ES2264697T3 - Variantes de cd154 y sus usos. - Google Patents
Variantes de cd154 y sus usos.Info
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Abstract
Un método in vitro para disminuir la expresión de CD154 de tipo salvaje sobre la superficie de una célula, comprendiendo el método la etapa de introducir en la célula una construcción de ácido nucleico que dirige la expresión de una CD154 mutante que carece de un dominio homólogo de factor de necrosis tumoral de CD154 de tipo salvaje, en el que la CD154 mutante es capaz de unirse a CD154 de tipo salvaje en el interior de una célula en la que están expresadas tanto CD154 mutante como CD154 de tipo salvaje, y en el que la CD154 mutante es capaz, con ello, de hacer que la CD154 de tipo salvaje alcance la superficie de la célula.
Description
Variantes de CD154 y sus usos.
Esta invención se refiere a métodos in
vitro para utilizar variantes de CD154 que carecen de al menos
una parte de un dominio homólogo de factor de necrosis tumoral para
inhibir la expresión de CD154 de tipo salvaje sobre la superficie
de células diana. Los compuestos de la invención son útiles para
tratar o inhibir trastornos inmunes dependientes de CD154.
CD154 (es decir, ligando de CD40 o CD40L) es una
proteína de la membrana de tipo II que se expresa principalmente
sobre células T activadas. La interacción de CD154 con su receptor,
CD40, es crítica para las funciones de células T helper
(colaboradoras) para inducir la diferenciación, proliferación y
conexión del isotipo de inmunoglobulina en células B (para una
revisión, véase Foy et al., Annu Rev Immunol 14,
591-617 (1996); van Kooten et al., J
Leukoc Biol 67:2-17 (2000)). El gen CD154,
localizado en la región cromosomal Xq2.6-2.7, abarca
más de 12 pares de kilobases y contiene cinco exones (Villa et
al., Proc Natl Acad Sci USA 91:2110-4
(1994)).
El primer exón codifica la región citoplásmica,
el dominio de la transmembrana, y seis aminoácidos del dominio
extracelular. El segundo y tercer exones codifican la región del
pedúnculo extracelular. Los cuarto y quinto exones codifican los
147 aminoácidos C-terminales (Villa et al.,
supra), una región que comparte una homología limitada con
otros miembros de la familia del factor de necrosis tumoral
("TNF" - siglas en inglés) y, por lo tanto, se denomina el
dominio homólogo del TNF ("TNFH" - siglas en inglés). La
estructura por rayos X del dominio TNFH de CD154 revela que
contiene un plegamiento a modo de sándwich de dos láminas \beta
con una topología de "brazo gitano" o llave griega. A pesar de
que miembros de la familia de TNF comparten la configuración de la
proteína de la membrana de tipo II, la homología limitada entre
estos miembros está localizada en el dominio TNFH
C-terminal de aproximadamente 150 residuos
aminoácidos.
Al igual que TNF y
linfotoxina-\alpha, CD154 de tipo salvaje existe
en forma de trímeros (Karpusas et al., Structure 3:
1031-9 (1995)). La formación de trímeros de CD154 es
mediada por el dominio TNFH. Se ha demostrado que el dominio TNFH
solo es capaz de formar trímeros (solicitud de patente PCT WO
97/00895; Karpusas et al., supra; Mazzei et
al., J Biol Chem 270:7025-8 (1995)). No
parece que mutantes por deleción a los que les falta una parte
principal de este dominio existan en forma de trímeros (Garber et
al., J Biol Chem 274:33545-50 (1999)).
Así, parece ser que el dominio TNFH es necesario y suficiente para
el ensamblaje de proteínas CD154 triméricas.
Mutaciones del gen CD154 que previenen la
expresión de la proteína CD154 funcional pueden conducir a una
inmunodeficiencia caracterizada por niveles elevados de IgM y
niveles bajos de IgG e IgA en el suero. Dado que el gen CD154 está
localizado en el cromosoma X en seres humanos, esta
inmunodeficiencia se denomina síndrome hiper-IgM
enlazado a X ("XHIM" - siglas en inglés) (Allen et al.,
Science 259:990-3 (1993); Korthauer et
al., Nature 361:539-41 (1993); DiSanto
et al., Nature 361:541-3 (1993);
Aruffo et al., Cell 72:291-300 (1993);
Fuleihan et al., Proc Natl Acad Sci USA
90:2170-3 (1993)). Se han identificado más de 70
mutaciones singulares en el gen CD154 en más de cien pacientes de
XHIM (Notarangelo et al., Immunol Today
17:511-6 (1996)). Estas mutaciones son muy
heterogéneas. Incluyen inserciones, deleciones y mutaciones
puntuales. Así, se puede concebir que sean diferentes los
mecanismos en los que se fundamentan los defectos funcionales de
CD154 en pacientes de XHIM (Garber et al., supra;
Seyama et al., Blood 92:2421-34 (1998)).
Dado que el gen CD154 está enlazado a X, cada
una de las células de individuos normales o pacientes de XHIM
constituye una sola especie de un transcrito codificador de CD154.
Sin embargo, en algunos pacientes de XHIM mutaciones en los sitios
de corte y empalme del donante (Seyama et al., supra;
y referencias citadas en la misma) o los sitios de corte y empalme
del aceptor (Ameratunga et al., Clin Diagn Lab Immunol
3:722-6 (1996)) conducen a la generación de
múltiples especies de transcritos de ARNm en una sola célula. Estos
transcritos incluyen los transcritos normalmente cortados y
empalmados que codifican CD154 de tipo salvaje, así como los
transcritos mal cortados y empalmados que codifican proteínas CD154
variantes que carecen de una parte principal del dominio TNFH, o
del dominio TNFH completo (Seyama et al., supra;
Ameratunga et al., supra).
Dado que parece ser que el dominio TNFH solo es
el responsable del ensamblaje de la proteína CD154 trimérica, se
predijo que variantes que carecen del dominio TNFH no afectan a la
trimerización de la proteína de tipo salvaje. Así, no está claro
por qué pacientes con mutaciones en los sitios de corte y empalme de
sus genes CD154 exhiben el síndrome XHIM, lo cual, presumiblemente,
resulta de una carencia de proteína CD154 funcional.
En J. Biol. Chem. vol. 274, 1999,
11310-11320, se hace una descripción de que CD154,
que carece del dominio TNFH, puede interactuar con CD154 de tipo
salvaje. Se observó la detección en la superficie de la célula de
heterodímeros de CD154 de tipo salvaje y CD154 mutante
estudiada.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de los autores de la misma de que variantes de CD154
que carecen de al menos una parte del dominio TNFH pueden, no
obstante, interactuar con una proteína CD154 de tipo salvaje a
través de la parte del pedúnculo. Esta interacción conserva a la
proteína CD154 de tipo salvaje intracelularmente, previniendo con
ello que la proteína de tipo salvaje sea expresada sobre la
superficie de la célula y participando en cualquier actividad
funcional de CD154. Este descubrimiento revela a la región del
pedúnculo de la proteína CD154 como un elemento estructural
previamente no reconocido que contribuye en el ensamblaje del
trímero CD154.
