ES2268903T3 - Agente antisentido de p53 y procedimiento. - Google Patents

Abstract

Una composición para su uso en el tratamiento de un estado de enfermedad caracterizado por la inducción de p53 en un sujeto en el que dicho estado de enfermedad es el resultado de una isquémia o de una lesión isquemia/reperfusión o es cáncer, que comprende un oligómero de morfolino antisentido que tiene la secuencia de bases SEQ ID NO: 1, identificado como 5''-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3'' y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

Agente antisentido de p53 y procedimiento.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a agentes antisentido y procedimientos para el tratamiento de patologías que se caracterizan por la inducción de p53. Estas dolencias incluyen trastornos de proliferación celular, tales como cáncer, restenosis y psoriasis, y estados hipóxicos inducidos por ataques isquémicos tales como ictus.

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Antecedentes de la invención

La importancia de p53 en la proliferación celular se hace evidente a partir de la observación de que más de la mitad de todos los cánceres humanos presentan mutaciones en p53 (Levine, 1997). Se observa una inducción de la expresión de p53 en células expuestas a agente alquilantes de ADN, óxido nítrico (Messmer, 1994), radiación ionizante y ultravioleta (Lu y Lane, 1993), la enzima de restricción PvuII que induce daños cromosómicos (Lu y Lane, 1993) y otros agentes capaces de inducir rotura de la cadena de ADN (Nelson y Kastan, 1994). También se ha demostrado que la isquemia/reperfusión (Raafat, 1997), modelos de epilepsia (Xiang, 1996) y la hipoxia (Graeber, 1994) inducen p53. Como se muestra en este documento y en estudios previos (Rininger, 1997), los niveles de proteína p53 también están muy regulados por incremento durante el transcurso de la regeneración hepática que sigue a la hepatectomía parcial, mostrando que el daño de origen endógeno también puede causar la inducción de p53 in vivo.

Se han postulado funciones para p53 en la actividad de control del ciclo celular, apoptosis, diferenciación y reparación de ADN (Magnelli, 1997). Los controles del ciclo celular sirven para dos funciones importantes. Una es asegurar que se completan los sucesos esenciales del ciclo celular antes de un suceso posterior, la otra es proporcionar más tiempo para reparar el ADN dañado antes de que tenga lugar la replicación de ADN y la mitosis (Hartwell, 1994). La actividad de control de p53 tiene lugar predominantemente a nivel de las células que entrar en la fase S (síntesis de ADN) del ciclo celular (Kastan, 1992). También se ha descrito la actividad de control del paso de G_{2} a M por p53, debido a su papel regulador antes del extremo 5' de p21^{waf-1}. En ausencia de cualquier proteína, las células con el ADN dañado se detienen en un estado similar a G_{2}, pero a continuación sufren fases S adicionales sin mitosis normales intermedias (fase M), lo que conduce a anomalías nucleares, por ejemplo, poliploidía y culmina en apoptosis (Waldman, 1996).

Resumen de la invención

La invención proporciona, en un aspecto, procedimientos y composiciones para tratar una patología caracterizada por la inducción de p53 en un sujeto mamífero. El procedimiento comprende administrar al sujeto, en un vehículo farmacéutico adecuado, una cantidad farmacéuticamente eficaz de un agente antisentido que tiene la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 1, identificada como 5'-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3, donde el agente antisentido es un oligonucleótido de morfolino. En una realización preferida, el agente antisentido comprende subunidades de morfolino unidas mediante enlaces de fosforodiamidato al esqueleto.

La invención también incluye composiciones de uso en el tratamiento de estas patologías. Estas composiciones incluyen agentes antisentido como se describe anteriormente, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En aplicaciones preferidas del procedimiento, el sujeto es un sujeto humano. La patología puede ser el resultado de un daño isquémico o por isquemia/reperfusión, tal como un ictus o la consecuencia de un trasplante de órganos. Alternativamente, la patología puede ser cáncer, en cuyo caso una realización preferida además comprende la administración de un agente eficaz para aumentar las especies de radicales de oxígeno a nivel celular. Estos agentes incluyen agentes radiosensibles, radiaciones ionizantes, un ambiente de oxígeno hiperbárico y agentes quimioterapéuticos, tales como ciertas antraciclinas o antraquinonas, que aumentan las especies de radicales de oxígenos a nivel celular.

Para el tratamiento del cáncer, el procedimiento también puede incluir la administración de un agente eficaz que interfiera en la progresión del ciclo celular de la fase G_{2} a la fase M. Estos agentes incluyen inhibidores de la fosfoquinasa C (PKC), bis(cloroetil)nitrosourea (BCNU), pentoxifilina, silimarina, estaurosporina, fenilahistina, paclitaxel, ácido retinoico, flavopiridol, metil-2,5-dihidrocinamato, herboxidieno, 9-nitrocamptotecina, maitotoxina, apigenina, nocodazol y colcemida.

En otro aspecto, la invención proporciona un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases de la SEQ ID NO: 1, identificada como 5'-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3', donde el oligonucleótido es un oligonucleótido de morfolino. En una realización, el oligonucleótido es un oligonucleótido de morfolino, que preferiblemente comprende subunidades unidas mediante enlaces de fosforodiamidato al esqueleto.

Estos y otros objetivos y características de la invención serán totalmente evidentes cuando se lea la siguiente descripción detallada junto con los dibujos que la acompañan.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la estructura de un análogo de oligonucleótido de morfolino unido por fosfodiamidato; y

La Figura 2 muestra los pesos húmedos (en g) de los restos de hígados en regeneración en ratas, 24 h después de una hepatectomía parcial y la administración de los siguientes oligonucleótidos antisentido, que tienen las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente: un fosforotioato (S-ODN, 1 mg/200 g), un fosforotioato C-5-P modificado (C-5-P, 0,1 mg/200 g) y un oligonucleótido de morfolino de esqueleto neutro (fosforodiamidato) (3,4 mg/200 g). Las barras de error representan una diferencia estadística de p < 0,05 respecto al control tratado con solución salina de cada grupo respectivo.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Un "oligonucleótido antisentido" o "agente antisentido" se refiere a una molécula que incluye una secuencia de bases heterocíclicas púricas y pirimidínicas, mantenida por un esqueleto, que están unidas de forma eficaz por puentes de hidrógeno a la correspondientes bases contiguas en una secuencia de ácido nucleico diana. El esqueleto está compuesto de restos de subunidades del esqueleto que mantienen a las bases heterocíclicas púricas o pirimidínicas en posiciones que permiten estos puentes de hidrógeno. Estos restos del esqueleto son restos cíclicos de 5 a 7 átomos de longitud, unido entre sí por enlaces que contiene fósforo de uno a tres átomos de largo.

