ES2272496T3

ES2272496T3 - Procedimiento de deshidratacion/rehidritacion para la preparacion de lipososmas.

Info

Publication number: ES2272496T3
Application number: ES01948934T
Authority: ES
Inventors: Brahim Lipoxen Technologies Limited Zadi
Original assignee: Lipoxen Technologies Ltd
Current assignee: Lipoxen Technologies Ltd
Priority date: 2000-02-04
Filing date: 2001-01-31
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2021-01-31
Also published as: EP1259225B1; DE60123583D1; WO2001056548A2; WO2001056548A3; US20030138481A1; JP4786105B2; JP2003521508A; ATE341310T1; AU2869901A; EP1259225A2; US7025988B2; DE60123583T2

Abstract

Procedimiento para la formación de liposomas que comprende las etapas siguientes: mezclar una suspensión acuosa de liposomas vacíos preformados formados por compuestos formadores de liposomas con ingrediente activo lipófilo en partículas; - deshidratar la suspensión acuosa que contiene liposomas vacíos, partículas activas y azúcar disuelto; y - rehidratar el producto deshidratado en un medio de rehidratación acuoso para formar vesículas de deshidratación/rehidratación (DRV).

Description

Procedimiento de deshidratación/rehidratación para la preparación de liposomas.

La presente invención se refiere a procedimientos para la formación de liposomas. En particular la invención se refiere a procedimientos para la formación de liposomas que contienen ingredientes activos que son lipófilos, de especial utilidad para la formulación de paclitaxel y análogos y derivados del mismo.

El paclitaxel es un agente antimicrotubular que ha presentado actividad clínica prometedora contra una amplia variedad de tumores, incluyendo los de ovario, mama y pulmón, así como melanomas y linfomas. Se ha descrito asimismo que los derivados de paclitaxel presentan propiedades análogas. El paclitaxel puede aislarse de su fuente natural (tejos) o producirse por síntesis.

El paclitaxel presenta una solubilidad muy baja en los vehículos acuosos convencionales. La única preparación aprobada para su utilización clínica consiste en una solución en el vehículo Cremophor EL que es una mezcla 50:50 de etanol y aceite de ricino etoxilado. La mezcla paclitaxel/Cremophor se diluye antes de ser infundida. Un problema consiste en que la mezcla diluida es inestable y el paclitaxel tiende a precipitar, requiriendo la utilización de un filtro en línea y produciendo pérdida de principio activo. Además el vehículo orgánico produce efectos secundarios tóxicos incluyendo una anafilaxia y dolor en el punto de inyección. Las pruebas en ratones indican una dosis baja tolerable máxima.

Se han ideado varias maneras de mejorar la dispersabilidad del paclitaxel en vehículos acuosos. Los derivados del fosfato con mejor solubilidad han sido preparados por Ueda, Y. et al. en Bioorg. Med. Chem. Lett. 3(1993), 1761-66 y Vyas, D. M. et al. en Bioorg. Med. Chem. Lett. 3(1993) 1357-60. Takahashi, T. et al. en Bioorg. Med. Chem. Lett. 8 (1998) 113-116 han sialilado el paclitaxel para hacerlo más soluble. Sharma, U. S. et al. en J. Pharm. Sci. 84(10) (1995) 1123-30 lo han acomplejado con ciclodextrinas. Matthew, A. E. et al. en J. Med. Chem. 35(1992) 145-151 y Deutsch, H. en J. Med. Chem. 32(1989) 788-792 han descrito otros profármacos de Taxol.

El paclitaxel se ha encapsulado asimismo en liposomas. Rahman, A. et al. en las patentes US nº 5.424.073, US nº 5.648.090 y (como Cabanes, A. et al.) en Int. J. Onc. 12 (1998) 1035-40 describen un procedimiento en el que el paclitaxel y los liposomas que forman los materiales se disuelven conjuntamente en el disolvente orgánico, se evapora el disolvente para dejar una película delgada seca de lípido en el fármaco y los liposomas formados por la acción de medio acuoso con agitación y posterior tratamiento con ultrasonidos para formar pequeñas vesículas unilaminares (SUV). Rahman et al. describen además la incorporación de trehalosa en la solución salina utilizada para hidratar la película final del lípido y fármaco. Las suspensiones de liposomas se almacenan a continuación congelándose a -80ºC (sin secarse aparentemente). La mezcla de liposomas congelados que contiene azúcar se descongela y se vuelve a congelar y se demuestra que es estable al almacenamiento durante varios meses. La relación en masa de azúcar:lípido parece que es de aproximadamente 10-15:1.