Por consiguiente, esta invención proporciona un
método in vitro para disminuir (incluido inhibir) la
expresión de proteína CD154 de tipo salvaje sobre la superficie de
células diana. En este método in vitro una construcción de
ácido nucleico se introduce en una célula diana que expresa CD154,
en donde la construcción es capaz de dirigir la expresión de una
proteína variante de CD154 que carece de un dominio TNFH funcional
de la proteína de tipo salvaje, de modo que la proteína variante es
incapaz de una trimerización y aún puede unirse a la proteína de
tipo salvaje, haciendo a la proteína de tipo salvaje incapaz de
alcanzar la superficie de la célula. Por ejemplo, la variante
carece de al menos una parte del dominio TNFH. A título de ejemplo,
una variante de CD154 útil en la invención puede carecer de al
menos 5 (por ejemplo al menos 10; al menos 15; o al menos 20)
aminoácidos del dominio TNFH. En una realización, una variante de
CD154 puede carecer del dominio TNFH completo. En otra realización,
una variante de CD154 puede comprender un dominio TNFH con
mutaciones por inserción y/o mutaciones puntuales.
Tal como se utiliza en esta memoria, el dominio
TNFH de CD154 corresponde a una región que se extiende desde los
residuos aminoácidos 116 a 261 de SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO:1 representa una secuencia de longitud
completa de CD154 humana, y está disponible en GenBank bajo el
número de acceso CAA48554 (haciendo referencia a Graf et al.,
Eur. J. Immunol. 22(12): 3191-4
(1992)). Isoformas alélicas de SEQ ID NO:1 también se pueden
utilizar como la secuencia afín para las variantes de CD154 útiles
en esta invención.
Ejemplos de variantes de CD154 útiles en esta
invención incluyen las que carecen de (1) los residuos aminoácidos
116-136, (2) los residuos aminoácidos
137-261, (3) los residuos aminoácidos
115-261 y (4) los residuos aminoácidos
97-261, respectivamente, de SEQ ID NO:1. Métodos
para generar variantes de CD154 son conocidos en la técnica.
Véanse, por ejemplo, la Fig. 1 y la Tabla 1 de Garber et al.,
J. Biol. Chem. 274:33545-650 (1999).
Esta invención proporciona, además, compuestos
para uso en un método para tratar o inhibir una enfermedad
dependiente de CD154 (por ejemplo, un trastorno inmune mediado por
la interacción CD154:CD40) en un sujeto (es decir un mamífero tal
como un primate, preferiblemente un ser humano). El método implica
administrar a células diana del sujeto, tales como células T (por
ejemplo células T CD4^{+} y CD8^{+}) o megacariocitos, una
variante de CD154 de la presente invención, disminuyendo con ello la
expresión de CD154 de tipo salvaje sobre la superficie de las
células diana. En una realización, la variante de CD154 se genera en
el interior de la célula diana, basado en la absorción por parte de
la célula de una construcción de expresión del gen que comprende
una secuencia de ácido nucleico que codifica esa variante.
Dentro del alcance de la presente invención se
encuentran también composiciones farmacéuticas que comprenden una
construcción de ácido nucleico que dirige la expresión de un mutante
de CD154 útil en un método de la invención. La invención
proporciona también el uso de una construcción de este tipo para la
fabricación de un medicamento para disminuir la expresión de CD154
de tipo salvaje sobre la superficie de una célula diana, y/o para
tratar a un paciente que padece de o es propenso a una enfermedad
mediada por CD154.
La presente invención es bien adecuada para el
suministro local y la absorción por parte de células diana en un
lugar que necesita un tratamiento terapéutico en el cuerpo del
sujeto. Por ejemplo, la construcción de expresión del gen descrita
en esta memoria se puede administrar localmente (por ejemplo
mediante inyección) al bazo u otros tejidos linfoides, o en un
lugar de la inflamación tal como un sitio de una herida o una lesión
patológica. Un tratamiento local de este tipo elude cualesquiera
complicaciones con las que se pueda topar con el suministro
sistémico de agentes inmunomoduladores.
Además, la presente construcción de expresión
del gen evita potenciales inconvenientes de agentes
inmunomoduladores extracelulares tales como anticuerpos. Los
anticuerpos, cuando se unen a un antígeno de la superficie de la
célula, pueden desencadenar la destrucción de la célula, por ejemplo
a través de una respuesta de citotoxicidad de la célula dependiente
de los anticuerpos, o por macrófagos u otras células efectoras que
exhiben receptores Fc sobre su superficie celular. Una destrucción
de este tipo de la célula puede no ser deseable en determinadas
estipulaciones terapéuticas.
Otras características y ventajas de la presente
invención resultarán evidentes a partir de los dibujos siguientes y
de la descripción detallada, y también de las reivindicaciones
adjuntas.
A menos que se defina de otro modo, todos los
términos y expresiones técnicos y científicos tienen el mismo
significado que el entendido habitualmente por un experto ordinario
en la técnica a la que pertenece esta invención. En lo que sigue se
describen métodos y materiales ejemplares.
La Fig. 1 es una autorradiografía que demuestra
la asociación de CD154 TNFH(-) con CD154 de tipo salvaje.
La Fig. 2 es un panel de autorradiografías que
demuestran el efecto inhibidor de CD154 TNFH(-), dependiente de la
dosis, sobre la producción de trímeros de CD154 funcionales.
Las Figs. 3A y 3B son un histograma y una tabla,
respectivamente, que muestran que un mutante de CD154 reduce la
actividad supra-regulante de
linfotoxina-\alpha de CD154 de tipo salvaje.
La Fig. 4 es un panel de autorradiografías que
demuestran que CD154 TNFH(-) previene la expresión en la superficie
de la célula de CD154 de tipo salvaje.
La Fig. 5 es un diagrama esquemático que ilustra
que CD154 TNFH(-) se une intracelularmente a CD154 de tipo salvaje
y previene que alcance la superficie de la célula.
En las décadas pasadas se ha establecido que la
activación de células T requiere tanto el receptor del antígeno de
células T ("TCR" - siglas en inglés) como señales
co-estimulantes suministradas de forma simultánea.
Por ejemplo, la producción de anticuerpos por parte de células B en
respuesta a los antígenos de la proteína requiere una interacción
específica para el antígeno entre células B y células T
colaboradoras, así como interacciones de
receptor-ligando co-estimulantes, no
específicas para el antígeno, entre las células B y T. Estas
interacciones no específicas para el antígeno incluyen la unión de
CD40 sobre células B a CD154 sobre células T.
