ES2270523T3 - Antigenos de superficie y proteinas utiles en composiciones para la diagnosis y prevencion de la enfermedad de lyme. - Google Patents

Abstract

Una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína o fragmento de la misma que se une a anticuerpos del agente causante de la enfermedad de Lyme en un sujeto mamífero, seleccionándose dicha secuencia de: (a) la SEQ ID NO: 1 o una secuencia complementaria de la misma; (b) la SEQ ID NO: 3 o una secuencia complementaria de la misma; (c) la SEQ ID NO: 4 o una secuencia complementaria de la misma; (d) la SEQ ID NO: 5 o una secuencia complementaria de la misma; (e) la SEQ ID NO: 6 o una secuencia complementaria de la misma; (f) la SEQ ID NO: 7 o una secuencia complementaria de la misma; (g) la SEQ ID NO: 8 o una secuencia complementaria de la misma; (h) la SEQ ID NO: 9 o una secuencia complementaria de la misma; (i) la SEQ ID NO: 10 o una secuencia complementaria de la misma; (j) la SEQ ID NO: 11 o una secuencia complementaria de la misma; (k) la SEQ ID NO: 12 o una secuencia complementaria de la misma; (l) la SEQ ID NO: 13 o una secuencia complementaria de la misma; y (m) una secuencia que codifica una proteína que comprende un fragmento de al menos 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, uniéndose dicho fragmento a un anticuerpo generado contra la proteína de SEQ ID NO: 2.

Description

Antígenos de superficie y proteínas útiles en composiciones para la diagnosis y prevención de la enfermedad de Lyme.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de las composiciones farmacéuticas y de diagnóstico útiles en el diagnóstico, el tratamiento y la profilaxis de borreliosis de Lyme. Más específicamente, la invención proporciona un antígeno de superficie natural aislado de Borellia y anticuerpos del mismo para uso en el diagnóstico, el tratamiento o la prevención de la enfermedad de Lyme.

Antecedentes de la invención

Borrelia burgdorferi (en sentido amplio) es un término genérico que abarca varias especies de Borrelia asociadas con, y que se cree que son el agente causante de, la borreliosis de Lyme (enfermedad de Lyme): B. burgdorferi en el sentido estricto, B. garinii y B. afzelii. Esta enfermedad se transmite mediante la picadura de diversas especies de garrapatas Ixodes que portan el espiroqueto. El principal depósito de la infección en los Estados Unidos es el ratón de patas blancas, Peromyscus leucopus, y la infección puede transmitirse a muchas especies de mamíferos, incluyendo perros, gatos y hombres [J.G. Donahue, et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 36: 92-96 (1987); R.T. Green, et al., J. Clin. Micro., 26: 648-653 (1988)]. A pesar de la presencia de una respuesta inmune activa, la enfermedad persiste durante años en los pacientes. Dicha persistencia se ha postulado que es el resultado, al menos en parte, de variación antigénica en las proteínas bacterianas [J.R. Zhang et al., Cell, 89: 275-285 (1997)].

El diagnóstico de enfermedad de Lyme en seres humanos y animales ha estado comprometido por la carencia de una serología definitiva que conduzca a un ensayo rápido y exacto. Los ensayos de diagnóstico actuales adolecen de baja sensibilidad y especificidad, como se ilustra por una reciente encuesta de funcionamiento de laboratorios de diagnóstico publicada por el "Wisconsin State Laboratory of Hygiene" [L. Bakken et al., J. Clin. Microbiol. 35: 537 (1997)]. Se necesita en la técnica una composición de diagnóstico sencilla, sensible y específica y un método para la detección temprana de la enfermedad de Lyme.

Las publicaciones referentes a proteínas y polipéptidos de Borrelia burgdorferi han sugerido su uso como agentes de diagnóstico o farmacéuticos. Dichas proteínas y polipéptidos incluyen las proteínas de superficie externa A y B (OspA y OspB), flagelina y otras proteínas designadas P21, P39, P66 y P83 según sus pesos moleculares estimados [A.G. Barbour et al., Infect. Immun., 45: 94-100 (1984); W.J. Simpson et al., J. Clin. Microbiol. 28: 1329-1337 (1990); K. Hansen et al., Infect. Immun. 56: 2047-2053 (1988); K. Hansen et al., Infect. J. Clin. Microbiol., 26: 338-346 (1988); B. Wilske et al., Zentral Bakteriol. Parasitenkd. Infektionshkr. Hyg. Abt. 1 Orig. Reihe A., 263: 92-102 (1986); D.W. Dorward et al., J. Clin. Microbiol. 29: 1162-1170 (1991); Solicitud de Patente de EE.UU. NTIS publicada nº 485.551; Solicitud de Patente Europea nº 465.204, publicada el 8 de Enero de 1992; Solicitud de Patente Internacional nº PCT/US91/01500, publicada el 19 de Septiembre de 1991; Solicitud de Patente Internacional nº PCT/EP90/02282, publicada el 11 de Julio de 1991; Solicitud de Patente Internacional nº PCT/DK89/00248, publicada el 3 de Mayo de 1990; Solicitud de Patente Internacional nº WO 92/00055, publicada el 9 de Enero de 1992.

Una proteína candidata preferida para una vacuna es OspA [M. Philipp et al., J. Spirochetal and Tick-borne Diseases, 3: 67-79 (1996)]. La expresión de OspA se anula o se regula negativamente cuando las espiroquetas están en camino desde el intestino medio de la garrapata a las glándulas salivares, a medida que tiene lugar la alimentación de sangre [A. DeSilva et al., J. Exp. Med. 183: 271-275 (1996)]. Este fenómeno genera problemas potenciales y puede reducir la eficacia de la vacuna de OspA. El descenso de las espiroquetas puede ocurrir sólo dentro del intestino medio de la garrapata [A. DeSilva et al., citado anteriormente] y no tras infección del hospedador vertebrado. Debido a que la saliva de Ixodes scapularis contiene un factor de descomplementación [T. Mather et al., "Ixodes saliva: vector competence for Borrelia burgdorferi and potential vaccine strategies", en el VII Congreso Internacional sobre Borreliosis de Lyme, San Francisco, CA (1996)], el descenso de espiroquetas dentro del intestino medio de la garrapata podría ocurrir mediante un mecanismo que implica sólo anticuerpo y no complemento.

Aunque el modo de acción de la destrucción dependiente de anticuerpo no se entiende completamente, parece que es un mecanismo de destrucción menos eficaz que el mediado por anticuerpo y complemento actuando conjuntamente [M. Sole et al., Infect. Immunol. 66: 2540-2546 (1998)]. Por tanto, puede permitir la evasión del intestino medio de aquellas espiroquetas que tengan una baja densidad de superficie de OspA. Es más, aunque la OspA es una proteína de B. burgdorferi abundante, sólo una fracción minoritaria de las moléculas de OspA se expone en la superficie externa de la espiroqueta [D. Cox et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 7973-7978 (1996)]. Por tanto, pequeñas variaciones en el número absoluto de moléculas de superficie OspA pueden causar diferencias significativas en el descenso de espiroquetas y hacer posible que una fracción de las espiroquetas residentes se escape a las glándulas salivares.

Los mutantes de escape de OspA evitarán fácilmente la destrucción en conjunto y, si son infecciosos para el hospedador vertebrado, contribuirán a reducir la eficacia de la vacuna de OspA aún más. En poblaciones clonales de B. burgdorferi que se dejan crecer in vitro, la prevalencia de mutantes que resisten la destrucción por anticuerpos anti-OspA se encuentra en el intervalo entre 10^{-5} y 10^{-2} [A. Sadziene et al., J. Exp. Med., 176: 799-809 (1992)]. Si dichas frecuencias se reproducen en una ninfa en alimentación, en la que los números de espiroquetas pueden alcanzar una media de 7.848 a las 15 horas de la unión [A. DeSilva et al., Am. J. Trop. Med. Hyg, 53: 397-404 (1995)], entonces pueden estar presentes varios mutantes en una sola garrapata. Los fenotipos mutantes típicos incluyen aquellos que no expresan OspA ni OspB y, frecuentemente, expresan una molécula quimérica compuesta por un fragmento N-terminal de OspA fusionado con un fragmento C-terminal de OspB. Estos mutantes de deleción se han encontrado en múltiples cepas de B. burgdorferi [P. Rosa et al., Mol. Microbiol. 6: 3031-3040 (1992)] y en varios aislamientos de garrapatas de California [T. Schwan et al., J. Clin. Microbiol. 31: 3096-3108 (1993)]. Los mutantes quiméricos (de delección) que son capaces de resistir la destrucción por el anticuerpo anti-OspA solo son destruidos por la acción combinada de anticuerpo y complemento. Puesto que el complemento parece ser no funcional en la garrapata [T. Mather et al., citado anteriormente] y OspA, y probablemente su forma quimérica también, no se expresan en el hospedador vertebrado poco después de la infección, los mutantes de escape de OspA quiméricos podrían infectar al hospedador vertebrado. Además, se estima que hasta un 2% de las garrapatas Ixodidae están sólo parcialmente alimentadas y por lo tanto siguen buscando [Y. Lobet, comunicación personal]. Si dichas garrapatas han tomado su alimento incompleto de un hospedador infectado con B. burgdorferi, tendrán espiroquetas en sus glándulas salivares que no expresan OspA y que infectarán fácilmente a un hospedador vacunado con OspA.

No se ha observado efecto de recuerdo [M. Philipp et al., citado anteriormente] ni debe esperarse después de la infección con espiroquetas de un hospedador vacunado con OspA. Por tanto, la vacuna de OspA puede requerir administraciones repetidas para mantener títulos de anticuerpo eficaces.

Existe por tanto la necesidad en la técnica de métodos y composiciones adicionales y mejorados para la prevención de la enfermedad de Lyme en seres humanos y animales, y para el tratamiento de la misma.

Sumario de la invención

La presente invención satisface la necesidad en la técnica proporcionando métodos y composiciones para la prevención de la enfermedad de Lyme basados en los antígenos de espiroqueta que se expresan por la espiroqueta durante su residencia en el hospedador vertebrado. Dichos métodos y composiciones pueden emplearse también para el tratamiento de la enfermedad de Lyme.

En un aspecto, la invención se refiere a un antígeno de superficie de Borrelia burgdorferi en sentido amplio aislado, que se expresa in vivo por la espiroqueta en el hospedador vertebrado. El antígeno, designado en la presente memoria como P39.5, se caracteriza adicionalmente por tener una masa molecular relativa de 39,5 kDa. Son también útiles fragmentos de este antígeno en las composiciones y métodos de esta invención.

En otro aspecto, la invención se refiere a nuevos polipéptidos/proteínas de serie de módulos de Borrelia.

En aún otro aspecto, la invención se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican P39.5 o fragmentos del mismo tales como P7-1, así como a secuencias de ácido nucleico que codifican otras proteínas de serie de módulos de Borrelia o fragmentos de las mismas. Estas secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias que hibridan con las secuencias anteriores en condiciones rigurosas, variantes alélicas de las mismas y mutantes de deleción de las mismas. En particular, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína o un fragmento de la misma que se une a anticuerpos del agente causante de la enfermedad de Lyme en un sujeto mamífero, seleccionándose dicha secuencia de: (a) la SEQ ID NO: 1 o una secuencia complementaria de la misma; (b) la SEQ ID NO: 3 o una secuencia complementaria de la misma; (c) la SEQ ID NO: 4 o una secuencia complementaria de la misma; (d) la SEQ ID NO: 5 o una secuencia complementaria de la misma; (e) la SEQ ID NO: 6 o una secuencia complementaria de la misma; (f) la SEQ ID NO: 7 o una secuencia complementaria de la misma; (g) la SEQ ID NO: 8 o una secuencia complementaria de la misma; (h) la SEQ ID NO: 9 o una secuencia complementaria de la misma; (i) la SEQ ID NO: 10 o una secuencia complementaria de la misma; (j) la SEQ ID NO: 11 o una secuencia complementaria de la misma; (k) la SEQ ID NO: 12 o una secuencia complementaria de la misma; (l) la SEQ ID NO: 13 o una secuencia complementaria de la misma; y (m) una secuencia que codifica una proteína que comprende un fragmento de al menos 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, uniéndose dicho fragmento a un anticuerpo generado contra la proteína de SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la invención se refiere a nuevas proteínas que comprenden fragmentos de la secuencia de proteína P39.5 o secuencias de proteína de serie de módulos descritas anteriormente, opcionalmente fusionadas o mezcladas con un segundo polipéptido o proteína seleccionado, que puede ser una proteína con hasta 90% de identidad en su secuencia aminoacídica con la de P39.5 u otros antígenos de Borrelia tales como OspA, y proteínas o polipéptidos derivados de otros microorganismos. En particular, la invención proporciona una proteína o un fragmento de la misma que se une a anticuerpos del agente causante de enfermedad de Lyme en un sujeto mamífero, comprendiendo dicha proteína o fragmento una secuencia aminoacídica seleccionada de (a) la SEQ ID NO: 2; (b) la SEQ ID NO: 14; (c) una secuencia aminoacídica codificada por la SEQ ID NO: 13; (d) una secuencia aminoacídica codificada por la SEQ ID NO: 7; (e) una secuencia aminoacídica codificada por la SEQ ID NO: 11; (f) una secuencia aminoacídica de (a) a (e) que tiene una sustitución aminoacídica conservativa en la misma; y (g) una secuencia aminoacídica que comprende un fragmento de al menos 8 aminoácidos de (a) o (b), uniéndose dicho fragmento a un anticuerpo generado contra una proteína de SEQ ID NO: 2.

En todavía otro aspecto, la invención se refiere a nuevas composiciones de proteína que comprenden las secuencias proteicas del (de los) antígeno(s) descrito(s) anteriormente, o fragmentos del (de los) mismo(s), opcionalmente mezcladas con un segundo polipéptido o proteína seleccionado, que puede ser una proteína con hasta 90% de identidad en su secuencia aminoacídica con la de P39.5 u otros antígenos de Borrelia tales como OspA, y proteínas o polipéptidos derivados de otros microorganismos.

En todavía un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para producir recombinantemente la proteína P39.5 anteriormente descrita, fragmentos de la misma o proteínas de fusión que contienen dichos fragmentos, expresando una secuencia de ADN que codifica la proteína, fragmento o proteína de fusión en una célula hospedadora seleccionada, y aislar la proteína a partir de la misma. Se proporcionan también en la presente memoria células hospedadoras transformadas con dichas secuencias de ADN. En particular, la invención proporciona un método de expresión recombinante de la proteína o fragmento de la invención que comprende cultivar una célula hospedadora recombinante transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteína o fragmento en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína o péptido.

En todavía otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo aislado dirigido contra el antígeno P39.5 anteriormente descrito, fragmentos del mismo, proteínas de serie de módulos o fragmentos, o una proteína de fusión que contiene dichos fragmentos. Estos anticuerpos pueden ser policlonales. Dichos anticuerpos pueden producirse mediante un método que comprende inmunizar un ser humano o un animal con un antígeno aislado como se describe anteriormente, o con uno o una mezcla de más de un fragmento del mismo, o proteína de fusión que contiene uno o más fragmentos de esta invención. Pueden prepararse otros tipos de anticuerpos a partir de dichos animales inmunizados, por ejemplo, recombinantes, monoclonales, quiméricos, humanizados, etc.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición terapéutica y a métodos para tratar seres humanos y/o animales con la enfermedad de Lyme. La composición terapéutica contiene un anticuerpo o proteína o fragmento como se describe anteriormente y un vehículo farmacéutico adecuado.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a composiciones de vacuna y a métodos de vacunación de un paciente humano o animal frente a la enfermedad de Lyme mediante el uso de estas composiciones anteriormente descritas. Las composiciones contienen una cantidad eficaz de al menos un antígeno de Borrelia de esta invención, por ejemplo, un antígeno que se expresa in vitro por espiroquetas de Borrelia, teniendo dicho antígeno una masa molecular relativa de 39.500 Da, o fragmento(s) antigénico(s) del mismo, o una proteína de fusión que contiene dicho fragmento, o proteína(s) de serie de módulos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición de vacuna puede contener la proteína P39.5, fragmentos de la misma, proteínas de fusión o mezclas de proteínas como se describen anteriormente.

