ES2267510T3 - Acidos nucleicos y polipeptidos de lisavirus quimericos. - Google Patents
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Abstract
Molécula portadora que contiene una secuencia polinucleotídica quimérica, en la que dicha secuencia polinucleotídica quimérica comprende una secuencia que codifica una parte de una glicoproteína que contiene al menos el sitio III de la glicoproteína de lisavirus, y comprende además una secuencia que codifica un antígeno heterólogo distinto de un antígeno de un lisavirus.
Description
Ácidos nucleicos y polipéptidos de lisavirus
quiméricos.
La presente invención se refiere a moléculas
portadoras que contienen ácidos nucleicos de lisavirus quiméricos, y
polipéptidos y proteínas quiméricos codificados por estos ácidos
nucleicos. Más particularmente, la invención se refiere a
composiciones inmunogénicas que comprenden ácidos nucleicos y
proteínas de lisavirus quiméricos.
La rabia es una enfermedad encefalopática
provocada por elementos del género Lyssavirus dentro de la
familia Rhabdoviridae. La rabia infecta a todos los animales
de sangre caliente e invariablemente es casi mortal en seres humanos
si no son tratados. Con base a las comparaciones de secuencias
nucleotídicas y análisis filogenéticos, el género de
Lyssavirus se ha dividido en 7 genotipos (GT). GT1 incluye
las cepas clásicas de vacuna y virus de rabia, mientras que GT2 a
GT7 corresponden a virus relacionados con rabia que incluyen virus
de murciélago de Lagos (GT2); virus de Mokola (GT3); virus de
Duvenhage (GT4); lisavirus de murciélago europeo 1
(EBL-1: GT5); lisavirus de murciélago europeo 2
(EBL-2: GT6); y lisavirus de murciélago australiano
(GT7).
En base en la antigenicidad, el género
Lyssavirus se dividió primero en cuatro serotipos. Más
recientemente, este género se dividió en dos grupos principales de
acuerdo con la reactividad cruzada del anticuerpo neutralizante del
virus (VNAb): El grupo 1 consiste en GT1, GT4, GT5, GT6, y GT7,
mientras que el grupo 2 consiste en GT2 y GT3. Los virus del grupo 2
no son patógenos cuando se inyectan periféricamente en ratones. La
virulencia de los lisavirus depende, al lo menos en parte, de la
glicoproteína presente en el recubrimiento viral. De manera
interesante, las glicoproteínas de los virus del grupo 2 muestran un
alto grado de identidad, en la región que contiene aminoácidos que
empeñan un papel importante en la patogenicidad, con la secuencia
correspondiente de virus GT1 no virulentos (véase, por ejemplo
Coulon et al., 1998, "An avirulent mutant of rabies virus
is unable to infect motoneurons in vivo and in
vitro", J. Virol.
72:273-278).
La glicoproteína del virus de rabia (G) está
compuesta de un dominio citoplásmico, un dominio transmembránico y
un ectodominio. La glicoproteína es un trímero, con los ectodominios
expuestos en la superficie del virus. El ectodominio está
involucrado en la inducción de tanto la protección como la
producción de VNAb después de la vacunación, tanto antes como
después de la exposición al virus. Por lo tanto, se ha dado mucha
atención a G en el desarrollo de vacunas de subunidad de rabia. De
manera estructural, G contiene tres regiones, la región
aminoterminal (N-terminal), una región de
"bisagra" o "enlazadora", y la región carboxiterminal
(C-terminal). (Véase figura 1).
Como se ilustra en la figura 1, generalmente se
piensa que el ectodominio de la glicoproteína (G) tiene dos sitios
principales antigénicos, el sitio II y el sitio III, los cuales son
reconocidos por aproximadamente 72,5% (sitio II) y 24% (sitio III)
de anticuerpos monoclonales neutralizantes (MAb), respectivamente.
El sitio II está localizado en la mitad N-terminal
de la proteína, y el sitio III está localizado en la mitad
C-terminal de la proteína. Las dos mitades están
separadas mediante una bisagra flexible alrededor de la región
lineal (aminoácido 253 a 257).
El ectodominio de G contiene además un sitio
menor (sitio a), y varios epítopos reconocidos por MAbs individuales
(I: resto 231 de aminoácidos; V: resto 294, y VI: resto 264) (5, 10,
18, 21 ref. 2). El sitio II es conformacional y discontinuo (restos
34 a 42 de aminoácidos y restos 198 a 200 de aminoácidos, los cuales
están asociados mediante puentes de disulfuro), mientras que el
sitio III es conformacional y continuo (restos 330 a 338). La lisina
330 y arginina 333 en el sitio III juegan un papel importante en
neurovirulencia, y pueden estar implicadas en el reconocimiento de
receptores neuronales (véase, por ejemplo, Coulon et al.,
supra, y Tuffereau et al., 1998, "Neuronal cell surface
molecules mediate specific binding to rabies virus glycoprotein
expressed by a recombinant baculovirus on the surfaces of
lepidopteran cells", J. Virol.
72:1085-1091). Los sitios II y III parecen
estar próximos entre sí en la estructura tridimensional, y expuestos
en la superficie de la proteína (Gaudin, Y., 1997, "Folding of
rabies virus glycoprotein: epitope acquisition and interaction with
endoplasmic reticulum chaperones", J. Virol.
71:3742-3750). Sin embargo, a pH bajo, la
molécula de G toma una conformación inactiva de fusión en la cual el
sitio II no es accesible para MAbs, mientras que los sitios a y III
permanecen más o menos expuestos (Gaudin, Y. Et al., 1995,
"Biological function of the low-pH,
fusion-inactive conformation of rabies virus
glycoprotein (G): G is transported in a
fusion-inactive state-like
conformation", J. Virol.
69:5528-5533; Gaudin, Y., et al.,
1991, "Reversible conformational changes and fusion activity of
rabies virus glycoprotein", J. Virol.
65:4853-4859).
Además, varias regiones distribuidas a lo largo
del ectodominio están involucradas en la inducción de células
auxiliares T (Th) (MacFarlan, R. et al., 1984, "T cell
responses to cleaved rabies virus glycoprotein and to synthetic
peptides", J. lmmunol.
133:2748-2752; Wunner, W. et al. 1985,
"Localization of immunogenic domains on the rabies virus
glycoprotein", Ann. Inst. Pasteur, 136
E:353-362). Basándose en estas propiedades
estructurales e inmunológicas, se ha sugerido que la molécula de G
puede contener dos partes inmunológicamente activas, cada una
potencialmente capaz de inducir tanto VNAb como células Th (Bahloul,
C. et al., 1998, "DNA-based immunization
for exploring the enlargement of immunological
cross-reactivity against the lyssaviruses",
Vaccine 16:417-
425).
425).
Las vacunas actualmente disponibles consisten o
derivan principalmente de virus GT1, contra los cuales dan
protección. Muchas cepas de vacunas no son efectivas contra GT4, y
ninguna es efectiva contra GT2 o GT3. Sin embargo, la protección
producida contra GT4 a 6 depende de la cepa de la vacuna. Por
ejemplo, la protección de lisavirus de murciélago europeo (GT5 y
GT6), cuyo aislamiento se ha hecho más frecuente en años recientes,
mediante la cepa de vacuna de rabia PM
(Pitman-Moore) no es muy robusta. La cepa PM induce
una protección contra EBL1 (GT5) más débil que la protección que
proporciona contra la cepa PV (virus de Pasteur).
Debido, en parte, a la importancia de la rabia
en la salud mundial, existe una continua necesidad de proporcionar
vacunas seguras, efectivas, y de acción rápida, y composiciones
inmunogénicas para tratar y prevenir esta enfermedad. Muchos
enfoques distintos del uso de preparaciones de virus intactos se han
propuesto y/o perseguido para proporcionar una composición
inmunogénica efectiva, y rentable específica para virus de rabia.
Por ejemplo, como se discutió anteriormente, se han desarrollado
vacunas de subunidad. También, se han propuesto vacunas con cierto
valor que podrían generar una respuesta inmune a múltiples serotipos
de rabia, así como otros diversos patógenos (Comisión Europea
COST/STD-3, 1996 "Advantages of combined
vaccines" Vaccine 14:693-700). De
hecho, se ha dado a conocer recientemente el uso de una vacuna
combinada de difteria, tétanos, tos ferina de células intactas,
poliomielitis inactivada, y rabia (Lang J. et al., 1997,
"Randomised Feasibility trial of pre-exposure
rabies vaccination with DTP-IPV in infants"
The Lancet 349:1663-1665). Las vacunas
combinadas que incluyen rabia también se han utilizado para
inmunización de perros (virus de moquillo, hepatitis, leptospirosis
y parvocanino), gatos (virus de panleucopenia, calici- y
parvo-felino) y ganado (virus de la glosopeda)
(Pastoret, P-P. et al., 1997, "Vaccination
against rabies" en Veterinary Vaccinology, Pastoret,
P-P. et al., Eds. (Elsevier):
616-628 23).
Además, las vacunas producidas en cultivos de
tejidos son costosas de producir a pesar de algunos intentos para
reducir sus costes. Por consiguiente, las vacunas de ADN, las cuales
son menos costosas de producir y ofrecen muchas ventajas,
constituirían una alternativa valiosa. Los informes de vacunaciones
de ADN incluyen inoculación en ratones con plásmidos que contienen
el gen que codifica la glicoproteína de virus de la rabia (G). Dicha
inoculación es muy potente induciendo respuestas inmunes humorales y
celulares en asociación con la protección contra una exposición
intracerebral (véase, por ejemplo, Lodmell, D. et al., 1998,
"DNA immunization protects nonhuman primates against rabies
virus" Science Med. 4:949-952;
Xiang, Z. et al., 1994, "Vaccination with a plasmid vector
carrying the rabies virus glycoprotein gene induces protective
immunity against rabies virus", Virol.
199:132-140 y Lodmell, D. et al.,
1998, "Gene gun particle mediated vaccination with plasmid DNA
confers protective immunity against rabies virus infection",
Vaccine 16, 115). La inmunización mediante ADN también
puede proteger a primates no humanos contra rabia (Lodmell et
al., 1998, supra).
También se pueden citar los documentos de Ballet
C. et al., 1999 (J. Virol. 73 (1): 225-233) y
Bahlool C. et al., 1998 (Vaccine, 1604):
417-425), que describen vectores plasmídicos que
contienen secuencias polinucleotídicas que codifican el sitio III o
el sitio II de la glicoproteína del lisavirus y el antígeno del
lisavirus distinto de un sitio III o II, y sus usos como vacuna para
inducir protección con la exposición a lisavirus.
Debido a que la administración de ADN plasmídico
genera respuestas inmunes humorales y celulares, incluyendo
producción de linfocitos T citotóxicos (CTL) (para un repaso, véase
Donnelly, J. et al., 1997, "DNA Vaccines", Annu. Rev.
immunol. 15:617-648), y se basa en una
tecnología versátil, la inmunización con ADN plasmídico puede
ofrecer un prospecto satisfactorio para vacunas multivalentes. Sin
embargo, se cree que el uso de una mezcla de plásmidos o un plásmido
individual que exprese varios antígenos induce problemas de
interferencia tanto en niveles transcripcionales como inmunológicos
(Thompson, S. et al., 1998, "Delivery of multiple CD8
cytotoxic cell epitopes by DNA Vaccination", J. immunol.
160:1717-1723). Por lo tanto, existe la
necesidad de desarrollar y producir vacunas a base de ADN
multivalentes que sean efectivas contra rabia y otras diversas
enfermedades; que sean seguras; y que sean rentables de producir y
utilizar.
La presente invención proporciona una molécula
portadora, tal como un vector de expresión de ADN, que comprende una
secuencia de polinucleotídica quimérica, en la que dicha secuencia
polinucleotídica quimérica comprende una secuencia que codifica una
parte de una glicoproteína que contiene al menos el sitio III de la
glicoproteína de lisavirus, y comprende además una secuencia que
codifica un antígeno heterólogo distinto de un antígeno procedente
de un lisavirus. La molécula portadora de la invención se puede usar
como una composición inmunogénica, o como una parte de una
composición inmunogénica, para provocar la respuesta inmune deseada.
Se describe que la respuesta inmune deseada puede ser una respuesta
protectora contra los virus de la rabia o virus relacionados de la
rabia, así como también contra otros organismos o polipéptidos. De
este modo, las moléculas portadoras de la invención se pueden usar
para obtener una composición inmunogénica, que se puede usar para
tratar a un individuo. La molécula portadora también se puede usar
para producir un polipéptido quimérico.
La presente invención también proporciona un
polipéptido que está codificado por la secuencia de ácidos nucleicos
presente en la molécula portadora de la invención. Se describe que
el polipéptido de la invención se puede usar para provocar una
respuesta inmunogénica en un individuo. De este modo, el polipéptido
quimérico de la invención se puede usar para obtener una composición
inmunogénica, que se puede usar para trata a un individuo.
La presente invención incluye composiciones
inmunogénicas que comprenden la molécula portadora de la invención
que contiene una secuencia polinucleotídica que codifica un
polipéptido quimérico (o de fusión), o el polipéptido quimérico así
codificado, que se puede usar para provocar la respuesta inmune.