CD40 humana es una proteína de la superficie de
la célula de 50 kD, expresada en células B maduras, macrófagos y
células endoteliales activadas. CD40 pertenece a una clase de
receptores implicados en la proliferación y la apoptosis, incluidos
Fas/CD95, receptores de TNF y receptores de linfotoxina. CD154
humana es una glicoproteína de la membrana de tipo II de 32 kD
expresada de forma transitoria, principalmente en células T
activadas. Se requiere la interacción CD40:CD154 para esencialmente
todas las respuestas inmunitarias dependientes de células T,
incluidas respuestas de anticuerpos. En particular, la interacción
CD40:CD154 proporciona señales estimulantes
anti-apoptóticas y/o de linfoquina.
La presente invención se basa en el sorprendente
descubrimiento de que variantes mutacionales de CD154 que carecen
de al menos una parte del dominio TNFH pueden unirse
intracelularmente a CD154 de tipo salvaje y previenen que la
proteína de tipo salvaje alcance la superficie de la célula. Así, la
expresión de una variante de CD154 de este tipo en las células T de
un sujeto puede suprimir específicamente las respuestas inmunitarias
dependientes de CD154 al eliminar la expresión sobre la superficie
de la célula de CD154 de tipo salvaje.
Se sabe que la interacción CD40:CD154 es
fundamental para la inducción de respuestas inmunitarias
dependientes de células T, incluidas respuestas inmunitarias
humorales mediadas por anticuerpos y respuestas inflamatorias
mediadas por células T a antígenos de proteínas. A pesar de que se
han invertido esfuerzos considerables por parte de varios grupos de
investigadores en el desarrollo de medios para intervenir en esta
interacción para prevenir o para tratar respuestas inmunitarias
indeseadas o patológicas, sigue existiendo la necesidad de medios
mejorados para interrumpir la interacción CD40:CD154 en
estipulaciones terapéuticas.
La presente invención proporciona los medios
mejorados. De acuerdo con esta invención, una variante de CD154 que
carece de un dominio TNFH funcional (por ejemplo un mutante CD154
TNFH-menos) se puede introducir en células T diana
en un sujeto para tratar (por ejemplo mitigar, retardar o invertir)
o inhibir (por ejemplo prevenir el brote o progreso) de
enfermedades dependientes de CD154 que se pueden caracterizar por
una complicación importante del sistema inflamatorio o sistema
inmune. Enfermedades de este tipo incluyen, pero no se limitan a
lupus, lupus eritematoso sistémico, lupus nefritis, lupus neuritis,
asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis,
enfisema, esclerosis múltiple, uveitis, enfermedad de Alzheimer,
lesión cerebral traumática, lesión de la médula espinal traumática,
apoplejía, aterosclerosis, restenosis coronaria, fallo cardiaco
congestivo isquémico, cirrosis, hepatitis C, nefropatía diabética,
glomerulonefritis, enfermedad autoinmunológica, osteoartritis,
artritis reumatoide, psoriasis, dermatitis atópica, esclerosis
sistémica, fibrosis inducida por la radiación, enfermedad de Crohn,
colitis ulcerosa, mieloma múltiple, enfermedad inflamatoria ocular,
enfermedad de injerto frente a huésped, rechazo de injerto (por
ejemplo rechazo de injerto de la córnea y la retina) o caquexia.
Las variantes mutacionales de CD154 también se
pueden administrar profilácticamente a un paciente que no haya
mostrado todavía síntomas de las enfermedades. Por ejemplo, las
variantes de CD154 se pueden utilizar para tratar pacientes que
vayan a ser sometidos a un trasplante con el fin de prevenir o
mitigar un posible rechazo del injerto.
En una realización, la proteína variante de
CD154 se puede introducir en una célula diana mediante la inyección
local de liposomas u otros soportes adecuados (por ejemplo
microesferas) que contienen la proteína variante. Para una
dirección reforzada, los liposomas u otros soportes adecuados se
pueden revestir con moléculas que actúan como ligandos de
receptores específicos para tejidos.
De acuerdo con esta invención, un mutante de
CD154 TNFH-menos también se puede introducir en una
célula diana al expresar dentro de la célula una construcción de
ácido nucleico que comprende una secuencia de promotor enlazada
operativamente a una secuencia que codifica la proteína CD154
mutante.
Una construcción de ácido nucleico de acuerdo
con esta invención se puede derivar de un vector de ADN o ARN
lineal o circular, no replicante, o de un plásmido o vector viral
replicante de forma autónoma. Alternativamente, la construcción se
puede integrar en el genoma del huésped. Se puede utilizar cualquier
vector que pueda transfectar o transducir una célula T. Vectores
preferidos son vectores virales, incluidos los que se derivan de
retrovirus defectuosos para la replicación (véase, por ejemplo, el
documento WO 89/07136; Rosenberg et al., N. Eng. J.
Med. 323(9): 570-578 (1990)), adenovirus
(véase, por ejemplo, Morsey et al., J. Cell. Biochem.,
supl. 17E (1993)), virus adeno-asociados (Kotin
et al., Proc. Natl. Acad. SCi. USA
87:2211-2215 (1990)), virus herpes simples
defectuosos para la replicación (VSH; Lu et al., Resumen,
página 66. Abstracts of the Meeting on Gene Therapy,
22-26 de sept., 1992, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, Nueva York), virus de la vacuna (Mukherjee
et al., Cancer Gene Ther. 7:663-70
(2000)) y cualesquiera versiones modificadas de estos vectores.
Métodos para construir vectores de expresión son bien conocidos en
la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, 2ª edición, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).
Los vectores de esta invención pueden dirigirse
específicamente contra células T. Vectores virales específicos para
células T, útiles en la terapia génica, son conocidos en la técnica.
Por ejemplo, se pueden utilizar (1) los vectores retrovirales de
Annenkov et al., Gene Therapy 7:714-22
(2000); Cavazzana-Calvo et al., Science
288:669-72 (2000); y Farson et al., J.
Gene Med. 1:195-209 (1999); (2) el vector
saimiri del virus herpes de Hiller et al., Gene
Therapy 7:664-74 (2000); (3) los vectores
híbridos basados en el VIH de Kung et al., J. Virol.
74:3668-81 (2000); (4) los vectores lentivirales
derivados del VIH de Costello et al., Gene Therapy
7:596-604 (2000); o (5) cualesquiera versiones
modificadas de los vectores arriba mencionados.
En estos vectores, las secuencias de control de
la expresión están enlazadas operativamente a la secuencia de
ácidos nucleicos que codifican la proteína mutante de la invención.
