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ES2269027T3 - Plasmidos, su construccion y su uso en la preparacion de interleuquina-4 y de muteinas de interleuquina-4. - Google Patents

Plasmidos, su construccion y su uso en la preparacion de interleuquina-4 y de muteinas de interleuquina-4. Download PDF

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ES2269027T3
ES2269027T3 ES00100129T ES00100129T ES2269027T3 ES 2269027 T3 ES2269027 T3 ES 2269027T3 ES 00100129 T ES00100129 T ES 00100129T ES 00100129 T ES00100129 T ES 00100129T ES 2269027 T3 ES2269027 T3 ES 2269027T3
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ES
Spain
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expression
muteins
gene
baselineskip
coli
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ES00100129T
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English (en)
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Heiner Dr. Apeler
Hermann Dr. Wehlmann
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Bayer AG
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Bayer Healthcare AG
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Publication date
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Abstract

Un vector para la elaboración de IL-4 y muteínas de IL-4 en una cepa de Escherichia coli, que comprende en orden de 5'' a 3'' los siguientes elementos operativamente unidos: un promotor regulable que consta del promotor del fago T5 de E. coli y dos secuencias de operador lac, un sitio de unión al ribosoma del fago T7 g10 de E. coli, un codon de partida traduccional, un gen estructural para IL-4 o una muteína IL-4 y más adelante en la cadena del gen estructural un terminador de la transcripción.

