ES2272754T3 - Uso de antagonistas mglur5 en la fabricacion de un medicamento en el tratamiento de sindrome x fragil, autismo y retardo mental. - Google Patents

Abstract

El uso de un Grupo I mGluR antagonista para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que tiene al menos una condición seleccionada del grupo consistente en síndrome X frágil, autismo y retardo mental.

Description

Uso de antagonistas mGluR5 en la fabricación de un medicamento en el tratamiento de Síndrome X Frágil, Autismo y Retardo Mental.

Contexto de la invención

En el sistema nervioso central (CNS) del mamífero, la transmisión de impulsos nerviosos se controla por la interacción entre un neurotransmisor enviado por una neurona transmisora y un receptor superficie sobre una neurona receptora, causando excitación de esta neurona receptora. L-Glutamato, el neurotransmisor más abundante en el CNS, media la principal ruta excitatoria en mamíferos, y es referida como un aminoácido excitatorio (AAE). Los receptores que responden al glutamato se llaman receptores de aminoácido excitatorio (AAE). Ver Watkins & Evans, Annual Reviews in Pharmacology and Toxicology, 21:165 (1981); Monaghan, Bridges, and Cotman, Annual Reviews in Pharmacology and Toxicology, 29:365 (1989); Watkins, Krogsgaard-Larsen, and Honore, Transactions in Pharmaceutical Science, 11:25 (1990).

Los receptores de aminoácido excitatorio se clasifican en dos tipos generales. Los receptores que están directamente enlazados con la abertura de los canales de catión en la membrana celular de las neuronas se denominan "ionotrópicos". Este tipo de receptor se ha subdividido en al menos tres clases, que se definen por las acciones despolarizante de los agonistas selectivos N-metil-D-aspartato (NMDA), ácido \alpha-amino-3-hidroxi-5-metilisozaxol-4-propinoico y ácido kainico (KA). Se han identificado cinco receptores de kainato, clasificados según su alta afinidad (KA1 y KA2) o baja afinidad (GluR5, GluR6 y GluR7). (Bleakman et al., Molecular Pharmacology, 1996, Vol. 49, No. 4, pp. 581-585).

El segundo tipo general de receptores es la proteína G o segundo mensajero unido al receptor aminoácido excitatorio "metabotrópico". El segundo tipo es una familia altamente heterogénea de receptores de glutamato que están unidos a múltiples sistemas del segundo mensajero. Basándose en su homología de secuencia de aminoácido, farmacología agonista, y en unión con mecanismos de transducción, los 8 subtipos mGlurR ahora conocidos se clasifican en tres grupos. Receptores de Grupo I (mGluR1 y mGluR5) han demostrado estar unidos a estimulación de fosfolipasa C resultante de hidrólisis fosfoinositida y elevación de niveles de Ca^{++} intracelular, y, en algunos sistemas de expresión, para la modulación de canales de ión, tales como canales K^{+}, canales Ca^{++'} canales de catión no selectivo, o receptores NIVIDA. Receptores del Grupo III (mGluR2 y mGluR3) y receptores del Grupo III (mGluRs 4, 6, 7, y 8) están negativamente unidos a adenililciclasa y han demostrado unirse con inhibición de formación cAMP cuando se expresaron heterogénemente en células mamarias, y con la proteína G activada hacia adentro rectificando los canales de potasio en occitos Xenopue y en células "en cepillo" monopolar del cerebelo. Junto con mGluR6, que se expresa básicamente sólo en la retina, los mGluRs se expresan de manera amplia en todo el sistema nervioso central.

Ambos tipos de receptores parecen no sólo mediar la transmisión sináptica normal a lo largo de las rutas excitatorias, sino que también participan en la modificación de conexiones sinápticas durante el desarrollo y a lo largo de toda la vida. Schoepp, Bockaert, y Sladeczek, Trends in Pharmacological Science, 11:508 (1990); McDonald y Johnson, Brain Research, 15:41 (1990).

La estimulación excesiva o inapropiada de receptores de aminoácido excitatorios provoca daño en las células neuronales o pérdida por medio de un mecanismo conocido como exctitotoxicidad. Este proceso ha sido sugerido para mediar degeneración neuronal en una variedad de condiciones. Agonistas y antagonistas de estos receptores pueden ser útiles para el tratamiento de condiciones precisas y crónico-degenerativas.

WO 01/10846 se refiere a compuestos 1,4-benzodiazepina y derivados. El documento describe que un número de estos compuestos actúa como moduladores de receptores de glutamato metabotrópico y, como tales, son útiles para tratar enfermedades del sistema central nervioso relacionadas con el sistema receptor de glutamato metabotrópico.

Breve resumen de la invención

La presente invención proporciona el uso de un antagonista Grupo I mGluR en la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de al menos una condición seleccionada del Síndrome X Frágil, autismo y retardo mental definido en las reivindicaciones adjuntas.

Se puede llevar a cabo la co-administración de otros agentes terapéuticas (p.ej., simultáneamente o en tiempos diferentes) al paciente (humano u otros animales) con una cantidad de un antagonista mGluR suficiente para tratar el desorden. La composición puede ser para administración oral o para administración transdermal.

En otro aspecto de la invención, el antagonista mGluR es un antagonista mGluR5.

En otro aspecto de la invención, el antagonista mGluR es como se define en las reivindicaciones.

Un método para preparar una preparación farmacéutica comprende la combinación de un antagonista mGluR y un excipiente farmacéuticamente aceptable en una composición para administración simultánea del fármaco.

Descripción detallada de las figuras Figura 1 Propiedades de (RS)-3,5-dihidroxifenilglicina (DHPG) inducida por depresión a largo plazo (LTD)

A: Dosis dependiente de efectos de aplicación DHPG (5 in; indicado por la flecha que va hacia abajo) en potencial de campo (FP) valores pendientes (10 \muM DHPG; N=5; 50 Mm; n=11; 100 \muM DPHG; n=4). Inserción: esquema de ubicación de electrodos simuladores (S) y grabadores extracelulares (R) en un sector hipocampo aislado CA1. Los potenciales del campo representativo (2-min de promedio) de un sector tratado con 50 \muM DHPG y tomado en tiempos indicados por los números en el gráfico.

Calibración: 0.5 mV, 5 ms.

B: DHPG-LTD es independiente de estimulación. Inserción: ubicación de electrodos simuladores (S1 y S2) que simularon dos entradas independientes en alternancia. La simulación a la ruta 1 (ruta OFF; \circ) se apagó inmediatamente antes de la aplicación DHPG y se reanudó 30 min después de que DHPG se lavara, mientras la otra entrada (ruta ON; \bullet) se estimuló en la frecuencia de la línea base (0.067 Hz) durante la duración del experimento. Se observó una magnitud similar de depresión en ambas rutas ON y Off (n=4).

C: DHPG-LTD es saturable. Dos aplicaciones de DHPG son suficientes para saturar LTD. Una tercera aplicación de DHPG no provoca ninguna otra depresión. (n=8).

D: Aplicación de DHPG (50 \muM; 5 min) provoca una persistente depresión de la media de potencial sináptico excitatorio (EPSP) valores pendientes (n=6). Formas de onda ESPS representativas (2-min promedio) se tomaron a partir de un experimento en tiempos indicados por números en el gráfico. Calibración: 5 mV, 10 ms.

E: Aplicación de DHPG (50 \muM; 5 min) disminuyó las amplitudes de corriente excitatoria post-sináptica (EPSC). Las células fueron sujetas con voltaje a -70 mV. El modo de grabación se encendió de la pinza de voltaje a la pinza de corriente (I) durante y 5 min después de la aplicación como se indica en la barra. ESPS representativas (2-min promedio) se tomaron a partir de un experimento en tiempos indicados por números en el gráfico.

Calibración: 125 pA, 25 ms.

Figura 2 DHPG-LTD, pero no receptor N-metil-D-aspartato (NMDAR)-dependiente LTD, necesitan mGluR5

A: DHPG-LTD es independiente de NMDAR. Preincubación de sectores en ácido D-2-amino-5-fosfonopentanoico (AP5; 50 \muM; \bullet; n=5) no afecta la magnitud de DHPG-LTD en comparación con sectores de control intercalados (\circ; n=4).

B: DHPG-LTD necesita mGluR5. Aplicación DHPG a sectores de homocigotos mGluR5 ratones demoledores (-/-; \circ, n=8) no produce LTD. LTD intermedio se observó en heterocigotos (+/-;\sqbullet; n=6) en comparación con sectores de ratones de tipo salvaje (wt; \bullet; n=9).

C: Estimulación sináptica de baja frecuencia (LFS)-LTD inducido no necesita mGluR5. LFS produce una magnitud similar de LTD en amos ratones homocigotos demoledores (-/-; \circ, n=6) en comparación con ratones de tipo salvaje (wt; \bullet; n=6).

Figura 3 DPHG-LTD es bloqueado por mGluR-dependiente LTD producido con PP-LFS, pero no NMDAR-dependiente LTD

A: Episodios repetidos de LFS se enviaron a NMDAR saturado-dependiente LTD. DHPG (flecha que va hacia abajo) fue posteriormente aplicado al sector.

B: Valores pendientes de FP renormalizados a la línea base de pres-DHPG (n=8).

C: Episodios repetidos de PP-LFS se enviaron a mGluR-dependiente LTD. DHPG (flecha que va hacia abajo) fue posteriormente aplicado al sector. El experimento completo se llevó a cabo en 50 \muM D-AP5 para prevenir inducción de NMDAR-dependiente LTD.

D: Valores pendientes de FP renormalizados a la línea base de pres-DHPG (n=5).

Figura 4 Estimulación de mGluR produce endocitosis de puntos GluR1

(a) Imágenes representativas de una neurona control y una neurona 15 minutos después de estimulación mGluR etiquetada por medio de inmunoquímica de tira ácida para mGluR1 internalizado. Barra de escala, 10 \mum. (b) Cuantificación reveló un aumento de 2.5 veces en la densidad de puntos internalizados tan pronto como 15 min, durando al menos 60 min. (c) mGluR-estimulado endocitosis de mGluR1 se bloquea por un grupo 1 antagonista mGluR, LY344545. (d) La inhibición de síntesis de proteína por tratamiento con cicloheximida (60 \muM) disminuyó endocitosis estimulada por mGluR.

Figura 5 Estimulación de mGluR produce pérdida de superficie sinóptica AMPARs

(a,b) Imágenes representativas de una neurona de control tintadas con un anticuerpo se dirigieron contra el marcador sináptico sinapsin I (a) y un anticuerpo contra la terminal-N de GluR2 (b). Barra de escala, 10 \mum. (c,d) Imágenes de magnificación más elevada de la misma célula como en (a) demostrando la colocación de sinapsina (c) y GluR2 (d). Barra de escala, 5 \mum. (e,f) Se observó un grado similar de colocación con anticuerpos contra sinaptofisina (e) y terminal -N de GluR1 (f). (g,h) No se detectó ningún cambio en la densidad de puntos de sinapsina 1 hora después de DHPG (g) pero hubo un elevado descenso en el número de puntos sinópticos GluR2 (h). Barra de escala 10 \mum. (i) La cuantificación reveló que 80.6 \pm 9.0% de puntos de sinapsis localizados con GluR2 en las neuronas de control. Sin embargo, 1 hora después de DHPG, sólo 40.8 \pm 11% de sinapsas tenían la superficie teñida para GluR2. (j,k) Sinapsas GluR1-positivo se reducen por tratamiento DHPG y la expresión estable de este cambio es inhibida por cicloheximida. Solamente 29.3 \pm 5.4% de sinapsas sinaptofisina-positivo expresaron puntos GluR1 15 min después de DHPG en comparación con 72.5 \pm 4.7% en cultivos de control. Este efecto de DHPG no se vio afectado por cicloheximida (j). Sin embargo, cicloheximida inhibió considerablemente la pérdida de GluR1 medido 60 min después de DHPG (k).

Figura 6 Estimulación de mGluR produce pérdida de superficie GluR1

(a) Borrón representativo que muestra las muestras de superficie total y biotinilado GluR1 de un cultivo de control (rutas 1 y 2) y 60 min después de tratamiento DHPG (vías 3 y 4). (b) La cuantificación densiométrica reveló que 60 min tras DHPG, los niveles de superficie de GluR1 se redujeron a 56.8 \pm 4.0% de los niveles de control.

Figura 7 Depresión sinóptica producida por DHPG es acompañada de la reducción en frecuencia mEPSC mediada por AMPAR

(a) Grabaciones mEPS representativas de una célula antes y una hora después de aplicación DHPG. (b) Histogramas de probabilidad cumulativa para intervalo de entre eventos y amplitud para la célula representada en (a) antes de DHPG y en un periodo que comienza 45 min después de la aplicación de DHPG. (c) Amplitud mESPC de promedio de grupo e intervalo de entre eventos antes, 15 min y 1 hora después de aplicación DHPG.

Figura 8 Estimulación de mGluR produce pérdida de superficie sinóptica AMPARs

(a,b) Imágenes representativas de una neurona de control tintadas con un anticuerpo se dirigieron contra el marcador sinóptico sinapsin I (a) y un anticuerpo a la terminal-N de NR1(b). Barra de escala, 10 \mum. (c,d) Imágenes de magnificación más elevada de la misma célula como en (a) demostrando la colocación de sinapsina (c) y NR1 (d). Barra de escala, 5 \mum. (e,f) No se detectó ningún cambio en la densidad de puntos de sinapsina 1 hora después de DHPG (e) pero hubo un elevado descenso en el número de puntos sinápticos NR1 (f). Barra de escala 10 \mum. (g) La cuantificación reveló que DHPG redujo el número de sinapsas positivas para NR1 60 min después de inicio del tratamiento y este efecto fue inhibido por cicloheximida. (h) Borrón representativo que muestra las muestras de superficie total y biotinilado GluR1 de un cultivo de control (rutas 1 y 2) y 60 min después de tratamiento DHPG (vías 3 y 4); re-investigación de borrón en Fig. 3a) 60 minutos después del tratamiento de DHPG, los niveles de superficie NR1 se redujeron a 32.3 \pm 8.2% de los niveles de control. Cicloheximida redujo la pérdida de superficie NMDARs a 79.1 \pm 14.5% de los niveles de control.

Figura 9 La aplicación de DHPG atenúa sinápticamente EPSCs evocados mediados por NMDAR y las corrientes evocadas por NMDA

(a) Depresión inducida por DHPG de EPSCS NMDAR evocado sinápticamente. (b) Promedio de dos minutos de amplitudes de corriente evocada por NMDA antes y después de aplicación de 100 \muM DHPG. (c) Promedio de dos minutos de corrientes de control evocadas por NMDA. En (a) y (b), las flechas indican inicio de 5 min de aplicación DHPG. R_{s}, resistencia de serie.

Modos más adecuados para llevar a cabo la invención Descripción detallada de la invención I. Perspectiva General

Recientemente han aparecido evidencias de la proteína de retardo mental X frágil (FMRP) y su inclusión en síntesis de proteína sináptica local dependiente de actividad. El principal glutamato excitatorio neurotransmisor, por medio del grupo I de receptores de glutamato metabotrópicos (mGluRs), estimula la síntesis de proteínas en dendritas. El Grupo I mGluRs es un subgrupo de la proteína G enlazada a la familia mGluR, y están compuestos de dos subtipo, mGluR1 y mGluR5. Trabajos posteriores demostraron que FMR1 y mARN está presente en dendritas y FMRP se sintetiza en respuesta a la activación mGluR de sinaptoneurosomas. (Weiler, et al, 1997). Debido a que FMRP por sí mismo puede regular tranlación mARN, la síntesis de FMRP en sinapsas en respuesta de mGluR puede ser un mecanismo a través del cual la actividad neuronal puede regular o controlar la síntesis de otras proteínas importantes para plasticidad sináptica y desarrollo.

A pesar de que se conocía que la activación mGluR puede estimular la síntesis de proteínas, y específicamente la de FMRP, el papel funcional de este mecanismo ha sido desconocido hasta hace poco. Varios estudios han demostrado que la activación del grupo I mGluRs con estimulación sináptica o el agonista R selectivo, S-dihidroxifenilglicina (DHPG) produce depresión a largo plazo (LTD) de repuestas sinápticas en área CA1 del hipocampo de la rata (Fitzjohn et al., 1999; Kemp and Bashir, 1999; Huber et al., 2000). LTD es dependiente en mGluR5 y de manera importante requiere la síntesis rápida y dendrítica de nuevas proteínas (Huber et al., 2000). Este mecanismo de LTD proporciona pistas para la función de glutamato o estimulación inducida por actividad de síntesis de proteína dendrítica local.

Se ha sugerido que un mecanismo similar a LTD podía ser el responsable de la eliminación o reducción de sinapsas inapropiadas que se forman durante los primeros periodos post-natales (Colman et al, 1997; Bear and Rittenhouse, 1999). Investigaciones recientes apoyan esta hipótesis. El tratamiento de cultivos neuronales del hipocampo con el grupo I agonista mGluR, DHPG, resulta en un descenso a largo plazo en la expresión de superficie de receptores de glutamato subtipo AMPA (AMPAR), los receptores responsables de transmisión sináptica en sinapasas excitatorias. Al igual que LTD, el descenso a largo plazo en la expresión de superficie AMPAR es dependiente sobre síntesis de proteínas (Snyder et al., 2000). Datos preliminares también indican una reducción concomitante en el número de terminales presinápticas tras el tratamiento DHPG. Todos estos datos unidos indican la activación de resultados mGluR5 en descensos en fuerza sináptica mediada probablemente por una reducción o eliminación en el número de sinapsas excitatorias. Este proceso de eliminación de sinapsa puede contribuir a la formación de conexiones apropiadas sinápticas durante el desarrollo así como en el almacenamiento de memorias en un adulto.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que FMRP juega un pape integral en el mecanismo LTD. Como se describe en detalle a continuación, el papel de FMRP en LTD se descubrió usando el modelo de ratón demoledor de Síndrome X Frágil. En resumen, los sectores de mente hipocampales fueron preparados para littermates demoledores o de tipo salvaje. Se produjo LTD con aplicación DHPG o un protocolo de estimulación sináptica, denominada estimulación de baja frecuencia emparejado con el pulso. De manera sorprendente, use observó un significante mejora de LTD en los ratones demoledores en ambos sectores tratados con DHPG y PP-LFS. Los resultados sugieren que FMRP puede normalmente funcionar como un inhibidor síntesis de proteína dependiente de mGluR y, en la ausencia de FMRP, existe síntesis irregulada de las proteínas necesarias. Una implicación de estos resultados es que un exceso de LTD o un mecanismo de eliminación de sinapsa en ratones demoledores FMR1 o paciente de X frágil puede perturbar el proceso de desarrollo sináptico y puede llevar a anormalidades en la estructura espinal dendrítica y finalmente a problemas cognitivos. De manera alternativa o como adición, la mejora de un mecanismo similar a LTD en el adulto podría contribuir a retardo mental.

El descubrimiento de un mecanismo neuronal asociado al retardo mental proporciona terapias para prevenir o invertir las anormalidades sinápticas y déficits cognitivos asociados con el síndrome X frágil, el síndrome de Down y otras forma de retardo mental, autismo, esquizofrenia y otros desordenes que implican la reducción reguladora de los niveles FMRP o de expresión. Por ejemplo, el tratamiento podía consistir en la administración de antagonistas de Gurpo I mGluRs, como mGluR5, durante el desarrollo inicial post-natal para atenuar el LTD anormalmente aumentado y restablecer el balance de formación sináptica y eliminación. Además, el tratamiento de adultos con antagonistas de Gurpo I mGluRs, como mGluR5, puede reducir los déficits de aprendizaje a la vista de evidencias de que las neuronas retienen su habilidad para formar dendritas y modular la expresión de la superficie de receptores durante algún
tiempo.

