ES2263451T3

ES2263451T3 - Metodo para producir un preparado basado en fibrinogeno y fibronectina, asi como composiciones proteinicas que se pueden obtener segun este metodo.

Info

Publication number: ES2263451T3
Application number: ES00906319T
Authority: ES
Inventors: Thomas Seelich; Ralf Broermann
Original assignee: Baxter AG
Current assignee: Baxter AG
Priority date: 1999-02-12
Filing date: 2000-02-10
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2020-02-10
Also published as: JP2007131638A; US6579537B2; CA2362513C; US20020172718A1; DE60027695D1; AU2804100A; AU2004201982A1; ATE325133T1; US7241603B2; DK1151007T3; AU774118B2; CA2362513A1; AU2004201982B2; DE60027695T2; WO2000047621A1; PT1151007E; EP1151007A1; SI1151007T1; EP1151007B1; US20030077270A1

Abstract

Método para producir composiciones proteínicas que comprenden fibrinógeno y fibronectina, caracterizado porque la solución inicial que contiene fibrinógeno y fibronectina se trata con una composición de precipitación que comprende una combinación de a) un poliol, en particular, un polialquilenglicol, o b) un alcohol de hasta cuatro átomos de carbono, especialmente etanol, o c) una sal orgánica, especialmente sulfato de amonio o de un metal alcalino y un aminoácido, en particular glicina o alanina, de manera que en una única etapa de precipitación se forma un precipitado que contiene fibrinógeno y fibronectina.

Description

Método para producir un preparado basado en fibrinógeno y fibronectina, así como composiciones proteínicas que se pueden obtener según este método.

La invención se refiere a un método para producir composiciones proteínicas que contienen fibronectina y fibrinógeno, y opcionalmente otros ingredientes, igualmente se refiere a las composiciones proteínicas que se pueden obtener según este método.

Los adhesivos tisulares basados en fibrinógeno ("adhesivos de fibrina") son conocidos desde hace tiempo. Se emplean para unir tejidos humanos o animales o partes de órganos, para cerrar heridas, en la hemostasia y para ayudar a la cicatrización de heridas, bien sin costuras o reforzados con suturas.

Su modo de acción se basa en una imitación de la fase final de la coagulación sanguínea.

Debido a la acción de la trombina, el fibrinógeno (soluble) en un principio se convierte en monómeros de fibrina que se agregan espontáneamente y forman una masa pegajosa, el llamado coágulo de fibrina. Simultáneamente, el factor XIII (F XIII) presente es activado por la trombina en presencia de iones calcio hasta convertirse en el factor XIIIa. Gracias a este último, los monómeros de fibrina agregados y también la fibronectina posiblemente presente se reticulan formando un polímero pesado debido a la formación de nuevos enlaces peptídicos. Debido a esta reacción de reticulación, la fuerza del coágulo formado aumenta sustancialmente. Por lo general, el coágulo se adhiere bien a la herida y a las superficies tisulares, lo cual implica un efecto adhesivo y hemostático.

Por tanto, los adhesivos de fibrina con frecuencia se utilizan como adhesivos en dos componentes que comprenden el componente fibrinógeno junto con una solución de trombina, que además contiene iones calcio.

Una ventaja especial de un adhesivo de fibrina consiste en que éste no permanece en su sitio de aplicación como un cuerpo extraño, sino que es reabsorbido completamente de la misma manera que durante la cicatrización natural de una herida y es reemplazado por tejido de nueva formación. Diversas células, por ejemplo macrófagos y posteriormente fibroblastos, migran hacia el coágulo, se lisan y reabsorben el material del coágulo y forman tejido nuevo.

Aunque los complicados procedimientos de cicatrización de heridas hasta el momento no están ni mucho menos completamente claros, es indudable que la presencia de fibronectina en el coágulo es de crucial importancia para el crecimiento celular y, por tanto, para la cicatrización.

Un coágulo de fibrina de composición óptima, por tanto, debería también contener fibronectina además de su principal componente, fibrinógeno.

Aunque el modo de acción de los adhesivos de fibrina equivale básicamente al proceso natural de coagulación sanguínea, para que sea lo suficientemente eficaz (fuerza adhesiva, efecto hemostático) es necesaria una concentración sustancialmente superior de componentes activos (en particular de fibrinógeno) de la presente en la sangre, la concentración de fibrinógeno en la sangre humana alcanza aproximadamente 2,5-3 mg/ml.

Se sabe que mediante la precipitación de PEG se puede obtener una solución de fibrinógeno con la que se podría lograr una fuerza adhesiva satisfactoria ya para concentraciones de fibrinógeno inferiores a 30 mg/ml en un sistema de ensayo artificial (WO 92/13495); aun así, no se puede garantizar una alta densidad en la red de fibrina (la cual se logra básicamente mediante altas concentraciones de fibrinógeno en el adhesivo de fibrina) para muchos de los fines de la adhesión tisular.

Por tanto, para garantizar una eficacia óptima, el contenido de fibrinógeno en el adhesivo de fibrina debería ser de al menos 70 mg/ml. No obstante, la producción de dicho fibrinógeno concentrado listo para su uso o la de soluciones adhesivas de fibrina entraña algunas dificultades.

Debido a que las soluciones listas para su uso no permanecen estables almacenadas por períodos largos de tiempo, se han de preparar bajo demanda por reconstitución a partir de preparados liofilizados o por descongelación de soluciones líquidas congeladas.

Debido a la relativamente baja solubilidad del fibrinógeno y a la simultánea alta concentración de fibrinógeno requerida en un adhesivo de fibrina eficaz, en general esto sigue siendo más engorroso y pesado de lo deseado por los usuarios a pesar de se han presentado diversas propuestas de mejora. Es comprensible que, en particular, en el campo de la cirugía de urgencia, se requiera una disponibilidad especialmente rápida y sencilla de un adhesivo de fibrina.

Además, por lo general las soluciones de adhesivo de fibrina concentradas son muy viscosas debido a las altas concentraciones de fibrinógeno. Sin embargo, es aconsejable que la viscosidad sea relativamente baja, no sólo para mejorar su manejo, sino también para determinados modos de aplicación del adhesivo de fibrina, por ejemplo cuando se aplica mediante dispositivos rociadores (como Duploject® con el equipo rociador asociado) o mediante un
catéter.