Sharma, A. et al. en Pharm. Res. 11 (6) (1994) 889-896 describen la encapsulación de paclitaxel (taxol) en liposomas formados a partir de mezclas de fosfolípidos que tienen una carga aniónica global. Los lípidos están constituidos por mezclas de fosfatidilcolina y fosfatidilglicerol en varias relaciones molares. Los liposomas se forman disolviendo conjuntamente paclitaxel y lípido en disolvente orgánico, formando una película delgada de la mezcla, redisolviéndose en butanol, congelándose, a continuación rehidratando en medio de rehidratación acuoso. La incorporación de fosfolípido con carga negativa se dice que reduce la agregación, y los liposomas eran físicamente estables durante más de dos meses y medio en estado hidratado, con la condición de que el contenido en paclitaxel no sea superior a 2% molar (sobre la base del contenido en lípidos totales). Los autores indican que la precipitación del fármaco en la etapa de disolución del disolvente orgánico produjo inestabilidad y debería evitarse.

Bernsdorff C. en J. Biomed. Mater. Res. 46 141-149 (1999) describen varias investigaciones del efecto sobre las bicapas de liposomas de paclitaxel. El fármaco parece afectar la fluidez de la bicapa.

En el documento US-A-5683715 los liposomas que comprenden un taxano comprenden, como lípido, esencialmente sólo fosfatidilcolina. Ejemplos de fosfatidilcolinas son dioleil, palmitoiloleil, o fosfatidilcolina de huevo. Los liposomas pueden proporcionarse en forma deshidratada con azúcares protectores en las superficies interna y externa de la bicapa. Los procedimientos generales descritos para formar liposomas no indican cómo el taxano debe incorporarse en los liposomas. En los ejemplos analizados, el paclitaxel se disuelve conjuntamente con el lípido en cloroformo o cloruro de metileno. A la solución mezclada se añade tampón acuoso seguido de eliminación del disolvente para formar vesículas multilaminares (MLV). El tratamiento con ultrasonidos, para formar vesículas más pequeñas produjo la precipitación de paclitaxel. Ninguno de los ejemplos liofiliza las composiciones liposómicas y no hay ninguna descripción de cómo incorporar el crioprotector.

En el documento US-A-5653998, el paclitaxel y otros compuestos insolubles en agua se forman en el interior de las composiciones liposómicas que contienen pocas cadenas de ácidos grasos como estabilizantes frente a la floculación. Pueden añadirse azúcares como crioprotectores. Las formulaciones se forman dispersando el lípido y taxol directamente en agua utilizando procedimientos de mezclado con alta energía, seguidos de filtración y homogeneización a alta presión. Una vez se ha encapsulado aparentemente el principio activo, puede añadirse un azúcar antes de la liofilización para crioprotección. La liofilización no cambia el tamaño de los liposomas.

En el documento WO-A-87/01933, la anfotericina B, que es un principio activo lipófilo, se forma dentro de las composiciones liposómicas. En un procedimiento, el principio activo, el azúcar y el lípido se disuelven todos conjuntamente en una solución alcohólica, que se seca a continuación se hidrata en tampón y a continuación se liofiliza y rehidrata.

En el documento WO-A-99/65465 se describen procedimientos de preparación de liposomas por una técnica de deshidratación/rehidratación. Se utiliza una solución de lípido en un disolvente orgánico para recubrir la superficie interna de un recipiente adecuado y el secado para formar una película delgada. La adición de un líquido que forma liposomas acuosos produce la formación de liposomas multilaminares que se someten a una etapa de control de tamaño para formar pequeñas vesículas unilaminares (SUV). El ingrediente activo puede disolverse conjuntamente con el lípido en el disolvente orgánico, puede estar presente en el líquido que forma liposomas o puede mezclarse con las SUV preformadas. La suspensión de liposomas que contiene el ingrediente activo se deshidrata posteriormente, por secado por nebulización o, con más frecuencia, por secado por congelación (liofilización). La mezcla seca se rehidrata posteriormente en un medio de rehidratación acuoso para formar vesículas de deshidratación/rehidratación (DRV). La invención en el documento WO-A-9965465 sirve para incorporar azúcar en la suspensión de liposomas antes de la etapa de deshidratación para aumentar el nivel de oclusión de los ingredientes activos hidrófilos.

Merisko-Liversidge, E. et al. en Pharm. Res. 13(2) (1996) 272-278 describen procedimientos alternativos para los fármacos lipófilos en suspensión en medios de suspensión acuosos. Ejemplos de fármacos lipófilos son paclitaxel, campotecina, etopósido y piposulfán. Los ingredientes activos se muelen en húmedo en suspensión acuosa que contiene estabilizante que es un tensioactivo no iónico. El tamaño de partícula final fue inferior a 400 nm.

Según la presente invención se proporciona un procedimiento para la formación de liposomas que comprende las etapas siguientes:

-: mezclar una suspensión acuosa de liposomas vacíos preformados formados por compuestos formadores de liposomas con ingrediente activo lipófilo en partículas;

-: deshidratar la suspensión acuosa que contiene liposomas vacíos, partículas activas y azúcar disuelto; y

-: rehidratar el producto deshidratado en un medio de rehidratación acuoso para formar las vesículas de deshidratación/rehidratación (DRV).