Un oligonucleótido de "morfolino" está compuesto por estructuras de subunidades de morfolino de la forma mostrada en la Figura 1, donde (i) las estructuras están unidas entre sí mediante enlaces que contienen fósforo, de uno a tres átomos de longitud, que unen el nitrógeno de una subunidad de morfolino con el carbono 5' del exociclo de una subunidad adyacente y (ii) B es un resto púrico o pirimidínico para apareamiento de bases que se une de forma eficaz, mediante enlaces de hidrógeno específicos de base, a una base en un polinucleótido. La Figura 1 muestra dos de estas unidades unidas por un enlace fosforodiamidato.

Un oligonucleótido "N3' \ding{212} P5' fosforamidato" es aquel en que el oxígeno 3' de la desoxirribosa 2' se ha sustituido por una amina 3' como se describe, por ejemplo, en Gryaznov y col. y en Chen y col.

Un "oligonucleótido 2'-O-alil (o alquil) modificado" es un oligonucleótido en el que el hidroxilo 2' se ha convertido en un éter de alilo o de alquilo. Típicamente, el éter de alquilo es un éter metílico.

Un "oligonucleótido C-5-propin-pirimidina modificado" es un oligonucleótido en que el grupo metilo del carbono C-5 de la base timidina y/o e hidrógeno del carbono C-5 de la base citidina se han sustituido por un grupo propino.

En un "ácido nucleico peptídico" las unidades de fosfato desoxirribosa de un esqueleto oligonucleotídico se sustituyen por enlaces poliamida. Como se describe, por ejemplo, en Nielsen y col. y en Hanvey y col., se obtiene el espaciado apropiado del esqueleto mediante el uso de unidades de 2-aminoetilglicina, con una base nucleotídica unida a grupos 2-amino a través de un grupo metilencarbonilo.

Un oligonucleótido o análogo de oligonucleótido "ARNasa inactivo" es aquel que actúa mediante un mecanismo independiente de la ARNasa, a diferencia de los oligonucleótidos ARNasa activos, tales como los fosforotioatos. Se cree que funcionan bloqueando de forma estérica la formación, transporte nucleocitoplasmático o traducción del ARN diana y, por tanto, también se denominan "bloqueantes estéricos". Esta clase incluye, por ejemplo, metilfosfonatos, oligonucleótidos de morfolino, como se describe en este documento, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), oligonucleótidos 2'-O-alil o 2'-O-alquil modificados y fosforamidatos N3' \ding{212} P5'.

Una dolencia "caracterizada por la inducción de p53" es una patología en la que los niveles o la expresión de la proteína p53 en células afectadas han aumentados en relación con el estado no patológico, y/o una dolencia en la que la supresión de la expresión de p53, algunas veces en combinación con otro tratamiento, tiene un efecto terapéutico beneficioso. Son ejemplos el cáncer, isquemia, tales como la que resulta de un ictus, infarto de miocardio o ataque epiléptico y el estado hipóxico resultante y daño por isquemia/reperfusión, tal como el que puede ocurrir en trasplantes de órganos.

Abreviaturas

ON = oligonucleótido

ODN = oligodesoxirribonucleótido

S-ODN = oligonucleótido de fosforotioato

C-5-P = oligonucleótido C-5-propin-pirimidina modificado

II. Oligonucleótidos antisentido A. Secuencias

Los agentes antisentido descritos en la presente solicitud comprenden subunidades de nucleótidos unidos por enlaces del esqueleto internucletídico que presentan las bases nucleotídicas para la hibridación con secuencias dianas de ARN. Las secuencias de bases de estos agentes son complementarias (antisentido) con porciones del ARNm de p53. La primera secuencia, que se corresponde con la SEQ ID NO: 1, es complementaria con una porción única del ARNm de p53 de rata (restos 1.182 a 1.199; número de acceso de Genbank X13058) y se denomina en este documento como "p53T". Esta secuencia es la misma en el ARNm de rata, ratón, mono y humano y, de este modo, son ideales para el ensayo in vivo en modelos animales.

La segunda secuencia, denominada "OL(1)p53" y que se corresponde con la SEQ ID NO: 2, es antisentido para el p53 humano y, por tanto, inhibe de forma eficaz la expresión de p53 en humanos (Iverson, Patente de EE.UU. Nº 5.641.754). Debido a que tiene cuatro fallos de emparejamiento con la secuencia de rata, no altera esta expresión en ratas y proporciona, por tanto, un control útil en los estudios en modelos de rata.

B. Estructura de los oligonucleótidos

Diversos análogos de oligonucleótidos conocidos en la técnica, presentan ventajas sobre los polinucleótidos "naturales" en áreas tales como estabilidad, resistencia a nucleasas en particular, reducción de unión inespecífica y biodisponibilidad (es decir, acceso a las células). Las estructuras pueden modificarse en el esqueleto, el resto de azúcar o las bases en sí. Estos análogos incluyen, por ejemplo, fosforotioatos (denominados en estos documentos como S-ODN), metilfosfonatos, fosfotriésteres, oligonucleótidos C-5-propin-pirimidina modificados (C-5-P), oligonucleótidos de morfolino, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), oligonucleótidos 2'-O-alil o 2'-O-alquil modificados y fosforamidatos N3' \ding{212} P5'.

La preparación de estos agentes antisentido es bien conocida en la técnica y a menudo puede realizarse convenientemente en sintetizadores automáticos. En el Ejemplo 1 se da un procedimiento general para la síntesis de S-ODN, C-5-P y oligonucleótidos de morfolino antisentido sin carga.

Se han propuesto dos mecanismos generales responsables de la inhibición de la expresión mediante oligonucleótidos antisentido (véase por ejemplo, Agrawal; Bonham; Boundvillain y la bibliografía citada en estos documentos). En el primero, un heterodúplex formado entre el oligonucleótido y el ARNm sirve como sustrato para la ARNasa H, que lleva a la escisión del ARNm. Los oligonucleótidos que pertenecen, o propuestos para pertenecer, a esta clase incluyen fosforotioatos, fosfotriésteres y fosfodiésteres (es decir, oligonucleótidos "naturales" no modificados). Generalmente, estos compuestos muestran una actividad elevada y, actualmente, los fosforotioatos son los oligonucleótidos más ampliamente empleados en aplicaciones antisentido. Sin embargo, estos compuestos tienden a producir efectos secundarios no deseados debido a la unión inespecífica a proteínas celulares (Gee), así como una escisión por ARNasa inadecuada del heterodúplex de ARN no diana (Giles).