Ambos requisitos, es decir la rápida disponibilidad y la baja viscosidad de las soluciones de adhesivo de fibrina concentradas, son más difíciles de cumplir si la preparación de las mismas (disolución o descongelación, respectivamente) se ha de efectuar sin más medios auxiliares, tales como equipos de calefacción o de agitación, a temperatura ambiente, y si los preparados de adhesivo de fibrina además contienen sustancias de alto peso molecular, en particular fibronectina. Pues la fibronectina también, especialmente en combinación con fibrinógeno, es relativamente difícil de disolver y por lo general lleva disminuir la solubilidad y a aumentar la viscosidad de los adhesivos de fibrina.

Los métodos para producir preparados que contienen fibrinógeno y que puedan utilizarse como adhesivos tisulares comprenden su producción a partir de crioprecipitados, opcionalmente con un paso posterior de lavado, y etapas de precipitación con etanol, sulfato amónico, polietilenglicol, glicina o \beta-alanina y, su producción a partir de plasma dentro del alcance de los métodos de fraccionamiento de plasma conocidos, respectivamente (fc, por ejemplo: "Methods of plasma protein fractionation", 1980 ed.: Curling Academic Press, páginas 3-15, 33-36, y 57-74, o Blombäck B y M., "Purification of human and bovine fibrinogen", Arkiv Kemi 10, 1959, página 415 y sig.).

En el estado de la técnica anterior ya se encuentran algunas sugerencias para reducir la viscosidad de las soluciones de fibrinógeno altamente concentradas. Así por ejemplo, son conocidas tanto la adición de solubilizantes tales como sustancias que contienen residuos de urea o guanidina, por ejemplo: arginina (fc DE 3203775-A1) o la adición de altas concentraciones de sales no fisiológicas. Sin embargo, se ha demostrado que tales adhesivos tisulares tienen propiedades citotóxicas e inhibidoras de la proliferación, respectivamente (Redl y col., Med. Welt 36, 1985, páginas 769-776)

En el documento EP 0 804 933 se sugiere la adición de sustancias que mejoren la solubilidad del fibrinógeno. Dichas sustancias son, por ejemplo, vitaminas, compuestos aromáticos como los aquellos derivados de benceno o de fenol, o aquellos derivados de compuestos heterocíclicos como piperidina, piridina o pirimidina. El documento WO 95/23167 A describe dos componentes (sal y ácido 6-aminohexanoico) que se añaden a un concentrado de proteínas obtenidas a partir de plasma total congelado donde el ácido 6-aminohexanoico se utiliza para anular la afinidad del plasminógeno hacia el fibrinógeno y no como un agente precipitante.

En el documento EP 0373044 A se describe un concentrado de plasma que se obtiene precipitando plasma con etanol.

El documento EP 0059265 describe una composición para cerrar y cicatrizar heridas que comprende un vehículo de colágeno, fibrinógeno, factor XIII y trombina. La preparación de esta composición incluye la formación de una emulsión mezclando los componentes con etanol y posterior evaporación de éste.

Por tanto, un objeto de la presente invención es eliminar los inconvenientes de los preparados conocidos y además mejorarlos, así como proporcionar composiciones proteínicas que tengan un alto contenido en fibrinógeno y una proporción de fibrinógeno a fibronectina fácilmente ajustable; y opcionalmente otros ingredientes, por ejemplo adecuados para un obtener un adhesivo tisular mejorado listos para su uso, mientras que se mantienen en particular propiedades tales como una buena compatibilidad celular o la formación de una estructura fisiológica de fibrina después de mezclarlo con una solución de trombina. Al mismo tiempo también se han de mejorar las propiedades de viscosidad de tales composiciones proteínicas o preparados farmacéuticos.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método simplificado y más rápido para producir dichas composiciones proteínicas. En particular de forma que también sea posible de realizar fácilmente a escala industrial.

Según la invención, estos objetivos se logran mediante un método de producción de composiciones proteínicas que comprenden fibrinógeno y fibronectina, el cual se caracteriza porque una solución inicial que contiene fibrinógeno y fibronectina se trata con una composición de precipitación que comprende un poliol, en particular polialquilenglicol o un alcohol de hasta cuatro átomos de carbono, en especial etanol, o una sal inorgánica, especialmente sulfato amónico o sulfato de un metal alcalino, y un aminoácido, en particular glicina o alanina, de modo que en una única etapa de precipitación se forma un precipitado que contiene fibrinógeno y fibronectina. Este método se caracteriza porque con la precipitación de la composición mediante una única etapa de precipitación se obtiene una preparación eficaz y que preserva las proteínas y con un alto rendimiento.

Después de la etapa de precipitación única, el precipitado obtenido puede ser procesado posteriormente por métodos conocidos per se, preferiblemente en una preparación farmacéutica, en particular un adhesivo tisular (adhesivo de fibrina).

Mediante un componente modificador de la solubilidad, se entiende una sustancia que tiene un efecto precipitante o un efecto que mejora la solubilidad de al menos una de las proteínas, fibrinógeno o fibronectina, bajo otras condiciones dadas tales como temperatura, pH, fuerza iónica, etc.

Sorprendentemente, según la invención se ha hallado que utilizando dos componentes modificadores de la solubilidad que son diferentes (uno del otro) en cooperación se permite una recuperación de fibrinógeno y fibronectina en el precipitado en grandes cantidades, siendo la etapa de precipitación única de la invención sorprendentemente menos dañina para las proteínas que la precipitación individual de las respectivas sustancias.

Además, también se ha demostrado que una composición precipitada según la invención y que comprende fibrinógeno y fibronectina presenta muchas propiedades muy mejoradas con vistas a su aplicación práctica, en particular en lo que se refiere a su viscosidad y reconstitución, por lo que se hace posible una aplicación más fácil de estas preparaciones.

Como materias primas para preparar la solución inicial, en principio se pueden utilizar todas aquellas que se han venido utilizando hasta el momento o aquellas que son posibles, respectivamente, de la técnica anterior para preparar dichas composiciones proteínicas.