El producto deshidratado se vuelve a hidratar antes de su utilización como parte de una etapa de preparación o como parte de una formulación para el médico especialista.

El producto deshidratado se vuelve a hidratar en un medio de rehidratación acuoso para formar vesículas de deshidratación/rehidratación (DRV). El medio de rehidratación comprende generalmente un medio acuoso farmacéuticamente aceptable, por ejemplo agua.

Después de la etapa de rehidratación, las DRV pueden someterse a una o más etapas de control del tamaño. Las DRV en el medio de rehidratación pueden someterse a mezclado físico, tratamiento con ultrasonidos u homogeneización. Sin embargo una ventaja de la presente invención consiste en que la incorporación de azúcar en la etapa de rehidratación produce la formación de las DRV que tienen tamaños que las hacen adecuadas para su administración como producto farmacéutico sin más etapas de control de tamaño. Preferentemente el producto final, ya sea de la etapa de rehidratación o de las etapas ulteriores de control de tamaño, presenta un diámetro medio inferior a 1.000 nm, preferentemente sustancialmente todas las vesículas que tienen tamaños inferiores a 1.500 nm. Más preferentemente el diámetro medio es inferior a 500 nm.

En la presente invención, la relación en peso de azúcar a compuestos formadores de liposomas en la etapa de deshidratación es preferentemente (por lo menos 2):1. Preferentemente la relación es (por lo menos 5):1. La relación puede ser (20 o más):1, pero preferentemente es (inferior a 20):1. Estas relaciones están referidas en peso, de azúcar a compuestos formadores de liposomas totales.

En la presente invención, la relación de compuestos formadores de liposomas:principio activo debería ser tan baja como fuera posible. La invención permite que se consigan relaciones (inferiores a 10):1. Preferentemente la relación es 7,5:(por lo menos 1).

En la presente invención, los liposomas en suspensión acuosa (antes de la deshidratación) están sustancialmente exentos de compuestos activos. Pueden contener tampón u otro excipiente líquido. Los liposomas se forman de este modo a partir de compuestos formadores de liposomas y medio acuoso en ausencia de ingrediente activo en la etapa previa o se adquieren como tales en un proveedor comercial. Los liposomas deberían preferentemente ser vesículas unilaminares pequeñas (SUV) por ejemplo con un diámetro medio inferior a 500 nm, preferentemente inferior a 200 nm, por ejemplo en el intervalo de 50 a 100 nm. Los liposomas están disponibles comercialmente o pueden producirse en una etapa previa de formación de liposomas utilizando técnicas convencionales.

Cuando se utilizan liposomas vacíos en el procedimiento, se mezclan con ingrediente activo en forma adecuada y se mezclan opcionalmente mediante agitación u homogeneización. Dado que el ingrediente activo es lipófilo, es probable que sea soluble en la suspensión acuosa a los niveles de concentración requeridos para los niveles adecuados requeridos en el producto seco. Las formas adecuadas de dispersar el ingrediente activo en la suspensión acuosa pueden ser las descritas por Merisko-Liversidge et al. (op. cit.).

Como alternativa al proceso de molienda en húmedo descrito por Merisko-Liversidge, los ingredientes activos pueden someterse a una etapa de precipitado preliminar o de formación de coloides en la que se disuelven en un disolvente orgánico y se vuelven a precipitar o formar en un coloide mediante la adición de una sustancia no disolvente del compuesto, normalmente agua. El precipitado puede recogerse y volverse a poner en suspensión en la suspensión acuosa de liposomas o en un líquido acuoso precursor que se añade a los componentes restantes para formar dicha suspensión acuosa de liposomas. Para la dispersión del ingrediente activo y/o la suspensión acuosa de liposomas puede ser necesario agitar durante el proceso para mantener las partículas de ingrediente activo dispersas adecuadamente. Puede mezclarse una suspensión coloidal directamente con la suspensión exenta de liposomas.

Una etapa preliminar de formación de un precipitado o coloide adecuados del ingrediente activo implica la disolución del ingrediente en un alcohol o en un éter. Preferentemente el alcohol o el éter deberían ser suficientemente volátiles para que puedan ser eliminados por evaporación del precipitado antes de incorporarse en la solución acuosa de liposomas. Alternativamente, el sólido y el líquido pueden separarse por centrifugación, con eliminación del sobrenadante, seguido de resuspensión en agua. En algunas circunstancias, sin embargo, todo el disolvente o una parte de él pueden permanecer con el precipitado del ingrediente activo con lo cual permanece en la suspensión de liposomas y opcionalmente también en el producto deshidratado. El precipitado debería tener un diámetro medio en volumen medido con un Malvem Mastersizers entre aproximadamente 1 \mum y 100 \mum, preferentemente entre aproximadamente 20 y 50 \mum.