Una segunda clase de análogos de oligonucleótidos, denominados "bloqueantes estéricos" o, alternativamente, "ARNasa inactivos" o "resistentes a ARNasa", no se observó que activaran a la ARNasa H y se cree que actúan mediante el bloqueo estérico de la formación, transporte nucleocitoplásmico o traducción del ARN diana. Esta clase incluye, por ejemplo, metilfosfonatos (Toulme) así como oligonucleótidos de morfolino, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), oligonucleótidos 2'-O-alil y 2'-O-alquil modificados y fosforamidatos N3' \ding{212} P5 (Gee). Se ha descrito que son más eficaces cuando se dirigen hacia el codón de inicio AUG, el sitio de empalme 5' o la región no traducida 5' de los ARNm. Hasta la fecha, han mostrado una actividad relativamente baja (Bonham) o, con más frecuencia, ninguna actividad cuando se dirigían más hacia el extremo 3', a las regiones codificantes (véase, por ejemplo, Toulme, para metilfosfonatos; Gambacorti para PNA; Knudsen para PNA que forman dúplex y Gee, para PNA y fosforamidatos N3' \ding{212} 5'). Se ha propuesto que los híbridos formados por estos ON, cuando se dirigen a la región codificante, no son suficientemente estables para evitar ser desplazados por la acción desenrollante del complejo ribosómico durante la traducción (Boudvillain, Gee). Una aproximación para abordar este problema ha sido unir covalentemente o intercalar el ON en su secuencia diana (Gee, Johansson). Sin embargo, sin estas modificaciones, la actividad de los ON de bloqueo estérico generalmente se ha limitado a las regiones de iniciación indicadas anteriormente.

III. Inducción de p53 en células en proliferación y supresión mediante p53 antisentido

En estudios publicados previamente (Arora, 1998), se administraron a ratas agentes antisentido p53T y ON(1)p53 descritos anteriormente inmediatamente después de una cirugía de hepatectomía parcial, como se describe en el Ejemplo 2. La regeneración del hígado de rata es un excelente sistema de modelo in vivo para estudiar los mecanismos de control del crecimiento y la proliferación celular en un ambiente natural para el tejido. Las células que proliferan rápidamente en la regeneración del hígado son extremadamente susceptibles a la carcinogénesis, ya que el tiempo disponible entre ciclos celulares para la reparación de ADN es mínimo (Grisham, 1983). Como se apuntó anteriormente, ON(1)p53 no altera la expresión de p53 en ratas y se usó como control.

Se observó una inducción masiva de p53 durante el proceso de regeneración en las ratas PH (poshepatectomizadas). Se midieron los efectos que siguieron a la administración de ON antisentido: ganancia de peso del hígado en regeneración; niveles de p53, PCNA, p21 y NADPH; contenido de ADN de células aisladas; contenido de proteínas microsomales; diversos ensayos de enzimas microsomales; tensión oxidativa, como ponía de manifiesto la peroxidación lipídica; e índice mitótico.

Cuando se trataban con p53T antisentido (SEQ ID NO: 1), los hígados perdían su actividad de control del paso de G_{1} a S en el ciclo celular, como se mostraba por el aumento (relativo a los controles) en la ganancia de peso, índice de mitosis y expresión de PCNA, que es un marcador preciso de la proliferación celular (Assy, 1988) y una reducción de 5 veces en la población de células en fase G_{1}. Los hígados de ratas PH tratadas con p53T también mostraban un número mayor de células multinucleadas. La recuperación funcional del hígado en regeneración, como se determinó mediante ensayos enzimáticos, también aumentaba con la inhibición de p53.

En resumen, los datos mostraban que la expresión de p53 se inhibe durante la regeneración de los hígados de ratas poshepatectomizadas tratadas con p53T antisentido (SEQ ID NO: 1), y que esta inhibición da lugar a la potenciación de la mitosis, elevación de la expresión de PCNA y a la disminución del número de células en la fase G_{1} del ciclo celular. Los resultados concuerdan con la actividad de control del paso de G_{1} a S en el ciclo celular de p53.

IV. Efecto comparativo de los agentes antisentido S-ODN, C-5-P y morfolino

Los agentes antisentido de morfolino de esqueleto neutro que tienen las secuencias de bases dadas como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 se preparan como se describe en el Ejemplo 1. Estos oligómeros de morfolino han mostrado elevada afinidad de unión a dianas de ARN y el esqueleto no cargado favorece su captación por las células y reduce las interacciones de unión no específicas, en relación con análogos cargados, tales como fosforotioatos. También se prepararon los correspondientes fosforotioatos C-5-propin-citosina modificados (C-5-P). Como se describe a continuación, se cree que el análogo de morfolino actúa como un "bloqueante estérico". Se ha descrito que los fosforotioatos C-5-P actúan mediante un mecanismo dependiente de la ARNasa H (Wagner), atribuido en general a los fosforotioatos.

El efecto de la administración intraperitoneal de estos agentes antisentido se comparó con el de estos fosforotioatos no modificados (S-ODN) respecto a la ganancia de peso húmedo de los restos de hígado en regeneración 24 horas tras PH, como se describe en la Sección III y en el Ejemplo 2. Los datos, mostrados en la figura 2, indican que la secuencia p53T es activa en el modelo de regeneración hepática para ambos análogos alternos ensayados y la secuencia OL(1)p53 permanecía inactiva (como se esperaba) con los análogos alternos a las dosis probadas.

\newpage

Una eficacia similar a la de una dosis de 1 mg/200 g de S-ODN p53T, se observó con 100 \mug/200 g de S-ODN C-5-P modificado y 50 nM/200 g (aproximadamente 3,7 mg/200 g) del oligonucleótido de morfolino anti-p53T (que tiene la SEQ ID NO: 1). Es especialmente destacable que el oligómero de morfolino antisentido es activo cuando se dirige al exón 10 de la región codificante del gen, en lugar de a la región 5' no traducida o al codón de inicio AUG. Como se indica anteriormente, los agentes antisentido "bloqueantes estéricos" generalmente no muestran actividad significativa cuando se dirigen en dirección 3' desde el sitio de iniciación de la traducción AUG. Esta secuencia codificante puede ser especialmente favorable para la unión de ON antisentido, formando dúplex suficientemente estables como para bloquear la traducción estéricamente. Además, como se apuntó anteriormente, se ha probado que los oligómeros de morfolino son moléculas de unión a ARN especialmente eficaces. Mientras que la invención no se limita a un mecanismo en particular, se postula que la hélice de ARN se distorsiona por la unión del oligonucleótido de morfolino y que esta distorsión interfiere con la unión al ribosoma.

Los estudios que apoyan la invención han sugerido que los grupos de propino del ODN C-5-P propin modificado sobresalen del surco principal del dúplex de ARN y, de este modo, también puede interferir estéricamente con la unión al ribosoma. Por consiguiente, la sustitución de otros grupos estéricamente voluminosos por el grupo propino, incluyendo grupos que tienen estructuras electrónicas diferente, tales como t-butilo, podría producir un efecto inhibidor similar.