Se han creado secuencias de ácidos nucleicos
quiméricas que codifican polipéptidos quiméricos que inducen
respuestas inmunogénicas en individuos. Como se discutió
anteriormente, se sabe en la técnica que el ADN puede producir tanto
respuestas inmunes humorales como celulares. Al hacer esto, es
posible que los propios ácidos nucleicos puedan inducir al menos
parte de la respuesta inmunogénica. De esta forma, los ácidos
nucleicos quiméricos y las moléculas portadoras pueden proporcionar
o promover una respuesta inmunogénica.
Como se utiliza en la presente, "quimérico"
y "fusión" se utilizan de manera intercambiable y con
referencia tanto a ácidos nucleicos como a polipéptidos. Estos
términos se refieren a ácidos nucleicos y polipéptidos que
comprenden secuencias que no se encuentran de manera natural
asociadas entre sí en el orden o contexto en el cual son colocados
de acuerdo con la invención. Por ejemplo, una glicoproteína
quimérica puede comprender una región C-terminal de
una rabia GT1 y una región N-terminal de una rabia
GT3 o GT5. Además, un ácido nucleico quimérico puede comprender un
segmento corto de una porción de un genotipo de rabia enlazado
directamente a otro segmento del mismo genotipo, en el que los dos
segmentos no son naturalmente adyacentes entre sí. De esta forma, un
polipéptido o ácido nucleico quimérico o de fusión no comprende la
secuencia natural de un virus de rabia en su totalidad, y puede
comprender secuencias heterólogas (de otra cepa de lisavirus, o de
otro organismo en conjunto). Las proteínas de fusión/quiméricas
tienen los dos (o más) segmentos heterólogos unidos a través de
enlaces peptídicos normales, mientras que los ácidos nucleicos de
fusión/quiméricos tienen los dos (o más) segmentos heterólogos
unidos a través de enlaces fosfodiéster normales.
En un aspecto de la invención, los ácidos
nucleicos quiméricos contenidos en la molécula portadora de la
invención comprenden a) una secuencia que codifica una parte de una
glicoproteína que contiene al menos el sitio III de una
glicoproteína de lisavirus, y comprende además b) una secuencia que
codifica un dominio transmembránico (o una porción del mismo que sea
funcionalmente equivalente al dominio transmembránico) de una
glicoproteína transmembránica. En realizaciones preferidas de este
aspecto de la invención, los ácidos nucleicos quiméricos contenidos
en la molécula portadora de la invención comprenden además una
secuencia que codifica el dominio citoplásmico de dicha
glicoproteína de dicho lisavirus. En realizaciones también
preferidas de este aspecto de la invención, los ácidos nucleicos
quiméricos comprenden además una secuencia que codifica al menos la
mitad C terminal de la glicoproteína del lisavirus. Se describe que
la secuencia que codifica el dominio transmembránico (o porción del
mismo) es una secuencia de una glicoproteína transmembránica de un
lisavirus, o de una glicoproteína transmembránica distinta de una
glicoproteína procedente de un lisavirus. Por ejemplo, puede ser de
una glicoproteína de otro organismo, o de una proteína
transmembránica que no sea una glicoproteína. En realizaciones, la
secuencia que codifica el dominio transmembránico (o porción del
mismo) y la secuencia que codifica el dominio citoplásmico son del
mismo lisavirus. La secuencia que codifica el sitio III y el dominio
citoplásmico son de la misma glicoproteína de lisavirus.
En una realización preferida de este aspecto de
la invención, el ácido nucleico quimérico contenido en la molécula
portadora de la invención incluye secuencias que codifican una
secuencia de sitio III de una glicoproteína de lisavirus, un
antígeno heterólogo distinto de un antígeno procedente de un
lisavirus, una secuencia de sitio II de una glicoproteína de
lisavirus, un dominio transmembránico de una proteína
transmembránica, y un dominio citoplásmico de una proteína
transmembránica. Se describe que el ácido nucleico quimérico de la
invención comprenda secuencias que codifiquen una proteína
antigénica (o porción antigénica de la misma), especialmente entre
las secuencias que codifican los sitios II y III.
Se describe que las secuencias que codifican el
sitio II y sitio III son secuencias que abarcan el sitio II y sitio
III de una glicoproteína de un lisavirus, respectivamente. En
realizaciones, la secuencia que codifica el sitio III no es idéntica
a ninguna de las secuencias conocidas del sitio III de los
lisavirus, pero muestra por lo menos 60% de identidad con una de las
secuencias de lisavirus, que se extiende 30 pares de bases a cada
lado de la secuencia de sitio III. Los análisis de secuencias y
estudios filogenéticos se realizan utilizando diferentes paquetes:
GCG (versión 8.1, 1994), CLUSTAL W (Thompson, 1994 #1040), PHYLIP
(versión 3.5: Felseustein, 1993, #1042), y GDE (Genetic Data
Environment, Versión 2.2: Institute Pasteur Scientific Computer
Service - S.I.S).
En esta invención, se describe que la secuencia
de sitio III es la de la cepa PV del virus de la rabia, o muestra
por lo menos 60% de identidad con esa secuencia de sitio III. Se
obtienen resultados muy satisfactorios con los siguientes
constructos, representados en la figura 1: PV-PV o
PV III o EBL1-PV o MOK-PV. El módulo
base debe de contener por lo menos una secuencia de PV III.
Se ha encontrado que la presencia del sitio III
de las glicoproteínas del lisavirus mejora la inmunogenicidad de
composiciones que comprenden la glicoproteína, o porciones de la
misma. La presente invención incluye ácidos nucleicos quiméricos que
comprenden una secuencia que codifica el sitio III de una
glicoproteína de lisavirus que está enlazada funcional, operativa y
físicamente a una secuencia homóloga o heteróloga que codifica un
dominio transmembránico de secuencia natural o sintética que
codifica una proteína transmembránica (o una porción de la misma que
sea funcionalmente equivalente al dominio transmembránico), y una
secuencia que codifica un dominio citoplásmico (o una porción del
mismo que sea suficiente para existir citoplásmicamente de manera
estable) procedente de glicoproteína. La glicoproteína es la de un
virus, y particularmente la de un lisavirus. Las secuencias de
ácidos nucleicos quiméricos pueden proceder todas del mismo
lisavirus, se pueden seleccionar de diversos lisavirus, o pueden ser
tanto de lisavirus como de otros virus y organismos. En
realizaciones preferidas, las secuencias de ácidos nucleicos que
codifican el sitio III y el dominio citoplásmico son del mismo
lisavirus.
El ácido nucleico quimérico de la molécula
portadora de la invención comprende una secuencia que codifica un
antígeno heterólogo, o una porción antigénica del mismo, distinto de
un antígeno procedente de un lisavirus. Por ejemplo, se describe que
el ácido nucleico quimérico puede comprender, además de los
elementos antes expuestos, una secuencia que codifica un epítopo de
leishmania, difteria, tétanos, poliomielitis, virus de la glosopeda,
virus del herpes, virus de moquillo en caninos, parvovirus y virus
de inmunodeficiencia felina. En una realización preferida, el ácido
nucleico quimérico contenido en la molécula portadora de la
invención comprende una secuencia que codifica un antígeno tumoral.
La secuencia que codifica el polipéptido heterólogo (o porción
antigénica del mismo) se fusiona (en marco) con la secuencia
codificante arriba detallada, en cualquier sitio que dé cómo
resultado un producto funcional. De esta forma, se describe que el
ácido nucleico quimérico de la invención puede incluir la secuencia
codificante para múltiples determinantes antigénicos, incluyendo,
pero sin limitarse a, epítopos del virus de rabia.
La molécula portadora de la invención se puede
usar para obtener una composición inmunogénica. La composición
inmunogénica puede constar esencialmente del ácido nucleico
quimérico, o puede comprender el ácido nucleico quimérico además de
otros componentes, incluyendo, pero sin limitarse a, adyuvantes,
excipientes, estabilizadores, vectores supramoleculares como se
describen en la patente europea nº 696.191 (Samain et al.), y
antígenos. Los componentes normalmente incluidos en composiciones
inmunogénicas son bien conocidos por el experto en la técnica, ya
que son las técnicas para preparar composiciones inmunogénicas,
tales como vacunas. Por lo tanto, el experto en la técnica puede
conseguir la preparación de la composición inmunogénica utilizando
técnicas bien conocidas, sin indebida o excesiva
experimentación.
El núcleo de la molécula portadora puede ser
cualquier molécula que se sepa que es útil para mantener, y
preferentemente expresar, un ácido nucleico que codifique un
polipéptido heterólogo. El núcleo de la molécula portadora puede
ser, por ejemplo, un plásmido, un fago, un fagómido, un cósmido, un
virus o un cromosoma artificial de levadura (YAC). Dichas moléculas
portadoras de núcleo también se denominan habitualmente como
vectores o vectores de expresión, y son bien conocidas por el
experto en la técnica y están ampliamente disponibles al público. La
molécula portadora de la invención se puede proporcionar como un
ácido nucleico desnudo, o empaquetado, tal como en cubierta o
caparazón viral. La molécula portadora se puede proporcionar como
ADN o ARN. Las formas modificadas de estos dos ácidos nucleicos se
incluyen dentro del alcance de la invención. La molécula portadora
puede comprender secuencias que permiten la transcripción de los
ácidos nucleicos quiméricos. Estas secuencias están operablemente
enlazadas con los ácidos nucleicos quiméricos de la invención (es
decir, su operación/función afecta directamente a la expresión del
ácido nucleico quimérico). En realizaciones, estas secuencias
incluyen elementos reguladores que permiten la expresión controlada
de los ácidos nucleicos quiméricos, de modo que la expresión de los
ácidos nucleicos quiméricos se pueda regular, por ejemplo,
retardando la expresión hasta que se desee, o expresando los ácidos
nucleicos quiméricos en ciertos tejidos o tipos de células
solamente. Dichos elementos de control son conocidos por el experto
en la técnica, y se pueden insertar o remover de manera habitual de
las moléculas portadoras según se desee o sea necesario, utilizando
reactivos y técnicas de biología molecular bien conocidos.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona una proteína o polipéptido quimérico que es codificado
y/o expresado por la secuencia de ácidos nucleicos quiméricos de la
molécula portadora de la presente invención.
Se describe que el sitio II y sitio III se
pueden obtener a partir de cualquier lisavirus, y ambos pueden
proceder, pero no necesariamente, del mismo lisavirus. Además, la
secuencia del sitio II y/o sitio III no tiene que ser idéntica a un
sitio II o sitio III de una glicoproteína de un lisavirus. La
secuencia de uno o ambos no es idéntica a ninguna de las secuencias
de sitio II o sitio III conocidas de los lisavirus, pero muestra por
lo menos 60% de identidad con una de las secuencias de lisavirus,
que se extiende 10 restos a cada lado de la secuencia de sitio II o
sitio III.
La invención también proporciona un polipéptido
quimérico con múltiples antígenos que incluyen, pero no se limitan
a, antígenos de la rabia. El polipéptido quimérico se puede utilizar
como, o como parte de, una composición inmunogénica, tal como una
vacuna. Así, el polipéptido de la invención es un polipéptido
inmunogénico que contiene por lo menos una región (la cual puede ser
aislada como un fragmento) que induce una respuesta inmunogénica. En
realizaciones en las que están presentes un sitio II, un sitio III,
y otro determinante antigénico, se prefiere, aunque no
necesariamente, que el otro determinante antigénico esté localizado
entre el sitio II y sitio III en la secuencia de aminoácidos
lineales (primarios) del polipéptido. Un antígeno preferido distinto
del sitio II o sitio III es un antígeno tumoral de una célula
tumoral.
Las moléculas portadoras y polipéptidos
quiméricos (las "moléculas") de la invención se pueden aislar
y/o purificar. Los términos "aislado" y "purificado" se
refieren a un nivel de pureza que se puede conseguir utilizando
tecnología actual. Las moléculas de la invención no necesitan ser
absolutamente puras (es decir, no contienen absolutamente ninguna
molécula de otras macromoléculas celulares), sino que deben ser
suficientemente puras de modo que un experto en la técnica reconozca
que ya no están presentes en el entorno en el cual se encontraron
originalmente (es decir, el medio celular). De esta forma, una
molécula purificada o aislada es aquella que se ha eliminado de al
menos alguna otra macromolécula presente en el entorno natural en el
cual se encontró. Las moléculas de la invención están esencialmente
purificadas y/o aisladas, lo que significa que la composición en la
cual están presentes está casi completamente, o incluso
absolutamente, libre de otras macromoléculas encontradas en el
entorno en el cual se encontraron originalmente las moléculas de la
invención. De esta forma, el aislamiento y purificación no ocurre
por adición o eliminación de sales, disolventes o elementos de la
tabla periódica, sino deben incluir la eliminación de al menos
algunas macromoléculas.
