ES2267492T3

ES2267492T3 - Derivados de ciclosporina y procedimiento de preparacion de dichos derivados.

Info

Publication number: ES2267492T3
Application number: ES00901297T
Authority: ES
Inventors: Manfred Mutter; Roland M. Wenger; Jean-Francois Universite de Lausanne GUICHOU; Michael c/o A. Miller Imperial College KELLER; Thomas Universite de Lausanne RUCKLE; Torsten Woehr
Original assignee: Debiopharm SA
Current assignee: Debiopharm SA
Priority date: 1999-02-05
Filing date: 2000-02-07
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2020-02-07
Also published as: EP1150999B1; ATE330968T1; AU2125300A; US6790935B1; DE60028936T2; PT1150999E; DK1150999T3; EP1150999A1; WO2000046239A1; DE60028936D1; CY1105452T1

Abstract

Derivado de ciclosporina cuya cadena peptídica comprende al menos un resto de aminoácido no natural de fórmula general I siguiente: en la que X representa un oxígeno o un azufre; R representa un hidrógeno o un alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; R1 y R2 representan, independientemente uno del otro, un hidrógeno, un alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, un alquileno que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un arilo sustituido o no sustituido, un hetero-arilo sustituido o no sustituido, un resto de un polímero hidrosoluble enlazado eventualmente a un grupo espaciador.

Description

Derivados de ciclosporina y procedimiento de preparación de dichos derivados.

La presente invención se refiere a derivados de ciclosporina, comprendiendo la secuencia peptídica de dichos derivados al menos un aminoácido no natural de tipo seudoprolina. La invención se refiere asimismo a un procedimiento de preparación de dichos derivados.

Las ciclosporinas constituyen una familia de metabolitos secundarios obtenidos mediante fermentación. Estas sustancias poseen propiedades biológicas importantes, entre éstas se puede citar la inmunosupresión, la inducción de la proliferación de nervios en enfermedades neurodegenerativas o también la parada de la replicación del virus del VIH-1. Hoy en día, se han aislado una treintena de ciclosporinas de fuente natural. La más conocida, por su uso durante transplantes de órganos, es la ciclosporina A (CsA). Después, se encontró que esta misma ciclosporina A podía abrir nuevos caminos en el tratamiento del SIDA inhibiendo la activación de las células CD4+.

Las ciclosporinas están constituidas de una secuencia peptídica cíclica compleja de once aminoácidos, siendo algunos de éstos aminoácidos no naturales frecuentemente metilados sobre el nitrógeno. Estas sustancias presentan un fuerte carácter hidrófobo que hace complicado su administración en el seno de un medio fisiológico.

En la actualidad, sigue siendo necesario realizar modificaciones de estructura a fin de mejorar la actividad biológica y/o las propiedades físico-químicas de las ciclosporinas existentes, ya sean de origen natural o sintético.

Así, la solicitud de patente GB 2 205 317 describe análogos de la Ciclosporina A que contienen aminoácidos modificados en la posición 9 y que presentan actividades inmunosupresoras.

En Helvetica Chimica Acta, 1997, 80, 695-705, S. Y. Ko et al. describen una serie de análogos de la Ciclosporina A, y han estudiado los efectos de modificar los aminácidos en posiciones 4, 6, 7 y 8 sobre una actividad inmunosupresora.

La solicitud de patente EP 0 300 785 describe análogos de la Ciclosporina A en los que el aminoácido en posición 1 ha sido modificado y son utilizables como agentes inmunosupresores.

La solicitud de patente EP 0 034 567 describe un método de síntesis total de análogos de la Ciclosporina A.

Para ello, uno de los objetivos de la presente invención es hacer que estén disponibles derivados de ciclosporina de origen natural o sintético, derivados cuya especificidad farmacológica haya sido mejorada, preferentemente para favorecer la inhibición de la activación de las células CD4^{+} con el fin de detener la replicación del virus del VIH-1.

Otro de los objetivos de la presente invención es hacer que estén disponibles derivados de ciclosporina de origen natural o sintético, derivados cuyas propiedades físicas hayan sido modificadas con el fin de conferirles un determinado carácter hidrófilo a fin de aumentar su solubilidad en un medio fisiológico, y facilitar así su administración.