Description

Plásmidos, su constitución y uso en la preparación de interleuquina-4 y de muteínas de interleuquina-4.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la construcción y uso de plásmidos de expresión en la elaboración de interleuquina-4 recombinante (IL-4) y muteínas de interleuquina-4.
Antecedentes de la invención
La interleuquina-4 humana (IL-4) está compuesta de 129 aminoácidos con un 50% de homología con la IL-4 del ratón. IL-4 es la única citoquina conocida para dirigir la diferenciación de células T ayudantes a un fenotipo T_{H2} (Mosmann y Sad, Immunol. Today 17, 138-146, 1996). Las señales de IL-4 sobre linfocitos y otras células a través de un complejo heterodimérico de dos receptores de citoquina, el IL-4R\alpha y la cadena \gamma común (\gammac). Se han descrito mutantes antagonistas IL-4 (Kruse y col., EMBO J. 11, 3237-3244, 1992). Tres aminoácidos cerca del extremo C-terminal (R121, Y124 y S125) son importantes para unión a la cadena \gammac. La introducción de Asp (D) en estas posiciones bloquea la dimerización del receptor y la señalización transmembrana.
La doble muteína de interleuquina-4 (IL-4 DM) es una variante de IL-4 con 2 cambios de aminoácidos en posiciones 121 y 124 llamados IL-4 R121D Y124D. IL-4 DM es capaz de bloquear tanto las actividades de IL-4 como las de IL-3. En contraste con todos los mutantes de sitio único no se ha encontrado nunca ninguna actividad agonista residual para esta muteína. Se cree que estas propiedades antagonistas de IL-4 DM son útiles para el tratamiento de enfermedades las cuales implican desarrollo de T_{H2} y/o producción de IgE (Ryan, J., Allergy Clin. Immunol. 99, 1-5, 1997).
Como se describe en diversas publicaciones, los organismos procariotas se pueden usar para producir IL-4 recombinante y muteínas de IL-4. Desafortunadamente, los sistemas descritos tienen un número de inconvenientes (expresión de bajo nivel, baja estabilidad del vector de expresión) los cuales hacen la producción a gran escala de IL-4 y muteínas de IL-4 imposible o económicamente no factible.
Ptitsyn L.R. y Altman I.B.: Bulletin of Experimental Biology and Medicine, vol. 119, nº. 1, enero 1995, páginas 77-79; se titula "Recombinant Escherichia coli strains provide high-level expression of human Interleukin-3 and Interleukin-4". La materia sujeto de la presente invención difiere de esta cita en que un promotor T5 de E. coli se refiere al operón reivindicado. La patente de los Estados Unidos 4.689.409 se refiere a potenciación de expresión microbiana de polipéptidos y Makrides S.C.: Microbiological Reviews, vol. 60, nº. 3, septiembre 1996, páginas 512-538, se refiere a "Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli".
Los criterios principales para un sistema de expresión eficiente y segura son:
\bullet
producción de alto rendimiento
\bullet
expresión estable regulable
\bullet
estabilidad del vector de expresión.
Varias características de un plásmido de expresión son importantes para los criterios enumerados anteriormente (Hanning y col., TIBTECH. 16, 54-60, 1998). Estos son:
\bullet
promotor
\bullet
sitio de unión al ribosoma (rbs)
\bullet
uso de codon del gen correspondiente
\bullet
terminador transcripcional
\bullet
gen de resistencia
\bullet
regulación de expresión
\bullet
origen de replicación (ori).
Sumario de la invención
Se generaron plásmidos de expresión de IL-4 y muteínas de IL-4 con modificaciones en todos los elementos relevantes para un sistema de expresión eficiente y seguro. La calidad y adecuabilidad del sistema de expresión correspondiente se evaluó principalmente de acuerdo con los criterios siguientes:
\bullet
producción de IL-4 y muteínas IL-4
\bullet
estabilidad de plásmido
\bullet
mantenimiento de capacidad de inducción.
El objeto de la presente invención es, por lo tanto, hacer disponible un procedimiento para la construcción y uso de plásmidos de expresión en la elaboración a gran escala de interleuquina-4 recombinante (IL-4) y muteínas de interleuquina-4. Además el sistema recién desarrollado huésped/vector sería bien adecuado para la expresión de otras proteínas (citoquinas, factores de crecimiento, receptores solubles, anticuerpos, etc.).
Sorprendentemente, se ha encontrado que bacterias transformadas con plásmidos de acuerdo con la presente invención dan velocidades de expresión, valores de estabilidad de plásmidos y valores de estabilidad de expresión muchas veces superiores a aquellos observados después de transformar los huéspedes idénticos con plásmidos conocidos en la técnica. Por lo tanto, los plásmidos de esta invención son con mucho más útiles para la preparación de interleuquina-4 recombinante y muteínas de interleuquina-4 que todos los plásmidos previamente conocidos.
El sistema vector recién desarrollado contiene los siguientes elementos:
\vskip1.000000\baselineskip
Promotor T5
El promotor T5 de fago de E. coli conjuntamente con dos secuencias de operador lac se deriva del plásmido pQE30 (Quiagen) perteneciente a la familia de plásmidos pDS (Bujard y col., Methods Enzymol. 155, 416-433, 1987 t Stüber y col., Immunological Methods, I. Lefkovits y B. Pernis, eds. Academic Pres, Inc., vol. IV, 121-152, 1990).
\vskip1.000000\baselineskip
Sitio de unión al ribosoma T7 g10
El sitio de unión al ribosoma (rbs) se deriva de la región anterior en la cadena del gen 10 del fago T7 (T7 g 10 líder). El gen 10 de fago T7 codifica para la proteína de cobertura, la cual es la proteína principal expresada después de infección con T7. El rbs de T7 g10 se obtuvo a partir del vector pET-9a (Studier y col., Methods Enzymol. 185, 60-89, 1990). La secuencia líder de T7 g10 abarca ahora una región de aproximadamente 100 pares de bases (Olins y col., Gene 227-225, 1998). En la construcción de expresión final se elimina la región anterior en la cadena del sitio XbaI. La secuencia líder de T7 g10 abarca ahora 42 pares de bases y cobija un intercambio de bases de G a A en posición 3638 del plásmido preferido.
\vskip1.000000\baselineskip
Uso del codon de la secuencia de IL-4 natural
