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ES2268961B1 - Nueva proteina epcr soluble de origen no proteolitico y su uso. - Google Patents

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ES2268961B1 ES200500623A ES200500623A ES2268961B1 ES 2268961 B1 ES2268961 B1 ES 2268961B1 ES 200500623 A ES200500623 A ES 200500623A ES 200500623 A ES200500623 A ES 200500623A ES 2268961 B1 ES2268961 B1 ES 2268961B1
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Abstract

Nueva proteína EPCR soluble de origen no proteolítico y su uso. La presente invención se refiere a una nueva forma soluble de EPCR procedente de un mecanismo de corte-empalme alternativo, y más concretamente a un polipéptido que comprende los residuos 201-256 de la secuencia SEQ ID NO:1, o un fragmento de dicha secuencia, así como a una proteína EPCR aislada o recombinante que comprende dicho polipéptido, a un polinucleótido aislado que codifica para dicho polipéptido, un mRNA que codifica una proteína que comprende dicho polipéptido y a su uso en la detección de enfermedades, a un vector de expresión o una célula hospedadora que comprenden dicho polinucleótido que comprende, un sistema de expresión que comprende el vector de expresión y dicha célula, un anticuerpo aislado específico para dicho polipéptido, un método y un kit para la detección selectiva in vitro en una muestra biológica, de una proteína EPCR que comprende la secuencia SEQ ID NO:1.

Description

Nueva proteína EPCR soluble de origen no proteolítico y su uso.
Antecedentes de la invención
La última proteína del sistema de la proteína C (PC) descrita es el receptor endotelial de la proteína C/proteína C activada (EPCR) (1, 2). El EPCR se expresa en la membrana de las células endoteliales y liga con alta afinidad (Kd \sim 30 nM) la PC y la proteína C activada (PCA). Su misión fisiológica es concentrar la PC en la superficie endotelial y presentarla al complejo trombina-trombomodulina favoreciendo de este modo una eficaz activación de la PC (3). En estudios realizados en primates no humanos se ha demostrado que el bloqueo del EPCR con un anticuerpo monoclonal disminuye la producción fisiológica de PCA en un 90% y estudios recientes sugieren que los defectos genéticos del EPCR pueden predisponer a padecer trombosis venosa y arterial (4-7). Estos hechos demuestran el importante papel que puede jugar el EPCR en la regulación de la coagulación y en la trombosis. Pero además, el EPCR parece ser una de las moléculas responsables del poderoso efecto antiinflamatorio de la PC.
La interacción PC/PCA con el EPCR podría jugar un papel crucial en la modulación de la respuesta coagulopática e inflamatoria que se desarrolla en la infección por gérmenes gramnegativos (8). Recientemente se ha podido demostrar que la PCA tiene un efecto antiinflamatorio y antiapoptótico en células endoteliales y que para que este efecto sea evidente es necesaria la presencia de EPCR (9, 10).
El EPCR es una glicoproteína de aproximadamente 46 kDa. La proteína madura está compuesta de 221 aminoácidos después de la eliminación del péptido señal, que consta de 17 residuos (11). Está codificada por un gen localizado en el brazo largo del cromosoma 20 (20q11.2), formado por cuatro exones interrumpidos por tres intrones (12). El exón I codifica la región 5' no traducida y el péptido señal, el exón IV codifica el dominio transmembrana, la cola intracitoplasmática compuesta por tres residuos y la región 3' no traducida. Los exones II y III codifican la mayor parte de la región extracelular del EPCR, que presenta homología con los dominios \alpha1 y \alpha2 de las proteínas pertenecientes a la superfamilia CD1 del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I. Recientemente se ha logrado cristalizar y analizar la estructura tridimensional que muestra cómo el EPCR presenta una plataforma formada por hojas plegadas \beta sobre la que se apoyan dos regiones con conformación en hélice \alpha que forman un bolsillo donde se aloja un fosfolípido que estabiliza la molécula (13). Así mismo, mediante alanine scanning, se han identificado los principales residuos implicados en la unión con la PC/PCA, a la que se une a través del dominio GLA de ésta en presencia de iones calcio y magnesio (14).
Pero además del EPCR anclado en la membrana de la célula endotelial, existe una forma soluble en plasma
(sEPCR) que, al menos parcialmente, procede de la digestión del EPCR por acción de metaloproteinasas inducidas por estímulos como la trombina (15, 16).
El artículo (15) J. Clin. Invest. vol. 100, no. 2, July 1997, 411-418, se refiere a una forma soluble de EPCR encontrada en plasma. Se dice que el EPCR en plasma parece ser una especie única, y la secuenciación del fragmento amino terminal de la proteína purificada dio como resultado una única secuencia de EPCR en plasma, y que era coincidente con la secuencia amino terminal de sEPCR recombinante. Se dice que como en el caso de otros receptores, el origen de dicho EPCR soluble puede ser ruptura proteolítica, o un mecanismo de corte-empalme alternativo, y en concreto la estructura genómica de EPCR bovino contiene un sitio de corte alternativo que codifica una proteína en la que el dominio de transmembrana es sustituido por una secuencia codificada por el intrón que se localiza a continuación del exón III (17). Este documento indica que se precisarían más estudios para probar la posibilidad de una forma de EPCR derivada de corte alternativo.
Por otra parte, la solicitud WO-9900673 se refiere al aislamiento y caracterización de sEPCR en plasma humano y se dice que el sEPCR puede proceder de proteolisis, en la que se libera un dominio extracelular de EPCR y deja el resto de la proteína unida a la membrana, o de un mecanismo de corte-empalme alternativo del mRNA que da lugar a la secuencia de altsEPCR. En la figura 1 que acompaña la presente solicitud se muestra un esquema en el que se observa la diferencia entre el EPCR soluble de origen proteolítico (sEPCR), el EPCR descrito en la solicitud WO-9900673 (altsEPCR)obtenido por corte- empalme alternativo y el nuevo EPCR objeto de la presente invención (sEPCRvar).
La presente solicitud por tanto señala que, al menos el EPCR humano, puede sufrir un procedimiento de corte-empalme alternativo, dando lugar a EPCR truncado soluble, que incluye un inserto único presente sólo en la forma EPCR soluble que procede de dicho mecanismo de corte-empalme alternativo (sEPCRvar). Dicho sEPCRvar puede servir como marcador de procesos de enfermedades en grandes vasos y de cáncer.