Así, la presente invención tiene por objeto derivados de ciclosporina de origen natural o de origen no natural, comprendiendo la cadena peptídica de dichos derivados al menos un resto de aminoácido no natural de fórmula general I siguiente:

1

en la que

X representa un oxígeno o un azufre;

R representa un hidrógeno o un alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, preferentemente un metilo;

R^{1} y R^{2} representan, independientemente uno del otro, un hidrógeno, un alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, un alquileno que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un arilo no sustituido, tal como fenilo, un arilo sustituido, tal como p-carbometoxi-fenilo o p-metoxi-fenilo, un hetero-arilo sustituido o no sustituido.

R^{1} y R^{2} pueden igualmente representar un resto de un polímero hidrosoluble enlazado eventualmente a un grupo espaciador. Ejemplos apropiados de tal polímero incluyen poli(óxidos de alquileno) (PAO) tales como los polietilenglicoles, poli(alcoholes vinílicos), polímeros a base de carbohidratos. Preferentemente, el polímero hidrosoluble es un poli(óxido de alquileno), tal como un polietilenglicol. El grupo espaciador puede ser un alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un arilo, tal como fenilo, un heteroarilo, llevando cada uno un grupo funcional que permite el anclaje al polímero. Cuando el polímero es un polietilenglicol, entonces el grupo espaciador preferido es p-carboxifenileno.

El nombre genérico de "seudoprolina" ha sido dado en la presente solicitud al aminoácido no natural de fórmula general I, y las abreviaturas Ser(\Psi^{R1,R2}pro), Thr(\Psi^{R1,R2}pro) o Cys(\Psi^{R1,R2}pro) indican que, en la fórmula general I, los símbolos (X, R) representan respectivamente (O, H), (O, Me) y (S, H), y que el aminoácido deriva respectivamente de serina, treonina o cisteína.

Preferentemente, los derivados de ciclosporina de la presente invención derivan de ciclosporinas, naturales o sintéticas, cuya cadena peptídica contiene al menos uno de los aminoácidos siguientes, con la configuración d ó 1: serina, treonina o cisteína. En la secuencia peptídica de los derivados de ciclosporina de la presente invención, al menos uno cualquiera de los aminoácidos serina, treonina o cisteína, con la configuración d o 1, de las ciclosporinas de referencia ha sido sustituido por el aminoácido no natural de fórmula general I.

En vista de la complejidad de la cadena peptídica de las ciclosporinas, cualquier modificación química de su estructura se hace rápidamente complicada. Por esta razón, se considera inapropiada una síntesis total.

Por lo tanto, otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento de preparación de estos derivados de ciclosporina que sea lo más simple posible utilizando productos, ciclosporinas y reactivos fácilmente accesibles.

Así, la presente invención tiene igualmente por objeto un procedimiento de preparación de los derivados de ciclosporina cuya cadena peptídica comprende al menos uno de los aminoácidos serina, treonina o cisterna, mediante N,O-acetalización de al menos uno de los tres aminoácidos anteriores, poniendo en contacto la ciclosporina con un compuesto de fórmula II siguiente:

2

en la que

Z_{1} y Z_{2} representan, independientemente uno del otro, halógeno, hidroxi, alcoxi, tiol; o

Z_{1} y Z_{2} representan juntos, oxígeno de un carbonilo o azufre de una tiona; y

R_{1} y R_{2} tienen la misma definición que la proporcionada anteriormente.

Preferentemente, el compuesto de fórmula II es un acetal o un tio-acetal.

Las propiedades, las ventajas de los derivados de ciclosporina de la presente invención, así como la manera de realizar el procedimiento de preparación de estos derivados aparecerán mediante los ejemplos de realizaciones presentados a continuación y mediante la ayuda de los dibujos en los que

- la Fig. 1 representa el esquema de síntesis de un derivado de ciclosporina;

- la Fig. 2 representa el esquema de síntesis de un intermedio de la preparación del derivado de la Fig. 1;

- la Fig. 3 representa los registros de cromatogramas de HPLC durante el transcurso de un ensayo de hidrólisis de un derivado de ciclosporina;

- la Fig. 4 es una curva que muestra la evolución a lo largo del tiempo de la concentración de los productos del mismo ensayo de hidrólisis; y

- la Fig. 5 representa una curva de cinética de inhibición de la actividad cis/trans isomerasa de la ciclofilina A de la glándula timo de ternero mediante un derivado de ciclosporina.