Como materia prima para preparar la solución inicial o para utilizar directamente como solución inicial se emplea preferentemente plasma, en particular plasma humano, o una fracción de plasma que contenga fibrinógeno y fibronectina, preferentemente una fracción derivada de un crioprecipitado, respectivamente.

No obstante, según la invención también se pueden emplear otras materias primas o soluciones iniciales que contengan fibrinógeno y fibronectina, por ejemplo sobrenadantes de cultivos celulares.

Los componentes que modifican la solubilidad se eligen de tal forma que en la etapa de precipitación única se forma un precipitado que contiene fibrinógeno y fibronectina en una proporción predeterminada y deseada.

Según la invención, los componentes contenidos en la composición precipitante se eligen de modo que, bajo determinadas condiciones, difieren unos de otros en términos de su efecto modificador de la solubilidad; es decir, mejora de la solubilidad o de la precipitación, sobre el fibrinógeno y la fibronectina, respectivamente. Por ejemplo, un componente puede tener un efecto precipitador básicamente en solamente una o dos de las proteínas; es decir, sobre el fibrinógeno o sobre la fibronectina.

Sin embargo, también es posible que uno de los componentes tenga un efecto precipitante sobre ambas proteínas, mientras que el otro componente tiene un efecto precipitante en solamente una de las dos proteínas o que incluso aumente la solubilidad de la otra proteína, esto es, que no actúe como un agente precipitante sino como un solubilizante.

En particular, el componente que modifica la solubilidad es una sustancia seleccionada del grupo de los alcoholes, en particular un alcohol de hasta cuatro átomos de carbono, una sal inorgánica, una sal orgánica, un poliol, en particular polialquilenglicol, un poliéster y un aminoácido. También pueden utilizarse ésteres, cetonas y compuestos orgánicos cíclicos, heterocíclicos o policíclicos.

Como componentes que modifican la solubilidad se utilizan, en particular, etanol, polietilenglicol, sales de amonio o alcalinas tales como sulfato de amonio o sulfato alcalino, o los aminoácidos glicina y (\beta-)alanina preferentemente.

Entre los polímeros orgánicos destacan especialmente los polímeros lineales, en particular aquellos que tienen un peso molecular promedio de aproximadamente entre 200 y 20.000, por ejemplo polialquilenglicoles. Se ha comprobado que el polietilenglicol es especialmente apropiado. Estos polímeros sintéticos no tóxicos, solubles en agua, en particular los que tienen un peso molecular entre 400 a 10.000, preferentemente de aproximadamente 4.000, se utilizan con más preferencia en la precipitación debido a su efecto preservante sobre el fibrinógeno y la fibronectina. Además del efecto especialmente preservante y suave de los componentes que han de utilizarse en la composición de precipitación, al seleccionarlos se ha de tener en cuenta su seguridad en lo que se refiere a su uso en
humanos.

Como par de componentes que se pueden utilizar según la invención están por ejemplo, polietilenglicol (PEG), en particular PEG 4000, que tiene una acción precipitante tanto sobre el fibrinógeno como sobre la fibronectina, y como segundo componente glicina, que en presencia de otro componente, por ejemplo polietilenglicol, sorprendentemente no sólo precipita el fibrinógeno preferentemente en comparación con la fibronectina, sino que incluso actúa como solubilizador para la fibronectina. La glicina en un rango de concentración mayor a 0,6 M, concentración a la cual de momento sólo se conoce a la glicina como agente precipitador de proteínas, tiene un efecto particularmente bueno sobre el aumento de la solubilidad de la fibronectina.

Naturalmente, la presente invención no está limitada a las combinaciones PEG y glicina, ya que el experto medio será capaz de encontrar fácilmente también otros componentes o par de componentes apropiados según la invención mediante ensayos sistemáticos sencillos.

Para llevar a cabo el método de la invención, el experto cualificado puede encontrar componentes apropiados o pares de componentes según el siguiente esquema de ensayos.

Bajo condiciones específicas tales como temperatura, pH, fuerza iónica, etc., y bajo agitación, se añaden alícuotas de la solución inicial, preparada por los métodos habituales, a composiciones de precipitación que contienen un primer componente modificador de la solubilidad, por ejemplo un aminoácido, y un segundo componente diferente de ellos, por ejemplo PEG 4000, etanol o sulfato de amonio. Se lleva a cabo una serie de precipitaciones en las que la concentración de uno de los componentes siempre se mantiene constante y la del otro varía. Se centrifugan los precipitados formados y se determina el contenido total de proteínas así como los contenidos relativos de fibrinógeno (Fbg), fibronectina (Fn) y albúmina (Alb); por ejemplo mediante SDS PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS) de las muestras reducidas y no reducidas, tiñendo con azul de Coomassie y realizando una evaluación densio-
métrica.

Entonces se escogen aquellos componentes que llevan a una composición proteínica que contenga el fibrinógeno y fibronectina deseados para la composición de precipitación según la invención. La optimización del sistema de componentes respectivo se efectuará mediante parámetros fáciles de comprobar tales como rendimiento, contenido relativo de fibrinógeno y fibronectina y viscosidad del preparado obtenido a un predeterminado contenido de fibrinógeno (por ejemplo: 70 o 100 mg de fibrinógeno por ml).

En una realización preferente, la composición de precipitación comprende polialquilenglicol, que se añade a la solución inicial, en particular a una concentración final del 1 al 12% w/v, preferentemente del 4 al 8% w/v.

En otra realización preferente, la composición de precipitación comprende uno o más aminoácidos que se añaden a la solución inicial, en particular a una concentración final de 0,5 a 3 M, preferentemente de 0,75 a 2 M, en particular de 0,75 a 1,5 M.

Se puede incluir una sal orgánica o inorgánica, por ejemplo sulfato de amonio, en una concentración de hasta un 20% w/v, preferentemente del 2 al 20% w/v, en particular entre el 5 y el 15% w/v.

La composición de precipitación se añade preferentemente en forma líquida.

También se pueden precipitar otros ingredientes de la materia prima mediante la composición de precipitación, por ejemplo y en particular, factor XIII. La capacidad de la composición modificadora de la solubilidad para coprecipitar dichas sustancias también puede influir en la elección final de los componentes individuales de la composición de precipitación.