Cuando la PCA se une al sEPCR, la primera pierde sus propiedades anticoagulantes pero mantiene su capacidad enzimática, por lo que se piensa que el sEPCR altera la especificidad de la PCA, dirigiéndola posiblemente hacia un sustrato no conocido por el momento, que podría estar en conexión con las propiedades antiinflamatorias atribuidas a la PCA (18). El sEPCR compite con el EPCR presente en la membrana por la proteína C y de este modo inhibe la generación de PCA. También se ha descrito que ese sEPCR es capaz de interaccionar con los neutrófilos activados a través de la proteinasa-3(PR3)(19), una proteinasa presente en los gránulos de los neutrófilos y de Mac-1 (CD11b/CD18, una integrina de expresión inducible, presente en la superficie de neutrófilos y monocitos). PR3 está probablemente involucrada en mecanismos de destrucción tisular actuando sobre los precursores de TNF-alpha e IL-1beta unidos a membrana; Mac-1 interviene en procesos de señalización celular y en fenómenos de adhesión intercelular, interactuando con moléculas de adhesión como ICAM-1 endotelial, por lo que juega un papel en el reclutamiento de neutrófilos durante los procesos inflamatorios. Presumiblemente, la unión del sEPCR a PR3 y Mac-1 reduciría la actividad de éstas.
Partiendo de DNA genómico humano (cDNA) los inventores han podido clonar y expresar una nueva proteína. El análisis y comparación de su secuencia con otras conocidas, así como su caracterización funcional, han demostrado que dicha proteína es una forma no conocida de la proteína EPCR soluble generada por procesos de corte-empalme alternativo. Por otra parte, dicha proteína tiene como rasgo diferencial una región polipeptídica codificada por la región originariamente considerada como región 3' no traducida del gen del EPCR, que no está presente en las formas de EPCR conocidas hasta el momento.
Descripción de la invención
La presente invención se refiere en primer lugar a una nueva forma soluble de EPCR, que denominamos EPCR soluble variante (sEPCRvar), más específicamente a un polipéptido procedente de un receptor endotelial de la proteína C, que comprende los residuos 201-256 - que constituyen la SEQ ID NO: 12 - de la secuencia SEQ ID NO: 1, o un fragmento de dicha secuencia de residuos. En una realización particular dicho fragmento posee al menos 9 aminoácidos. Según realizaciones particulares de la invención dicho fragmento está seleccionado entre un fragmento que comprende los residuos 213-227 (SEQ ID NO: 13), 229-242 (SEQ ID NO: 14), 212-226 (SEQ ID NO: 15), 227-241 (SEQ ID NO: 16), 242-256 (SEQ ID NO: 17), de la SEQ ID NO: 12.
En una realización particular dicho fragmento posee propiedades inmunogénicas y resulta particularmente útil en procedimientos para producir anticuerpos específicos.
La presente invención se refiere además a una proteína aislada o recombinante que comprende un polipéptido constituido por la secuencia SEQ ID NO: 12. Dicha proteína es una proteína EPCR.
Según una realización preferente de la invención, dicha proteína EPCR aislada o recombinante comprende la secuencia SEQ ID NO: 1.
Un objeto adicional de la presente invención es una proteína recombinante que comprende un polipéptido constituido por la secuencia SEQ ID NO: 12, o un fragmento de dicha secuencia de residuos.
Un objeto adicional de la presente invención es un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para un polipéptido constituido por la secuencia SEQ ID NO: 12, o un fragmento de dicha secuencia de residuos. En una realización particular dicho polinucleótido procede de una secuencia de cDNA correspondiente a la SEQ ID NO: 2. Este cDNA se refiere a DNA retrotranscrito a partir de mRNA.
En una realización particular de la invención el polinucleótido de la invención puede estar contenido en un constructo de DNA. Así, un objeto adicional de la invención es un constructo de DNA que codifica una proteína o polipéptido que comprende los residuos 201-256 de la secuencia SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 12), o un fragmento de dicha secuencia de residuos. Preferentemente dicho fragmento tiene al menos 9 aminoácidos. En una realización particular de dicho constructo, éste comprende un polinucleótido que procede de una secuencia de cDNA correspondiente a la SEQ ID NO: 2. Dicho constructo de DNA puede incorporar una secuencia de control operativamente unida a dicha proteína o polipéptido. Cuando se refiere a ácidos nucléicos y polinucleótidos "operativamente unida" significa que una región nucleotídica está puesta en relación funcional con otra secuencia nucleotídica. Las "secuencias de control" son señales de expresión, reconocidas específicamente por una determinada célula hospedadora, que regulan funciones como por ejemplo la transcripción y traducción de una determinada secuencia codificadora. Son secuencias de control los promotores, potenciadores de expresión o enhancers, terminadores de la transcripción, sitios de unión de ribosomas, etc. El empalme de las secuencias deseadas para formar el constructo de DNA puede realizarse mediante corte y empalme en sitios de restricción apropiados. Si estos sitios de unión no existen es posible generarlos mediante procedimientos convencionales de ingeniería genética utilizando oligonucleótidos sintéticos como adaptadores o espaciadores.
El polinucleótido o constructo de DNA de la invención puede ser obtenido por métodos de ingeniería genética convencionales, frecuentemente recogidos en manuales de laboratorio.
El polinucleótido o constructo de la invención pueden insertarse en un vector de expresión adecuado. Así, un objeto adicional de la presente invención es un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido o constructo de DNA. La elección del vector de expresión en las distintas realizaciones de la invención dependerá de la célula hospedadora en la que vaya a ser introducido dicho vector de expresión. A modo de ejemplo, el vector en el que se inserta el polinucleótido o constructo de DNA de la invención puede ser un plásmido o un virus, que una vez introducido en la célula hospedadora puede integrarse o no en el genoma celular. Este vector de expresión puede obtenerse también mediante métodos convencionales.
Un objeto adicional de la invención es una célula hospedadora transformada que comprende un polinucleótido o constructo de DNA que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12, o un fragmento de dicha secuencia de residuos con al menos 9 aminoácidos. Según la invención la célula hospedadora transformada puede ser un procariota, p. ej. Escherichia coli, o una célula eucariota, p. ej. una levadura (entre otras Pichia Pastoris y Saccharomyces cerevisiae), una célula de insectos, o una línea celular de mamífero.
En una realización particular de la invención un polinucleótido de la invención con SEQ ID NO: 2 es introducido en Pichia pastoris para producir una proteína sEPCR recombinante de SEQ ID NO: 1, correspondiente a la nueva forma de sEPCR generada por corte y empalme alternativo descrita en la presente invención (sEPCRvar). Los métodos empleados para generar los constructos de DNA, los vectores de expresión y células hospedadoras transformadas necesarios para producir la proteína recombinante se describen detalladamente más adelante, incluyendo el procedimiento para su purificación.
En una realización particular de la invención el vector de expresión que incluye el polinucleótido o constructo de DNA de la invención está diseñado para su utilización en composiciones y procedimientos de transferencia o terapia génica in vivo. En una realización más particular este vector de expresión es un vector viral. Son vectores virales adecuados para este propósito entre otros un vector adenoviral, adenoasociado, retroviral, lentiviral, alfaviral, herpesviral, derivado de coronavirus, etc.
Un objeto adicional de la presente invención es un sistema de expresión que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12, o un fragmento de dicha secuencia de residuos, y una célula hospedadora transformada con dicho polinucleótido o dicho constucto. Preferentemente dicho fragmento comprende al menos 9 aminoácidos.