Cuando el disolvente orgánico utilizado para disolver el ingrediente activo antes de la formación de precipitado o coloide es miscible en agua, puede no ser necesario recuperar el precipitado como material anhidro antes de mezclar con la suspensión de liposomas. En este caso, el disolvente orgánico puede permanecer en la suspensión de liposomas y/o en el producto deshidratado, si el disolvente orgánico no es volátil. La presencia de disolvente orgánico residual puede ayudar a la incorporación del ingrediente lipófilo a las vesículas del producto. Preferentemente el disolvente orgánico se elimina sustancialmente por completo durante el tratamiento, ya que puede interferir con las propiedades de las vesículas finales. Preferentemente de este modo la suspensión acuosa que se deshidrata está sustancialmente exenta de disolvente orgánico.

Se prefiere realizar una etapa de precipitación preliminar del ingrediente activo en la que el ingrediente activo se disuelva en un disolvente orgánico adecuado, y se precipite a continuación en éste mediante la adición de un precipitante. El precipitado se separa del líquido, preferentemente por centrifugación o filtración. El sobrenadante o filtrado se descarga preferentemente y el sólido resuspendido en una sustancia no disolvente.

Los disolventes orgánicos adecuados para disolver el ingrediente activo lipófilo son los alcoholes, tal como etanol o éteres o éteres de glicol, tales como los polietilenglicoles de bajo peso molecular. El precipitante y el medio de resuspensión son normalmente acuosos, preferentemente constituidos por agua sola.

El azúcar utilizado en la etapa de deshidratación puede ser un mono- o disacárido. Preferentemente es un disacárido, por ejemplo trehalosa o, más preferentemente sacarosa. El azúcar debería disolverse totalmente en la suspensión acuosa. Esto se consigue generalmente mediante la formación de una solución precursora del azúcar en agua, aunque se ha descubierto que algunos azúcares son suficientemente solubles en agua que pueden añadirse directamente a la suspensión de liposomas como sólido en partículas.

En la presente invención los compuestos formadores de liposomas pueden tener una carga general, que puede ser positiva o, preferentemente, negativa. La utilización de dichos compuestos puede proporcionar mejor estabilidad para las vesículas de deshidratación y rehidratación en suspensión acuosa. Se conocen lípidos aniónicos e incluyen la fosfatidilserina y el fosfatidilglicerol. Se prefiere que los compuestos formadores de liposomas no tengan carga en conjunto, y que cada componente no posea carga en conjunto. Preferentemente los compuestos formadores de liposomas incluyen los lípidos iónicos bipolares, normalmente fosfolípidos iónicos bipolares tal como la fosfatidiletanolamina o, más preferentemente la fosfatidilcolina. Los lípidos comprenden generalmente derivados de acilo digrasos (que son ésteres), pero pueden incluir alternativamente los análogos de éter. Los grupos acilo grasos se seleccionan según la fluidez deseada, seleccionando cadenas largas adecuadas y la presencia, posición y configuración de enlaces insaturados de tipo etileno en la cadena. Los compuestos formadores de liposomas pueden comprender además colesterol que puede mejorar la estabilidad de los liposomas en presencia de plasma.

La presente invención es adecuada para encapsular una gama de fármacos lipófilos tal como los investigados por Meristo-Liversidge et al. op. cit. Es de valor especial para encapsular paclitaxel y derivados o análogos del mismo (taxanos) que, como se mencionó anteriormente, presentan problemas concretos que han demostrado ser difíciles de resolver. Otros fármacos lipófilos que, se cree, pueden estar prácticamente encapsulados en la invención comprenden esteroides, fármacos a base de platino y antiinflamatorios no estereoideos.

La presente invención se ilustra en los ejemplos adjuntos:

Materiales

PC - Fosfatidilcolina hidrogenada de soja se adquiere en Lipoid

CHOL - Colesterol se adquiere en Sigma

DMPG - Dimiristioil fosfatidilglicerol se adquiere en Lipoid

DSPG - Diestearoil fosfatidilglicerol se adquiere en Lipoid

DSPC - Diestearoil fosfatidilcolina se adquiere en Lipoid

DSPE-PEG - Diestearoil fosfatidiletanolamina PEGilada (PM del PEG = 2.000) fue una donación de Sequus

PC de huevo - fosfatidilcolina de huevo se adquiere en Lipid products.

Paclitaxel es el fármaco utilizado en todos los experimentos. El paclitaxel marcado con ^{3}H se adquiere en Moravek Biochemicals

DOPE marcada con ^{14}C (dioleil fosfatidilcolina) se adquiere en Amersham internacional.

