadena de Reparación (RCR) es otro método de amplificación que puede ser útil en la presente invención y supone templar varios sondas a través de una región insertada dirigidamente para amplificación, seguido de una reacción de reparación en que solamente están presentes dos de las cuatro bases. Las otras dos bases se pueden añadir como derivados biotinilados para una fácil detección. Un método similar se utiliza en SDA.

Secuencias específicas de citocinas se pueden detectar también utilizando una reacción de sondas cíclica (CPR). En la CPR, se hibrida, a ADN que está presente en la muestra, una sonda que tiene 31 y 51 secuencias de ADN específico de no-citocina y secuencia media de ARN específico de citocina. En la hibridación, la reacción se trata con RNasa H, y los productos de la sonda identificados como productos característicos que generan una señal que se liberan después de digestión. El molde original se templa a otra sonda del ciclo y se repite la reacción. De este modo, la CPR supone la amplificación de una señal generada por hibridación de una sonda a un ácido nucleico específico de
citocina.

Se pueden utilizar aún otros métodos de amplificación descritos en la Solicitud británica GB No. 2.202.328, y en la Solicitud de PCT No. PCT/US89/01025, de acuerdo con la presente invención. En la primera solicitud, se utilizan cebadores "modificados" en una síntesis tipo PCR, dependiente de molde y enzima. Los cebadores se pueden modificar marcándolos con una fracción de captura (por ejemplo, biotina) y/o una fracción de detector (por ejemplo, enzima). En la última solicitud, se añade a una muestra un exceso de sondas marcadas. En presencia de la secuencia diana, la sonda se une y se escinde catalíticamente. Después de la escisión, la secuencia diana se libera intacta para ser enlazada por la sonda en exceso. La escisión de la sonda marcada señala la presencia de la secuencia
diana.

Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico incluyen sistemas de amplificación basados en transcripción (TAS) (Kwoh D. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86: 1173, Gingeras T. R. y col., Publicación PCT WO 88/10315 que incluye amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA) y 3SR. En NASBA, los ácidos nucleicos se pueden preparar por amplificación por extracción convencional con fenol/cloroformo, desnaturalización con calor de una muestra clínica, tratamiento con tampón de lisis y columnas de mini-rotación para aislamiento de ADN y ARN o extracción de ARN con cloruro de guanidinio. Estas técnicas de amplificación suponen templado de un cebador que tiene secuencias específicas de próstata. Después de la polimerización se digieren los híbridos de ADN/ARN con RNasa H mientras que las moléculas de ADN de doble hebra se desnaturalizan con calor de nuevo. En cualquier caso, el ADN de una sola hebra se hace completamente de doble hebra por adición de un segundo cebador específico de próstata seguido de polimerización. Las moléculas de ADN de doble hebra se transcriben entonces de forma múltiple por una polimerasa tal como T7 o SP6. En una reacción cíclica isoterma, los ARN se transcriben inversamente a ADN de doble hebra, y se transcriben una vez más con una polimerasa tal como T7 o SP6. Los productos resultantes ya sean truncados o completos indican secuencias específicas de cáncer de
próstata.

La Publicación de Patente Europea No. 329822, describe un proceso de amplificación de ácido nucleico que supone sintetizar cíclicamente ARN de una sola hebra ("ARNss"), ADNss, y ADN de doble hebra (ADNds) que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención. El ARNss es un primer molde para un primer oligonucleótido cebador, que se alarga por transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN). El ARN se separa entonces del duplex ADN:ARN resultante por la acción de ribonucleasa H (RNasa H, una RNasa específica para RNA en un duplex con ADN o con ARN). El ADNss resultante es un segundo molde para un segundo cebador, que incluye también las secuencias de un promotor de ARN polimerasa (del que es ejemplo ARN T7 polimerasa)5' para su homología a su molde. Este cebador se extiende entonces por ADN polimerasa (por ejemplo fragmento "Klenow" grande de ADN de E. coli polimerasa I). resultando como una molécula del ADN de doble hebra ("ADNds") que tiene una secuencia idéntica a la del ARN original entre los cebadores y que tiene adicionalmente, en un extremo, una secuencia de promotor. Esta secuencia de promotor se puede utilizar por la apropiada ARN polimerasa para hacer muchas copias de ARN del ADN. Estas copias pueden entonces volverse a introducir en el ciclo que conduce a una amplificación muy rápida. Con una selección apropiada de enzimas, esta amplificación se puede hacer isotérmicamente sin adición de enzimas en cada ciclo. Debido a la naturaleza cíclica de este proceso, la secuencia de partida se puede elegir para que esté en la forma de ADN o ARN.