En aún un aspecto adicional, la invención se refiere a composiciones de vacuna y a métodos de vacunación de un paciente humano o animal frente a la enfermedad de Lyme mediante el uso de composiciones de ácido nucleico, por ejemplo, vacunas de ADN. Las composiciones contienen una cantidad eficaz de una secuencia de ADN que codifica al menos un antígeno de Borrelia de esta invención o fragmento(s) antigénico(s) del mismo, antígeno(s) de serie de módulos o una proteína de fusión que contiene dicho fragmento, y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional.

En aún un aspecto adicional, la invención proporciona un método para diagnosticar borreliosis de Lyme en un ser humano o animal. Este método incluye las etapas de incubar un antígeno o anticuerpo de esta invención, preferiblemente marcado convencionalmente para detección, con una muestra de fluidos biológicos de un ser humano o animal que se va a diagnosticar. En presencia de infección por B. burgdorferi del paciente humano o animal, se forma un complejo antígeno-anticuerpo. Posteriormente, se analiza la mezcla de reacción para determinar la presencia o ausencia de estos complejos antígeno-anticuerpo. En una realización adicional, el ensayo de diagnóstico puede emplear secuencias de ADN, preferiblemente secuencias antisentido, del antígeno o fragmentos del mismo, y diagnosticar la infección por la presencia de secuencias en un fluido biológico del paciente que hibriden con las mismas. Pueden emplearse otros formatos de ensayo convencionales utilizando reactivos identificados por esta invención.

En otro aspecto, la invención proporciona un kit para diagnosticar infección por B. burgdorferi en una muestra de paciente humano o animal que contiene al menos un anticuerpo capaz de unirse al menos a un antígeno de esta invención o fragmento(s) antigénico(s) del mismo, o a una secuencia de ADN que codifica uno o más antígenos de esta invención o a una secuencia antisentido del mismo. Los anticuerpos y secuencias pueden marcarse opcionalmente para detección, o puede incluirse en el kit un sistema de detección.

Se describen adicionalmente otros aspectos y ventajas de la presente invención en la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la misma.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una gráfica de la titlulación de destrucción dependiente de anticuerpo mediada por complemento (ADCK) de espiroquetas de B. burgdorferi cepas JD1 (\medcirc), B31 (\Delta) y B. garinii cepa IP90 (\boxempty) con suero de un mono Rhesus inoculado por garrapata con espiroquetas JD1.

La Fig. 2 es una descripción esquemática de porciones de la secuencia de ADN de la nueva P39.5 que codifican un marco de lectura abierto único que codifica una proteína deducida de 37,7 kDa. Este fragmento de ADN se denomina 7-1 y la proteína deducida se designa como P7-1. La región en negro es una región única que se extiende desde aproximadamente el pb 769 a aproximadamente el pb 854 de la SEQ ID NO: 1. La región marcada IA se extiende desde aproximadamente el pb 1 a aproximadamente el pb 309 de la SEQ ID NO: 1; IB se extiende desde aproximadamente el pb 855 a aproximadamente el pb 1.189 de la SEQ ID NO: 1. Las regiones IA y IB tienen un 70% de identidad. Las regiones IIA, que se extiende desde aproximadamente el pb 310 a aproximadamente el pb 494 de la SEQ ID NO: 1, y IIB, que se extiende desde aproximadamente el pb 595 a aproximadamente el pb 769 de la SEQ ID NO: 1, tienen un 91% de identidad. Las regiones A, que se extiende desde aproximadamente el pb 208 a aproximadamente el pb 309 de la SEQ ID NO: 1, y B, que se extiende desde aproximadamente el pb 495 a aproximadamente el pb 595 de la SEQ ID NO: 1, tienen un 84% de identidad. Las regiones B y C, que se extienden conjuntamente desde aproximadamente el pb 1.090 a aproximadamente el pb 1.189 de la SEQ ID NO: 1, tienen un 90% de identidad.

La Fig. 3 es una gráfica de barras que ilustra la destrucción in vitro de espiroquetas IP90 con: plasma de un mono infectado con espiroquetas JD1 y complemento de mono (barra 1); anticuerpo del mismo plasma que se purifica por afinidad en P39.5 nativa y complemento de mono (barra 2); el mismo anticuerpo descrito para la barra 2 sin complemento (barra 3); complemento solo (barra 4); y medio BSK-H solo (barra 5). Las barras de error representan la desviación estándar de la media de dos determinaciones.

La Fig. 4 es una gráfica de barras que muestra la ACDK de espiroquetas de la cepa IP90 utilizando: una agrupación de plasma de monos infectados con JD1 de B. burgdorferi a una dilución de 1:10 (barras 1, 5); suero agrupado de ratones inmunizados con una forma recombinante de P7-1 (rP7-1) y coadyuvante Ribi a 1:10 (barras 2, 6) y 1:50 (barra 3); y ratones inmunizados con coadyuvante Ribi solo (barras 4, 7). Se utilizó complemento de mono en ADCK de las barras 1-4 y complemento de conejillo de Indias en ADCK de las barras 5-7. Las barras de error representan el error estándar de la media de dos determinaciones.

La Fig. 5 es una ilustración de la "serie" de módulos VLS silenciosos en un tramo de ADN de aproximadamente 8 kb de longitud, duplicado de J.R. Zhang et al., Cell 89: 275-285 (1997).

La Fig. 6 es una transferencia Western de lisados de espiroquetas de B. burgdorferi cepas JD1 y B31 y B. garinii cepa IP90 desarrollada con suero de monos inoculados por aguja (carriles 1) e inoculados por garrapatas (carriles 2) con las espiroquetas JD1, y anticuerpos del último suero separados por purificación por afinidad de las espiroquetas JD1 vivas enteras (carriles 3).

Denominaciones de los listados de secuencias

La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de ácido nucleico del clon 7-1.

La SEQ ID NO: 2 es la secuencia proteica deducida del clon 7-1.

La SEQ ID NO: 3 es el extremo 5’ de la secuencia de ácido nucleico del clon 1-1.

La SEQ ID NO: 4 es una secuencia parcial de ácido nucleico del clon 1-1 encontrada en la mitad de la secuencia de ácido nucleico.

La SEQ ID NO: 5 es el extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico del clon 1-1.

La SEQ ID NO: 6 es el extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico del clon 3-1.

La SEQ ID NO: 7 es el extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico del clon 3-1.

La SEQ ID NO: 8 es el extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico del clon 6-1.

La SEQ ID NO: 9 es el extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico del clon 6-1.

La SEQ ID NO: 10 es el extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico del clon 9-1.

La SEQ ID NO: 11 es el extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico del clon 12-1.

La SEQ ID NO: 12 es el extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico del clon 12-1.

La SEQ ID NO: 13 es una secuencia parcial de ácido nucleico obtenida a partir del clon 14 que, cuando se añade a la terminación 5' del clon 7-1 [SEQ ID NO: 1], forma un fragmento mayor de P39.5, concretamente P7-1. Las primeras seis bases 5' terminales son del vector de plásmido.

La SEC Nº ID 14 es la secuencia de proteína deducida de la SEQ ID NO: 13.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo antígeno de superficie de Borrelia, P39.5, que se expresa por la espiroqueta cuando reside en el hospedador vertebrado ("in vivo"). Este antígeno es el objetivo de destrucción dependiente de anticuerpo mediada por complemento (ADCK) in vitro. Este nuevo antígeno, fragmentos del mismo, anticuerpos desarrollados del mismo, las secuencias de ácido nucleico que codifican el mismo y el uso de dichos antígenos, anticuerpos y secuencias de ácido nucleico en composiciones de diagnóstico, terapéuticas y profilácticas y en métodos para el tratamiento o la prevención de enfermedad de Lyme, proporcionan ventajas frente al uso de otras proteínas y anticuerpos de Borrelia en composiciones y métodos conocidos con este fin.

I. El antígeno P39.5 de la invención

En una realización, la presente invención se refiere a un nuevo antígeno de Borrelia aislado, designado como P39.5. Este antígeno se expresa tanto in vitro como in vivo por espiroquetas de Borrelia, por ejemplo, espiroquetas de B. garinii cepa IP90. Este antígeno, o un homólogo del mismo, se expresa también in vivo por espiroquetas de B. burgdorferi en sentido estricto de cepas JD1, B31 y NT1. Este antígeno tiene una masa molecular aparente de 39,5 kDa en espiroquetas IP90, y se caracteriza funcionalmente por la capacidad de desencadenar anticuerpos en animales durante el transcurso de una infección natural con espiroquetas de Borrelia. Estos anticuerpos inducidos destruyen las espiroquetas IP90 mediante ADCK in vitro. El anticuerpo desencadenado destruye también las espiroquetas de la cepa NT1 de B. burgdorferi en sentido amplio, una cepa aislada a partir del líquido cefalorraquídeo de un paciente en los Estados Unidos, pero no caracterizada adicionalmente dentro del complejo de especies en sentido amplio. Esta cepa se proporcionó por la Dra. Patricia Coyle, State University of New York en Stony Brook, Nueva York.

Se transformó el fragmento génico designado 7-1 de una cepa de B. burgdorferi en sentido amplio (B. garinii cepa IP90) insertado en el plásmido pBluescript II en E. coli, y se depositó en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland ("ATCC") el 27 de Junio de 1997 con el número de acceso 98478. Cuando este fragmento génico se expresa en E. coli, se aísla en forma de una proteína pura y se utiliza la proteína como inmunógeno en ratones, el anticuerpo así producido reacciona con P39.5 de IP90. Se insertaron de forma similar cada uno de los otros fragmentos génicos designados 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 y 12-1 de Borrelia garinii cepa IP90 en plásmidos pBluescript II, se transformaron en E. coli y se depositaron. Estos últimos depósitos se realizaron en la ATCC en o antes del 25 de junio de 1998 con los números de acceso 98768 para 1-1, 98769 para 3-1, 98770 para 6-1, 98771 para 9-1 y 98772 para 12-1. Todos los depósitos se realizaron para satisfacer los requisitos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes, y cumplen completamente los requisitos de la Oficina Estadounidense de Patentes y Marcas de depósitos para procedimientos de patente. Las secuencias útiles en la presente invención pueden obtenerse a partir de estos depósitos.

A. Secuencias de ácido nucleico

La presente invención se refiere a secuencias de ácido nucleico de mamífero que codifican fragmentos de P39.5. Las secuencias de ácido nucleico de esta invención se aíslan a partir de materiales celulares con los que están naturalmente asociados. Como se describe en los ejemplos a continuación, se clonó y secuenció un segmento de 1.190 pb que codifica una porción de la región de codificación del gen P39.5 de Borrelia. Abarca un marco de lectura abierto único que codifica una supuesta proteína de 37,7 kDa. Esta secuencia parcial de ADN se reseña en las SEQ ID NO: 13 y 1. La SEQ ID NO: 13 es una secuencia inmediatamente 5' de la primera base de la SEQ ID NO: 1. Conjuntamente, estas secuencias forman una proteína parcial de 1.189 pb y aproximadamente 396 aminoácidos. El fragmento secuenciado está compuesto principalmente por dominios hidrofílicos que contienen varias regiones repetidas internamente y una única región que se extiende desde aproximadamente el pb 627 a aproximadamente el pb 712 de la SEQ ID NO: 1. Véase la Fig. 2, que identifica las secuencias repetidas e identifica las homologías e identidades porcentuales de dichas secuencias.

Cuando en este texto las secuencias de proteína y/o ADN se definen por sus homologías o identidades porcentuales con secuencias identificadas, los algoritmos utilizados para calcular las identidades porcentuales o similitudes porcentuales incluyen los siguientes: el algoritmo de Smith-Waterman [J.F. Collins et al., 1988, Comput. Appl. Biosci. 4: 67-72; J.F. Collins et al., "Molecular Sequence Comparison and Alignment" (M.J. Bishop et al., Eds.) en "Practical Approach Series: Nucleic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII", IRL Press: Oxford, Inglaterra, RU (1987), pág. 417] y los programas BLAST y FASTA [E.G. Shpaer et al., 1996, Genomics 38: 179-191]. Estas referencias se incorporan a la presente memoria como referencia.

Se describen también en la presente memoria otros fragmentos de ácido nucleico de Borrelia, por ejemplo, fragmentos de serie de módulos, así como fragmentos de P39.5. Dichos fragmentos se designan como 1-1 (que codifica una proteína/péptido P1-1), 3-1 (que codifica una proteína/péptido P3-1), 6-1 (que codifica una proteína/péptido P6-1), 9-1 (que codifica una proteína/péptido P9-1) y 12-1 (que codifica una proteína/péptido P12-1). Preferiblemente, dichos fragmentos se caracterizan por codificar una porción biológicamente activa de P39.5, por ejemplo, un epítopo. Generalmente, estos fragmentos oligonucleotídicos son de al menos 15 nucleótidos de longitud. Sin embargo, pueden seleccionarse fragmentos oligonucleotídicos de tamaños variables según se desee. Dichos fragmentos pueden utilizarse para fines tales como realizar reacción en cadena con polimerasa (PCR), por ejemplo en una muestra de tejido de biopsia. Por ejemplo, los fragmentos útiles de ADN de P39.5 y las secuencias correspondientes comprenden secuencias que aparecen entre los pb 793-816 de la SEQ ID NO: 1 y los pb 59-85 de la SEQ ID NO: 13. Se identifican en la Fig. 2 otros fragmentos útiles. Los fragmentos de 1-1 incluyen secuencias de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5. Los fragmentos de 3-1 incluyen secuencias de las SEQ ID NOS: 6 y 7; los fragmentos de 6-1 incluyen secuencias de las SEQ ID NOS: 8 y 9. Un fragmento de 9-1 incluye la secuencia de la SEQ ID NO: 10. Los fragmentos de 12-1 incluyen las secuencias de las SEQ ID NOS: 11 y 12. Las secuencias completas de 1-1, 3-1, 6-1,9-1 y 12-1 y otros fragmentos útiles pueden obtenerse fácilmente por un experto en la técnica recurriendo a técnicas de secuenciación de ADN convencionales aplicadas al ADN depositado en la ATCC anteriormente.

Las secuencias de ADN de SEQ ID NOS: 1 y 3-12, así como los materiales depositados identificados anteriormente, permiten a un experto en la técnica obtener fácilmente las correspondientes cadenas antisentido de estas secuencias de ADN. Además, utilizando técnicas conocidas, un experto en la técnica puede obtener fácilmente secuencias genómicas y de ADNc adicionales que flanquean las secuencias de ADN ilustradas o las correspondientes secuencias de ARN, según se desee. De forma similar, la disponibilidad de las SEQ ID NOS: 1 y 3-12 y los materiales depositados de esta invención permite a un experto en la técnica obtener análogos de otras especies de P39.5, péptidos de B. garinii y fragmentos de los mismos, mediante el uso de las secuencias de ácido nucleico de esta invención como sondas en una técnica convencional, por ejemplo, reacción en cadena con polimerasa. Las variantes alélicas de estas secuencias dentro de una especie (concretamente, secuencias que contienen algunas diferencias nucleotídicas individuales respecto a una secuencia de aparición más común dentro de una especie, pero que sin embargo codifican la misma proteína o una proteína con la misma función) tales como otras variantes de P39, SEQ ID NO: 2, pueden obtenerse también fácilmente dado el conocimiento de esta secuencia dado por esta invención.

Otras secuencias de ácido nucleico pueden ser capaces de hibridar en condiciones rigurosas [véase J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed., "Cold Spring Harbor Laboratory" (1989)] con las secuencias de SEQ ID NO: 1, sus cadenas antisentido o fragmentos biológicamente activas de las mismas. Es un ejemplo de una condición de hibridación altamente rigurosa la hibridación a 2 x SSC a 65ºC, seguida de lavado con 0,1 x SSC a 65ºC durante 1 hora. Como alternativa, es una condición de hibridación de alto rigor ejemplar en 50% de formamida, 4 x SSC a 42ºC. Las condiciones de rigor moderadamente alto pueden probarse también útiles, por ejemplo, hibridación en 4 x SSC a 55ºC, seguida de lavado con 0,1 x SSC a 37ºC durante 1 hora. Es una condición de hibridación de rigor moderadamente alto ejemplar alternativa en 50% de formamida, 4 x SSC a 30ºC.