Como una medida efectiva de la predisposición de uso de codon sinónimo, el índice de adaptación de codones (CAI) puede ser útil para predecir el nivel de expresión de un gen dado (Sharp y col., Nucleic Acids Res. 15, 1281-1295, 1987 y Apeler y col., Eur. J. Biochem. 247, 890-895, 1997). El CAI se calcula como la media geométrica de los valores de uso de codones sinónimos relativos (RSCU) correspondientes a cada uno de los codones usados en un gen, divididos por el CAI máximo posible para un gen de la misma composición de aminoácidos. Se calculan valores de RSCU para cada codon a partir de genes expresados muy altamente de un organismo particular, por ejemplo E. coli, y representan la frecuencia observada de un codon dividido por la frecuencia esperada bajo la asunción de uso igual de los codones sinónimos para un aminoácido. Los genes altamente expresados, por ejemplo genes que codifican proteínas ribosomales, tienen generalmente altos valores de CAI \geq 0,46. Los genes pobremente expresados como lac1 y trpR en E. coli tienen valores de CAI bajos \leq 0,3.
El valor de CAI de E. coli calculado para la secuencia de IL-4 natural es 0,733. Esto prueba que el gen natural sería adecuado para expresión alta en E. coli. Sin embargo un gen sintético con uso de codon de E. coli óptimo (valor de CAI = 1) tiene el potencial para incrementar adicionalmente el nivel de expresión. Por lo tanto se diseñan y clonan los genes de IL-4 sintética y muteína de IL-4.
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Terminador transcripcional
Un fragmento de DNA de T7 que contiene el terminador de transcripción T\Phi se deriva del vector pET-9a (Studier y col., Methods Enzymol. 185, 60-89, 1990). Los terminadores transcripcionales determinan los puntos donde se disocia el complejo mRNA-RNA polimerasa-DNA, terminando por lo tanto la transcripción. La presencia de un terminador transcripcional al final de un gen altamente expresado tiene varias ventajas: minimiza secuestro de RNA polimerasa que se podría involucrar en transcripción innecesaria, restringe la longitud de mRNA al mínimo, limitando así gasto de energía, como transcripción fuerte puede interferir con el origen de replicación, un terminador transcripcional incrementa estabilidad de plásmido debido a mantenimiento de número de copias (Balbas y Bolivar, Methods Enzymol. 185, 14-37, 1990).
Gen de resistencia
El gen de resistencia a kan se deriva del vector pET-9a (Studier y col., Methods Enzymol. 185, 60-89, 1990). Originalmente, este es el gel kan de Tn903 del vector pUC4KISS (Barany, Gene 37, 111-123, 1985). En el plásmido preferido el gen kan y el gen de IL-4 y el gen de la muteína de IL-4 tienen orientaciones opuestas, así no debería haber un incremento en producto de gen kan después de inducción debido a transcripción de lectura a través del promotor T5. Se eligió kanamicina como un marcador selectivo porque es el antibiótico preferido para propósitos de GMP. Además, los vectores basados en gen kan son más estables que plásmidos resistentes a ampicilina (bla). La selección con ampicilina tiende a perderse en cultivos según el fármaco se degrada por la enzima segregada \beta-lactamasa. El modo de resistencia bacteriana a kanamicina depende de una aminoglicósido fosfotransferasa que inactiva el antibiótico.
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Regulación de expresión
La expresión de genes controlada es absolutamente necesaria para el establecimiento de un sistema de plásmidos estable, particularmente si la proteína de interés es deletérea para la célula huésped. El plásmido preferido usa un sistema inducible basado en lac que consta de un gen represor lac (lacI) y dos secuencias operadoras de lac sintéticas fusionadas más adelante en la cadena que el promotor del fago T5 de E. coli. El promotor lacI^{q} y el gen estructural lacI se aislaron a partir del vector pTrc99A (Amman y col., Gene 69, 301-315, 1988). I^{q} es una mutación del promotor la cual conduce a sobreproducción del represor lacI. El represor lac que se da en la naturaleza es una molécula tetramérica que comprende cuatro subunidades idénticas de 360 aminoácidos cada una. El tetrámero del represor lac es un dímero de dos dímeros funcionales. Las cuatro subunidades se mantienen juntas mediante un haz de cuatro hélices formadas a partir de los residuos 340-360. Debido al aislamiento del gen lacI del vector pTrc99A mediante un corte con NarI se eliminan los residuos más allá del aminoácido 331 y se añaden 10 aminoácidos no codificados normalmente en el gen lacI. Se sabe que pueden tener lugar mutaciones o deleciones en la parte C-terminal de lacI, más allá del aminoácido 329, dando como resultado dímeros funcionales que aparecen fenotípicamente similares al represor que se encuentra en la naturaleza (Pace y col., TIBS 22, 334-339, 1997).
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Origen de replicación (ori)
El origen de replicación (ori) del plásmido preferido se deriva del vector pET-9a, el ori del cual se origina a partir de pBR322. El plásmido preferido por lo tanto lleva el replicón pMB1 (ColE1). Los plásmidos con este replicón son plásmidos multicopia que se replican en una manera "relajada". Se mantienen un mínimo de 15-20 copias de plásmido en cada célula bacteriana bajo condiciones de crecimiento normales. El número actual para el plásmido preferido está en este intervalo. La replicación del ori tipo Co1E1 es inicia por un trascrito de RNA del nucleótido 555, RNA II, el cual forma un híbrido persistente con su DNA de plantilla cerca del ori. El híbrido RNA II-DNA se escinde después mediante RNAsa H en el ori para producir un 3' OH libre que sirve como un cebador para DNA polimerasa I. Este cebado de síntesis de DNA se regula negativamente por RNA I, una molécula de RNA de 108 nucleótidos complementaria al extremo 5' del RNA II. La interacción del RNA I antisentido con RNA II causa un cambio conformacional en RNA II que inhibe la unión de RNA II al DNA de plantilla y previene consecuentemente la iniciación de síntesis de DNA plasmídico. La unión entre RNA I y II se potencia mediante una proteína pequeña de 63 aminoácidos (la proteína Rop, siglas en inglés de Represora de cebador), la cual está codificada por un gen situado 400 nucleótidos más adelante en la cadena desde el origen de replicación (Sambrook y col., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989). La deleción del gen rop conduce a un incremento en número de copias y debido a un efecto dosificador de gen a niveles de expresión potenciados del plásmido codificó gen heterólogo. Esta observación fue hecha también para los vectores de expresión de IL-4 probados. Pero ello resulta en que los plásmidos de rop son inestables y se pierden muy rápidamente durante la fermentación bajo condiciones no selectivas. Por lo tanto el replicón del plásmido preferido contiene el gen rop para asegurar estabilidad plasmídica alta. El plásmido preferido carece del gen mob que se requiere para movilización y es por lo tanto incapaz de dirigir su propia transferencia por conjugación de una bacteria a otra.