Como se puede ver a partir de la descripción
anterior, la invención proporciona una composición inmunogénica que
comprende la proteína quimérica o molécula portadora de la
invención. Por ejemplo, los polipéptidos quiméricos de la invención
se pueden utilizar para obtener una composición inmunogénica. La
composición inmunogénica puede constar esencialmente del polipéptido
quimérico, o puede comprender el polipéptido quimérico además de
otros componentes, incluyendo, pero sin limitarse a, adyuvantes,
excipientes, estabilizadores, vectores supramoleculares (documento
EP 696.191, Samain et al.) y antígenos. Los componentes
normalmente incluidos en composiciones inmunogénicas son bien
conocidos por los expertos en la técnica, ya que son las técnicas
para la preparación de composiciones inmunogénicas, tales como
vacunas. Por lo tanto, el experto en la técnica puede conseguir la
preparación de la composición inmunogénica utilizando técnicas bien
conocidas, sin indebida o excesiva experimentación.
Se describe que la composición inmunogénica de
acuerdo con la invención es una composición que provoca una
respuesta inmune por lo menos para lisavirus. Debido a que las
moléculas portadoras y polipéptidos de la invención pueden
comprender determinantes antigénicos de los diversos genotipos de
lisavirus en diferentes combinaciones, la composición inmunogénica
de la invención puede proporcionar un amplio espectro de protección
contra lisavirus que inducen encefalomielitis, incluyendo virus de
la rabia. Además, debido a que las secuencias que codifican
múltiples epítopos de lisavirus se pueden incluir en un ácido
nucleico quimérico, la composición inmunogénica de la invención
puede proporcionar una respuesta inmune a múltiples genotipos (que
incluye a todos) de lisavirus. Preferiblemente, la composición
inmunogénica de la invención provoca una respuesta inmune tanto
celular como humoral.
Además, la composición inmunogénica de la
invención proporciona epítopos procedentes no solamente de
lisavirus, sino también de cualquier otro organismo (incluyendo
antígenos producidos por células humanas, tales como antígenos no
deseables encontrados en la superficie de células cancerosas). Esto
permite la construcción de composiciones inmunogénicas que incluyen,
pero no se limitan a, vacunas que tienen amplia aplicabilidad, ya
que una composición individual se puede utilizar para provocar una
respuesta inmune a múltiples patógenos. Por ejemplo, se puede
obtener una composición inmunogénica que proporcione una respuesta
inmunológica protectora frente a una amplia escala de lisavirus,
mientras que al mismo tiempo proporciona una respuesta protectora
frente a otros virus, tales como polio e influencia. Dicha
composición inmunogénica multivalente se proporciona por la
naturaleza quimérica de los ácidos nucleicos y polipéptidos de la
invención, así como la presencia del sitio III de un lisavirus, el
cual confiere una fuerte respuesta inmunogénica a los epítopos del
polipéptido antigénico.
La composición inmunogénica de la invención
provoca una respuesta inmunogénica en individuos a quienes se
administra. La respuesta inmunogénica puede provocar una respuesta
inmune protectora, pero dicha respuesta no es necesaria. Las
respuestas inmunogénicas se pueden potenciar, o de otra forma
modificar, por la inclusión de componentes, además de los ácidos
nucleicos quiméricos, proteínas quiméricas y moléculas portadoras de
la invención. De manera alternativa, las composiciones inmunogénicas
pueden constar esencialmente de los ácidos nucleicos quiméricos,
proteínas quiméricas y moléculas portadoras de la invención.
La invención describe un método para obtener una
composición inmunogénica. En una realización, el método comprende
aislar y/o purificar el ácido nucleico o polipéptido quimérico o la
molécula portadora. En otra realización, el método comprende aislar
el ácido nucleico o polipéptido o la molécula portadora, luego
combinarlo con componentes adicionales. Los componentes adicionales
pueden ser cualquier compuesto adecuado que no tenga un efecto
adverso en la inmunogenicidad, seguridad o efectividad del ácido
nucleico, polipéptido o molécula portadora de la invención. Los
componentes adicionales incluyen pero no se limitan a compuestos y
aditivos que se añaden típicamente a composiciones inmunogénicas
para aumentar la inmunogenicidad, estabilidad y biodisponibilidad.
Dichos aditivos se describen anteriormente, y son conocidos por los
expertos en la técnica.
En otra realización, el método para obtener una
composición inmunogénica es un método para expresar un polipéptido
(híbrido) quimérico para uso en la producción de una composición
inmunogénica. En esta realización, el ácido nucleico quimérico de la
molécula portadora de la invención se expresa (transcribe y traduce)
de modo que se produce el polipéptido quimérico. El polipéptido
quimérico así producido es entonces aislado y/o purificado hasta un
nivel aceptable, de modo que se puede utilizar para obtener una
composición inmunogénica. Como se utiliza en la presente, un
polipéptido es un polímero de aminoácidos, e incluye péptidos (más
de 3 aminoácidos de longitud), y proteínas (más de 100 aminoácidos
de longitud). La producción del polipéptido quimérico se puede
realizar in vivo o in vitro. Preferiblemente, la
producción ocurre in vivo mediante expresión en cultivos
bacterianos o de tejido, y el polipéptido quimérico se aísla de esos
cultivos utilizando técnicas conocidas de purificación de
proteínas.
También se describen métodos para obtener las
moléculas portadoras y los polipéptidos quiméricos de la invención.
Los métodos incluyen técnicas comúnmente conocidas de manipulación
genética, que son bien conocidas por los expertos en la técnica. Se
puede utilizar cualquier técnica conocida, que sea practicada de
manera normal por el experto en la técnica, para producir y
purificar las moléculas quiméricas de la molécula portadora de la
invención. La novedad de la invención no reside en estas técnicas,
sino en las moléculas quiméricas construidas a través del uso de las
mismas. En este aspecto, los métodos se pueden utilizar para obtener
un ácido nucleico o molécula portadora para uso en la producción de
una composición inmunogénica, tal como una vacuna de ADN.
La invención también describe métodos para
tratar a individuos con las composiciones inmunogénicas de la
invención. Preferiblemente, el método es un método de vacunación. El
método comprende administrar las composiciones inmunogénicas a
individuos, o pacientes, en necesidad de tratamiento, que se
considera que necesitan tratamiento, o que desean tratamiento
profiláctico (protector) para una enfermedad o trastorno. Se puede
utilizar cualquier método conocido de administración en este aspecto
de la invención, incluyendo, pero sin limitarse a, inyección con
jeringa y aguja (por ejemplo, subcutánea, intramuscular,
intravenosa), administración oral o en mucosas, inhalación,
administración tópica (por ejemplo, aplicación directa a la piel), y
mediante supositorio.
También se describe un método comprende
administrar los ácidos nucleicos quiméricos de la molécula portadora
de la invención a un individuo, en una cantidad suficiente para
provocar una reacción inmunogénica en el receptor. Preferiblemente,
esta respuesta es una respuesta protectora. La cantidad de ácido
nucleico necesaria para dicha inmunización se puede determinar por
los expertos en la técnica sin experimentación indebida o excesiva.
Por ejemplo, se pueden administrar composiciones que comprendan los
ácidos nucleicos quiméricos y moléculas portadoras de la invención
en una cantidad de 40 a 100 \mug, intramuscularmente, en una o
varias inyecciones. Una dosis de 100 \mug es generalmente útil
para perros, y una dosis de 40 \mug para ratones (con peso de 20
g).
También se describe un método comprende
administrar los polipéptidos quiméricos de la invención a un
individuo. Preferiblemente, la respuesta es una respuesta
protectora. La cantidad de polipéptido necesaria para dicha
inmunización se puede determinar por los expertos en la técnica sin
experimentación indebida o excesiva. Por ejemplo, se pueden
administrar composiciones que comprendan los polipéptidos quiméricos
de la invención en una cantidad de 1 a 10 \mug,
intramuscularmente, en una o varias inyecciones.
También se describe un método comprende
administrar la molécula portadora de la invención a un individuo.
Preferiblemente, la respuesta es una respuesta protectora. La
cantidad de molécula portadora necesaria para dicha inmunización la
puede determinar el experto en la técnica sin experimentación
indebida o excesiva. Por ejemplo, se pueden administrar
composiciones que comprendan las moléculas portadoras de la
invención en una cantidad de 40 a 100 \mug, intramuscularmente, en
una o varias inyecciones.
También se describe un método que incluye además
administrar cualquier combinación de los ácidos nucleicos
quiméricos, los polipéptidos quiméricos y la molécula portadora de
la invención, a un individuo. El individuo puede ser un animal, y de
preferencia es un mamífero. Más preferiblemente, el mamífero se
selecciona del grupo que consta de un ser humano, un perro, un gato,
un bóvido, un cerdo y un caballo. En una realización especialmente
preferida, el mamífero es un ser humano.
También se describen métodos de tratamiento que
incluyen administrar composiciones inmunogénicas que comprendan
polipéptidos, pero también composiciones que comprendan ácido
nucleicos (incluyendo la molécula portadora). Los expertos en la
técnica son conscientes del concepto, aplicación y efectividad de
vacunas de ácidos nucleicos (por ejemplo, vacunas de ADN) y las
tecnologías de las vacunas de ácidos nucleicos, así como de las
tecnologías a base de polipéptidos y proteínas. La tecnología a base
de ácidos nucleicos permite la administración de ácidos nucleicos,
desnudos o encapsulados, directamente a tejidos y células, sin la
necesidad de producir proteínas codificadas antes de la
administración. La tecnología se basa en la capacidad de estos
ácidos nucleicos para ser captados por células del organismo
receptor y expresados para producir un determinante inmunogénico al
cual responde el sistema inmune del receptor. Normalmente, los
antígenos expresados se despliegan en la superficie celular de
células que han captado y expresado los ácidos nucleicos, pero los
antígenos codificados se pueden expresar y exportar al sistema
circulatorio del individuo receptor. Dicha tecnología de vacunas de
ácidos nucleicos incluye, pero no se limita a, el suministro de ARN
y ADN desnudo, y el suministro de vectores de expresión que
codifican polipéptidos de interés (moléculas portadoras). Aunque la
tecnología se denomina "vacuna", es igualmente aplicable a
composiciones inmunogénicas que no dan como resultado una respuesta
protectora.
La presente invención también describe el
suministro de ácidos nucleicos como parte de composiciones más
grandes o más complejas. Entre estos sistemas de suministro se
incluyen virus, partículas similares a virus, o bacterias que
contienen el ácido nucleico quimérico o molécula portadora de la
invención. También se incluyen dentro del alcance de la invención
los ácidos nucleicos y moléculas portadoras de los complejos de la
invención con compuestos permeabilizantes de células, tales como
liposomas. Otros compuestos, vectores supramoleculares (documento
EP 696.191, Samain et al.) y sistemas de suministro para
vacunas de ácidos nucleicos son conocidos por los expertos en la
técnica, y se ejemplifican en los documentos WO 90 111092 y WO 93
06223 (patentes de Vical), y se pueden obtener y utilizar sin
experimentación indebida o excesiva.
Los métodos para tratar individuos incluyen
tratamiento profiláctico, tratamiento terapéutico y tratamiento
curativo. El tratamiento profiláctico es el tratamiento de un
individuo, utilizando los métodos de la invención, antes de que se
identifique cualquier signo clínico de enfermedad o infección. De
esta forma, el tratamiento profiláctico es un tratamiento
preventivo, e incluye vacunación. El tratamiento profiláctico
también incluye el tratamiento que es instituido después del
comienzo de la enfermedad o infección real, pero antes de que se
observe otro signo clínico de la enfermedad o infección. El
tratamiento terapéutico es el tratamiento de un individuo después de
que se identifica por lo menos un signo clínico de enfermedad o
infección, o después de que se sabe (o que se sospecha en gran
medida) que un individuo ha sido expuesto a una cantidad de un
agente suficiente para ocasionar enfermedad o infección. Los métodos
de tratamiento terapéutico no necesariamente dan como resultado la
eliminación de la enfermedad o infección; sin embargo, proporcionan
una mejora clínicamente detectable en por lo menos un signo clínico
de la enfermedad o infección. Los métodos de tratamiento curativo
dan como resultado la eliminación completa de los signos clínicos de
la enfermedad o infección en el individuo tratado. Se incluye en
los métodos de tratamiento curativo aquellos que dan como resultado
la eliminación completa del agente causante de la infección o
enfermedad, ya sea éste un virus, bacteria, o célula hospedante (tal
como una célula cancerosa). También se incluye en los métodos de
tratamiento curativo aquellos que ocasionan remisión completa de una
enfermedad, es decir, la eliminación completa de cualquier signo
clínico externo de infección o enfermedad, y la represión de todas
las manifestaciones clínicas detectables de la infección o
enfermedad.
Con respecto a vacunación de la rabia, se sabe
que el virus puede ser tratado tanto profiláctica (por ejemplo,
mediante vacunación de perros) como curativamente (por ejemplo,
mediante una serie de inyecciones a un ser humano previamente
mordido por un perro rabioso). De esta forma, también se describe un
método de vacunación de un individuo con una vacuna que comprende la
composición inmunogénica de la invención. Como se discutió
anteriormente, se describe que la composición inmunogénica de la
invención puede comprender (o codificar) múltiples determinantes
antigénicos. Por lo tanto, el método de tratamiento descrito puede
incluir múltiples tipos de tratamiento para múltiples tipos de
enfermedades o infecciones. Por ejemplo, un método individual de
tratamiento puede comprender tratamiento profiláctico de la polio,
tratamiento profiláctico y terapéutico de la rabia, y tratamiento
profiláctico de la gripe.