La presente invención se refiere al uso de antagonistas de Gurpo I mGluRs, como mGluR5, en la fabricación de un medicamento para tratar Síndrome X Frágil y otras formas de retardo mental, y autismo. Un antagonista mGluR es una sustancia que disminuye o elimina el efecto de un ligando (agonista) que activa un mGluR. Por lo tanto, el antagonista puede ser, por ejemplo, un antagonista químico, un antagonista farmacocinético, un antagonista por bloqueo receptor, un antagonista no-competitivo, o un antagonista fisiológico.

Los antagonistas pueden hacer efecto el nivel de las interacciones ligando-receptor, como competitivamente o no competitivamente (p. ej., alostéricamente) inhibiendo el enlace del ligando. En otras realizaciones, el antagonista puede actuar en dirección descendente del receptor, inhibiendo la interacción del receptor con una proteína G. Un "antagonista farmacocinética" reduce de manera eficaz la concentración del fármaco activo y su lugar de acción, p. ej., aumentando la tasa de degradación metabólica del ligando activo. Antagonismo por receptor-bloqueo implica dos mecanismos importantes: 1) antagonismo competitivo reversible y 2) antagonismo competitivo irreversible o no-equilibrado. El antagonismo competitivo reversible se da cuando la tasa de disociación de la molécula antagonista es lo suficientemente alta que, además del ligando, las moléculas antagonistas que enlazan con los receptores se sustituyen de manera eficaz por el ligando. El antagonismo competitivo irreversible o no-equilibrado se da cuando el antagonista se disocia muy lentamente o no por completo del receptor, dando como resultado que no tiene lugar ningún cambio en la ocupación antagonista cuando se aplica el ligando. Por consiguiente, el antagonismo es insuperable. Como aquí es empleado, un "antagonista competitivo" es una molécula que se enlaza directamente con el receptor o ligando de modo que estéricamente infiere con la interacción del ligando con el receptor.

El antagonismo no-competitivo describe una situación donde el antagonista no compite directamente con el enlace de ligando en el receptor, sino que bloquea un punto en la ruta de transducción de señal tras la activación del receptor por parte del ligando. El antagonismo fisiológico describe aproximadamente la interacción de dos sustancias cuyas acciones opuestas en el cuerpo tienden a cancelarse mutuamente. Como antagonista también puede ser una sustancia que disminuye o elimina la expresión de mGluR funcional. Por lo tanto, un antagonista puede ser, por ejemplo, una sustancia que disminuye o elimina: 1) la expresión de los genes que codifican mGluR5, 2) la translación de ARN mGluR5, 3) la modificación post-translacional de proteína mGluR5, o 4) la inserción de mGluR5 en la membrana celular.

II. Definiciones

Una "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de un compuesto que incluye un antagonista mGluR que es eficaz, tras administración de dosis única o múltiple a un paciente, en tratamiento con pacientes que sufren los desórdenes citados.

El término "ED_{50}" significa la dosis del fármaco que produce el 50% de su máxima respuesta o efecto.

El término "IC_{50}" significa la concentración de un fármaco que inhibe una actividad o propiedad al 50%, por ejemplo reduciendo la frecuencia de una condición, como muerte celular al 50%, reduciendo el enlace de un péptido competidor con una proteína al 50% o reduciendo el nivel de una actividad al 50%.

El témino "LD_{50}" significa la dosis de un fármaco que es letal en el 50% de lo sujetos testados.

Un "paciente" o "sujeto" a ser tratado por el método cuestionado puede ser un humano o un animal no humano.

"Composición" significa una combinación de múltiples sustancias en una mezcla total.

El término "profármaco" pretende abarcar compuestos que, bajo condiciones fisiológicas, se conviertes en agentes terapéuticamente activos de la presente invención. Un método común para hacer un profármaco es incluir partes de una molécula seleccionadas, como ésteres, que son hidrolizadas bajo condiciones fisiológicas para revelar la molécula deseada. En otras realizaciones, el profármaco se convierte por una actividad enzimática del animal huésped.

El término "metabolitos" se refiere a derivados activos producidos tras la introducción de un compuesto en un entorno biológico como el de un paciente.

Un "agonista" es una molécula que activa cierto tipo de receptor. Por ejemplo, moléculas de glutamato actúan como agonista cuando excitan receptores EM. Sin embargo, una molécula "antagonista" es una molécula que previene o reduce los efectos ejercidos por un agonista sobre un receptor. El término "índice terapéutico" se refiere al índice terapéutico (IT) de un fármaco definido como LD_{50}/ED_{50}.

Por "parche transdermal" se entiende un sistema capaz de enviar un fármaco a un paciente a través de la piel, o cualquier otra superficie externa adecuada que incluye membranas de la mucosa como aquellas del interior de la boca. Tales sistemas de envío normalmente constan de un refuerzo flexible, un adhesivo y una matriz retenedora del fármaco, protegiendo el refuerzo el adhesivo y la matriz y sujetando el adhesivo el todo sobre la piel del paciente. En contacto con la pie, la matriz retenedora del fármaco envía dicho fármaco a la piel, permitiendo que el fármaco pase a través de la piel en el sistema del paciente.

El término "estáticamente importante" como aquí se emplea significa que los resultados obtenidos no tienen muchas posibilidades de ser fluctuaciones de azar al nivel específico de probabilidad. Los dos niveles específicos más comunes e importantes son 0.05 (p=0.05) y 0.01 (p=0.01). El nivel de importancia igual a 0.05 o 0.01 significa que la probabilidad de error es de 5 de cada 100 y 1 de cada 100, respectivamente.

El término "fuentes de asistencia médica" se refiere a organizaciones o individuos que proporcionan servicios sanitarios a una persona, comunidad, etc. Ejemplos de "fuentes de asistencia médica" incluyen doctores, hospitales, comunidades de jubilación de cuidado continuado, facilidades de cuidado especializado, facilidades de cuidados leves, clínicas de diferentes especialidades, centros de salud independientes, agencias de salud doméstica, y organizaciones de mantenimiento de la salud.

El término "redes de distribución" se refiere a individuos u organizaciones que están unidas entre sí y transfieren productos de un individuo, organización o lugar a un conjunto de otros individuos, organizaciones o lugares.

El término "grupo de ventas" se refiere a una organización de individuos que están asociados con la venta de cierto producto.

El término "autorizar" significa conceder la autoridad del propietario de una patente de unos conocimientos a otra persona, dando permiso o licencia a éste último para hacer o usar la composición patentada o método o conocimientos.

III. Compuestos Ejemplares A. Antagonistas mGluR ejemplares

La presente invención considera el uso de antagonistas Grupo I mGluR, preferentemente mGluR5.

Ejemplos de antagonistas mGluR5 incluyen, sin limitación, 2-metil-6(feniletinil)-piridina (MPEP), (E)-6-metil-2-estirilpiridina (SIB 1893), LY293558, 2-metil-6-[(1 E)-2-feniletinil-piridina, 6-metil-2-fenilazo)3-piridinol, (RS)-\alpha-metil-4-carboxifenilglicina (MCPG), 3S,4aR,6S,8aRS-6-((((1H-tetrazola-5-il)metil)oxi)metil)-1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 8a-decahidroisoquinolina-3-ácido carboxílico, 3S, 4aR,6S,8aR,-6-(((4-carboxi)-fenil)metil)-1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 8a-decahidroisoquinolina-3-ácido carboxílico, y sus sales farmacéuticamente aceptables, análogos y derivados de los mismos.

Antagonistas de mGluR5 también se describen en WO 01/66113, WO 01/32632, WO 01/14390, WO 01/05963, WO 01/02367, WO 01/02342, WO 01/02340, WO 00/20001, WO 00/73283, WO 00/69816, WO 00/63166, WO 00/26199, WO 00/26198, EP-A-0807621, WO 99/54280, WO 99/44639, WO 99/26927, WO 99/08678, WO 99/02497, WO 98/45270, WO 98/34907, WO 97/48399, WO 97/48400, WO 97/48409, WO 98/53812, WO 96/15100, WO 95/25110, WO 98/06724, WO 96/15099, WO 97/05109, WO 97/05137, US 6,218,385, US 5,672,592, US 5,795,877, US 5,863,536, US 5,880,112, US 5,902,917, números de solicitudes US permitidas 08/825,997, 08/833,628,
08/842,360, y 08/899,319, todas ellas aquí incluidas como referencias.

Por ejemplo, diferentes clases de antagonistas mGluR5 se describen en WO 01/08705 (pp. 3-7), WO 99/44639 (pp. 3-11), y WO 98/34907 (pp. 3-20).

Otra clase de antagonista mGluR5, oligonucleótidos antisentido, se describen en WO 01/05963. Oligonucleótidos antisentido para mGluR5 se pueden preparar por analogía y se usarse para antagonizar de manera selectiva mGluR5, como se desee.

Otra clase de antagonistas mGluR5 se describe en WO 01/02367 y WO 98/45270. Tales compuestos generalmente tienen la siguiente fórmula:

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1

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2

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donde R representa H o una molécula de hidrocarbono hidrolizable como un alquilo, heteroalquilo, alquenilo o molécula aralquilo.

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En ciertas realizaciones el sistema de isoquilina tiene la formación estereoquímica.

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3

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(donde, como se conoce en la técnica, un punto oscuro sobre el carbono indica que el hidrógeno viene fuera de la página, y un par de guiones indican que un hidrógeno se extiende bajo el plano de la página), el enantiómetro del mismo, de una mezcla racémica de los dos.

Otra clase de antagonistas, descrita en WO 01/66113, tiene la fórmula:

\vskip1.000000\baselineskip

4

donde

R_{1} significa hidrógeno, bajo alquilo, hidróxilo-bajo alquilo, bajo alquilo-amino, piperidino, carboxi, carboxi esterificado, carboxi amidatado, insustituido o bajo alquilo-, bajo alquilo-, halo- y/o trifluorometilo-sustituido N-bajo-alquilo-N-fenilcarbamoil, bajo alcoxi, halo-bajo alquilo o halo-bajo alcoxi;

R_{2} significa hidógeno, bajo alquilo, carboxi, carboxi esterificado, carboxi amidatado, hidóxilo-bajo alquilo, hidróxilo, bajo alquilo o bajo alcanoiloxi, 4-(4-fluoro-benzoil-piperidina)-1-carboxi-4-5. butiloxicarbonil-piperazina-1-yl-carboxi,4-(4-azido-2-hidroxibenzoilo)-piperazina-1-yl-carboxi o 4-(4-azido-2-hidroxi-3-yodo-benzoilo)-piperazina-1-yl-carboxi;

R_{3} representa hidógeno, bajo alquilo, carboxi, bajo alcoxi-carbonil, bajo alquilo-carbamoil, hidroxi-bajo alquilo, di-bajo alquilo-aminometil, morfolinocarbonil o 4-(4-fluoro-benzoilo)-piperazina-1-yl-carboxi;

R_{4} representa hidrógeno, bajo alquilo, hidróxilo-bajo alquilo, amino-bajo alquilo, bajo alquilamino-bajo alquilo, di-bajo alquilamino-bajo alquilo, insustituido o hidroxi-sustituido bajo alquileneamino-bajo alquilo, bajo alcanoyloxi, amino-bajo alcoxi, bajo alquilamino-bajo alcoxi, di-bajo alquilaino-bajo alcoxi, phtalimido-bajo alcoxi, insustituido o hidroxi-o-2-oxo-imidazolidin-1-yl-sustituido bajo alquileneamino-bajo alcoxi, carboxi, carboxi esterificado o amidatado, carboxi-bajo alcoxi o carboxi esterificado-bajo alcoxi, y X representa de manera opcional un halo-sustituido bajo alquenileno o grupo alquenileno unido vía vecinal a átomos de carbono saturados o un grupo azo (-N=N-), y R_{5} denota un grupo aromático y heteroaromático que es insustituido o sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados de bajo alquilo, halo, halo-bajo alquilo, halo-bajo alcoxi, bajo alquenilo, bajo alquinilo, insustituido o bajo alquilo-, bajo al-
coxi-, halo-y/o trifluorometil-sustituido fenil-bajo alquinilo, hidroxi, hidroxi-bajo alquilo, bajo alcanoiloxi-bajo alquilo, bajo alcoxi, bajo alqueniloxi, bajo alquilenedioxi, bajo alcanoiloxi, amino-, bajo alquilamino-, bajo alcanoylamino o N-bajo alquilo-N-bajo alcanoilamino-bajo alcoxi, insustituido o bajo alquilo-, bajo alcoxi-, halo- y/o trifluorometilo-sustituido fenoxi, insustituido o bajo alquilo-, bajo alcoxi, halo y/o trifluorometil-sustituido fenil-bajo alcoxi, acil, carboxi, carboxi esterificado, carboxi amidatado, ciano, carboxi-bajo alquilamino, carboxi esterificado-bajo alquilamino, carboxi amidatado-bajo alquilamino, fosfono-bajo alquilamino-fosfono esterificado-bajo alquilamino, nitro, amino, bajo alquilamino, di-bajo alquilamino-acilamino, N-acil-N-bajo alquilamino, fenilamina, fenil-bajo alquilamino, cicloalquilo-bajo alquilamino o heteroarilo-bajo alquilmino cada uno de los cuales puede ser insustituido o bajo alquilo-, bajo alcoxi-, halo- y/o trifluorometilo-sustituido; sus N-óxidos y sus sales farmacéuticamente
aceptables.

En ciertas realizaciones, como se describe en WO 01/66113 y WO 00/20001, estos compuestos tienen la siguiente fórmula:

5

donde,

R_{1} es hidrógeno, (C_{1-4}) alquilo, (C_{1-4}) alcoxicarbonilo, di (C_{1-4}) alquilamino,

R_{2} es hidrógeno, hidroxi, carboxi, (C_{1-4}) alcoxicarbonilo, di(C_{14}) alquilaminometilo, 4-(4-fluoro-benzoilo)-piperidina-1-yl-carboxi,4-t-butiloxicarbonilo-piperazina-1-yl-carboxi, 4-(4-azido-2-hidroxibenzoilo)-piperazina-1-yl-carboxi, o 4-(4-azido-2-hidroxi-3-yodo-benzoilo)-piperazina-1-yl-carboxi,

R_{3} es hidrógeno, (C_{1-4}) alquilo, carboxi, (C_{1-4}) alcoxicarbonil, (C_{1-4}) alquilcarbamoil, hidroxi (C_{1-4}) alquilo, di(C_{1-4}) alquilaminometil, morfolinocarbonilo o 4-(4-fluoro-benzoilo)-piperazina-1-yl-carboxi,

R_{4} es hidrógeno, hidróxilo, carboxi, (C_{2-5}) alcanoiloxi, (C_{1-4}) alcoxicarbonilo, amino (C_{1-4}) alcoxi, di(C_{1-4}) alquilamino (C_{1-4})alquilo o hidroxi(C_{1-4})alquilo, y

R_{5} es un grupo de fórmula:

\vskip1.000000\baselineskip

6

donde,

R_{a} y R_{b} son independientemente hidrógeno, halógeno, nitro, ciano, (C_{1-4}) alquilo, (C_{1-4}) alcoxi, trifluorometilo, trifluorometoxi o (C_{2-5}) alquinilo, y

R_{c} es hidrógeno, flúor, bromo de cloro, hidroxi-(C_{1-4}) alquilo, (C_{2-5}) alcanoiloxi, (C_{1-4}) alcoxi, o ciano, y

R_{d} es hidrógeno, halógeno o (C_{1-4}) alquilo;

en forma libre o en la forma de sales farmacéuticamente aceptables.

En otras realizaciones descritas en WO 01/66113, antagonistas mGluR5 tienen estructuras con la siguiente fórmula:

7

donde R_{6} es hidrógeno, hidroxi, o alcoxi C_{1-6};

R_{7} es hidrógeno, carboxi, tetrazolil, -SO_{2}H, -SO_{3}H, -OSO_{3}H, -CONHOH, o -P(OH)OR', -PO(OH)OR', -OP(OH)OR' o -OPO(OH)OR' donde R' es hidrógeno, alquilo C_{1-6}, alquenil C_{2-6}, o aril C_{1-6};

R_{8} es hidrógeno, hidroxi o alcoxi C_{1-4}; y

R_{9} es flúor, trifluorometilo, nitro, alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-7}, alquenilo C_{2-6}, alquinilo C_{2-6}, alquitio, heteroaril, opcionalmente aril sustituido, opcionalmente aril sustituido alquilo C_{1-6}, opcionalmente aril sustituido alquenilo C_{2-6}, opcionalmente aril sustituido alquinilo C_{2-6}, opcionalmente ariloxi sustituido, opcionalmente aril sustituido alquitio C_{1-6}, -CONR''R''', -NR''R''', -OCONR''R''', -OCONR''R''' o -SONR''R'', donde R'' y R''' son cada uno hidrógeno, alquilo C_{1-6} o aril alquilo C_{1-6}, o R'' y R''' juntos forma un aro alquileno C_{3-7};

o una sal o éster de los mismos.

Incluso otra clase de antagonistas mGluR5 se describe en WO/63166. Estos compuestos tienen la siguiente fórmula:

8

donde

R_{10} significa hidrógeno o bajo alquil;

R_{11} significa, independientemente para cada concurrencia, hidrógeno, bajo alquilo, bajo alcoxi, halógeno o trifluorometilo;

X significa O, S, o dos átomos de hidrógeno que no forman un puente;

A^{1}/A^{2} significan, independientemente y de manera respectiva, fenil o un heterociclo de 6 miembros que contiene 1 o 2 átomos de hidrógeno;

B es un grupo de fórmula 9, donde

R_{12} significa alquilo bajo, bajo alquenilo, bajo alquinilo, benzilo, bajo alquilo-cicloalquilo, bajo alquilo-ciano, bajo alquilo-piridinil, bajo alquilo-bajo alcoxi-fenil, bajo alquilo-fenil (opcionalmente sustituido por bajo alcoxi), fenil (opcionalmente sustituido por bajo alcoxi), o bajo alquilo-morfolinil; cicloalquilo, bajo alquilo-trifluorometilo, o bajo alquilo-morfolinil;

Y significa -O-, -S- o enlace;

Z significa -O- o -S-;

O B es un grupo heterociclico de 5 miembros de fórmulas

10

Donde

R^{13} y R^{14} independientemente significan hidrógeno, bajo alquilo, bajo alcoxi, ciclohexil, bajo alquilo-ciclohexil o trifluorometil, con la condición de que al menos uno de R^{13} o R^{14} es hidrógeno;

Al igual que con sus sales farmacéuticamente aceptables.