V. Procedimientos terapéuticos

La presente invención proporciona un procedimiento para inhibir la expresión de p53, especialmente en células caracterizadas por la inducción de p53 y en el que la inhibición de p53 produce un beneficio terapéutico. El procedimiento puede usarse para tratar una patología que se caracteriza por la inducción de p53. El procedimiento comprende administrar al sujeto que tiene esta dolencia, o a células recogidas de este sujeto, un oligonucleótido de morfolino con una secuencia que se corresponde con la SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, el sujeto es un sujeto humano.

Como demostraron los datos mostrados en este documento y publicados en Arora, 1998, el ON anti-p53 suprime la expresión de p53 en ratas poshepatectomizadas. Se descubrió que los ON de morfolino y C-5-P eran más eficaces que cantidades equivalentes del fosforotioato no modificado (S–ODN), según se determinó mediante la ganancia de peso del hígado en regeneración. El oligómero de morfolino es sorprendentemente eficaz a la vista del hecho de que se dirige a una región codificante (exón 10), muy en dirección 3' desde la región de inicio AUG, siendo ésta la diana convencional para oligonucleótidos antisentido ARNasa inactivos ("bloqueantes estéricos").

A. Terapia antiproliferativa

Como se ha indicado anteriormente, se observa una inducción de la expresión de p53 en células expuestas a diversos agentes que dañan el ADN. El ADN dañado se repara más frecuentemente mediante síntesis de ADN no programada. Esta reparación normalmente tiene lugar durante la fase G_{1} del ciclo celular, que precede a la fase S (síntesis). Sin embargo, si las bases del ADN modificadas permanecen sin reparar (por ejemplo, eliminando el control del paso de G_{1} a S del ciclo celular, enviando de este modo prematuramente a la célula a la fase S), las consecuencias pueden incluir mutagénesis, debido a la replicación errónea de moldes de bases nucleotídicas de ADN dañados, y/o a muerte celular, debido a la incapacidad de la célula para replicar su genoma más allá de un sitio del ADN dañado.

La inhibición de la expresión de p53 suprime este control del ciclo celular y, de este modo, puede usarse para matar selectivamente células con el ADN dañado. En la patente de EE.UU. Nº 5.641.764 (Iverson) se mostraba que la administración de un oligonucleótido de fosforotioato antisentido que tenía la secuencia OL(1)p53 (SEQ ID NO: 2) producía apoptosis ex vivo e in vivo en células hepáticas humanas. El efecto se incrementaba exponiendo las células a condiciones que aumentaban el contenido neto de oxígeno reactivo en las células. Este tratamiento produce un pequeño o ningún efecto adverso en tejido normal, ya que el tejido normal tiene actividad de bloqueo de oxígeno mayor que las células cancerígenas. La mayoría de las células, por ejemplo, normalmente contienen una o más enzimas, tales como SOD, catalasa o glutatión peroxidasa, que se combinan muy rápidamente e inactivan el exceso de especies de oxígeno reactivo. Como se describe anteriormente, se cree que la supresión de control del paso de G_{1} a S mediante la inhibición de p53 previene la reparación del ADN dañado, llevando a la mutagénesis y a la muerte celular.

En un procedimiento preferido, por tanto, especialmente útil frente a células cancerígenas, el ON se administra en combinación con un agente capaz de aumentar la citotoxicidad inducida por radicales de oxígeno. El oligonucleótido y el agente pueden administrarse sustancialmente de forma conjunta, o secuencialmente, dándose en primer lugar cualquier agente terapéutico. Sin embargo, los mejores resultados se logran cuando el oligonucleótido se administra con suficiente antelación para permitir que se alcancen los niveles terapéuticos en sangre.

El aumento de los niveles de radicales de oxígeno se produce, por ejemplo, exponiendo la célula a la radiación, o a un agente capaz de producir citotoxicidad inducida por radicales de oxígeno, tal como, por ejemplo, antibióticos de antraciclina citotóxicos (por ejemplo, doxorrubicina), BCNU, BCO (butionina sulfoximina), peróxido de hidrógeno u oligonucleótidos antisentido inhibidores de SOD (superóxido dismutasa), catalasa, GSH sintetasa, GSH reductasa o GSH peroxidasa.

El agente capaz de producir citotoxicidad inducida por radicales libres puede ser, por ejemplo, un radiosensibilizador, un agente quimioterapéuticos que genere radicales de oxígeno o un oligonucleótido capaz de interaccionar con la células del hospedador causando la formación de radicales hidroxi (por ejemplo, véase Iversen, Nº de Serie de EE.UU. 07/735.067, presentada el 25 de julio de 1991, titulada "Inhibición de mutagenicidad inducida por la unión de oligonucleótidos a células", cuyo contenido se incorpora a este documento como referencia). Pueden usarse en el procedimiento de la invención varios agentes citotóxicos que tiene un efecto letal sobre las células diana del paciente, en el que el efecto letal puede potenciarse mediante uno o más agentes sensibilizadores. Se incluyen la radiación (tanto si la terapia por radiación se administra internamente como si se administra por medios externos) y fármacos citotóxicos. Ejemplos de algunos de los muchos fármacos son las mostazas nitrogenadas, tales como la mostaza nitrogenada de L-fenilalanina (melfalán); agentes quimioterapéuticos de antraciclina, tales como daunorrubicina y doxorrubicina, y compuestos de platino, tales como cis-diaminodicloro platino (cis-platino).

La radiación administrada internamente incluye radioisótopos terapéuticamente eficaces inyectados en un paciente. Estos radioisótopos incluyen, pero sin limitaciones, los radionucleidos de metales ^{186}Re, ^{188}Re, ^{64}Cu, ^{67}Cu, ^{109}Pd, ^{212}Bi, ^{203}Pb, ^{212}Pb, ^{211}At, ^{97}Ru, ^{105}Rh, ^{198}Au, ^{199}Ag o ^{131}I. Estos radioisótopos generalmente se unirán a moléculas portadoras (por ejemplo, en forma de un conjugado quelato-anticuerpo) cuando se administran a un paciente. Ejemplos de agentes radioterapéuticos adecuados administrados internamente son los quelatos de radionucleidos de metales conjugados con anticuerpos como se describe, por ejemplo, en la publicación EP Nº 188.256. La radiación administrada por medios externos incluye radiación con haz externo, tales como la terapia con cobalto.

La elección de un agente sensibilizador depende de factores tales como el tipo de tumor en particular que se va a tratar y el agente citotóxico que se va a administrar. Preferiblemente, el compuesto es selectivo de un cierto sitio diana in vivo, tal como una célula cancerígena. Por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 4.628.047 describe el uso de diltiazem para potenciar la sensibilidad de varios tipos de células cancerígenas a agentes citotóxicos, tales como doxorrubicina. Otros emparejamientos de sensibilizadores con fármacos citotóxicos, así como diferencias esperadas en la susceptibilidad de tipos diferentes de células cancerígenos al tratamiento con estos agentes se describen en Important Advances in Oncology (DeVita y col., editores, J B., Lippincott Co., Filadelfia (1986), pág. 145-157).