Miller, H. I., y col., en la Solicitud PCT WO 89/06700, describen un esquema de amplificación de secuencia de ácido nucleico basado en la hibridación de una secuencia de promotor/cebador a un ADN de una sola hebra ("ADNss") de diana seguido de transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Este esquema no es cíclico, es decir, no se producen nuevos moldes de los transcriptos de ARN resultantes. Otros métodos de amplificación incluyen "raza" descrita por Frohman, M.A., In: "PCR Protocols: A Guide to Methods and Aplications" 1990. Academic Press, N.Y.) y "PCR11 de un solo lado" (Ohara, O., y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:5673-5677)

En la etapa de amplificación del presente método se pueden utilizar también métodos basados en el ligamiento de dos (o más) oligonucleótidos en la presencia de ácido nucleico que tiene la secuencia del "di-oligonucleótico" resultante, amplificando así el di-oligonucleótido (Wu, D.Y. y col. Genomics 1989; 4:560).

Después de la amplificación, se puede detectar la presencia o ausencia del producto de la amplificación. El producto amplificado se puede secuenciar por cualquier método conocido en la especialidad, que incluye, sin que quede limitado solo a éste, el método de Maxam y Gilbert, véase Sambrook, supra. El producto amplificado secuenciado se puede comparar entonces con los resultados obtenidos con el tejido sajado antes del tratamiento de vacuna. Las muestras de tejido obtenidas antes del tratamiento de vacuna estarán libres de secuencias de citocina, particularmente IFN\gamma, TNF, IL2, IL12 e IL13. Los ácidos nucleicos se pueden fragmentar en tamaños variables de fragmentos discretos. Por ejemplo, se pueden separar fragmentos de ADN según el peso molecular por métodos tales como, y sin que quede limitado solo a ésta, electroforesis a través de matriz de gel de agarosa. Los geles se analizan entonces por hibridación Southern. En forma breve, el ADN en el gel se transfiere a un substrato de hibridación o matriz tal como, y sin que quede limitado a ellas, una lámina de nitrocelulosa y una membrana de nylon. Se aplica una sonda marcada a la matriz en condiciones de hibridación seleccionadas para hibridar con ADN complementario localizado sobre la matriz. La sonda puede ser de una longitud capaz de formar un duplex estable La sonda puede tener un intervalo de medida de aproximadamente 200 a aproximadamente 10.000 nucleotidos de longitud, preferiblemente aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Los emparejamientos erróneos tales como, y sin que quede limitado solo a estos casos, los de, secuencias con similar hidrofobicidad e hidrofilicidad, quedarán patentes para los especialistas una vez leída la presente descripción. Los especialistas conocen diversos marcadores para visualización o detección, tales como, sin que quede limitado a ellos, teñido fluorescente, teñido con bromuro de etidio por ejemplo, avidina/biotina, marcado radiactivo tal como marcado con ^{32}P. Preferiblemente, el producto, tal como producto de PCR, se puede colocar en gel de agarosa y visualizarse utilizando teñido tal como teñido con bromuro de etidio. Véase Sambrook y col., supra. La matriz se puede analizar entonces por autoradiografía para localizar fragmentos particulares que se hibridan a la sonda.

Un estuche de equipo (kit) de diagnóstico para análisis de selección en cuanto a la eficacia de una composición de células conjugadas con hapteno autólogas, irradiadas, que comprende, en uno o más recipientes, un par de cebadores, donde uno de los cebadores del citado par es complementario a una secuencia específica de citocina, donde el citado cebador se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10, y un medio para visualizar ADN amplificado; siendo el citado estuche de equipo útil para determinar la eficacia de la citada composi-
ción.

La invención se ilustra además por medio del siguiente ejemplo práctico que es solo ilustrativo y no ha de entenderse como limitativo de la presente invención para este modo de realización específico.

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Ejemplo 1

Inhibición de la proliferación de células de tumor de vacuna por conjugación con hapteno

Se obtuvieron células de tumor a partir de muestras de biopsia de trece pacientes de melanoma y nueve de cáncer de ovario. Las células se aislaron desde las masas de tumor como se ha descrito en la presente memoria descriptiva, y se congelaron hasta que se necesitaron. Se utilizó disociación enzimática de células de tumor. Se utilizó también en este estudio una línea celular establecida utilizando células de melanoma de un paciente. Se dividieron entonces las células de tumor de cada paciente en cuatro grupos: (i) células de tumor de control; (ii) células de tumor irradiadas; (iii) células de tumor conjugadas con hapteno; y (iv) células de tumor conjugadas con hapteno, irradiadas. Las células de los grupos (ii) y (iv) se irradiaron a 2500 cGy. Las células se conjugaron con un hapteno tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Se dejaron crecer entonces las células a 37ºC en medio de cultivo de tejido (RPMI-1640 con suero de ternera fetal al 10% o suero humano acumulado) en pocillos de microvaloración durante 2-14 días. Los pocillos se sometieron entonces a impulsos con ^{125}IUDR durante cuatro horas, Se recogieron los aglomerados con un colector de células automático, se midió la incorporación de ^{125}I utilizando un contador gamma. Los conteos por minuto para cada pocillo indican la capacidad proliferativa de las células. Los resultados están representados en la Tabla 1.