Otra clase de antagonistas mGluR1 se describe en WO 01/32632. Estos compuestos tienen la siguiente fórmula:

11

X^{1} representa O o NH;

L representa un enlace o una cadena de alquileno (1-6C) opcionalmente interrumpida por O, S, OS, SO o NH y opcionalmente sustituido en un átomo de carbono de alquileno por flúor o hidroxi, (1-4C) alcoxi u oxo;

R^{1} representa un grupo carbocíclico o heterocíclico insustituido o sustituido;

R^{2} representa un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo carboxil, un grupo ciano, un SCH_{2}CN, o un grupo de fórmula X^{2}-R^{5} en el cual X^{2} representa un enlace, O, S, SO, SO^{2} o NH y R^{5} representa (1-8C)alquilo, (3-10C)cicloalquilo, halo(1-6C)alquilo, hidroxi(1-6C)alquilo, dihidroxi(1-4C)alquilo, (1-4C)alcoxi(1-4C)alquilo, (1-4C)alcanoil(1-4C)alquilo, (1-4C)alcanoiloxi(1-4C)alquilo, carboxi(1-4C)alquilo, (1-4C)alquilaminocarbonil(1-4C)alquilo, (1-4C)alcanoilamino, (1-4C)alcanoilamino(1-4C)alquilo, (1-4C)alcanoilamino[(1-4C)alquilo]2, (1-4C)alquitio(1-4C)alquilo, (1-4C)alquilsulfinil(1-4C)alquilo, (1-4C)alquilsulfonil(1-4C)alquilo, (1-4C)alquilsulfonílamino (1-4C)alquilo, (1-4C)alquilamino-sulfonil(1-4C)alquilo, di(1-4C)alquilaminofosfonil(1-4C)alquilo, fenil o feniel (1-4C)alquilo en el cual cualquier grupo fenil es insustituido o sustituido por uno o más sustitutos seleccionados independientemente de un átomo halógeno, (1-4C)alquilo y (1-4C)alcoxi, y

R^{3} y R^{4} representa cada uno de manera independiente (1-4C)alquilo o junto con los átomos de carbono a los cuales están unidos forman un aro carbocíclico o heterocíclico insustituido o sustituido; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Otra clase de antagonistas mGluR5 se describe en WO 01/14390. Estos compuestos tienen la fórmula:

12

donde,

bien J o K se toman juntas con uno o más átomos adicionales independientemente seleccionados de un grupo consistente en C, O, S y N en patrones de sustitución químicamente razonables para forma un aro carbocíclico o heterocíclico saturado o insaturado de 3-7 miembros, y L es -CH,

O J, K, y L se toman juntos con uno o más átomos adicionales independientemente seleccionados de un grupo consistente en C,

O, S y N en patrones de sustitución químicamente razonables para forma un aro de estructura mono-, bi-, o tricíclico, hetero o carbocíclico saturado o insaturado de 4-8 miembros;

Z es un metal del grupo quelatado;

R_{1} y R_{2} son independientemente hidrógeno, C_{1}-C_{9} alquilo, C_{2}-C_{9} alquenil, C_{3}-C_{4} cicloalquil, C_{5}-C_{7} cicloalquenil, o Ar, donde cada mencionado alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, o Ar es independientemente insustituido o sustituido con uno o más sustitutos; y

Ar es una parte de molécula carbocíclica o heterocíclica que es insustituida o sustituida con uno o más sustitutos;

O un equivalente a los mismos farmacéuticamente aceptable.

Otra clase más de antagonistas mGluR5 se describe en Patente US N° 6,218,385. Estos compuestos tienen la siguiente fórmula.

13

R^{1} significa hidrógeno, hidroxi, bajo alquilo, oxígeno, halógeno, o -OR, O(C_{3}-C_{6})cicloalquilo, -O(CHR)_{n} - (C_{3}-C_{6})cicloaquilo, -O (CHR)_{n} CN, -O(CHR)_{n} CF_{3}, -O(CHR)(CHR)_{n} NR_{2}, -O(CHR)(CHR)_{n}OR, -O(CHR)_{n}-bajo alquenilo, OCF_{3}, -OCF_{2}-bajo alquenilo, -OCHRF, -OCHF-bajo alquenilo, -OCF_{2}CRF_{2}, -OCF_{2}Br, -O(CHR)_{n}CF_{2}Br, -O(CHR)_{n}-fenil, donde el grupo fenil puede estar opcionalmente sustituido independientemente entre sí por de uno a tres grupos de alquilo bajos, bajo alcoxi, halógeno, nitro o ciano. -O(CHR) (CHR)_{n}-morfolino, -O(CHR)(CHR)_{n}-pirrolidino, -O(CHR)(CHR)_{n}-piperidino, -O(CHR)(CHR)_{n}-imidazolo, -O(CHR)(CHR)_{n}-triazolo, -O(CHR)_{n}-piridino, -O(CHR)(CHR)_{n}-OSi-bajo alquilo, -O(CHR)(CHR)_{n}-OS(O)_{2}-bajo alquilo, -(CH_{2})_{n}CH=CF_{2}, -O(CHR)_{n} 2,2-dimetil-[1,3]dioxolano, -O(CHR)_{n}CHOR-CH_{2}OR, O(CHR)_{n}-CHOR-(CHR)_{n} CH_{2}OR o -SR O -S (CHR)_{n} COOR, o -NR_{2}, N(R)(CER)(CHR)_{n}OR, -N(R)(CHR)_{n} CF_{3}, -N(R)(CHR)(CHR)_{n} morfolino, -N(R)(CHR)(CHR)_{n}-imidazolo, -N(R)
(CHR)(CHR)_{n}-pirrolidino, -N(R)(CHR)(CHR)_{n}-pirrolidina-2-uno, -N(R)(CHR)(CHR)-piperidino, -N(R)(CHR)
(CHR)_{n}-triazolo, -N(R)(CHR)(CHR)_{n}-piridino, o

R^{1} y R^{4} están interconectados a los grupos -(CH_{2})_{3-5}-, -(CH_{2})_{2}-N=; -CH=N-N=, -NH-CH=CH- o -NR-CH_{2}-CH_{2}- y forman junto con cualquier átomo N o C a los cuales están unidos un aro adicional; N es 1-6;

R significa hidrógeno, bajo alquilo o bajo alquenilo, independientemente entre sí, si más de un R está presente;

R^{2} significa nitro o ciano;

R^{3} significa hidrógeno, bajo alquilo, =O, -S, -SR, -S(O)_{2}-bajo alquilo, -(C_{3}-C_{6})cicloalquilo o piperazino, opcionalmente sustituido por bajo alquilo, o -CONR_{2}, -(CHR)_{n}CONR_{2}, -(CHR)_{n}OR, -(CH_{2})_{n}-CF_{3}, CF_{2}, -(CHR)_{n}OC(O)CF_{3}, -(CHR)_{n} COOR, -(CHR)_{n} SC_{6}H_{5}, donde el grupo fenil puede estar opcionalmente sustituido independientemente de cada uno por uno a 3 grupos de bajo alquilo, bajo alcoxi, halógeno, nitro o ciano, -(CHR)_{n}-1,3 dioxo-1,3-dihidro-isoindol, -(CHR)_{n}-tetrahidro-piran-2-iloxi o -(CHR)_{n} -S-bajo alquilo o -NR_{2}, -NRCO-bajo alquilo, -NRCHO, -N(R)(CHR)_{n}CN, -N(R) (CHR)_{n}CF_{3}, -N(R)(CHR)(CHR)_{n}-OR, -N(R)C(O) (CHR)_{n} O-bajo alquilo, -NR(CHR)_{n}, bajo alquilo, -NR(CHR)(CHR)_{n}-OR, -N(R)(CHR)(CHR)_{n}-O-fenil donde el grupo fenil puede estar opcionalmente sustituido independientemente de cada uno por uno a 3 grupos de bajo alquilo, bajo alcoxi, halógeno, nitro o ciano, -N(R)(CHR)_{n}-bajo alquenilo, -N(R)(CHR)(CHR)_{n}-O-(CHR)_{n}OR, -N(R)(CHR)_{n}C(O)O-bajo alquilo, -N(R)(CHR)_{n} C(O)NR-bajo alquilo, -N(R)(CH_{2})_{n}-2,2-dimetilo-[1,3]dioxolana,-N(R)(CHR)_{n} morfolino, -N(R)(CHR)_{n}-pyridino, -N(R)(CHR)(CHR)_{n}-piperidino, -N(R)(CHR)(CHR)_{n}-pirrolidino, -N(R)(CHR)(CHR)_{n}-O-piridino, N(R)(CHR)(CHR)_{n} imidazolo, -N(R)(CHR)_{n}-CR_{2}-(CHR)_{n} -OR, -N(R)(CHR)_{n} -CR_{2}-OR, -N(R)(CHR)_{n} -CHOR-CH_{2}OR, -N(R)(CHR)_{n}-CHOR-(CHR)_{n}-CH_{4}OR, o -OR, -O(CHR)_{n}CF_{3}, -OCF_{3}, -O(CHR)(CHR)_{n}-O-fenil, donde el grupo fenil puede estar opcionalmente sustituido independientemente de cada uno por uno a 3 grupos de bajo alquilo, bajo alcoxi, halógeno, nitro o ciano, -O(CHR)(CHR)_{n}-O-bajo alquilo, -O(CHR)_{n}-piridino o -O(CHR)(CHR)_{n}-morfolino;

o R^{3} y R^{4} están interconectados con los grupos-(CH_{2})_{3-5}-, (CH_{2})_{2}-N=, -CH=N-N=-, -CH=CH-N=, -NH-CH=CH- o NR-CH_{2}-CH_{2}- y forman junto con cualquier átomo N o C a los cuales están unidos un aro adicional; y

R^{4} significa hidrógeno, bajo alquilo, bajo alquenilo o -OR, -OCF_{3} -OCF_{2}-R, -OCF_{2}-bajo alquilo, -OCHRF, -OCHF-bajo alquenilo, -O(CHR)_{n}CF_{3}; o -(CHR)_{n}CHRF, -(CHR)_{n}CF_{2} R, -(CHR)_{n}CF_{3}, -(C_{3}-C_{6})cicloalquilo-(CHR)_{n}(C_{3}-C_{6})cicloalquilo, (CHR)_{n}CN, -(CHR)_{n}-fenil, donde el grupo fenil puede estar opcionalmente sustituido independientemente de cada uno por uno a 3 grupos de bajo alquilo, bajo alcoxi, halógeno, nitro o ciano, -(CHR)(CHR)_{n}OR, -(CHR)_{n} CHORCH_{2}, OR; -(CHR)(CHR)_{n}NR_{2}, -(CHR)_{n} COOR, -(CHR)(CHR)_{n}OSi-bajo alquilo, -(CHR)(CHR)_{n}-OS(O)_{2}-bajo alquilo, -(CH_{2})_{n}-CH=CF_{2}, -CF_{3}, -CF_{2}-R, -CF_{2}-bajo alquenilo, -CHRF, -CHF-bajo alquenilo, -(CHR)_{n}-2,2-dimemil-[1,3]dioxolana, -(CH_{2})_{n}-2-oxo-azepan-1-yl, -(CHR)(CHR)_{n}-morfolino, -(CHR)_{n}-piridino, -(CHR)(CHR)_{n}-imidazolo, -(CHR)(CHR)_{n}-triazolo, -(CHR)(CHR)_{n}-pirrolidino, opcionalmente sustituido por (CH_{2})_{n}OH, -(CHR)(CHR)_{n}-3-hidroxi-pirrolidino o -(CHR)(CHR)_{n}-piperidino, o -NR_{2}, -N(R)(CHR)_{n}-piridino, -N(R)C(O)O-bajo alquilo, -N(CH_{2}CF_{3})C(O)O-bajo alquilo, -N[C(O)O-bajo alquilo]_{2}, -NR-NR-C(O)O-bajo alquilo o -N(R)(CHR)_{n}CF_{3},-NRCF_{3}, -NELCF_{2}-R, -NRCF_{2}-bajo alquelino, -NRCHRF, -NRCHP-bajo alquenilo;

o es ausente si X es -N= o =N-;

R^{5} y R^{6} significan hidrógeno, bajo alquilo, bajo alcoxi, amino, nitro, -SO_{2}NH_{2} o halógeno; o

R^{5} y R^{6} están interconectados al grupo -O-CH_{2}-O y forman junto con los átomos C a los cuales están unidos un aro adicional de 5 miembros;

R^{7} y R^{8} significan hidrógeno, bajo alquilo, bajo alcoxi, amino, nitro o halógeno;

R^{9} y R^{10} significan hidrógeno y bajo alquilo;

R^{11} y R^{12} significan hidrógeno, bajo alquilo, hidroxi, bajo alcoxi, bajo alcoxicarboniloxi o bajo alcanoiloxi;

R^{13} y R^{14} significan hidrógeno, tritio o bajo alquilo;

R^{15} y R^{16} significan hidrógeno, tritio, bajo alquilo, hidroxi, bajo alcoxi o están unidos en un grupo oxo; o

X significa -N=, =N-, -N<, >C=o=C<;

Y significa -N=, =N-, -NH-, -CH= o =CH; y

la línea de puntos puede ser un enlace cuando R1, R3 o R4 representan átomo bivalente, al igual que con las sales farmacéuticamente aceptables de cada compuesto de la fórmula anteriormente indicada y las formas racémicas y opcionalmente activas de cada compuesto de la fórmula arriba indicada.

También se describen antagonistas mGluR5 en WO/01/02342 y WO/01/02340. Estos compuestos tienen las siguientes fórmulas respectivamente:

14

estereosímeros de los mismos, o sales farmacéuticamente aceptables o hidratos de los mismos, donde:

R1 y R2 se seleccionan de un grupo consistente en:

1)

H; o

2)

Un grupo ácido seleccionado de un grupo que comprende carboxi, fosfono, fosfino, sulfono, sulfino, borono, tetrazol, isoxazol, -(CH_{2})_{n}-carboxi, (CH_{2})_{n}-fosfono, (CH_{2})_{n}-fosfino, (CH_{2})_{n}-sulfono, (CH_{2})_{n}-sulfino, (CH_{2})_{n}-borono, (CH_{2})_{n}-tetrazol, y (CH_{2})_{n}-isoxazol, donde n = 1, 2, 3, 4, 5 o 6; o

X es un grupo ácido seleccionado del grupo consistente en carboxi, fosfono, fosfino, sulfono, sulfino, borono, tetrazol, isoxazol;

Y es un grupo seleccionad del grupo consistente en 1° amino, 2° amino, 3° amino, sales de amino cuaternario, 1° amino alifático, 2° amino alifático, 3° amino alifático, sales de amino cuaternario alifáticas, amino 1° aromático, amino 2° aromático, amino 3° aromático, sales de amino cuaternario aromático, imidazol, guanidino, boronoamino, allil, urea, tiourea;

m es 0, 1;

R3, R4, R5, R6 son independientemente H, nitro, amino, halógeno, tritio, trifluorometil, trifluoroacetil, sulfo, carboxi, carbamoil, sulfamoil o ésteres aceptables de los mismos;

O una sal de los mismos con un ácido o base farmacéuticamente aceptable.

Más clases de antagonistas mGluR5 se describen en WO 00/73283 y WO 99/26927. Estos compuestos tienen la fórmula: R-[Enlace]-Ar;

donde R es una cadena recta o ramificada opcionalmente sustituida de grupo alquilo, arialquilo, cicloalquilo, o alquilcicloalquilo que preferentemente contiene 5-12 átomos de carbono. Ar es una parte de molécula heteroaromática, arialquilo o heteroaralquilo opcionalmente sustituida que contiene hasta 10 átomos de carbono y hasta 4 heteroátomos, y [enlace] es -(CH_{2})_{n}-, donde n es 2-6, y donde hasta 4 grupos CH_{2} pueden independientemente sustituirse por grupos seleccionados del grupo consistente en C_{1}-C_{3} alquilo, CHOH, CO, O, S, SO, SO_{2}, N, NH, y NO. Dos heteroátomos en el [enlace] pueden no estar adyacentes excepto cuando estos átomos son ambos N (como en -N=N de -NH-NH-) o son N y S como en un sulfonamido. Dos grupos adyacentes CH_{2} en [enlace] también puede reemplazarse o sustituirse por un grupo alqueno o alquino sustituido o insustituido. También se proporcionan sales farmacéuticamente aceptables.

Otra clase de antagonistas mGluR5 se describe en WO 00/69816. Estos compuestos tienen la siguiente fórmula:

15

donde,

n es O, 1 o 2;

X es O, S, NH, o NOH;

R^{1} y R^{2} son independientemente H, CN, COOR, CONHR, C_{1}-C_{6}, alquilo, tetrazola, o R^{1} y R^{2} juntos representan "=O";

R es H o C_{1}-C_{6} alquilo;

R^{3} es C_{1}-C_{6} alquilo, C_{2}-C_{6} alquenilo, C_{3}-C_{6} cicloalquilo, -CH_{2}OH, -CH_{2}-alquilo, -COOH; Ar es un grupo aromático o heteroaromático insustituido o sustituido;

Z representa un grupo de las fórmulas

16

donde,

R^{4} y R^{5} son independientemente H, halógeno, C_{1}-C_{6} alcoxi, -OAr, C_{1}-C_{6} alquilo, -CF_{3}, COOR, CONHR, -CN, -OH, -COR, S(C_{1}-C_{6} alquilo), -SO_{2}(C_{1}-C_{6} alquilo);

A es CH_{2}, O, NH, NR, S, SO, SO_{2}, CH_{2}-CH_{2}, CH_{2}O, CHOH, C(O); donde R es como se ha definido anteriormente;

B es CHR, CR_{2}, C_{1}-C_{6} alquilo, C(O), -CHOH, -CH_{2}-O, -CH=CH, CH_{2}-C(O), CH_{2}-S, CH_{2}-S(O), CH_{2}-SO_{2}; -CHCO_{2}R; o -CH-NR_{2}, donde R es como se ha definido anteriormente;

Het es un heterociclo como furano, tiofeno, o piridina;

o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Otras clases de antagonistas mGluR5 se describen en WO 00/26199 y WO 00/26198. Estos compuestos tienen la siguiente fórmula:

17

en la cual,

R^{1}, R^{2} y R^{3} son independientemente hidrógeno, (C_{1}-C_{6}) alquilo, (C_{2}-C_{6}) alquenilo, (C_{3}-C_{10})cicloalquilo, aril insustituido o sustituido, aril (C_{1}-C_{6}) alquilo insustituido o sustituido, aril (C_{2}-C_{6}) alquilo insustituido o sustituido, halo, carboxi, (C_{1}-C_{6}) alcoxicarbonil o -(CH_{2})_{m}-OH, donde m es 1, 2 o 3;

= indica un enlace sencillo o doble;

X e Y son independientemente cada uno hidrógeno, o X e Y representan juntos un punte de la fórmula o -(CH_{2})_{n} donde n es 1 o 2;

A1 y A2 son independientemente cada uno un aril insustituido o sustituido;

Z es -CO-, -SO_{2} o -CH_{2}-; teniendo en cuenta que, cuando Z es -CO-, A_{1} no es 3, 4, 5-trimetoxifenil;

o una sal farmacéuticamente aceptable o éster de los mismos.

Otra clase de antagonistas mGluR5 se describe en WO 99/54280. Estos compuestos tienen la siguiente fórmula:

18

donde,

R1 puede ser un grupo ácido seleccionado del grupo consistente en carboxil, fosfono, fosfito, sulfono, sulfino, borono, tetrazol, isoxazol, CH_{2}-carboxil, CH_{2}-fosfono, CH_{2}-fosfino, CH_{2}-sulfono, CH_{2}-sulfino, CH_{2}-borono, CH_{2}-tetrazol, CH_{2}-isoxazol y homólogos más elevados de los mismos.