Las secuencias de ácido nucleico pueden modificarse. Utilizando los datos de secuencia de las SEQ ID NOS: 1 y 3-12, está dentro de la experiencia en la técnica obtener o preparar sintética o recombinantemente otras secuencias polinucleotídicas, o secuencias polinucleotídicas modificadas, que codifican las proteínas completas o fragmentos útiles de la invención. Dichas modificaciones a nivel del ácido nucleico incluyen, por ejemplo, modificaciones en las secuencias nucleotídicas que son silenciosas o que cambian los aminoácidos, por ejemplo, para mejorar la expresión o secreción. Se incluyen también las variaciones alélicas, causadas por la degeneración natural del código genético.

Se describen también en la presente memoria mutantes de los fragmentos P39.5 y las secuencias de serie de módulos 1-1, 3-1, 6-1, 7-1, 9-1 y 12-1 proporcionadas en la presente memoria. Dichos mutantes incluyen deleciones amino-terminales, carboxi-terminales o internas que retienen sustancialmente la antigenicidad de la P39.5 completa u otras proteínas o fragmentos. Dicho mutante truncado o de deleción puede expresarse con el fin de afectar a la actividad del gen completo o de tipo silvestre o fragmentos génicos.

Estas secuencias de ácido nucleico son útiles para una variedad de usos de diagnóstico, profilácticos y terapéuticos. Ventajosamente, las secuencias de ácido nucleico son útiles en el desarrollo de sondas de diagnóstico y sondas terapéuticas para uso en la detección y el diagnóstico de la enfermedad de Lyme utilizando una variedad de ensayos de ácido nucleico conocidos, por ejemplo, transferencias Northern y Southern, reacción en cadena con polimerasa (PCR) y otras técnicas de ensayo conocidas por el experto en la técnica. Las secuencias de ácido nucleico de esta invención son también útiles en la producción de proteínas P39.5 y homólogos, así como otras proteínas de B. garinii.

Las secuencias nucleotídicas de la invención pueden aislarse mediante usos convencionales de técnicas de reacción en cadena con polimerasa o clonación tales como las descritas en textos convencionales tales como Sambrook et al., citado anteriormente. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico del antígeno de esta invención pueden prepararse o aislarse a partir de ADN de B. garinii utilizando cebadores y sondas de ADN y técnicas de PCR. Como alternativa, el antígeno puede obtenerse a partir de bancos génicos derivados de ADN genómico entero de B. garinii. Estas secuencias, fragmentos de las mismas, modificaciones de las mismas y secuencias completas pueden construirse recombinantemente utilizando técnicas de ingeniería genética o síntesis química o PCR convencionales y similares utilizando la información proporcionada en la presente memoria.

B. Secuencias proteicas

La presente invención se refiere también a proteínas de B. burgdorferi en sentido amplio tales como proteínas y péptidos de B. garinii, incluyendo polipéptidos o proteínas P39.5 y los péptidos/proteínas representados por las denominaciones P1-1, P3-1, P6-1, P7-1 P9-1 y P12-1 de esta invención. Estas proteínas están libres de asociación con otras proteínas o materiales contaminantes con los que se encuentran en la naturaleza. Debido a que la P39.5 nativa se extrajo completamente en la fase detergente en una extracción con Triton-X114, es probablemente una lipoproteína. El antígeno P39.5 tiene una masa molecular relativa de 39.500 Da medida mediante inmunotransferencia Western (véanse el ejemplo 2 y la Fig. 6). En una realización, la invención proporciona un polipéptido de P39.5 parcial [SEQ ID NO: 2] de aproximadamente 354 aminoácidos, probablemente una lipoproteína, que tiene una masa molecular relativa predicha de aproximadamente 37,7 kDa (concretamente, "el fragmento P7-1"). Esta secuencia aminoacídica deducida [SEQ ID NO: 2] es hasta un 22% idéntica a los miembros de la familia de la proteína mayor variable (Vmp) de lipoproteínas de superficie externa de Borrelia hermsii (véase el ejemplo 6). Es aproximadamente un 50% idéntica a la secuencia similar a Vmp (vls) VIsE de la cepa B31 de B. burgdorferi [J.-R. Zhang et al., citado anteriormente] y a otras secuencias vls de B. burgdorferi [concretamente, Vls-6 nº Genbank U76406 (53% de identidad a lo largo de 190 aa); VIsE nº Genbank U84553 (57% a lo largo de 210 aa) y U84566 (58% a lo largo de 209 aa) y U84555 (58% a lo largo de 210 aa))].

VIsE es parte de un antígeno de B. burgdorferi que experimenta variación antigénica mediante un mecanismo de recombinación mediante el que se recombina un fragmento central de la copia expresada (VIsE) con fragmentos de una secuencia de 15 "módulos" localizada cadena arriba de la copia expresada [J. Zhang, citado anteriormente]. Cada módulo es de 500 pb de longitud de media, y la serie completa ocupa un tramo de ADN de aproximadamente 8 kb. Uno de los rasgos notables de esta serie de módulos es que, en B31 de B. burgdorferi, los módulos están dispuestos en un marco de lectura abierto casi contiguo interrumpido sólo por un codón de paro en el módulo vls11 y dos desplazamientos de marco en los módulos vls14 y vls16. Véase, por ejemplo, la Fig. 6, que es una copia de una estructura similar definida en Zhang et al., citado anteriormente.

Se forma una secuencia proteica parcial más larga de P39.5 mediante la fusión directa de la secuencia parcial del clon 14 [SEQ ID NO: 14] al extremo 5' de la secuencia de SEQ ID NO: 2. La identificación de la secuencia del clon 14 como una secuencia 5' a la secuencia de P7-1 resultó de superponer secuencias entre los dos clones a partir de los que se obtuvieron estas secuencias, demostrando dichas secuencias superpuestas que eran parte del mismo marco de lectura abierto. Por tanto, la Leu (aminoácido 47 de la SEQ ID NO: 14) es seguida inmediatamente por la Lys (aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 2) en la secuencia aminoacídica deducida de P39.5 mayor.

La presente invención proporciona secuencias de ADN y aminoacídicas deducidas parciales de varios fragmentos que parecen ser parte de la serie de módulos de B. garinii IP90. Estos fragmentos, que pueden incluir 7-1, se denominan 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 y 12-1, y son de entre 1 y 2 kb de longitud. Cada uno de ellos expresa un péptido (menos el promotor lacZ de pBluescript) que es proporcional al tamaño del inserto y que reacciona con el anticuerpo de monos infectados. Ninguno de los extremos 5' de estos fragmentos [SEQ ID NOS: 1, 3, 6, 8, 10 y 11] contiene una secuencia líder hidrofóbica o una secuencia señal consenso de peptidasa II del tipo que es característico de lipoproteínas bacterianas. Estos fragmentos deben ser por lo tanto parte de la serie de módulos de IP90 y, como la serie de módulos de B31, están dentro del marco. Estas proteínas similares a vls se identifican por las secuencias 5' y 3' parciales [véanse, por ejemplo, las SEQ ID NO: 1, 3, 5 a 12]. Un experto en la técnica que utilice técnicas convencionales tales como PCR puede utilizar fácilmente las secuencias 5' y 3' parciales proporcionadas en la presente memoria y las secuencias de ADN (o biblioteca de ADN) de B. garinii o los materiales depositados en la ATCC para cada proteína de serie de módulos identificada anteriormente para identificar las secuencias completas de la misma. Dichos métodos son rutinarios y no se considera que requieran experimentación indebida, dada la información proporcionada en la presente memoria.

Los antígenos de esta invención pueden caracterizarse mediante medidas inmunológicas incluyendo, sin limitación, transferencia Western, determinaciones de masa macromolecular mediante determinaciones biofísicas tales como SDS-PAGE/tinción, HPLC y similares, ensayos de reconocimiento de anticuerpo, ensayos de reconocimiento de células T, ensayos de unión de MHC y ensayos para inferir la protección inmune o patología inmune mediante transferencia adoptiva de células, proteínas o anticuerpos.

El antígeno de superficie P39.5 proteico descrito en la presente memoria (así como sus variantes o análogos de origen natural en otra especie de Borrelia o las otras proteínas similares a Vls identificadas en la presente memoria) puede aislarse en forma de una proteína intacta completa o un polipéptido o fragmento de la misma. En una realización, P39.5 se aísla mediante procedimientos de inmunotransferencia según su masa molecular respectiva, como se describe a continuación en el ejemplo 5. Dicho aislamiento proporciona el antígeno en una forma sustancialmente libre de otros materiales proteicos y no proteicos del microorganismo y del vector garrapata. Las moléculas que comprenden los polipéptidos y antígenos de Borrelia de esta invención pueden aislarse de la espiroqueta y purificarse adicionalmente utilizando cualquiera de una variedad de métodos convencionales incluyendo: cromatografía líquida tal como en fase normal o inversa, utilizando HPLC, FPLC y similares; cromatografía de afinidad (tal como con ligandos inorgánicos o anticuerpos monoclonales); cromatografía de exclusión por tamaño; cromatografía de quelato de metal inmovilizado; electroforesis en gel y similares. Un experto en la técnica puede seleccionar las técnicas de aislamiento y purificación más apropiadas sin apartarse del alcance de esta invención.

Como alternativa, las secuencias aminoacídicas de P39.5 o las otras proteínas de Borrelia de esta invención pueden producirse recombinantemente siguiendo técnicas de ingeniería genética convencionales [véanse, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente, y la descripción detallada siguiente de preparación de las proteínas].

i. Análogos/antígenos modificados

Se describen también en la presente memoria análogos o versiones modificadas de la proteína P39.5 o las proteínas similares a vls P1-1, P3-1, P6-1, P7-1, P9-1 y P12-1, proporcionadas en la presente memoria. Típicamente, dichos análogos difieren de las proteínas identificadas específicamente por sólo uno a cuatro cambios de codón. Los ejemplos incluyen polipéptidos con variaciones aminoacídicas menores de las secuencias aminoacídicas parciales ilustradas de, por ejemplo P7-1 (SEQ ID NO: 2), en particular, sustituciones aminoacídicas conservativas. Las sustituciones conservativas son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales y propiedades químicas. Se describen también en la presente memoria homólogos de las proteínas de la invención, que se caracterizan por tener al menos un 85% de identidad con la SEQ ID NO: 2 o con las secuencias de las proteínas similares a vls. Basándose en la información de secuencia proporcionada en la presente memoria, un experto en la técnica puede obtener fácilmente P7-1 completa u homólogos y análogos de P7-1, así como homólogos y análogos de proteína similar a vls completa 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 y 12-1 de otra especie bacteriana.

Puede modificarse también un antígeno de la presente invención para aumentar su inmunogenicidad. Por ejemplo, el antígeno puede acoplarse a compuestos químicos o vehículos inmunogénicos, a condición de que el acoplamiento no interfiera con la actividad biológica deseada del antígeno o el vehículo. Para una revisión de algunas consideraciones generales de estrategias de acoplamiento, véase "Antibodies, A Laboratory Manual", "Cold Spring Harbor Laboratory", ed. E. Harlow y D. Lane (1988). Los vehículos inmunogénicos útiles conocidos en la técnica incluyen, sin limitación, hemocianina de lapa bocallave (KLH); albúmina de suero bovino (BSA); ovoalbúmina (PPD) (derivado proteico purificado de tuberculina); glóbulos rojos; toxoide del tétanos; toxoide del cólera; perlas de agarosa; carbono activado o bentonita. Los compuestos químicos útiles para acoplar incluyen, sin limitación, grupos dinitrofenol y ácido arsonílico.

El antígeno puede modificarse también mediante otras técnicas tales como desnaturalización con calor y/o SDS.

ii. Fragmentos/mutantes de deleción

Están abarcados adicionalmente por esta invención fragmentos adicionales del polipéptido P39.5, el péptido P7-1 o las otras proteínas similares a vls identificadas en la presente memoria. Dichos fragmentos se caracterizan deseablemente por tener una actividad biológica similar a la exhibida por la proteína completa incluyendo, por ejemplo, la capacidad de inducir anticuerpos del agente causante de la enfermedad de Lyme. Estos fragmentos pueden diseñarse u obtenerse con cualquier longitud deseada, incluyendo tan pequeños como de aproximadamente 5-8 aminoácidos de longitud. Dicho fragmento puede representar un epítopo de la proteína.

Las repeticiones internas de P39.5 (véase la Fig. 2) indican que esta proteína, como OspA, puede experimentar recombinaciones homólogas en Borrelia que pueden conducir a mutantes que expresan versiones acortadas parcialmente suprimidas del gen. Por tanto, la proteína P7-1 [SEQ ID NO: 2] de la invención puede modificarse para crear mutantes de deleción, por ejemplo, mediante truncado en las terminaciones amino o carboxi, o mediante eliminación de uno o más aminoácidos. Los mutantes de deleción de P7-1 creados mediante recombinación homóloga de sus secuencias repetidas (Fig. 2) están también abarcados por esta invención, así como las secuencias de ADN que los codifican. En ciertos mutantes de deleción, se suprimen porciones de la región de codificación de P39.5 descritas anteriormente, por ejemplo, regiones IIa, IIB y B.

Los mutantes de deleción de los antígenos P39.5 que, como P39.5 y al contrario que OspA, se expresan in vivo, probablemente se destruirán tras la infección del hospedador vertebrado. La mayoría de los mutantes de deleción de OspA escapan a la destrucción con anticuerpo anti-OspA en ausencia de complemento, pero son destruidos por este anticuerpo y el complemento actuando conjuntamente. Puesto que el anticuerpo anti-OspA destruye espiroquetas en el intestino medio de la garrapata (donde se expresa OspA, pero el complemento probablemente no es activo), los mutantes de deleción de OspA pueden escapar al anticuerpo anti-OspA desencadenado por la vacuna de OspA. En contraposición, puesto que P39.5 se expresa in vivo, donde el complemento y el anticuerpo anti-P39.5 están ambos presentes, los mutantes de deleción de P39.5 no pueden escapar a una vacuna basada en P39.5.

Pueden prepararse todavía otros fragmentos modificados de P39.5, P1-1, P3-1, P6-1, P7-1, P9-1 o P12-1 mediante cualquier número de técnicas ahora convencionales para mejorar la producción de los mismos, para potenciar la estabilidad de las proteínas u otras características, por ejemplo, la actividad de unión o biodisponibilidad, o para conferir alguna otra propiedad deseada a la proteína. Pueden prepararse fácilmente otros fragmentos útiles de estos polipéptidos por un experto en la técnica utilizando técnicas conocidas tales como mutagénesis de deleción y expresión.

iii. Proteínas de fusión o multiméricas y composiciones

Pueden construirse también la proteína P39.5 o fragmentos de la misma, así como las proteínas de serie de módulos similares a vls o fragmentos de las mismas, utilizando técnicas de ingeniería genética convencionales, como parte de una proteína mayor y/o multimérica o composiciones proteicas. Los antígenos de esta invención pueden estar en combinación con proteínas de superficie externa de B. burgdorferi tales como OspA, OspB, OspC, así como BmpA, B, C, o diversos fragmentos de los antígenos descritos en la presente memoria, pueden estar en combinación entre sí. En dicha combinación, el antígeno puede estar en forma de una proteína de fusión. El antígeno de la invención puede estar opcionalmente fusionado con un polipéptido o proteína seleccionado, por ejemplo, los antígenos de Borrelia OspA, OspB, OspC BmpA, BmpB, BmpC, otros antígenos de Borrelia y proteínas o péptidos derivados de otros microorganismos. Por ejemplo, un antígeno o polipéptido de esta invención puede estar fusionado en su terminación N o terminación C con polipéptido OspA o polipéptido OspB o polipéptido OspC o con un polipéptido no OspA no OspB o combinaciones de los mismos. Los polipéptidos OspA y OspB que pueden ser útiles con este fin incluyen polipéptidos identificados en la técnica anterior [véase, por ejemplo, el documento PCT/US91/04056] y variantes de los mismos. Los polipéptidos no OspA no OspB que pueden ser útiles con este fin incluyen polipéptidos de la invención y aquellos identificados en la técnica anterior, incluyendo la proteína OspC de B. burgdorferi, la proteína asociada a flagelos y fragmentos de la misma, otras proteínas de B. burgdorferi y fragmentos de las mismas y proteínas no B. burgdorferi y fragmentos de las mismas.