Será evidente para los expertos en la técnica
que se pueden hacer diferentes modificaciones y variaciones en la
construcción de las moléculas de la invención sin apartarse del
alcance o espíritu de la misma. Ahora, la invención se describirá
con más detalle con referencia a ejemplos específicos de la
invención.
La invención se describirá con más detalle con
referencia a los dibujos, en los cuales:
La figura 1 representa glicoproteínas de
lisavirus y construcciones quiméricas de glicoproteínas de
lisavirus. SP - péptido señal; TM - dominio transmembránico; S1 -
restos de aminoácidos NL; S2 - restos de aminoácidos NS; S3 - restos
de aminoácidos LFAV.
- (A)
- Representación esquemática de glicoproteína (G) de PV de lisavirus, que indica regiones que abarcan el sitio II, el sitio III y los epítopos I, V y VI, así como también se presenta en la parte superior el dominio transmembránico (TM). Los polipéptidos quiméricos están ilustrados esquemáticamente en las otras líneas, con puntos de supresión y/o fusión indicados por números de restos. Los números son las posiciones de los restos de aminoácidos en la proteína madura (péptido señal escindido).
- (B)
- Secuencias de aminoácidos de los polipéptidos quiméricos en los sitios de fusión. La región lineal que porta el epítopo VI (aminoácido 264) se indica subrayando en los restos 251-275. Los cuadros negros y grises señalan las secuencias de EBL-1 y Mok, respectivamente. Las líneas punteadas representan aminoácidos similares a los de la secuencia de PV, y los puntos corresponden a espacios.
- (C)
- Representación esquemática de las secuencias insertadas que codifican el epítopo de poliovirus C3 involucrado en la inducción de anticuerpos neutralizantes del virus (B), y el epítopo de células CD8 H-2d (CTL) de la nucleoproteína del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) involucrado en la inducción tanto de linfocitos T citotóxicos (CTL) como en la protección contra la exposición a LCMV en la glicoproteina G de lisavirus truncada (GPVIII) y quimérica (GEBL1-PV).
- (D)
- También se da el análisis de la secuencia PEST putativa alrededor de la unión del extremo de la parte EBL1 y el comienzo del epítopo de células B.
- (E)
- Comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas de proteínas G de lisavirus seleccionados. La secuencia de consenso se presenta como la secuencia inferior. Los cuadros en gris claro indican los principales sitios antigénicos. Los cuadros en gris oscuro indican el péptido señal hidrófobo (SP) y el dominio transmembránico (TM). Los motivos subrayados NX(S/T) son sitios potenciales de N-glicosilación.
La figura 2 muestra microscopía de
inmunofluorescencia indirecta de la producción de G de lisavirus en
células Neuro-2a 48 horas después de la transfección
transitoria con diversos plásmidos: pGPV-PV (A, B y
C), pG-PVIII (D, E y F), pGEBL1-PV
(G, H e I), pGMok-PV (J, K y L), y
pGPV-Mok (M, N y O). Cuarenta y ocho horas después
de la transfección, las células se permeabilizaron y tiñeron con
anticuerpos: PAb anti-G del PV (A, D, G, J y M), MAb
anti-sitio III de la G nativa del PV de PV D1 (B, E,
H y K), MAb anti-sitio III de la G desnaturalizada
de 6B1 (C y F), PAb anti-G de EBL-1
(I), PAb anti-G de Mok (L y N) y suero de un ratón
no inmunizado (O).
La figura 3 muestra los resultados de un estudio
cinético de síntesis de antígeno en células Neuro-2a
transfectadas transitoriamente con pGPV-PV (a),
pGEBL1-PV (b) o pG-PVIII (c). Las
células se permeabilizaron a diferentes tiempos, y se tiñeron con
PAb de PV (barra punteada) o MAb anti-sitio III de
la G desnaturalizada de 6B1 (barra sombreada).
La figura 4 muestra los resultados de la
inducción de células productoras de IL-2 mediante
plásmidos que codifican diferentes G de lisavirus. Se inyectaron
intramuscularmente ratones BALB/c (dos animales por cada uno de los
plásmidos) (50 \mul en cada músculo tibial anterior) con 40 \mug
de plásmido (pGPV-PV, pG-PVIII,
pGEBL1-PV, pGMok-PV y
pGPV-Mok). Se retiraron los bazos 21 días después, y
los esplenocitos se estimularon específicamente in vitro
mediante virus inactivados y purificados (PV, EBL1 o Mok), G PV, o
se estimularon policlonalmente mediante concanavalina A (ConA).
Luego, la cantidad de IL-2 liberada se analizó por
triplicado mediante bioensayo, y los títulos se expresaron como
U/ml.
La figura 5 muestra la inducción de VNAb contra
genotipos de lisavirus Europeo mediante plásmido. Se inyectaron a
ratones BALB/c con 40 \mug de plásmido en el músculo tibial.
- (A)
- Inyección con pGPV-PV. Los ratones recibieron una revacunación en el día 30. Los sueros (conjunto de tres muestras) se analizaron en los días 27 y 40 para determinar VNAb contra virus de genotipos 1 (CVS y PV), 5 (EBL1b) y 6 (EBL2b).
- (B)
- Inyección con pGEBL1-PV. Cuatro ratones recibieron solamente una inyección de plásmido, y se recogieron muestras de sangre en diferentes intervalos mediante perforación transorbital. Los sueros se analizaron mediante RFFIT utilizando virus de PV y EBL1b para determinación de VNAb.
La figura 6 muestra protección comparativa
inducida por plásmidos pGPV-PV,
pGEBL1-PV y vacunas de PM y PV de la rabia, contra
CVS, EBL-1b, y EBL-2b. Se inyectaron
a ratones BALB/c (9 animales por serie) intraperitonealmente en los
días 0 y 7 con 0,5 ml de vacuna de PM diluida 1/10º (círculos
negros), o con 2 \mug de virus de PV inactivado y purificado
(cuadros negros). Para las inmunizaciones a base de ADN, se
inyectaron a ratones BALB/c (5 animales por cada plásmido) en el
músculo tibial con PBS (círculos en blanco) o con 40 \mug de
diferentes plásmidos pGPV-PV (rombo),
EBL1-PV (triángulo negros), cadena plasmídica de
pClneo (cruz). Se inyectaron a ratones Suizos (6 animales) con
pGPV-PV (cuadro blanco).
- (a)
- se inyectó virus inactivado. Los ratones BALB/c y Suizos se expusieron i.c. en el día 21 con aproximadamente 30 LD_{50} de CVS.
- (b)
- se inyectó virus inactivado. Los ratones BALB/c y Suizos se expusieron i.c. en el día 21 con aproximadamente 30 LD_{50} de EBL-1b.
- (c)
- se inyectó virus inactivado. Los ratones BALB/c y Suizos se expusieron i.c. en el día 21 con aproximadamente 30 LD_{50} de EBL-2b.
- (d)
- se inyectó ADN. Los ratones BALB/c y Suizos se expusieron i.c. en el día 21 con aproximadamente 30 LD_{50} de CVS.
- (e)
- d) se inyectó ADN. Los ratones BALB/c y Suizos se expusieron i.c. en el día 21 con aproximadamente 30 LD_{50} de EBL-1b.
- (f)
- d) se inyectó ADN. Los ratones BALB/c y Suizos se expusieron i.c. en el día 21 con aproximadamente 30 LD_{50} de EBL-2b.
La figura 7 muestra la microscopia de
inmunofluorescencia indirecta de antígenos expresados en células
Neuro-2a transfectadas con plásmidos.
- (A)
- las células se transfectaron con plásmido pGEBL1-(B-CTL)_{2}-PV, y se tiñeron con D1 MAb de la rabia.
- (B)
- las células se transfectaron con plásmido pGEBL1-(B-CTL)_{2}-PV, y se tiñeron con C3 MAb de poliovirus.
- (C)
- las células se transfectaron con plásmido pGEBL1-(B-CTL)_{2}-PV, y se tiñeron con el PAb antipolivirus tipo 1.
- (D)
- las células se transfectaron con plásmido pClneo, y se tiñeron con 1) D1 MAb de la rabia, 2) C3 MAb de poliovirus, o 3) PAb antipoliovirus tipo 1.
La figura 8 muestra la inducción de células
productoras de IL2 mediante pGPVIII (A) o pGEBL1-PV
(B) que portan epítopos de poliovirus y de LCMV. Se inyectaron a
ratones BALB/c (dos animales para cada plásmido) i.m. (50 \mug en
cada músculo tibial anterior) con plásmidos. Se retiraron los bazos
14 días después, y los esplenocitos se estimularon in vitro a
través de medio de cultivo celular (barra cruzada) específicamente
mediante lisavirus inactivados y purificados (IPLV PV: barra
fragmentada; IPLV EBL: sombras claras), o se estimularon
policlonalmente mediante ConA (barra punteada). La cantidad de
IL-2 liberada se analizó luego por triplicado
mediante bioensayo, y los títulos se expresaron como U/ml.
- (A)
- Los plásmidos inyectados fueron plásmidos vacíos de pClneo, pGPVIII, y p(B-CTL)_{2}-GPVIII.
- (B)
- Los plásmidos inyectados fueron pClneo, pGEBL1-PV, pGEBL1-(B)-PV, pGEBL1-(CTL)-PV, pGEBL1-(CTL-B)-PV, pGEBL1-(B-CTL)_{2}-PV.
La figura 9 muestra un estudio cinético en
ratones BALB/c de producción de anticuerpos inducida por
p(B-CTL)2-GPVIII o
pGPVIII contra péptido de poliovirus y virus de rabia. Se inyectaron
a tres ratones con 40 \mug de
p(B-CTL)2-GPVIII
(cuadro y círculo), o pGPVIII (triángulo), o pClneo vacío (rombo).
Después de perforación mediante vía retroorbital en diferentes
tiempos, los sueros se analizaron mediante ELISA para determinar los
anticuerpos contra péptido de poliovirus (cuadro y rombo) o el virus
de rabia (círculo, triángulo y rombo).
La figura 10 muestra la influencia de un cebado
en la producción de anticuerpos antipéptidos de poliovirus, inducida
por p(B-CTL)2-GPVIII.
Cinco grupos de tres ratones recibieron en el día 0 PBS (2 grupos),
p(B-CTL)2-GPVIII (2
grupos), o pPVIII. Un grupo (inyectado con
p(B-CTL)2-GPVIII) no
se revacunó, mientras que el grupo inyectado con pPVIII se revacunó
con p(B-CTL)2-GPVIII
en el día 26. Un grupo (inyectado con
p(B-CTL)2-GPVIII) se
revacunó con
p(B-CTL)2-GPVIII en el
día 14. Todos los animales se controlaron en el día 39, mediante
ELISA, para determinar la producción de anticuerpos
antipeptídicos.
La figura 11 muestra la producción de
anticuerpos neutralizantes del virus de rabia contra la cepa
original del virus Challenge (CVS) después de la inyección del
plásmido homogéneo completo pGPV en perros sabueso.
Grupo A: inyección de 100 \mug de plásmido en
un sitio en los días 0, 21, 42 y 175.
Grupo B: inyección de 33 \mug de plásmido en
tres sitios en los días 0, 21, 42 y 175.
Grupo C: inyección de 100 \mug de plásmido en
un sitio en los días 0 y 175.
Grupo D: inyección de disolución salina
tamponada de fosfato (control).
La figura 12 muestra la respuesta de anticuerpos
neutralizantes individuales contra un virus de rabia silvestre
(zorro de Francia, virus de rabia silvestre del zorro FWR) después
de inyección del plásmido homogéneo completo pGPV en perros sabueso.
También se muestra la protección inducida contra una exposición
intramuscular realizada en el día 175 con un virus de rabia
silvestre aislado de perros rabiosos.
| Perros nos. 1 a 3 | = grupo A |
| Perros nos. 4 a 6 | = grupo B |
| Perros nos. 7 a 9 | = grupo C |
| Perros nos. 10 a 12 | = grupo D |
La figura 13 muestra células N2A transfectadas
con el plásmido DBL-3/PVHIII (Fugene, Roche
Molecular Biochemicals) y fijadas con acetona (80%) durante 10
minutos en hielo. A) anti proteína de fusión DBL-3
GST de ratón (dilución 1/1000). B) Anti PVIII de conejo (dilución
1/400). Se muestran las reactividades de fondo vistas con el segundo
anticuerpo conjugado a FITC. Esta figura muestra claramente que
tanto las regiones DBL-3 como PVIII se expresaron de
manera eficiente en la membrana de las células transfectadas.
Para los ejemplos, se utilizaron los siguientes
materiales y métodos, excepto que se especifique de otro modo.
Se adquirieron ratones BALB/c hembras
(H-2^{d} BALB/c), de 6 a 8 semanas, y ratones
Suizos (14 a 16 g) de "Centre d'Elevage et de Recherche" Enero
(Legenest St Isle, Francia).
Células y lisavirus. Las células
BHK-21 utilizadas para la producción y titulación de
lisavirus se cultivaron en medio esencial mínimo (MEM) de Eagle que
contiene suero fetal bovino al 5% (FBS) y suero de becerro recién
nacido al 5% (Perrin, P., 1996, "Techniques for the preparation of
rabies conjugates", en Laboratory techniques in rabies,
Meslin, F-X., Kaplan, M., y Koprowski, H. Eds., (WHO
Ginebra): 433-445). Las células de neuroblastoma
(Neuro-2a) utilizadas para estudios de transfección
con plásmidos se cultivaron en MEM que contiene FBS al 8%.