Un sensibilizador preferido es BSO (butionina sulfoximina, disponible en Chemical Dynamics Corporation, South Plainfield, N.J), un aminoácido sintético que inhibe la \gamma-glutamilcisteína sintetasa y lleva a un descenso marcado de glutatión (GSH) en las células. De este modo, se piensa que BSO funciona como un sensibilizador para fármacos que tienen un efecto citotóxico potenciado por el descenso en los niveles de glutatión celular. Especialmente preferido es el isómero S de BSO, que es útil para retirar el glutatión de la célula (véanse las Patentes de EE.UU. Nº 5.171.885 y 5.245.077).

Pueden identificarse combinaciones adicionales de sensibilizadores y agentes citotóxicos mediante procedimientos tales como ensayos in vitro usando células cultivadas que se corresponden con las células diana deseadas (por ejemplo, una línea celular cancerígena específica). Por ejemplo, Russo y col. describen ensayos para determinar si BSO es eficaz para la reducción de los niveles de la glutatión sintetasa en un tipo en particular de línea celular.

La descripción anterior de especies que generan radicales de oxígeno, agentes citotóxicos y sensibilizadores se dirige principalmente a las células diana preferidas, es decir, células cancerígenas caracterizadas por la expresión de p53. Estos cánceres incluyen los de vejiga, cerebro, mama, cuello del útero, colon, esófago, laringe, hígado, pulmón, ovario, páncreas, próstata, piel, estómago y tiroides.

En otro procedimiento preferido, la administración del ON antisentido se acompaña de la administración de un agente eficaz para interferir en la progresión de la fase G_{2} a la fase M (mitosis) del ciclo celular. Estos agentes incluyen, por ejemplo, pentoxifilina (Russell, 1996), silmarina (Ahmad, 1998), estaurosporina (Swe, 1997), fenilahistina (Kanoh, 1997), paclitaxel (Shu, 1997), ácido retinoico (Zhu, 1997), flavopiridol (Sedlacek, 1996), metil-2,5-dihidrocinamato (Koch, 18996), herboxidieno (Horiguchi, 1996), 9-nitrocamptotecina (Khooustov, 1995), maitotoxina (VanDolah, 1996), apigenina (Sato, 1994), nocodazol y colcemida (Zhang, 1998). Publicaciones recientes (Cross, 1995) sugieren que p53 es un instrumento de control del huso, que asegura el ensamblaje completo del aparato del huso durante la fase de mitosis (M) del ciclo celular. En estudios que apoyan la invención, ratones deficientes en p21, cuando se trataban con inhibidores del paso de G_{2} a M, tales como los enumerados anteriormente, mostraban un grado elevado de aneuploidía en las células afectadas. Se postula que los inhibidores impiden que las células experimenten una progresión normal hacia la fase de mitosis y, careciendo de control mitótico (y de paso de la fase G_{1} a S), las células experimentan fases de síntesis (S) sucesivas que dan lugar a aneuploidía. Debido a que p53 es necesario para la activación transcripcional de p21, las células en las que se ha inhibido p53 mediante los agentes antisentido de la invención, mostrarían un efecto similar.

También pueden usarse inhibidores del huso, tales como nocodazol o colcemida (Cross, Zhang) junto con agentes antisentido anti-p53. En ausencia de control del huso dependiente de p53, se espera que estas células experimenten ciclos celulares sucesivos con fases mitóticas anómalas o incompletas, llevando también a poliploidía o aneuploidía.

También pueden tratarse trastornos hiperproliferativos. Los ejemplos de trastornos hiperproliferativos de la piel incluyen células infectados con el virus del papiloma humana (HPV), normalmente asociado con verrugas, neoplasias superficiales de la piel, tales como melanomas, carcinomas premalignos y malignos, queratosis actínica, lupus eritematoso, dermatitis y psoriasis. Las enfermedades hiperproliferativas de otros tejidos epiteliales (por ejemplo, endotelio, mesotelio) incluyen enfermedad obstructiva reversible de las vías respiratorias, tal como asma y bronquitis. También pueden tratarse diversos trastornos hiperproliferativos del ojo, incluyendo córnea cónica, queratoconjuntivitis, conjuntivitis vernal y queratitis leucoma. Los procedimientos también pueden usarse para tratar enfermedades vasculares hiperproliferativas, tales como hiperplasia de células de la íntima del músculo y restenosis.

B. Tratamiento de estados hipóxicos y de isquemia

Otras patologías caracterizadas por la inducción de p53 incluyen estados hipóxicos tales como los que siguen a un ataque isquémico, tal como un ictus. Por ejemplo, se observó que p53 se expresaba preferiblemente en células apoptóticas tras la isquemia cerebral (Li) y en neuronas dañadas en modelos de isquemia y epilepsia (Xiang). Raafat observaba un aumento en los niveles de p53 tras la isquemia/reperfusión en riñones y proponía que el aumento puede facilitar la apoptosis. También se ha descrito que el choque térmico induce p53 (Graeber). Por lo tanto, en otro aspecto, la invención incluye el tratamiento de tejidos sometidos a estos esfuerzos, por ejemplo, choque térmico, convulsiones epilépticas, ictus y otros casos de isquemia y/o reperfusión (por ejemplo, tras el trasplante de órganos) con agentes antisentido anti-p53, como se describe en este documento.

VI. Formulaciones y administración A. Formulaciones terapéuticas

Para la administración de acuerdo con los procedimientos de tratamiento de la invención, los oligonucleótidos antisentido se combinan preferiblemente con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un vehículo o excipiente líquido adecuado y aditivos auxiliares opcionales. Los vehículos y excipientes líquidos son convencionales y están disponibles en el mercado. Ilustrativos de los mismos son agua destilada, solución salina fisiológica, soluciones acuosas de dextrosa y similares.

En general, además de los compuestos activos, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener excipientes y compuestos auxiliares adecuados que faciliten el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que puedan usarse farmacéuticamente. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas, tales como azúcares, por ejemplo, lactosa o sacarosa, manitol o sorbitol, preparaciones de celulosa y/o fosfatos cálcicos, y aglutinantes, tales como almidón, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona. Si se desea, pueden añadirse agentes de desintegración, tales como los almidones mencionados anteriormente, así como almidón carboximetilo, polivinil pirrolidona entrecruzada, agar, ácido algínico y una sal de los mismos. Los compuestos auxiliares incluyen agentes de regulación del flujo y lubricantes, por ejemplo, sílice, talco, ácido esteárico o sales de los mismos, y/o polietilenglicol.