Según una realización preferente, se intenta mantener el plasminógeno bien en la composición proteínica precipitada o en la preparación farmacéutica, bastante bajo. Por tanto, se utiliza preferentemente una composición de precipitación en la que el plasminógeno queda en su mayor parte en el sobrenadante, lo que significa que en el precipitado obtenido el plasminógeno está reducido con respecto al fibrinógeno y/o la fibronectina en comparación con la materia prima.

Según otra realización preferente, se pueden añadir otros ingredientes a la composición proteínica, en particular inhibidores de fibrinolisis, factor XIII, antibióticos, factores de crecimiento, analgésicos, agentes antiinflamatorios o mezclas de los mismos. Dichas adiciones se pueden efectuar antes, durante y después del paso de precipitación y preferentemente se realizan después de dicho paso.

En el transcurso de los procesos posteriores, en particular en la formulación final, la composición proteínica según la invención o la preparación farmacéutica según la invención, preferentemente está completamente congelada o liofilizada, especialmente si se ha de lograr una mayor estabilidad durante el almacenaje. La preparación farmacéutica listo para su uso según la presente invención se proporciona preferentemente en forma líquida.

En particular, el método según la invención tiene la ventaja que de se pueden obtener directamente composiciones proteínicas bien definidas de manera sencilla, mientras que los métodos utilizados hasta la fecha de fraccionamiento de proteínas, en especial fraccionamiento de plasma, siempre han tratado de obtener proteínas individuales tan puras como fuera posible, y opcionalmente de mezclarlas de nuevo después, para obtener la mezcla deseada.

Por la simplicidad y la brevedad del método según la invención, también se minimizan los riesgos de contaminación microbiana y de formación de pirógenos durante la producción. Además, las proteínas sensibles del plasma, por ejemplo el fibrinógeno y la fibronectina, quedan preservadas y en buena medida protegidas de una posible desnaturalización, y esta es la razón por la que los preparados según la invención presentan mejores propiedades.

Sorprendentemente se ha demostrado que las composiciones proteínicas o las preparaciones farmacéuticas que se pueden obtener mediante una única etapa de precipitación de la combinación de la invención, a concentraciones igualmente altas de fibrinógeno, tienen aproximadamente una viscosidad un 25% inferior, preferentemente un 30%, en especial un 40% inferior que preparaciones equiparables, por ejemplo los adhesivos de fibrina obtenidos por los métodos de producción tradicionales, en particular por precipitación con un solo agente.

Por preparaciones equiparables se entienden preparaciones que tienen contenidos similares de fibrinógeno y fibronectina, y opcionalmente más ingredientes, y un grado equiparable de pureza, que muestran una similar buena compatibilidad celular y que forman coágulos de estructura de fibrina fisiológica después de mezclarlos con una solución de trombina.

En una realización especialmente preferente, la composición proteínica y el preparado farmacéutico listo para usar no contienen sustancialmente ninguna otra sustancia que mejore la solubilidad del fibrinógeno y tampoco se añaden dichas sustancias al preparado.

Sorprendentemente, se ha demostrado que las composiciones líquidas según la invención tienen una viscosidad marcadamente inferior en comparación con preparaciones equiparables conocidas, por lo cual se facilita especialmente su manejo y la utilización de los adhesivos de fibrina.

En particular a temperatura ambiente, las composiciones liofilizadas según la invención se pueden reconstituir más fácil y rápidamente que otras preparaciones equiparables.

Particularmente, cuando se traslada el método de la invención a gran escala, lo cual es además otra ventaja de la presente invención, éste se puede aplicar a gran escala de forma eficaz y rentable, es preferente añadir la composición de precipitación en forma líquida. Ésta puede ser una solución o una suspensión.

También se ha demostrado que es conveniente que el precipitado obtenido después de la etapa única de precipitación se lave al menos una vez con un tampón de lavado. Además de un adecuado sistema de tampón, el tampón de lavado contiene preferentemente ácido tranexámico, lisina, ácido \varepsilon-aminocaproico, detergentes o mezclas de estas sustancias. También puede contener inhibidores de fibrinolisis o inhibidores de proteasas, de origen plasmático, animal o vegetal, o inhibidores obtenidos por ingeniería genética o sintéticamente, respectivamente. Dichas sustancias se pueden añadir por separado o pueden estar ya en la materia prima.

Un inhibidor de proteasas preferente es, por ejemplo, la aprotinina, en particular la aprotinina preparada por ingeniería genética. Otro inhibidor de fibrinolisis preferente es el ácido tranexámico (ácido trans-4-(aminometil)ciclohexanoico, t-AMCHA).

El precipitado proteínico obtenido puede utilizarse como tal o puede ser procesado posteriormente en una composición proteínica o en una preparación farmacéutica por métodos conocidos per se. Entre tales métodos de procesamiento se encuentran por ejemplo, diversas etapas de purificación tales como tratamiento (lavado) con un tampón de lavado en frío, o la formulación como una preparación farmacéutica, respectivamente.

Estas composiciones o preparados finales de la invención son especialmente adecuados para la adhesión tisular, la hemostasia y para ayudar o acelerar la cicatrización de heridas.

El plasma que preferentemente se utiliza como materia prima en la presente invención es preseleccionado preferiblemente, por ejemplo según el método del documento WO 96/35437, por lo que una contaminación microbiana queda casi excluida del todo. Preferentemente sólo se utiliza materia prima en la que se ha comprobado la ausencia de agentes patógenos, en particular de virus y/o de priones.

En otra realización preferente, se proporciona al menos un paso para inactivar o debilitar posibles agentes patógenos presentes.

Para inactivar los agentes patógenos preferentemente se efectúa un tratamiento tensioactivo y/o térmico (tratamiento en seco o con vapor); por ejemplo un tratamiento térmico en estado sólido, en particular un tratamiento con vapor según EP-0 159 311 o EP 519 901 o EP 674 531.

Otros tratamientos para inactivar agentes patógenos comprenden también el tratamiento con métodos químicos o químico/físicos, por ejemplo con sustancias caotrópicas según los documentos WO 94/13329, DE 4434538 o EP-0131740 (disolvente), o por fotoinactivación.