Tres ciclosporinas sirvieron de referencia para preparar los derivados según la invención. Dos de estas ciclosporinas son de origen natural. Son la ciclosporina A (CsA) y la ciclosporina C (CsC). La tercera ciclosporina, a saber la
[D-Ser^{8}]ciclosporina A, se obtiene mediante fermentación incorporando el aminoácido D-serina según el procedimiento descrito por Traber et al. en The Journal of Antibiotics, 1989.

Se realizaron dos series de ensayos según la naturaleza de los derivados de ciclosporina preparados. La primera serie de ensayos se dirigió hacia la modificación de las propiedades físicas de las ciclosporinas, confiriéndoles en particular un carácter hidrófilo. La segunda serie se enfocó en la mejora de sus propiedades biológicas.

A este respecto y según estudios de estructura-actividad bien establecidos, se sabe que la parte peptídica continua de la ciclosporina A constituida por los aminoácidos situados en posiciones 10 hasta 11, 1 hasta 3 (sistema de numeración cogiendo como posición 1 el aminoácido MeBmt), se enlaza a la ciclosporina (CyP), proteína que tiene una actividad peptidilprolil cis-trans isomerasa. Después, la parte peptídica libre se une a la calcineurina (Cn), y el complejo así formado [(CsA-CyP)-Cn] es responsable de la inmunosupresión inhibiendo la transcripción de los genes esenciales de las citoquinas. La ciclosporina C se diferencia, en cuanto a su estructura, de la ciclosporina A por el aminoácido en posición 2, a saber Ser en lugar de Abu. En cambio, su modo de acción es similar.

1. Preparación de los derivados de la ciclosporina A, a saber [5-L-Thr(\psi^{R1,R2}pro)]CsA de fórmula general III siguiente

3

En los derivados de la ciclosporina A de fórmula general III, la seudoprolina L-Thr(\psi^{R1,R2}pro) ocupa la posición 5, sustituyendo así a la valina de la ciclosporina A.

Para ello, el ciclo de la ciclosporina A se abre mediante ruptura del enlace peptídico 4-5. A su vez, se rompe el enlace peptídico 7-8. Después de etapas de protección y de activación, el dipéptido Fmoc-NMeLeu-L-Thr(\psi^{R1,R2}pro)-OH, preparado previamente, se une al aminoácido Ala en posición 7; después, el ciclo peptídico se vuelve a cerrar, llevando así a los derivados [5-L-Thr(\psi^{R1,R2}pro)]CsA de la ciclosporina A.

Los derivados de fórmula IIIa y IIIb se prepararon haciendo reaccionar el dipéptido Fmoc-NMeLeu-L-Thr(\psi^{R1,R2}
pro)-OH apropiado.

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Derivado	R_{1}	R_{2}
IIIa	H	MeO-PEG 750-NHCO-fenil-
IIIb	Me	Me

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El esquema de síntesis del derivado IIIa, así como el de uno de sus intermedios de síntesis, el dipéptido Fmoc-NMeLeu-L-Thr(\psi^{MeO-PEG750-NHCO-fenil-,H}pro)-OH, se presentan en detalle en las figuras 1 y 2. Parece que dicho procedimiento que utiliza la apertura de la ciclosporina A, la inserción de un péptido que contiene la seudoprolina apropiada, y después el cierre del ciclo, aunque conduzca a la obtención de los derivados de la presente invención, no puede, por el hecho de su complejidad, permitir la preparación de un gran número de derivados y a gran escala.

Se presentará a continuación un modo de realización del procedimiento de preparación de la presente invención de derivados de ciclosporina, utilizando, como ciclosporina de partida, ciclosporinas cuya cadena peptídica comprende al menos uno de los aminoácidos serina, treonina o cisteína.

En una sola etapa que utiliza una reacción de N,O-acetalización de al menos uno de los tres aminoácidos anteriores con la ayuda de un compuesto apropiado de fórmula II anterior, se obtiene un derivado de ciclosporina en el que la seudoprolina sustituyó uno de los aminoácidos serina, treonina o cisteína de la ciclosporina de partida.

2. Preparación de los derivados L-Thr(\psi^{R1,R2}pro)CsC de la ciclosporina C de fórmula general IV siguiente:

4

Los derivados IVa hasta IVh se prepararon según el procedimiento general siguiente.