Se pueden utilizar cualesquiera secuencias de control de la
expresión que puedan dirigir un nivel de transcripción deseado en
células T. Para células eucarióticas, las secuencias de control de
la expresión pueden incluir un promotor, un reforzador tal como uno
derivado de un gen de inmunoglobulina, SV40, citomegalovirus, etc.,
y una secuencia de poliadenilación. Una construcción de ácidos
nucleicos de esta invención puede contener también un sitio de
entrada al ribosoma interno ("IRES" - siglas en inglés) y un
intrón que puede estar localizado, de manera deseable, entre la
secuencia de promotor/reforzador y la secuencia que codifica la
CD154 mutante. La selección de éstos y otros elementos de vector
comunes es convencional. Véase, por ejemplo, Sambrook et al.,
supra; Ausubel et al., Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons Nueva York, (1989); y
referencias citadas en los mismos.
En una realización de la presente invención se
utiliza el promotor nativo para CD154. El promotor nativo puede ser
preferido cuando se desea que la expresión de la CD154 mutante deba
mimetizar la expresión nativa. El promotor nativo se puede utilizar
cuando la expresión de la CD154 mutante deba ser regulada
temporalmente o de un modo de desarrollo, o de una manera
específica para el tejido, o en respuesta a estímulos de
transcripción nativos específicos. En una realización adicional,
otros elementos de control de la expresión nativos tales como
elementos de reforzador, sitios de poliadenilación o secuencias de
consenso Kozak se pueden utilizar también para mimetizar la
expresión
nativa.
nativa.
En otra realización de la presente invención se
desean promotores específicos para células T. Promotores de este
tipo incluyen dos clases: promotores específicos para el tipo de
células y promotores específicos para la activación. Ejemplos de
promotores de este tipo incluyen, sin limitación, promotores
derivados de los genes de CD2, CD4, CD3, cadenas \alpha y \beta
del receptor de células T e IL-2.
Para prevenir una inmunosupresión prolongada,
puede ser deseable utilizar promotores inducibles para regular la
expresión de CD154 mutante. Promotores de este tipo son conocidos en
la técnica. Éstos incluyen, sin limitación, (1) promotores
inducibles por tetraciclina (Gossen et al., Science
268:1766-1769 (1995); Harvey et al., Curr.
Opin. Chem. Biol. 2:512-518 (1998)); (2)
promotores supresibles por tetraciclina
(Alvarez-Vallina et al., Cancer Gene
Therapy 7:526-9 (2000); Gossen et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551
(1992)); (3) los sistemas de promotores inducibles por rapamicina
de Ye et al., Science 283:88-91
(1999); Magari et al., J. Clin. Invest.
100:2865-2872 (1997); y Rivera et al.,
Nat. Medicine 2:1028-1032 (1996); (4) el
promotor de metalotionina inducible por zinc; (5) el promotor del
virus del tumor mamario de ratón (MMTV - siglas en inglés)
inducible por dexametasona (Dex); (6) el sistema de promotor de T7
polimerasa (documento WO 98/10088); (7) el promotor del insecto
ecdisone (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:3346-3351 (1996)); (8) los sistemas de
promotores inducibles por RU486 (Wang et al., Nat. Biotech.
15:239-243 (1997); Wang et al., Gene
Ther. 4:432-441 (1997); y (9) las versiones
modificadas de los sistemas de promotores de arriba. Otros tipos de
promotores inducibles, útiles en esta invención, son los regulados
por un estado fisiológico específico, por ejemplo temperatura, fase
aguda o en células replicadoras solamente.
Todavía en otra realización de la presente
invención, se desea una expresión constitutiva de alto nivel.
Promotores ejemplares para este propósito incluyen, sin limitación,
el promotor/reforzador LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV -
siglas en inglés) retroviral, el promotor/reforzador inmediato
temprano del citomegalovirus (CMV - siglas en inglés) (véase, por
ejemplo, Boshart et al., Cell
41:521-530 (1985)), el promotor de SV40, el
promotor de la dihidrofolato reductasa, el promotor de
\beta-actina citoplásmico y el promotor de la
fosfoglicerol quinasa (PGK - siglas en inglés).
Al utilizar la guía proporcionada por esta
solicitud, un experto en la técnica puede realizar una selección
entre las secuencias de control de la expresión y versiones
modificadas de las mismas sin apartarse del alcance de esta
invención.
Las construcciones de ácidos nucleicos de esta
invención se pueden formular en forma de una composición
farmacéutica para uso en cualquier transferencia de genes
transitoria y/o estable in vivo e in vitro. La
composición comprende al menos la construcción de ácidos nucleicos
y un soporte farmacéuticamente aceptable tal como solución salina.
También se pueden emplear otras suspensiones estériles, acuosas y no
acuosas, que se sabe son soportes farmacéuticamente aceptables y
que son bien conocidas por el experto en la técnica. La construcción
puede utilizarse para la terapia génica in vivo y ex
vivo, para la producción in vitro de proteínas y para
análisis de diagnóstico.
La construcción de ácidos nucleicos se puede
introducir en células diana en forma de ADN desnudo o, por ejemplo,
mediante fusión de liposomas (véase, por ejemplo, Nabel et
al., Science 249:1285-8 (1990); Ledley,
J. Pediatrics 110:1-8 y
167-74 (1987); Nicolau et al., Proc. Natl.
Acad. Sci USA 80:1068-72 (1983)), fantasmas de
eritrocitos, o métodos de microesfera (micropartículas; véanse, por
ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 4.789.734, 4.925.673 y
3.625.214; Gregoriadis, Drug Carriers in Biology and
Medicine, págs. 287-341, Academic Press,
1979). Alternativamente, la construcción de ácidos nucleicos se
puede acoplar a ligandos de receptores específicos para células T
y, con ello, puede penetrar en las células T a través de endocitosis
mediada por el receptor.
Si la construcción de ácidos nucleicos está
basada en virus, ésta se puede también empaquetar en forma de un
virión el cual se utiliza luego para transducir una célula (por
ejemplo una célula T autóloga aislada de un paciente) ex
vivo. La célula infestada se devuelve luego al cuerpo del
paciente. Alternativamente, el virus recombinante se puede
administrar directamente a un paciente, por ejemplo por vía
intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intramuscular,
subcutánea; y/o por vía intradérmica, según se determina por un
experto en la técnica de la terapia génica. Un dispositivo de
liberación lenta tal como una bomba implantable se puede utilizar
para facilitar el suministro del virus recombinante a una célula.
Cuando el virus es administrado a un sujeto, se puede dirigir a las
células específicas a infestar controlando el método de suministro.
Por ejemplo, la inyección intravenosa del virus se puede utilizar
para facilitar el dirigir el virus a una célula T en circulación.
Las zonas diana del cuerpo para los sitios de suministro locales
incluyen, por ejemplo, los pulmones, la piel, los nódulos
linfáticos, el timo, el bazo y la médula ósea. Un suministro de este
tipo puede ser, por ejemplo, por vía tópica, por inhalación,
aerosol o inyección local, incluidos, por ejemplo, catéteres de la
vena porta. Según se necesite, se pueden repetir los tratamientos
de la invención, según se determina por un experto en la
técnica.