El debilitamiento mediante filtración, en particular ultrafiltración, preferentemente en presencia de agentes ligantes de virus, por ejemplo Aerosil, también es un método preferente para debilitar los virus dentro del alcance de la presente invención.

Según la invención, la inactivación mediante tratamiento térmico, tratamiento con disolventes, tratamiento con detergentes o combinaciones (simultáneas o consecutivas) de estos tratamientos, así como de manera opcional la filtración, son particularmente preferentes.

La inactivación puede efectuarse antes o después de la filtración. Preferentemente, se efectúan dos inactivaciones independientes, por ejemplo un tratamiento antes de la etapa única de precipitación y un segundo tratamiento después de éste.

En otra realización preferente, la composición proteínica se caracteriza porque contiene el factor XIII. El factor XIII preferentemente es añadido y su contenido es, por ejemplo, de al menos 80 unidades por gramo de fibrinógeno, preferentemente al menos 100 U/g de fibrinógeno. En caso de que también haya sustancias inhibidoras de la reacción de reticulación de fibrina, por ejemplo posibles antibióticos presentes en el preparado, el contenido de factor XIII se aumenta preferentemente a al menos 500 U/g de fibrinógeno. Preferiblemente, el factor XIII se añade como producto purificado inactivado de virus y por separado (es especialmente preferente un preparado de factor XIII producido según el documento EP 0 637 451).

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En otra realización preferente, la composición proteínica se caracteriza por un bajo contenido en plasminógeno. El contenido de plasminógeno es preferentemente de 1,6 mg/g de fibrinógeno a lo sumo, en especial inferior a 0,8 mg/g de fibrinógeno y en particular de menos de 0,3 mg/g de fibrinógeno.

Ventajosamente, la composición proteínica según la invención comprende fibronectina y fibrinógeno en una proporción de entre 0,02 a 0,5, preferentemente de 0,02 a 0,25, también preferentemente de 0,02 a 0,2, en especial de 0,04 a 0,16, en particular de aproximadamente 0,1 (0,05 a 0,15); es decir, a diferencia de los preparados de fibrinógeno muy puros (WO 94/20524), sigue conteniendo cantidades considerables de fibrinógeno.

La composición proteínica puede además comprender ingredientes activos tales como antibióticos, factores de crecimiento, analgésicos o combinaciones de los mismos.

En una realización preferente, la composición proteínica que comprende fibrinógeno y fibronectina en una proporción fibronectina/fibrinógeno de 0,02 a 0,5 según la invención se caracteriza porque

a): como solución contiene al menos 70 mg de fibrinógeno/ml o puede ser reconstituida o licuada en dicha solución,

b): a 20ºC tiene una viscosidad de 350 cSt a lo sumo, preferentemente a una osmolaridad inferior a 500 mOsm, en especial inferior a 400 mOsm,

c): después de mezclarla con una solución trombina-CaCl_{2} forma un coágulo opaco con estructura fisiológica de fibrina y

d): no contiene una adición de una sustancia que mejore la solubilidad que presente un grupo que contenga benceno, piridina, piperidina, pirimidina, morfolina, pirrol, imidazol, pirazol, furano, tiazol o purina.

En otra realización preferente, la composición proteínica según la invención comprende fibrinógeno y fibronectina en una proporción fibronectina/fibrinógeno de 0,02 a 0,5 se caracteriza porque

b): a 20ºC tiene una viscosidad de 150 cSt a lo sumo, preferentemente a una osmolaridad inferior a 500 mOsm, en especial inferior a 400 mOsm,

d): contiene una o varias sustancias solubilizantes con un grupo que contiene benceno, piridina, piperidina, pirimidina, morfolina, pirrol, imidazol, pirazol, furano, tiazol o purina en una concentración total máxima de 150 mM.

Las composiciones proteínicas o las preparaciones farmacéuticas de la invención son versátiles en términos de su utilización. En particular, las preparaciones según la invención se utilizan para la adhesión tisular, la hemostasia y/o la cicatrización de heridas.

En otra realización preferente, las composiciones proteínicas o las preparaciones farmacéuticas de la invención también pueden utilizarse para producir una biomatriz basada en fibrina. Para ello, la composición proteínica o la preparación farmacéutica de la invención se añade con una enzima adecuada para convertir el fibrinógeno en fibrina, preferentemente trombina, y la fibrina formada se utiliza o bien en su estado reciente o bien después de liofilización y rehumidificación como material portador para las células en crecimiento o como la llamada biomatriz (véase por ejemplo WO 99/15209).

La biomatriz de la invención puede estar presente en varias formas, por ejemplo en forma de esponja, en láminas, microperlas o como escamas.

La biomatriz basada en fibrina de la invención es especialmente adecuada para el crecimiento celular, en particular de células humanas. Como ejemplos de células capaces de ser cultivadas o de crecer mediante esta matriz de fibrina se mencionan queratinocitos, fibroblastos, condrocitos. Dicha biomatriz es también apropiada para curar heridas o para sustituir tejido, en particular como sustituto de la piel. Otra realización de la presente invención es una preparación farmacéutica que comprende una composición proteínica según la presente invención.

A continuación se explica con más detalle la invención mediante los siguientes ejemplos y figuras, a los que, sin embargo, no queda restringida.

Fig. 1: muestra la dependencia de la proporción fibronectina/fibrinógeno (Fn/Fbg) en el precipitado sobre la concentración de PEG en la mezcla de precipitación (concentración de glicina: 1 M).

Fig. 2: muestra la dependencia de la proporción fibronectina/fibrinógeno (Fn/Fbg) en el precipitado sobre la concentración de glicina en la mezcla de precipitación (concentración de PEG: 6,5% w/v).

Fig. 3: muestra la dependencia de la proporción fibronectina/fibrinógeno (Fn/Fbg) en el precipitado sobre la concentración de \beta-alanina en la mezcla de precipitación (concentración de etanol: 2% w/v).

Fig. 4: muestra la dependencia de la proporción fibronectina/fibrinógeno (Fn/Fbg) en el precipitado sobre la concentración de sulfato de amonio en la mezcla de precipitación (concentración de \beta-alanina: 1 M).