Pueden proporcionarse recubrimientos adecuados para los núcleos de las grageas, si se desea que puedan ser resistentes a los jugos gástricos. Con este fin, pueden usarse soluciones concentradas de azúcar, que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, lacas en solución y disolventes orgánicos adecuados y mezclas de disolventes. Para producir recubrimientos resistentes a los jugos gástricos se usan soluciones de preparaciones de celulosa adecuadas, tales como ftalato de acetilcelulosa y ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa. Pueden añadirse soluciones colorantes y pigmentos a los comprimidos de grageas recubiertas para su identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.

Otras preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificador, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los compuestos activos en forma de gránulos que pueden mezclarse con cargas, tales como lactosa, aglutinantes, tales como almidones, y/o lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos preferiblemente se disuelven o resuspenden en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizantes.

Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía rectal, por ejemplo, supositorios, están compuestos de una combinación de los compuestos activos con una base para supositorio. Las bases adecuadas para supositorio incluyen triglicéridos naturales o sintéticos, hidrocarburos parafinados, polietilenglicoles o alcanoles superiores. Además, es posible usar cápsulas rectales de gelatina que están compuestas de una combinación de los compuestos activos con una base. Los posibles materiales base incluyen triglicéridos líquidos, polietilenglicoles o hidrocarburos parafinados.

Las formulaciones líquidas adecuadas para su administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua o dispersable en agua. Además, pueden administrarse suspensiones de los compuestos activos como suspensiones oleosas apropiadas para inyección. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen ácidos grasos, por ejemplo aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos grasos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones para inyección acuosa pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.

Además de la administración con vehículos convencionales, los ingredientes activos pueden administrarse mediante diversas técnicas de administración especializadas. Por ejemplo, los compuestos de la presente invención puede administrarse encapsulados en liposomas. El ingrediente activo, dependiendo de su solubilidad, puede estar presente tanto en la fase acuosa como en la capa o capas lipídicas o en lo que generalmente se denomina suspensión liposómica. La capa lipídica generalmente comprende fosfolípidos, tales como lecitina o esfingomielina, esteroides tales como colesterol, tensioactivos iónicos tales como diacetilfosfato, estearilamina o ácido fosfatídico y/u otros materiales hidrófobos. Los diámetros de los liposomas generalmente oscilan de aproximadamente 15 nm a aproximadamente 5 micrómetros.

Los procedimientos para preparar estas formas de dosificación son conocidos o estarán claros para los expertos en la técnica, por ejemplo, véase Remington's Pharmaceutical Sciences (19ª Edición, Williams y Wilkins, 1995). Las preparaciones farmacéuticas se hicieron según procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse por medio de procedimientos convencionales de mezcla, granulación, producción de grageas, disolución o liofilización. El proceso usado dependerá en última instancia de las propiedades físicas del ingrediente activo usado.

B. Tratamiento de tumores

La composición puede administrarse a un sujeto por vía oral, transdérmica o parenteral, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular. Para su uso antineoplásico in vivo, los oligonucleótidos antisentido del ARNm de p53 preferiblemente se administran por vía intravenosa.

Según la presente invención, el oligonucleótido que inhibe la expresión de p53, que actúa, por tanto, como un regulador por disminución de la ruta de reparación oxidativa, se administra a un paciente antes o junto con la administración del agente capaz de producir citotoxicidad inducida por radicales de oxígeno. Cuando se administran simultáneamente, los dos agentes activos puede estar en forma conjugada o no conjugada. Si están en forma conjugada, se prefiere que el conjugado comprenda un enlace escindible, de modo que el oligonucleótido y el agente citotóxico se liberen en el sitio diana.

La cantidad de cada agente administrado es tal que la combinación de los dos tipos de agente es terapéuticamente eficaz. Las dosis variarán según factores tales como la edad, salud, sexo, estatura y peso del paciente, la vía de administración, la toxicidad de los fármacos y las susceptibilidades relativas del cáncer al oligonucleótido y al agente citotóxico. Se han establecido dosis y formas de dosificación recomendadas para la mayoría de los agentes citotóxicos y pueden obtenerse de fuentes convencionales, tales como, el Physicians Desk Reference, publicado por la Medical Economics Company Inc., Oradell, N.J. Si es necesario, estos parámetros puede determinarse para cada sistema mediante procedimientos y análisis bien establecidos, tales como, en ensayos clínicos.

Para su uso in vivo, la dosis preferida de los oligonucleótidos de la invención típicamente es aquella necesaria para lograr una concentración en la sangre de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 \mumol/l. Esta concentración puede alcanzarse de varias formas; se ha encontrado que son aceptables dosis de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,2 mg/kg/hora mediante infusión continua por vía IV. Pueden administrarse cantidades mayores o menores de oligonucleótido si es necesario.

El ejemplo 3, a continuación, demuestra la aplicación de la invención al tratamiento del linfoma humano de células B.

C. Tratamiento del daño isquémico

La dolencia isquémica puede ser debida a una interrupción en la circulación cerebral, tal como la causada por un fallo cardíaco, u otras dolencias que llevan a la pérdida global de aporte sanguíneo al cerebro o a interrupciones localizadas del flujo sanguíneo, tales como las debidas a una hemorragia cerebral o a sucesos trombóticos y embólicos localizados, o por un traumatismo craneal. La dolencia isquémica que se va a tratar generalmente se asocia con ictus, definido como la disminución o pérdida repentina de la función neurológica causa por una obstrucción o rotura de vasos sanguíneos en el cerebro. El daño cerebral secundario que resulta del episodio isquémico original normalmente incluye la destrucción de células cerebrales, o lesiones en el área que rodea al daño isquémico, en el caso de isquemia focal, y también en áreas de vulnerabilidad selectiva en lesiones, tales como el hipocampo o los ganglios basales en el caso de isquemia global. El daño secundario puede manifestarse a menudo por deficiencia funcional, tal como la pérdida de memoria a corto o largo plazo.

El ON se formula para su administración por vía parenteral en un vehículo inerte adecuado, tal como una solución salina fisiológica estéril. La dosis administrada se determinará en función de la vía de administración. Una vía adecuada es la intracerebroventricular (ICV), a un nivel de dosis de aproximadamente 50 \mug - 5mg de ON/kg de peso corporal. Puede estimarse una dosis farmacéuticamente eficaz, es decir, una dosis eficaz para producir una reducción significativa del daño anatómico y/o funcional, a partir de la dosis/respuesta observada en sistemas modelo de daño isquémico e ictus. Estos sistemas modelo incluyen el modelo de isquemia global en gerbo, producido por la oclusión transitoria de las arterias carótidas del cuello y el modelo de oclusión de los cuatro vasos en rata. El daño anatómico se examina en los tejidos y el daño funcional puede evaluarse mediante la observación de hiperactividad, una consecuencia normal de la isquemia cerebral en animales o por el efecto en la memoria a corto plazo. Estos procedimientos son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.051.403.