Un objeto adicional de la invención es un método para producir una proteína o polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 12 o un fragmento de dicha secuencia de residuos, preferentemente con al menos 9 aminoácidos, dicho método caracterizado porque comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un polinucleótido o constructo de DNA de la invención en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína, polipéptido o fragmento. Las condiciones para optimizar el cultivo dependerán de la célula hospedadora empleada. Si se desea, este método puede incluir también algunos pasos para aislamiento y purificación de la proteína o polipéptido expresado.
Alternativamente, la proteína o polipéptido de la invención puede obtenerse por otros métodos convencionales, por ejemplo mediante técnicas de síntesis química sobre fase sólida; purificarse mediante cromatografía liquida de alta resolución (HPLC); y, si se desea, se pueden analizar también mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante secuenciación y espectrometria de masas, análisis de aminoácidos, resonancia magnética nuclear, etc.
Un objeto adicional de la presente invención es un mRNA que codifica para una proteína que comprende una secuencia SEQ ID NO: 1, o fragmento de dicha secuencia de residuos.
Un objeto adicional de la presente invención es un anticuerpo aislado específico para un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 12, o un fragmento de dicha secuencia de residuos que posea propiedades inmunogénicas. En una realización particular dicho fragmento posee al menos 9 aminoácidos.
En una realización particular dicho anticuerpo es específico para un polipéptido o fragmento cuya secuencia está seleccionada entre los residuos 201-256 (SEQ ID NO: 12), 213-227 (SEQ ID NO: 13), 229-242 (SEQ ID NO: 14), 212-226 (SEQ ID NO: 15), 227-241 (SEQ ID NO: 16), 242-256 (SEQ ID NO: 17), todos ellos referidos a la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 12.
En otra realización particular dicho anticuerpo es específico para la SEQ ID NO: l y no reconoce la región 1-200 cuando no está unida a la región 201-256.
Según una realización preferente dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
Un objeto adicional de la presente invención es un método para la detección selectiva in vitro en una muestra biológica, de una proteína EPCR que comprende los residuos 201-256 de la secuencia SEQ ID NO: 1, por ejemplo la nueva proteína EPCR de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de dicha secuencia de residuos, que comprende:
- obtener una muestra biológica,
- analizar la cantidad de proteína EPCR que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12, o un fragmento de dicha secuencia de residuos.
Dicha muestra biológica puede ser cualquier muestra que incluya material biológico. En una realización preferida dicha muestra biológica es una muestra de orina, plasma, suero, tejido o fluido intersticial.
Dicho método puede ser cualquier método conocido, entre otros por ejemplo espectrometría de masas, inmunoensayos, ensayos químicos, cromatografía líquida y distintos métodos fotométricos directos e indirectos. Por ejemplo, pueden aplicarse algunos métodos analíticos para cuantificar el marcador mediante espectrometría de masas. De modo general, el marcador se aísla de la muestra biológica, por ejemplo mediante cromatografía líquida o electroforesis bidimensional en gel. El marcador se cuantifica mediante espectrometría de masas, por ejemplo espetrometría de masas en tandem asociada con cromatografía líquida (LC-MS), MALDI-TOF-MS ("matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry time-of flight MS"), etc. La cuantificación del marcador diana puede realizarse por comparación con estándares del marcador purificado en cantidades conocidas, o por comparación con las cantidades de dicho marcador presentes en el mismo tipo de muestras biológicas obtenidas de controles sanos.
En otra realización de la invención el método puede ser un inmunoensayo. De modo general, en el inmunoensayo se emplean uno o más ligandos del marcador. Tal y como se emplea en esta invención, un "ligando" es cualquier compuesto o molécula capaz de unirse específicamente al marcador diana. Estos ligandos pueden utilizarse por separado o en combinación (pueden utilizarse por ejemplo anticuerpos en combinación con aptámeros).
En una realización de la invención el inmunoensayo podría ser un ensayo homogéneo, un ensayo heterogéneo, un enzima-inmunoensayo (EIA, ELISA), un ensayo competitivo, un ensayo inmunométrico (sandwich), un ensayo turbidimétrico, un ensayo nefelométrico u otros similares. Igualmente el inmunoensayo podría realizarse manualmente o por medio de un analizador automático.
En el método de la invención dicha cantidad de proteína está asociada a una enfermedad seleccionada entre una enfermedad inflamatoria asociada a daño vascular, inflamación, una enfermedad asociada a coagulación anormal y cáncer. Dicha enfermedad puede ser también una enfermedad autoinmune tal como lupus, sepsis, shok, pre-eclampsia, diabetes, angina inestable, en monitorización de transplantes, reestenosis, angioplastia, enfermedad hepática o
renal.
Según el método de la invención se puede además comparar la cantidad de proteína EPCR detectada frente a un estándar de calibración.
Un objeto adicional de la presente invención es un kit de ensayo para la detección y cuantificación de una proteína EPCR que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12, por ejemplo la nueva proteína EPCR de SEQ ID NO; 1, o un fragmento de dicha secuencia de residuos, preferentemente de al menos 9 aminoácidos, que comprende:
a) un anticuerpo específico para un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12, o un fragmento de dicha secuencia de residuos, o un anticuerpo específico para la proteína SEQ ID NO: 1 que no reconozca la región 1-200 cuando no está unida a la región 201-256.
b) reactives para detectar una reacción entre el anticuerpo a) y la proteína EPCR que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12, o un fragmento de dichos residuos, presente en una muestra biológica.
Preferentemente el kit comprende también estándares para correlacionar la cantidad de reacción producida con unos niveles normales y anormales de proteína EPCR que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12.
Un objeto adicional de la presente invención es el uso de un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12, o un fragmento de dicha secuencia de residuos, para la detección y cuantificación de un mRNA correspondiente a una proteína EPCR que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12, por ejemplo la nueva proteína EPCR de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de dicha secuencia de residuos, preferentemente dicho fragmento es de al menos 9 aminoácidos. Dicha proteína EPCR está presente en una cantidad asociada a una enfermedad seleccionada entre una enfermedad inflamatoria asociada a daño vascular, inflamación, cáncer y una enfermedad asociada a coagulación anormal.
Además la nueva forma soluble de EPCR de origen no proteolítico puede servir para desarrollar métodos de análisis que sean selectivos para detectar única y exclusivamente la presencia de esta forma de EPCR soluble (sEPCRvar), con las ventajas que puede conllevar en la detección de enfermedades específicas, sin que dichos métodos solapen con aquéllos en los que se detectan otras formas de EPCR soluble o EPCR de membrana.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Muestra los distintos tipos de EPCR, dependiendo del modo en que se procese el ARN para generar el ARN mensajero (ARNm) maduro se pueden generar 3 formas alternativas de ARNm, que a su vez producirán 3 formas distintas de la proteína: 1. Un ARNm con los 4 exones que se traducirá como EPCR de membrana 2. Un ARNm que incluye únicamente los exones Ex I, Ex II y Ex III seguido del intrón tres y toda la secuencia posterior a este intrón, y se traducirá como una forma soluble de EPCR, descrita por Esmon en WO-9900673 (altsEPCR). 3. Por la nueva forma de corte y empalme alternativo descrita en la invención, se generará un ARNm que incluye los exones Ex I, Ex II y Ex III pero en el procesamiento se pierde el exón Ex IV, con lo cual no se transcribirán ni el dominio transmembrana ni la cola citoplasmática, y en su lugar aparece a continuación del Exon III una secuencia de lo que sería un exón críptico situado en la región 3' no traducida, en este caso el ARNm se traducirá como la nueva forma soluble EPCR de la invención (sEPCRvar).