Fig. 5: muestra la dependencia de la proporción fibronectina/fibrinógeno (Fn/Fbg) en el precipitado sobre la concentración de \beta-alanina en la mezcla de precipitación (concentración de sulfato de amonio: 5% w/v).

Ejemplos

Ejemplo 1

Se disolvió plasma humano crioprecipitado preparado según métodos conocidos per se con una cantidad multiplicada por 4 de una solución tampón que contenía citrato sódico 20 mM, cloruro sódico 120 mM, ácido tranexámico 5 mM, así como 1.200 IU de heparina/l. Se ajustó el pH a 7,3 y se filtró hasta clarificación.

Se añadieron alícuotas de esta solución a la solución que contenía glicina y polietilenglicol 4000 (PEG 4000), agitando a temperatura ambiente, de modo que en cada caso se obtuvo una concentración final 1 M de glicina y concentraciones finales de PEG 4000 que oscilaban entre el 1 y el 10% (w/v).

Se centrifugaron los precipitados formados y se determinó el contenido relativo de fibrinógeno (Fbg), de fibronectina (Fn) y de albúmina (Alb) mediante SDS PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS) de las muestras reducidas y no reducidas, tiñendo con azul de Coomassie y realizando una evaluación densiométrica (véase también EP 0 345 246, Ejemplos 1-37).

En la Tabla 1 se resumen los resultados; la proporción fibronectina/fibrinógeno con respecto a la concentración PEG se representa gráficamente también en la Fig. 1.

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TABLA 1 Dependencia de la composición proteínica del precipitado sobre el contenido de PEG en la mezcla de precipitación (concentración de glicina 1 M)

% (w/v) PEG	% Proteína	% Proteína	% Proteína	Fibronectina/
	Fibrinógeno	Fibronectina	Albúmina	Fibrinógeno
1	84	3	5	0,04
2	83	4	5	0,05
3	82	5	4	0,06
4	81	7	4	0,09
5	80	8	4	0,10
6	78	9	3	0,12
7	77	10	3	0,13
8	76	11	3	0,15
9	75	13	2	0,17
10	74	14	2	0,19

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El ejemplo muestra cómo se pueden obtener los precipitados de proteínas según la invención a partir de una mezcla de proteínas plasmáticas mediante una única precipitación con una mezcla de dos componentes (aquí, glicina y PEG), cuyos precipitados proteínicos contienen cantidades variables de fibrinógeno además del principal componente, fibrinógeno, donde la proporción fibronectina/fibrinógeno se puede ajustar como se desee dentro de determinados limites (por ejemplo eligiendo los agentes según el Ejemplo 1 en un rango de 0,02-0,2), eligiendo de forma adecuada las concentraciones de agentes y la proporción de unos con respecto a otros, respectivamente. Dichos precipitados proteínicos son adecuados, por ejemplo, para la producción de adhesivos tisulares basados en fibrinógeno (adhesivos de fibrina).

Ejemplo 2

Se disolvió plasma humano crioprecipitado de manera similar al Ejemplo 1, se ajustó el pH a 7,3 y se filtró hasta clarificación. Se añadieron alícuotas de esta solución de forma similar al Ejemplo 1 con soluciones que contenían glicina y PEG 4000, de modo que en cada caso se obtuvo una concentración final de 6,5% (w/v) de PEG, y concentraciones finales de glicina que oscilaban entre 0,2 y 1 M. Se centrifugaron los precipitados formados de manera análoga al Ejemplo 1 y se analizaron.

En todas las variantes, la producción de proteína fue del 95%. La proporción fibronectina/fibrinógeno con respecto a la concentración de glicina se resume en la Tabla 2 y además se representa gráficamente en la Fig. 2.

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TABLA 2 Dependencia de la composición proteínica del precipitado sobre el contenido de glicina en la mezcla de precipitación (concentración PEG 6,5% w/v)

Mol/l de glicina	Fibronectina/Fibrinógeno
0,2	0,16
0,4	0,16
0,6	0,16
0,8	0,14
1,0	0,11

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Complementando al Ejemplo 1, este ejemplo muestra que los agentes de precipitación de proteínas conocidos per se, tales como glicina, de ningún modo actúan solamente como agentes de precipitación cuando de utilizan en combinación con PEG, sino que, bajo determinadas condiciones, la glicina, puede actuar por ejemplo como solubilizador de fibronectina, dándose esta circunstancia en una concentración en la que hasta el momento sólo era conocida la glicina como agente de precipitación de la proteína.

Los siguientes Ejemplos 3-5 presentan composiciones de preparados equiparables obtenidas según el estado de la técnica anterior.

Ejemplo 3

Se disolvió un crioprecipitado de plasma como en el Ejemplo 1. Mientras se agitaba a temperatura ambiente, se añadió glicina hasta una concentración final de 2 mol/l. Se centrífugo el precipitado proteínico formado y se analizó como en el Ejemplo 1. El fibrinógeno había precipitado casi completamente. El contenido relativo de fibrinógeno ascendía al 86% de la cantidad total de proteínas, el contenido relativo de fibronectina era del 1,5%. La proporción fibronectina/fibrinógeno era, por tanto, 0,017.

Ejemplo 4

Se disolvió un crioprecipitado de plasma como en el Ejemplo 1. Mientras se agitaba a temperatura ambiente, se añadió PEG 4000 hasta una concentración final del 10% (w/v). Se centrífugo el precipitado proteínico formado y se analizó como en el Ejemplo 1. El fibrinógeno había precipitado casi completamente. El contenido relativo de fibrinógeno ascendía al 72% de la cantidad total de proteínas, el contenido relativo de fibronectina era del 16%. La proporción fibronectina/fibrinógeno era, por tanto, 0,22.

Ejemplo 5

Se disolvió un crioprecipitado de plasma como en el Ejemplo 1. Mientras se agitaba a temperatura ambiente, se añadió PEG 4000 hasta una concentración final del 10% (w/v). Se centrífugo el precipitado proteínico formado, se disolvió de nuevo y se añadió glicina a la solución en una concentración final de 2 M, mientras se agitaba a temperatura ambiente. Se centrífugo de nuevo el precipitado proteínico formado y se analizó como en el Ejemplo 1. El contenido relativo de fibrinógeno ascendía al 93% de la cantidad total de proteínas, el contenido relativo de fibronectina era del 1,5%. La proporción fibronectina/fibrinógeno era, por tanto, 0,016.

