ES2267037T3

ES2267037T3 - Ligamento protesico biomimetico y procedimiento de obtencion.

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Publication number: ES2267037T3
Application number: ES04703194T
Authority: ES
Inventors: Bernard Brulez; Jacques-Philippe Laboureau; Veronique Migonney; Mihaela Ciobanu; Graciela Pavon-Djavid; Alain Siove
Original assignee: L A R S LABORATOIRE D APPLIC E; Lars - Laboratoire D'application Et De Recherche Scientifique
Current assignee: L A R S LABORATOIRE D APPLIC E; Lars - Laboratoire D'application Et De Recherche Scientifique
Priority date: 2003-01-17
Filing date: 2004-01-19
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2024-01-19
Also published as: DE602004001221T2; RU2005126409A; US7700147B2; FR2850026A1; EP1599238B1; ATE329631T1; CA2513359A1; CN1777450A; US20060136057A1; CN100352518C; FR2850026B1; CA2513359C; RU2339407C2; WO2004067051A1; EP1599238A1; DE602004001221D1

Abstract

Procedimiento de tratamiento de prótesis artificiales de poliéster, y particularmente de tereftalato de polietileno, con el fin de conferirles la capacidad de mimetizar los materiales vivos, y especialmente de facilitar el anclaje y el desarrollo de los fibroblastos tras la implantación de dichas prótesis, caracterizado dicho procedimiento de funcionalización biomimética porque comprende una primera etapa de preparación de la superficie de poliéster en medio disolvente, seguida de una etapa de injerto de polímeros o de copolímeros biológicamente activos en la superficie de poliéster de dichas prótesis, etapa de injerto que consiste en realizar una peroxidación de la superficie por ozonización, seguida de una polimerización radicalaria de una disolución de al menos un monómero.

Description

Ligamento protésico biomimético y procedimiento de obtención.

La presente invención concierne a un ligamento prótesico biomimético, así como a su procedimiento de obtención.

Los ligamentos artificiales para la sustitución de ligamentos articulares biológicos, y particularmente los de la rodilla, son en algunos casos específicos preferidos a las técnicas de sutura directa o de reconstitución mediante un injerto autógeno. En efecto, la calidad de estos ligamentos, tanto desde el punto de vista mecánico como de biocompatibilidad, ha mejorado considerablemente en los últimos veinte años.

Así, por ejemplo, a través de la patente francesa FR-96.14263 se conoce un ligamento prótesico de tereftalato de polietileno (PET) denominado de "fibras orientadas". Este ligamento está constituido por una tira enrollada o plegada sobre ella misma, tira que comprende dos extremos intraóseos y una parte intermedia intraarticular constituida por una madeja de hilos de tejido activos longitudinales, adyacentes y no unidos entre sí transversalmente. Al implantar el ligamento se aplica una torsión longitudinal sobre cada hilo activo, dando lugar a un ligamento dextrógiro o levógiro que reproduce la torsión natural de los ligamentos flexionados. Este tipo de ligamentos de PET, material cuya biocompatibilidad es bien conocida, presenta una resistencia extremadamente elevada ante los esfuerzos de tracción, flexión y torsión, dejando asumir una esperanza de vida superior a la de los ligamentos conocidos.

No obstante, a pesar de los enormes progresos desde el punto de vista biomecánico, todavía se producen en los pacientes roturas de estos ligamentos artificiales. Estudios realizados sobre las causas de estos fracasos han puesto en evidencia una mala respuesta de los fibroblastos tras el implante. En efecto, la distribución de estas células no es homogénea en la superficie del ligamento, los fibroblastos no se desarrollan en las zonas protésicas intraóseas y se agrupan en cúmulos sobre las fibras en la zona intraarticular. Además, estos fibroblastos presentan una morfología redondeada anormal, con pocos puntos de anclaje a la superficie del ligamento. La secreción de colágeno por parte de estas células es, de hecho, desordenada, e implica una individualización de las fibras de la zona intraarticular, con una acumulación de los tejidos fibrosos entre la cubierta de la parte central de las prótesis, contribuyendo así a su fracaso.