Procedimientos Formación de SUV

Los compuestos formadores de liposomas en las proporciones deseadas (especificadas en las tablas a continuación) se disuelven conjuntamente en cloroformo, se utilizan para formar una película delgada en la superficie interna de un matraz y se secan, a continuación se añade agua (como medio acuoso formador de liposomas) en agitación para formar vesículas multilaminares (MLV). La suspensión de MLV se trata con ultrasonidos y se eliminan las partículas metálicas por centrifugación. Las SUV presentan un diámetro medio comprendido en el intervalo entre 60 y 80 nm.

Etapas de deshidratación y rehidratación

El procedimiento se basa en el procedimiento descrito por Kirby, C. y Gregoriadis, G. en Biotechnology 2(1984) 979-984. Se mezclan 2 ml de SUV con azúcar en forma sólida y a continuación se añade el ingrediente activo (en las proporciones descritas en los ejemplos específicos a continuación) con agitación, según sea necesario para impedir que algunos componentes se separen de la suspensión. La suspensión se enfría posteriormente a una temperatura de aproximadamente -35ºC durante 2 a 3 horas. El producto congelado se deshidrata a alto vacío posteriormente durante la noche.

La torta liofilizada se rehidrata en 100 a 300 \mul de agua (solución de rehidratación) para formar las DRV. Se tomaron muestras y se determinó el tamaño de las vesículas por espectroscopia de correlación de fotones utilizando un medidor Zeta, además se realizaron observaciones visuales de la suspensión de DRV para las señales de inestabilidad, por floculación u otros problemas. Además, se determina el índice de oclusión observando ^{3}H en el sedimento y en el sobrenadante después de la centrifugación.

Ejemplo 1 Optimización de la concentración de azúcar para la relación lípido:paclitaxel alta

En este ejemplo se prepara una solución de paclitaxel en etanol a una concentración de 20 mg/ml. Se añade una cantidad de la solución etanólica de paclitaxel a las SUV formadas a partir del compuesto formador de liposomas especificado en la tabla 1, de modo que se formen 1 a 4 ml de suspensión (dependiendo de la cantidad de lípido) que contiene 2 mg de paclitaxel y 78 mg de lípido total de modo que se formen 4 a 5 ml de suspensión. Las relaciones de lípidos son molares. Se añade también una alícuota de sacarosa sólida utilizando el procedimiento general (es decir, antes del fármaco) de modo que se forme una suspensión de liposomas que tiene la relación sacarosa:lípido especificada en la tabla 1.

La suspensión de lípidos se sometió a liofilización y rehidratación mediante la técnica general descrita anteriormente. Se analizaron las DRV para determinar su tamaño medio y los índices de oclusión.

Se observó que los índices de oclusión estaban comprendidos entre el 98 y el 99%. Se realizaron pruebas por duplicado y los resultados se presentan en la Tabla 1.

TABLA 1

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1

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Ejemplo 2 Variación de la cantidad de lípido

En este ejemplo la cantidad total de paclitaxel y de sacarosa permanecen iguales. La cantidad de lípido se modifica, pero el experimento es por lo demás como se describe en el ejemplo 1 anterior. Los niveles de oclusión se encuentran comprendidos otra vez en el intervalo entre 98 y 99%. Los resultados se presentan en la tabla 2 a continuación.

TABLA 2

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2

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Los resultados de los ejemplos 1 y 2 indican que la relación de sacarosa a lípido debería estar optimizada, como está la relación de lípido a paclitaxel. La presencia de etanol en la etapa de deshidratación y/o de paclitaxel parece aumentar el tamaño último de las DRV, donde la relación de lípido:fármaco es demasiado baja. La presencia de sacarosa no parece mejorar el tamaño en gran medida, aunque la estabilidad de las DRV mejora cuando la relación lípido:fármaco es (superior a 5):1.

Ejemplo 3

En este ejemplo, la relación de azúcar:lípido en peso aumenta a 10 mientras que los componentes lípidos varían. En cada caso el contenido total en lípidos está comprendido entre 38 y 40 mg mientras que la concentración de paclitaxel permanece como en los ejemplos 1 y 2, es decir 2 mg. Los índices de oclusión para todos los ejemplos están comprendidos en el intervalo entre 98 y 99%. Otros detalles son como en el ejemplo 1. Los resultados se presentan en la tabla 3.

TABLA 3

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3

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Los resultados en la tabla 3 indican que el colesterol mejora la estabilidad de las DRV.