Los Ejemplos 3-5 muestran que con los métodos conocidos del estado de la técnica anterior no es posible llegar, en un paso o incluso en varios pasos consecutivos, a mezclas de proteínas que tengan una proporción determinada de fibronectina/fibrinógeno, como cuando, por ejemplo, se utiliza una combinación de glicina y PEG en las concentraciones utilizadas en el Ejemplo 1 o 2, para llegar a una proporción que oscila entre 0,02 y 0,2.

Ejemplo 6

Producción de un preparado liofilizado según la invención, con dos etapas independientes de inactivación del virus

Se disolvió plasma humano crioprecipitado preparado según métodos conocidos per se con una cantidad multiplicada por 4 de una solución tampón (LP1) que contenía citrato sódico 20 mM, cloruro de sodio 120 mM, ácido tranexámico 5 mM (t-AMCHA), así como 1.200 IU de heparina/l y se filtró hasta clarificación. Posteriormente se llevó a cabo el denominado tratamiento con disolvente/detergente (SD) para inactivar los posibles virus envueltos presentes. Para ello, se añadió una mezcla de Tritón X-100, Tween 80 (Polisorbato-80K) y tri-n-butilfosfato (TNBP) para dar concentraciones finales del 1%, 0,3% y 0,3% (v/v) respectivamente. Después de agitar durante 1 hora a temperatura ambiente, se filtró de nuevo hasta clarificación. Se añadió la solución con un mismo volumen de una solución que contenía glicina 2 M y PEG 4000 al 13% (w/v) (composición de precipitación) agitando a temperatura ambiente durante 30 minutos y se centrífugo. Se molió el sedimento y se disolvió de nuevo en LP1 que contenía Tween 80 al 1%, y se repitió la precipitación del mismo modo. Para eliminar el SD y los reactivos de precipitación, se molió el sedimento y se trató en frío (0-2ºC) 2 veces con una cantidad multiplicada por 10 de una solución tampón que contenía Na_{3}-citrato 10 mM y t-AMCHA 5 mM en presencia de pequeñas cantidades de Tween 80. Luego se disolvió el sedimento lavado en una solución tampón que contenía Na_{3}-citrato 10 mM y t-AMCHA 5 mM. Después de ajustar la concentración de proteínas a 40 g/l, se liofilizó la solución en conjunto. Para efectuar una ulterior inactivación de virus, el material liofilizado se ajustó a una humedad residual del 7-8% y se calentó durante 10 horas a 60ºC más 1 hora a 80ºC bajo exclusión de oxígeno. Se disolvió el liofilizado así tratado en una solución de niacinamida 20 mM con una concentración de proteínas de 38 g/l, se mezcló con 6 g de albúmina humana pasteurizada/l y se ajustó el pH
a 7,3.

Se esterilizó por filtración la solución, se colocó en recipientes finales de 5,0 ml (pequeñas botellas de cristal) bajo condiciones estériles y se liofilizó.

El producto final así obtenido constituía una solución lista para usar cuando se disolvió con 2,0 ml de agua para inyección (WFI) o con 2,0 ml de una solución de t-AMCHA 50 mM, con un contenido en fibrinógeno de más de 70 mg/ml. Esta solución, por ejemplo, se puede utilizar como adhesivo para tejidos.

En principio, en lugar de utilizar agua pura también se puede disolver el producto final liofilizado en soluciones acuosas que contengan sustancias activas adicionales, por ejemplo inhibidores de fibrinolisis, factor de coagulación XIII, antibióticos, factores de crecimiento, analgésicos, etc.

El producto obtenido según el método arriba descrito se correspondía en su contenido de proteínas y composición básicamente con la preparación de adhesivo para tejidos descrita en el documento EP 804933 A2 (Ejemplo 2). La proporción fibronectina/fibrinógeno era aproximadamente 0,09, el contenido en plasminógeno de aproximadamente 0,15 mg/g de fibrinógeno. Después de mezclar la solución de adhesivo tisular lista para su uso con un volumen igual de una solución de trombina-CaCl_{2}, se formaron coágulos fisiológicos, opacos viscoelásticos.

A pesar de la amplia concordancia con el producto descrito en el documento EP 804933, el adhesivo tisular según la invención se caracteriza por tener una marcada viscosidad inferior, con un contenido idéntico de una sustancia que mejora la solubilidad del fibrinógeno (50 mM niacinamida).

Esto es al menos sorprendente, ya que el preparado según la invención no había sido sometido a una, sino a dos etapas de inactivación de virus independientes; y además, el tratamiento con vapor se había llevado a cabo en peores condiciones (10 horas, 60ºC más 1 hora a 80ºC). Según la experiencia, dicho tratamiento térmico conduce a una peor solubilidad y una mayor viscosidad.

De este modo, sorprendentemente, se ha descubierto que el t-AMCHA, además de su efecto antifibrinolítico conocido, reduce la viscosidad de las soluciones que contienen fibrinógeno. En particular, el t-AMCHA reduce además la viscosidad de las soluciones de adhesivo para tejidos obtenidas según la invención (véase Tabla 3).

TABLA 3 Viscosidad (cSt) en presencia de niacinamida 50 mM

Temperatura	Adhesivo tisular según	Adhesivo tisular según	Adhesivo tisular según
(ºC)	la invención	la invención	EP 804933A2
		+ t-AMCHA 50 mM	(Ejemplo 2)
20	99	78	277
25	76	63	132
30	56	52	81
37	39	34	53

Ejemplo 7

Producción de un adhesivo tisular totalmente congelado según la invención con dos etapas independientes de inactivación de virus

Hasta la esterilización por filtración, la producción se llevó a cabo de manera semejante al Ejemplo 6. Posteriormente, se liofilizó una vez más la solución esterilizada por filtración bajo condiciones estériles, se disolvió en una solución de adhesivo para tejidos concentrada, se rellenó en recipientes finales (jeringuillas desechables) y se almacenó totalmente congelada. Antes de usarse, solamente es necesario descongelarla.

La solución de adhesivo para tejidos lista para su uso tenía las mismas propiedades que la preparación disuelta del Ejemplo 6.