Frente a este problema de asegurar una buena "reocupación" fibroblástica de las prótesis, la patente FR 2.651.994 propone impregnar el ligamento protésico con colágeno, estando orientadas las fibras de colágeno según el eje longitudinal del ligamento con objeto de obtener una buena dirección para su "reocupación" por un tejido conjuntivo vivo. Además de una eficacia limitada y poco satisfactoria, esta solución tiene como principal inconveniente la dependencia de la calidad, difícilmente reproducible del colágeno utilizado.

La presente invención pretende por tanto remediar estos problemas proponiendo un procedimiento de funcionalización biomimética de los ligamentos, particularmente, procedimiento que les confiere particularmente la capacidad de mimetizar los materiales vivos con el fin de mejorar su integración biológica.

A este respecto y según la invención, se propone un procedimiento de funcionalización biomimética de prótesis de poliéster, y particularmente de tereftalato de polietileno (PET) apreciable porque comprende una primera etapa de preparación de la superficie de poliéster en un medio disolvente y una segunda etapa de injerto de polímeros o copolímeros biológicamente activos en la superficie del poliéster de dichas prótesis, etapa de injerto que consiste en realizar una peroxidación de la superficie mediante una ozonización, seguida de una etapa de polimerización radicalaria de una disolución de al menos un monómero. Se apreciará que por prótesis de poliéster se entiende cualquier prótesis constituida por fibras de PET o de un derivado de poliéster con las características convenientes para su utilización en ligamentos, así como cualquier prótesis que presente en su superficie o la de sus fibras una capa de poliéster, y particularmente de PET.

Se comprende que, al crear en la superficie de un ligamento fabricado según la patente FR-96.14263 mencionada anteriormente, un "recubrimiento" de polímeros biológicamente activos, se modifican sus propiedades de adherencia y de proliferación celular, haciéndolas favorables para una reocupación fibroblástica normal y homogénea, según muestran los resultados de los cultivos celulares obtenidos.

Se pueden mejorar estas propiedades procediendo, en la etapa de preparación de la superficie de poliéster, en medio disolvente solamente o en medio disolvente y después en medio acuoso, que precede a la etapa de injerto.

Estas dos variantes de esta etapa de preparación contribuyen considerablemente a mejorar la eficacia de la etapa de injerto, aumentando la calidad de la superficie injertada, así como la cantidad de (co)polímeros injertados. Juegan igualmente un papel no despreciable en el carácter biocompatible del ligamento así tratado.

Otras ventajas y características se harán más evidentes a partir de la descripción que sigue de la variante de ejecución completa, dada como ejemplo no limitativo, del procedimiento de funcionalización según la invención.

El procedimiento según la invención se aplica aquí a prótesis de ligamentos ya formadas o incluso a tramas de tejido de poliéster que intervienen en la fabricación de dichas prótesis; el procedimiento se divide en las siguientes etapas:

Etapa 1

Preparación de la superficie de poliéster 1A) En medio disolvente

Esta etapa denominada de desensimado es necesaria con el fin de eliminar las grasas y las impurezas incorporadas durante la fabricación de la trama de poliéster que sirve de estructura al ligamento. También permite evitar reacciones patológicas de tipo sinovitis aguda tras del implante en el paciente. Además, esta etapa permite asegurar un crecimiento de los fibroblastos sobre una superficie de poliéster ya limpia, crecimiento no observado en superficies no limpias.

Se distinguen dos variantes de esta preparación en medio disolvente, según la naturaleza del disolvente elegido.