R2 puede ser un grupo básico seleccionado del grupo consistente en 1° amino, 2° amino, 3° amino, sales de amonio cuaternario, 1° amino alifático, 2° amino alifático, 3° amino alifático, sales de amonio cuaternario alifáticas, amino 1° aromático, amino 2° aromático, amino 3° aromático, sales de amonio cuaternario aromático, imidazol, guanidino, boronoamino, allil, urea, tiourea;

R3 puede ser H, alifático, aromático o heterocíclico;

R4 puede ser un grupo ácido seleccionado del grupo consistente en carboxil, fosfono, fosfito, sulfono, sulfino, borono, tetrazol, isoxazol; estereoisómeros de los mismos;

y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Otra clase de antagonistas mGluR5 se describe en WO 99/08678. Estos compuestos tienen la siguiente fórmula:

19

donde R significa halógeno o bajo alquilo;

N significa 0-3;

R1 significa bajo alquilo; cicloalquilo; benzilo opcionalmente sustituido por hidroxi, bajo alcoxi o bajo alquilo; bezoilo opcionalmente sustituido por amino, bajo alquilamino o di-bajo alquilamino, acetil o cicloalquil-carbonil; y 90 significa un residuo de 5 miembros aromático que está unido a N-átomo y que además contiene 1-3 átomos además del átomo N de enlace al igual que las sales farmacéuticamente aceptables.

Los antagonistas preferentes son aquellos que proporcionan una reducción de activación por parte del ligando de al menos 10%, y más preferentemente de al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o incluso al menos 99% en una concentración del antagonista, por ejemplo, de 1 \mug/ml, 10 \mug/ml, 100 \mug/ml, 500 \mug/ml, 1 mg/ml, 10 mg/ml, 100 mg/ml. El porcentaje de antagonismo representa el porcentaje de descenso de actividad de mGluR, por ejemplo, mGluR5, en una comparación de ensayos en la presencia y ausencia del antagonista. Cualquier combinación de los grados de porcentaje de antagonismo arriba mencionados y concentración de antagonistas puede usarse para definir un antagonista de la invención, siendo preferente un mayor antagonismo en concentraciones más bajas.

Un antagonista para uso en la invención puede ser un antagonista relativamente no-específico que es un antagonista de mGluR5 en general. Preferentemente, sin embargo, un antagonista de manera selectiva antagoniza el grupo I mGluRs. Incluso más preferentemente, un antagonista empleado en la invención es un antagonista selectivo de mGluR5. Un antagonista selectivo de mGluR5 es uno que antagoniza mGluR5, pero antagoniza otro mGluR5 sólo débilmente o sustancialmente no del todo, o al menos antagoniza otro mGluR5 con EC50 al menos 10 o incluso 100 o 1000 veces más grande que E50 en el cual antagoniza mGluR5. Los antagonistas más preferentes son aquellos que puede antagonizar de modo selectivo mGluR5 en bajas concentraciones, por ejemplo, aquellos que pueden causar un nivel de antagonisamo de 50% o mayor en una concentración de 100 \mug/ml o menos.

Los compuestos útiles en la presente invención particularmente bibliotecas de variantes que tiene varias clases representativas de sustitutos, están dispuestos a someterse a química combinatoria y otras técnicas de síntesis paralelas (ver, por ejemplo, PCT WO 94/08051). El resultado es que las bibliotecas amplias de compuestos relacionados, p. ej., una biblioteca variada de antagonistas mGluR5 potenciales, pueden analizarse rápidamente en ensayos de alto rendimiento para identificar compuestos de plomo, así como para refinar la especifidad, toxicidad, y/o perfil citotóxico-cinético de un compuesto de plomo.

Simplemente como ilustración, una biblioteca combinatoria para los propósitos de uso de acuerdo con la presente invención es una mezcla de compuestos, como compuestos químicamente relacionados, que puedes analizarse juntos para una propiedad deseada. La preparación de muchos compuestos relacionados en una única reacción reduce en gran medida y simplifica en número de procesos de análisis que necesitan llevarse a cabo. El análisis para las propiedades físicas apropiadas puede hacerse con los métodos convencionales.

La diversidad en una biblioteca puede crearse en una variedad de diferentes niveles. Por ejemplo, los grupos de aril sustrato usados en las reacciones combinatorias pueden ser diversos en términos del núcleo de la molécula aril, p. ej., una variación en términos de la estructura del aro, y/o puede variar con respecto a otros sustitutos.

Una variedad de técnicas están disponibles en este campo para generar bibliotecas combinatorias de pequeñas moléculas orgánicas tales como las antagonistas del objeto. Ver, por ejemplo, Blondelle et al. (1995) Trends Anal. Chem. 14:83; the Affymax U.S Patents 5,359,115 y 5,362,899: the Ellman U.S. Patent 5,288,514: the Still et al. publicación PCT WO 94/08051; Chen et al. (1994) JACS 116:2661: Kerr et al. (1993) JACS 115:252; publicaciones PCT WO 93/09668 y WO 91/07087; y the Lerner et al ., publicación PCT WO 93/20242). Por consiguiente, una variedad de bibliotecas en el orden de aproximadamente 100 a 1,000,000 o más variedades de los antagonistas del objeto pueden sintetizarse y analizarse para una actividad o propiedad particular.

Una biblioteca de candidatos antagonistas diversos pueden sintetizarse utilizando una técnica adaptada a las técnicas descritas en Still et al. publicación PCT WO 94/08051, estando unidos a un reborde de polímero por un grupo hidrolizable o fotolizable, localizado en una de las posiciones de los antagonistas candidatos o un sustituto de un intermediario sintético. De acuerdo con la técnica de Still et al, la biblioteca es sintetizada sobre un conjunto de rebordes, incluyendo cada uno de los cuales un conjunto de etiquetas que identifican una particular diversidad en ese reborde. Los diversómeros pueden soltarse del reborde, por ejemplo, por hidrólisis y testarse para
actividad.

A) Caracterización Directa

Una creciente tendencia en el campo de química combinatoria es explotar la sensibilidad de técnicas tales como espectometría de masa (EM), por ejemplo, que puede usarse para caracterizar cantidades sub-fentomolar de un compuesto, y para determinar directamente la constitución química de un compuesto seleccionado de una biblioteca combinatoria. Por ejemplo, donde la biblioteca es provista de una matriz de soporte insoluble, poblaciones discretas de compuestos pueden retirarse en primer lugar del suporte y caracterizarse por EM. En otras realizaciones, como parte de la técnica de preparación de muestra de EM, tales técnicas EM como MALDI pueden usarse para soltar un compuesto de la matriz, particularmente donde un enlace inestable se usa originalmente para atar el compuesto a la matriz. Por ejemplo, un reborde seleccionado de una biblioteca puede irradiarse en un paso MALDI con el fin de soltar las moléculas orgánicas de la matriz, e ionizar las partículas orgánicas para análisis EM.

B) Síntesis Multipinza

Las bibliotecas pueden tomar formato multipinza. En resumen, Geysen y sus colaboradores (Geysen et al. (1984) PNAS 81:3998-4002) introdujo un método para generar bibliotecas de compuestos por una síntesis paralela sobre pinzas de polietilieno tamizadas con ácido poliacrílico presentadas en formato de placa de microtítulo. La técnica Geysen puede usarse para sintetizar y analizar cientos de compuestos a la semana empleando el método multipinza, y los compuestos atados pueden reutilizarse en muchos ensayos. Las moléculas de unión apropiadas también pueden estar agregadas a las pinzas para que los compuestos puedan partirse o rajarse de los soportes tras la síntesis para análisis de pureza y otras evaluaciones. (c. f. Bray et al. (1990) Tetrahedron Left 31:5811-5814; Valerio et al. (1991) Anal Biochem 197:168-177; Bray et al. (1991) Tetrahedron Lett 32:6163-6166).

C) Dividir-Enganchar-Recombinar

Una biblioteca variada de compuestos puede estar provista de un conjunto de rebordes que utilizan la estrategia de dividir-enganchar-recombinar (ver, por ejemplo, Houghten (1985) PNAS 82:5131-5135; y Patentes U.S 4,631,211; 5,440,016; 5,480,971). En resumen, como el propio nombre indica, en cada paso de síntesis donde se introduce degeneración en la biblioteca, los rebordes se dividen en grupo separados iguales al número de sustitutos diferentes que se añaden en una posición particular en la biblioteca, los diferentes sustitutos enganchados en reacciones separadas, y los rebordes recombinados en un pozo para la siguiente iteración.

La estrategia dividir-enganchar-recombinar puede llevarse a cabo usando una técnica análoga al método llamado "bolsa de té" desarrollada en primer término por Houghten, donde la síntesis de compuesto se da en resina sellada dentro de bolsas de polipropileno poroso (Houghten et al. (1986) PNAS 82:5131-5135). Sustitutos son enganchados al compuesto que soporta las resinas colocando las bolsas en soluciones de reacción apropiadas, mientras que todos los pasos comunes como lavado y desprotección de resina se realizan simultáneamente en un recipiente de reacción. Al final de la síntesis, cada bolsa contiene un solo compuesto.

D) Bibliotecas Combinatorias por Luz Dirigida, Síntesis Química Paralela Dirigible

Una técnica de síntesis combinatoria en la cual se da la identidad de un compuesto por su localización en un sustrato de síntesis se denomina una síntesis espacialmente dirigible. El proceso combinatorio puede llevarse a cabo controlando la adición o un reagente químico a situaciones específicas sobre un soporte sólido (Doler et al. (1991) Anny Rep Med Chem 26:271-280; Fodor, S.P.A. (1991) Science 251:767; Pirrung et al. (1992) Patente U.S N° 5,143,854; Jacobs et al. (1994) Trends Biotechnol 12:19-26). La resolución especial de fotolitografía permite la miniaturización. Esta técnica puede llevarse a cabo mediante el uso de reacciones de protección/desprotección con grupos protectores fotoalterables.

Los puntos clave de esta tecnología se ilustran en Galop et al (1994) J Med Chem 37:1233-1251. Se prepara un sustrato de síntesis para enganchar por medio de la unión covalente de nitroveratriloxicarbonil (NVOC) fotoalterable uniones de amino protegidas u otras uniones fotoalterables. Se emplea luz para activar de manera selectiva una región específica del soporte de síntesis para enganchar. La retirada de los grupos fotoalterables protectores por luz (desprotección) resulta en la activación de áreas seleccionadas. Tras la activación, el primero de un conjunto de análogos aminoácidos, cada uno de ellos soportando un grupo protector fotoalterable en el final amino, se expone a toda la superficie. El enganche sólo se da en regiones que fueron dirigidas por la luz en el paso precedente. La reacción se paraliza, las placas se lavan y el sustrato se vuelve a iluminar por medio de una segunda máscara, activando una región diferente para reacción con un segundo bloqueo de construcción protegido. El patrón de máscaras y la secuencia de reactivos definen los productos y sus ubicaciones. Debido a que este proceso utiliza técnicas de fotolitografía, el número de compuestos que pueden sintetizarse es limitado solamente por el número de zonas de síntesis que puede dirigirse con la resolución apropiada. La posición de cada compuesto es precisamente conocida; de ahí, sus interacciones con otras moléculas pueden ser directamente evaluadas.

En una síntesis química dirigida por luz, los productos dependen del patrón de iluminación y del orden de adición de los reactivos. Variando los patrones litográficos, muchas series diferentes de compuestos de test pueden sintetizarse simultáneamente; esta característica lleva a la generación de otras estrategias diferentes de enmascaramiento.

E) Bibliotecas Combinatorias Codificadas

Este método utiliza una biblioteca de compuestos provista de un sistema de etiquetado enmascarado. Una mejora reciente en la identificación de compuestos activos de bibliotecas combinatorias emplea sistemas de índices químicos con etiquetas que únicamente codifican los pasos de reacción y un dado reborde se da y por deducción, la estructura que lleva. Conceptualmente, esta técnica imita bibliotecas de exposición phage, donde la actividad deriva de péptidos expresados, pero las estructuras de los péptidos activos se deducen de la secuencia correspondiente de ADN genómica. La primera codificación de bibliotecas combinatoriales sintéticas empleó ADN como código. Una variedad de otras formas de codificación se han presentado, incluyendo codificación con bio-oligómeros secuenciables (p. ej., oligonucleótidos y péptidos) y codificación binaria con etiquetas adicionales no-secuenciables.

1) Etiquetado con bio-oligómeros secuenciables

El principio para usar oligonucieótidos para codificar bibliotecas sintéticas combinatorias se describió en 1992 (Brenner et al. (1992) PNAS 89:5381-5383), y un ejemplo de tal biblioteca apareció el año siguiente (Neddles et al. (1993) PNAS 90:10700-10704). Una biblioteca combinatoria de nominalmente 7^{7} (= 823,543) péptidos compuestos de todas las combinaciones de Arg, Gin, Phe, Lys, Val, D-Val y Thr (código aminoácido de tres letras), cada uno de los cuales se codificó por un dinucleótido específico (TA, TC, CT, AT, U, CA y AC, respectivamente), se preparó una serie de vueltas alternativas de síntesis de péptido y oligonucleótido sobre un soporte sólido. En este trabajo, la funcionalidad del amino sobre el reborde fue específicamente diferenciado hacia la síntesis de péptido o oligonucleótido mediante la preincubación simultánea de los rebordes con reagentes que generan grupos protegidos OH para síntesis de oligonucleótidos y grupos NH_{2} protegidos para síntesis de péptidos (aquí, en un radio de 1:20). Cuando se completó, las etiquetas que consistían en 659-mers, 14 de ellas llevaron el código. La biblioteca enlazada al reborde se incubó con un anticuerpo fluorescentemente etiquetado, y rebordes que contienen anticuerpos enlazados que emitían fuertes fluorescentes se cultivaron por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Las etiquetas de ADN se amplificaron por PCR y se secuenciaron y los péptidos pronosticados se sintetizaron. Tras tales técnicas, las bibliotecas de compuestos pueden derivarse para uso en el método objeto, donde la secuencia de oligonucleótido de la etiqueta identifica las reacciones combinatorias secuenciales que un reborde particular sufrió, y por lo tanto proporciona la identidad del compuesto sobre el reborde.

El uso de etiquetas de oligonucieótidos permite el análisis de manera exquisita de la etiqueta. A pesar de esto, el método requiere la elección cuidadosa de series ortogonales de grupos protectores necesarios para alternar co-síntesis de la etiqueta y el miembro de la biblioteca. Además, la inestabilidad de la etiqueta, particularmente los anoméricos de fosfato y azúcar, pueden limitar la elección de reagentes y condiciones que pueden emplearse para la síntesis de bibliotecas no-oligoméricas. En realizaciones preferentes, las bibliotecas emplean enlaces que permiten la desunión selectiva del miembro de biblioteca compuesto del test para el ensayo.

También se han empleado péptidos como moléculas de etiquetaje para bibliotecas combinatorias. Dos técnicas ejemplares se describen en la técnica, y las dos emplean enlaces ramificados a una fase sólida tras la cual los filamentos de ligando y codificación se elaboran alternativamente. En la primera técnica (Kerr et al. (1993) JACS 115:2529-2531), se logra la ortoganilidad in síntesis empleando protección ácido-alterable para el filamento de codificación y protección base-alterable para el filamento de compuesto.

En una técnica alternativa (Nikolaiev et al. (1993) Pept Res 6:161-170), se emplean enlaces ramificados para que la unidad de codificación y el compuesto de test puedan estar unidos al mismo grupo funcional en la resina. En esta realización, un enlace rasgable puede colocarse entre el punto de ramificación y el reborde para que la rotura suelte una molécula que contenga tanto el código como el compuesto (Ptek et al. (1991) Tetrahedron Lett 32:3891-3894). En otra realización, el enlace rasgable puede situarse para que el compuesto del test pueda separarse de modo selectivo del reborde, dejando el código atrás. Esta última construcción es particularmente valiosa porque permite el análisis del compuesto de test sin interferencia potencial de los grupos de codificación. Ejemplos en la técnica de fisura independiente y secuencias de miembros de biblioteca de péptidos y sus etiquetas correspondientes han confirmado que las etiquetas pueden predecir con precisión la estructura peptídica.

2) Etiquetaje No-Secuenciable: Codificación Binaria

Una forma alternativa de codificar la biblioteca del compuesto del test emplea una serie de moléculas de etiquetaje electrofórico no-secuenciables que se usan como un código binario (Ohlemeyer et al. (1993) PNAS 90:10922-10926). Etiquetas ejemplares son éteres de alquilo haloaromáticos que se detectan como sus éteres trimetilsilil a menos que niveles femtomolar por cromatografía de gas de captura de electrón (ECGC). Variaciones en la longitud de la cadena de alquilo, así como la naturaleza y posición de los sustitutos halido aromáticos, permiten la síntesis de la menos 40 etiquetas, que en principio pueden codificar 2^{40} (p. ej., más de 10^{12}) moléculas diferentes. En el informe original (Ohlmeyer et al., supra) las etiquetas estaban enlazadas a aproximadamente 1% de los grupos de amino disponibles de una biblioteca péptida por medio de un enlace fotorasgable o-nitrobenzilo. Esta técnica es conveniente cuando se preparan bibliotecas combinatorias de análogos de péptido u otras moléculas que contienen amino. Sin embargo, se ha desarrollado un sistema más versátil que permite codificar prácticamente cualquier biblioteca combinatoria. Aquí, el compuesto estaría unido a través de un enlace éter cachetol a través de inserción carbeno en la matriz del reborde (Nestler et al. (1994) J Org Chem 59:4723-4724). Esta estrategia de unión ortogonal permite la desunión selectiva de miembros de biblioteca para ensayo en solución y decodificación posterior por ECGC tras la desunión selectiva de las series de etiquetas.

A pesar de que varias bibliotecas de enlace amido en la técnica emplean codificación binaria con etiquetas electrofóricas a grupos amino, unir estas etiquetas directamente a la matriz reborde proporciona gran versatilidad en las estructuras que pueden prepararse en bibliotecas combinatorias codificadas. Unidas de este modo, las etiquetas y sus enlaces son prácticamente no reactivos como la propia matriz de reborde. Se han señalado dos bibliotecas combinatorias codificadas binarias donde las etiquetas electrofóricas están directamente unidas a la fase sólida (Ohlemeyer et al. (1993) PNAS 92:6027-6031) y proporcionan guía para generar la biblioteca compuesta objeto. Ambas bibliotecas se construyeron usando una estrategia de unión ortogonal en la cual el miembro de la biblioteca estaba unido al soporte sólido por un enlace fotoalterable y las etiquetas estaban unidas por medio de un enlace únicamente rompible por vigorosa oxidación. Debido a que los miembros de la biblioteca pueden ser repetidamente parcialmente fotoeluídos del soporte sólido, los miembros de la biblioteca pueden utilizarse en múltiples ensayos. La sucesiva fotoelución también permite una estrategia de análisis iterativo de elevada productividad: en primer lugar, se colocaron múltiples rebordes en placas microtítulo de 96-pozos; en segundo lugar, los compuestos son parcialmente separados y transferidos a placas de ensayo; en tercer lugar, un ensayo de unión metal identifica los pozos activos; en cuarto lugar, los correspondientes rebordes son reorganizados individualmente en nuevas placas microtítulo; en quinto lugar, los compuestos activos individuales son identificados; y en sexto lugar, las estructuras son decodificadas.