La línea celular T citotóxica dependiente de
interleuquina-2 (IL-2) (CTLL) se
cultivó como se describe anteriormente (Perrin, P. et al.,
1988, "Interleukin-2 increases protection against
experimental rabies", Immunobiol.
177:199-209) en medio
RPMI-1640 (Gibco: Flowbio, Courbevoie, Francia) que
contiene FBS al 10%, 1 mM de piruvato de sodio, 1 mM de aminoácidos
no esenciales, 5x10^{-5} M 2-mercaptoetanol,
tampón HEPES (Flow Laboratories, Bethesda, USA), y 5 a 10 unidades
(para 1x10^{4} células) de IL-2 de rata
(sobrenadante de esplenocitos estimulado con concanavilina A: Con
A). Las células se incubaron a 37ºC en una atmósfera humidificada
que contiene 7,5% CO_{2}.
Se multiplicaron (se hicieron pasar) cepas de la
rabia de virus fijo PV-Paris/BHK-21,
CVS, así como cepas de virus relacionados con la rabia (EBL1b,
EBL2b, LCMV, y Mok), en células BHK-21 como se
describe anteriormente por Perrin, P., 1996, más arriba. Los
lisavirus de murciélago Europeo utilizados fueron EBL1b (número de
cepa 8916FRA), derivads de un aislado de murciélago de Francia, y
EBL2b (número de cepa 9007FIN, un obsequio de H. Bouhry), aislado de
un ser humano en Finlandia (Amengal, B. et al., 1997,
"Evolution of European bat lissaviruses", J. Gen. Virol.
78:2319-2328). La cepa Arm/53b de LCMV fue
provista amablemente por Drs. M. Oldstone y M. McChesney (Scripps
Clinic, La Jolla, CA).
Antígenos y vacunas del virus de rabia.
Los lisavirus inactivados y purificados (IPRV) se prepararon como se
describe por Perrin, P., 1996, más arriba. Los virus se
purificaron a partir de sobrenadantes de células infectadas
inactivadas (\beta-propiolactona) y clarificadas,
mediante ultracentrifugación a través de un gradiente de sacarosa.
La glicoproteína de PV se solubilizó a partir de IPRV, y se purificó
(G PV) como se describe anteriormente por Perrin, P., 1996, más
arriba, y Perrin, P., et al., 1985, "Rabies immunosomes
(subunit vaccine) structure and immunogenicity", Vaccine,
3:325-332.
Los dos virus de la rabia inactivados utilizados
para estudios de protección comparativos se prepararon con dos cepas
diferentes: 1) PM como vacuna comercial para uso humano; (Pasteur
Vaccins Mames-la Coquette Francia; Lote Y0047); 2)
PV como vacuna para uso en laboratorio (IPRV).
Construcción de plásmidos que expresan genes
de G de lisavirus. Se seleccionó la región (aminoácidos
253-275) que solapa el único epítopo no
conformacional (VI) (Figura 1) para la construcción de genes
quiméricos, debido a que supuestamente está estructuralmente menos
limitada que los dos sitios II y III antigénicos principales. Los
genes de G de lisavirus homogéneos y quiméricos (véase la figura 1)
se introdujeron en el vector de expresión eucariótico pClneo
(Promega), se propagaron y se amplificaron en cepa DH5\alpha de
E. coli mediante protocolos de clonación molecular
estándares, bien conocidos por el experto en la técnica. Los
plásmidos pGPV-PV y pGMok-PV se
prepararon como se describe anteriormente (Bahloul, C., et
al., 1998, "DNA-based immunization for
exploring the enlargement of immunological
cross-reactivity against the lyssaviruses",
Vaccine 16:417-425). Los plásmidos
pGPV-Mok, pG-PVIII y
pGEBL1-PV se obtuvieron de la siguiente manera.
Para pGPV-Mok, la secuencia
codificante de la parte del sitio II de G PV (aminoácidos
1-257) se amplificó mediante RT-PCR
utilizando cebadores degenerados:
- PVXbaI: (SEQ ID NO.: 1)
- PVBc/I: (SEQ ID NO.:2)
El producto de PCR se insertó en el sitio Smal
de pUC19, después se cortó con Bc/I y EcoRI, y se ligó
entre los mismos sitios en pGMok-Mok, dando
pGPV-Mok, que contiene una fusión en marco de
aminoácidos 1-257 de G PV con aminoácidos
258-503 de G Mok.
El gen de pG-PVIII, con una
supresión en marco interno entre el extremo del péptido señal de PV
y el resto 253, se obtuvo introduciendo un adaptador sintético entre
los sitios de restricción EcoRI y Bc/I del plásmido
pGMok-PV. Este adaptador de PV, que contiene un solo
sitio EcoRI, se generó hibridando 200 picomoles de cada
cebador en 250 mM de Tris-HCl pH 7,7. El plásmido
pG-PVIII se depositó el 22 de diciembre de 1998 en
el Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM),
Paris, Francia, y se le dio el número de acceso
I-2115.
- PVp1: (SEQ ID NO.: 3)
- Pvp2: (SEQ ID NO.4)
Para generar el gen de
pGEBL1-PV, se generó un adaptador sintético que
corresponde a los aminoácidos 2-14 de
EBL-1a (cepa 8615POL) (1) y sitios de restricción
BestEII y EcoRI individuales, de la misma manera que
aquella para pG-PVIII, mediante hibridación con:
- EBL1p1: (SEQ ID NO.: 5)
- EBL1p2: (SEQ ID NO.: 6)
Este adaptador de EBL1 se ligó en marco en el
sitio EcoRI de pG-PVIII. Se generó entonces
un fragmento que corresponde a los aminoácidos
15-253 de EBL-1a (cepa 8615POL),
mediante RT-PCR de ARN viral, utilizando cebadores
EBL1 p3 y EBL1 p4:
- EBL1p3: (SEQ ID NO.: 7)
- EBL1p4: (SEQ ID NO.: 8)
El producto de RT/PCR se digirió con
BstEII y EcoRI, y se ligó en los mismos sitios
introducidos mediante el adaptador de EBL1, dando como resultado una
fusión en marco entre el péptido señal de PV, la parte EBL1a del
sitio II y la parte del sitio III de PV. La identidad de cada
constructo se confirmó mediante secuenciación automática con
reacción de terminador con colorante sobre un secuenciador ABI 377
(Perkin-Elmer). El pEBL1-PV se
depositó en el CNCM el 22 de diciembre de 1998, y se le asignó el
número de acceso 1-2114.
Inserción de epítopos de células B y CD8
extrañas en genes de G truncados o quiméricos. Los genes
truncado (pGPVIII) y quimérico (pGEBL1-PV), dados a
conocer anteriormente, que contienen un sitio de clonación
EcoRI único, se utilizaron para la inserción de epítopos de
células B y CD8 extrañas. Los genes de G de lisavirus se
introdujeron en le vector de expresión eucariótico pClneo (Promega),
se propagaron y se amplificaron en cepa DH5\alpha de Eschericia
coli mediante protocolos estándares de clonación molecular.
Los epítopos de las células B y CD8 se
insertaron en el sitio de restricción EcoRI de los genes de G
de lisavirus truncados o quiméricos, en la región de bisagra
(aminoácidos 253 a 275) de la molécula en la posición 253. El
epítopo de células B (denominado *B+) correspondió al fragmento C3
(aminoácidos 93 a 103: DNPASTTNKDK: SEQ ID NO: 9) de la proteína del
poliovirus VP1. El epítopo de células CD8 (denominado *CTL+)
correspondió a los aminoácidos 119-127 (PQASGVYMG:
SEQ ID NO:10) o a los aminoácidos 117-132
(ERPQASGVYMGNLTAQ: SEQ ID NO:11) de la nucleoproteína del virus de
la coriomeningitis linfocítica. Los plásmidos
p(B-CTL)2-GPVIII,
pGEBL1-(B)-PV, pGEBL1-(CTL)-PV,
pGEBL1-(B-CTL)-PV,
pGEBL1-(B-CTL)_{2}-PV, y
pGEBL1-(CTL-B)-PV se obtuvieron de
la siguiente manera (véase también la figura 1):
El gen de
P(B-CTL)2-GPVIII se
generó mediante clonación de dos etapas de un adaptador sintético en
el sitio de restricción EcoRI único, hibridando 200 picomoles
de cada uno de los cebadores:
- \text{*}B-CTLP1+: (SEQ ID NO:12)
- \text{*}B-CTLp2+: (SEQ ID NO:13)
Para pGEBL1-(B)-PV,
pGEBL1-(CTL)-PV, los adaptadores sintéticos
utilizados para la inserción fueron respectivamente:
- B: Bp3+: (SEQ ID NO: 14)
- \text{*}Bp4+: (SEQ ID NO: 15)
- CTL: CTLp5+: (SEQ ID NO: 16)
- \text{*}CTLp6+: (SEQ ID NO:17).
Para la construcción de los plásmidos
pGEBL1-(B-CTL)-PV y
pGEBL1-(CTL-B)-PV, se utilizaron
pGEBL1-(B)-PV y pGEBL1-(CTL)-PV en
las mismas condiciones como anteriormente para insertar las
secuencias de CTL y B, respectivamente, en los genes quiméricos.
La identidad de cada constructo se confirmó
mediante secuenciación automática con reacción de terminador con
colorante en un secuenciador ABI 377
(Perkin-Elmer).
Experimentos de expresión transitoria. La
capacidad de los plásmidos para inducir la expresión transitoria de
antígenos relacionados con G se estudió después de la transfección
de células Neuro 2a utilizando el método mediado por liposomas
catiónicos DOTAP, de acuerdo con las instrucciones del fabricante
(Boehringer Mannheim). Cada pocillo de una microplaca de cultivo
celular (Falcon) se inoculó con 3 x 10^{4} células (en MEM, 10%
FBS), y se incubó durante 24 horas a 37ºC en una atmósfera
humidificada que contiene 7,5% de CO_{2}. La placa se lavó
entonces con MEM sin FBS, y se incubó como antes durante 1 hora. El
sobrenadante celular se eliminó, y los pocillos se lavaron y se
llenaron con un volumen total de 50 \mul de disolución de
transfección, la cual contiene 0,1 \mug de plásmido y 6 \mul de
DOTAP (metilsulfato de
(N-(1-2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio)
en disolución salina estéril tamponada con HEPES (150 mM de NaCl, 20
mM de HEPES) incubada previamente a temperatura ambiente durante 15
minutos. Las placas se incubaron durante 5 horas a 37ºC en presencia
de 7,5% de CO_{2}. Se añadieron a cada pocillo 200 \mul de MEM
que contiene FBS al 2%, y la placa se incubó durante 24 a 140 horas
en las mismas condiciones, antes del análisis de la expresión
transitoria mediante inmunofluorescencia indirecta.
La capacidad de los plásmidos para inducir la
expresión transitoria de G y antígenos extraños relacionados se
estudió después de la transfección de células Neuro 2a utilizando el
reactivo de transfección FuGENE 6, de acuerdo con las instrucciones
del fabricante (Boehringer Mannheim). Cada pocillo de una cámara
Labtek de cultivo celular Nunc (Life Technologies) se inoculó con 3
x 10^{4} células (en MEM, 10% FBS), y se incubó durante 24 horas a
37ºC en una atmósfera humedecida que contiene 7,5% de CO_{2}. Las
placas se lavaron entonces con MEM sin FBS, y los pocillos se
llenaron con 50 \mul de disolución de transfección: 0,1 \mug de
plásmido, 3 \mul de reactivo de transfección FuGENE 6, y 47 \mul
de medio. La placa se incubó durante 18 horas a 37ºC en presencia de
7,5% de CO_{2}. Se añadieron a cada pocillo 200 \mul de MEM que
contiene 5% FBS, y la placa se incubó otras 24 horas en las mismas
condiciones, antes del análisis de la expresión transitoria mediante
inmunofluorescencia indirecta.
Anticuerpos. Los anticuerpos policlonales
(PAb) dirigidos contra PV y Mok G se obtuvieron como se describe por
Perrin, P., 1996, "Techniques for the preparation of rabies
conjugates", en Laboratory techniques in rabies, Meslin,
F-X., Kaplan, M., y Koprowski, H., Eds. (WHO
Ginebra):433-445, mediante inmunización de conejo
con glicoproteína de virus purificado. El PAb contra el virus
EBL-1b se obtuvo mediante inmunización de ratón con
virus inactivado y purificado.
También se utilizaron tres anticuerpos
monoclonales (MAb) dirigidos contra PV G. El PVE12 MAb (un MAb
desarrollado por M. Lafon et al., 1985 "Use of a monoclonal
antibody for quantitation of rabies vaccines glycoprotein by enzyme
immunoassay", J. Biol. Standard
13:295-301) reconoce el sitio II de G nativa.
El D1 MAb (isotipo IgG 1), producido en nuestro laboratorio,
reconoce el sitio III de G nativa, pero no de G tratada con SDS. El
6A1 MAb (un MAb reportado en 18 de 2) reconoce la proteína G
desnaturalizada con SDS, y más precisamente dos péptidos localizados
en dirección 3' del sitio III, cerca de la parte COOH terminal del
ectodominio de G (aminoácidos 342-433 y
397-450).