Se lleva a reflujo una mezcla que comprende ciclosporina C (CsC) anhidra (50 mg, 41 \mumoles), el dimetilacetal R_{1}R_{2}C(OMe)_{2} (205 \mumoles, 5 eq.) y la sal de piridinio del ácido p-tolueno sulfónico (4,0 mg, 0,4 eq., PPTS) en tolueno anhidro (4 ml). Una vez que la reacción está terminada, la fase orgánica se lava mediante Na_{2}CO_{3} (10%, 2x5 ml), y agua (2x5 ml), y se seca sobre sulfato de magnesio. La fase orgánica se concentra a presión reducida para dar un aceite. El producto bruto se disuelve en 2 ml de una mezcla acetonitrilo/agua (1:1 v/v), y se purifica mediante HPLC de fase inversa (C_{18}, 60-100% B, 40 min.). La liofilización da un polvo blanco del derivado de ciclosporina C.

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Derivado	R_{1}	R_{2}	Tiempo de	Rend.	Masa (calc.)
			reacción (min.)	(%)	encontrada m/z
IVa	H	Ph-	45	74	(1306,7) 1306,7
IVb	H	Ph-Ph	30	89	(1382,8) 1383,8
IVc	H	CH_{2}=CH-	60	75	(1256,7) 1257,7
IVd	H	p-CO_{2}Me-Ph-	120	55	(1364,7) 1364,7
IVe	H	p-OMe-Ph-	60	90	(1336,2) 1337,2
IVf	H	p-AllOOC-Ph-	50	95	(1390,7) 1391
IVg	H	p-HOOC-PhCH(OMe)_{2}	50^{d}	75	(1350,7) 1351
IVh	H	PEG^{850}-CH-	240	20	(\approx1851) \approx1851^{e}

3. Preparación de los derivados D-Ser^{8}(\psi^{R1,R2}pro)CsA de la D-Ser^{8}-cilosporina A de fórmula general V siguiente:

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5

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Los derivados Va hasta Ve se prepararon según el procedimiento general siguiente.

Se calienta a 100ºC una mezcla que contiene la ciclosporina D-Ser^{8}-CsA (secada) (1 eq.), el dimetilacetal R_{1}R_{2}C(OCH_{3})_{2} (10 eq.), la PPTS (piridinio del ácido para-tolueno sulfónico) (0,4 eq.) y DMSO anhidro (0,016 M). El medio de reacción se vierte en 150 ml de AcOEt. La fase orgánica se lava sucesivamente con una disolución de NaHCO_{3} saturada (3 veces) y una disolución de NaCl saturada (1 vez), y después se seca sobre Na_{2}SO_{4} y se concentra. El producto bruto se purifica mediante cromatografía sobre gel de sílice (Acetona/hexano 4/6), para dar un polvo
blanco.

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Derivado	R_{1}	R_{2}	Tiempo de	Rend. en	Rf (Acetona/H	HPLC en	Masa ESI-MS
			reacción	%	exano) (4/6)	minutos
Va	CH_{3}	CH_{3}	3 h	58	0,25	17,98	1244/1276/1293
Vb	-CH_{2}OAc	H	30 h	74	0,32	18,65	1334/1351
Vc	-(CH_{2})-NH-Fmoc	H	2 h	70	0,25	17,96	1509/1526
Vd	-Ph	H	3 h	72	0,50	19,16	1306/1323/1328
Ve	-p-Ph-CH_{2}-NH-	H	20 min.	67	0,54	19,42	1419/1436
	Aloc

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4. Propiedades físicas de los derivados de ciclosporina de la presente invención 4.1. Obtención de profármacos

Se descubrió, de manera sorprendente, que la introducción de una seudoprolina en el seno de la cadena de una ciclosporina permitía obtener un profármaco de esta misma ciclosporina.

En efecto, la estabilidad química de los derivados de la presente invención frente, en particular, a condiciones de hidrólisis ácida, se estudió como función de la naturaleza de los grupos portados en posición para del núcleo fenilo que constituye los sustituyentes R_{1} o R_{2}. Grupos electro-atractores estabilizan el ciclo oxazolidina de la seudoprolina. Sin embargo, grupos electrodonantes tal como el grupo metoxi, hace a la seudoprolina muy sensible a los entornos ácidos y, mediante reacción reversible, el ciclo oxazolidina se abre, liberando así la serina o la treonina de la ciclosporina de partida.