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D. Tratamiento de restenosis

Un aspecto importante de una terapia antirrestenosis eficaz, especialmente respecto a agentes antisentido, es el suministro eficaz del oligómero antisentido a las células afectadas. Normalmente, los fármacos antirrestenosis administrados por vía sistémica no consiguen alcanzar una concentración eficaz en el sitio de lesión del vaso si no se usan concentraciones de fármaco intolerablemente elevadas. Los dispositivos de administración, tales como los descritos en la solicitud de patente de EE.UU. de propiedad compartida y en trámite junto con ésta, número de serie 09/062.160, titulada "Procedimiento de tratamiento de la restenosis mediante antisentido dirigido hacia CMV", pueden usarse para suministrar el oligómero en el lugar de la angioplastia en el paciente. El oligómero preferiblemente es un oligómero de morfolino y, preferiblemente, está contenido en un vehículo farmacológicamente aceptable. El oligómero también puede estar contenido en un vehículo polimérico biocompatible, también descrito en la solicitud referenciada anteriormente.

Preferiblemente, el oligómero se suministra junto con el procedimiento de angioplastia. Como publicó Farrell, la captación de un oligonucleótido por las células puede aumentar significativamente cuando el compuesto se administra a arterias dañadas con un globo, en relación con la captación por las arterias normales. La terapia con fármacos usando las composiciones de la invención puede combinarse con terapia de radiación o fotodimánica.

Las dosis se determinan según la estatura del sujeto, la vía de administración y la extensión del tejido afectado, según prácticas farmacéuticas convencionales. El nivel de fármaco preferido es aquel que es eficaz para inhibir la expresión de p53 y reduce o previene la restenosis, sin efectos secundarios intolerables. Para un humano adulto, la dosis recomendada está en el intervalo de 1-25 \mumoles de oligómero antisentido y, preferiblemente, de 2-15 \mumoles. La dosis óptima para una vía de administración determinada puede determinarse mediante experimentación rutinaria según procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse para la administración al lugar de la lesión del vaso, modelos in vivo tales como los descritos en Edelman y Rosenberg.

Cuando el oligómero se incorpora en un dispositivo de administración de fármacos, el dispositivo suministra de forma eficaz una dosis apropiada de fármaco, como se describe anteriormente. Respecto al área superficial del tejido que se va a tratar, una dosis eficaz normalmente está en el intervalo de 30 a 3.000 \mug de oligómero por cm^{2} de pared del vaso y, más preferiblemente, de aproximadamente 300 a 1.500 \mug/cm^{2}. También puede darse la composición al paciente de forma periódica tras la angioplastia, a un nivel de dosificación suficiente como para inhibir además la restenosis.

Mientras que la invención se ha descrito en referencia a procedimientos y realizaciones específicas, se apreciará que pueden hacerse diversas modificaciones sin alejarse de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Síntesis de oligonucleótidos

Todas las síntesis de extensión de cadena se realizaron en un sintetizador de ADN de Applied Biosystems Modelo 380B (Foster City, CA) usando 1 \mumol de columna soporte y la aproximación del cianoetilo que emplea la química del fosforamidato como describe el Boletín del Usuario de ABI, Nº 58, 1991. El sintetizador se programó con el protocolo del manual del usuario.

El resumen de una síntesis típica es el siguiente: se inserta 1 \mumol de soporte de columna de gel de sílice con la base 3' del ODN (es decir, nucleótido sin modificar, nucleótido C-5-propino o análogo del nucleótido morfolino) unido mediante el grupo 3' hidroxilo, y la síntesis se realiza base a base en dirección de 3' a 5'. Todos los reactivos líquidos son suministrados por Applied Biosystems, Inc. El gas argón es suministrado por Air Products (Omaha). La primera etapa es el lavado de la columna con acetonitrilo y después con gas argón que elimina cualquier resto de la columna. A continuación, el ácido tricloroacético protona el grupo dimetoxitritilo (DMT), que protege el oxígeno 5' de los nucleótidos durante la síntesis de ODN. A continuación, el DMT protonado se elimina de la base. La columna se lava otra vez con acetonitrilo y argón. El DMT eliminado se recoge en la salida de residuos de DMT en tubos de ensayo y se analiza si tiene un color anaranjado brillante. Este análisis de color se realiza para asegurarse de que la destritilación ha sido satisfactoria. Los grupos DMT pueden cuantificarse por espectrofotometría leyendo la absorbancia a 498 nm. Si el color no es naranja brillante, entonces puede que la destritilacion de las bases no se haya realizado satisfactoriamente y puede que tenga lugar una síntesis de ODN impuros. La siguiente etapa de la síntesis es la unión de la siguiente base en la secuencia del ODN. Una base nucleotídica apropiada, modificada a fosforamidato de cianoetilo, se disuelve en acetonitrilo y se añade con tetrazol a la columna. Las bases reaccionan para formar un enlace fosfito internucleotídico. La columna se lava otra vez con acetonitrilo y argón. Cualquier grupo 5' hidróxido no conjugado se cubre con un grupo acetilo lavando la columna con anhídrido acético y 1-metilimidazol. Esta cubierta evitará que estas bases no conjugadas continúen la síntesis y reduce la longitud de las impurezas. Las columnas se lavan de nuevo y los fosfitos trivalentes se oxidan a los triésteres de fosforotioato pentavalente con disulfuro de tetraetiltiuram y acetonitrilo. La columna se lava otra vez con acetonitrilo y argón. A continuación, la síntesis se repite de nuevo con la siguiente base de la secuencia empezando con la etapa de destritilación. Los S-ODN se escinden de la columna pasando a través de la columna hidróxido amónico y se recoge el eluído. El hidróxido amónico y el cianoetilo (de los enlaces fosfato) se eliminan por evaporación de la solución de S-ODN en una centrífuga al vacío durante una noche. El ODN deshidratado se diluye en solución salina estéril. La pureza del S-ODN se analizó aplicando una muestra del S-ODN diluido en agua en un gel de poliacrilamida al 10%. La concentración de S-ODN se determina leyendo la absorbancia a 260 nm y multiplicando la absorbancia por su coeficiente de extinción.

Detalles adicionales de la preparación de análogos de oligonucleótidos de morfolino pueden encontrarse, por ejemplo, en Summerton y Weller, Antisense & Nucleic Acid Drug Dev. 7: 187-195 (1997).