Ejemplo 4

En este ejemplo se investiga el significado de la incorporación de lípido aniónico por omisión o reducción de la cantidad de PG o por sustitución por lípido PEGilado. En todos los experimentos, el nivel de lípido está comprendido entre 38 y 40 mg mientras que el paclitaxel permanece en 2 mg. Se sigue el mismo procedimiento general utilizado en el Ejemplo 1. Todos los índices de oclusión estaban comprendidos en el intervalo entre 98 y 99%. Los resultados se presentan en la tabla 4.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4

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La Tabla 4 indica que, para los liposomas preparados por el procedimiento general descrito en el Ejemplo 1, la incorporación de lípido aniónico parece proporcionar alguna estabilidad frente a la floculación en el producto. La reducción del nivel de lípido aniónico, por debajo de 0,01 partes por mol referida a una parte de cada PC y colesterol, todavía produce liposomas con estabilidad adecuada frente a la floculación. La eliminación del lípido aniónico conduce a una solución inestable, en la que floculan los liposomas. La sustitución del lípido aniónico por líquido PEGilado, que podría esperarse que proporciona resistencia a la floculación, a niveles relativamente altos (Ejemplo 4.6) proporciona alguna estabilidad. Sin embargo a un nivel inferior al del Ejemplo 4.3, la suspensión es inestable.

Ejemplo 5 Utilización de PEG300 como vehículo para fármacos

En este ejemplo, en lugar de disolver el paclitaxel en alcohol, se disuelve en una solución acuosa que comprende 75% de PEG que tiene un peso molecular de 300, en 25% de agua. Se realizaron dos series de experimentos, una utilizando 100 \mul de la solución de 75% de PEG, y la otra utilizando 100 \mul de la solución de paclitaxel en la solución de 75% de PEG, en cada caso añadida a las SUV de la misma manera que se añade la solución etanólica de paclitaxel a las SUV en el Ejemplo 1. De este modo la suspensión final contiene 2 mg de paclitaxel y 75 a 80 mg de lípido total. Los detalles restantes son como en la técnica general.

En cada caso los índices de oclusión de paclitaxel eran de aproximadamente 98%. Las mezclas de lípido utilizadas, la cantidad de sacarosa y los tamaños de las DRV producidas se presentan en la tabla 5 a continuación.

TABLA 5

5

Los resultados en la tabla 5 demuestran claramente el efecto sobre los liposomas de la oclusión de la sacarosa para lípidos neutros y aniónicos, con y sin fármaco, predisueltos en PEG. Este es el mismo efecto general ilustrado anteriormente para los procedimientos en los que se disuelve el fármaco en etanol.

Los resultados demuestran asimismo que aumentando el nivel de sacarosa se produce una disminución del tamaño de DRV, de nuevo con o sin fármaco. La presencia de fármaco parece producir una DRV mayor.

Ejemplo 6

En este ejemplo, se utiliza un procedimiento similar al utilizado en el Ejemplo 5. Es decir el fármaco se disuelve previamente en una solución acuosa de PEG al 75% en peso. En este experimento no se realizó comparación con PEG excepto sin fármaco. En cada experimento, el nivel total de fármaco utilizado fue 2 mg por experimento mientras que la cantidad de lípido estaba comprendida en el intervalo entre 38 y 40 mg (en comparación con 75 a 80 utilizado en el Ejemplo 5). La mezcla de lípido es igual a la utilizada en los Ejemplos 5.1 a 5.4. En cada caso, el nivel de oclusión de paclitaxel era de aproximadamente 98 a 99%.

Los resultados se presentan en la Tabla 6.

TABLA 6

6

Los resultados demuestran que, para este sistema, el aumento en la cantidad de sacarosa proporciona más reducción en el tamaño de DRV.

Ejemplo 7 Pruebas in vivo

Se prepararon liposomas según la técnica general y el ejemplo 1, e incluyendo sacarosa en una cantidad de 7 veces en peso el peso del lípido, utilizando las mezclas y relaciones de lípido y las relaciones peso de lípido:peso de fármaco indicadas a continuación en la Tabla 7 (composiciones iguales que en la Tabla 1). Para proporcionar un trazador radioactivo en el paclitaxel y en el lípido, se utilizaron respectivamente un vestigio de paclitaxel marcado con ^{3}H y de dioleoilfosfatidiletanolamina marcada con ^{14}C. Se inyectó i.v. 1 ml de DRV en ratas (2 mg de paclitaxel y 20, 40 ó 78 mg de lípido respectivamente). Se extrajeron muestras de sangre de los animales después de 2 minutos, 10 minutos, 60 a 80 minutos y 120 minutos y se detectó el marcador ^{3}H y ^{14}C. Se calcularon los porcentajes totales de marcador de lípido y de marcador de paclitaxel a los intervalos de tiempo respectivos.

Los resultados se presentan en la Tabla 7. Como comparación, se utiliza un paclitaxel disponible en el mercado en la composición de Cremophor utilizado al mismo nivel de dosis. (El paclitaxel disponible en el mercado tiene vestigios de marcador ^{3}H añadidos).

TABLA 7

7

Se sacrificaron los animales después de 2 ½ horas y se determinó el nivel de cada marcador en el riñón (K), hígado (L) y bazo (S).

Los resultados se presentan en la Tabla 8.