Microscopía de inmunofluorescencia. La
expresión transitoria de antígenos de G en células transfectadas se
calculó con y sin permeabilización (30 minutos de incubación con
acetona al 80% sobre hielo, seguido del secado por aire). Las
células transfectadas se incubaron durante 1 hora a 37ºC con PAb o
MAb. Se lavaron con PBS, y se incubaron durante 1 hora a 37ºC con
anticuerpo secundario conjugado con anti-FITC de
conejo o de ratón (Nordic Immunol. Labs, Países Bajos). Las células
se lavaron, se montaron en glicerol, y se examinaron en un
microscopio de fluorescencia invertida Leica.
Dos anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos
contra PV G (D1 MAb isotipo IgG 1) y poliovirus (C3 MAb) se
utilizaron para tinción de antígeno mediante inmunofluorescencia
indirecta (IIF). D1 MAb reconoce el sitio III de G nativa pero no de
G tratada con SDS, y C3 MAb reconoce la región
93-103 de la proteína VP1 de cápsida de
PV-1. También se utilizó un anticuerpo policlonal
neutralizante de conejo, dirigido contra el poliovirus tipo 1
nativo.
La expresión transitoria se evaluó después de la
fijación de paraformaldehído al 3% (Sigma) (20 minutos de incubación
a temperatura ambiente) sin permeabilización. Las células fijas
fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente con MAb. Se
lavaron con disolución salina tamponada con fosfato (PBS), y se
incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo
secundario conjugado con anti-FITC de ratón o de
conejo de cabra (Nordic Immunol. Labs, Países Bajos). Las células se
lavaron, se montaron en Mowiol (Sigma) y se examinaron en un
microscopio de fluorescencia invertida Leica.
Análisis de secuencia PEST putativa. Las
secuencias PEST polipeptídicas, implicadas potencialmente en la
degradación rápida de proteína, se analizaron con el programa de
ordenador de búsqueda PEST desarrollado de acuerdo con Rogers, et
al., 1986, "Amino acid sequences common to rapidly degraded
proteins: the PEST hipótesis", Science 234:
364-369.
Inyección de plásmidos en ratones. Para
estudios inmunológicos, se anestesiaron ratones BALB/c con
pentobarbital (30 mg/kg) y se inyectaron 20-50
\mug de plásmido (diluido en PBS) en cada músculo tibial anterior.
Esto fue más efectivo que la inyección a través de la ruta de
cuadriceps (observación personal). Se recogió sangre para el ensayo
de anticuerpo de suero, durante varios días mediante perforación
retro-orbital.
Para estudios de protección contra LCMV, los
ratones recibieron 3,5 \mug de cardiotoxina (Laoxan A.P., Les
Ulis, Francia) en cada pata, cuatro días antes de la anestesia y de
la inmunización para degenerar el músculo.
Ensayo de liberación de
interleuquina-2. Catorce días después de la
inyección, los bazos se retiraron de los ratones BALB/c sin
tratamiento, o de los inyectados con plásmido. Los esplenocitos
(alícuotas de 1 ml que contienen 6x10^{6}) se estimularon con 0,5
\mug de antígeno de lisavirus (por ejemplo,
IPLV-PV e IPLV-EBL1) o 5 \mug de
concanavilina A (Miles), en placas de 24 pocillos
(Nuclon-Delta, Nunc), y se cultivaron de acuerdo
con procedimientos estándar en medio de RPMI-1640
(Gibco) que contiene 10% FBS, 1 mM de piruvato de sodio, 1 mM de
aminoácidos no esenciales, 5x10^{-6} M de
2-mercaptoetanol, 10 mM de tampón HEPES (Flow
Laboratories). Las células se incubaron durante 24 horas a 37ºC en
una atmósfera humedecida que contiene 7% de CO_{2}. En estas
condiciones, las células que producen IL-2 son
principalmente células CD4+. La IL-2 producida en
sobrenadantes de cultivos de esplenocitos se tituló mediante
bioanálisis utilizando células CTLL como se describe anteriormente
por Perrin, P. et al., 1996, "The
antigen-specific cell-mediated
immune response in mice is suppressed by infection with pathogenic
lyssaviruses", Res. Virol.
147:289-299. La proliferación celular se
determinó por triplicado, basándose en la absorción de
^{3}H-timidina (New England Nuclear). La
concentración de IL-2 se determinó como unidades por
ml (U/ml), utilizando IL-2 recombinante de ratón
(Genzyme Corporation, Cambridge, MA, USA) como referencia. Las
células CTLL crecieron en presencia de IL-2 de ratón
y anticuerpos anti-IL-4, pero no en
presencia de IL-4 (hasta 10 U/ml), y en ausencia de
IL-2. De esta manera, la IL-2 se
detectó de manera predominante mediante esta técnica.
Ensayos de anticuerpo. Para el ensayo de
anticuerpos de suero, se recogió sangre durante varios días mediante
perforación retro-orbital. Se tituló IgG de rabia
mediante ensayo inmunoabsorbente enlazado con enzima (ELISA),
utilizando microplacas recubiertas con glicoproteína de rabia
purificada. El título correspondió a la dilución reciproca de la
muestra de suero que da la densidad óptica equivalente al doble de
la dada por el suero (diluido 1/20) de ratones inyectados con PBS.
Los isotipos totales anti-IgG o IgG1, IgG2a e IgG3
de la rabia se analizaron mediante ELISA utilizando microplacas
recubiertas con IPRV como se describe anteriormente por Perrin, P.
et al., 1996, "The influence of the type of immunosorbent
on rabies antibody EIA; advantages of purified glycoprotein over
whole virus", J. Biol. Standard. 14:95, con sueros
de isotipo anti-IgG de ratón de conejo como el
anticuerpo secundario (Nordic Immunol. Labs, Países Bajos) y un
conjugado de peroxidasa anti-IgG de conejo de cabra
(Nordic Immunol. Labs, Países Bajos) como el anticuerpo
terciario.
Los anticuerpos neutralizantes de lisavirus se
titularon mediante la prueba de inhibición de foco fluorescente
rápido (RRFFIT) (descrita por Smith, J. et al., 1996, "A
rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) for determining
virus-neutralizing antibody", en Laboratory
techniques in rabies, cuarta edición (Eds. Meslin,
F-X; Kaplan, M y Koprowski, H) WHO, Ginebra.:
181-189), con las modificaciones descritas
anteriormente de Perrin, P. et al., 1986, J. Biol.
Standard. 14:95. Se usaron los sobrenadantes de células
infectadas (virus PV, CVS y EBL2) y virus purificados (virus Mok y
EBL1). Los títulos de anticuerpo anti-PV o CVS se
expresan en unidades internacionales por ml (IU/ml), utilizando el
Segundo Estándar Internacional (Statens Seruminstitut, Copenhague,
Dinamarca) como referencia. Para la determinación del título del
anticuerpo contra otros lisavirus, la dilución de suero que provoca
50% de inhibición de la velocidad de enfoque fluorescente se definió
como la que tiene el mismo título de VNAb en cuanto a referencia
ensayada contra CVS.
Los anticuerpos a PV-1 se
analizaron mediante ELISA como se describe anteriormente, utilizando
microplacas recubiertas con un péptido sintético constituido por un
trímero de aminoácidos 93-103 de VP1. También se
ensayó mediante ELISA la producción de anti-IgG de
LCM.
Ensayo de protección. La actividad
protectora de vacunas y plásmidos se determinó de acuerdo con el
ensayo de potencia de NIH. Se inyectaron diluciones de vacuna de
manera intraperitoneal (i.p.) en ratones, en los días 0 y 7,
mientras que los plásmidos (40 \mug) se inyectaron en cada músculo
tibial anterior, en el día 0 únicamente. Los ratones se expusieron
entonces de manera intracerebral (i.c.), en el día 21, a alrededor
de 30 LD_{50} de diversos lisavirus (CVS, LCMV, EBL1b, o EBL2b).
Los animales se observaron durante 28 días o, de manera alternativa,
se sacrificaron en el día 21 después de la exposición, y se
recogieron muestras de sangre con el fin de controlar la eliminación
de virus y la producción de anti-IgG de LCMV.
Se utilizaron plásmidos que contienen genes de G
de lisavirus homogéneos (pGPV-PV), truncados
(pG-PVIII), y quiméricos (pGEBL1-PV,
pGMok-PV y PGPV-Mok), para
transfectar células Neuro 2a. La tinción celular mediante
inmunofluorescencia indirecta se da en la figura 2, y se puede
resumir de la siguiente manera.
Después de la transfección con
pGPV-PV, se detectó el antígeno con PV PAb (figura
2A), PV D1 MAb (figura 2B), o PV E12 MaA (no se muestra),
principalmente en la membrana celular (resultados similares con
células no permeabilizadas, no se muestran los datos), y se
detectaron muy pocas con 6A1 MAb (figura 2C). Las células
transfectadas con pG-PVIII tuvieron forma redonda, y
se tiñeron completamente (tanto el citoplasma como la membrana) con
PV PAb (figura 2D) o 6A1 MAb (figura 2F), pero no con PV D1 MAb
(figura 2E). Las células transfectadas con pGEBL1-PV
se tiñeron principalmente en la membrana celular con PV PAb (figura
2G), PV D1 MAb (figura 2H) o EBL-1 PAb (figura 2I).
Las células transfectadas con pGMoK-PV se tiñeron
(principalmente en la membrana) con PV PAb (figura 2J), PV D1 MAb
(figura 2K), Mok PAb (figura 2L), y muy pocas se tiñeron con 6A1 MAb
(no se muestra). Las células transfectadas con
pGP-Mok se tiñeron con PV PAb (figura 2M) o Mok Pab,
y tuvieron forma redonda (figura 2N). La transfección celular
distingue dos tipos de antígenos de G: 1) teñidos principalmente en
la membrana de células de forma normal, en particular utilizando MAb
neutralizante dirigido contra el sitio II (PV E12) y III (PV D1); y
2) teñidos tanto en el citoplasma como en la membrana de células de
forma redonda, en particular utilizando MAb (6A1), que reconoce la
molécula de G desnaturalizada.
La cinética de la expresión de proteína G se
estudió con la transfección de células con tres plásmidos
representativos: pGPV-PV (homogéneo),
pGEBL1-PV (quimérico) y pG-PVIII
(truncado). El pGPV-PV produjo antígenos de G en
aproximadamente 60% de células cuando se sometieron a tinción con PV
PAb, mientras que muy pocas células se tiñeron con PV 6A1 MAb en
cualquier punto de tiempo (figura 3a). Aproximadamente 55% de
células transfectadas con pGEBL1-PV se sometieron a
tinción con PV Pab, y hasta 15% con 6A1 MAb (figura 3b), indicando
que algunas moléculas de G estaban desnaturalizadas. De 10 a 20 por
ciento de células transfectadas con pG-PVIII
tuvieron forma redonda y se tiñeron con PV Pab, mientras que 5 a 10%
fueron positivas con 6A1 MAb, indicando que las moléculas de G
estaban desnaturalizadas (figura 3c).
Se evaluó la capacidad de los plásmidos
pGPV-PV, pG-PVIII,
pGEBL1-PV, pGMok-PV y
pGPV-Mok para inducir células que producen
IL-2, y los resultados se muestran en la figura 4.
Los plásmidos con la parte del sito III de PV, ya sea sin fusionar
(pG-PVIII) o con cualquier parte del sitio II de
lisavirus (pGPV-PV, pGEBL1-PV y
pGMok-PV), indujeron de manera eficiente células que
producen IL-2 (240 a 550 mU/ml). Esto fue cierto
incluso para pG-PVIII, que, sin embargo, tuvo
únicamente baja eficiencia tanto para la transfección celular (véase
lo anterior) como para la inducción de anticuerpos (véase a
continuación). Para los plásmidos quiméricos EBL1-PV
y Mok-PV, la respuesta de células T fue mayor
después de la estimulación con PV inactivada y purificada que con
los virus EBL-1 b o Mok. Este no fue debido a la
calidad de los antígenos purificados, porque la inmunización de los
ratones BALB/c con virus PV, EBL-1b, o Mok
inactivados y purificados, seguido de la estimulación in
vitro con el mismo antígeno, indujo niveles similares de
producción de IL-2 (PV: 250 mU/ml,
EBL-1b: 350 mU/ml y Mok: 400 mU/ml). Por el
contrario, el plásmido pGPV-Mok indujo únicamente
una respuesta celular Th débil (título de IL-2: 50
mU/ml), que fue producida de manera similar in vitro después
de la estimulación con virus PV o Mok inactivados y
purifica-
dos.
dos.
El plásmido pG-PVIII truncado no
indujo la producción de anticuerpos de la rabia, cuando se analizó
mediante RFFIT y ELISA. Sin embargo, cuando se inyectó
IL-2 junto con pG-PVIIII, y después
sólo 7 días después, se detectaron mediante ELISA anticuerpos el día
21 únicamente (no se muestran los datos). De este modo, la parte del
sitio III se expresó in vivo, e indujo una producción débil
de anticuerpos no neutralizantes, la cual se impulsó mediante
IL-2 exógena.