Variante 1

Desensimado sin hinchamiento de la superficie

Se aplica un mínimo de 12 ciclos de extracción en un aparato de SOHXLET y un control de los residuos de cuerpos grasos después del 12º ciclo de limpieza con hexano. A continuación de estos ciclos de limpieza con hexano se realizan unos ciclos de lavado con éter etílico (RPE), un mínimo de tres lavados, con un control de los residuos después del tercer lavado

Variante 2

Desensimado con un disolvente apto para hinchar la superficie de poliéster

La utilización de un disolvente apto para hinchar la superficie del poliéster ofrece la ventaja de mejorar el injerto aumentando el número de peróxidos sobre la superficie tratada durante la etapa de ozonación.

Dicho disolvente tiene como característica tener una constante dieléctrica superior a 30. Preferiblemente, este disolvente es del tipo éter cíclico o alifático. Además, se elegirá de entre los siguientes grupos de disolventes: tetrahidrofurano (THF), dimetilsulfóxido (DMSO), N,N-dimetilformamida (DMF), N,N-dimetilacetamida (DMA), N-metilpirrolidona (NMP). Estos disolventes tienen la ventaja de presentar una toxicidad baja o nula, y permiten así una utilización fácil en el medio industrial.

El tratamiento se realiza mediante inmersión de las piezas de poliéster en el disolvente durante una duración del orden de 5 minutos a una hora aproximadamente, preferiblemente de 10 a 25 minutos. Así, como ejemplo, se elegirá una duración de 15 minutos a temperatura ambiente para una inmersión en tetrahidrofurano (THF).

1B) En medio acuoso

El objeto de esta etapa opcional de preparación de la superficie en medio acuoso es eliminar los residuos de la fabricación del poliéster presentes en su superficie, tales como ácidos orgánicos de bajo peso molecular como, por ejemplo, el ácido tereftálico para el PET. Se obtiene así una superficie perfectamente preparada para la ozonación.

El tratamiento consiste en lavar las piezas de poliéster en una disolución de carbonato sódico (Na_{2}CO_{3}) al 5% en peso en agua destilada. Estos lavados se efectúan en caliente, es decir, a más de 60ºC y menos de 120°C, y preferiblemente con una ligera ebullición, es decir, 100°C \pm 5°C, durante una decena de minutos. Por supuesto, puede utilizarse cualquier otro carbonato alcalino o alcalinotérreo tal como K_{2}CO_{3} ó CaCO_{3}. El lavado es seguido por aclarados sucesivos con agua destilada hasta que el pH del agua de aclarado sea de 7.

1C) Limpieza

Cualesquiera que sean las etapas efectuadas anteriormente (variante 1 ó 2 de la etapa 1A, y después la etapa 1B, o solamente la etapa 1A), el producto de poliéster se limpia a continuación, por ejemplo, mediante un aclarado con etanol absoluto o con tetrahidrofurano (THF), seguido de un secado en estufa con una duración de 30 minutos, por ejemplo.

Etapa 2

Injerto de polímeros o de copolímeros biológicamente activos sobre la superficie de poliéster 2A) Elección y preparación de los monómeros

Los monómeros utilizados según la invención son monómeros susceptibles de polimerización y de copolimerización radicalaria que dan lugar a polímeros biocompatibles que estimulan la proliferación y la diferenciación celular, y más particularmente la de los fibroblastos. Dichos monómeros que contienen grupos carboxilato, fosfato, sulfonato y sulfato se describen en, por ejemplo, la patente US 6.365.692 y pueden ser utilizados según la invención solos o mezclados. Se preferirá utilizar ácido metacrílico y sulfonato de estireno, así como sus mezclas. Antes de utilizarlos para la polimerización, estos monómeros serán previamente purificados. Así, por ejemplo, para el estirensulfonato sódico, se purifica mediante recristalización en una mezcla de agua bidestilada/alcohol (10/90, v:v), y después se disuelve a 70ºC en esta disolución. A continuación se filtra al vacío con un disco de vidrio sinterizado con un índice de porosidad de 5 y se conserva a 4°C. Los cristales de sulfonato sódico formados se recuperan por filtración, y el sólido obtenido se seca al vacío a 50°C hasta la obtención de un peso constante.