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Se proporciona todavía otra proteína de fusión de esta invención expresando la molécula de ADN formada por la secuencia de ADN de P39.5 o un fragmento de la misma fusionado con fragmentos de ADN que son homólogos (25-95% de identidad) de P39.5. Un ejemplo de dicha proteína comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 2, con la que se fusionan fragmentos aminoacídicos que son hasta un 95% idénticos a esa secuencia. Estos fragmentos pueden insertarse en cualquier orden y pueden contener secuencias repetidas tales como las representadas en la Fig. 2. Estas largas series de ADN que forman un marco de lectura abierto único pueden construirse a partir de homólogos de P39.5, incluyendo P39.5, o derivarse de los marcos de lectura abiertos largos de origen natural tales como una o más de las proteínas de módulo vls. Las proteínas de módulo vls de B. garinii (por ejemplo, las proteínas designadas P1-1, P3-1, P6-1, P9-1 y/o P12-1) pueden fusionarse entre sí y/o insertarse en la secuencia de ADN de P39.5 o P7-1, creando así una molécula de ADN grande que expresa una proteína que puede estimular una variedad de especificidades de anticuerpo.

Estas proteínas de fusión que comprenden múltiples polipéptidos de esta invención se construyen para uso en los métodos y composiciones de esta invención. Estas proteínas de fusión o proteínas multiméricas pueden producirse recombinantemente, o pueden sintetizarse químicamente. Pueden incluir también los polipéptidos de esta invención fusionados o acoplados a restos distintos de aminoácidos, incluyendo lípidos y carbohidratos. Además, los antígenos de esta invención pueden emplearse en combinación con otros agentes de vacuna de Borrelia descritos en la técnica anterior, así como con otras especies de agentes de vacuna derivados de otros virus. Dichas proteínas son eficaces en la prevención, el tratamiento y el diagnóstico de la enfermedad de Lyme causada por un amplio espectro de aislamientos de B. burgdorferi.

Una composición proteica que puede ser una alternativa preferida a las proteínas de fusión descritas anteriormente es un cóctel (concretamente una mezcla sencilla) que contiene diferentes proteínas o fragmentos de P39.5, o diferentes mezclas de las proteínas de serie de módulos de esta invención. Es probable que dichas mezclas de estas proteínas o fragmentos antigénicos de las mismas sean útiles en la generación de anticuerpos deseados de B. garinii.

iv. Sales

Puede utilizarse también un antígeno de la presente invención en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Los ácidos y bases adecuados que son capaces de formar sales con los polipéptidos de la presente invención son bien conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen ácidos y bases inorgánicos y orgánicos.

II. Métodos de preparación de antígenos y secuencias de ácido nucleico de la invención A. Expresión in vitro

Para producir P7-1 recombinante y/u otras proteínas de serie de módulos u otros fragmentos de P39.5 de esta invención, se insertan las secuencias de ADN de la invención en un sistema de expresión adecuado. Deseablemente, se construye una molécula o vector recombinante en el que la secuencia polinucleotídica que codifica la proteína seleccionada, por ejemplo P7-1, está ligada operativamente a una secuencia de control de expresión heteróloga que permite la expresión de la proteína. Son conocidos en la técnica de expresión de proteínas numerosos tipos de vectores de expresión adecuados mediante técnicas de biología molecular estándar. Dichos vectores se seleccionan de entre los tipos de vector convencionales incluyendo sistemas de expresión de insectos, por ejemplo, expresión de baculovirus, o de levadura, fúngica, bacterial o vírica. Pueden utilizarse con este fin también otros vectores de expresión apropiados, de los que son conocidos numerosos tipos en la técnica. Los métodos para obtener dichos vectores de expresión son bien conocidos. Véase Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1989); Miller et al., Genetic Engineering 8: 277-298 (Plenum Press, 1986) y las referencias citadas en los mismos.

Las células hospedadoras o estirpes celulares adecuadas para transfección mediante este método incluyen células bacterianas. Preferiblemente, al menos para uso de la proteína P39.5, que se cree que es una lipoproteína (por ejemplo, véase el ejemplo 5), la proteína seleccionada se expresa en bacterias, que tienen la maquinaria celular para unir lípidos. Este sistema de expresión es especialmente preferido cuando la proteína se va a expresar para uso como vacuna o producto terapéutico. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, MC1061 y las cepas utilizadas en los siguientes ejemplos) son bien conocidas como células hospedadoras en el campo de la biotecnología. Se van a emplear también en este método diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas, Streptomyces y otros bacilos y similares.

Muchas cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la técnica están también disponibles como células hospedadoras para expresión de los polipéptidos de la presente invención. Pueden emplearse también otras células fúngicas como sistemas de expresión. Aunque la levadura puede lipidar también proteínas, el patrón de lipidación puede ser diferente que en bacterias, concretamente, diferentes de la proteína nativa.

Se utilizan células de mamífero tales como células 293 humanas, células de ovario de hámster chino (CHO), la estirpe celular COS-1 de mono o células 3T3 de múrido derivadas de ratones Swiss, Balb-C o NIH. Otra estirpe celular de mamífero adecuada es la estirpe celular CV-1. Son conocidas en la técnica todavía otras células hospedadoras de mamífero adecuadas, así como métodos para transfección, cultivo, amplificación, examen, producción y purificación [véanse, por ejemplo, Gething y Sambrook, Nature, 293: 620-625 (1981) o, como alternativa, Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 5 (7): 1750-1759 (1985) o Howley et al., Patente de EE.UU. 4.419.446].

Como alternativa, pueden utilizarse células de insecto tales como células de Spodoptera frugiperda (Sf9).

Por tanto, puede producirse una proteína recombinante de Borrelia, por ejemplo, P7-1 u otras proteínas de serie de módulos, mediante un método que implica transfectar, por ejemplo mediante medios convencionales tales como electroporación, una célula hospedadora con al menos un vector de expresión que contiene un polinucleótido de la invención bajo el control de una secuencia reguladora transcripcional. La célula hospedadora transfectada o transformada se cultiva después en condiciones que permiten la expresión de la proteína. Se recupera la proteína expresada, se aísla y opcionalmente se purifica de la célula (o del medio de cultivo, si se expresa extracelularmente) mediante medios apropiados conocidos por el experto en la técnica.

Por ejemplo, se aíslan las proteínas en forma soluble después de lisis celular, o se extraen utilizando técnicas conocidas, por ejemplo, en clorhidrato de guanidina. Si se desea, las proteínas o fragmentos de la invención se producen en forma de una proteína de fusión. Dichas proteínas de fusión son aquellas descritas anteriormente. Como alternativa, por ejemplo, puede ser deseable producir proteínas de fusión para potenciar la expresión de la proteína en una célula hospedadora seleccionada, para mejorar la purificación, o para uso en la monitorización de la presencia de la proteína deseada, por ejemplo P7-1, en tejidos, células o extractos celulares. Los asociados de fusión adecuados para las proteínas de la invención son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, entre otros, \beta-galactosidasa, glutation-S-transferasa y poli-histidina.

B. Expresión in vivo

Como alternativa, cuando se desea expresar in vivo P7-1 u otra proteína de serie de módulos de la invención (entera o un fragmento deseable), por ejemplo, para inducir anticuerpos o como vacuna de ADN, se selecciona fácilmente un vector apropiado para suministro por un experto en la técnica. Los vectores ejemplares para suministro génico in vivo están fácilmente disponibles a partir de una variedad de fuentes académicas y comerciales e incluyen, por ejemplo, virus adenoasociados [Solicitud de Patente Internacional nº PCT/US91/03440], vectores de adenovirus [M. Kay et al., Prog. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2353 (1994); S. Ishibashi et al., J. Clin. Invest. 92: 883 (1993)] u otros vectores virales, por ejemplo, diversos poxvirus, vaccinia, etc. Los métodos para inserción de un gen deseado, por ejemplo P7-1, y obtención de la expresión in vivo de la proteína codificada son bien conocidos por los expertos en la técnica.

III. Anticuerpos de la invención

La presente invención proporciona también anticuerpos capaces de reconocer y unirse a los antígenos aislados o modificados o multiméricos de esta invención, incluyendo anticuerpos derivados de mezclas de dichos antígenos o fragmentos de los mismos. Estos anticuerpos son útiles en el diagnóstico de la enfermedad de Lyme y en composiciones terapéuticas para tratar seres humanos y/o animales que dan positivo o, antes del ensayo, exhiben síntomas de la enfermedad de Lyme. Los anticuerpos son útiles en diagnóstico solos o en combinación con anticuerpos de otros antígenos de esta invención, así como anticuerpos de otros antígenos de B. burgdorferi conocidos. Estos anticuerpos son también útiles en composiciones de vacuna pasiva.

Los anticuerpos de esta invención se generan por medios convencionales utilizando los antígenos aislados, recombinantes o modificados de esta invención, o mezclas de dichos antígenos o fragmentos antigénicos. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales se generan estimulando convencionalmente el sistema inmune de un animal o ser humano seleccionado con el antígeno aislado o mezcla de proteínas o péptidos antigénicos de esta invención, permitiendo que el sistema inmune produzca anticuerpos naturales de los mismos, y recogiendo estos anticuerpos de la sangre animal o humana u otro fluido biológico.

Por ejemplo, se produce un anticuerpo según la invención administrando a un hospedador vertebrado el antígeno o composición antigénica de esta invención, por ejemplo, P7-1. Preferiblemente, se utiliza una versión recombinante de P7-1 (rP7-1) como inmunógeno. Un anticuerpo policlonal adecuado contra el antígeno P7-1 destruye espiroquetas IP90 in vitro mediante destrucción dependiente de anticuerpo mediada por complemento (ADCK) independientemente de si el anticuerpo se obtuvo: (1) mediante purificación de afinidad utilizando como inmunoabsorbente antígeno P39.5 nativo de espiroquetas IP90 (separado en una transferencia Western; véase la Fig. 6) y como fuente de anticuerpo el antisuero generado durante una infección de monos Rhesus con espiroquetas JD1 o, (2) mediante inmunización de ratones con P7-1 recombinante de IP90 (rP7-1).

Por tanto, se aísla un anticuerpo de la invención purificando por afinidad antisuero generado durante una infección de un animal vertebrado, por ejemplo un mono Rhesus, con espiroquetas JD1, utilizando como inmunoabsorbente el antígeno P39.5 nativo de IP90, o una o más de las proteínas de serie de módulos identificadas en la presente memoria. De forma similar, se aísla un anticuerpo de la invención inmunizando ratones con un antígeno recombinante purificado de esta invención, o una P39.5 aislada purificada de origen nativo. Se generan también anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra P39.5. Se generan estirpes celulares de hibridoma que expresan mAb deseables mediante técnicas convencionales bien conocidas, por ejemplo, Kohler y Milstein, y las muchas modificaciones conocidas de las mismas. Se generan anticuerpos de título alto similarmente deseables aplicando técnicas recombinantes conocidas a los anticuerpos monoclonales o policlonales desarrollados de estos antígenos [véanse, por ejemplo, Solicitud de Patente PCT nº PCT/GB85/00392; publicación de Solicitud de Patente Británica nº GB2188638A; Amit et al., Science 233: 747-753 (1986), Queen et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989); Solicitud de Patente PCT nº PCT/WO9007861; y Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1988)a].

Dada la descripción contenida en la presente memoria, un experto en la técnica puede generar anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos dirigidos contra P39.5 o las proteínas de módulo, o fragmentos antigénicos de las mismas, recurriendo a técnicas conocidas mediante la manipulación de las regiones determinantes de la complementariedad de anticuerpos animales o humanos del antígeno de esta invención. Véase, por ejemplo, E. Mark y Padlin, "Humanization of Monoclonal Antibodies", capítulo 4, "The Handbook of Experimental Pharmacology", vol. 113, "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", Springer-Verlag (junio de 1994).

Como alternativa, los antígenos se ensamblan en forma de complejos multiantigénicos [véase, por ejemplo, Solicitud de Patente Europea 0339695, publicada el 2 de Noviembre de 1989] o en forma de mezclas simples de proteínas/péptidos antigénicos y se emplean para desencadenar anticuerpos de título alto capaces de unirse al (a los) antíge-
no(s) seleccionado(s) a medida que aparecen en los fluidos biológicos de un animal o ser humano infectado.

Se proporcionan adicionalmente por la presente invención anticuerpos antiidiotípicos (Ab2) y anticuerpos anti-antiidiotípicos (Ab3). Los Ab2 son específicos de la diana a la que se unen los anticuerpos anti-P39.5 de la invención, y los Ab3 son similares a los anticuerpos P39.5 (Ab1) en sus especificidades de unión y actividades biológicas [véase, por ejemplo, M. Wettendorff et al., "Modulation of anti-tumor immunity by anti-idiotypic antibodies" en "Idiotypic Network and Diseases", ed. por J. Cerny y J. Hiernaux, J. Am. Soc. Microbiol., Washington DC, pág. 203-229 (1990)]. Estos anticuerpos antiidiotípicos y anti-antiidiotípicos se producen utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Dichos anticuerpos antiidiotípicos (Ab2) pueden portar la imagen interna de P39.5, las proteínas de módulo, o fragmentos de las mismas, y por tanto son útiles con los mismos fines que P39.5, las proteínas de módulo o los fragmentos.

En general, los antisueros policlonales, anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos que se unen al antígeno seleccionado (Ab1) son útiles para identificar epítopos de P39.5 o las proteínas de módulo para separar P39.5 (o las proteínas de módulo) y análogos de las mismas de los contaminantes en el tejido vivo (por ejemplo, en columnas cromatográficas y similares), y en general como herramientas de investigación y como material de partida esencial para el desarrollo de otros tipos de anticuerpos descritos anteriormente. Los anticuerpos antiidiotípicos (Ab2) son útiles por unirse a la misma diana y, por tanto, pueden utilizarse en lugar del antígeno original, por ejemplo P39.5, para inducir una respuesta inmune. Los anticuerpos Ab3 son útiles por la misma razón que los Ab1 son útiles. Se contemplan también otros usos como herramientas de investigación y como componentes para la separación de P39.5 o las proteínas de módulo de otros contaminantes, por ejemplo, para los anticuerpos descritos anteriormente.

Para uso en ensayos de diagnóstico, los anticuerpos están asociados a marcajes convencionales que son capaces, solos o concertadamente con otras composiciones o compuestos, de proporcionar una señal detectable. Cuando se emplea más de un anticuerpo en un método de diagnóstico, los marcajes son deseablemente interactivos para producir una señal detectable. Lo más deseablemente, el marcaje es detectable visualmente, por ejemplo, colorimétricamente. Se han descrito en la técnica una variedad de sistemas enzimáticos que funcionarán revelando una señal colorimétrica en un ensayo. Como ejemplo, la glucosa oxidasa (que utiliza glucosa como sustrato) libera peróxido como producto. La peroxidasa, que reacciona con peróxido y un donante de hidrógeno tal como tetrametilbenzidina (TMB), produce una TMB oxidada que se observa como un color azul. Otros ejemplos incluyen peroxidasa de rábano picante (HRP) o fosfatasa alcalina (AP) y hexoquinasa junto con glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, que reacciona con ATP, glucosa y NAD+ proporcionando, entre otros productos, NADH, que se detecta como un aumento de la absorbancia a 340 nm de longitud de onda. Otros sistemas de marcaje que pueden utilizarse en los métodos de esta invención son detectables por otros medios, por ejemplo, micropartículas de látex coloreadas [Bangs Laboratories, Indiana] en las que se embeben tinte y pueden utilizarse en lugar de enzimas para formar conjugados con los anticuerpos y proporcionar una señal visual indicativa de la presencia del complejo resultante en ensayos aplicables. Todavía otros marcajes incluyen compuestos fluorescentes, compuestos o elementos radiactivos. Los marcajes detectables para unión a anticuerpos útiles en ensayos de diagnóstico de esta invención pueden seleccionarse fácilmente de entre numerosas composiciones conocidas y fácilmente disponibles para un experto en la técnica de los ensayos de diagnóstico. Los métodos y anticuerpos de esta invención no están limitados por el marcaje detectable o sistema de marcaje particular empleado.

IV. Métodos y ensayos de diagnóstico

La presente invención proporciona también métodos de diagnóstico de la enfermedad de Lyme. Estos métodos de diagnóstico son útiles para diagnosticar a seres humanos o animales que exhiben los síntomas clínicos, o se sospecha que los tienen, de enfermedad de Lyme.