En el plásmido se eliminaron preferiblemente todos los elementos no necesarios para la replicación plasmídica, la resistencia y la expresión regulable.
Por ejemplo, se puede usar un gen de interleuquina-4 natural o de muteína de interleuquina-4 en lugar de uno sintético con uso de codon de E. coli optimizado. El terminador de transcripción preferido es T\Phi, pero se pueden usar también otros terminadores como rrmB T2 o aspA.
Los procedimientos empleados en el transcurso del establecimiento del sistema de expresión se dan a continuación.
Materiales y procedimientos Enzimas
Las endonucleasas de restricción, la fosfatasa alcalina intestinal de ternero, la polinucleótidoquinasa T4 y la DNA ligasa T4 se compraron de Boehringer Mannheim y GIBCO-BRL y se usaron como se recomendó por el fabricante.
Procedimientos de DNA recombinante
Se han descrito procedimientos de clonación estándar en Sambrook y col. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989). Las transformaciones se llevaron a cabo de acuerdo con M. Scott (Seed y Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3365-3369, 1987). Como huéspedes para transformaciones se usaron ante todo las cepas de E. coli DH5\alpha (GIBCO BRL) y W3110 (ATCC 27325). El genotipo de W310 es K12, F, [N(rrnD-rrnE)]\lambda^{-}.
Los aislamientos a gran escala de DNA plasmídico se llevaron a cabo con puntas de Quiagen (Quiagen). La extracción de fragmentos de DNA a partir de geles de agarosa se llevó a cabo usando Jetsorb (Genomed) como se recomienda por el suministrador.
Los oligonucleótidos para mutagénesis dirigida a sitio, las reacciones de PCR y secuenciación se obtuvieron de MGW Biotech, Pharmacia Biotech o GIBCO BRL.
Los experimentos de mutagénesis se llevaron a cabo mediante le procedimiento de Deng y Nickoloff (Deng y Nickoloff, Anal. Biochem. 200, 81-88, 1992) usando el sistema de "Mutagénesis por Eliminación de Sitio Único" de Pharmacia Biotech. El cebador usado para la recreación del rbs T7 g10 tiene la secuencia siguiente:
5'TCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACATCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAA3' 
\hskip0,25cm
(Seq. 1).
Todas las construcciones y secuencias de DNA se confirmaron usando Secuenciación de Ciclo Terminador de Tinción con DNA polimerasa AmpliTaq, FS sobre un secuenciador ABI 313A (Applied Biosystems).
La invención se explica en más detalle mediante los siguientes ejemplos, figuras e información de secuencias:
Fig. 1 a Fig. 4: Construcción del plásmido de expresión preferido. (Abreviaturas: IL-4 TM, muteína triple IL-4; IL-4 DM, muteína doble IL-4).
Fig. 5: Estabilidad de plásmidos de los vectores de expresión de muteínas de IL-4 pRO21.1.O y pRO2.1.O. El vector pRO2.1.O permanece totalmente estable durante 78 generaciones sin selección con antibióticos. En contraste el vector de expresión pRO21.1.O, el cual se basa en el plásmido comercialmente disponible pET-30a (Novagen), se pierde muy rápidamente. Sólo el 16% de las colonias contienen el plásmido después de 78 generaciones sin selección de kanamicina.
Fig. 6: Mantenimiento de capacidad de inducción y expresión del vector de expresión de muteínas de IL-4 e IL-4 preferido.
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Ejemplos
Ejemplo 1
Prueba de Estabilidad de plásmidos
La prueba de estabilidad de plásmidos se comenzó siempre con un cultivo congelado en nitrógeno líquido. Se determinó la DO_{600} del cultivo descongelado, el cultivo se diluyó hasta 10^{-4} en tampón PBS y se plaqueó en placas de agar LB sin antibiótico.
Se inoculó 1 ml de cultivo descongelado en 100 ml de medio peptona (peptona de soja 30 g, extracto de levaduras 20 g, KH_{2}PO_{4} 5 g, glicerol 20 g, MgSO_{4} x 7H_{2}O 1 g por litro, pH 7,0) y se incubó a 37ºC con 280 rpm durante 24 horas.
Se determinó la DO_{600} del cultivo crecido, el cultivo se diluyó hasta 10^{-6} en tampón PBS y se plaqueó en placas de agar LB sin antibiótico para conseguir colonias bien separadas.
Se inocularon 100 \mul del cultivo crecido en 100 ml de medio de peptona y se incubaron a 37ºC con 280 rpm durante 24 horas. Este procedimiento se repitió ocho veces.
Se pusieron en rejilla 100 colonias bien separadas sobre placas LB con kanamicina (25 \mug/ml) y placas LB sin kanamicina y se incubaron a 37ºC durante toda una noche. El porcentaje de colonias resistentes se determinó cada día.
El número de generaciones por día se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: log[DO_{600 \ FINAL}/DO_{600 \ PRINCIPIO}]/
log 2.
Para los estudios de expresión se diluyó 1 ml de cultivo crecido 100 veces en medio LB y se manejó como se describe (véase ejemplo 2).
Ejemplo 2
Expresión
Para expresión a pequeña escala de interleuquina-4 y muteínas de interleuquina-4 las células se crecieron en medio LB (bactotriptona 10 g, extracto de levadura 5 g, NaCl 10 g por litro, pH 7,5) hasta que la DO_{600} alcanzó 0,8-1,0. Se indujo expresión por adición de IPTG a una concentración final de 0,5 mM e incubación continuada durante 5 horas. Las células se cosecharon mediante centrifugación.
Para análisis de SDS-PAGE se resuspendieron sedimentos de células en tampón de carga de SDS-PAGE a una concentración de 1 unidad de DO_{600}/100 \mul.
<110> Bayer AG
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<120> PLÁSMIDOS, SU CONSTRUCCIÓN Y SU USO EN LA ELABORACIÓN DE INTERLEUQUINA-4 Y MUTEÍNAS DE INTERLEUQUINA-4
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Plásmidos para muteínas de IL-4
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PantentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
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<212> DNA
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<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Organismo Desconocido: cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaattgtga gcggataaca atttcacaca tctagaaata attttgttta actttaagaa 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4202
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Descripción de Organismo Desconocido: humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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1