B. Ensayos Ejemplares de Antagonista mGluR5

Métodos para identificar antagonistas mGluR son conocidos en la técnica. Básicamente, tales métodos comprenden el paso de determinar si un agente de test es un antagonista mGluR5 y determinar si un antagonista así identificado puede usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de Síndrome X Frágil, y/o autismo.

Un ejemplo de un ensayo para determinar la actividad de un compuesto de test como un antagonista de mGluR5 consiste en expresar mGluR5 en células CHO que han sido transformadas con cADNs codificando la proteína receptora mGluR5 (Daggett et al., 1995, Neuropharmacology, 34, 871). El mGluR5 es después activado por la adición de quiscualato y/o glutamato y puede evaluarse por, por ejemplo la medida de: (1) hidrólisis fosfoinositol (Litschig et al., 1999, Mol. Pharmacol. 55, 453); (ii) acumulación de [3H] citidinefosfato-diacilglicerol (Cavan et al., 1999, Neuropharmacology 38, A10); o detección fluorescente de entrada de calcio en células Kawabata et al., 1996, Nature 383, 89-1; Nakahara et al., 1997, J. Neurochemistry 69, 1467). El ensayo puede llevarse a cabo en la presencia o en la ausencia de un producto de test con el fin de determinar si el compuesto de test puede antagonizar la actividad del producto del test. Este ensayo puede realizarse para análisis de elevada productividad.

Antagonistas de receptor mGluR5 también pueden identificarse por estudios de enlace de ligando radioetiquetados en el receptor humano mGluR5 clonado y expresado (Korezak et al., 1994, Recept. Channels 3: 41-49), por pinza de voltaje de célula completa y grabaciones electrofisiológicas de actividad funcional en el receptor humano mGluR5 (Korezak et al., 1994, Recept. Channels 3: 41-49) y por pinza de voltaje de célula completa y grabaciones electrofisiológicas de corrientes en neuronas de los ganglios de raíz dorsal en ratas extremadamente aisladas (Bleakman et al., 1996, Mol. Pharmacol. 49: 581-585).

Pueden llevarse a cabo experimentos adecuados de control. Por ejemplo, un antagonista putativo de mGluR5 puede testarse con mGluR1 con el fin de determinar la especifidad del antagonista putativo, u otros receptores relacionados con mGluRs para eliminar la posibilidad de que es un antagonista general de receptores de membrana celular.

Productos de test adecuados para identificar un antagonista mGluR5 incluyen bibliotecas combinatorias, identidades químicas definidas, péptidos y miméticos peptídicos, oligonucleótidos y bibliotecas de productos naturales. Los productos de test pueden usarse en un análisis inicial de, por ejemplo, diez productos por reacción, y los productos de lotes que muestran antagonismo testado individualmente. Además, los productos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos de cadena sencilla, cuerpos quiméricos y anticuerpos injertados en CDR) pueden usarse.

C. Preparaciones farmacéuticas de Antagonistas mGluR5

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de antagonistas mGluR5 en la fabricación de preparaciones farmacéuticas. Los antagonistas mGluR5 puede formularse convenientemente para administración con un medio biológicamente aceptable, no-pirogénico, y/o estéril, como agua, salina regulada, poliol (por ejemplo, glicerol, glicol propileno, polietileno líquido, glicol y análogos) o mezclas adecuadas de los mismos. La concentración óptica de los ingredientes activos en el medio elegido puede determinarse empíricamente, de acuerdo con los procedimientos bien conocidos por los químicos médicos. Como aquí es empleado, "medio biológicamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, y similares que pueden ser apropiados para la ruta adecuada de administración de la preparación farmacéutica. El uso de tal medio para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. En la medida en la que cualquier medio convencional o agente es incompatible con la actividad de antagonistas mGluR5, su uso en la preparación farmacéutica de la invención es valorado. Medios adecuados y sus formulaciones globales de otras proteínas se describen, por ejemplo, en el libro Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA (1985)). Estos medios incluyen "formulaciones depósito" inyectables.

Las formulaciones farmacéuticas también incluyen composiciones veterinarias, p. ej., preparaciones farmacéuticas del antagonista mGluR5 adecuadas para usos veterinarios, p. ej., para el tratamiento de ganado o animales domésticos, p. ej., perros.

Métodos de introducción también pueden proporcionarse por dispositivos recargables o biodegradables. Se han desarrollados varios dispositivos poliméricos de lento escape y se han testado in vitro en años recientes para el envío controlado de fármacos. Una variedad de polímeros biocompatibles (incluyendo hidrogeles) incluyen polímeros biodegradables y no degradables y pueden usarse para formar un implante para el escape sostenido de un antagonista mGluR5 en un punto particular diana.

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Las preparaciones pueden darse oralmente, parenteralmente, tópicamente o rectamente. Por supuesto, se dan por formas adecuadas a la ruta de administración deseada. Por ejemplo, pueden administrarse en forma de pastillas o cápsulas, por inyección, inhalación, loción para ojos, pomada, supositorio, parche de escape controlado, etc, administración por inyección, infusión o inhalación; tópico por loción o pomada; y rectal por supositorios. Son preferibles las administraciones orales y tópicas.

Las expresiones "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" como aquí se emplean significan modos de administración diferentes a administración enteral o tópica, usualmente por inyección, e incluye sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradermal, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subarcanoide, intraespinal e intraesternal.

Las expresiones "administración sistémica" y "administrado sistémicamente", "administración periférica" y "administrado periféricamente" como aquí se emplean significan que la administración de un compuesto, fármaco u otro material en vez de entrar directamente al sistema central nervios, entra al sistema del paciente que por lo tanto, está sujeto al metabolismo y otros procesos como administración subcutánea.

Estos compuestos pueden administrarse a humanos u otros animales para terapia por cualquier ruta de administración, incluyendo oralmente, nasalmente o mediante, por ejemplo, un spray, rectalmente, intravaginalmente, parenteralmente, intracisternalmente y tópicamente como mediante polvos, pomadas o gotas, incluyendo bocalmente y sublingualmente.

Respecto a la ruta de administración seleccionada, los compuestos que pueden usarse en una forma hidratada adecuada, y/o composiciones farmacéuticas, se formulan en formas de dosis farmacéuticamente aceptables como las descritas a continuación o por otros métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

Niveles de dosis reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que es eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente en particular, composición, modo de administración, sin ser tóxico para el paciente.

El nivel de dosis seleccionado dependerá de una variedad de factores que incluyen la variedad empleada del compuesto particular de la presente invención, el es éster, sal o amida de los mismos, la ruta de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con los inhibidores de respuesta particular empleados, la edad, sexo, peso, condición, estado de salud general e historial médico previo del paciente a ser tratado, y factores similares bien conocidos en la medicina.

Un médico o veterinario que tiene experiencia ordinaria en la técnica puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario puede comenzar dosis de los compuestos de la invención empleados con el fin de lograr el efecto terapéutico deseado y gradualmente aumentar la dosis hasta que se logre el efecto deseado.

En general, una dosis diaria adecuada del compuesto de la invención será esa cantidad del compuesto que sea la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. Tal dosis eficaz dependerá generalmente de los factores descritos anteriormente. Generalmente, dosis intravenosas, intracerebroventriculares y subcutáneas de los compuestos de esta invención para un paciente variará entre 0.0001 y 100 mg por kilogramos de peso de cuerpo por día.

Si se desea, la dosis diaria eficaz del compuesto activo puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas de manera separada a intervalos apropiados a lo largo del día, opcionalmente, en forma de dosis de unidad.

El término "tratamiento" pretende englobar profilaxis, terapia y cura.

El paciente que recibe este tratamiento es cualquier animal que lo necesite, incluyendo primates, en particular humanos, y otros mamíferos como equinos, ganado, cerdos y ovejas; y aves de corral y mascotas en general.

El compuesto puede administrarse como tal o en mezclas con portadores farmacéuticamente aceptables y puede también administrarse junto con otros agentes microbiales como penicilinas, cefalosporinas, aminoglicosidas y glicopéptidos. Por lo tanto, la terapia en conjuntos incluye administración secuencial, simultánea y separada del compuesto activo de tal modo que los efectos terapéuticos del primer administrado no desaparecen completamente cuando se administra el siguiente.

Cuando es posible que un compuesto sea administrado solo, es preferible administrar un compuesto como una formulación farmacéutica (composición). La composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede formularse para administración de cualquier modo conveniente para uso en medicina humana o veterinaria.

Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de uno o más de los compuesto descritos anteriormente en la fabricación de una composición farmacéuticamente aceptable formulada junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables (aditivos) y/o diluyentes. Como se describe con más detalle a continuación, las composiciones farmacéuticas pueden estar especialmente formuladas para administración en forma sólida o líquida, incluyendo aquellas adaptadas para lo siguiente: (1) administración oral, por ejemplo, empapados (soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas), pastillas, bolos alimenticios, polvos, gránulos, y pastas para aplicación en la lengua; (2) administración parenteral, por ejemplo, por inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa como, por ejemplo, una solución o suspensión estéril; (3) aplicación tópica, por ejemplo, como crema, pomada o spray aplicado a la piel; o (4) intravaginalmente o intrarectalmente, por ejemplo, como un supositorio vaginal, crema o espuma. Sin embargo, en ciertas realizaciones, los compuestos en cuestión pueden simplemente disolverse o suspenderse en agua estéril.

La expresión "portador farmacéuticamente aceptable" como aquí es empleado significa un material farmacéuticamente aceptable, composición o medio, como un filtro líquido o sólido, diluyente, excipiente, disolvente, o material en cápsulas, implicado en llevar o transportar los reguladores en cuestión de un órgano, o parte del cuerpo, a otro órgano o parte del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de que sea compatible con los otros ingredientes de la formulación y que no sea dañino para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen (1) azúcares, como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, como celulosa carboximetil sódica, celulosa etil y acetato celulosa; (4) tragacanth en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, como mantequilla de cacao y ceras supositorios; (9) aceites, como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de alazor, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, como glicol de propileno; (11) polioles, como glicerina, sorbitol, manitol y glicol polietileno; (12) ésteres como oleato etil y laurato etil; (13) agar; (14) agentes búfer, como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pyrogen; (17) salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etil; (20) soluciones de búfer fosfato; y (21) otras sustancias compatible no-tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.

Como se ha establecido anteriormente, ciertos antagonistas mGluR5 pueden contener un grupo básico funcional, como amino o alquilamino, y son, por lo tanto, capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con ácidos farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" en esto aspecto, se refiere a las sales de adición ácido no tóxicas, inorgánicas y orgánicas de compuestos de la presente invención. Estas sales pueden prepararse in situ durante el aislamiento final y purificación de los compuestos de la invención, o de manera separada reaccionando un compuesto purificado de la invención en su forma de base libre con un ácido orgánico u orgánico adecuado, y aislando la sal consecuentemente formada. Sales representativas incluyen las sales de hidrobromuro, hidrocloruro, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato y laurilsulfonato y similares. (Ver, por ejemplo, Berge et al. (1977) "Pharmaceutical salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19).

Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos en cuestión incluyen sales convencionales no tóxicas o sales de amonio cuaternarias de los compuestos, p. ej., de ácidos no tóxicos orgánicos e inorgánicos. Por ejemplo, tales sales convencionales no tóxicas incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos tales como hidrocloruro, hidrobromuro, sulfúrico, sulfámico, fosfórico, nítrico y similares; y las sales preparadas de ácidos orgánicos tales como acético, propiónico, sucínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, palmítico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutámico, benzoico, slalicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluenesulfónico, metanosulfónico, etano disulfónico, oxálico, isotiónico, y similares.

En otros casos, los compuestos útiles en la invención pueden contener uno o más grupos funcionales ácidos y por lo tanto, capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con bases farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" en estos casos se refiere a las sales de adición de base orgánica o no orgánica de compuestos de la presente invención. Estas sales pueden asimismo prepararse in situ durante el aislamiento final y purificación de los compuestos o de manera separada reaccionando el compuesto purificados en su forma de ácido libre con una base adecuada, como hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metal farmacéuticamente aceptable, con amonio, o con amina primaria, secundaria o terciaria farmacéuticamente aceptable. Sales de tierra alcali o alcalinas incluyen sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio y similares. Aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición base incluyen etilamina, dietilamina, etilenediamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina y similares (Ver, por ejemplo, Berge et al, supra).

Agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, como sulfato lauril sodio y esterarato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de escape, agentes protectores, agentes endulzantes, saborizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en las composiciones.

Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua como ácido ascórbico, hidrocloruro de cistenina, bisulfato sódico, metabisulfito sódico, sulfito sódico y similares; (2)antioxidantes solubles en aceite como palmitato ascorbil, hidroxianisola butilado (BHA); hidroxitoluene butilado (BHT), lecitina, galato propilo, alpha-tocopherol, y sitiarles; y (3) agentes quelatantes de metal como ácido cítrico, ácido tetraacético etilenediamina (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.

Formulaciones incluyen aquellas para administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosis de unidad y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos por el farmacéutico. La cantidad de ingrediente activo puede combinarse con un material portador para producir una forma de única dosis variará dependiendo del huésped a ser tratado, el modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de única dosis será generalmente la cantidad del compuesto que produce un efecto terapéutico. Generalmente, en uno de cada diez casos, esta cantidad variará entre 1 por ciento y 99 por ciento de ingrediente activo, preferentemente entre 5 por ciento y 70 por ciento, más preferentemente, entre 10 por ciento y 30 por ciento.

Métodos para preparar estas formulaciones o composiciones incluyen el paso de asociar un compuesto de la presente invención con el portador y, opcionalmente, uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan uniformemente asociando un compuesto de la presente invención con portadores líquidos, o portadores sólidos divididos finamente, o ambos, y por lo tanto, si es necesario, se da forma al producto.

Formulaciones adecuadas para administración oral pueden tener la forma de cápsulas, sobres, píldoras, pastillas (usando una base saborizante, normalmente sacarosa y acacia o tragacanth), polvos, gránulos, o como una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida en aceite-en-agua o en agua-en-aceite, o como un elixir o jarabe, o en pastillas (usando una base inerte como gelatina o glicerina, o sacarosa o acacia) y/o como limpiadores de boca y similares, cada uno de ellos conteniendo una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente invención como un ingrediente activo. Un compuesto de la presente invención pueden también administrarse como un bolo alimenticio, electuario o pasta.

En forma de dosis sólida para administración oral (cápsulas, píldoras, pastillas, grageas, polvos, gránulos y similares), el ingrediente activo se mezcla con uno o más portadores famacéuticamente aceptables, como citrato sódico o fosfato dicalcio y/o alguno de los siguientes: (1) filtros o diluentes, como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y/o ácido silícico; (2) aglutinantes, como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, pirrolidona polivinilo, sacarosa y/o acacia; (3) humectantes, como glicerol; (4) agentes desintegradotes, como agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, cierto silicatos, y carbonato sódico; (5) agentes retardantes en solución, como parafina; (6) aceleradores de absorción, como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, como, por ejemplo, alcohol de cetil y monoestearato glicerol; (8) absorbentes, como arcilla caolina y bentonita; (9) lubricantes, como talco, estearato de calcio, esterarato de magnesio, glicoles de polietileno sólido, sulfato lauril sódico, y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de cápsulas, pastillas y píldoras, las composiciones farmacéuticas también contienen agentes búfer. Composiciones sólidas de un tipo similar pueden emplearse como filtros en cápsulas de gelatina blanda y dura rellenas usando tales excipientes como lactosa o azúcares de leche, así como glicoles de polietileno de altos pesos moleculares y similares.

Una pastilla se puede hacer por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Pastillas comprimidas pueden prepararse usando aglutinantes (por ejemplo, gelatina o celulosa hidroxipropilmetil), agentes de dispersión o activo en superficie. Pastillas moldeadas también pueden hacerse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvos humedecido con un diluyente líquido inerte.

Las pastillas, y otras formas de dosis sólidas de las composiciones farmacéuticas, como grageas, cápsulas, píldoras y gránulos, pueden marcarse o prepararse con revestimientos o estructuras, como revestimientos entéricos u otros revestimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. También pueden formularse para proporcionar una retirada lenta y controlada de los ingredientes activos en uso, por ejemplo, celulosa de hidroxipropilmetil, liposomas y/o microsesferas. También pueden esterilizarse por, por ejemplo filtración a través de filtros retenedores de bacterias, o incorporando agentes esterilizadores en la forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse en agua estéril, u otros medios inyectables estériles inmediatamente después del uso. Estas composiciones también pueden contener de manera opcional agentes opacos y puede que en una composición retiren sólo los ingredientes activos, o preferentemente, en una cierta porción del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de manera retardada. Templos de composiciones insertadas que pueden usarse incluyen sustancias poliméricas y ceras. El ingrediente activo también puede estar en forma de microcápsula, si es adecuado, con uno o más de los excipientes arriba mencionados.

Las formas de dosis líquidas para administración oral de los compuestos incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del ingrediente activo, las formas en dosis líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizadores y emulsionantes, como alcohol etilo, alcohol isopropilo, carbonato etilo, acetato etilo, alcohol benzilo, benzoato benzilo, glicol propileno, 1,3-butileno glicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, castor y sésamo) glicerol, alcohol tetrahidrofuril, glicoles polietileno, ésteres de ácidos grasos de sorbitan y mezclas de los mismos.

Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y en suspensión, agentes endulzantes, saborizantes, colorantes, perfumantes y conservantes.

Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes en de suspensión como, por ejemplo, alcoholes isostearil ethoxilatado, sorbitol polioxietileno y ésteres de sorbitan, celulosa mircrocristalina, bentonita metahidroxido, agar-agar y tragacanth, y mezclas de los mismos.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas para administración rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio, que puede prepararse mezclando uno o más compuestos de la invención con uno o más excipientes adecuados no irritantes o portadores que comprendan, por ejemplo, manteca de cacao, glicol polietileno, una cera supositorio o un salicilato, y que es sólido a temperatura ambiente, pero líquido a temperatura corporal y, por lo tanto, se derretirá en el recto o cavidad vaginal y soltará el inhibidor de respuesta activa.

Las formulaciones que son adecuadas para administración vaginal también incluyen formulaciones para supositorios vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o spray que contienen tales portadores bien conocidos en la técnica por ser los apropiados.

Las formas de dosis para la administración tópica y transdermal de un compuesto de la invención incluye polvos, sprays, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhaladores. Puede ser necesario que el compuesto activo pueda mezclarse bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable, y con cualquier conservador, búfer o propelente.

Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, en adición a un compuesto activo, como grasas animales o vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanth, derivados de celulosa, glicoles de polietileno, siliconas, benonitas, ácido silícico, talco y óxido de zinc, o mezclas de los mismos.

Polvos y sprays pueden contener, además de un compuesto, excipientes como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvos de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los sprays pueden además contener propelentes habituales, como clorofluorohidrocarbonos e hidrocarbonos volátiles no sustituidos, como butano y propano.

Los parches transdermales tienen la ventaja añadida de que proporcionan el envío controlado de un compuesto de la presente invención al cuerpo. Tales formas de dosis pueden realizarse disolviendo o dispersando los inhibidores de respuesta en el medio apropiado. Los procesadores de absorción pueden usarse para aumentar el flujo de inhibidores de respuesta a través de la piel. La tasa de tal flujo puede controlares bien proporcionando una membrana de control o bien dispersando el compuesto en una matriz polímera o gel.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral consta de uno o más compuestos de la invención en combinación con uno o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones o polvos estériles acuosos o no acuosos estériles, isotónicos y farmacéuticamente aceptables que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes del uso, que pueden contener antioxidantes, búferes, bacteriostatos, solutos que da la formulación isotónica con la sangre del recipiente o agentes de suspensión o de engrosamiento.