En una realización, este método de diagnóstico implica detectar la presencia de anticuerpos anti-P39.5 de origen natural que se producen por el sistema inmune del paciente humano o animal infectado en sus fluidos biológicos, y que son capaces de unirse a los antígenos de esta invención o combinaciones de los mismos. Este método comprende las etapas de incubar un antígeno P39.5 o un antígeno de serie de módulos de esta invención con una muestra de fluidos biológicos del paciente. Los anticuerpos presentes en los fluidos como resultado de infección por B. burgdorferi formarán un complejo anticuerpo-antígeno con el antígeno. Posteriormente, se analiza la mezcla de reacción para determinar la presencia o ausencia de estos complejos antígeno-anticuerpo. La etapa de análisis de la mezcla de reacción comprende poner en contacto la mezcla de reacción con un asociado de unión marcado específico del anticuerpo.

En una realización similar, este método de diagnóstico implica detectar la presencia de anticuerpos anti-P1-1, anti-P3-1, anti-P6-1, anti-P7-1, anti-P9-1 y/o anti-P12-1 de origen natural que se producen por el sistema inmune del paciente humano o animal infectado en sus fluidos biológicos, y que son capaces de unirse a los antígenos de esta invención o combinaciones de los mismos. Este método comprende las etapas de incubar uno o preferiblemente una mezcla de estos antígenos de esta invención con una muestra de fluidos biológicos del paciente. Los anticuerpos presentes en los fluidos como resultado de la infección por B. burgdorferi formarán complejos anticuerpo-antígeno con el(los) antígeno(s). Posteriormente, la mezcla de reacción se analiza para determinar la presencia o ausencia de estos complejos antígeno-anticuerpo. La etapa de análisis de la mezcla de reacción comprende poner en contacto la mezcla de reacción con un asociado de unión marcado específico del anticuerpo.

En una realización del método, se somete a electrotransferencia o transferencia puntual el antígeno purificado, fragmento o mezcla de antígenos sobre papel de nitrocelulosa. Posteriormente, se incuba el fluido biológico (por ejemplo, suero o plasma) con el antígeno transferido, y se deja unir el anticuerpo en el fluido biológico con el(los) antígeno(s). El anticuerpo unido se detecta después mediante métodos inmunoenzimáticos estándar.

En otra realización del método, se conjugan perlas de látex con el(los) antígeno(s) de esta invención. Posteriormente, se incuba el fluido biológico con el conjugado perla/proteína, formando así una mezcla de reacción. Se analiza después la mezcla de reacción para determinar la presencia de los anticuerpos.

En otra realización, el método de diagnóstico implica detectar la presencia de P39.5 de origen natural o antíge-
no(s) de serie de módulos mismo(s) en su asociación con el patógeno de Borrelia en los fluidos biológicos de un animal o ser humano infectado por el patógeno. Este método incluye las etapas de incubar un anticuerpo de esta invención (por ejemplo, producido administrando a un ser humano y/o animal adecuado un antígeno de esta invención, preferiblemente marcado convencionalmente para detección) con una muestra de fluidos biológicos de un ser humano o un animal que se va a diagnosticar. En presencia de infección por Borrelia del paciente humano o animal, se forma un complejo antígeno-anticuerpo (aparece unión específica). Posteriormente, se retira opcionalmente el anticuerpo marcado en exceso, y se analiza la mezcla de reacción para determinar la presencia o ausencia del complejo antígeno-anticuerpo y la cantidad de marcaje asociado al mismo.

Los ensayos que emplean un antígeno proteico de la invención pueden ser heterogéneos (concretamente, requieren una etapa de separación) u homogéneos. Si el ensayo es heterogéneo, puede emplearse una variedad de medios de separación, incluyendo centrifugación, filtración, cromatografía o magnetismo.

Un ensayo preferido para el examen de productos sanguíneos u otros fluidos fisiológicos o biológicos es un ensayo de inmunosorción ligado a enzima, concretamente un ELISA. Típicamente, en un ELISA se adsorbe el(los) antíge-
no(s) aislado(s) de la invención en la superficie de un pocillo de microvaloración directamente o mediante una matriz de captura (concretamente, anticuerpo). Los sitios de unión a proteína residuales en la superficie se bloquean después con un agente apropiado tal como albúmina de suero bovino (BSA), suero de cabra normal termoinactivado (NGS) o BLOTTO (una solución tamponada de leche desgrasada desecada que contiene también un conservante, sales y un agente antiespumante). Se incuba después el pocillo con una muestra biológica sospechosa de contener anticuerpo anti-B. burgdoferi específico. La muestra puede aplicarse pura o, más a menudo, puede diluirse, habitualmente en una solución tamponada que contiene una pequeña cantidad (0,1-5,0% en peso) de proteína tal como BSA, NGS o BLOTTO. Después de incubar durante un periodo de tiempo suficiente para dejar que ocurra una unión específica, se lava el pocillo para retirar la proteína no unida y después se incuba con inmunoglobulina anti-humana marcada (\alpha-Hulg) o anticuerpos marcados de otra especie, por ejemplo, perros. El marcaje puede elegirse de una variedad de enzimas, incluyendo peroxidasa de rábano picante (HRP), \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina y glucosa oxidasa, como se describe anteriormente. Se deja suficiente tiempo para que ocurra de nuevo la unión específica, después se lava el pocillo de nuevo para retirar el conjugado no unido y se añade el sustrato para la enzima. Se deja desarrollar el color y se determina visual o instrumentalmente la densidad óptica de los contenidos del pocillo.

Adicionalmente, pueden unirse a placas de ELISA mAb u otros anticuerpos de esta invención que son capaces de unirse al(a los) antígeno(s). En otro método de diagnóstico, se incuba el fluido biológico en la placa unida a anticuerpo y se lava. La detección de cualquier complejo antígeno-anticuerpo, y la medida cualitativa del mAb marcado, se realiza convencionalmente como se describe anteriormente.

Otros formatos de ensayo útiles incluyen el vaso de filtración y la varilla de inmersión. En el primer ensayo, se fija un anticuerpo de esta invención a un filtro de vidrio sinterizado en la abertura de una tapa pequeña. Se pasa a través del filtro el fluido o muestra biológico (5 ml). Si está presente el antígeno (concretamente, infección por B. burgdorferi), se unirá al filtro que se visualiza después mediante un segundo anticuerpo/detector. El ensayo de varilla de inmersión implica fijar un antígeno o anticuerpo a un filtro, que se sumerge después en el fluido biológico, se seca y se examina con una molécula detectora.

Otros ensayos de diagnóstico pueden emplear el(los) antígeno(s) o fragmentos de esta invención como sondas de ácido nucleico o secuencias antisentido, que pueden identificar la presencia de infección en el fluido biológico mediante hibridación con secuencias complementarias producidas por el patógeno en los fluidos biológicos. Dichas técnicas tales como PCR, hibridaciones Northern o Southern, etc., son bien conocidas en la técnica.

Debe entenderse por un experto en la técnica que pueden diseñarse cualquier número de formatos de ensayo de proteína convencionales, particularmente formatos de inmunoensayo, o formatos de ensayo de ácido nucleico, para utilizar los antígenos aislados y anticuerpos o sus secuencias de ácido nucleico o secuencias antisentido de esta invención para la detección de infección por Borrelia en animales y seres humanos. Esta invención no está por tanto limitada por la selección del formato de ensayo particular, y se cree que abarca formatos que son conocidos por los expertos en la técnica.

V. Kits de diagnóstico

Por conveniencia, los reactivos para ELISA u otros ensayos descritos en la presente memoria pueden proporcionarse en forma de kits. Dichos kits son útiles para diagnosticar infección por Borrelia en una muestra humana o animal. Dicho kit de diagnóstico contiene un antígeno de esta invención y/o al menos un anticuerpo capaz de unirse a un antígeno de esta invención, o a las secuencias de ácido nucleico que lo codifican, o a sus secuencias antinsentido. Como alternativa, dichos kits pueden contener una mezcla simple de dichos antígenos o secuencias, o medios para preparar una mezcla simple.

Estos kits pueden incluir placas de microvaloración a las que se han preadsorbido las proteínas o anticuerpos de antígeno de Borrelia o secuencias de ácido nucleico de la invención, diversos diluyentes y tampones, conjugados marcados para la detección de antígenos o anticuerpos unidos específicamente, o ácidos nucleicos y otros reactivos generadores de señal tales como sustratos enzimáticos, cofactores y cromógenos. Otros componentes de estos kits pueden determinarse fácilmente por un experto en la técnica. Dichos componentes pueden incluir anticuerpos de captura policlonal o monoclonal, antígeno de esta invención o un cóctel de dos o más de los anticuerpos, extractos purificados o semipurificados de estos antígenos como patrones, anticuerpos detectores de mAb, un anticuerpo anti-ratón o anti-humano con molécula indicadora conjugada con el mismo, una placa ELISA preparada para absorción, cuadros indicadores para comparaciones colorimétricas, guantes desechables, instrucciones de descontaminación, varillas aplicadoras o recipientes, y un vaso de preparación de muestra. Dichos kits proporcionan un modo conveniente y eficaz para un laboratorio clínico de diagnosticar infección por Borrelia.

VI. Composiciones terapéuticas

Los antígenos, anticuerpos, secuencias de ácido nucleico o secuencias antisentido de la invención, solos o en combinación con otros antígenos, anticuerpos, secuencias de ácido nucleico o secuencias antisentido pueden utilizarse adicionalmente en composiciones terapéuticas y en métodos para tratar seres humanos y/o animales con enfermedad de Lyme. Por ejemplo, una de dichas composiciones terapéuticas puede formularse para contener un vehículo o diluyente y uno o más de anti-P7-1 u otro anticuerpo de proteína de serie de módulos de la invención. Los vehículos farmacéuticamente adecuados facilitan la administración de las proteínas, pero son fisiológicamente inertes y/o no nocivos.

Los vehículos pueden seleccionarse por un experto en la técnica. Los vehículos ejemplares incluyen solución salina estéril, lactosa, sucrosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo y agua. Adicionalmente, el vehículo o diluyente puede incluir un material retardador tal como monoestearato de glicerol o diestearato de glicerol solo o con una cera. Además, pueden utilizarse formulaciones poliméricas de liberación lenta.

Opcionalmente, esta composición puede contener también ingredientes farmacéuticos convencionales tales como conservantes o estabilizantes químicos. Los ingredientes adecuados que pueden utilizarse en una composición terapéutica junto con los anticuerpos incluyen, por ejemplo, casaminoácidos, sucrosa, gelatina, rojo fenol, N-Z amina, difosfato de monopotasio, lactosa, lactoalbúmina hidrolizada y lecha desecada.

Como alternativa, o además de los anticuerpos de la invención, se espera que otros agentes útiles en el tratamiento de la enfermedad de Lyme, por ejemplo, antibióticos o agentes inmunoestimulantes y elementos de regulación de citocinas, sean útiles en la reducción o eliminación de los síntomas de enfermedad. Los agentes que pueden utilizarse para suprimir o contrarrestar los supresores inmunes liberados por el vector garrapata de la espiroqueta deberían actuar ayudando a la inmunidad natural del ser humano o animal infectado. Por tanto, dichos agentes pueden funcionar concertadamente con las composiciones terapéuticas de esta invención. El desarrollo de composiciones terapéuticas que contienen estos agentes está dentro de la experiencia de la técnica a la vista de las enseñanzas de esta invención.

Pueden tratarse un ser humano o un animal de enfermedad de Lyme administrando una cantidad eficaz de dicha composición terapéutica. Una "cantidad eficaz" puede ser entre aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1.000 \mug/ml de un anticuerpo de la invención. Una dosificación adecuada puede ser de aproximadamente 1,0 ml de dicha cantidad eficaz. Dicha composición puede administrarse 1-3 veces al día durante un periodo de 1 día a 12 semanas. Sin embargo, pueden hacerse ajustes de la dosificación adecuada por el médico o veterinario a cargo dependiendo de la edad, sexo, peso y salud general del paciente humano o animal. Preferiblemente, dicha composición se administra por vía parenteral, preferiblemente intramuscular o subcutánea. Sin embargo, puede formularse también mediante cualquier otra vía adecuada, incluyendo oral o tópica.

VII. Composiciones de vacuna

No surge ninguno de los problemas potenciales de la técnica anterior con una vacuna basada en un antígeno que se expresa en el hospedador vertebrado. Puede proporcionarse una vacuna basada en antígeno de superficie mejorada para la prevención de la enfermedad de Lyme en seres humanos y otros animales mediante la inclusión del antígeno P39.5 de esta invención, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Esta composición de vacuna puede contener una o más de las formas aisladas, recombinantes, modificadas o multiméricas del antígeno P39.5 de la invención, o mezclas de los mismos. De forma similar, pueden emplearse sales de las proteínas antigénicas en dichas composiciones.

Otra realización de una composición de la presente invención está basada en los otros antígenos de serie de módulos, concretamente, P1-1, P3-1, P6-1, P7-1, P9-1 y P12-1. El inventor propone que el mecanismo de variación antigénica al que está sometido el antígeno vlsE indica que este antígeno es crucialmente importante para la supervivencia de espiroquetas en el hospedador vertebrado. Un nuevo método de vacuna implica evitar el mecanismo de defensa de espiroquetas inmunizando un hospedador con una gran fracción de los epítopos que están expresados en la serie de módulos que es la fuente misma de la variación. Esto se hace posible por el hecho único de que la mayoría de esta serie de módulos está dentro del marco. Los inventores han demostrado este concepto, como se describe en los ejemplos siguientes, inmunizando un hospedador con el antígeno de serie de módulos P7-1, e induciendo anticuerpo que destruye las espiroquetas. Por tanto, un método de vacunación implica por tanto administrar al hospedador varias o todas las proteínas clonadas y purificadas descritas anteriormente, que derivan de secciones antigénicamente distintas de la serie de módulos IP90. Aunque puede prepararse una variedad de composiciones inmunogénicas a partir de dichas proteínas, se prefiere actualmente emplear con este fin una mezcla simple de dos o más de las proteínas de serie de módulos o fragmentos peptídicos de las mismas.

Las combinaciones de antígeno(s) de esta invención con otros antígenos de B. burgdorferi tales como las proteínas OspA, OspB y OspC, proteínas BmpA, B, C o D, o fragmentos de las mismas, están también abarcadas en la presente memoria.

Los vehículos ejemplares son como se describen anteriormente para composiciones terapéuticas. Opcionalmente, la composición de vacuna puede contener adicionalmente coadyuvantes, conservantes, estabilizantes químicos u otras proteínas antigénicas. Típicamente, los estabilizantes, coadyuvantes y conservantes se optimizan para determinar la mejor formulación para eficacia en el ser humano o animal diana. Los conservantes ejemplares adecuados incluyen clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, parabenos, vainillina de etilo, glicerina, fenol y paraclorofenol.

Uno o más de los componentes de vacuna anteriormente descritos puede mezclarse o adsorberse con un coadyuvante convencional. El coadyuvante se utiliza para atraer leucocitos o potenciar una respuesta inmune. Dichos coadyuvantes incluyen, entre otros, Ribi, aceite mineral y agua, hidróxido de aluminio, Amphigen, avridina, L121/escualeno, D-lactida-polilactida/glicósido, polioles Pluronic, dipéptido de muramilo, Bordetella destruida y saponinas tales como Quil A. Además, una composición de vacuna de la invención puede comprender adicionalmente otros antígenos no B. burgdorferi, incluyendo Bordetella bronchiseptica, parvovirus canino, moquillo canino, rabia, Leptosporidia, coronavirus canino y adenovirus canino. Pueden incluirse también en estas composiciones otros antígenos de vacuna originarios de otras especies, por ejemplo, coronavirus felino, etc.

Un método profiláctico puede comportar administrar a un animal o ser humano una cantidad eficaz de dicha composición. Las composiciones antigénicas de P39.5 y/o proteína de serie de módulos se administran en una "cantidad eficaz", es decir, una cantidad de antígeno que es eficaz en una vía de administración para proporcionar un beneficio de vacuna, concretamente, inmunidad protectora. Pueden determinarse las cantidades adecuadas de antígeno por un experto en la técnica basándose en el nivel de respuesta inmune deseado. Sin embargo, en general, la composición de vacuna contiene entre 1 ng y 1.000 mg de antígeno y, más preferiblemente, 0,05 \mug a 1 mg por ml de antígeno. Las dosis adecuadas de composición de vacuna de la invención pueden determinarse fácilmente por un experto en la técnica. Generalmente, una dosis adecuada está entre 0,1 y 5 ml de la composición de vacuna. Adicionalmente, dependiendo del paciente humano o de la especie animal que se esté tratando, concretamente su peso, edad y salud general, la dosificación puede determinarse también fácilmente por un experto en la técnica.