Claims (4)

1. Un vector para la elaboración de IL-4 y muteínas de IL-4 en una cepa de Escherichia coli, que comprende en orden de 5' a 3' los siguientes elementos operativamente unidos: un promotor regulable que consta del promotor del fago T5 de E. coli y dos secuencias de operador lac, un sitio de unión al ribosoma del fago T7 g10 de E. coli, un codon de partida traduccional, un gen estructural para IL-4 o una muteína IL-4 y más adelante en la cadena del gen estructural un terminador de la transcripción.
2. Construcción de DNA la cual comprende la secuencia de DNA mostrada en la Seq. ID Nº: 2.
3. Escherichia coli transformada con el vector de la reivindicación 1 o con la construcción de DNA de la reivindicación 2.
4. Uso del vector de acuerdo con la reivindicación 1 o de la construcción de DNA de acuerdo con la reivindicación 2 en un procedimiento de preparación de IL-4 y muteínas de IL-4.
ES00100129T 1999-01-20 2000-01-07 Plasmidos, su construccion y su uso en la preparacion de interleuquina-4 y de muteinas de interleuquina-4. Expired - Lifetime ES2269027T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99100967 1999-01-20
EP99100967A EP1022339B1 (en) 1999-01-20 1999-01-20 Plasmids, their construction and their use in the manufacture of interleukin-4 and interleukin-4 muteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2269027T3 true ES2269027T3 (es) 2007-04-01