Ejemplos de portadores acuosos o no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas incluyen agua, etanol, polioles (como glicerol, glicol propileno, glicol polietileno, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables como oleato etil. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de materiales de revestivimiento, como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerida en el caso de dispersión, y por el uso de surfactantes.

Estas composiciones también pueden mantener adyuvantes como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersadores. La prevención de la acción de los microorganismos puede asegurarse mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antihongo, por ejemplo, parabeno, clorobutano, ácido fenol, y similares. También se puede desear incluir agentes isotónicos, como azúcares, cloruro sódico, y similares en la composición. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica aceptable puede ser provocada por la inclusión de agentes que retrasan la absorción como monoestearato de aluminio y gelatina.

En algunos casos, con el fin de prolongar el efecto de un fármaco, se desea ralentizar la absorción del fármaco de inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede llevar a cabo mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tiene poca solubilidad en agua. La tasa de absorción del fármaco dependerá entonces de su tasa de dilución que, a su vez, dependerá del tamaño del cristal o la forma del cristalino. De manera alternativa, la absorción retardada de una forma de droga administrada parenteralmente se lleva a cabo disolviendo o suspendiendo la droga en un medio de aceite.

Las formas inyectables de depósito se realizan formando matrices microencapsuladas de los compuestos en cuestión en polímeros biodegradables como polilactida-poliglicolida. Dependiendo del radio de fármaco al polímero, y la naturaleza del polímero particular empleado, la tasa de liberación de fármaco puede controlarse. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan encerrando el fármaco en liposomas o microemulsiones que sean compatibles con el tejido corporal.

Cuando los compuestos se administran como fármacos a humanos o animales, pueden darse solo o como un fármaco que contiene, por ejemplo, 0.1 a 99.5% (más preferentemente, 0.5 a 90%) de ingrediente activo en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

La adición del compuesto activo al alimento animal es preferentemente realizada preparando una premezcla de apropiado alimento conteniendo el compuesto activo en una cantidad efectiva e incorporando la premezcla en la ración completa.

De manera alternativa, un concentrado intermedio o suplemento alimenticio que contiene el ingrediente activo puede mezclarse en la comida. El modo en el que tal alimento se premezcla y se preparan y administran las raciones completas se describe en libros de referencia como "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman and Co, San Francisco, U.S.A 1969 o "Livestock Feed and Feeding" O and B books, Corvallis, Ore., U.S.A 1977.

V. Usos Ejemplares de los Compuestos de la Invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona el uso de un antagonista del un Grupo I mGluR, como un mGluR5, preferentemente mGluR5 humano, en la fabricación de un medicamento para uso en un método de tratamiento o prevención del Síndrome X Frágil y otras formas de retardo mental, o autismo. En varias realizaciones, la presente invención contempla modos de tratamiento y profilaxis que utilizan uno más de los antagonistas mGluR en cuestión.

Los mecanismos neuronales que producen retardo mental son prácticamente desconocidos. El descubrimiento de la base genética de algunas formas de retardo mental, como Síndrome X Frágil, ha facilitado que se llegue a comprender los mecanismos celulares responsables de los déficits cognitivos asociados con el retardo mental. El Síndrome X Frágil es la forma heredada más común de retardo mental, afectando a 1 de cada 1500 hombres y 1 de cada 2500 mujeres (de Vries, et al, 1993). La mayoría de los pacientes muestran muchos déficits neurológicos, incluyendo retardo mental de moderado a severo. (IQ=30-70), ataques durante la niñez, defectos visuales espaciales, dificultades de aprendizaje y características de autismo. A diferencia de otras formas de retardo mental, los pacientes de X Frágil no muestran grandes deformidades neuroanatómicas a pesar de que ascienden los déficits cognitivos (Hinton, et al., 1991; Winslewski, et al., 1991). En su lugar, existe una neuropatología a menor escala, al nivel de sinapsa. Las neuronas corticales de pacientes con síndrome X Frágil se caracterizan por la longitud dendrítica reducida y por un número de espinas irregulares, muy largas, finas y sinuosas y una reducción en espinas maduras, cortas y pequeñas y gruesas. Estas espinas largas y finas se parecen a espinas inmaduras o dendríticas prevalentes en neuronas desarrolladas durante la maduración de sinapsa (Fiala, et al., 1998). Patologías dendríticas similares se asocian a otras formas de retardo mental como Síndrome de Down o Rett (Marín-Padilla, 1972); Kaufmann and Moser, 2000). Por lo tanto, los malos funcionamientos del desarrollo o función dendrítica pueden ser un mecanismo común que caracteriza el retardo mental.

La base molecular del Síndrome X Frágil se descubrió cuando se observó que los pacientes del Síndrome X Frágil tienen una expansión en la 5' región no trasladada del gen del retardo mental frágil X (FMR1), que resulta del silenciamiento transcripcional (estudiado por Pieretti, et al., 1991; Verheij, et al., 1993). Como apoyo a esta hipótesis, un modelo ratón de síndrome X frágil fue desarrollado por un "noqueo" (KO) del gen FMR1 (Bakker and Consortium, 1994). Los ratones FMRI-KO tienen muchos de los síntomas el síndrome X frágil humano incluyendo los déficits de aprendizaje e hiperactividad (Fisco, et al., 1999; Paradee, et al., 1999).

Estudios de la función normal de FMRP han indicado que FMRP es un regulador de síntesis de proteína o traslación mARN. FMRP tiene 2 regiones de enlace ARN y se asocia con poliribosomas de traslación y un subconjunto de mARNs del cerebro. (Khandjian et al., 1996; Tamanini et al., 1996). Una forma muy rara pero severa de síndrome X frágil se causa por una simple mutación de aminoácido (I304N) en uno de los dominios de enlace ARN de FMRP. La severidad del fenotipo X frágil observado con la mutación I304N indica que el enlace ARN y asociación con poliribosomas es crucial para la función de FMRP (Siomi, et al., 1994). De manera interesante, ahora se conoce que los poliribosomas y FMRP están presentes en espinas dendríticas y las sinapsas tienen la habilidad de sintetizar la proteína sugiriendo que FMRP pueda funcionar específicamente para regular la síntesis de proteínas localmente en sinapsas (Steward and Reeves, 1988; Feng, et al, 1997).

En años recientes, un número de estudios han demostrado que los mecanismos de reforzamiento o debilitación sináptica dependiente de actividad, como potenciación a largo plazo (LTP) o depresión a largo plazo (LTD) respectivamente, contribuyen a la formación y maduración de sinapsa (estudiado por Collin et al, 1997; Constantine-Paton y Clime, 1998). Ambos LTP y LTD pueden reflejar un cambio en el nivel de densidad superficial de receptores neurotransmisores en la región sináptica de membranas neuronales. Por ejemplo, la expresión de superficie de receptor NMDA o receptor AMPA pueden reducirse en LTD o aumentar en LTD. Por lo tanto, una alteración en plasticidad sináptica dependiente de actividad durante la maduración de sinapsa puede ser una de las fuentes características de anormalidades espinales y fenotipo X Frágil. Además, modificaciones persistentes en el nivel de sinapsa puede que sean la base neuronal de aprendizaje y memoria en los adultos. La plasticidad dependiente de actividad alterada en cerebros maduros de pacientes afectados puede ser un factor en las deficiencias de aprendizaje comprobadas en síndrome X frágil.

El autismo es un desorden neurológico de incapacidad que afecta a cientos de americanos y comprende un número de subtipos, con varias causas putativas y escasos tratamientos paliativos documentados. Los desórdenes del espectro autístico pueden estar presentes en el nacimiento, o pueden tener posterior aparición, por ejemplo, a la edad de dos o tres años. No existen claros marcadores biológicos para el autismo. El diagnóstico del desorden se realiza considerando el grado al cual el niño alcanza el síndrome de comportamiento, que se caracteriza por déficits en sociabilidad, comunicación verbal y no verbal recíproca junto con comportamiento restringido, repetitivo y estereotípico.

Se sugiere una base genética para el autismo mediante observaciones como anomalías del desarrollo en pacientes autistas, incidencia aumentada de autismo en hermanos de pacientes autistas, y una tendencia para un conjunto de gemelos monocigóticos de ser ambos bien autista o no autista (también llamado "concordancia" para un desorden). Sin embargo, en la mayoría de los individuos autistas (75-80%), no se encuentra causa para el autismo. Estudios previos han implicado anormalidades que comprenden neurotransmisores incluyendo serotonina, norpinephrina, e histamina en algunos casos de autismo. Otros factores causantes pueden incluir rubéola, problemas durante el embarazo, parto y nacimiento, enfermedad de inclusión citomegálica, fenilquetonuria, y síndrome X frágil. Los niños autistas tienen también un riesgo elevado de desarrollar desórdenes de ataques, como epilepsia, especialmente durante su adolescencia.

Un número de diferentes tratamientos para autismo se han desarrollado. Muchos de los tratamientos, sin embargo, se dirigen a los síntomas de la enfermedad más que a las causas. Por ejemplo, las terapias que van desde psicoanálisis a la psicofarmacología se han empleado en el tratamiento del autismo. A pesar de que algunos síntomas clínicos se han minimizado mediante estos tratamientos, se ha demostrado una escasa mejoría en únicamente una pequeña parte de los casos. Sólo un pequeño porcentaje de personas autistas se vuelven capaces de funcionar como adultos autosuficientes.

El síndrome de Down, una causa grave de retardo mental congénito, es también el defecto humano de nacimiento más común. El síndrome de Down se da en uno de cada 800 recién nacidos, con incidencia ascendente en el bebé si la madre tiene más de 35 años. Afectando aproximadamente a un millón de americanos, es la causa genética principal de retardo mental y está asociada a una esperanza de vida más corta. Otros síntomas son defectos intestinales o del corazón, problemas con el sistema inmunológico y endocrino, y deformidades del tejido o esqueleto.

Más del 90 por ciento de individuos afectados por el síndrome de Down tiene un número extra de cromosoma 21 en todas sus células, dando cada célula un total de 47 cromosomas en lugar de 46, que es lo normal. Por este motivo, la condición es también conocida como "Trisomía 21". Trisomia 21 resulta de la falta de disyunción o fallo de cromosomas para separarse en algún momento durante la división de meiosis o mitosis. La mayoría de los individuos con síndrome de Down tienen trisomía 21, y a la inversa, en individuos que transportan una translocalización que implica el cromosoma 21, y en mosaicos que tienen células trisómicas y normales, se ven las características del síndrome. Sin embargo, existen raras formas de síndrome de Down en las cuales sólo parte del cromosoma 21 está presente por triplicado.

Ejemplificación

La invención que ahora se está describiendo a modo general, se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos que están incluidos meramente para fines de ilustración de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención, y no pretenden limitar la invención.

Ejemplo 1 Inducción Química de mGluR5 y Depresión a Largo Plazo Dependiente de Síntesis de Proteína en Área de Hipocampo CA1 a. Resumen

Trabajos recientes han demostrado que patrones específicos de estimulación sináptica pueden inducir depresión a largo plazo (LTD) en el área CA1 que depende de la activación de receptores de glutamato metabotrópicos (mGluRs) y la rápida síntesis de proteína. Aquí mostramos que la misma forma de modificación sináptica puede inducirse por aplicación breve del agonista selectivo mGluR (RS)-3,-5-dihidroxifenilglicina (DHPG). DHPG-LTD 1) es una forma saturable de plasticidad sináptica, 2) requiere mGluR5, 3) es mecánicamente distinta de receptor N-metil-D-aspartato (NMDAR)-dependiente LTD, y 4) comparte un mecanismo de expresión común con síntesis de proteína dependiente LTD evocada usando estimulación sinóptica. DHPG-LTD debería ser útil para análisis bioquímicos de mGluR5 y modificación sináptica dependiente de síntesis de proteína.

b. Introducción

Depresión a largo plazo homosináptica (LTD) es una forma comúnmente expresada de plasticidad sináptica en el cerebro. El tipo mejor entendido de LTD es inducido en el área hipocampal CA1 por estimulación de baja frecuencia sináptica (LSF) por medio de un N-metil-D-aspartato (NMDA) receptor-dependiente ascendiente en intracelular postsináptico Ca^{2+} y la activación de una cascada de fosfatasa de proteína (Bear and Abraham 1996). Baja las circunstancias apropiadas, la activación farmacológica de receptores NMDA (NMDARs) pueden también inducir este tipo de LTD. Esta visión "químico LTD" ha sido útil para la caracterización bioquímica del mecanismo, revelando, por ejemplo, que LTD dependiente de NMDAR está asociado con defosforilación de la subunidad GluR1 del ácido postsináptico \alpha-amino-3-hidroxi-5-metilo-4-isoxazolepropiónico (AMPA) (Lee et al. 1998).

Trabajos recientes han demostrado que los tipos mecánicamente distintos de LTD pueden también estar inducidos en CA1 por otros tipos de estimulaciones sinápticas. Por ejemplo, estimulación de pulso en pareja repetida a 1 Hz durante 15 minutos (PP-LFS) induce que LTD sea independiente de NMDARS y precise activación de receptores de glutamato metabotrópico (mGluRs) (Huber et al., 2000); Kemp and Bashir 1999). Esta forma dependiente de mGluR de LTD es particularmente interesante porque también precisa rápida traslación de mARN pre-existente (Huber et al. 2000). Una visión "química-LTD" podría ser particularmente útil para analizar este mecanismo nuevo. De hecho, informes de varios grupos indican que la activación pasajera del grupo I mGluR con el agonista selectivo (RS)-3-5-dihidroxifenilglicina (DHPG) puede inducir LTD (Camodeca et al., 1999; Fitzjohn et al. 1999; Huber et al., 2000; Palmer et al. 1997). Sin embargo, está claro que no todos los protocolos son equivalentes, por ejemplo, algunos son eficaces sólo bajo condiciones de bajo Mg^{2+} y parcialmente dependientes de NMDARs (Palmer et al. 1997; Schanbel et al. 1999).

Aquí caracterizamos un protocolo de inducción química que produce de manera segura LTD dependiente de síntesis de proteína (Huber et al. 2000). Demostramos que mGluR5 es necesario para inducción LTD y proporciona nuevas evidencias de que este LTD inducido químicamente comparte un mecanismo de expresión saturable con LTD inducido usando PP-LFS. Anticipamos que el método que aquí describimos será útil para entender cómo la activación de mGluR regula la traslación mARN y la expresón de LTD sináptico.

c. Métodos

Todos los animales se usaron de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Brown. Se prepararon fragmentos del hipocampo del día postnatal 21-30 (P21-30) ratas Long Evans (Charles River, Cambridge, MA), y ratones de noqueo mGluR5 (Lu et al. 1997) como se ha descrito previamente (Huber et al. 2000). Para la mayoría de los experimentos CA3 fue retirado inmediatamente después de seccionar. Los fragmentos se recuperaron durante 1-2 h a temperatura ambiente (ratas) o a 30°C (ratones) en fluido cerebroespinal artificial (ACSF) que contiene (en nM) 124 NaCl, 5 KCl, 1.25 NaH_{2}PO_{4}, 26 NaHCO_{3}, 1 MgCl_{2}, 2 CaCl_{2}, y 10 dextrosa, saturado con 95% O_{2} 5% CO_{2}. Para la grabación, los fragmentos se colocaron en una cámara de grabación de inmersión y se prefundieron con 30°C ACSF a una tasa de 2 ml/min.

Los potenciales de campo evocados sinápticamente (FPS) se grabaron del área CA1 como se ha descrito previamente (Huber et al. 2000). Se hicieron microelectrodos afilados y grabaciones de pinzas de voltaje de célula completa usando amplificadores Axoclamp 2B y Axopatch ID (Instrumentos Axon), respectivamente. Los electrodos afilados (8-120 MO) se rellenaron con 3 M K-acetato y 10 mM KCl; pipetas de refuerzo (3-7 M\Omega) se rellenaron con (en mM) 134 K-gluconato, 6 KCl, 4 NaCl, 10 HEPES, 0.2 EGTA, 4 MgATP, 0.3 TrisGTP, y 14 fosfocreatina. El pH de la solución interna se ajustó a 7.25 con KOH, y la osmolaridad se ajustó a 300 mOsm con H_{2}O o sacarosa. Sólo experimentos en los cuales hubo menos del 15% de cambio en resistencia de serie fueron incluidos en el análisis. Las formas de ondas se filtraron a 2 kHz y se obtuvieron y digitalizaron a 10 kHz en un PC usando el banco de trabajo del experto (DataWave System, Boulder, CO).

Las respuestas de línea base se recogieron cada 10-30 s usando una intensidad de simulación (10-30 \muA: 0-2 ms) 50-60% de la respuesta máxima. Experimentos en los cuales hubo un >5% de desviación en la magnitud de la respuesta durante el periodo de 20 min de línea base antes de DHPG y LFS fueron excluidos de análisis adicionales. Todos los experimentos con ratones KO mGluR5 usaron crías de tipo salvaje como controles y actuaron ciegas al genotipo, posteriormente determinado por Terrino (Troy, NY). LFS consistió en 900 pulsos da 1 Hz. PP-LFS consistió en 900 pares de estímulos (50-ms intervalo de interestímulos) enviados a 1 Hz. En experimentos de saturación, la duración del estímulo ascendió de 00.2 a 0.4 ms durante PP-LFS.

Los datos del grupo se analizaron del siguiente modo: 1) las inclinaciones iniciales de FPs y los potenciales post-sinápticos excitatorios (EPSPs), o la amplitud de las corrientes post-sinápticas excitatorias (EPSCs), para cada experimento se expresaron como porcentajes del precondicionamiento o promedio de línea base de DHPG, 2) la escala de tiempo en cada experimento se convirtió a tiempo desde la aparición o comienzo del condicionamiento o DHPG, y 3) el tiempo, datos normalizados fueron calculados de promedio a lo largo de experimentos y se expresaron en el texto y figuras como los medios \pm SE. Se determinaron diferencias significativas entre grupos usando un t-test independiente o ANOVA llevado a cabo en un promedio de 5-min 1 hora después de la aplicación LFS o DHPG.

R,S-DHPG y ácido D-2-amino-5-fosfonopentanoico (D-AP5) fue adquirido en Tocáis (St. Louis, MO); el resto de los elementos químicos fueron de Sigma Chemical (St. Louis, MO). DHPG se preparó como una reserva de 100 veces en H_{2}O, se alicuó y almacenó a -20°C. Se realizaron reservas una vez a la semana. Una reserva de 10 veces de AP5 se preparó en ACSF y se almacenó a 4°C. Estas reservas se diluyeron en ACsf para lograr sus concentraciones finales. Se disolvió picrotoxina directamente en ACSF inmediatamente antes del uso.

d. Resultados

La aplicación de DHPG durante 5 min produjo una depresión precisa y dependiente de dosis de FPs evocados (Figr. IA). A concentraciones \geq 50 \muM, el FP no se recuperó por completo después de que se extrajera el fármaco. Sin embargo, las respuestas sinápticas se estabilizaron a un nivel depresivo (50 \muM: 69 \pm 5%, medios \pm SE, de línea base pre-DHPG; n=11; 100 \muM:48 t 1%; n=4). En todos los estudios posteriores 50 \muM DHPG fue utilizado para inducir lo que nos referimos como DHPG-LTD. Aplicaciones de otro grupo I agonista mGluR, ácido quiscálico (5 min; 5 \muM), también resultó en LTD (81 \pm 2%; n=4), en el que sólo una entrada fue estimulada durante DHPG, indicando que DHPG-LTD no precisa estimulación sináptica concurrente (estimulado: 62 \pm 4%; no estimulado: 68 \pm 5%; P>0.2; Fig. 1B). DHPG-LTD también demostraron evidencia de saturación; dos aplicaciones de 50 \muM DHPG fueron suficientes para producir depresión máxima (Fig. 1C).