Las dosificaciones de la construcción de ácidos
nucleicos de esta invención en la terapia génica dependerán
principalmente de factores tales como el estado que esté siendo
tratado. La dosificación también puede variar dependiendo de la
edad, el peso y la salud del paciente. Por ejemplo, una dosificación
efectiva para seres humanos de un virus que codifica CD154 mutante
está generalmente en el intervalo de aproximadamente 0,5 ml a 50 ml
de solución salina que contiene el virus a concentraciones de
aproximadamente 1 x 10^{7}, 1 x 10^{8}, 1 x 10^{9}, 1 x
10^{10}, 1 x 10^{11}, 1 x 10^{12}, 1 x 10^{13}, 1 x
10^{14}, 1 x 10^{15} ó 1 x 10^{16} de partículas víricas por
dosis administrada. La dosificación será ajustada para equilibrar
los beneficios de corrección frente a cualesquiera efectos
secundarios adversos. Los niveles de expresión de CD154 mutante
pueden vigilarse para determinar el tipo y la frecuencia de la
administración de dosificación.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
se pueden utilizar solas o en una mezcla, o combinación química,
con uno o más materiales, incluidos otras proteínas o vectores
recombinantes que aumenten la estabilidad biológica de las
proteínas o de los vectores recombinantes, o con materiales que
aumenten la capacidad de las composiciones de dirigir células T de
forma selectiva.
Además, las composiciones farmacéuticas de la
invención se pueden utilizar en combinación con otro régimen
inmunomodulador para conseguir la inmunosupresión deseada, por
ejemplo la integración a largo plazo, libre de rechazo de tejido
donante heterólogo en un receptor primate. Por ejemplo, se puede
utilizar un agente que bloquee la interacción CD154:CD40, o que
bloquee la co-estimulación a través de CD28, CD80 o
CD86.
Inhibidores ejemplares de la interacción
CD154:CD40 son anticuerpos contra CD154 tales como anticuerpos
monoclonales ("mAbs" - siglas en inglés) 5c8 (producidos por
el hibridoma con el número de acceso en ATCC HB 10916; descritos en
la patente de Estados Unidos 5.474.771); ImxM90, ImxM91 e ImXM92
(descritos en la patente de Estados Unidos 5.961.974); y los
comercialmente disponibles de Ancell (clones 24-31,
nº de catálogo 353-020, Bayport, MN), Genzyme
(Cambridge, MA, nº de catálogo
80-3703-01) y PharMingen (San Diego,
nº de catálogo 33580D). Se han producido y se han caracterizado
numerosos anticuerpos anti-CD154 adicionales (véase,
por ejemplo, la solicitud de patente PCT WO 96/23071 de
Bristol-Myers Squibb).
Otros inmunomoduladores conocidos que bloquean
la interacción CD154:CD40 incluyen moléculas
anti-CD154 de otros tipos tales como fragmentos Fab
completos, compuestos F(ab')_{2}, regiones V_{H},
regiones F_{V}, anticuerpos de cadena sencilla (véase, por
ejemplo, la Solicitud de Patente PCT WO 96/23071), polipéptidos,
proteínas de fusión (tales como CD40Ig, como en Hollenbaugh et
al., J. Immunol. Meth. 188:1-7 (1995)) y
compuestos de moléculas pequeñas tales como compuestos
semi-peptídicos pequeños o compuestos no peptídicos.
Todos estos inmunomoduladores son capaces de bloquear o interrumpir
la interacción CD154:CD40. Procedimientos para diseñar, rastrear y
optimizar moléculas pequeñas se proporcionan en la publicación de
Patente PCT WO 97/00895, cuya memoria descriptiva se incorpora con
ello como referencia.
Para evitar respuestas inmunes potenciales al
virus recombinante durante la terapia génica, puede ser también
deseable adoptar un régimen de tratamiento idéntico o similar al
descrito en Chirmule et al., J. Virol.
74:3345-52 (2000). En este régimen un paciente es
tratado primeramente de forma concomitante con (1) el virus
recombinante sin la inserción de CD154 mutante y (2) un
inmunomodulador tal como un anticuerpo anti-CD154
humanizado u otro inhibidor de la co-estimulación.
Después, el paciente es tratado con el virus que codifica CD154
mutante. Se ha demostrado que un régimen de dos etapas de este tipo
da como resultado una inhibición importante y prolongada de la
respuesta humoral específica para el virus recombinante que a menudo
provoca efectos secundarios en pacientes de terapia génica.
Véase también la Patente de Estados Unidos
5.872.174 y la Solicitud de Patente PCT WO 96/26285.
Un sistema modelo ejemplar para someter a ensayo
la eficacia de regímenes de terapia génica con CD154 mutante es el
modelo de aloinjerto renal en primates descrito en Kirk et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94:8789-94 (1997), cuyas enseñanzas se incorporan
en esta memoria como referencia. Este modelo con monos rhesus puede
servir como un ensayo riguroso de la manipulación inmune: uno que es
exquisitamente sensible, incluso a pequeños cambios en la función
de aloinjerto o efectos adversos en la cicatrización de heridas de
un receptor y función del sistema inmune. Además, tiene una
similitud biológica con el trasplante de riñón humano:
específicamente, genes que codifican proteínas MHC están bien
conservados entre monos rhesus y seres humanos, y el rechazo de los
monos rhesus de órganos vascularizados se asemeja estrechamente al
observado clínicamente.
Se apreciará fácilmente que este sistema de
modelo es adecuado para evaluar injertos que comprenden tejido
renal (de los riñones). Otros sistemas de modelos preclínicos
reconocidos en la técnica, preferiblemente sistemas de modelos con
primates, son adecuados para confirmar la eficacia de la terapia
génica con CD154 mutante en la supresión del rechazo de otros tipos
de tejido de injerto tales como el hígado, el corazón, los pulmones,
el páncreas, los islotes pancreáticos, la piel, el sistema nervioso
periférico y central. Además, la eficacia de la terapia génica con
CD154 mutante de acuerdo con la presente invención se puede
confirmar en modelos con animales de lupus nefritis tales como los
descritos en las Solicitudes de Patente PCT WO 98/30240 y WO
98/30241. Una eficacia de este tipo también se puede confirmar en
modelos de aloinjerto de la córnea en animales tales como modelos
de aloinjerto de la córnea en ratones.
Los siguientes Ejemplos ilustran los métodos y
materiales de la presente invención.