También se puede generar EPCR soluble por actividad proteolitica, posiblemente de una metaloproteasa (aún no caracterizada) que corta al EPCR a la altura de la membrana, de modo que se genera una nueva forma soluble de EPCR (sEPCR), que consta de la fracción del receptor extracelular, y carece del dominio transmembrana y de la cola intracitoplasmática.
Figura 2. Patrón de bandas obtenido tras la amplificación del cDNA de HUVEC con cebadores específicos del gen del EPCR: además de la banda correspondiente al cDNA del EPCR silvestre (1221 pb, flecha 1) se observa un nuevo fragmento amplificado, correspondiente al cDNA de la nueva isoforma variante generada por corte-empalme alternativo (flecha 2).
Figura 3. Células COS-7 transfectadas con EPCR silvestre (panel A) o con la isoforma (panel 13), fusionados ambos con la proteína verde fluorescente. En el panel A se aprecia como la proteína silvestre tiende a acumularse en la membrana celular (flechas), mientras que con la isoforma 3 no se aprecia este patrón de localización (panel B).
Figura 4. Ilustra la expresión de sEPCRvar en Pichia pastoris. El sEPCRvar se purificó a partir del sobrenadante de células de P. pastoris transformadas de forma estable, tal como se indica en la descripción. Panel A: Muestra distintas proteínas separadas por SDS-PAGE y detectadas utilizando el colorante GELCODE Blue; Calle St: marcador de peso molecular, se indica el peso molecular de cada banda expresado en KDa; Calle 1: sEPCR recombinante. Se observa una banda difusa (debido a la intensa glicosilación de la proteína) de aproximadamente 42 Kda; Calle 2: sEPCRvar. Se observa una banda difusa (debido a la intensa glicosilación de la proteína) de aproximadamente 47 KDa. Panel B: Proteínas detectadas mediante Western blot con el anticuerpo monoclonal anti-EPCR;. Calle St: Marcador de peso molecular, se indica el peso molecular de cada banda expresado en KDa; Calle 1: blanco; Calle 2: sEPCRvar. Se observa una banda difusa de aproximadamente 47 KDa (que se extiende entre 35 y 60 KDa, debido a la variable glicosilación de la proteína).
Figura 5. Amplificación del gen del EPCR a partir de cDNA de distintos tejidos y tumores. Panel A) 1: marcador de peso molecular, 2: corazón, 3: hígado, 4: riñón, 5: páncreas, 6: pulmón, 7: placenta. Panel B) 1: marcador de peso molecular, 2: músculo esquelético, 3: cerebro, 4: timo, 5: intestino delgado, 6: bazo. Panel C) 1: Marcador, 2: próstata, 3: testículo, 4: ovario 5: colon. Panel D)son muestras de lineas tumorales de tumores de pulmón 2: H 446, 3: H 510, 4: H1264, 5: H 549, 6: H 441, 7: HTB 51 8: H 676, 9: H 727, 10: H 720, 11: H 385, 12: H 1299.
La calle correspondiente al marcador de peso molecular está señalada en la figura con el acrónimo St (de estándar). La banda inferior del marcador corresponde a un tamaño de 100 pb; cada nueva banda representa un tamaño incrementado 100 pb respecto de la su banda contigua inferior (100 pb, 200 pb, 300 pb,...).
Modo de realización de la invención Amplificación del cDNA de EPCR a partir de cDNA de células endoteliales
Las células HUVEC se obtuvieron a partir de vena de cordón umbilical humano, se cultivaron de acuerdo con procedimientos estándar (Jaffe EA, Nachman RL, Becker CG, Minick CR.Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J. Clin. Invest. 1973 Nov; 52 (11): 2745-56). y se extrajo el RNA total siguiendo técnicas estándar, como se describe en (Perez-Ruiz A, Montes R, Velasco F, Lopez-Pedrera C, Antonio Paramo J, Orbe J, Hermida J, Rocha E. Regulation by nitric oxide of endotoxin-induced tissue factor and plasminogen activator inhibitor-1 in endothelial cells. Thromb Haemost. 2002 Dec;88(6):1060-5.) El RNA obtenido se retrotranscribió a cDNA incubándolo con transcriptasa 60 minutos a 37ºC, seguido de cinco minutos a 65ºC para la inactivación de la enzima. Para ello se añadían 120 Unidades an de transcriptasa inversa M-MuLV (Gibco BRL) a 1 \mug de RNA en un volumen final de 10 \muL, que contenían 4 \muL de la solución tampón de la transcriptasa inversa, 2 mmol/L de deoxinucleótidos (dNTPs, Invitrogen), 0,3 \mug/mL de hexámeros aleatorios (Gibco BRL), 0,5 mmol/L de ditiotreitol (DTT, Gibco BRL) y 35 U de inhibidor de Rnasas (RNAsin de placenta humana 48.000 U/mL, RNA guard, GE Healthcare Bio-Science).
Se analizó la expresión del gen del EPCR mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los cebadores (Genset, Francia) utilizados fueron un cebador 5' correspondiente a la secuencia SEQ ID NO: 3 y un cebador 3' correspondiente a la secuencia SEQ ID NO. 4.
La PCR se llevó a cabo en un volumen de 25 \muL. Se utilizaron alícuotas del cDNA obtenido previamente por retrotranscripción de 1 \mug de RNA, a las que se les añadía 1 U de taq DNA polimerasa (Roche), 2,5 \muL de solución tampón de reacción (Roche), 0,5 \muL de cada cebador (de una solución 10 \mumol/L), 0,25 \muL de deoxinucleótidos (dNTPs, GE Healthcare Bio-Science) y 0,25 \mul de BSA 1 mg/mL. La mezcla de reacción se ajusta a 25 microL con agua. El ciclo de amplificación consta de una fase de 30 segundos (s) a 94ºC de desnaturalización, y otra fase de hibridación (annealing) y extensión de 3,5 minutos a 72ºC. Los ciclos se repiten 5 veces después de lo cual se realizan 32 ciclos con la misma fase de desnaturalización y una fase de hibridación (annealing) y extensión de 3 minutos a 68ºC. Se termina la amplificación manteniendo la mezcla durante 5 minutos a 68ºC como periodo de extensión final. El segmento amplificado por PCR tiene una longitud de 1221 pares de bases (pb). Cuando se amplifica en estas condiciones el gen del EPCR aparece una banda adicional a una altura de aproximadamente 850 pb. Estas dos bandas correspondientes al cDNA obtenido tras la de células HUVEC con cebadores específicos como se ha descrito se muestran en la figura 2, donde la flecha 1 señala la banda correspondiente al cDNA del EPCR silvestre que tiene 1221 pb, y la flecha 2 señala el cDNA de la nueva isoforma variante generada por corte-empalme alternativo que tiene aproximadamente 850 pb.