En general, la vacuna se administrará una vez por estación. Cada estación de garrapatas, habitualmente en primavera, debe administrarse un recuerdo. La vacuna puede administrarse mediante cualquier vía adecuada. Sin embargo, la administración parenteral, particularmente intramuscular y subcutánea, es la vía preferida. Se prefiere también la vía de administración oral. Las vías de administración pueden combinarse, si se desea, o ajustarse.

Adicionalmente, la vacuna puede ser una vacuna de ADN, que incluye la secuencia de ADN de P7-1 o un fragmento de la misma, otra proteína de serie de módulos, o un fragmento de la misma, opcionalmente bajo el control de secuencias reguladoras. Por tanto, el ADN que codifica antígeno puede portarse en un vector, por ejemplo, un vector vírico. Generalmente, un tratamiento basado en vector adecuado contiene entre 1 x 10^{-3} ufp y 1 x 10^{12} ufp por dosis. Sin embargo, la dosis, momento y modo de administración de estas composiciones pueden determinarse por un experto en la técnica. Factores tales como edad y condición física del vacunado pueden tenerse en cuenta para determinar la dosis, momento y modo de administración de la composición inmunogénica o de vacuna de la invención.

VIII. Examen y desarrollo de fármacos

Las proteínas, anticuerpos y secuencias polinucleotídicas de la presente invención pueden utilizarse también en el examen y desarrollo de compuestos químicos o proteínas que tienen utilidad como fármacos terapéuticos o vacunas para el tratamiento o el diagnóstico o la prevención de la enfermedad de Lyme. Como ejemplo, un compuesto capaz de unirse a P39.5 y prevenir su actividad biológica puede ser un componente fármaco útil para el tratamiento o la prevención de la enfermedad de Lyme. Los métodos descritos en la presente memoria pueden aplicarse también a fragmentos de P39.5. De forma similar, un compuesto capaz de unirse a una proteína de serie de módulos, o fragmento de la misma, y que previene su actividad biológica puede ser un componente fármaco útil para el tratamiento o la prevención de la enfermedad de Lyme.

Los métodos de ensayo adecuados pueden determinarse fácilmente por un experto en la técnica. Cuando se desea, y dependiendo del ensayo seleccionado, puede(n) inmovilizarse el(los) antígeno(s) seleccionado(s), por ejemplo P39.5, directa o indirectamente (por ejemplo, mediante un anticuerpo anti-P39.5) sobre una superficie adecuada, por ejemplo, en un formato ELISA. Dichas superficies de inmovilización son bien conocidas. Por ejemplo, puede utilizarse una perla inerte humectable. Como alternativa, el antígeno seleccionado, por ejemplo P39.5, puede utilizarse en ensayos de examen que no requieran inmovilización, por ejemplo, en el examen de bibliotecas combinatorias. Existen ensayos y técnicas para el examen y desarrollo de fármacos capaces de unirse a un antígeno de esta invención, por ejemplo, P39.5 Éstos incluyen el uso del sistema de presentación en fagos para expresar la(s) proteína(s) antigénica(s) y utilizar un cultivo de E. coli transfectada u otro microorganismo para producir las proteínas para estudios de unión de compuestos de unión potencial. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en G. Cesarini, FEBS Letters, 307 (1): 66-70 (julio de 1992); H. Gram et al., J. Immunol. Meth., 161: 169-176 (1993); C. Summer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3756-3760 (mayo de 1992), incorporados como referencia a la presente memoria.

Pueden emplearse otras técnicas de examen de fármacos convencionales utilizando las proteínas, anticuerpos o secuencias polinucleotídicas de esta invención. Como ejemplo, un método para identificar compuestos que se unen específicamente a una proteína de esta invención, por ejemplo P39.5, puede incluir simplemente las etapas de poner en contacto una proteína P39.5 seleccionada con un compuesto de ensayo para permitir la unión del compuesto de ensayo a P39.5; y determinar la cantidad de compuesto de ensayo, si la hubiera, que se une a la proteína P39.5. Dicho método puede implicar la incubación del compuesto de ensayo y la proteína P39.5 inmovilizada sobre un soporte sólido. Pueden emplearse métodos similares para una o más de las proteínas de serie de módulos.

Típicamente, la superficie que contiene el ligando inmovilizado se permite entrar en contacto con una solución que contiene la proteína, y se mide la unión utilizando un sistema de detección apropiado. Los sistemas de detección adecuados incluyen el conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante y la conjugación directa con un marcador, por ejemplo, fluoresceína. Son bien conocidos otros sistemas por los expertos en la técnica. Esta invención no está limitada por el sistema de detección utilizado.

Otro método de identificar compuestos que se unen específicamente a P39.5 u otra proteína de esta invención puede incluir las etapas de poner en contacto la proteína, por ejemplo P39.5, inmovilizada sobre un soporte sólido, tanto con un compuesto de ensayo como una secuencia de proteína que es un receptor de P39.5, para permitir la unión del receptor a la proteína P39.5; y determinar la cantidad de receptor que se une a la proteína P39.5. La inhibición de la unión de la proteína normal por el compuesto de ensayo indica así la unión del compuesto de ensayo a la proteína P39.5. Pueden emplearse métodos similares para una o más de las proteínas de serie de módulos.

Por tanto, mediante el uso de dichos métodos, pueden proporcionarse compuestos que son capaces de interaccionar con P39.5 o porciones de la misma y/o proteína(s) de serie de módulos o porciones de la(s) misma(s) y potenciar o reducir la actividad biológica de la proteína, según se desee. Se cree que dichos compuestos están abarcados por esta invención. Dondequiera que se cite adicionalmente la proteína P39.5. anterior o posteriormente, puede sustituirse por P7-1 o una o más de las otras proteínas de serie de módulos.

Los siguientes Ejemplos ilustran los métodos preferidos para obtener antígenos proteicos de la invención y preparar los ensayos y composiciones de la invención. Significativamente, estos ejemplos indican que el antígeno P39.5 de esta invención es útil para el diagnóstico y la profilaxis de la enfermedad de Lyme, y puede mejorar la serología de Lyme. Estos ejemplos son sólo ilustrativos y no limitan el alcance de la invención.

Ejemplo 1

Cepas bacterianas y anticuerpos de Borrelia A. Cepas bacterianas

La cepa JD1 de B. burgdorferi en sentido estricto [J. Piesman et al., J. Clin. Microbiol. 25: 557-558 (1987) y T.G. Schwan et al., J. Clin. Microbiol. 27: 1734-1738 (1989)] se obtuvo del Center for Disease Control and Prevention, y se mantuvo en soluciones madre congeladas de pocas pasadas (<7). B31 es también una cepa de B. burgdorferi en sentido estricto obtenida a partir del CDC y mantenida como anteriormente. IP90 es una cepa de B. garinii que se proporcionó también por el CDC.

Los organismos B. burgdorferi se cultivaron a 34ºC en un medio de cultivo BSK-H (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo).

B. Anticuerpos de mono

Se incubaron espiroquetas vivas con anticuerpo sérico de monos Rhesus que se habían infectado con B. burgdorferi cepa JD1 por la picadura de ninfas de I. scapularis. Se retiraron los anticuerpos no unidos por lavado de las espiroquetas y se retiraron los anticuerpos unidos con un tampón de bajo pH. Se obtuvieron los anticuerpos de mono de tres fuentes:

a) de monos Rhesus infectados con B. burgdorferi cepa JD1 mediante inoculación por aguja,

b) de monos Rhesus infectados con B. burgdorferi cepa JD1 por exposición de los animales a ninfas de Ixodes scapularis infectadas con JD1,

c) mediante purificación por afinidad de espiroquetas vivas utilizando como material de partida antisuero que se recogió de animales inoculados por garrapatas del modo siguiente: se incubó un volumen de 800 \mul de muestras de suero diluido (1/40 en medio BSK-H) termoinactivado agrupadas a partir de 3 animales inoculados con garrapatas con 1 x 10^{9} bacterias vivas totales a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, se centrifugaron las muestras a 13.000 x g durante 15 minutos a 4ºC. Se readsorbió después el sobrenadante dos veces más como se describe anteriormente. Se lavó tres veces con BSK-H el sedimento bacteriano que se recuperó después de la primera adsorción para retirar los anticuerpos no unidos. Después del último lavado, se resuspendió el sedimento en 400-500 \mul de glicina-HCl 0,2 M, pH 2,2, NaCl 0,5 M, y se centrifugó. Se recuperó el sobrenadante y se llevó el pH a 7,00 mediante la adición de base Tris 2,0 M.

Ejemplo 2

Identificación preliminar de p39.5 de IP90

Se hicieron reaccionar los anticuerpos del Ejemplo 1, sección B, con transferencias Western de extractos completos de espiroquetas JD1, B31 e IP90. Las transferencias Western se realizaron del modo siguiente: se sometieron a electroforesis preparaciones antigénicas en minigeles de acrilamida al 15% (10 x 10 x 0,1 cm) con un gel de apilamiento de acrilamida al 5%. Se dispensaron por carril 20 \mul de lisado que contenía 7 x 10^{8} bacterias solubilizadas o 25 \mug de proteína (medida por DO a 280 nm) (el carril preparativo completo es igual a 16 carriles sencillos; por lo tanto, se cargaron 400 \mug de proteína en cada gel preparativo). Se realizó la electroforesis utilizando un aparato minigel (Integrated Separation Systems, Hyde Park, MA) a una corriente constante de 23 mA, con los tampones de U. Laemmli, Nature, 227: 680-685 (1970). Para inmunotransferencia, se electrotransfirieron las proteínas desde los geles de poliacrilamida a papel de nitrocelulosa (Schleicher and Schuell, Keene, NH) durante una noche a un voltaje constante de 22 V en una unidad de transferencia Mighty Small (Hoeffer Scientific Instruments, San Francisco, CA) como se describe por H. Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354 (1979). Se evaluó la eficacia de la transferencia tiñendo parte de la nitrocelulosa con oro coloidal (Integrated Separation Systems). Se bloquearon las membranas de nitrocelulosa con leche en polvo desgrasada al 3% (Carnation) preparada en PBS que contenía 0,05% de Tween-20 (Integrated Separation Systems) (PBS-T) durante 2 horas a temperatura ambiente.

Después de la etapa de bloqueo, se montaron las membranas en un Miniblotter 45 (Immunetics, Cambridge, MA) según las instrucciones del fabricante, y se introdujeron 110 \mul de cada muestra de suero diluida 1/50 con PBS-T en los canales del Miniblotter y se dejaron interaccionar con la membrana de nitrocelulosa durante 1 hora a temperatura ambiente en una plataforma agitada. Después de la incubación, se utilizó el sistema colector para lavar las membranas con PBS-T. En este punto, se desensambló el Miniblotter y se recogió la transferencia. Se realizó el resto de las etapas de incubación en bandejas pequeñas. Después del lavado, se incubaron las membranas durante 1 hora con anticuerpos de IgM anti-humana (específica de cadena \mu) e IgG (específica de cadena \gamma) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) biotinilados diluidos 1/200 en PBS-T. Se sondearon los anticuerpos biotinilados con un complejo de avidina/peroxidasa de rábano picante biotinilada (Vector) preparado según las instrucciones del fabricante. Se utilizó el reactivo 4-cloro-1-naftol (Sigma) como cromógeno. Se detuvo la reacción de color lavando las membranas con agua destilada.

Se preparó una transferencia Western (Fig. 6) de lisados de espiroquetas de B. burgdorferi cepas JD1 y B31 y B. garinii cepa IP90 desarrollados con suero de monos inoculados por aguja e inoculados por garrapatas con las espiroquetas JD1, y se separaron anticuerpos del último suero mediante purificación por afinidad de las espiroquetas JD1 vivas completas. El anticuerpo purificado por afinidad reconoció cuatro antígenos en transferencias Western de lisados completos de espiroquetas de B. burgdorferi JD1. Los antígenos se denominaron P1 (masa molecular relativa (Mr) 39-40.000), P2 (Mr 35-37.000), P3 (Mr 22-24.000) y P4 (Mr 18-19.000). Estos antígenos se reconocieron también, como se esperaba, por muestras de suero de animales inoculados por aguja y por suero de monos inoculados por garrapatas. Además, esta transferencia Western indicó que los anticuerpos purificados por afinidad reconocían lo que parecían ser P1, P2 y P4 en espiroquetas B31 y lo que parecía ser P1 (pero con una masa molecular ligeramente mayor) en B. garinii, así como un antígeno adicional de masa molecular relativa mayor. Estos dos últimos antígenos se reconocieron también exclusivamente por los sueros de los animales inoculados tanto por aguja como por garrapatas. P1 se identificó eventualmente como P39, también conocido como BmpA. El antígeno similar presente en espiroquetas IP90 se identificó provisionalmente como P39.5 y se mostró en la transferencia Western abordada anteriormente.

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Ejemplo 3

Destrucción dependiente de anticuerpo mediada por complemento de espiroquetas JD1, B31 E IP90

Se empleó suero de monos inoculados por garrapatas en un ensayo ADCK del modo siguiente. Se descongelan rápidamente muestras congeladas de B. burgdorferi a 37ºC, se cultivan hasta que hayan alcanzado la fase semilogarítmica (aproximadamente 3 días, 1-2 x 10^{7} espiroquetas/ml), se centrifugan a 8.000 x g durante 20 minutos, se resuspenden en medio BSK-H y se cuentan. Se llevó a cabo el ensayo de ADCK por duplicado en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos (Costar). Se añadieron un total de 5-6 x 10^{5} espiroquetas en 25 \mul de medio BSK-H a cada pocillo que contenía 50 \mul de muestras de suero termoinactivado (56ºC, 30 minutos) diluidas 1:10 en el mismo medio. Se incubaron las placas a 34ºC bajo una mezcla de gases de 3% de CO_{2}, 5% de O_{2} y el resto de N_{2} durante 20 minutos antes de la adición de 25 \mul de complemento (suero de mono normal). Después de 18-24 horas de incubación en las mismas condiciones, se cuantificaron los números totales de bacterias muertas (inmóviles) y vivas (móviles) con un microscopio de campo oscuro. La equivalencia entre inmovilidad y muerte en un ensayo similar se ha determinado antes [M. Aydintug et al., citado anteriormente]. Se consideró significativa la destrucción si el % medio de espiroquetas muertas supera en tres veces el valor del % medio de destrucción observado en presencia de suero
normal.

Se realizó la ADCK con espiroquetas de B. burgdorferi cepas JD1 y B31 y B. garinii cepa IP90 utilizando suero de animales que se inocularon por garrapatas con espiroquetas JD1. Como se muestra en el Ejemplo 2, este suero reconoció sólo dos antígenos en transferencias de IP90, uno de una masa molecular relativa similar a la de P1, y otro de una masa molecular relativa mayor. Como se muestra en la Fig. 1, se destruyeron por el suero las tres cepas de espiroquetas, indicando que al menos uno de los antígenos mostrado en la transferencia Western de IP90 era la diana de ADCK.

Ejemplo 4

Identificación de P39.5

Se investigó la identidad de la supuesta banda de BmpA (P39) observada en las transferencias Western de IP90. Se desarrolló una transferencia Western de lisados de JD1 e IP90 con anticuerpo monoclonal anti-flagelina (mAb); mAb anti-P39; anticuerpo policlonal anti-P39; mAb anti-P35; anti-BmpD policlonal y sueros de dos monos inoculados por garrapatas con espiroquetas JD1. En el análisis de transferencia Western comparativo de antígenos JD1 e IP90 que se procesaron en el mismo gel, ambos extractos antigénicos reaccionaron con el mAb anti-flagelina H9724. Sin embargo, un mAb anti-BmpA reaccionó sólo con BmpA de JD1 y el suero de mono inmunizado con BmpA recombinante de JD1 reaccionó fuertemente con la transferencia de JD1, como se esperaba, pero muy débilmente con el antígeno BmpA de IP90. Además, las muestras de suero obtenidas a partir de dos monos infectados con JD1 reaccionaron con los dos mismos antígenos como anteriormente en la transferencia de IP90, y proporcionaron ocasionalmente bandas adicionales (más débiles) de mayor peso molecular. La banda de menor masa molecular de las dos corresponde de hecho a una molécula mayor que la BmpA de IP90, identificada con el anticuerpo policlonal anti-BmpA. La banda de mayor peso molecular corresponde probablemente a flagelina, ya que tenía la misma masa molecular que la banda de IP90 que reaccionó con el mAb H9724.