2B) Ozonización

Las prótesis o las tramas de poliéster constitutivas de estas prótesis tratadas previamente según la etapa 1 son introducidas en un dispositivo de ozonización, tal como el que se utiliza clásicamente.

Por ejemplo, se podrá utilizar un reactor tubular de 500 cm^{3} que contenga 100 cm^{3} de agua bidestilada, reactor que está provisto de un tubo de inmersión de alimentación de ozono. Se podrá utilizar, por ejemplo, un flujo gaseoso equivalente de ozono a 50 g/m^{3} de oxígeno. Para esta cantidad de ozono, la duración óptima de la ozonización del PET es de 20 a 90 minutos. Las medidas de la tasa de peróxido demuestran que la tasa óptima se obtiene entre 30 y 60 minutos de ozonización, siempre para este mismo flujo de ozono. Igualmente se mencionará que una duración de la ozonización superior a 90 minutos degrada fuertemente la superficie del PET.

Adicionalmente, destacaremos la aportación de la variante 2 de la etapa 1A. En efecto, la utilización de un disolvente apto para hinchar la superficie aumenta la tasa de peróxido en un factor de 5, con respecto a la utilización de un disolvente sin hinchamiento. Una vez finalizada la ozonización, las prótesis o las tramas de poliéster introducidas en el dispositivo de ozonización se aclaran y se limpian, por ejemplo, según el protocolo siguiente: aclarar tres veces con agua bidestilada, después tres veces con alcohol absoluto, después tres veces con tetrahidrofurano (THF). A continuación, secar en la estufa al vacío durante 30 minutos a 25°C.

2C) Polimerización

El o los monómeros elegidos y preparados según la etapa 2A se disuelven en agua, preferiblemente bidestilada. Se puede elegir cualquier concentración compatible con la puesta en práctica de la reacción de polimerización radicalaria con un mínimo del 5% en peso. Ventajosamente se elegirán concentraciones cercanas a la solubilidad límite del o de los monómero(s) en la disolución, con un medio viscoso que favorece así las reacciones de propagación polimérica radicalaria con respecto a las reacciones de terminación: se obtienen así cadenas poliméricas injertadas de un tamaño más grande. Esto se corresponde con la elección de una concentración ponderal k = s - \varepsilon, en la que s es la solubilidad limite y \varepsilon tiene un valor del 1 al 7% en peso. Así, por ejemplo, en el caso del sulfonato de poliestireno, cuyo límite de solubilidad es del 20% en peso, se elegirá una concentración del 15%.

La duración de la etapa de polimerización depende de la naturaleza del monómero. Se estima como el tiempo necesario para la gelificación del medio a la temperatura de reacción. Así, por ejemplo, nos quedaremos con que para el sulfonato de poliestireno, a 70°C, la polimerización durará 1 hora, y que a 65°C, durará 1 hora 30.

La reacción de polimerización se realiza en un recinto cerrado herméticamente y desprovisto de oxígeno, por ejemplo, realizando un burbujeo con argón. En este recinto se introduce la disolución de monómeros o de comonómeros que se quieren hacer reaccionar, y las prótesis o bandas de tejido de poliéster previamente ozonizadas. El recipiente herméticamente cerrado se calienta al baño María a la temperatura y con la duración determinadas según se explicó anteriormente.

Al finalizar la reacción, los elementos de poliéster que han sido injertados son extraídos del reactor. A continuación se pueden lavar estos materiales injertados con el fin de eliminar, particularmente, el (los) residuo(s) de monóme-
ro(s) que no ha(n) reaccionado. Por ejemplo, se puede lavar la superficie funcionalizada varias veces con un disolvente adecuado del o de los monómero(s), con agua bidestilada por ejemplo, y opcionalmente se puede finalizar el lavado con cualquier disolvente adecuado, etanol absoluto por ejemplo, con el fin de eliminar los eventuales restos de polímeros no injertados.