TABLA 8

8

Los resultados en la Tabla 7 parecen demostrar que existe una disociación entre el lípido y el paclitaxel en el plasma durante el periodo del experimento. Es probable que sea ventajoso ya que indica que el paclitaxel puede liberarse después de la administración. Los valores en la Tabla 8 demuestran que la distribución del tejido del paclitaxel liposómico favorece al hígado y al bazo, en comparación con la formulación de la técnica anterior.

Ejemplo 8

Los liposomas preparados como en el Ejemplo 7 estaban compuestos como se muestra en la Tabla 9. Las relaciones de lípido a masa de fármaco fueron 20:1. Para proporcionar un trazador radioactivo en el paclitaxel y en el lípido, se utilizaron vestigios de paclitaxel marcado con ^{3}H y de dioleoilfosfatidilcolina marcada con ^{14}C. Se inyectaron los liposomas a ratones por vía intravenosa (0,33 mg de paclitaxel y 8 mg de lípido para cada formulación). Se tomaron muestras de sangre a los 5, 30, 60 y 180 minutos en cuyo momento se sacrificaron los animales. Se midieron radioactividades de paclitaxel (^{3}H) y de lípido (^{14}C) en muestras de plasma sanguíneo, hígado, bazo y riñones y se calculó el porcentaje de radiomarcadores de paclitaxel y lípido en el plasma total y en los tejidos a los intervalos de tiempo respectivos. Como comparación, se utilizó una composición de paclitaxel (mezclado con fármaco marcado con trazador ^{3}H) Cremophor disponible en el mercado al mismo nivel de dosis.

Los resultados se presentan en las Figuras 1 y 2 y en la Tabla 9. Las Figuras 1 y 2 demuestran que la eliminación del paclitaxel liposómico (Fig. 1) del plasma es mucho más rápida que la de los liposomas (Fig. 2), siendo la implicación que existe una disociación entre el paclitaxel y los liposomas en el plasma durante el periodo del experimento. La Fig. 1 demuestra asimismo que la eliminación inicial (a los 5 min) de paclitaxel en Cremophor es más rápida que la de paclitaxel en cualquiera de las formulaciones liposómicas mostradas. Mucha parte del paclitaxel administrado con liposomas finaliza en el hígado (L) y en el bazo (S) mientras que cantidades menores de paclitaxel en Cremophor alcanzan estos tejidos (Tabla 9). Estos resultados demuestran que los liposomas pueden alterar la farmacocinética del fármaco.

TABLA 9

9

Ejemplo 9

En este experimento, en lugar de disolver el paclitaxel en alcohol y utilizar la solución directamente para añadir a las SUV se realiza una etapa de precipitación preliminar de paclitaxel. Se solubilizó el paclitaxel en etanol absoluto a una concentración de 20 mg/ml. Se añadieron 600 \mul de esta solución madre (12 mg de paclitaxel) a 8 ml de agua destilada. Esto produjo la precipitación de paclitaxel, observada al enturbiarse la solución. Se recuperó el precipitado de paclitaxel de la suspensión por centrifugación. Se eliminó el sobrenadante y se volvió a poner en suspensión el sedimento en 3 ml de agua destilada.

Se añadieron 500 \mul del paclitaxel redispersado (conteniendo 2 mg de paclitaxel) a una suspensión de las SUV, seguido de adición de sacarosa, deshidratación y rehidratación siguiendo el resto de la técnica general descrita anteriormente. En este experimento, la cantidad total de lípido en cada caso fue de 37 a 40 mg, mientras que la relación de sacarosa a lípido se presenta en la Tabla 9 a continuación, junto con las relaciones de lípido.

TABLA 10

10

Los resultados demuestran que, para el paclitaxel precipitado, el tamaño de DRV es menor para las composiciones neutras de lípido (9.1 y 9.2). El Ejemplo 9.3, que utiliza lípido aniónico, genera asimismo las DRV de poco tamaño deseables. Una comparación directa con las mezclas neutras de lípido exentas de PEG no es posible, sin embargo, a la vista de la diferencia en la concentración de sacarosa. Los resultados del Ejemplo 9.4 indican que, para las mezclas de lípido con un contenido de grupo acilo insaturado significativo, el producto de las DRV presenta un tamaño útil.

Ejemplo 10

Se sigue la técnica general indicada en el Ejemplo 9 para precipitar taxol antes de la mezcla con las SUV excepto que, en lugar de utilizar etanol, se utilizó un 75% en volumen de la mezcla PEG/agua para disolver el taxol (utilizando la misma concentración de 20 mg/ml). Además se utilizaron 4 ml de agua para precipitar 100 \mul de solución. Después de dejar la suspensión durante una hora, se realizó la centrifugación para separar el paclitaxel precipitado. Se elimina el sobrenadante. Se evalúa el contenido de taxol en el sedimento y se obtiene que es de aproximadamente 99% del taxol añadido al principio. Se vuelve a dispersar el sedimento en agua, y se mezcla la suspensión con las SUV, y la sacarosa sólida, se liofiliza y se rehidrata como en la técnica general. En cada experimento la cantidad de lípido utilizada para una muestra de 2 mg de paclitaxel es de aproximadamente 38 mg. Las mezclas de lípido y la relación sacarosa:lípido se presentan en la tabla 10 a continuación.