Ejemplo 2

Hepatectomía parcial

El estudio de hepatectomía parcial se realizó en ratas machos Sprague Dawley (Sasco, Omaha, NE) que pesaban entre 200-220 gramos. Los animales se alojaron en jaulas de plástico transparentes en una instalación aprobada por la AAALAC de UNMC con ciclos de 12 horas de luz/oscuridad y se les permitió el libre acceso a comida de rata de Purina y a agua corriente. Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el "Comité Institucional de Cuidado y Utilización de Animales" de la Universidad.

El procedimiento se realizó como se describe en Higgins y Anderson (1931). Se emplearon técnicas quirúrgicas asépticas. Las ratas se anestesiaron usando metoxiflurano (Mallinckrodt Veterinary, Mundelein, IL) y se pusieron con su superficie ventral expuesta. Se afeitó un área de tres a cuatro centímetros de longitud a lo largo de la línea mediana inmediatamente posterior al proceso xifoide y se frotó con betadine. Se hizo una incisión a lo largo de la línea mediana para dejar expuesto el hígado. Se ligaron de forma segura los lóbulos medio y lateral izquierdo y, a continuación, se escindieron. Esto dio lugar a la retirada de aproximadamente el 65 al 70 por ciento del total del hígado. La incisión abdominal se cerró en dos capas. Las ratas control que no sufrieron hepatectomía parcial experimentaron una cirugía idéntica pero ficticia, ya que sus hígados fueron sólo expuestos pero no se escindieron parcialmente.

Administración de oligonucleótidos: Los ODN se inyectaron por vía intraperitoneal a una dosis de 1 mg/200 g/día para S–ODN, 0,1 mg/220 g/día para C-5-P S-ODN y 50 nM (aproximadamente 3,4 mg/200 g/ día) para morfolino. A todas las ratas se les administraron los respectivos ODN inmediatamente después de recuperar la consciencia tras la cirugía, y cada 24 h a partir de entonces, dependiendo de la duración del experimento. A continuación, se permitió que las ratas se recuperaran durante 1, 2, 5 ó 7 días desde el momento de la cirugía. El peso húmedo ganado se determinó 24 h después de la administración de ODN para obtener los datos mostrados en la Figura 1.

Ejemplo 3

Tratamiento del linfoma de células B humano

Régimen de tratamiento con el fármaco: Empezando a día 0, los pacientes reciben un oligonucleótido de morfolino antisentido que tiene la SEQ ID NO: 1 a una dosis de 0,2 mg/kg/h como una infusión continua por vía IV durante 7 días a través de un dispositivo de acceso venoso. Se da quimioterapia MINE empezando el día 4, según el siguiente programa:

\bullet

Inyección de Mesna (MESNEX^{TM}, Bristol-Meyers Oncology): 500 mg/m^{2} IV 30 minutos antes de ifosfamida, 250 mg/m^{2} IV cuatro horas después de ifosfamida y 250 mg/m^{2} por vía oral ocho horas después de la ifosfamida los días 4 y 7.

\bullet

Ifosfamida (IFEX^{TM}, Bristol-Meyers Oncology): 1,33 g/m^{2} IV los días 4 y 7.

\bullet

Clorhidrato de mitoxantrona (NOVANTRONE^{TM}, Laboratorios Lederle) 10 mg/m^{2} IV sólo el día 4.

\bullet

Etopósido (VEPESID^{TM}, Bristol-Meyers Oncology) 80 mg/m^{2} IV los días 4 y 7.

En los pacientes se evalúa de forma regular la toxicidad y la respuesta de su enfermedad. Semanalmente, a los pacientes se les realiza el CBC (recuento sanguíneo completo) y el recuento de plaquetas. Los ciclos se repiten cada 4 semanas hasta un máximo de 6 ciclos. Se evalúa en los pacientes la respuesta mensurable de la enfermedad a cada ciclo mediante examen físico. Los pacientes se clasifican respecto a su respuesta (respuesta completa, respuesta parcial, respuesta estable o progresión de la enfermedad).

Se espera que los pacientes muestren una respuesta clínica aumentada con esta terapia en oposición a la terapia tradicional MINE que no incluyen el uso del oligonucleótido antisentido de SEQ ID NO: 1 (OL(1)p53). Se espera que OL(1)p53 haga sensibles a las células cancerígenas a los efectos de MINE inhibiendo el mecanismo de reparación del ciclo celular, matando preferiblemente, de este modo, a las células cancerígenas mediante apoptosis independiente de p53.

<110> AVI BioPharma, Inc.

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<120> Agente y procedimiento antisentido para p53

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<130> 0450-0022.41

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<140> Aún no asignado

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<141> Presentado en este documento

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<150> US 60/105.695

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<151> 26-10-1998

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<160> 2

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<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

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<210> 1

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido antisentido

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

tcagtctgag tcaggccc

\hfill

18

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<210> 2

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido antisentido

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<400> 2

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ccctgctccc ccctggctcc

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20

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Claims (9)

1. Una composición para su uso en el tratamiento de un estado de enfermedad caracterizado por la inducción de p53 en un sujeto en el que dicho estado de enfermedad es el resultado de una isquemia o de una lesión isquemia/reperfusión o es cáncer, que comprende un oligómero de morfolino antisentido que tiene la secuencia de bases SEQ ID NO: 1, identificado como 5'-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3' y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que el oligonucleótido de morfolino comprende subunidades de morfolino unidas mediante enlaces fosforodiamidato al esqueleto.

3. La composición de la reivindicación 1, que además comprende un agente eficaz para aumentar las especies de radicales de oxígeno a nivel celular.

4. La composición de la reivindicación 3, en la que dicho agente se selecciona de un agente radiosensibilizante, radiación ionizante, un ambiente de oxígeno hiperbárico y un agente quimioterapéutico que aumenta las especies de radicales de oxígeno a nivel celular.

5. La composición de la reivindicación 4, en la que dicho agente quimioterapéutico es una antraciclina o antraquinona.

6. La composición de la reivindicación 1, que además comprende un agente eficaz para interferir en la progresión de la fase G_{2} a la fase M del ciclo celular.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que dicho agente se selecciona del grupo que consiste en el inhibidor de la fosfocinasa C (PKC), bis(cloroetil)nitrosourea (BCNU), pentoxifilina, silimarina, estaurosporina, fenilahistina, paclitaxel, ácido retinoico, flavopiridol, metil-2,5-dihidrocinamato, herboxidieno, 9-nitrocamptotecina, maitotoxina, apigenina, nocodazol y colcemida.

8. Un oligómero de morfolino que tiene la secuencia de bases SEQ ID NO: 1, identificada como 5'-TCA GTC TGA GTC AGG CCC-3'.

9. Un oligómero según la reivindicación 8, que comprende subunidades de morfolino unidas mediante enlaces fosforodiamidato al esqueleto.