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Las grabaciones intracelulares confirmaron que DHPG-LTD de FPs refleja transmisión sináptica disminuida. Tanto microelectrodos afilados de EPSPs y grabaciones de pinzas de voltaje de célula completa de EPSPs (grabado a -70 mV) LTD revelado estable (EPSP: 61 \pm 5%; n=6; Fig. 1D; EPSC: 69 \pm 5%; Fig. 1E). Como contraste, no hubo cambios a largo plazo importantes en el potencial de membrana, resistencia de salida, o excitabilidad de membrana medida 1 h después DHPG (datos no mostrados). Por lo tanto, DHPG-LTD es una modificación duradera de transmisión sináptica.

El antagonista competitivo NMDAR AP5 (50 \muM) no tuvo efecto en la magnitud de DHPG-LTD en comparación con los fragmentos de control intercalados (AP5: 83 \pm 3%, n=5; control: 85 \pm 3%, n=4; P > 0.3; Fig. 2A). LTD inducido con 5 \muM ácido quiscálico fue también afectado por AP5 (79 \pm 2%, n=3). Por lo tanto, LTD inducido por activación farmacológica del grupo 1 mGluR bajo estas condiciones experimentales no requiere activación NMDAR concurrente.

Para evaluar la relación de mGluR5 en el área CA1 de neuronas piramidales (Romano et al. 1995), DHPG-LTD se intentó en ratones carentes de este receptor. DHPG-LTD estuvo ausente en los mutantes homocigóticos mGluR5 (98 \pm 3% medido 1 h después de la aplicación de DHPG; n=8; Fig. 2A). Una cantidad intermedia de LTD se observó en mutantes heterocigóticos (84 \pm 4%; n=6), en comparación con los controles de crías de tipo salvaje (77 \pm 2%; n=9, Fig. 2B). Un ANOVA de un solo sentido reveló un efecto significante de genotipo [F(2,19) = 10.33, P < 0.001]. Un test posterior Tukey reveló que los heterocigotos y los de tipo salvaje eran significadamente diferentes de los homocigotos (P < 0.025). A pesar de que una hay tendencia para DHPG-LTD en los heterocigotos para ser inferiores a los de tipo salvaje, no es significativa (P = 0.5). Por lo tanto, DHPG-LTD estrictamente se basa en mGluR5, y la presencia de un alelo GluR5 es suficiente para la inducción LTD. A diferencia de DHPG-LTD, LTD normal dependiente de NMDAR, inducido con LFS, se observó en mutantes homocigóticos (87 \pm 2%; n=6; P > 0.6; Fig. 2C) en comparación con los ratones de tipo salvaje (89 \pm 5%; n=6). Estos resultados de los noqueados mGluR5 indican que los mecanismos de inducción de LTD dependiente de NMDAR y DHPG-LTD son diferentes. El siguiente experimento fue diseñado para comprobar si estas dos formas de LTD utilizan mecanismos de expresión similares. Se enviaron repetidos episodios de LFS para saturar LTD dependiente de NMDAR (Fig. 3A). DHPG fue posteriormente aplicado, y la magnitud de LTD fue medida para renormalizar los valores de inclinación FP a una línea de base pre-DHPG. Si LTD dependiente de NMDAR y DHPG-LTD utiliza un mecanismo de expresión común, la saturación previa de LTD dependiente de NMDAR debería reducir u ocluir DHPG-LTD. Sin embargo, DHPG incluso disminuyó las respuestas sinápticas (81 \pm 5% de línea base pre-DHPG; n=5; P < 0.05; Fig. 3B), sugiriendo que LTD dependiente de NMDAR y DHPG-LTD usan distintos mecanismos de expresión.

La misma técnica se empleó para evaluar si DHPG-LTD emplea el mismo mecanismo de expresión saturable que el LTD dependiente mGluR evocado sinópticamente. PP-LFS en la presencia del antagonista NMDAR D-AP5 (50 \muM) se usó para saturar LTD dependiente mGluR, y DHPG (50 \muM) se aplicó posteriormente al fragmento (Fig. 3C). A diferencia con el experimento de oclusión previo, la aplicación de DHPG después de la saturación de LTD con PP-LFS no indujo más LTD (100 \pm 5% de línea de base pre-DHPG; n=5; P > 0.5; Fig. 3D). Estos resultados proporcionan claras pruebas de que mGluR-LTD inducido con DHPG y PP-LFS comparten mecanismos de expresión comunes.

e. Debate

Se ha introducido un número de diferentes protocolos par inducir LTD homosináptico en CA1 (Beretta y Cherubini 1998; Camodeca et al. 1999; Dudek and Bear 1992; Fitzjohn et al. 1999; Huber et al. 2000; Kemp and Bashir 1999; Oliet et al. 1997; Overstreet et al. 1997; Palmer et al. 1997). A pesar de que la relación ha sido sugerida para muchos de estos, la constelación de descubrimientos resulta confusa y no es completamente consistente con una única forma dependiente de mGluR de LTD. Por ejemplo, se ha documentado que la aplicación de 100 \muM DHPG durante 10 min en porciones del hipocampo en adultos provoca poco LTD a menos que la excitabilidad de la porción aumente retirando Mg^{2+} del medio extracelular (Palmer et al. 1997; Schnabel et al. 1999). El LTD resultante es parcialmente bloqueado por antagonistas NMDAR. Además, PP-LFS en la sección hipocampal del adulto puede aparentemente provocar LTD por medio de la activación del grupo 1 mGluRs o activación de receptores AMPA/kainato (Kemp and Bashir 1999). A diferencia de esto, demostramos recientemente que en ratas P21-30, ambos PP-LFS y DHPG (50 \muM, 5 min) induce LTD que es 1) independiente de activación NMDAR, 2) bloqueado por completo por antagonistas mGluR, y 3) dependiente de una fase pasajera de traslación mARN (Huber et al. 2000). Este último descubrimiento es de particular importancia, ya que este modelo mGluR-LTD debería ser útil para aclarar la regulación y función de síntesis de proteína dendrítica, que puede ser defectuosa en retardo mental X frágil (Jin and Warren 2000).

Debido a los efectos diversos de DHPG y PP-LFS, no se podía asumir que los descubrimientos previos bajo diferentes condiciones experimentales podrían aplicarse a nuestro modelo. Por lo tanto, era necesario caracterizar la forma de mGluR-LTD dependiente de síntesis de proteína. Aquí hemos demostrado que DHPG-LTD es una forma saturable de plasticidad sináptica, que precisa mGluR5, que es mecánicamente distinta de LTD dependiente de NMDAR y que, de modo importante, comparte un mecanismo de expresión saturable común con el LTD evocado usando PP-LFS. Debido a que DHPG-LTD no requiere estimulación sináptica concurrente, es una forma de "química-LTD" (Lee et al. 1998) que debería ser útil para estudios bioquímicos y biofísicos.

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f. Referencias

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Ejemplo 2 Intemalización de receptores de glutamato ionotrópicos en respuesta a la activación de mGluR a. Resumen

La activación del grupo 1 de receptores de glutamato ionotrópicos (mGluRs) estimula la síntesis de proteína dendrítica y depresión sináptica a largo plazo (LTD), pero no queda claro cómo están relacionados estos efectos. Aquí facilitamos evidencias de que una consecuencia de la activación en el hipocampo es la pérdida rápida de receptores AMPA y NMDA de sinapsas. Como mGluR-LTD, la expresión estable de este cambio requiere la síntesis de proteína. Estos datos sugieren que la expresión mGluR-LTD es al menos parcialmente postsináptica, y que una consecuencia funcional de síntesis de proteína dendrítica es la regulación del tráfico de receptor de glutamato.

b. Introducción

Dos formas mecánicamente distintas de depresión a largo plazo homosináptica (LTD) coexisten en el hipocampo. Inducción de una forma depende de la activación de receptores N-metilo-D-aspartato (NMDARs) y fosfatasas de proteína postsináptica, e inducción de la otra forma depende de la activación del grupo 1 postsináptico de receptores de glutamato metabotrópicso (mGluRs) y la traslación local de mARN^{1} dendrítico. Existe un fuerte apoyo por la idea de que LTD dependiente de NMDAR (NMDA-LTD) es una consecuencia de expresión sináptica reducida de receptores \alpha-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazola-4-propionato (AMPARs)^{2-7}. Se sabe menos sobre la expresión de LTD dependiente de mGluR (mGluR-LTD), a pesar de que se ha sugerido un mecanismo presináptico^{8-9}.

Hasta hace poco, el progreso sobre mGluR-LTD se ha visto obstaculizado por la falta de un protocolo de inducción sináptico fiables. Un método alternativo ha sido activar de manera pasajera un grupo 1 mGluRs con el agonista selectivo (R,S)-3,5-dihidroxifenilglicina (DHPG)^{10-13} En porciones del hipocampo, DHPG (50 \muM, 5 min) provocó que LTD requiera síntesis de proteína^{13}, y eso parece usar el mismo mecanismo de expresión saturable que mGluR-LTD evocado con actividad sináptica establecida^{14}. Por lo tanto, empleamos este protocolo de inducción química sobre neuronas del hipocampo en cultivo y en porciones para investigar la posibilidad de que mGluR-LTD se exprese como un cambio en la expresión del receptor de glutamato postsináptico.

c. Resultados 1) DHPG estimula la internalización de AMPARs

Para examinar el efecto de activación de mGluR sobre AMPARs expresado en la superficie de neuronas del hipocampo, usamos un protocolo de tinte inmunoquímico de tira ácida. Los receptores de superficie sobre neuronas del hipocampo cultivadas vivas fueron etiquetados con anticuerpos dirigidos contra la N-terminal extracelular de la subunidad GluR1. Las células fueron tratadas con DHPG (50 \muM, 5 min) o medio de control y, después de varios intervalos, los anticuerpos de superficie remanentes fueron retirados con un baño de ácido acético. Las neuronas se fijaron, y se realizó inmunocitoquímica bajo condiciones permeables de membrana para detectar anticuerpos enlazados para AMPARs internalizados. Todos los análisis se llevaron a cabo sin conocimiento experto de las condiciones de tratamiento.

La aplicación DHPG durante 5 minutos estimuló un aumento superior al doble en puntos internalizados GluR1 que se observó 15 minutos después del inicio del tratamiento (puntos por 10 \num de dendrita, control, 0.62 \pm 0.09, n=65 células; DHPG, 1-44 \pm 0.17, n=60 células; p < 0.0002) y persistió durante al menos 1 hora (control, 0.58 \pm 0.08, n=42 células; DHPG, 1.14 \pm 0.15, n=38 células; Fig. 4a y b). La internalización aumentada de GluR1 fue una consecuencia específica de activar grupo 1 mGluRs, como fue completamente bloqueado por el antagonista mGluR LY344545 (ref. 15; 100 \muM; control, 0.42 \pm 0.10, n=15; DHPG, 1.39 \pm 0.34, n=14; LY344545 solo, 0.32 \pm 0.08, n=13; DHPG + LY344545, 0.29 \pm 0.04, n=17; Fig. 4c). En contraste, el antagonista NMDAR ácido 2-amino-5-fosfonovalérico (APV, 50 \muM) no tuvo ningún efecto (control, 0.74 \pm 0.19, n=7; DHPG, 1-49 \pm 0.22, n=10; DHPG + APV, 1.51 \pm 0.3, n=10).

La expresión estable de mGluR-LTD requiere síntesis de proteína dendrítica^{13}. Descubrimos que el pretratamiento de cultivos con el inhibidor cicloheximida de traslación mARN (chx, 60 \muM, aplicado 15 min antes de DHPG) también inhibió de manera relevante el aumento inducido por DHPG en GluR1 internalizado medido a los 60 minutos (control, 0.85 \pm 0.14, n=24; DHPG, 1.5 \pm 0.27, n=20; DHPG + chx, 1.02 \pm 0.12, n=25, diferente de DHPG solo a p < 0.03, Fig. 4d). Un inhibidor de síntesis de proteína mecánicamente distinto, anisomicina, también bloqueó endocitosis estimulada por mGluR (información no mostrada). Ni cicloheximida ni anisomicina tuvieron un efecto relevante en los niveles de base de puntos internalizados (control + chx, 0.76 \pm 0.09, n=10, Fig. 4d).

2) AMPARs de superficie se pierden tras el tratamiento DHPG

Después determinamos si el aumento inducido por DHPG en AMPARs internalizados va acompañado por un descenso de red en los grupos de receptores expresados en superficie en sinapsas. A varios intervalos después del lavado de DHPG, las células se fijaron y la superficie GluR2 o GluR1 fueron etiquetadas con anticuerpos N-terminal sin permeabilización. Los cultivos fueron posteriormente permeabilizados, y las sinapsas se etiquetaron usando un anticuerpo contra el sinapsin I marcador presináptico o sinaptofisina enganchados al anticuerpo secundario apropiado. Bajo condiciones de control, la mayoría de las sinapsas fueron inmunoreactivas para grupos AMPAR (GluR2, 80.6 \pm 9.0%, n=10 células, 200 sinapsas, Fig. 5a-d; GluR1, 72.5 \pm 4.7%; n=15 células, 225 sinapsas; Fig. 5e y f).

El porcentaje de sinapsas con grupos AMPAR se redujo en gran medida mediante el tratamiento DHPG. Sólo 4.8 \pm 11% de sinapsas tenían superficie teñida para GluR2 (n=10 células, 200 sinapsas; p < 0.03) medido 1 horas después del tratamiento (Fig. 5g-i). Se obtuvieron resultados similares en experimentos adicionales con GluR1 (29.3 \pm 5.4% GluR1-sinapsas positivas 15 min. Después del tratamiento DHPG, n=14 células, 210 sinapsas; 20.0 \pm 12.0% GluR1-sinapsas positivas 60 min después del tratamiento DHPG, n=15 células, 224 sinapsas; Fig. 5j y k).

El pretratamiento de cultivos con cicloheximida (60 \muM, aplicado 15 min antes de DHPG) inhibió el descenso inducido por DHPG en grupos sinápticos GluR1 medido a los 60 minutos (sinapsas con GluR1, 55.7 \pm 5.1%, n=15 células, 225 sinapsas; p < 0.05 contra DHPG solo; Fig. 5k). Sin embargo, el número de GluR1-sinapsas positivas descendió 15 min después del inicio de DHPG en la presencia del inhibidor (sinapsas con GluR1, 37.8 \pm 3.8%, n=15 células, 225 sinapsas; Fig. 5j). Estos datos sugieren que la síntesis de proteína está involucrada en determinar el destino de receptores internalizados, pero no en la inicial endocitosis estimulada por la activación mGluR.

Para confirmar el efecto de la activación mGluR sobre superficie AMPARs usando una técnica alternativa, tratamos cultivos de alta densidad con DHPG (50 \muM, 5 min) o medio de control y los receptores de superficie fueron etiquetados con biotina 60 minutos más tarde. Los receptores con biotina fueron precipitados y el radio de superficie al total GluR1 fue determinado por análisis western blotting cuantitativo. Este análisis bioquímico confirmó que AMPARs de superficie se reducen por tratamiento DHPG a sólo 56.8 \pm 4.0% del valor en los cultivos de control (n=4 en cada grupo de tratamiento; p < 0.01; Fig. 6).

3) Aplicación DHPG reduce frecuencia mEPSC

Los experimentos inmunocitoquímicos y bioquímicas sugieren que el tratamiento DHPG tiene posibilidades de tener efecto significativo en la transmisión sináptica mediada por AMPAR en neuronas cultivadas. Para investigar esta posibilidad directamente, examinamos el efecto de DHPG en mEPSCs mediadas por AMPAR. Como se observó para otras manipulaciones que estimulan la internalización del receptor (por ejemplo, ver ref. 16), observamos un importante descenso en la frecuencia de mEPSCs. El intervalo de inter-evento fue 315% de línea base a 15 min después del tratamiento DHPG (n=11 células, p < 0.05) y 319% de línea base a 60 minutos (n=9, p < 0.002; Fig. 7).

Además del cambio en frecuencia, hubo también una tendencia hacia amplitud mEPSC atenuada a 15 (94.2% línea base; n=11 células) y 60 (92.2% línea base; n=9 células; Fig. 7) minutos después de DHPG, pero este efecto no consiguió significado estadístico. Considerándolo junto con los resultados de imagen y bioquímicos, la interpretación más sencilla de los datos mEPSC es que DHPG silencia una discreta población de sinapsas porque su complemento completo de AMPARs es internalizado.

4) NMDARs de superficie se pierden tras el tratamiento DHPG

La activación NMDAR ha demostrado estimular una pérdida de AMPARs sinápticos sin afectar NMDARs^{2}. Para determinar si la estimulación de mGluR afecta los grupos NMDAR, las células se trataron con DHPG, se fijaron y tiñeron con un anticuerpo N-terminal para la subunidad NR1 del NMDAR bajo condiciones impermeables. Las células fueron posteriormente permeabilizadas y las sinapsas se etiquetaron usando un anticuerpo contra sinapsina I. En neuronas de control, 67 \pm 4% de sinapsas (n=20 células, 300 sinapsas) puntos inmureactivos NR1 contenidos (Fig. 8a-d y g). Tras el tratamiento DHPG, el porcentaje de NR1-sinapsas positivas se redujo a 28 \pm 6% en 15 minutos (n=16 células, 240 sinapsas, p < 0.003) y 21 \pm 3% en 60 minutos (n=19 células, 285 sinapsas; Fig. 8e y g). Como fue el caso para AMPARs, el cambio en los grupos NR1 de superficie tras DHPG fue bastante atenuado a los 60 minutos cuando los cultivos fueron tratados con cicloheximida (42 \pm 5% NR1-etiquetado a los 60 min; n=20 células, 300 sinapsas; p < 0.05 contra DHPG solo, Fig. 8g).

La pérdida de NMDARs de sinapsas tras DHPG fue sorprendente. Para descartar la posibilidad de cambios no específicos en las neuronas post-sinápticas, controlamos cambios en la distribución de receptores GABA_{A} usando un anticuerpo contra el N-terminal de la subunidad \beta_{1}. A diferencia de sinaspsas con receptores de glutamato, DHPG no tuvo efecto en el porcentaje de puntos etiquetados de sinapsina con grupos GABA_{A} \beta_{1} (control, 11.8 \pm 4%, n=10 células, 150 sinapsas; 60 minutos después del tratamiento DHPG, 10.9 \pm 2%, n=10; datos no mostrados). Para corroborar la pérdida de NMDARs de superficie tras DHPG, los cultivos de alta densidad se trataron con DHPG (50 \muM, 5 min, n=5), DHPG + cicloheximida (60 \muM; n=4), o medio de control (n=5), y NMDARs de superficie fueron etiquetadas con biotina 60 minutos más tarde. Los receptores con biotina fueron precipitados y el radio de superficie al total NR1 fue determinado por análisis western blotting cuantitativo (Fig. 8h e i). Este análisis bioquímico confirmó que NMDARs de superficie se reducen bastante por tratamiento DHPG a 32.3 \pm 14.5% de control; Fig. 8i).