Un anticuerpo monoclonal creado contra P35 a partir de JD1 reaccionó con esta molécula en la transferencia de JD1, pero no en la transferencia de IP90, mientras que un antisuero policlonal de ratón creado contra BmpD de JD1 reaccionó con BmpD tanto de JD1 como de Ip90, aunque la banda de BmpD de IP90 era muy débil. Por tanto, la identidad del antígeno de IP90 que podría ser la diana de ADCK no era BmpA, BmpD o P35. Se designó en adelante en la presente memoria como P39.5.

Se desarrolló después una transferencia Western de lisados de espiroquetas JD1 e IP90 incubadas con suero de un mono inoculado por garrapatas con JD1; antisuero policlonal de mono de P39; mAb H9724 de mono de flagelina; anticuerpo anti-P39.5 de mono obtenido mediante purificación de afinidad a partir de una muestra de suero de un mono inoculado por garrapatas con JD1, y anti-P7-1 recombinante de ratón (rP7-1). Para identificar P39.5 en transferencias Western de lisados JD1, el anticuerpo anti-P39.5 desencadenado en monos infectados con JD1 se purificó por afinidad utilizando tiras de nitrocelulosa que tenían P39.5 de IP90 unida a las mismas. Como se esperaba, este anticuerpo reaccionaba con el antígeno P39.5 en una transferencia Western de lisado de IP90 pero, sorprendentemente, no conseguía reaccionar con la transferencia de JD1. Este resultado implicaba que P39.5 de JD1 no se expresaba in vitro, se expresaba escasamente como para ser indetectable por el anticuerpo anti-P39.5 purificado por afinidad en las transferencias de JD1, o se expresaba in vitro por JD1 de una manera que no era reactiva cruzada antigénicamente con el anticuerpo separado por purificación de afinidad de P39.5 de IP90.

Obviamente, las espiroquetas JD1 tenían que expresar P39.5 in vivo y en cantidades suficientemente altas para ser inmunogénicas, puesto que de otro modo el anticuerpo anti-P39.5 que se había purificado por afinidad no se habría desencadenado en primer lugar. En la transferencia Western descrita anteriormente, la posición de BmpA se indicaba por su reacción con el antisuero policlonal anti-BmpA y la de flagelina por la reacción de esta molécula con el mAb H9724.

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Se identificó así un nuevo antígeno de Borrelia que se expresa abundantemente in vitro por B. garinii cepa IP90 e in vivo por B. burgdorferi en sentido estricto cepa JD1. Este antígeno, P39.5, era la diana en la ADCK de espiroquetas IP90.

Ejemplo 5

Clonación de P39.5 A. Clonación en bacteriófago

Se construyó una biblioteca de ADN total cortado aleatoriamente de B. garinii IP90 en el vector bacteriófago \lambdaZAPII [Stratagene, La Jolla, CA] y se examinó con una agrupación de plasma recogido de monos Rhesus infectados con la cepa JD1 de B. burgdorferi. Las muestras de plasma utilizadas para la agrupación se seleccionaron de tal modo que contuvieran anticuerpo que reconociera sólo P39.5, la supuesta flagelina y 1 ó 2 bandas débiles de mayor peso molecular no identificadas adicionales observadas en algunas transferencias Western de IP90.

Después de varias rondas de examen, se rescataron 11 clones en el fagémido pBlueScript [Stratagene], se purificaron los plásmidos recombinantes y se utilizaron para transformar células de la cepa SURE de E. coli. Se seleccionaron varios transformantes de cada clon original, se confirmó la presencia del inserto y se hizo crecer uno de dichos transformantes de cada clon, se indujo para expresión, se lisó y se analizó por transferencia Western con la agrupación de plasma original. Los once fragmentos clonados hibridaron entre sí por hibridación de transferencia
puntual.

Uno de los once clones (denominado 7-1) se seleccionó para sobreexpresión y purificación basándose en la fuerte reactividad de la proteína expresada con los anticuerpos plasmáticos. El inserto 7-1 era de 950 pb de longitud.

Se confirmó la identidad de la proteína expresada como antigénicamente idéntica a, o reactiva cruzada con, P39.5, mostrando que el anticuerpo de la muestra de plasma original que se purificó por afinidad utilizando el clon como inmunoaborbente reaccionaba con P39.5 en una transferencia Western de lisado de B. garinii. Se desarrolló una transferencia Western de lisados de espiroquetas IP90 reaccionadas con plasma de un mono infectado con espiroquetas JD1; anticuerpo del mismo plasma purificado por afinidad con los antígenos recombinantes expresados por el clon 1-1 y el clon 7-1 de B. garinii. Se demostró en la transferencia la reactividad del lisado de IP90 con la agrupación de plasma de mono. Se mostró la reactividad del lisado de IP90 con el anticuerpo purificado por afinidad con la proteína 1-1 recombinante, y con el anticuerpo purificado por afinidad con la proteína 7-1 recombinante.

Se obtuvo una secuencia de ADN parcial para P7-1 [SEQ ID NO: 1]. Aproximadamente 950 pb derivaban del clon 7-1. Además, se obtuvieron aproximadamente 140 kb de las regiones cadena arriba a partir del clon 14 [SEQ ID NO: 13]. El fragmento de ADN formado por la secuencia 5' de la SEQ ID NO: 13 y la secuencia SEQ ID NO: 1 es de 1.189 pb de longitud, que se representa en la Fig. 2. Abarca un marco de lectura abierto único que codifica una proteína deducida de 37,7 kDa. Su alto contenido de alanina da como resultado su masa molecular bastante baja. Puesto que la masa molecular media de los aminoácidos de esta proteína es 95, hay ausentes aproximadamente 57 pb de la región de codificación completa. Puesto que no se observó secuencia líder hidrofóbica y puesto que P39.5 tiene las propiedades de solubilidad de las lipoproteínas (véase a continuación), se deduce que P7-1 es antigénicamente reactiva cruzada con P39.5, pero no es la P39.5 completa misma.

Datos distintos de la secuencia aminoacídica deducida de P7-1 [SEQ ID NO: 14 y 2] sugieren que P39.5 es una lipoproteína. En primer lugar, la forma nativa de P39.5 presente en extractos de células completas de espiroquetas IP90 era totalmente extraíble, concretamente, se reparte en la fase detergente de un experimento de separación de fases con Triton-X114. En segundo lugar, la mayoría de su secuencia está compuesta por dominios hidrofílicos, muy parecidos a OspA, pero debe expresarse en la superficie externa, puesto que es diana de anticuerpo. En tercer lugar, su % de identidad con varios miembros de la familia Vmp de lipoproteínas de Borrelia hermsii es considerable, por ejemplo, 22% con Vmp4, 19% con Vmp23, 18% con Vmp17 y 17% con Vmp21. Estas secuencias están disponibles en la base de datos GENBANK.

Un rasgo interesante de su secuencia nucleotídica es la presencia de varias regiones repetidas internamente, mostradas en la Fig. 2. Los bloques IA y IB son un 70% idénticos. El bloque IIA es del orden de un 91% idéntico a IIB, y los bloques A, B y C son entre un 84 y un 90% idénticos. El único fragmento solamente interno es el designado por el bloque negro. Claramente, dicha molécula tenderá a experimentar recombinaciones homólogas del mismo tipo que aparecen entre y dentro de los genes OspA y OspB, que tienen regiones de homología [P. Rosa et al., citado anteriormente]. Sin embargo, dichos mutantes de escape potenciales no pueden escapar a la acción combinada de anticuerpo y complemento, como se demostró con referencia al caso de OspA [Sole et al., citado anteriormente].

B. Expresión y purificación de P7-1 recombinante con el sistema Qiaexpress™

El sistema Qiaexpress™ de Qiagen Inc. (Chatsworth, CA) aprovecha la alta afinidad de seis residuos de histidina consecutivos por cationes divalentes tales como Ni. Este último se conjuga con ácido nitrilotriacético (NTA), que a su vez se liga a agarosa. Puesto que el marcador de afinidad es muy pequeño (mínimamente 6 residuos), puede dejarse en la proteína de fusión sin consecuencias graves con respecto a las propiedades antigénicas de la proteína. El marcador de afinidad 6 x His puede incorporarse a la terminación N o C. Están disponibles una serie de vectores (vectores pQE) para construir ambos tipos de fusión.

Se examinó inicialmente en los recombinantes la presencia de los insertos esperados en los plásmidos. Esto fue seguido por una transferencia Western para confirmar la expresión de proteína en estos recombinantes. Se desarrollaron las transferencias Western con suero de ratones control infectados con las espiroquetas de la cepa correspondiente o con un anticuerpo de ratón que detecta específicamente el epítopo MRGS(His)6 (Qiagen), que era la secuencia de marcador de afinidad presente en algunos de los vector pQE [para fusiones N-terminales]. Una alternativa igualmente sensible era utilizar conjugado Ni-NTA-fosfatasa alcalina, que estaba también disponible en Qiagen.

Las células E. coli que contenían el constructo de fusión se dejaron crecer hasta fase semilogarítmica, se indujeron con IPTG 0,3 mM durante un periodo de 3 horas, se sedimentaron, se lavaron una vez con tampón de sonicación [NaPO_{4} 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM] y se almacenaron durante una noche a –20ºC. El día siguiente, se resuspendieron las células en tampón de sonicación y se sometieron a sonicación en hielo utilizando pulsos de 15 segundos durante un total de 2 minutos. Inmediatamente después de la sonicación, se añadió el inhibidor de serinproteasa PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) para prevenir la degradación por dichas proteasas. Se separó por centrifugación el desecho celular y se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo. Mientras tanto, se lavó la resina Ni-NTA una vez con 10 volúmenes de columna (vc) de tampón de sonicación. Se dejó unir la proteína de fusión con la resina Ni-NTA en un tubo durante 1 hora. Se separó por centrifugación la resina y se desechó el sobrenadante. Se resuspendió la resina en 10 vc de tampón de sonicación, se vertió en una columna y se lavó 3 veces con 10 vc del mismo tampón seguido de 3 lavados de 10 vc con tampón de lavado [NaPO_{4} 50 mM, pH 6,3, NaCl 300 mM]. Finalmente, se eluyó la proteína de fusión con 10 vc de tampón de elución [NaPO_{4} 50 mM, pH 4,5, NaCl 300 mM] y se recogieron las fracciones. Se ensayó en las fracciones la proteína y se agruparon las fracciones que contenían la mayor concentración de proteína y se neutralizaron a pH 7,0 con NaPO_{4} dibásico. Se calculó la concentración de proteína en la muestra agrupada y se procesó una alícuota en un gel SDS-PA y se tiñó con plata para comprobar la pureza. Los rendimientos típicos fueron de aproximadamente 4-5 mg/litro de cultivo.

Ejemplo 6

Potencial protector in vitro de P7-1 en monos

Se purificó anticuerpo anti-P7-1 a partir de la misma agrupación de plasma de mono utilizada para examinar la biblioteca de ADN, absorbiéndolo y eluyéndolo con ácido de tiras de nitrocelulosa que contenían la proteína P7-1 recombinante (rP7-1) expresada a partir del clon 7-1. Se confirmó la monoespecificidad del anticuerpo en una transferencia Western como se describe en los Ejemplos 2 y 4, y se utilizó el anticuerpo en ADCK como se describe en el Ejemplo 3.

La fracción de espiroquetas IP90 muertas después de una incubación de 24 horas con el anticuerpo anti-P7-1 purificado por afinidad fue de 55% (Fig. 3, barra 2). Se reconstituyó el anticuerpo a una concentración equivalente a una dilución 1:10 de su concentración en plasma. Esta tasa de destrucción era comparable a la observada con una dilución 1:10 del mismo plasma (67%, Fig. 3, barra 1). El complemento era esencial para efectuar la destrucción, ya que sólo se destruía un 12% de las espiroquetas en su ausencia (Fig. 3, barra 3). La destrucción en presencia de complemento de mono solo fue ligeramente mayor de lo habitual, porque el valor fue 25% (Fig. 3, barra 4), mientras que el valor más frecuentemente obtenido fue 10-15%, a pesar de las espiroquetas JD1 [M. Aydintug et al., Infect. Immun. 62: 4929-4937 (1994)]. En medio BSK-H solo, murieron un 12% de las espiroquetas
(barra 5).

Estos resultados indicaron que el anticuerpo del antígeno P7-1 recombinante (un fragmento de P39.5) de IP90, desencadenado en monos durante el transcurso de una infección natural con espiroquetas JD1, podía destruir espiroquetas IP90 por ADCK.

Estos experimentos demostraron el potencial protector de P7-1 y formaron la base de selección de este antígeno como candidato a vacuna.

Ejemplo 7

Potencial protecor de P7-1 en ratones

Este Ejemplo muestra que los ratones pueden inmunizarse directamente con la P7-1 recombinante. Los anticuerpos de ratón generados mediante inmunización con rP7-1 y coadyuvante Ribi fueron capaces de destruir hasta un 60% de las espiroquetas IP90 in vitro mediante destrucción dependiente de anticuerpo mediada por complemento (ADCK). Para evaluar el potencial protector de P7-1 más directamente, se subclonó el fragmento de ADN del clon 7-1 en pQE como se describe en el Ejemplo 5, y se purificó la proteína expresada en cantidades de miligramos y se utilizó para inmunizar ratones C3H/HeJ. Se administraron a los ratones cuatro inyecciones de 30 \mug cada una de P7-1 recombinante en 0,2 ml de coadyuvante Ribi R-700 (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT). Formulación de R-700: MPL™ 0,25 mg/ml, dicorinomicolato de trehalosa sintético 0,25 mg/ml, escualeno (hexametiltetracosahexano) 20 \mul/ml y monooleato (Tween 80) 2 \mul/ml. Se administraron las inyecciones por vía intraperitoneal, separadas tres semanas. Dos semanas después de la última inmunización, se extrajo sangre a los ratones, se confirmó la especificidad del anticuerpo desencadenado por transferencia Western utilizando extractos celulares completos de espiroquetas IP90 como antígeno y se agruparon las muestras de suero.

El suero de ratones inmunizados con el coadyuvante Ribi solo no reconoció antígenos en transferencias de IP90. El suero de ratones inmunizados con rP7-1 y Ribi reconoció, como se esperaba, la banda de P39.5 en lisados de IP90, pero también una banda más débil ligeramente por encima de la banda de flagelina de 41 kDa, y una banda de masa molecular mayor también. De forma interesante, este mismo anticuerpo de ratón reconoció una banda de 41 kDa en transferencias Western de lisados JD1, y también un antígeno de masa molecular ligeramente mayor.

Este resultado difería del obtenido con anticuerpo anti-rP7-1 purificado por afinidad a partir de monos en el ejemplo anterior y era debido probablemente al hecho de que la afinidad del anticuerpo de ratón se dejó madurar durante mucho más tiempo (12 semanas) que la del anticuerpo de mono (4-5 semanas). Como consecuencia, su afinidad de unión fue mayor pero su especificidad fue menor, y puede unirse a epítopos reactivos cruzados pero no idénticos.

Después de una inyección de recuerdo adicional, los ratones que proporcionaron el anticuerpo anti-P7-1 que destruyó un 60% de las espiroquetas IP90 mediante ADCK in vitro proporcionaron un antisuero que destruyó un 100% de dichas espiroquetas en un experimento del mismo tipo. Además, este mismo antisuero fue capaz de destruir un 50% de las espiroquetas de la cepa NT I (una cepa hasta ahora no tipificada, pero probablemente en sentido estricto, ya que se aisló del líquido cefalorraquídeo de un paciente en el nordeste de Estados Unidos). En contraposición, no pudo destruirse ninguna espiroqueta de la cepa JD1 ni in vitro (por ADCK) ni in vivo en un experimento de infección por garrapatas con ratones inmunizados con pP7-1 y coadyuvante Ribi.