Secuenciación de la banda adicional de EPCR amplificado
Se reamplificó la banda 2 utilizando las mismas condiciones de amplificación pero partiendo como molde de la banda de 850 pb de la figura 2. El producto de amplificación se purificó tras electroforesis en gel de agarosa mediante el kit comercial QIAquick Gel Extraction kit siguiendo las instrucciones del fabricante. El producto así purificado se utilizó como molde para la reacción de secuencia (ABI Prism® BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit). Se realizaron dos reacciones de secuencia una en dirección 5'-3' y otra en la dirección contraria utilizando los cebadores correspondientes afilas secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO. 6.
El resultado de la reacción se analizó en el secuenciador automático ABI Prism 377 DNA Sequencers. La conclusión es que la nueva banda corresponde a un fragmento definido por la secuencia SEQ ID NO: 7:
La parte central de este fragmento cuya secuencia es SEQ ID NO: 2, corresponde al cDNA de un nuevo EPCR al que le falta el exón cuatro y parte de la región 3' no traducida. El origen de este cDNA es probablemente un fenómeno de corte-empalme alternativo del RNA del EPCR. La figura 1 muestra el ARNm correspondiente a este cDNA, donde se ve que dicho ARNm incluye los exones Ex I, Ex II y Ex III y a continuación una secuencia llamada ND.
Esta nueva especie de cDNA codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 1. Los residuos 1-17 de dicha secuencia corresponden al péptido señal; los residuos 18-200 corresponden al dominio extracelular común de EPCR; los residuos 201-256 corresponden al nuevo dominio diferencial de esta nueva forma de EPCR y sustituyen al dominio transmembrana del EPCR. Este nuevo dominio no cumple los criterios para ser un dominio transmembrana.
Expresión del EPCR Y sEPCRvar fusionados con la proteína verde fluorescente en células de mamífero
Para estudiar la localización subcelular de la isoforma EPCR se clonó su cDNA en el vector pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO para expresarlo como proteína fusionada con la proteína verde fluorescente. El vector así preparado se utilizó para transformar transitoriamente células COS-7 de mamífero en cultivo utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen); como control se utilizó el mismo vector en el que se había clonado el cDNA del EPCR silvestre fusionado con la proteína verde fluorescente. La localización subcelular del EPCR silvestre y de la isoforma se detectó mediante microscopía de fluorescencia. La figura 3 muestra la comparación de las células COS-7 de mamífero transformadas como se ha descrito, en la que se ve como el EPCR silvestre se localiza principalmente en la membrana celular (flechas), donde se observa la fluorescencia verde; sin embargo, la isoforma sEPCRvar, de acuerdo con la hipótesis de los inventores, no se localiza en la membrana celular.
Clonación, expresión, purificación y caracterización de la de la isoforma del EPCR Clonaje y expresión
Para expresar el EPCR variante identificado (sEPCRvar), se ha amplificado la secuencia del sEPCRvar sin su péptido señal (residuos 17-256,) mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los iniciadores SEQ ID NO. 8 y SEQ ID NO. 9 que añadían un sitio de restricción ClaI y otro NotI en los extremos 5' y 3' respectivamente, utilizando como molde cDNA de células endoteliales. Estas modificaciones permitieron ligar la secuencia de sEPCRvar a los sitios ClaI y NotI del plásmido pPICZ\alphaC (Invitrogen) a continuación de la señal de secreción del factor \alpha de Saccharomyces cerevisiae que permite la secreción eficiente de muchas proteínas al medio extracelular desde el interior de levaduras. Debido al proceso de clonaje se añadieron un resto de serina y otro de isoleucina en el extremo amino del sEPCRvar. Mediante secuenciación directa se comprobó que la secuencia del inserto y del vector era la correcta. Con el vector de expresión previamente preparado y tras linearización del mismo con la enzima de restricción PmeI, se transformaron células de Pichia pastoris mediante un método químico (Easy Comp, Invitrogen), dando como resultado la integración, mediante recombinación homóloga, de la secuencia codificante de sEPCRvar en el promotor endógeno de respuesta a metanol. El producto de la transformación se cultivó en presencia de zeocina para seleccionar aquellas colonias de P. pastoris transformadas con el vector que contenía la secuencia codificante del sEPCRvar que a su vez contiene el gen de la resistencia a la zeocina. Brevemente, las levaduras transformadas se cultivaron en 4 ml de medio BMY [1% de (p/v) de extracto de levadura, 2% (p/v) de peptona, fosfato potásico 100 mM (pH 6,0), 1,34% (p/v) de fuente de nitrógeno de levaduras con sulfato amónico, 4 x 10-5% (p/v) de biotina] suplementado con 1% (v/v) de glicerol (BMGY) y se incubaron a 28-30ºC durante unas 18 horas con agitación. Las células se recogieron por centrifugación a 2.000 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó y se procedió a inducir la expresión de sEPCRvar con metanol al 1% durante 18 horas. Para ello, las células se resuspendieron en 3 ml de BMY suplementado con 0,5% (p/v) de metanol y se incubaron durante 18 horas a 28-30ºC aproximadamente con agitación vigorosa. Tras la inducción, las muestras procedentes del medio condicionado se cargaron en geles de NuPAGE Bis-Tris al 12% (Invitrogen, Carlsbad, CA) y el sEPCRvar se detectó mediante Western Blot utilizando el anticuerpo monoclonal RCR-2 (Amablemente cedido por el Dr. Kenji Fukudome, Saga University, Japón) (figura 4). Para la producción a gran escala se seleccionó la colonia que secretó la concentración más alta de sEPCRvar. En las colonias seleccionadas por su alta capacidad de producción de sEPCRvar se estudió el metabolismo del metanol (metabolizador rápido o lento) de las colonias, lo que permitió establecer las condiciones óptimas de expresión para la colonia más adecuada. Una vez optimizadas las condiciones de cultivo e inducción con metanol, se aumentó la escala para producir grandes cantidades de sEPCRvar.