Etapa 3

Impregnación con agentes bioquímicos

Esta etapa es opcional. Pretende reforzar la capacidad de integración biológica del ligamento en el que anteriormente se han injertado los polímeros biomiméticos según se expuso en las etapas 1 y 2. Así, la impregnación de la prótesis con uno o varios agentes bioquímicos pretende aumentar sus propiedades de adherencia y de proliferación celular. Estos agentes bioquímicos que favorecen la colonización por parte de los fibroblastos son una proteína de la familia de las fibronectinas y/o del colágeno de tipo I y/o III. Ventajosamente se utilizará una mezcla de las proteínas anteriores, es decir, una mezcla de fibronectinas y colágenos de tipo I y/o III: se observa un efecto sinérgico sobre la adherencia de los fibroblastos. La impregnación de la prótesis por estos agentes podrá realizarse, por ejemplo, mediante remojo en un baño que contiene colágeno.

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Ni que decir tiene que esta etapa de impregnación no es necesariamente la etapa de injerto, y que puede insertarse e intercalarse entre otras etapas de la preparación del ligamento en función de su estadio de fabricación. Además, ventajosamente, esta etapa de impregnación vendrá seguida por una etapa de esterilización del ligamento.

Con el fin de medir la eficacia del procedimiento recientemente descrito, se han realizado ensayos comparativos sobre porciones de tejidos en fibras de PET tricotadas, siendo el poliéster semicristalino, con una tasa de cristalinidad del 40% C = 5%, y con una temperatura de fusión cercana a los 260°C \pm 5°C. Estos tejidos de fibra están constituidos por ligamentos artificiales tales como los fabricados y comercializados por el demandante. También se han preparado fibras de PET de blanco no injertadas y dos tipos de fibras de PET injertadas con poli(estirensulfonato sódico) e injertadas igualmente con una mezcla equiponderal de ácido metacrílico (AM) y de estirensulfonato sódico (SSNa). En la tabla 1 se encuentran las diferentes condiciones de preparación.

TABLA 1 Preparación de las muestras

	Preparación de la superficie	Ozonización	Injerto
Fibras PET no	Hexano y éter etílico: Na_{2}CO_{3}	-	-
injertadas	al 5%
Fibras PET	THF: 15 min; Na_{2}CO_{3} al 5%	60 min a 50 g de O_{3}/m^{3} de O_{2}	Disolución de SSNa al
injertadas (1)		50 g de O_{3}/m^{3} de O_{2}	15% en peso; 1h 30
			a en peso; 1h 30 a 65ºC
Fibras PET	THF: 15 min; Na_{2}CO_{3} al 5%	60 min a 50 g de O_{3}/m^{3} de O_{2}	Disolución del 15% de
injertadas (2)			SSNa y 15% de AM
			(en peso); 1h 30 a 65ºC

A continuación se ha procedido a las diferentes pruebas de evaluación biológica, y particularmente a cultivos de fibroblastos y de adherencia de fibroblastos sobre estas diferentes superficies, y los resultados obtenidos figuran en la tabla, a continuación:

TABLA 2 Evaluación biológica

Parámetros	PET no injertado	PET injertado (1) y (2)
Número de células en confluencia	1 x 10^{5} células/pocillo	1 x 10^{5} células/pocillo
(cultivo en placas de 24 pocillos)
Desarrollo de los fibroblastos	Reparto en cúmulos no homogéneos	Reparto homogéneo por toda la
	a lo largo de las fibras	superficie del tejido
Morfología	Forma redondeada	Forma alargada y extendida
Fuerza de adherencia (unidad relativa)	1	5-8
Adsorción del colágeno de tipo I	100	143
(proporciones relativas en ng/cm^{2})

Se observa por tanto que el injerto de polímeros biomiméticos, y en particular de sulfonato de estireno, en la superficie de ligamentos de poliéster permite un desarrollo normal y homogéneo de los fibroblastos sobre esta superficie.