En este ejemplo se determinó la distribución del tamaño de dos repeticiones con una desviación estándar del tamaño determinada para cada muestra. Los resultados se presentan asimismo en la tabla.

TABLA 11

11

Los resultados ilustrados en la Tabla 11 demuestran que la precipitación en PEG con recuperación del paclitaxel del precipitante, proporciona de nuevo resultados deseables desde el punto de vista del tamaño de DRV. Se consiguen buenos resultados tanto para las mezclas neutras de lípido como para las mezclas de lípido con una carga aniónica global.

Ejemplo 11

Se prepararon SUV formadas por fosfatidilcolina de semilla de soja y colesterol equimolares utilizando la técnica general descrita anteriormente. Para confirmar que se formaban liposomas, se realizaron dos series de experimentos. En la primera, se mezclaron las SUV con carboxifluoresceína, se deshidrataron y rehidrataron utilizando la técnica general descrita anteriormente que incluye azúcar en la composición de SUV. En paralelo, se mezclaron las SUV con carboxifluoresceína (CF) y paclitaxel, y se deshidrataron y rehidrataron tal como se describió anteriormente con azúcar en la composición de SUV. El paclitaxel estaba en la forma utilizada en el ejemplo 9. Se determinaron el porcentaje de CF encapsulado y el diámetro medio Z.

Cuando se encapsuló CF sola, la tasa de encapsulación fue de aproximadamente 12%. El diámetro medio Z fue de aproximadamente 100 nm. Para CF y paclitaxel encapsulados conjuntamente, la tasa de encapsulación de CF fue de aproximadamente 17%, mientras que el diámetro medio Z fue de aproximadamente 171 nm. El comportamiento de la carboxifluoresceína en el producto ocluido conjuntamente fue similar a éste en el que CF sola estaba ocluida. Dado que es bien conocido que utilizando esta técnica CF llegará a estar ocluida en las SUV, es razonable suponer que el producto del procedimiento de la invención genera pequeñas vesículas que contienen paclitaxel.

En una prueba por separado, las SUV formadas por PC de semilla de soja y colesterol equimolares se mezclaron con paclitaxel precipitado, se deshidrataron y se rehidrataron utilizando el mismo procedimiento general. Se recuperaron los liposomas y se observaron al microscopio electrónico de transmisión. La presencia de bicapas de lípido pudo apreciarse claramente en las DRV.

Claims

1. Procedimiento para la formación de liposomas que comprende las etapas siguientes:

-: rehidratar el producto deshidratado en un medio de rehidratación acuoso para formar vesículas de deshidratación/rehidratación (DRV).

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el medio de rehidratación está constituido por agua.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el ingrediente activo se forma en una suspensión coloidal en una etapa preliminar de formación de la suspensión antes de mezclarse con los liposomas vacíos.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende las etapas preliminares de formación de la suspensión que consisten en disolver el ingrediente activo en un disolvente para formar una disolución, añadir a esta disolución un precipitante que precipite el ingrediente activo, recuperar el precipitado del sobrenadante, volver a poner en suspensión el precipitado en un no disolvente y mezclar la suspensión de precipitado resuspendido con los liposomas vacíos.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el disolvente es un alcohol, un éter o un éter glicólico y el precipitante y el vehículo de resuspensión son ambos agua.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el disolvente se selecciona de entre etanol y polietilenglicol de bajo peso molecular.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la deshidratación se realiza por secado por atomización o, preferentemente, por liofilización.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el azúcar es un mono- o disacárido, preferentemente sacarosa.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los materiales formadores de liposomas comprenden por lo menos un compuesto no iónico o iónico bipolar (sin carga global), que comprende preferentemente colesterol con una fosfatidilcolina.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que los materiales formadores de liposomas comprenden además un compuesto aniónico.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la relación de azúcar:lípido está comprendida en el intervalo (superior a 5):1 (peso/peso).

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la relación de lípido:ingrediente activo es (inferior a 10):1, preferentemente 7,5:(por lo menos 1).

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los liposomas en suspensión acuosa tienen un diámetro medio inferior a 100 nm.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que las DRV tienen un tamaño de partícula medio superior al tamaño de partícula medio de los liposomas en suspensión acuosa.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que las DRV tienen un tamaño de diámetro medio inferior a 1.000 nm, más preferentemente inferior a 500 nm.

16. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el ingrediente activo es un taxano, preferentemente el paclitaxel.