Purificación
Después de concentrar y dializar frente a Tris-HCl 20 mM (pH 7,6) sin NaCl, el sobrenadante del cultivo de P pastoris, se realizarán dos pasos sucesivos de purificación: cromatografía de intercambio fónico y filtración en gel. En la purificación por intercambio fónico se empleó una columna Resource Q column (GE Healthcare Bio-Science) y la elución se realizó con un gradiente 0,0-300 mM de NaCl en un volumen equivalente al de 20 columnas. Las fracciones eluídas que contenían el sEPCRvar se reunieron y concentraron mediante ultrafiltración centrífuga y, a continuación, se aplicaron a una columna a Superdex 75-HR10/30 (GE Healthcare Bio-Science) para efectuar la filtración en gel. La concentración de proteína purificada se determinó utilizando el ensayo de proteína total BCA (Pierre, Rockford, IL) y patrones de BSA. Para detectar el sEPCRvar purificado, las muestras se cargaron en geles al 12% de NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se realizó una electroforesis en condiciones redúctoras seguido de tinción con azul de Coomassie. Un gel de electroforesis se sometió a electroblotting y el sEPCRvar fue detectado con el anticuerpo monoclonal RCR-2. Para estimar el peso molecular del sEPCRvar se utilizó un patrón de peso molecular incluido en cada gel de electroforesis.
Estudio bioquímico para caracterizar la actividad de la nueva variante de EPCR soluble La afinidad del sEPCRvar por la PC
Generación de PCA en células endoteliales cultivadas. La línea celular utilizada fue EA.hy926, una línea de células endoteliales humanas transformada que ha retenido la capacidad de expresar trombomodulina y EPCR (Stearns-Kurosawa DJ, Kurosawa S, Monica JS, Ferrell GL, Esmon CT. The endothelial cell protein C receptor augments protein C activation by the thrombin-thrombomodulin complex. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93:10212-6). Se incubaron 5 x 10^{4} células por pocillo de una placa de 96 pocillos con 0,02 U/ml de trombina (0,17 nM) (ERL, Swansea, Reino Unido) y concentraciones crecientes de PC (Baxter, Deerfield, IL, USA) oscilando entre 50 y 1.000 nM en tampón Tris 20 mM, pH 7,4, suplementado con NaCl 150 mM, CaCl_{2} 5 mM, MgCl_{2} 0,6 mM, 1% de BSA, 0,001% de Tween-20 y 0,02% de NaN_{3}. Después de 45 minutos a temperatura ambiente se añadió lepirudina (Schering AG, Berlin, Germany) a una concentración final de 0,2 \mul, para inhibir la trombina y 3-4 minutos después se añadió el sustrato cromogénico S-2366 (Chromogenix, Milan, Italy) a una concentración final de 0,4 mM con el objeto de monitorizar su proteolisis por la PCA. El incremento en la absorbancia a 405 nm fue registrado cinéticamente en un lector de microplaca (iEMS REader, Labsystems, Finlandia). El ajuste de los datos de la curva a la ecuación de Michaelis-Menten fue realizado usando el programa Enzfitter (Biosoft, Cambridge, Reino Unido) que calculó el valor de la Km de la activación de la PC bajo esas condiciones.
Para estudiar el efecto inhibidor del sEPCRvar, se añadieron 2 \mumol/L simultáneamente con la trombina y la PC. Así, el efecto de sEPCRvar sobre la activación de la PC pudo ser analizado y comparado con el efecto que el sEPCR tiene sobre la activación de la PC que es un reflejo de su afinidad por la PC.
La Tabla 1 muestra las características bioquímicas de la activación de la proteína C por trombina en la superficie de células endoteliales en cultivo en presencia o ausencia de sEPCR y de sEPCRvar.
TABLA 1
Km (nM) V_{max} (UA/segundo)
PC sola 49 0,0054
PC + 2 \mumol/L sEPCR 881 0,008
PC+ 2 \mumol/L sEPCRvar 698 0,007
La afinidad del sEPCR y sEPCRvar por la APC
Determinación del tiempo de tromboplastina parcial activada. El tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) se determinó utilizando el equipo Diagnostica Stago Boerhringer Mannheim STA Compact (Roche) y el reactivo Pathromtin (Dade Behring, USA) utilizando una mezcla de cinco plasmas de sujetos sanos. Como es bien conocido, la presencia de PCA en una mezcla de plasmas normales provoca el alargamiento del TTPa. En las condiciones experimentales usadas, el TTPa en ausencia de PCA fue de 33,1 \pm 0,4 s (media \pm DE), mientras que al añadir PCA a una concentración final de 1 nmol/L, el TTPa se prolongó hasta 43,9 \pm 0,4 s. Al añadir sEPCR el efecto de la PCA disminuyó de tal forma que, en presencia de 1 mmol/L de sEPCR, el TTPa fue de 37,2 \pm 0,2 s. Este efecto inhibidor del sEPCR sobre el efecto anticoagulante de la PCA es dosis dependiente. El sEPCR añadido a la mezcla de plasmas normales no tuvo ningún efecto directo sobre el TTPa (33,1 \pm 0,4 s en ausencia frente a 33,9 \pm 0,4 s en presencia de sEPCR). Todos los experimentos se repitieron cuatro veces. Cuando en lugar de sEPCR se añadió la misma concentración de sEPCRvar el resultado fue superponible al obtenido con el sEPCR lo que demuestra que el sEPCRvar se une a la PCA, como lo hace el sEPCR.
La Tabla 2 muestra el efecto del sEPCR y del sEPCRvar en la función anticoagulante de la PCA. Tiempos de coagulación (TTPa) de una mezcla de plasmas normales a la que se añadió 1 nmol/L de PCA y distintas concentraciones de sEPCR. Se representa la media \pm DE de cuatro experimentos. El TTPa en ausencia de PCA fue de 33,1 \pm 0,4 segundos.
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TABLA 2
TTPA con PCA 1 nmol/L (segundos)
sEPCR(nmol/L)
0 43,9\pm0,4
10 41,8\pm0,6
50 41,8\pm0,2
100 40,5\pm0,6
250 39,9\pm0,3
500 39,5\pm0,2
1000 38,2\pm0,2
sEPCRvar (nmol/L)
0 43,9\pm0,4
10 41,7\pm0,3
50 41,8\pm0,9
100 41\pm0,5
250 39,7\pm0,2
500 39,4\pm0,9
1000 37,9\pm0,3 
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Estudio de la expresión del sEPCRvar en distintos tejidos y en lineas tumorales
Para identificar los tejidos en los que se expresa sEPCRvar se estudió una genoteca de cDNA de distintos tejidos humanos (Multiple tissue cDNA (MTC) panels I and II, Bioscience, USA) mediante PCR empleando cebadores que permitan la amplificación simultánea del cDNA correspondiente al EPCR y al sEPCRvar. Los cebadores (Genset, Francia) utilizados fueron los correspondientes a las secuencias SEQ ID NO. 10 y SEQ ID NO. 11.