\newpage
Ejemplo
1
BJAB, una línea de células B humana, fue una
donación del Dr. George Mosialos de Harvard Medical School. La
línea de células se mantuvo en un medio RPMI suplementado con
penicilina, estreptomicina, suero bovino fetal inactivado por
calor, al 10% y glutamina 4 mM. El mAb 9E10 se produjo y se purificó
a partir del cultivo del hibridoma 9E10, disponible de American
Type Cultura Collection. Véase también G.I. Evan et al.,
"Isolation of Monoclonal Antibodies Specific for Human
c-myc Proto-Oncogene Product",
Mol Cell Biol 5:3610-3616 (1985) en relación
con el mAb 9E10 y la etiqueta myc EQKLISEEDL. Procedimientos para
tratar por ingeniería, producir y purificar proteína de fusión
CD40-F_{c}, 5c8 humanizado y anticuerpos
policlonales de conejo Rb779 y Rb784 se llevaron a cabo como se
describe en Hsu et al., J Biol Chem
272:911-5 (1997).
Un ADNc de CD154 de tipo salvaje se aisló de una
genoteca de ADNc preparada de células de la sangre periférica
humana activadas. La secuencia codificante de este ADNc codifica una
proteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.
Procedimientos para construir mutantes de CD154 se llevaron a cabo
tal como se describe en Garber et al., supra. Los
ADNcs de tipo salvaje y mutante se subclonaron o reconstruyeron a
partir de fragmentos de restricción con la secuencia confirmada en
un sitio NotI único en un CMV, vector de expresión, accionado por
un promotor temprano inmediato que contiene un origen SV40 para la
amplificación en células COS7. Las células COS7 se transfectaron
con ADN de plásmido superenrollado utilizando lipofectamina (Gibco
BRL, Grand Island, Nueva York), siguiendo las instrucciones del
fabricante. El ADN del plásmido que carece de la secuencia
codificante de CD154 se utilizó como un control negativo, y un
vector que contiene la secuencia codificante de CD154 de tipo
salvaje se utilizó como un control positivo en todos los ejemplos.
La expresión de CD154 y sus variantes se analizó en células
transfectadas, recolectadas 72 horas después de la transfección. El
marcaje metabólico y la biotinilación de proteínas de la superficie
de la célula, la inmunosupresión, la electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida ("SDS-PAGE"
- siglas en inglés) y el análisis de transferencia western se
realizaron utilizando procedimientos descritos en Hsu et
al., supra.
La preparación de las fracciones de membrana a
partir de células COS7 transfectadas y los procesos para el
análisis de la supra-regulación de
linfotoxina-\alpha se realizaron como se ha
descrito previamente Garber et al., supra).
Ejemplo
2
Para investigar el efecto del mutante TNFH(-)
sobre la expresión de CD154 de tipo salvaje, lisados de células
COS7 marcadas metabólicamente, co-transfectadas con
ADNcs que codifican estas proteínas, se analizaron mediante
inmunoprecipitación utilizando anticuerpos específicos para CD154.
Para distinguir la proteína mutante del componente p18 de los
complejos heterotriméricos de tipo salvaje (Hsu et al.,
supra), una etiqueta myc fue tratada por ingeniería en el
extremo C de los primeros 96 aminoácidos de CD154 para reemplazar
los aminoácidos no CD154 (11 ó 21 aminoácidos) predichos en los
transcritos cortados y empalmados de forma aberrante (pacientes 19,
20 y 21 en Seyama et al., supra).
Para determinar la asociación de mutantes de
CD154 con la proteína de tipo salvaje, lisados de células preparados
a partir de células COS7 marcadas metabólicamente con ^{35}S,
co-transfectadas con ADNc que codifica la CD154 de
tipo salvaje de longitud completa o la CD154 mutante marcada con myc
(residuos aminoácidos 1-96 de SEQ ID NO:1) o ambos
se inmunoprecipitaron con el mAb 9E10 anti-myc, el
mAb 5c8 anti-CD154 humano o el antisuero Rb784 (o
"784") del péptido
anti-CD154-terminal. Los
inmunoprecipitados se analizaron mediante electroforesis en
gradiente al 10-20% en gel de
SDS-PAGE, seguido de autorradiografía (Fig.1).
La Fig.1 muestra que cuando CD154 de tipo
salvaje fue expresada sola, inmunoprecipitados del antisuero Rb784
del péptido anti-CD154-terminal
(pista 3) y el mAb 5c8 anti-CD154 (pista 4)
contenían principalmente la proteína p33 de longitud completa, algo
de proteína p31 y una pequeña cantidad de p18 (p33, p31 y p18 son
componentes de CD154 de tipo salvaje). Esto es consistente con la
observación previa de los autores de la invención (Hsu et
al., supra). Los componentes p33, p31 y p18 no se
observaron en los inmunoprecipitados del mAb 9E10
anti-myc (pista 1) o del antisuero de conejo
control (pista 2). Cuando se expresó sola una proteína CD154 mutante
(que contenía los residuos aminoácidos 1-96 de SEQ
ID NO:1 y estaba enlazada a una etiqueta myc) ("TNFH(-)"), un
componente p17, correspondiente a la propia proteína mutante, se
inmunoprecipitó tanto mediante 9E10 como mediante Rb784, pero no
mediante el mAb 5c8 o el antisuero de conejo control (pistas 5 a 8).
Cuando las proteínas mutante y de tipo salvaje se
co-expresaron, inmunoprecipitados de 9E10 contenían
no sólo la proteína mutante p17 marcada con myc, sino también las
proteínas de tipo salvaje p33, p31 y p18 (pista 9). Se encontraron
modelos de proteína similares en inmunoprecipitados de Rb784 y mAb
5c8, pero no el suero control (pistas 10 a 12). De manera notable,
los inmunoprecipitados del mAb 5c8 exhibían una cantidad menor de
estas proteínas, sugiriendo que no todas las proteínas de tipo
salvaje expresadas eran reconocidas por 5c8.
Los datos anteriores revelan tres hallazgos
importantes: primero, las proteínas CD154 mutantes pueden ser
producidas de forma estable y pueden ser detectadas fácilmente. En
segundo lugar, las proteínas CD154 mutantes a las que les falta el
dominio TNFH pueden asociarse con CD154 de tipo salvaje. En tercer
lugar, al menos algunas de las proteínas de tipo salvaje, al tiempo
que están asociadas con las proteínas mutantes, pueden interactuar
con el mAb 5c8, cuyo epítopo de unión ha demostrado ser
conformacional y similar al sitio de unión de CD154 para CD40.
Ejemplo
3
Los datos mostrados en la Fig. 1 sugieren que la
asociación de CD154 TNFH(-) con CD154 de tipo salvaje puede
comprometer la capacidad de la proteína de tipo salvaje de
interactuar con su receptor. Para examinar adicionalmente esto, los
autores de la invención transfectaron células COS7 con (1) una
cantidad constante de un plásmido que contenía ADNc que codifica
CD154 de longitud completa y una cantidad variable de un plásmido
que contenía ADNc que codifica CD154 TNFH(-). Los transfectantes se
marcaron luego metabólicamente con ^{35}S y se lisaron.