Por el contrario, cuando la parte del sitio III
de PV se enlazó con la parte del sitio II homóloga, como en
pGPV-PV, mostró fuerte inmunogenicidad. Una sola
inyección de plásmido pGPV-PV en ratones dio como
resultado niveles elevados de VNAb medidos 27 días más tarde, tanto
contra el virus PV como CVS homólogos y el virus
EBL-2b heterólogo (figura 5a). El isotipo de
anticuerpo inducido fue principalmente IgG 2a, pero también se
observó una respuesta débil de IgG 1 (no se muestran los datos). Sin
embargo, la correlación entre títulos de VNAb contra PV fue más
fuerte con IgG 2a (r=0,974) que con el título de IgG 1 (r=0,71),
indicando que el VNAb inducido por inmunización a base de ADN fue
principalmente IgG 2a. El título de VNAb contra los virus PV y CVS
homólogos aumentó cuando los ratones recibieron una inyección de
recuerdo en el día 30 y sus sueros de verificaron en el día 40, pero
no los títulos de VNAb contra el virus EBL-2b
heterólogo, que permaneció sin cambios (figura 5a). En estas
condiciones, también se demostró una relación entre el nivel de VNAb
inducido por pGPV-PV y la protección de ratones
contra una exposición i.c. con CVS: todos los animales con un título
de VNAb (en el día 20) por encima de 1,5 IU/ml sobrevivieron a la
exposición en el día 21 (no se muestra). Por el contrario, no se
produjo ninguna cantidad significativa de VNAb contra
EBL-1b después de una sola inyección o después de
una revacunación.
De este modo, se investigó la capacidad de la
parte del sitio III de PV para llevar la parte del sitio II de EBL1
heterólogo, siguiendo la observación previa de que el plásmido
quimérico pGMok-PV indujo VNAb contra los virus PV y
Mok. Una sola inyección del plásmido quimérico
pGEBL1-PV indujo de manera similar VNAb contra los
virus PV y EBL-1b (figura 5b). Catorce días después
de la inyección, los títulos fueron 2 IU/ml, y aumentaron hasta 17
IU/ml después de 80 días. El nivel de producción de VNAb contra
EBL-1b fue siempre más elevado que aquel contra PV,
pero la diferencia no fue significativa.
Tomados juntos, estos resultados demostraron
claramente que los genes de G quiméricos que codifican la parte del
sitio III de PV y la parte del sito II de G de otros lisavirus,
tales como EBL-1 b o Mok, son inductores muy
potentes de VNAb contra virus progenitores. Por el contrario, el
constructo de pGPV-Mok simétrico no induce VNAb
contra ninguno de los virus PV o Mok (no se muestra).
Se estudió la capacidad tanto del plásmido
pGPV-PV homogéneo como del plásmido
pGEBL1-PV quimérico para inducir la protección
contra una exposición i.c. con virus que representan genotipos de
lisavirus implicados en la transmisión de encefalomielitis en Europa
(CVS para GT1, EBL1b para GT5, y EBL2b para GT6). Se comparó su
eficiencia con la de una vacuna disponible comercialmente (cepa PM:
GT1) y una preparación de laboratorio (cepa PV: GT1) (figura 6).
La cadena plasmídica (pClneo) no indujo
protección contra ningún virus (figura 6d, e y f). Por el contrario,
pGPV-PV protegió al 70% de ratones BALB/c (y 85% de
Suizos) contra CVS (figura 6d), al 30% contra EBL1b (figura 6e), y
al 72% contra EBL2b (figura 6f). En las mismas condiciones,
pGEBL1-PV protegió al 60% de ratones BALB/c contra
CVS (figura 6d), al 75% contra EBL1b (figura 6e) y al 80% contra
EBL2b (figura 6f). De este modo, si la inmunización con cualquiera
de los dos plásmidos no mostró diferencia significativa en la
protección contra CVS (GT1) y EBL2b (GT6), el
pGEBL1-PV quimérico fue mucho más eficiente contra
EBL1b (GT5), y es claramente el mejor candidato para la protección
con inmunización a base de ADN contra los tres genotipos de
lisavirus Europeo.
En cuanto a la protección inducida por vacunas
de cultivo celular inactivado utilizando las cepas PM y PV contra
las mismas exposiciones: una dosis humana de vacuna de PM diluida
1/10 protegió al 80% de ratones contra CVS (figura 6a), al 36%
contra EBL1b (figura 6b), y al 80% contra EBL2b (figura 6c). En las
mismas condiciones, 2 \mug de PV IPRV protegió al 100% de ratones
tanto contra CVS (figura 6a) como contra EBL1b (figura 6b), y al 85%
contra EBL2b (figura 6c). Parece que para una dosis de vacuna que
protegió de 80 a 85% de los animales contra EBL2b, la cepa de PV
protegió al 100% y la cepa de PM únicamente al 36% contra EBL1b. De
este modo, la cepa de PM es menos efectiva que la cepa de PV contra
EBL1b.
Los plásmidos que contienen las secuencias
codificantes de antígeno extraño asociadas con los genes de G de
lisavirus truncado (pG-PVIII) o quimérico
(pGEBL1-PV) se estudiaron para determinar su
capacidad para transfectar de manera transitoria células Neuro 2a.
Excepto para
pG(B-CTL)_{2}-PVIII,
que indujo una tinción de IIF (en el citoplasma) únicamente después
de la permeabilización, todos los plásmidos indujeron la expresión
de antígenos relacionados con poliovirus y lisavirus en la membrana
celular de células no permeabilizadas, como se dio a conocer
previamente para los mismos plásmidos sin epítopos extraños.
Con fines ilustativos, en la figura 7 se dan los
resultados de la transfección obtenidos con
pGEBL1-(B-CTL)_{2}-PV. Se
evidenció la parte de G del virus de la rabia, reconocida por PV D1
MAb (figura 7A), y el inserto de poliovirus reconocido por el C3 MAb
(figura 7B) o el PAb anti poliovirus tipo 1 (figura 7C), mientras
que no se observó tinción con los mismos MAb y PAb en células
transfectadas con PClneo (figura 7D). Esto indica claramente que,
excepto para
pG(B-CTL)_{2}-PVIII,
la glicoproteína pGEBL1-PV quimérica permitió la
expresión del epítopo de células B de poliovirus, solo o en
asociación con el epítopo de células CTL de LCMV, en la membrana de
superficie celular bajo una forma nativa, mientras que se mantuvo la
expresión de G de lisavirus.
El gen de pGPVIII truncado se utilizó para
llevar y expresó los epítopos de célula B de C3 VP1 y de
CD8^{+}CTL de LCMV, en ratones después de la inmunización a base
de ADN.
Aunque el gen de pGPVIII indujo células que
producen IL-2 que pueden ser estimuladas in
vitro mediante IPRV 21 días después de la inyección, no se
observó producción después de 14 días (figura 8A). Sin embargo, se
observó una producción significativa con
pG(B-CTL)_{2}-GPVIII,
después de 14 días (figura 8A). Esto indica que la fusión de
epítopos extraños con GPVIII mejora de manera significativa la
producción de células Th dirigidas a la parte del sitio III de G de
la rabia.
Aunque pGPVIII no indujo anticuerpos antirabia
en ausencia de IL-2 exógena (figura 9), el estudio
cinético de anticuerpo inducido por
pG(B-CTI-)_{2}-GPVIII
mostró que la producción significativa de anticuerpo ocurrió tanto
contra G de la rabia como contra el péptido de poliovirus (figura
9). Esto también indica que la fusión de epítopos extraños con
GPVIII mejora de manera significativa la producción de anticuerpo
dirigido a la parte del sitio III de PV G de la rabia. Más aún, el
GPVIII truncado fue capaz de llevar y permitir la expresión de
epítopo de célula B de poliovirus in vivo con producción de
anticuerpos.
La producción de anticuerpos inducida por
p(B-CTL)_{2}-GPVIII
contra un péptido de poliovirus también se estudió después de cebar
con pGPVIII o con el propio
p(B-CTL)_{2}-GPVIII
(figura 10). Cuando se inyectó
p(B-CTL)_{2}-GPVIII
sin cebador, y se controló 13 días (PBS/
p(B-CTL)2-GPVIII
-D26-) o 39 días después
(p(B-CTL)2-GPVIII
-D0-), el título de anticuerpo antipeptídico fue de 65 y 80,
respectivamente. Sin embargo, si se realiza un cebado con pGPVIII o
p(B-CTL)_{2}-GPVIII,
el título fue de 200 y 600, respectivamente. Esto demuestra
claramente que los dos tipos de cebado mejoran la producción de
anticuerpos contra un péptido de poliovirus.
La inmunogenicidad tanto de epítopos celulares B
como CD8 T, y la consecuencia de su inserción en la inmunogenicidad
de la glicoproteína quimérica, se analizó de acuerdo con respuestas
inmunes humorales y mediadas por células, tras la inmunización a
base de ADN. Cuando se insertaron epítopos en el plásmido
pGEBL1-PV quimérico, la inducción de células
productoras de IL-2, capaces de ser estimuladas por
IPLV, dependió de los epítopos insertados. Se obtuvieron dos tipos
de resultados, y se muestran en la figura 8B: i) la producción de
IL-2 inducida por
pGEBL1-(B-CTL)_{2}-PV,
pGEBL1-(CTL-B)-PV, y
pGEBL1-(CTL)-PV fue similar a la inducida por
pGEBL1-PV; y ii) se inhibió la producción de
IL-2 inducida por
pGEBL1-(B-CTL)-PV (no se muestran
los datos) y pGEBL1-(B)-PV. En consecuencia, parece
que la G de EBL1-PV quimérica puede llevar epítopos
celulares B y CD8 T extraños sin efectos negativos en su capacidad
para inducir células productoras de IL-2. Sin
embargo, en lo que respecta al epítopo de células B, se observó un
efecto de posición debido a que su inserción inmediatamente detrás
de la secuencia de EBL1 fue perjudicial para la inducción de células
auxiliares T estimuladas por G de lisavirus. Sin embargo, este
fenómeno no se probó con
pGEBL1-(B-CTL)_{2}-PV.
La inserción de epítopos extraños en
pGEBL1-PV también se estudió para determinar su
consecuencia en la inducción de anticuerpos contra péptido de
poliovirus y VNAb tanto contra lisavirus de PV como de EBL1 (Tabla
1). Los cuatro plásmidos que contienen el epítopo de células B
(pGEBL1-(B)-PV,
pGEBL1-(CTL-B)-PV,
pGEBL1-(B-CTL)_{2}-
PV, y pGEBL1-(B-CTL)-PV) indujeron anticuerpo contra el péptido de poliovirus. Sin embargo, cuando el epítopo de células B siguió a la secuencia de EBL1 (pGEBL1-(B-CTL)-PV y pGEBL1-(B)-PV), la producción de anticuerpos fue más débil que cuando el epítopo de B se separó mediante el epítopo de células CD8 (pGEBL1-(CTL-B)-PV). Los resultados para pGEBL1-(B-CTL)_{2}-PV fueron intermedios. La inserción de epítopos extraños indujo una disminución de producción de VNAb anti-lisavirus, pero se mantuvo a un nivel elevado cuando los animales se inyectaron con pGEBL1-(CTL)-PV o pGEBL1-(CTL-B)-PV. Sin embargo, cuando el epítopo de células B se insertó inmediatamente detrás de la secuencia de EBL1, se observó una producción no tan grande de un VNAb anti-lisavirus.
PV, y pGEBL1-(B-CTL)-PV) indujeron anticuerpo contra el péptido de poliovirus. Sin embargo, cuando el epítopo de células B siguió a la secuencia de EBL1 (pGEBL1-(B-CTL)-PV y pGEBL1-(B)-PV), la producción de anticuerpos fue más débil que cuando el epítopo de B se separó mediante el epítopo de células CD8 (pGEBL1-(CTL-B)-PV). Los resultados para pGEBL1-(B-CTL)_{2}-PV fueron intermedios. La inserción de epítopos extraños indujo una disminución de producción de VNAb anti-lisavirus, pero se mantuvo a un nivel elevado cuando los animales se inyectaron con pGEBL1-(CTL)-PV o pGEBL1-(CTL-B)-PV. Sin embargo, cuando el epítopo de células B se insertó inmediatamente detrás de la secuencia de EBL1, se observó una producción no tan grande de un VNAb anti-lisavirus.
En resumen, la G de EBL1-PV
quimérica puede llevar y permitir la expresión in vivo de
epítopos de células B neutralizantes de poliuvirus y lisavirus, pero
la presencia del epítopo de célulsa B de poliuvirus, inmediatamente
detrás de la secuencia de EBL1 (excepto para inserción de
(B-CTL)_{2}), es perjudicial para la
inmunogenicidad tanto de la parte del sitio II como del sitio III de
la glicoproteína quimérica. Por otro lado, cuando los epítopos
extraños se fusionaron con la G de PVIII truncada, se puede inducir
tanto la producción de anticuerpos auxiliares T como no
neutralizantes.