La PCR se llevó a cabo en un volumen de 25 \muL. Se utilizaron alícuotas del cDNA, a las que se les añadía 1 U de taq DNA polimerasa (Roche), 2,5 \muL de solución tampón de reacción (Roche), 0,5 \muL de cada cebador (de una solución 10 \mumol/L), 0,25 \muL de deoxinucleótidos (dNTPs, GE Healthcare Bio-Science) y 0,25 \mul de BSA 1 mg/mL. La mezcla de reacción se ajusta a 25 microL con agua. El ciclo de amplificación consta de una fase de 30 segundos (s) a 94ºC de desnaturalización, y otra fase de hibridación (annealing) 1 MINUTO A 56ºC y extensión de 1,5 minutos a 72ºC. Los ciclos se repiten 35 veces. Se termina la amplificación manteniendo la mezcla durante 5 minutos a 72ºC como periodo de extensión final. El segmento del cDNA de EPCR amplificado tiene una longitud de 578 pb mientras que el del sEPCRvar es de 189 pb (Figura 5). La forma sEPCRvar se expresa abundantemente en páncreas, corazón, hígado, riñón, pulmón, placenta, timo,intestino delgado, bazo y colon. La forma sEPCRvar se expresa de modo abundante en alguna de las líneas tumorales sobre todo en H 549, H 441 y H 720. Alguna de las líneas tumorales, particularmente H 446 y H 676, expresan además otra forma todavía no identificada que de acuerdo con su movilidad electroforética tiene 1000 pb.
En la figura 5 muestra la amplificación del gen del EPCR a partir de cDNA de distintos tejidos y tumores. Panel A 1: marcador de peso molecular, 2: corazón, 3: hígado, 4: riñón, 5: páncreas, 6: pulmón, 7: placenta. Panel B) 1: marcador de peso molecular, 2: músculo esquelético, 3: cerebro, 4: timo, 5: intestino delgado, 6: bazo. Panel C) 1: Marcador, 2: próstata, 3: testículo, 4: ovario 5: colon. Panel D)son muestras de lineas tumorales de tumores de pulmón 2: H 446, 3: H 510, 4: H1264, 5: H 549, 6: H 441, 7: HTB 51 8: H 676, 9: H 727, 10: H 720, 11: H 385, 12: H 1299.
Producción de anticuerpos
Inmunización. Se inmunizaron ratones BALB/C machos, de al menos 1 mes de edad con sEPCRvar de acuerdo con el siguiente patrón: Tres inmunizaciones subcutáneas o intradermales, o intraperitoneales, o combinaciones de estas con una cantidad de immunógeno entre 10 y 200 \mug en adyuvante de Freund u otro adyuvante, espaciadas al menos dos semanas; dos semanas después de la tercera inmunización se administraron dos nuevas dosis de refuerzo, espaciadas dos días y empleando la misma cantidad de inmunógeno pero esta vez en suero salino. También se inmunizaron otros animales con una mezcla de los péptidos 213-227, 229-242, 212-226, 227-241, 242-256 de la SEQ ID NO: 1. Estos péptidos fueron elegidos por ser fragmentos altamente hidrofílicos de acuerdo con el programa Protscale siguiendo el algoritmo de Kyte J., Doolittle R.F. (J. Mol. Biol., 1982; 157:105-132).
Fusión. Dos días después de la última dosis de refuerzo se producirán hibridomas; técnica que consiste en la fusión de esplenocitos del animal con células de mieloma (SP2/O-Ag14; P3X63-Ag8.6.5.3; P3-NS-1-Ag4-1; etc.) en presencia de polietilenglicol 1500 ó 4000. Este agente posibilita la fusión de las membranas, de modo que se generarán híbridos entre los diversos tipos celulares: el híbrido entre un linfocito B del animal y una célula de mieloma constituirá un nuevo tipo celular, hibridoma, que producirá un anticuerpo y además será inmortal en cultivo. Se añadirá medio HAT al cultivo celular para seleccionar estos hibridomas y eliminar el resto de híbridos: el HAT contiene aminopterina, inhibidor de la vía de síntesis De novo de la guanosina (vía De novo). Debido a que las células de mieloma carecen de enzima HPRT funcional necesaria en la vía de salvamento de síntesis de ácidos nucleicos, cuando se les bloquea con aminopterina la única vía disponible, vía De novo, son incapaces de sintetizar ácidos nucleicos; por tanto, tras dos semanas de cultivo, las únicas células que sobrevivirán en el cultivo serán algunos híbridos esplenocito-mieloma: los esplenocitos conferirán al híbrido la capacidad de síntesis de guanosina mediante la vía alternativa, y la célula de mieloma la capacidad de ser cultivadas indefinidamente en cultivo in vitro.
Detección de hibridomas productores de anticuerpos anti-sEPCRvar y anti sEPCR. Las células en medio HAT se distribuirán en al menos diez microplacas de cultivo de 96 pocillos. Entre nueve y catorce días tras la fusión, el tamaño de las colonias será suficiente para analizar la presencia de anticuerpos en su sobrenadante. Para seleccionar los hibridomas que secreten anticuerpos que nos interesen, es decir anticuerpos frente al sEPCRvar, se tomarán muestras de sobrenadante de todos los pocillos de las cinco microplacas que contengan clones para someterlos a un inmunoensayo: se realizaran ensayos de ELISA y Western Blot. Para el ELISA se tapizarán placas con sEPCRvar 0,3 \mug/pocillo; tras una incubación de 15 horas a 4ºC y el bloqueo correspondiente con proteína adecuada, se añadirán los sobrenadantes de los cultivos, se realizaran los lavados correspondientes y a continuación un anticuerpo secundario anti-inmunoglobulina de ratón. De este modo, tras lavar y revelar con peroxidasa y o-fenilendiamina los pocillos en los que se detecte color o un aumento en la absorbancia (492 nm) podrán contener clones de hibridomas secretores de anticuerpos frente al sEPCRvar. Para el Western Blot se correrá un gel de poliacrilamida con la proteína recombinante y/o un extracto tisular o celular que exprese la proteína sEPCRvar. Se transferirá a una membrana de nitrocelulosa o PVDF que se dividirá en zonas independientes mediante un aparato tipo rejilla para probar la presencia de anticuerpos específicos en los sobrenadantes. Tras bloquear e incubar con el anticuerpo específico se lavará tres veces y se incubará con un anticuerpo secundario conjugado a la enzima peroxidasa. El revelado se realiza mediante un sustrato que al ser transformado por la enzima da lugar a luz en el lugar en que se ha unido el anticuerpo específico. Si la banda luminosa corresponde a una proteína con el peso molecular esperado, las células productoras de anticuerpos del pocillo del que proviene el sobrenadante se crecerán y se congelarán en nitrógeno líquido.
Dado que sEPCRvar contiene toda la porción sEPCR, se estudiará la reactividad frente a la región extracelular del EPCR recombinante de los hibridomas que sean positivos frente a sEPCRvar. De este modo se podrán seleccionar los hibridomas que produzcan anticuerpos frente a la región específica del sEPCRvar.
Monoclonalidad de los hibridomas. Para asegurarnos de que cada cultivo de células que secreta un anticuerpo anti-sEPCRvar es monoclonal se aplicarán técnicas de clonaje o dilución límite: se harán crecer células aisladas en nuevas microplacas de cultivo a partir del cultivo original o células madre que dieron positivo en el primer ensayo de Western Blot o ELISA. Una vez que las nuevas colonias surgidas a partir de una o más células hayan adquirido el tamaño suficiente, se tomarán de nuevo sobrenadantes de estas para someterlos a un nuevo ELISA o Western Blot. Las colonias que den positividad de nuevo se someterán a dilución límite y se repetirá el proceso hasta que el 100% de los sobrenadantes analizados tras la tercera dilución límite contengan anticuerpos frente al sEPCRvar.