En relación con la Tabla 1, se midió el crecimiento de células a diferentes días para asegurarse de que las células no se habían recuperado de los efectos antiproliferativos de irradiación o DNP, o de ambos.

TABLA 1 Inhibición de la proliferación de células de vacuna por tratamiento de irradiación (RT) y/o haptenización (DNP)

1

	^{1}Sin Rx - sin tratamiento de irradiación
	^{2}RT - tratamiento de irradiación (2500 cGy)
	^{3}DNP - haptenización
	^{4}RT+DNP - haptenización y tratamiento de irradiación (2500 cGy)
	^{5}Conteos por minuto (CPM)

Los resultados anteriores demuestran que la haptenización sola inhibe la proliferación de células de tumor. Basándose en este ensayo de ^{125}IUDR, indudablemente la haptenización sola es más eficaz que la irradiación en la prevención de la proliferación. Según esto, la vacuna de células de tumor de la invención se puede preparar omitiendo la etapa de irradiación o cualquier otro tratamiento destinado a evitar el crecimiento de células de tumor en el cuerpo de un paciente a la inyección; inesperadamente, la haptenización sola es suficiente para estos resultados.

Claims (16)

1. Una composición para inducir una respuesta anti-tumor, en un paciente humano que padece un tumor, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de células de tumor que:

(i)

se conjugan a un hapteno;

(ii)

son del mismo tipo de tumor que el tumor del paciente

(iii)

no son alogénicas al citado paciente

donde la conjugación a hapteno hace a las células del tumor incapaces de crecimiento en el cuerpo del paciente, y donde las citadas células de tumor no son tratadas aparte para hacerlas incapaces de crecimiento en el cuerpo del paciente.

2. La composición según la reivindicación 1 donde las citadas células de tumor no son irradiadas antes de la administración.

3. La composición según la reivindicación 1 que comprende un máximo de aproximadamente 7,5 x 10^{6} células de tumor.

4. La composición según la reivindicación 1 donde las citadas células de tumor se seleccionan del grupo que consiste en células de tumor de melanoma, pulmón, mama, riñón, próstata, ovario y leucemia.

5. La composición según la reivindicación 1 donde el citado hapteno se selecciona del grupo que consiste en dinitrofenilo, trinitrofenilo, N-yodoacetil-N'-(5-sulfonic 1-naftil)etilen diamina, ácido trinitrobencenosulfónico, isotiocianato de fluoresceína, ácido arsénico benceno isotiocianato, ácido trinitrobencenosulfónico, ácido sulfanílico, ácido arsanílico, dinitrobenceo-S-mostaza y combinaciones de ellos.

6. La composición según la reivindicación 4 donde el citado hapteno es dinitrofenilo.

7. La composición según la reivindicación 1 que contiene además un coadyuvante.

8. La composición según la reivindicación 7 donde el citado coadyuvante se selecciona del grupo que consiste en Bacillus Calmette-Guerin, QS-21, endotoxina detoxificada y una citocina.

9. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la manufactura de un medicamento para inducir una respuesta anti-tumor en un paciente mamífero que sufre de tumor.

10. Un método para preparar una célula de tumor humano incapaz de crecimiento, método que comprende la etapa de conjugación de la célula de tumor humano a un hapteno, in vitro, donde la conjugación de hapteno hace a la célula de tumor incapaz de crecimiento y donde la célula de tumor humano no se trata separadamente para hacerla incapaz de crecimiento.

11. El método según la reivindicación 10, donde la célula de tumor humano no se irradia.

12. El método según la reivindicación 10, donde la célula de tumor humano se selecciona del grupo que consiste en célula de tumor melanoma, de pulmón, mama, riñón, próstata, ovario y leucemia.

13. El método según la reivindicación 10, donde la citada célula de tumor humano es una célula de melanoma humano.

14. El método según la reivindicación 10, donde el citado hapteno se selecciona del grupo que consiste en dinitrofenilo, trinitrofenilo, N-yodoacetil-N'-(5 sulfónico 1-naftil)etilen diamina, ácido trinitrobenceno sulfónico, isotiocianato de fluoresceína, ácido arsénico benceno isotiocianato, ácido trinitrobencenosulfónico, ácido sulfanílico, ácido arsanílico, dinitrobenceno-S-mostaza y combinaciones de los mismos.

15. El método de la reivindicación 14, donde dicho hapteno es dinitrofenilo.

16. El método de la reivindicación 14, donde dicho hapteno es ácido sulfanílico.