Inmunoprecipitados de los lisados se analizaron mediante un
gradiente al 10-20% de gel de
SDS-poliacrilamida, seguido de autorradiografía
(Fig. 2).
La Fig. 2 muestra que la cantidad de CD154 de
tipo salvaje inmunoprecipitada por parte de Rb 784 era la misma,
independientemente de la cantidad de ADN de TNFH(-) utilizada para
la transfección (fig. 2, panel inferior). En la pista 1, las
células fueron transfectadas con sólo el plásmido que codifica CD154
de tipo salvaje. En las pistas 2-4, las células
fueron transfectadas con la misma cantidad del plásmido CD154 de
tipo salvaje y una cantidad variable del plásmido TNFH(-); y las
relaciones del primer plásmido al último plásmido eran 3:1, 1:1 y
1:3, respectivamente. En la pista 6, las células fueron
transfectadas con solamente un plásmido control.
Los datos mostrados en la fig. 2 indican que la
expresión de la proteína de tipo salvaje no se vio afectada por la
introducción del mutante TNFH(-). Sin embargo, la cantidad de la
proteína de tipo salvaje reconocida por una proteína de fusión
CD40-F_{c} o por el mAb 5c8 era inversamente
proporcional a la cantidad del plásmido TNFH (-) utilizada para la
transfección (fig. 2, paneles superior y central, respectivamente).
De manera interesante, sólo una pequeña parte del mutante TNFH(-)
total expresado (Fig. 2, panel inferior) fue inmunoprecipitada por
CD40-F_{c} o por el mAb 5c8. Estos resultados
demuestran que la expresión del mutante TNFH(-) afectaba a la
actividad interactuante del receptor, pero no al nivel de expresión,
de CD154 de tipo salvaje de un modo dependiente de la dosis.
Ejemplo
4
Para someter a ensayo si la
co-expresión de CD154 mutante afecta a la función de
la proteína de tipo salvaje, membranas irradiadas con UV
procedentes de células COS7 transfectadas, transfectadas con ADNcs
que codifican CD154 de tipo salvaje y/o mutante se incubaron con
células BJAB durante 24 h. En la fig. 3B se indican relaciones de
ADNcs de tipo salvaje a mutante utilizadas para las transfecciones
de COS7. Las células BJAB se tiñeron con mAb
anti-linfotoxina-\alpha marcado
con biotina, NC2, luego con estreptavidina marcada con ficoeritrina
y, finalmente, se fijaron con paraformaldehído al 1%. El análisis
FACS de las células BJAB se utilizó subsiguientemente para
determinar el nivel de linfotoxina-\alpha
supra-regulada sobre la superficie de las células (fig. 3A,
en la que las barras representan las intensidades de fluorescencia
media).
Las Figs. 3A y 3B muestran que la
co-expresión de la proteína CD154 mutante con la
proteína de tipo salvaje reducía la capacidad
supra-regulante de linfotoxina-\alpha de la
proteína de tipo salvaje presente sobre las membranas del plasma.
Este efecto inhibidor era dependiente de la dosis. Cuando la
cantidad de ADNc de tipo salvaje utilizada para la transfección era
un tercio del ADNc mutante, la actividad funcional de CD154
descendió al nivel de fondo.
Ejemplo
5
Existen al menos dos posibles mecanismos
mediante los cuales CD154 mutante inhibe las funciones de CD154 de
tipo salvaje de una manera dependiente de la dosis. Primero, una
CD154 de tipo salvaje asociada con una CD154 mutante puede ser
menos activa en la interactuación con CD40. En segundo lugar, una
CD154 de tipo salvaje asociada con una CD154 mutante puede no ser
funcional en absoluto, y la actividad observada en la
supra-regulación de linfotoxina-\alpha
puede ser debida exclusivamente a las proteínas de tipo salvaje que
no se asocian con proteínas mutantes. Para distinguir estas dos
posibilidades, los autores de la invención examinaron seguidamente
las propiedades bioquímicas de proteínas CD154 expresadas sobre las
superficies de las células.
Para ello, células COS7 fueron transfectadas el
día uno con ADNc que codifica CD154 de tipo salvaje o ADNc que
codifica el mutante TNFH(-), o ambos. Los transfectantes se lavaron
el día cuatro con PBS para separar los desechos de las células y a
las células no fijadas, y luego se marcaron con biotina in
situ. El marcaje se llevó a cabo utilizando
biotina-sulfo-NHS a una
concentración de 0,5 mg/ml en agua que se dejó sobre las células
durante 3 minutos a la temperatura ambiente. La reacción se detuvo
utilizando glicina, permaneciendo las células transfectantes en un
amplio exceso molar de glicina durante 15 minutos, después de lo
cual se aclararon con PBS.
Luego se lisaron las células transfectantes, se
centrifugaron para separar los desechos de las células y se
inmunoprecipitaron con CD40-F_{c}, Rb779, Rb784 ó
9E10. Los inmunoprecipitados se sometieron a electroforesis en gel
de SDS-poliacrilamida al 10-20%, se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se sometieron a
prueba con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante
(Fig. 4).
La Fig. 4 muestra que la proteína de fusión
CD40-F_{c}, Rb784 y Rb779, pero no 9E10
inmunoprecipitaban las proteínas de tipo salvaje marcadas con
biotina. Además, la cantidad de CD154 de tipo salvaje detectada en
la superficie de la célula era inversamente proporcional a la
relación de ADNc mutante a ADNc de tipo salvaje utilizada para la
co-transfección. Así, la expresión de la proteína
mutante TNFH(-) evitaba la expresión en la superficie de la
proteína de tipo salvaje de una manera dependiente de la dosis. De
manera importante, los autores de la invención no detectaron la
proteína mutante (p17) marcada con biotina en inmunoprecipitados
con proteína de fusión CD40-F_{c}, Rb784 y Rb779,
sugiriendo que las proteínas de tipo salvaje marcadas con biotina,
es decir expresadas sobre la superficie de la célula, no estaban
asociadas con la proteína mutante TNFH(-). Dado que hay un total de
ocho residuos lisina en el dominio extracelular del mutante TNFH(-),
no era probable que alguno de estos residuos lisina fuese accesible
para la biotinilación bajo las condiciones experimentales, de modo
que no se detectaron las proteínas mutantes presentes sobre la
superficie. Además de ello, el hecho de que 9E10 no
inmunoprecipitara a ninguna proteína de tipo salvaje indica que
ninguna de las proteínas de tipo salvaje en la superficie de la
célula estaba asociada con el mutante TNFH(-).
Junto con los resultados mostrados en la Fig.1,
estos datos indican que proteínas CD154 de tipo salvaje, no
asociadas con el mutante TNFH(-), se expresaron sobre la superficie
de la célula. Sin embargo, las proteínas de tipo salvaje
complejadas con el mutante TNFH(-) quedaron retenidas en el interior
de la célula. Así, la asociación con el mutante TNFH(-) previene la
expresión de CD154 de tipo salvaje sobre la superficie de la
célula.