Ya que el epítopo celular CD8 T está implicado
en la inducción de protección contra LCMV, se estudió la G truncada
y quimérica que lleva el epítopo celular CD8* T de LCMV, para
determinar su actividad protectora (Tabla 2). El
p(B-CTL)_{2}-GPVIII
truncado indujo únicamente una protección parcial. Cuando los
epítopos celulares B y CD8 T se insertaron en el
GEBL1-PV quimérico, se observó una protección
significativa con pGEBL1-(CTL-B)-PV
contra una exposición letal con LCMV (70% de ratones sobrevivieron).
En estas condiciones, los animales que sobrevivieron eliminan
completamente el virus cuando se controlaron mediante
RT-PCR 21 días después de la infección (no se
muestran los datos). Esto indica que la G quimérica es muy potente
para llevar un epítopo celular CD8 protector. Sin embargo, en cuanto
a las respuestas inmunes de anti-lisavirus y
poliovirus, la inserción del epítopo celular B de poliovirus
inmediatamente detrás de la secuencia de EBL1 indujo una inhibición
de la actividad protectora del siguiente epítopo celular CD8.
Debido a que se observó claramente un efecto de
posición perjudicial para la posición de la inserción del epítopo
celular B antes o después del epítopo celular CTL, se analizó la
presencia de secuencias PEST putativas en los diferentes plásmidos
(figura 1D). Únicamente dos plásmidos (pGEBL1-(B)-PV
y pGEBL1-(B-CTL)_{2}-PV)
contuvieron secuencias PEST putativas debido a la unión del extremo
de EBL1 y la secuencias del epítopo celular B. Sin embargo, la
sustitución de la serina (S) en
pGEBL1-(B-CTL)_{2}-PV por
una leucina (L) en pGEBL1-(B)-PV redujo el valor
PEST de +8,38 a +4,20.
Perros sabueso de 4 a 8 años se asignaron en
cuatro grupos experimentales (Tabla 3). Se mantuvieron en jaulas
aisladas, y se alimentaron con alimento comercial (400 g cada día).
Se inyectaron de manera intramuscular en la pata posterior con 100
\mug de plásmido (grupo A, B y C) o PBS (grupo D). El plásmido se
inyectó en un sitio en el día 0, 21, 42, y 175 (grupo A), o en el
día 0 y 175 (grupo C). También se inyectó en tres sitios (3x33
\mug) en el día 0, 21, 42, y 175 (grupo B). Las muestras de sangre
se recogieron (a partir de perforación de vena) en los días 0, 28,
49, 70, 120, 175, y 189.
Los anticuerpos neutralizantes de lisavirus se
titularon mediante prueba de inhibición de foco fluorescente rápida
(RFFIT), con las modificaciones descritas anteriormente de (28 de
los perros) utilizar virus PV, CVS o FWR) célula. Los títulos de
anticuerpos neutralizantes anti-PV, CVS o FWR se
expresan en unidades internacionales por ml (IU/ml) utilizando el
2nd International Standard (Statens Seruminstitut, Copenhague,
Dinamarca) como referencia, o como la dilución de suero recíproca
que inhibe 50% del foco fluorescente. En estas condiciones, un
título de 40, 70, o 60 (dilución de suero recíproca) fue equivalente
a 0,5 IU/ml contra PV, CVS o FWR, respectivamente.
Como se muestra en la figura 11, se puede
inducir un anticuerpo neutralizante de virus (VNAb) mediante el
plásmido que contiene el gen que codifica los grupos de proteína G
(A, B y D), mientras que no se detectó ningún anticuerpo en animales
inyectados con PBS (grupo D), cualquiera que sea el protocolo de
inyección. Los niveles más destacados de VNAb se obtuvieron después
de una inyección y una revacunación en el día 21 (grupo A), o en el
día 175 (grupo C). Conforme se produce la seroconversión para 0,5
IU/ml, se puede concluir que todo los animales se habían
seroconvertido. Más aún, de acuerdo con la bibliografía, se puede
concluir que todos los perros inyectados con plásmido están
protegidos contra un ataque de virus de rabia.
Estos resultados son representativos y la
dosificación se puede extrapolar a otros animales susceptibles a la
rabia, incluyendo seres humanos.
La malaria durante el primer embarazo provoca un
alto índice de muerte fetal y neonatal. La disminución de
susceptibilidad durante embarazos subsecuentes se correlaciona con
la adquisición de anticuerpos que bloquean la unión de glóbulos
rojos infectados a sulfato de condroitina A (CSA), un receptor para
parásitos en la placenta. De manera reciente, se ha identificado un
dominio dentro de una proteína 1 de membrana de eritrocito de
Plasmodium falciparum (PfEMP-1) que se une a CSA
(Buffet et al. P. falciparum domain mediating adhesion
to chondroitin sulfate A: A receptor for human placental infection
(1999) P.N.A.S. 96:12743-12748). Se
clonó un gen var que se expresa en glóbulos rojos parasitados de
unión a CSA (PRBCs). El gen tuvo 8 dominios de tipo receptor, y se
desmotró que el dominio
de tipo unión de Duffy (DBL), llamado DBL-3, une CSA y exhibe la misma especificidad de unión que PRBCs.
de tipo unión de Duffy (DBL), llamado DBL-3, une CSA y exhibe la misma especificidad de unión que PRBCs.
Puesto que los anticuerpos protectores presentes
después del embarazo bloquean la unión a CSA de parásitos de
diferentes partes del mundo, DBL-3, aunque variante,
puede inducir inmunidad reactiva cruzada que protegerá a mujeres
embarazadas y sus fetos. De este modo, el dominio
DBL-3 se vuelve un candidato como una vacuna para
mujeres embarazadas en África.
El dominio DBL-3 contiene un
número de cisteínas que parecen ser cruciales para el pliegue
correcto de la región de unión a CSA. Este pliegue no puede ser
lograble, muy probablemente, en sistemas de expresión bacteriana
(datos no publicados). Un enfoque importante para inducir
anticuerpos capaces de interferir con la unión a CSA de eritrocitos
infectados es aplicar una estrategia de vacuna de ADN utilizando el
dominio DBL-3 fusionado a la parte PV III de la
rabia. Se ha mostrado que la parte PVIII de la glicoproteína de la
rabia promueve función auxiliar eficiente.
\vskip1.000000\baselineskip
| Plásmido inyectado | Anticuerpo neutralizante | Anticuerpo antipéptido | |
| (U/ml) contra: | de poliovirus | ||
| Virus de la rabia | Lisavirus 1 de | (Dilución reciproca) | |
| murciélago Europeo | |||
| pGEBL1-(B-CTL)2-PV | 0,9 (0,05) | 1,1 (0,07) | 1100 (200) |
| pGEBL1-(CTL-B)-PV | 1,8 (0,2) | 8,0 (1,0) | 1510 (490) |
| pGEBL1-(B-CTL)-PV | 0,06 (0,06) | 0,6 (0,07) | 810 (210) |
| pGEBL1-(CTL)-PV | 2,6 (0,2) | 5,2 (0,2) | 0 (0) |
| pGEBL1-(B)-PV | 0,1 (0,01) | 0,21 (0,09) | 355 (45) |
| pGEBL1-PV | 5,9 (2,1) | 21,9 (1,8) | 0 (0) |
| pClneo | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) |
\vskip1.000000\baselineskip
La tabla 1 muestra la producción de anticuerpos
inducida por el plásmido pGEBL1-PV quimérico que
porta varios epítopos extraños. Los ratones BALB/c (tres para cada
plásmido) se inyectaron con 50 \mug de varios plásmidos en cada
músculo tibial. El suero se analizó en el día 21 para determinar el
anticuerpo neutralizante del virus EBL1 o de la rabia, mediante el
método de RFFIT (título expresado en IU/ml), y para determinar el
anticuerpo antipéptido de poliovirus mediante ELISA. Los resultados
se expresan como el título medio, y la desviación estándar se da en
paréntesis.
| Plásmido inyectado | Supervivencia de animales (%) |
| pClneo | 0/10 (0) |
| p(B-CTL)2-GPVIII | 2/5 (40) |
| pGEBL1-(B-CTL)-PV | 0/10 (0) |
| pGEBL1-(CTL-B)-PV | 7/10 (70) |
\vskip1.000000\baselineskip
La tabla 2 muestra la protección inducida por el
plásmido pGEBL1 quimérico que porta los epítopos CD8^{+} de LCMV.
Los ratones BALB/c (tres para cada plásmido) se inyectaron con 40
\mug de diversos plásmidos, y se expusieron i.c en el día 21. El
porcentaje de animales que sobrevivieron se da entre paréntesis.
\vskip1.000000\baselineskip
| Grupo | Número de perro | Sexo* | Edad | Inyección | ||
| (Años) | Producto | Número de | Día | |||
| inyectado | sitio | |||||
| A | 1 | M | 8 | Plásmido | 1 | 0, 21, 42 y 175 |
| 2 | F | 6 | Plásmido | 1 | 0, 21, 42 y 175 | |
| 3 | F | 6 | Plásmido | 1 | 0, 21, 42 y 175 | |
| B | 4 | F | 6 | Plásmido | 3 | 0, 21, 42 y 175 |
| 5 | M | 6 | Plásmido | 3 | 0, 21, 42 y 175 | |
| 6 | F | 8 | Plásmido | 3 | 0, 21, 42 y 175 | |
| C | 7 | M | 4 | plásmido | 1 | 0 y 175 |
| 8 | F | 7 | plásmido | 1 | 0 y 175 | |
| 9 | F | 4 | plásmido | 1 | 0 y 175 |
| Grupo | Número de perro | Sexo* | Edad | Inyección | ||
| (Años) | Producto | Número de | Día | |||
| inyectado | sitio | |||||
| D | 10** | M | 4 | PBS | 1 | 0, 21, 42 y 175 |
| 11 | M | 4 | PBS | 1 | 0, 21, 42 y 175 | |
| 12 | M | 4 | PBS | 1 | 0, 21, 42 y 175 | |
| \hskip0.1cm * M: macho; F: hembra | ||||||
| ** Descartado en el día 160 (enfermo) |
<110> Institut Pasteur
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Acidos nucléicos y polipéptidos de
lisavirus quimérico
\vskip0.400000\baselineskip
<130> d18780
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US60/129501
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-04-15
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Rabia
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttctagagcc accatggttc ctcaggctct cctg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Rabia
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgatcaac tgaccgggag ggc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebadores de adaptador sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebadores de adaptador sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211>54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebadores de adaptador sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatttcccaa tctacaccat cccggataaa atcggaccgt ggtcacctat tccg
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebadores de adaptador sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattcggaat aggtgaccac ggtccgattt tatccgggat ggtgtagatt ggga
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Rabia
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgtggtcac ctattgatat aaaccatctc agctgcccaa acaacttgat cgtggaagatgag
\hfill63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Rabia
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaattcgag caccattctg gagcttc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Proteína VP1 de poliovirus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> nucleoproteína de virus de
coriomeningitis linfocítica
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Ala Ser Gly Val Tyr Met Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> nucleoproteína de virus de
coriomeningitis linfocítica
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Arg Pro Gln Ala Ser Gly Val Tyr Met Gly
Asn Leu Thr Ala Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebadores de adaptador sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebadores de adaptador sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebadores de adaptador sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatttggata acccggcgtc gaccactaac aa
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebadores de adaptador sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattcttatc cttgttagtg gtcgacgccg gg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebadores de adaptador sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatttggata gacctcaggc ctctggtgtg tatatgggta atcttacggc ccag
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebadores de adaptador sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattctggga agtaagatta cccatataca caccagaggc ctgaggtctc tcca
\hfill54
Claims (9)
1. Molécula portadora que contiene una
secuencia polinucleotídica quimérica, en la que dicha secuencia
polinucleotídica quimérica comprende una secuencia que codifica una
parte de una glicoproteína que contiene al menos el sitio III de la
glicoproteína de lisavirus, y comprende además una secuencia que
codifica un antígeno heterólogo distinto de un antígeno de un
lisavirus.
2. Molécula portadora según la reivindicación
1, en la que dicha secuencia polinucleotídica quimérica comprende
además una secuencia que codifica un dominio transmembránico de una
proteína transmembránica.
3. Molécula portadora según la reivindicación
2, en la que dicha secuencia polinucleotídica quimérica comprende
además una secuencia que codifica un dominio citoplásmico de dicha
glicoproteína de dicho lisavirus.
4. Molécula portadora según las
reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha secuencia polinucleotídica
quimérica comprende una secuencia que codifica al menos la mitad C
términal de una glicoproteína de lisavirus.
5. Molécula portadora según la reivindicación
1, en la que dicha secuencia polinucleotídica quimérica comprende
además:
a) una secuencia que codifica una secuencia del
sitio II de una glicoproteína de un lisavirus;
b) un dominio transmembránico de una proteína
transmembránica; y
c) un dominio citoplásmico de una proteína
transmembránica.
6. Molécula portadora según las
reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho antígeno es un antígeno de
tumor.
7. Molécula portadora según las
reivindicaciones 2, 3 ó 5, en la que dicho dominio transmembránico
procede de un proteína distinta de una glicoproteína de
lisavirus.
8. Polipéptido codificado por la secuencia
polinucleotídica quimérica de la molécula portadora según las
reivindicaciones 1 a 7.
9. Composición inmunogénica que comprende la
molécula portadora de las reivindicaciones 1 a 7, o un polipéptido
según la reivindicación 8.
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