Destacaremos además que la superficie tratada presenta una afinidad más elevada frente a las proteínas que permite tener una mejor adsorción del colágeno y de otros factores bioquímicos, lo que favorecen la colonización por parte de los fibroblastos. Se entiende por tanto que los ligamentos, cuya superficie habrá sido tratada según las etapas 1 y 2 del procedimiento, y en las que a continuación se hace pasar por la etapa 3 de impregnación por dichos factores bioquímicos, verán aún sus capacidades para hacer adherirse a los fibroblastos y para orientar correctamente su desarrollo, particularmente mejoradas.

Finalmente, ni que decir tiene que el procedimiento de funcionalización biomimética según la invención puede aplicarse sobre cualquier tipo de prótesis de poliéster para la que se quiera mejorar la integración biológica, y que los ejemplos recientemente ofrecidos sólo son ilustraciones particulares, y en ningún caso limitativos de los ámbitos de aplicación de la invención.

Claims

1. Procedimiento de tratamiento de prótesis artificiales de poliéster, y particularmente de tereftalato de polietileno, con el fin de conferirles la capacidad de mimetizar los materiales vivos, y especialmente de facilitar el anclaje y el desarrollo de los fibroblastos tras la implantación de dichas prótesis, caracterizado dicho procedimiento de funcionalización biomimética porque comprende una primera etapa de preparación de la superficie de poliéster en medio disolvente, seguida de una etapa de injerto de polímeros o de copolímeros biológicamente activos en la superficie de poliéster de dichas prótesis, etapa de injerto que consiste en realizar una peroxidación de la superficie por ozonización, seguida de una polimerización radicalaria de una disolución de al menos un monómero.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque el tereftalato de polietileno es semicristalino.

3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 caracterizado porque la duración de la ozonización, para un contenido en ozono del orden de 50 g/cm^{3}, está comprendida entre 20 y 90 min.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque el monómero es estirensulfonato sódico.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque la disolución de monómeros tiene una concentración de monómero(s) comprendida entre el 5% y k%, en la que k es una concentración próxima a la solubilidad límite del o de los monómero(s) en la disolución.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque la primera etapa de la preparación de la superficie del poliéster en el medio disolvente está seguida por una etapa complementaria de preparación en un medio acuoso antes de proceder al injerto.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque el medio disolvente está constituido por hexano y éter etílico.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque el medio disolvente está constituido por al menos un disolvente apto para modificar la superficie mediante hinchamiento.

9. Procedimiento según la reivindicación 8 caracterizado porque que el disolvente apto para modificar la superficie mediante hinchamiento es del tipo éter cíclico o alifático con una toxicidad baja o nula.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9 caracterizado porque el disolvente apto para modificar la superficie mediante hinchamiento tiene una constante dieléctrica superior a 30.

11. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8, 9 ó 10 caracterizado porque el disolvente apto para modificar la superficie mediante hinchamiento se elige de entre los siguientes grupos de disolventes: tetrahidrofurano (THF), dimetilsulfóxido (DMSO), N,N-dimetilformamida (DMF), N,N-dimetilacetamida (DMA), N-metilpirrolidona (NMP).

12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 caracterizado porque la etapa de preparación de la superficie en medio acuoso consiste en tratar la superficie de poliéster en caliente con una disolución acuosa de sales de carbonatos alcalinos o alcalinotérreos, como por ejemplo, Na_{2}CO_{3} ó CaCO_{3}, con el fin de eliminar los residuos de fabricación del poliéster presentes en su superficie.

13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque comprende una etapa complementaria de impregnación de la prótesis tras la etapa de injerto con uno o varios agentes bioquímicos que favorecen la colonización por parte de los fibroblastos.

14. Procedimiento según la reivindicación 13 caracterizado porque el agente bioquímico es una proteína de la familia de las fibronectinas y/o del colágeno de tipo I y/o III.

15. Ligamento artificial de fibras tejidas o tricotadas de PET caracterizado porque dichas fibras se tratan según el procedimiento conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.