Se evaluó la ADCK tanto con complemento de mono como de conejillo de Indias. El suero de conejillo de Indias normal (de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) se utilizó como fuente de complemento en el último caso. Se utilizó la misma agrupación de plasma de mono de animales infectados con B. burgdorferi JD1 como control positivo. A una dilución de 1:10, esta agrupación de plasma destruyó un 57% de las espiroquetas IP90 después de 24 horas de incubación (Fig. 3, barra 1). El antisuero de ratón de rP39.5 destruyó un 73,5% de las espiroquetas a una dilución de 1:10 y un 60,5% a 1:50 (barras 2 y 3, respectivamente). El suero de ratones inmunizados con coadyuvante Ribi solo destruyó un 21% de las espiroquetas (barra 4). El complemento de conejillo de Indias era menos eficaz en el ensayo de ADCK. Se destruyó una fracción de un 37% de las espiroquetas con el plasma control positivo a 1:10 (barra 5), mientras que el antisuero anti-P39.5 de ratón a la misma dilución destruyó un 48% de las espiroquetas en presencia de complemento de conejillo de Indias (barra 6). Se destruyó una fracción de un 12% de las espiroquetas en presencia de una dilución 1:10 de suero de ratones administrados con Ribi solo (barra 7). De forma interesante, sólo se destruyó un 6% de las espiroquetas JD1 cuando se incubaron con una dilución 1:10 de antisuero anti-r39.5 de ratón, una fracción que no difería de la que destruyó sólo el suero control (no mostrado). Por tanto, las bandas reconocidas en la transferencia de JD1 representan probablemente una reactividad cruzada espúrea, pero no la P39.5
de JD1.

Ejemplo 8

Uso en diagnóstico de P7-1 en seres humanos

Se obtuvieron 19 muestras de suero humano de los "Centers for Disease Control and Prevention (CDC)". Cuatro de estas muestras eran de donantes que no tenían historial de enfermedad de Lyme y nunca habían residido en la zona donde esta enfermedad es endémica. Las otras quince muestras eran de pacientes que vivían en zonas endémicas de enfermedad de Lyme, tenían señales y/o síntomas de la enfermedad y, con la excepción de un paciente, eran serológicamente positivos por el criterio recomendado por los CDC. Ese criterio proporciona que los pacientes sean positivos por un ensayo ELISA sensible a Lyme y que sean también positivos por una transferencia Western de IgM o IgG, de modo que al menos dos de las siguientes tres bandas estuvieran presentes en transferencias de IgM positivas (24, 39 ó 41 kDa) y cinco de las siguientes diez bandas estuvieran presentes en transferencias de IgG positivas (18, 21, 28, 30, 39, 41, 45, 58, 66 y 93 kDa).

El ensayo, basado en la detección de anticuerpo IgG mediante la incubación de muestras de suero diluidas a 1:200 con tiras de nitrocelulosa sobre las que se había electrotransferido antígeno P39.5 purificado, y posterior detección del anticuerpo unido mediante los métodos inmunoenzimáticos descritos en el ejemplo 2, proporcionó los siguientes resultados. Las cuatro muestras de suero de donantes que no tenían historial de enfermedad de Lyme y no habían residido nunca en la zona donde esta enfermedad es endémica, no tuvieron anticuerpo anti-P39.5 detectable. De las quince muestras restantes, catorce fueron positivas. La única muestra negativa fue la que tampoco consiguió mostrar anticuerpo según el criterio recomendado por los CDC. Por tanto, el sencillo procedimiento descrito en la presente memoria basado en el antígeno P39.5 como sonda de diagnóstico para anticuerpo anti-B. burgdorferi es, por su evaluación inicial, tan sensible y específico como el método en dos etapas más complejo que está actualmente recomendado por los CDC.

En otro ensayo de diagnóstico, la proteína antigénica expresada a partir del fragmento de ADN 7-1, rP7-1, se ensayó como sonda para el diagnóstico serológico temprano de enfermedad de Lyme en monos Rhesus. Las muestras de suero obtenidas a partir de tres pares de monos Rhesus infectados con tres cepas diferentes de B. burgdorferi B31, JD1 y NT1, respectivamente, contenían anticuerpo detectable de rP7-1 purificado en la semana 2 de infección, detectado mediante transferencia Western. Se ensayaron simultáneamente ambos anticuerpos IgM e IgG. El resultado indica que el anticuerpo de P7-1 aparece tempranamente en el transcurso de la infección, independientemente de la cepa de B. burgdorferi que está desencadenando la respuesta de anticuerpo.

Se evaluó de nuevo la sensibilidad de la detección de anticuerpo frente a transferencia Western como anteriormente, con una batería de 43 muestras de suero humano obtenidas de los CDC. Se realizó el experimento de modo ciego. Las muestras de los CDC se habían obtenido a partir de pacientes con un diagnóstico clínico de enfermedad de Lyme que satisfacían los criterios más rigurosos de los CDC para la definición de caso. De las 43 muestras de pacientes clínicamente positivos, 34 se reseñaron positivas por los CDC, a juzgar por los criterios de Dressler [Dressler, F. et al., 1993, J. Infect Dis. 167: 392-340] utilizando el ensayo de transferencia Western de MarDx Diagnostics Inc. (Lyme Disease MarBlot). Con la transferencia Western de diagnóstico basada en el antígeno P7-1, fue positivo un número igual de muestras (34), aunque los resultados negativos o positivos no siempre coincidían en ambos ensayos. Por tanto, la Western basada en P7-1 en la que se detecta una sola banda (o no), y que es por lo tanto un ensayo sencillo de interpretar, proporcionó la misma sensibilidad que uno de los ensayos de diagnóstico de enfermedad de Lyme más conseguidos, aunque engorroso de interpretar, actualmente en el mercado.

En ensayos para especificidad antigénica, hasta ahora, de 12 muestras de suero de pacientes sifilíticos, 11 fueron negativas con el ensayo a pesar del hecho de que todas las muestras contuvieran anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con múltiples antígenos en una transferencia Western de antígenos de B. burgdorferi completa. La única muestra de suero que proporcionó un resultado positivo fue de un paciente que tenía también infección por VIH y varias infecciones relacionadas con el SIDA.

Ejemplo 9

Las proteínas de serie de módulos

Como se afirmó anteriormente, la secuencia aminoacídica predicha a partir de la secuencia nucleotídica del fragmento 7-1 es aproximadamente un 50% idéntica a la VlsE de la cepa B31 de B. burgdorferi, que es parte de un antígeno de B. burgdorferi que experimenta variación antigénica mediante un mecanismo de recombinación mediante el que un fragmento central de la copia expresada (VlsE) se recombina con fragmentos de una serie de 15 "módulos" localizados cadena arriba de la copia expresada [J. Zhang, citado anteriormente].

Se han clonado varios fragmentos de ADN que parecen ser parte de la serie de módulos de B. garinii IP90. Además de 7-1, estos fragmentos denominados 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 y 12-1 son de entre 1 y 2 kb de longitud. Cuando se expresan en forma recombinante, sustancialmente como se describen anteriormente para P7-1 (aparte del promotor lacZ de pBluescript), cada uno de los fragmentos de serie de módulos expresa un péptido que es comparable con el tamaño del inserto y que reacciona con anticuerpo de monos infectados. Ninguno de los extremos 5' de estos fragmentos contiene una secuencia líder hidrofóbica o una secuencia señal consenso de peptidasa II del tipo que es característico de lipoproteínas bacterianas. Estos fragmentos deben ser por lo tanto parte de la serie de módulos de IP90 y, como la serie de módulos de B31, están dentro del marco. Las secuencias de ADN de las terminaciones 5' y 3' (entre aproximadamente 100-500 pb) de cada fragmento se ilustran en las SEQ ID NO: 3 a 12. Obsérvese que sólo el extremo 5' del fragmento 9-1 está ilustrado en la SEQ ID NO: 10.

Se ha analizado la antigenicidad de estos fragmentos de dos modos. En primer lugar, se estudió la reactividad de los fragmentos de transferencias Western con muestras de suero recogidas longitudinalmente de monos Rhesus durante un periodo de 48 semanas después de una inoculación por garrapatas con B. burgdorferi JD1. Las proteínas expresadas por los fragmentos 9-1 y 7-1 reaccionaron predominantemente con muestras de suero recogidas entre las semanas 2 y 24 después de la infección (PI) (reactores tempranos), las proteínas expresadas por los fragmentos 3-1 y 6-1 reaccionaron principalmente con muestras de suero recogidas entre las semanas 24 y 48 PI (reactores tardíos), y las proteínas de los fragmentos 1-1 y 12-1 mostraron una reactividad uniforme en gran medida durante el intervalo de tiempo de 48 semanas investigado. Este resultado sugiere que cada uno de los fragmentos clonados contiene epítopos únicos.

Para confirmar este concepto, se construyó una agrupación de sueros con las muestras empleadas en los análisis de transferencia Western descritos anteriormente, y se preincubó una alícuota de esta agrupación "temporal" con un exceso del antígeno purificado expresado a partir de 7-1 (rP7-1). De este modo, el anticuerpo anti-P7-1 que estaba presente en la agrupación de sueros ya no estaba disponible para reaccionar con el antígeno P7-1 en transferencias Western. Sin embargo, esta agrupación de sueros seguía siendo capaz de reaccionar con las proteínas expresadas por los otros fragmentos de ADN, con la excepción de 12-1. Puesto que este último es un reactor "tardío", es posible que los anticuerpos de los epítopos supuestamente únicos de 12-1 puedan haberse diluido en la agrupación de sueros. Todos los fragmentos anteriores se subclonaron en el vector pQE para expresión utilizando metodologías convencionales como se describen anteriormente para P7-1.

El inventor ha teorizado que el mecanismo de variación antigénica al que está sometido el antígeno P39.5 de IP90, en virtud de su homología con los antígenos vlsE de B31, indica que este antígeno es crucialmente importante para la supervivencia de espiroquetas en el hospedador vertebrado. Por tanto, los métodos y composiciones de esta invención se diseñan para evitar este mecanismo de defensa de espiroquetas inmunizando un hospedador con una gran fracción de los epítopos que se expresan en la serie de módulos que es la fuente misma de la variación. Esto se hace posible por el hecho único de que la mayoría de esta serie de módulos está dentro del marco. Por lo tanto, como se citó anteriormente, un método de vacunación implica administrar al hospedador varias o todas las proteínas clonadas y purificadas descritas anteriormente que derivan de secciones antigénicamente distintas de la serie de módulos de IP90. Véanse, por ejemplo, los resultados obtenidos cuando se introdujo P7-1 en un hospedador y se indujeron anticuerpos que destruyeron las espiroquetas.

Todas las referencias y documentos de prioridad anteriormente indicados se incorporan a la presente como referencia. Están incluidas numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención en la memoria descriptiva identificada anteriormente, y se espera que sean obvias para un experto en la técnica. Dichas modificaciones y alteraciones de las composiciones y procesos de la presente invención se cree que están abarcadas en el alcance de las reivindicaciones adjuntas a la misma.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: The Administrators of Tulane Educational Fund

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Antígenos de superficie y proteínas útiles en composiciones para el diagnóstico y la prevención de la enfermedad de Lyme

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 14

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(iv)

FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:

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(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn edición nº 1.0, versión nº 1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: EP 98931729.2

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 29 de Junio de 1998

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1047 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CATENARIEDAD: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1...1047

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

1

2

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 349 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 283 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

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5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 233 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 194 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 369 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 142 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 210 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

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10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 236 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 199 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 272 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 289 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 142 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2...142

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

16

Claims (20)

1. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína o fragmento de la misma que se une a anticuerpos del agente causante de la enfermedad de Lyme en un sujeto mamífero, seleccionándose dicha secuencia de:

(a)

la SEQ ID NO: 1 o una secuencia complementaria de la misma;

(b)

la SEQ ID NO: 3 o una secuencia complementaria de la misma;

(c)

la SEQ ID NO: 4 o una secuencia complementaria de la misma;

(d)

la SEQ ID NO: 5 o una secuencia complementaria de la misma;

(e)

la SEQ ID NO: 6 o una secuencia complementaria de la misma;

(f)

la SEQ ID NO: 7 o una secuencia complementaria de la misma;

(g)

la SEQ ID NO: 8 o una secuencia complementaria de la misma;

(h)

la SEQ ID NO: 9 o una secuencia complementaria de la misma;

(i)

la SEQ ID NO: 10 o una secuencia complementaria de la misma;

(j)

la SEQ ID NO: 11 o una secuencia complementaria de la misma;

(k)

la SEQ ID NO: 12 o una secuencia complementaria de la misma;

(l)

la SEQ ID NO: 13 o una secuencia complementaria de la misma; y

(m)

una secuencia que codifica una proteína que comprende un fragmento de al menos 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, uniéndose dicho fragmento a un anticuerpo generado contra la proteína de SEQ ID NO: 2.

2. Una proteína o fragmento de la misma que se une a anticuerpos del agente causante de la enfermedad de Lyme en un sujeto mamífero, comprendiendo dicha proteína o fragmento una secuencia aminoacídica seleccionada de:

(a)

la SEQ ID NO: 2;

(b)

la SEQ ID NO: 14

(c)

una secuencia aminoacídica codificada por la SEQ ID NO: 13;

(d)

una secuencia aminoacídica codificada por la SEQ ID NO: 7;

(e)

una secuencia aminoacídica codificada por la SEQ ID NO: 11; y;

(f)

una secuencia aminoacídica de (a) a (e) que tiene una sustitución aminoacídica conservativa en la misma;

(g)

una secuencia aminoacídica que comprende un fragmento de al menos 8 aminoácidos de (a) o (b), uniéndose dicho fragmento a un anticuerpo generado contra una proteína de SEQ ID NO: 2.

3. La proteína o fragmento de la reivindicación 2 que se fusiona con una segunda proteína, en los que dicha segunda proteína es una proteína o fragmento de la reivindicación 2.

4. La proteína o fragmento según la reivindicación 2, en los que dicha proteína o fragmento se acopla a nitrocelulosa, perlas de látex o un pocillo o placa de microvaloración, o filtro.

5. La proteína o fragmento según la reivindicación 2, en los que dicha proteína o fragmento de la misma se acopla a un marcaje detectable o reactivo generador de señal.

6. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1 bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas.

7. Una célula hospedadora transformada con el vector según la reivindicación 6.

8. Un método para expresar recombinantemente la proteína o fragmento de la reivindicación 2 ó 3, que comprende cultivar una célula hospedadora recombinante transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteína o fragmento en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína o péptido.

9. Un método para preparar una proteína o fragmento de la reivindicación 2 ó 3, que comprende sintetizar químicamente dicha proteína o fragmento.

10. Un reactivo de diagnóstico que comprende una secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1, una secuencia que codifica una proteína o fragmento de la reivindicación 2, o una secuencia que codifica una proteína o fragmento de la reivindicación 2 fusionada con una secuencia que codifica una segunda proteína, y un marcaje detectable que está asociado a dicha secuencia.

11. Un anticuerpo aislado que está dirigido contra una proteína o fragmento de la reivindicación 2.

12. El anticuerpo según la reivindicación 11, que es capaz de destruir espiroquetas IP90 in vitro mediante destrucción dependiente de anticuerpo mediada por complemento.

13. El anticuerpo según la reivindicación 11, que es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.

14. Un anticuerpo aislado mediante purificación por afinidad de antisuero generado durante una infección de monos Rhesus con espiroquetas JD1 utilizando como inmunoabsorbente la proteína o fragmento de la reivindicación 2.

15. Un anticuerpo antiidiotípico específico del anticuerpo de la reivindicación 11.

16. Un reactivo de diagnóstico que comprende el anticuerpo según la reivindicación 11 y un marcaje detectable.

17. Un método para diagnosticar borreliosis de Lyme en un ser humano o animal, que comprende incubar in vitro un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 o una proteína según la reivindicación 2 ó 3 con una muestra de fluidos biológicos de un ser humano o animal que se va a diagnosticar, en el que en presencia de B. burgdorferi se forma un complejo antígeno-anticuerpo, y posteriormente se analiza en dicha muestra de fluido la presencia de dicho complejo.

18. Una secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1, una proteína de las reivindicaciones 2 a 4, un anticuerpo de las reivindicaciones 11 a 15 o un reactivo de diagnóstico de la reivindicación 16 para uso en el diagnóstico de borreliosis de Lyme en un ser humano o animal.

19. Un kit para diagnosticar la enfermedad de Lyme en un ser humano o animal, que comprende una secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1, una proteína o fragmento de la reivindicación 2 ó 3 o un anticuerpo de la reivindicación 11.

20. El kit según la reivindicación 19, que comprende adicionalmente un marcaje detectable o un agente generador de señal.