La Fig. 5 ilustra este proceso inhibidor. Cuando
las proteínas de tipo salvaje y mutante son
co-expresadas, las proteínas de tipo salvaje pueden
formar trímeros con o sin el mutante TNFH(-) asociado. Sin embargo,
los unidos por la proteína mutante no pueden madurar sobre la
superficie de la célula. La asociación con TNFH(-) per se no
compromete la capacidad de la proteína de tipo salvaje de
interactuar con el receptor, CD40.
Ejemplo
6
Para estudiar el potencial efecto dominante
negativo de la variante TNFH(-) sobre CD154 de tipo salvaje, los
autores de la invención co-expresaron estas dos
proteínas en células COS y examinaron sus propiedades bioquímicas y
funcionales. Sus resultados indican que al complejar con la proteína
de tipo salvaje, la proteína mutante previene la expresión sobre la
superficie de la célula de CD154 de tipo salvaje. Esta observación
es importante por al menos dos aspectos. Primero, implica que
mientras que las células de un paciente son capaces de producir
proteínas CD154 tanto de tipo salvaje como mutantes TNFH(-), no son
capaces de producir CD154 funcional sobre la superficie de la
célula y de conducir a un fenotipo hiper-IgM. En
segundo lugar, la observación de las autores de la invención revela
que, además del dominio TNFH, otras partes de CD154 también
participan en el ensamblaje de trímeros CD154.
Dado que CD154 es expresada transitoriamente
sobre la superficie de la célula de linfocitos T tras la activación,
incluso una reducción parcial de la expresión en superficie de esta
proteína será beneficiosa para la supresión de células T
indeseadas, mediada por respuestas inmunológicas. Así, la
introducción de una variante CD154 que carece de un dominio TNFH
funcional en células T diana proporcionará una oportunidad
terapéutica al bloquear de manera eficaz la expresión de CD154
funcional sobre la superficie de las células diana.
<110> BIOGEN, INC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VARIANTE DE CD154
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> A103PCT (00455.191)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 261
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Un método in vitro para
disminuir la expresión de CD154 de tipo salvaje sobre la superficie
de una célula, comprendiendo el método la etapa de introducir en la
célula una construcción de ácido nucleico que dirige la expresión
de una CD154 mutante que carece de un dominio homólogo de factor de
necrosis tumoral de CD154 de tipo salvaje, en el que la CD154
mutante es capaz de unirse a CD154 de tipo salvaje en el interior
de una célula en la que están expresadas tanto CD154 mutante como
CD154 de tipo salvaje, y en el que la CD154 mutante es capaz, con
ello, de hacer que la CD154 de tipo salvaje alcance la superficie de
la célula.
2. Uso de una construcción de ácido
nucleico que dirige la expresión de una CD154 mutante que carece de
un dominio homólogo de factor de necrosis tumoral de CD154 de tipo
salvaje, en donde la CD154 mutante es capaz de unirse a CD154 de
tipo salvaje en el interior de una célula en la que están expresadas
tanto CD154 mutante como CD154 de tipo salvaje, y en donde la CD154
mutante es capaz, con ello, de hacer que la CD154 de tipo salvaje
alcance la superficie de la célula, para la preparación de una
composición farmacéutica para tratar a un paciente que padece o
está predispuesto a una enfermedad mediada por CD154, en donde la
enfermedad mediada por CD154 es rechazo de injerto, enfermedad
autoinmune o enfermedad inflamatoria.
3. Uso de una construcción de ácido
nucleico que dirige la expresión de una CD154 mutante que carece de
un dominio homólogo de factor de necrosis tumoral de CD154 de tipo
salvaje, en donde la CD154 mutante es capaz de unirse a CD154 de
tipo salvaje en el interior de una célula en la que están expresadas
tanto CD154 mutante como CD154 de tipo salvaje, y en donde la CD154
mutante es capaz, con ello, de hacer que la CD154 de tipo salvaje
alcance la superficie de la célula, para la preparación de una
composición farmacéutica para tratar a un paciente que padece o
está predispuesto a una enfermedad mediada por CD154, en donde la
enfermedad mediada por CD154 se selecciona del grupo que consiste
en lupus, lupus eritematoso sistémico, lupus nefritis, lupus
neuritis, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis,
enfisema, esclerosis múltiple, uveitis, enfermedad de Alzheimer,
lesión cerebral traumática, lesión de la médula espinal traumática,
apoplejía, aterosclerosis, restenosis coronaria, fallo cardiaco
congestivo isquémico, cirrosis, hepatitis C, nefropatía diabética,
glomerulonefritis, osteoartritis, artritis reumatoide, psoriasis,
dermatitis atópica, esclerosis sistémica, fibrosis inducida por la
radiación, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, mieloma múltiple,
enfermedad inflamatoria ocular y caquexia.
4. El método o uso de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que
dicha CD154 mutante carece de al menos una parte del dominio
homólogo de factor de necrosis tumoral de CD154 de tipo salvaje.
5. El método o uso de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que dicha CD154 mutante consiste en los
residuos aminoácidos 1-96 de SEQ ID NO:1.
6. El método o uso de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la
construcción de ácido nucleico comprende un vector derivado de un
virus.
7. El método o uso de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que el vector derivado del virus es un
vector retroviral, vector lentiviral, vector adenoviral o un vector
viral adeno-asociado.
8. El método o uso de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la
construcción de ácido nucleico o composición farmacéutica se
introduce en la célula o en el paciente a través de una transducción
viral.
9. El uso de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 2-4, en donde la composición
farmacéutica se diseña para ser introducida en la célula o en el
paciente in vivo o ex vivo
10. El método o uso de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la
célula es una célula T o un megacariocito, una célula de un
mamífero, una célula humana o una célula T humana.
11. Una composición farmacéutica que
comprende una construcción de ácido nucleico que dirige la expresión
de una CD154 mutante que carece de un dominio homólogo de factor de
necrosis tumoral de CD154 de tipo salvaje, en donde la CD154
mutante es capaz de unirse a CD154 de tipo salvaje en el interior de
una célula en la que están expresadas tanto CD154 mutante como
CD154 de tipo salvaje, y en donde la CD154 mutante es capaz, con
ello, de hacer que la CD154 de tipo salvaje no alcance la superficie
de la célula.
12. La composición farmacéutica de acuerdo
con la reivindicación 11, en donde dicha CD154 mutante carece de al
menos una parte del dominio homólogo de factor de necrosis tumoral
de CD154 de tipo salvaje.
13. La composición farmacéutica de acuerdo
con la reivindicación 12, en donde la CD154 mutante consiste en los
residuos aminoácidos 1-96 de SEQ ID NO:1.
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