Por ejemplo, el derivado IVd, obtenido a partir de la ciclosporina C, se sometió a condiciones fisiológicas tales como aquellas encontradas en el aparato digestivo (pH 1, THF/HCl). Como se ha representado en las figuras 3 y 4, en 300 horas, la ciclosporina se reconstituyó totalmente.

4.2. Obtención de derivados hidrófilos

El enganche de un polímero altamente hidrosoluble tal como puede ser el polietilenglicol en los derivados IIIb y IVh suprimió el carácter hidrófobo de las ciclosporinas de partida, respectivamente las ciclosporinas A y C.

5. Actividades biológicas de los derivados de ciclosporina de la presente invención, efecto inhibidor frente a la ciclofilina A de la glándula timo del ternero

El ensayo de unión descrito por Fisher et al. en Biomed. Biochim. Acta, 1984, para las cis/trans isomerasas se aplicó a la ciclofilina de la glándula timo del ternero (3,8 nm), tomando como referencia la unión de la ciclosporina A. Las relaciones IC_{50}/IC_{50CSA} se reúnen en la tabla siguiente.

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Derivados	IIIb	IVa	IVb	IVc	IVd	IVe	IVf	IVg	IVh
IC_{50}/IC_{50CSA}	3,2	6	5,8	5,3	7,8	15,4	4	24,1	21,5

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La curva de inhibición de la actividad cis/trans isomerasa de la ciclofilina A mediante el derivado IVb se representa en la figura 5.

De manera sorprendente, a pesar de las modificaciones importantes, por ejemplo modificaciones estéricas o la fijación de la configuración de los enlaces peptídicos, que resulta de la introducción de una seudoprolina en la parte peptídica de las ciclosporinas A o C que se supone que se unen a la ciclofilina, no se constató pérdidas importantes de actividad para la mayoría de los derivados, en particular para los derivados IIb, IVa-d y IVf. Igualmente, se observa que derivados tales como el derivado IVb cuya seudoprolina porta un sustituyente bifenílico con carácter altamente hidrófobo, inhibe de forma relativamente fuerte la ciclofilina.

Tal como se puede observar, los derivados de ciclosporina según la presente invención poseen propiedades muy interesantes.

La introducción de una seudoprolina que presenta sustituyentes apropiados permite, en particular, uno o varios de los efectos siguientes:

-: mejorar las propiedades farmacocinéticas de ciclosporinas mediante solubilización en un medio fisiológico;

-: obtener profármacos de ciclosporinas;

-: introducir grupos reactivos que permiten la reticulación o el marcado;

-: modular la conformación peptídica de las ciclosporinas por el hecho de las restricciones estéricas debidas al ciclo de cinco cadenas lo que conduce a modular la actividad biológica de las ciclosporinas.

Claims

1. Derivado de ciclosporina cuya cadena peptídica comprende al menos un resto de aminoácido no natural de fórmula general I siguiente:

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en la que

X representa un oxígeno o un azufre;

R representa un hidrógeno o un alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono;

R^{1} y R^{2} representan, independientemente uno del otro, un hidrógeno, un alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, un alquileno que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un arilo sustituido o no sustituido, un hetero-arilo sustituido o no sustituido, un resto de un polímero hidrosoluble enlazado eventualmente a un grupo espaciador.

2. Derivado según la reivindicación 1, caracterizado porque, en el aminoácido de fórmula general I, R representa un hidrógeno o un metilo.

3. Derivado según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque deriva de una ciclosporina cuya cadena peptídica contiene al menos uno de los aminoácidos seleccionados de entre serina, treonina o cisteína, con una configuración d o l.

4. Derivado según la reivindicación 3, caracterizado porque al menos uno cualquiera de los aminoácidos serina, treonina o cisteína de la ciclosporina de referencia está sustituido por el aminoácido de fórmula general I.

5. Procedimiento de preparación de los derivados según la reivindicación 4, que comprende una reacción de N,O-acetalización de al menos uno de los tres aminoácidos serina, treonina o cisteína, poniendo en contacto la ciclosporina de referencia con un compuesto de fórmula II siguiente:

7

en la que

R_{1} y R_{2} tienen la misma definición que aquella dada anteriormente.