Family

ID=8237378

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10022258A1 (de) 2000-05-08 2001-11-15 Bayer Ag Reinigung von Proteineinschlusskörpern durch Querstrom-Mikrofiltration
KR100443570B1 (ko) * 2001-07-31 2004-08-09 크레아젠 주식회사 재조합 인간 인터루킨-4의 제조방법
EP1314739A1 (en) 2001-11-22 2003-05-28 Bayer Ag Process for renaturation of recombinant, disulfide containing proteins at high protein concentrations in the presence of amines
JP2006055082A (ja) * 2004-08-20 2006-03-02 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 発光甲虫由来赤色発光酵素安定体の生産及び精製法
CN118440969B (zh) * 2024-07-08 2024-10-15 天津凯莱英生物科技有限公司 可溶性表达质粒突变体库的构建方法及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4689406A (en) * 1983-08-10 1987-08-25 Amgen Enhancement of microbial expression of polypeptides
ATE119200T1 (de) * 1986-03-27 1995-03-15 Monsanto Co Erhöhte produktion von proteinen in bakterien durch verwendung einer neuen ribosombindungsstelle.
ATE123526T1 (de) * 1987-08-17 1995-06-15 Hoffmann La Roche Hochreprimierbare expressionskontrollsequenzen.
FR2724665B1 (fr) * 1994-09-16 1996-12-20 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de production de proteines recombinantes, plasmides et cellules modifiees
MY124565A (en) * 1996-07-19 2006-06-30 Bayer Corp High-affinity interleukin-4-muteins

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