5) LTD de NMDAR-EPSCs

La pérdida de grupos NR1 sináptico claramente distingue el efecto de DHPG de otros tratamientos que afectan de manera selectiva AMPARs^{2, \ 17-19}. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que además de la depresión de transmisión sináptica mediada por AMPAR, inducción de mGluR-LTD debería también afectar la transmisión mediada por NMDARs. Para verificar esta hipótesis, químicamente inducimos LTD en porciones del hipocampo de ratas de días 21-28 post-natales (P21-28) con DHPG^{14} cuando controlamos corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) mediadas por NMDAR en neuronas CA1 de voltaje a +40 mV, como se ha descrito previamente^{20}. Estos experimentos revelaron que la aplicación de DHPG (5 min) produjo LTD dependiente de dosis de NMDAR-EPSCs (EPSC amplitud 30 minutos después del tratamiento DHPG como porcentaje de línea base, 50 \muM, 70.7 \pm 2.9, n=3, p < 0.05; 100 \muM ; 57.7 \pm 1.0, n=5; diferente de línea base a p < 0.00005, t-test en pareja; Fig. 9a).

Como un test adicional para una pérdida inducida por mGluR de función NMDAR, examinamos los efectos de 100 \muM DHPG (5 min) en corrientes evocadas por NMDA aplicadas cerca de la parte próxima de la dendrita apical primaria (Fig. 9b). Se dio una significante depresión de corrientes NMDAR (línea de base de porcentaje a 50-60 min después del tratamiento DHPG, 61.1 \pm 12.0, n=7; control, 97.3 \pm 9.4; n=7; p < 0.05); sin embargo, el curso de tiempo de este cambio fue mucho más lento que el observado para EPSCs evocados sinápticamente. A diferencia de EPSCs, que fue en depresión inmediatamente, las corrientes evocadas por NMDA pasajeramente potenciadas (como se describió previamente con el agonista ácido 1-amino-ciclopentano-1,3 dicarboxilico (ACPD)^{10, \ 21}) y después ascendió lentamente a lo largo del curso de una hora. El primero LTD de EPSCs pudo contarse por un mecanismo presináptico o por la dispersión rápida de NMDARs (sin internalización inmediata). La migración de NMDARs dentro de la membrana ha sido demostrada tanto en células cultivadas^{22} como en porciones^{23}. A pesar de las consecuencias tempranas, sin embargo, la depresión paralela de respuestas evocadas por NMDAR EPSCs y NMDA 60 minutos después del tratamiento DHPG es consistente con una reducción eventual en expresión de superficie NMDAR durante mGluR-LTD.

d. Debate

Nuestros datos demuestran que la activación del grupo 1 mGluRs en neuronas del hipocampo cultivadas estimula la internalización de receptores sinápticos AMPA y NMDA, y que la expresión estable de estos cambios es sensible para los inhibidores de síntesis de proteína. El mismo tratamiento DHPG (50 \muM, 5 min) en porciones del hipocampo estimula mGluR-LTD que depende de traslación^{13} mARN postsináptica y, como ahora demostramos, se expresa como un cambio en NMDAR así como transmisión mediada por AMPAR. Por lo tanto, la retirada de receptores de glutamato sinápticos es un mecanismo candidato para la expresión de mGluR-LTD en el hipocampo. Esta noción es consistente con el descubrimiento de que LTD del cerebelo, que es también provocado por la activación del grupo 1 mGluRs, requiere endocitosis postsináptica de AMPARs^{24}.

MGluR1-LTD del hipocampo se mostró previamente como asociado a una frecuencia reducida de respuestas postsinápticas 412987as y espontáneas que, de acuerdo con suposiciones tradicionales de análisis cuántico, sugirió un mecanismo de expresión presináptico^{8, \ 9}. Sin embargo, estos datos también son consistentes con el "silencio sináptico", que surge de la pérdida total4l de receptores en una sinapsa activada^{16, \ 17, \ 25}.

Similar a lo que observamos tras la activación mGluR, NMDA-LTD se asocia con una expresión reducida de AMPARs postsinápticos (y una frecuencia disminuida de corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas^{2}). En principios, dos rutas de inducción LTD podían converger en un mecanismo de expresión saturable común en las mismas sinapsas; sin embargo, esta hipótesis no concuerda con el descubrimiento de que mGluR-LTD y NMDA-LTD no son mutualmente ocluyentes^{9, \ 14} Una alternativa es que mGluRs y NMDARs regulan poblaciones separadas de AMPARs, quizás en poblaciones distintas de sinapsas.

Varios estudios previos sugirieron que NMDARs sinápticos son relativamente estáticos en comparación con
AMPARs^{4, \ 19, \ 27}. Sin embargo, creemos que NMDARs y AMPARs se internalizan con un curso de tiempo similar (<15 min) tras el tratamiento DHPG. Endocitosis rápida de NMDARs también se ha demostrado en cultivos de corteza inmadura bajo condiciones elementales^{28}. Esta internalización de receptor se inhibió por el enlace de la proteína de densidad postsináptica PSD95 a la C-terminal de la subunidad NR2B. Por lo tanto, un mecanismo potencial para endocitosis NMDAR estimulada por DHPG pudo incluir regulación de interacción de PSD95 y NR2B.

Además de la relevancia obvia para mGluR-LTD del hipocampo, sugerimos que nuestros descubrimientos podían ser de importancia adicional. En primer lugar, demostramos un único papel para la síntesis de proteína que, considerándolo con los descubrimientos previos^{13, \ 26, \ 29}, tiene posibilidades de ocurrir en la neurona postsináptica como una consecuencia específica de actividad sináptica. Usando el tráfico de receptores de glutamato como un ensayo, esta preparación debería ser útil para diseccionar los mecanismos moleculares que unen con la activación mGluR con la regulación de traslación mARN dendrítica. En segundo lugar, la pérdida de receptores ionotrópicos en neuronas del hipocampo tras DHPG recuerda lo que sucede en la sección neuromuscular antes de la eliminación de sinapsa, y grupo 1 mGluRs han sido implicados recientemente en la pérdida de sinapsas de fibra en ascenso en el cerebelo^{31} en desarrollo. Por lo tanto, el modelo que describimos debería ser útil para testar la hipótesis vigente desde hace tiempo de que mGluRs y el mecanismo LTD están implicados en eliminación de sinapsa dependiente de actividad en la corteza cerebral^{32, \ 33}.

e. Métodos 1) Protocolo inmunoquímico de tira ácida

Cultivos de baja densidad de neuronas del hipocampo de ratas se realizaron como se ha descrito previamente^{34}. Todas las ratas se colocaron o almacenaron en el Centro de Cuidado Animal de la Universidad de Brown y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado Animal de la Universidad de Brown. En resumen, se retiró el hipocampo de los fetos de ratas E18, se tripsinizaron (0.25%), desasociaron por trituración, y se colocaron en placas en poli-L-lisina (1 mg/ml) en cubreobjetos de cristal cubiertos (80,000 células (ml) durante 4 horas. Los cubreobjetos fueron posteriormente transferidos a platos que contenían una monocapa de células gliales en medio de crecimiento y se dejó que las neuronas maduraran durante 14-22 días. AMPARs de superficie se etiquetaron en células vivas con un anticuerpo dirigido contra la N-terminal extracelular de la subunidad GluR1 (aminoácidos 271-285; 5 \mug por ml; Investigación Oncogenética, San Diego, California, y una cesión de R. Huganir). Las neuronas fueron posteriormente tratadas con un agonista específico del grupo 1 mGluRs DHPG, 50 \muM en medio) o medio de control durante 5 min. Diez o quince minutos después del tratamiento, las células se enfriaron en salina Tris-búfer (TBS) a 4°C para frenar endocitosis, y después se expusieron a 0.5 M NaCl/0.2 M ácido acético (pH 3.5) durante 4 min en hielo para retirar el anticuerpo unido al GluR1 extracelular. Los cultivos se enjuagaron y fijaron en 4% paraformaldehído con 4% de sacarosa. El teñido no específico fue bloqueado y las células se permeabilizaron en TBS que contenía 0.01% Triton-X, 4% suero de cabra y 2% BSA. El anticuerpo primario internalizado se hizo visible por incubación con un anticuerpo secundario etiquetado Cy3 durante 1 hora (1:300). En los estudios iniciales, los tratamientos incluían 1 \muM tetrodotoxina y 1 \muM \omega-conotoxina para limitar el escape neurotransmisor inducido por depolarización. Más tarde encontramos que se obtenían idénticos resultados sin \omega-conotoxina, por lo que, como consecuencia, este tratamiento fue omitido.

2) Localización inmunocitoquímica de receptores sinápticos

Tras el tratamiento sináptico, cultivos de baja densidad se fijaron en 4% de paraformaldehído con 4% de sacarosa durante 5 minutos. Los cultivos se enjuagaron en PBS y después se bloquearon en PBS con 29% de suero fetal bovino durante 1 hora. Los cultivos se tiñeron con anticuerpos de receptor N-terminal durante toda la noche a 4°C (GluR2, 1:100, Chemicon, Ternecula, California; GluR1 1:100, cesión de R. Huganir, NR1, 1:500, Chemicon MAB363; GABA_{A}\beta_{1}, 1:100 Santa Cruz Biologicals, Santa Cruz, California). Los cultivos fueron posteriormente enjuagados en búfer de bloqueo que contenía 0.1% Triton-X durante 20 minutos y se expuso a anticuerpos dirigidos contra proteínas presináptcias (sinapsina 1, 1:100, Chemico; sinaptofisina, 1:100, Boehringer Manheim, Irvine, California) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los cultivos fueron posteriormente enjuagados y se expusieron a los anticuerpos secundarios fluorescentes apropiados (Jackson Immunoreserach, West Grove, Pennsylvania).

3) Análisis de información inmunocitoquímica

La microscopia se llevó a cabo con un microscopio Nikon E800 usando un objetivo 60 x 1-4 NA (Melvilla, New York). Las imágenes fluorescentes se recogieron con un cámara Sensys de CCD enfriado y se analizaron usando software IP-Labs. Se recogieron imágenes adicionales con un microscopia confocal Olympus Flowview con un objetivo 60 x 1.2 NA. Todos los análisis se llevaron a cabo para el historial de estimulación del cultivo. Los campos microscópicos tenían 1-3 neuronas que representan soma homogéneo y generalmente morfología saludable con múltiples procesos distintos. La inmunofluorescencia se analizó a lo largo de los próximos 50 \mum de 3 o más dendritas con intensidad de fluorescencia dos veces el tinte del fondo de la neurona. Se analizaron cinco células para cultivo y 3-6 cultivos se analizaron por condición. Se llevaron a cabo controles separados con cada experimento y se empleó un t-tes de Estudiantes para determinar la importancia estadística. Los datos se expresaron como puntos por 10 \mum de dendrita a menos que se establezca de otro modo.

4) Medidas bioquímicas de receptores expresados de superficie

Se llevaron a cabo experimentos bioquímicos como se ha descrito previamente^{35}. En resumen, neuronas del hipocampo de 2 semanas de edad cultivadas a alta densidad se trataron con medio de control o 50 \muM DHPG durante 5 minutos, y se incubaron durante 1 hora a 37°C para permitir que ocurra endocitosis. Los cultivos hermanos fueron colocado en hielo para frenar endocitosis y se lavaron dos veces con fluido cerebroespinal artificial de hielo (ACSF) que contenía 124 nM NaCl, 5 nM KCl, 1.25 mM NaH_{2}PO_{4}, 26 mM NaHCO_{3}, 0.8 Mm MgCl_{2}, 1.8 mM CaCl_{2}, 10 mM dextrosa, y saturado con 95% O_{2} 5% CO_{2}. Los cultivos fueron posteriormente incubados con ACSF que contenía 1 mg/ml Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois) durante 30 min en hielo. Los cultivos se enjuagaron con TSB para eliminar la reacción de biotina. Los cultivos se colocaron en 300 \mul de búfer RIPA modificado (1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% ácido deoxicólico, 50 nM NaPO_{4}, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF, 10 mM pirofosfato sódico, 1 mM ortovanadato sódico, 1 mM PMSF, y 1 mg/ml leupeptina). Los homogenados se centrifugaron a 14,000x g durante 15 min a 4°C. Se retiraron quince microlitros (5%) de lo sobrenadante para medir total de mGluR1 o NR1; 200 \mul (66.67%) del sobrenadante remanente se incubó con 100 \mul de 50% azarosa Neutravidin (Pierce Chemical Company) durante 3 h a 4°C, se lavó 3 veces con búfer RIPA, y las proteínas unidas se suspendieron en 40 \mul de búfer muestra SDS y se coció. Se llevaron a cabo análisis cuantitativos Western Blot en el total en las proteínas biotinilazadas (superficie) usando anticuerpos anti-GluR1 C-terminal (1:1000, Upstate Biotechnology, Lake Placid, New Cork) y anticuerpos anti-GluR N-terminal (1:1000, Chemicon). Las bandas inmunoreactivas se visualizaron por quimiluminiscencia mejorada (ECL, Amersham, Piscataway, New Jersey) capturada en rollo de autoradiografía (Amersham Hyperfilm ECL). Las imágenes digitales, producidas por escáneres densiotométricos de autorradigrafías en un ScanJet Ilcx (Hewlett Packard, Palo Alto, California) con software DeskScan II (Hewlett Packard), se cuantificaron usando software NIH Imagen 1.6. El radio total/de superficie se calculó para cada cultivo, y los grupos de tratamiento se compararon un t-tes emparejado. Los experimentos de control confirmaron que la actina de proteína intracelular no fue biotinilazada en este ensayo. Para fines de exposición, los datos se expresan como el radio de DHPG a los valores de control.

5) Grabaciones mEPSC y análisis

Las células de hipocampo cultivadas a temperatura ambiente se unieron en 1 ml/min en medio consistente en 140 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 20 mM glucosa, 1.8 mM CaCl_{2}, 0.8 mM MgCl_{2}, 0.05 mM picrotoxina, 0.0001 mM TTX, y pH se ajustó a 7.4 con NaOH. Los electrodos de parche (4-5 m\Omegae)) se rellenaron con 116 mM Kgluconato, 6 mM KCl, 20 mM HEPES, 0.5 mM EGTA, 2 mM NaCl, 4 mM Mg-ATP, 0.3 mM Na-GTP, 10 mM fosfocreatina de sodio, se ajustó a pH 7.3 y osmolaridad \approx300 mM. Las células fueron sometidas a pinza de voltaje de 60 mV (junto al potencial de la membrana en descanso de las células), y mEPSCs se amplificaron usando el amplificador Axopatch 1D. Los registros se filtraron a 2 kHz, digitalizaron a 10 kHz, y se almacenaron en un ordenador mediante el uso de Experimenter's Workbench (Data Wave Systems, Boulder, Colorado) en cinta de video. Las resistencias de serie y de salida se controlaron a lo largo del experimento y sólo aquellas células estables (<15% cambio) en estos parámetros se incluyeron en el análisis. La resistencia media de salida fue \approx600 M\Omega y la resistencia media de serie fue \approx15 M\Omega. Los hechos se detectaron fuera de línea usando un programa de detección automática (MiniAnalysis, Synaptosoft, Decatur, Georgia) con un conjunto de umbral de detección en un valor mayor que al menos dos desviaciones estándar de los valores de ruido. El umbral de detección se mantuvo constante durante la duración de cada experimento. Sólo los hechos con un tiempo de ascenso monotónico y descenso exponencial se incluyeron en el análisis. El intervalo inter-evento y amplitud mEPSC se compararon durante periodo de línea base de 10 min y en ventanas de 10 min 15 y 60 minutos después de la aplicación de 50 \muM DHPG durante 5 minutos. Debido a la distribución anormal de parámetros mEPSC, las estadísticas se llevaron a cabo usando tests de categorías señalizadas Wilcoxon y el significado se situó en p < 0.05.

6) Fisiología de porción de hipocampo

Las porciones de hipocampo se prepararon de ratas P21-30 Long Evans (Charles River, Cambridge, Massachutsetts) como se ha descrito previamente^{13, \ 14}. Las porciones se recuperaron a temperatura ambiente durante 1-2 h en fluido cerebroespinal artificial que contenía 124 nM NaCl, 5 mM KCl, 1.25 nM NaH_{2}PO_{4}, 26 mM NaHCO_{3}, 1 mM MgCl_{2}, 2 mM CaCl_{2} 10 mM dextrosa, saturado con 95% O_{2}, 5% CO_{2}. Para la grabación, las porciones se colocaron en una cámara de grabación sumergida y se unieron con ACSF 30°C en una tasa de 2 ml/min.

EPSCs mediados por NMDAR evocados sinápticamente se grabaron desde el área CA1 como se ha descrito previamente para la corteza visual^{20}. Corrientes evocadas por NMDA se examinaron por NMDA 1 mM (hecho en ACSF), se aplicó durante 3.5-12.5 ms, junto a la porción próxima a la dendrita apical descrita. Las corrientes evocadas por NMDA fueron provocadas una vez cada dos minutos. La intensidad de estimulación o duración/presión de pulso psicoprizt se ajustaron para provocar una corriente interna con amplitud de 50 pA o mayor.

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Equivalentes

Aquellos expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar o establecer mediante la experimentación habitual, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención aquí descrita. Tales equivalentes pretenden estar abarcados en las siguientes reivindicaciones.

Claims (12)

1. El uso de un Grupo I mGluR antagonista para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que tiene al menos una condición seleccionada del grupo consistente en síndrome X frágil, autismo y retardo mental.

2. El uso de acuerdo a la reivindicación 1, donde el Grupo I mGluR antagonista tiene un ED50 para antagonismo de un receptor de Grupo I al menos 10 veces inferior que el ED50 para antagonismo de receptor de un Grupo II o Grupo III.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el antagonista mGluR es un antagonista mGluR5.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 donde el Grupo I mGluR antagonista tiene al menos un ED50 para antagonismo mGluR5 al menos 10 veces inferior que el ED50 para antagonismo mGluR1.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el Grupo I mGluR antagonista tiene un ED50 para antagonismo de receptores de glutamato ionotrópicos.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el Grupo I mGluR antagonista se enlaza con un receptor mGluR o una proteína intracelular G incluida en la trasducción de señal de receptor mGluR.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el Grupo I mGluR antagonista se selecciona de (E)-6-metilo-2-estiril-piridina (SIB 1893), 6-metilo-2-(fenilazo)-3-piridinol, a-metilo-4-carboxifenilglicina (MCPG), 2-metilo-6-(feniletinilo)-piridina (MPEP).

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el Grupo I mGluR antagonista se administra en una dosis que varía entre 10 y 1000 mg/kg cuerpo peso/día.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el Grupo I mGluR antagonista tiene un ED50 de 1 \muM o menos; opcionalmente siendo 100 nM o menos.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el Grupo I mGluR antagonista tiene un índice terapéutico (TI) de 10 o mayor; opcionalmente siendo 100 o más.

11. El uso de la reivindicación 1, donde el sujeto es un humano.

12. El uso de la reivindicación 1, donde el antagonista mGluR es un antagonista mGluR1.