Purificación de los anticuerpos. Tras cultivar los hibridomas en condiciones especiales para obtener un mayor rendimiento en concentración de anticuerpo (botellas de cultivo con el sistema CELLine de Integra BioSciences o con el sistema CELline CL-1000 de Becton Dickinson), los sobrenadantes que contengan IgGs serán sometidos a purificación mediante cromatografía de líquidos mediante alguna o varias de las siguientes metodologías: cromatografía de inmunoafinidad, de afinidad (en proteína A/Proteína G/Proteína L, metal inmobilizado, tioafinidad), de intercambio catiónico, de hidroxiapatita, de interacción hidrofóbica, de filtración en gel, etc. Mediante un un equipo ÄKTA FPLC, GE Healthcare Bio-Science).
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<110> Proyecto de Biomedicina CIMA S.L.
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<120> NUEVA PROTEÍNA EPCR SOLUBLE DE ORIGEN NO PROTEOLÍTICO Y SU USO
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<130> FIMA04007
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<160> 17
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<170> PatentIn version 3.3
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<210> 1
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<211> 256
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> SIGNAL
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<222> (1)..(17)
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<223> Péptido señal
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (18)..(200)
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<223> Dominio extracelular común de EPCR
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (201)..(256)
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<223> Dominio diferencial de la nueva forma EPCR soluble
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<400> 1
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1
2 
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<210> 2
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<211> 771
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
3 
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<210> 3
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<211> 23
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<212> DNA
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<400> 3
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gaacccaggt ccggagcctc aac 
\hfill
23 
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cagcgaacgc ttggccctgg taccac 
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26 
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gctcaatgcc taccaacgca ctcgg 
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<213> Artificial
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<212> DNA
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<220>
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<400> 8
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36 
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<213> Artificial
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agctatcgta gcggccgcct accctattat atcagc 
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36 
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<210> 10
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<211> 27
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<213> Artificial
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gcagtatgtg cagaaacata tttccgc 
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27 
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<212> DNA
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catcccaagt ctgacacacc tggaagt 
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27 
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<210> 12
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<211> 56
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Dominio diferencial de la nueva forma EPCR soluble (Fragmento 201-256 de la proteína sEPCRvar)
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<400> 12
6 
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<210> 13
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Fragmento 213-227 de la proteína sEPCRvar
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<400> 13
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\sa{Leu Gln Arg Gln Thr Glu Ser Pro Glu Ala Phe Lys Arg Tyr Asn}
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<210> 14
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Fragmento 229-242 de la proteína sEPCRvar
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<400> 14
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\sa{Ile Asn Lys Ser Ser Thr Ile Lys Ile Gln His Ser Ile Leu}
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<223> Fragmento 212-226 de la proteína sEPCRvar
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<400> 15
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\sa{Ile Leu Gln Arg Gln Thr Glu Ser Pro Glu Ala Phe Lys Arg Tyr}
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<210> 16
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<223> Fragmento 227-241 de la proteína sEPCRvar
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<400> 16
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<223> Fragmento 242-256 de la proteína sEPCRvar
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<400> 17
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\sa{Leu Pro Gly Val Ser Asp Leu Gly Trp Asp Ala Asp Ile Ile Gly}

Claims (19)

1. Un polipéptido de un receptor endotelial de la proteína C, útil como marcador de procesos de enfermedades en grandes vasos y de cáncer, caracterizado porque está constituido por la secuencia SEQ ID NO: 12, o por un fragmento de dicha secuencia seleccionado entre: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17.
2. Una proteína EPCR aislada o recombinante caracterizada porque comprende un polipéptido constituido por la secuencia SEQ ID NO: 12.
3. Una proteína EPCR aislada o recombinante según la reivindicación 2, cuya secuencia es SEQ ID NO: 1.
4. Un polinucleótido aislado o recombinante, caracterizado porque codifica un polipéptido constituido por la secuencia SEQ ID NO: 12 o que codifica para un fragmento de dicha secuencia seleccionado entre: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17.
5. Un polinucleótido según la reivindicación 4, caracterizado porque procede de una secuencia de cDNA correspondiente a la SEQ ID NO: 2.
6. Un polinucleótido según una de las reivindicaciones 4 o 5, caracterizado porque comprende además una secuencia de control operativamente unida que regula la expresión de la proteína o polipéptido codificado por dicho polinucleótido.
7. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido definido en una de las reivindicaciones 4-6.
8. Una célula hospedadora, caracterizada porque comprende un polinucleótido definido en una de las reivindicaciones 4-6, o un vector de expresión según la reivindicación 7.
9. Una célula hospedadora según la reivindicación 8, caracterizada porque dicha célula es una célula procariota o una célula eucariota.
10. Una célula hospedadora según la reivindicación 9, caracterizada porque dicha célula es la bacteria Escherichia coli o la levadura Pichia pastoris.
11. Un sistema de expresión caracterizado porque comprende un vector de expresión tal como el definido en la reivindicación 7 y una célula hospedadora como la definida en una de las reivindicaciones 8-10.
12. Un mRNA caracterizado porque codifica una proteína que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12, o fragmentos de dicha secuencia seleccionados entre: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17.
13. Un anticuerpo aislado caracterizado porque reconoce específicamente un polipéptido definido en la reivindicación 1 o un fragmento de dicha secuencia de residuos que posea propiedades inmunogénicas seleccionado entre: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17.
14. Un anticuerpo según la reivindicación 13, caracterizado porque es específico para la SEQ ID NO: 1 y porque no reconoce la región 1-200 cuando no está unida a la región 201-256 (SEQ ID NO: 12).
15. Un anticuerpo según una de las reivindicaciones 13-14 caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal.
16. Un método para la detección selectiva in vitro en una muestra biológica, de una proteína EPCR que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12, caracterizado porque dicho método comprende:
- obtener una muestra biológica,
- analizar la cantidad de proteína EPCR que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12.
17. Un método según la reivindicación 16, caracterizado porque dicha cantidad de proteína está asociada a una enfermedad seleccionada entre una enfermedad inflamatoria asociada a daño vascular, inflamación, cáncer y una enfermedad asociada a coagulación anormal.
18. Un método según una de las reivindicaciones 16-18, caracterizado porque comprende comparar la cantidad de proteína EPCR detectada frente a un estándar de calibración.
19. Un kit de ensayo para la detección y cuantificación de una proteína EPCR que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12, caracterizado porque comprende:
a) un anticuerpo específico tal como el definido en una de las reivindicaciones 13 a 15,
b) reactivos para detectar una reacción entre el anticuerpo a) y la proteína EPCR que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12 presente en una muestra biológica.
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