Antes de liofilizar de nuevo la solución de adhesivo para tejidos diluida y esterilizada por filtración y de disolverla en estado concentrado, también se puede evaporar directamente a vacío suave en una solución de adhesivo para tejidos concentrada.

Método para medir la viscosidad

Para estandarizar el método de medición, inicialmente se congela una muestra de la solución de adhesivo para tejidos a \leq -20ºC. Para determinar su viscosidad, se descongela la muestra al baño maria a la temperatura de medida deseada, se incuba durante aproximadamente 30 minutos a esa temperatura y luego se determina su viscosidad en un viscosímetro capilar de temperatura controlada.

Posteriormente, se puede incubar la muestra a mayor temperatura en el viscosímetro, y se puede repetir la medida a dicha temperatura. Las medidas individuales se efectúan en serie de temperaturas cada vez mayores. Si se miden en la secuencia invertida, se podrían obtener valores falsos (demasiado bajos), ya que el equilibrio solamente se logra lentamente a temperaturas cada vez menores.

Ejemplo 8

Se disolvió un crioprecipitado plasmático como en el Ejemplo 1, se ajustó el pH a 7,3 y se filtró hasta clarificación. De manera semejante al Ejemplo 1, se añadieron alícuotas de esta solución a soluciones que contenían \beta-alanina y etanol, aunque no a temperatura ambiente, sino a 0ºC, de manera que en cada caso se obtuvo una concentración de etanol del 2% (v/v), y diferentes concentraciones de \beta-alanina en un rango de 0-1 M. Se centrifugaron los precipitados formados de forma semejante al Ejemplo 1 y se analizaron. En la Fig. 3 se representa gráficamente la proporción Fn/Fbg dependiente de la concentración de \beta-alanina.

TABLA 4 Dependencia de la composición proteínica del precipitado sobre el contenido de \beta-alanina en la mezcla de precipitación (concentración de etanol: 2%)

\beta-alanina (M)	Fn/Fbg
0,0	0,43
0,2	0,34
0,4	0,30

(Continuación)

\beta-alanina (M)	Fn/Fbg
0,6	0,26
0,8	0,25
1,0	0,23

De manera semejante al Ejemplo 2, este ejemplo muestra que los agentes de precipitación de proteínas conocidos per se, como \beta-alanina, cuando se utilizan en combinación con etanol, no actúan de ningún modo solamente como agentes de precipitación, sino que también pueden actuar, bajo determinadas condiciones de \beta-alanina, como solubilizadores de fibrinógeno.

Los siguientes Ejemplos 9-11 muestran composiciones de preparados equiparables obtenidos según el estado de la técnica anterior.

Ejemplo 9

Se disolvió un crioprecipitado plasmático como en el Ejemplo 1. Se añadió \beta-alanina, agitando a 0ºC, hasta obtener una concentración final de 2 M. Se centrífugo el precipitado de proteínas formado y se analizó como en el Ejemplo 1. El contenido relativo de fibrinógeno ascendía al 74% del total de proteínas, el contenido relativo de fibronectina era del 16%. La proporción Fn/Fbg era, por tanto, 0,22.

Ejemplo 10

Se disolvió un crioprecipitado plasmático como en el Ejemplo 1. Se añadió etanol, agitando a 0ºC, hasta obtener una concentración final del 2% (v/v). Se centrífugo el precipitado de proteínas formado y se analizó como en el Ejemplo 1. El contenido relativo de fibrinógeno ascendía al 67% del total de proteínas, el contenido relativo de fibronectina era del 29%. La proporción Fn/Fbg era, por tanto, 0,43.

Ejemplo 11

Se disolvió un crioprecipitado plasmático como en el Ejemplo 1. Se añadió etanol, agitando a 0ºC, hasta obtener una concentración final del 2% (v/v). Se centrífugo el precipitado de proteínas formado, se disolvió de nuevo y se añadió \beta-alanina a la solución agitando a 0ºC hasta obtener una concentración de 2 M. Se centrífugo el precipitado de proteínas formado de nuevo y se analizó como en el Ejemplo 1. El contenido relativo de fibrinógeno ascendía al 77% del total de proteínas, el contenido relativo de fibronectina era del 16%. La proporción Fn/Fbg era, por tanto, 0,21.

Los Ejemplos 9-11 muestran que con los métodos conocidos del estado de la técnica anterior no es posible, en una etapa e incluso en varias etapas consecutivas, llegar a mezclas de proteínas que tengan proporciones definidas Fn/Fbg como cuando se utiliza, por ejemplo, una combinación de \beta-alanina y etanol en las concentraciones utilizadas en el Ejemplo 8, para llegar a una proporción que oscile entre 0,23-0,34.

Ejemplo 12

Se disolvió un crioprecipitado plasmático como en el Ejemplo 1, se ajustó el pH a 7,3 y se filtró hasta clarificación. De manera semejante al Ejemplo 1, se añadieron alícuotas de esta solución a soluciones que contenían \beta-alanina y sulfato de amonio, de manera que, en cada caso, se obtuvo una concentración de \beta-alanina 1 M y diferentes concentraciones de sulfato de amonio en un rango entre 5-15% (w/v). Se centrifugaron los precipitados formados de manera semejante al Ejemplo 1 y se analizaron. En la Tabla 5 se resumen los resultados; en la Fig.4 se representa gráficamente la proporción Fn/Fbg dependiente de la concentración de sulfato de amonio.

TABLA 5 Dependencia de la composición proteínica del precipitado sobre el contenido de sulfato de amonio en la mezcla de precipitación (concentración de \beta-alanina: 1 M)

% (w/v) de sulfato de amonio	(% de Proteínas) Fbg	(% de Proteínas) Fn	(% de Proteínas) Alb	Fn/Fbg
5	69	5	0	0,07
10	78	12	0	0,15
15	78	16	0	0,21

De manera similar al Ejemplo 1, este ejemplo muestra cómo se pueden obtener los precipitados de proteínas a partir de una mezcla de proteínas plasmáticas mediante una única precipitación con una composición de precipitación de dos componentes (aquí \beta-alanina y sulfato de amonio), cuyos precipitados proteínicos contienen cantidades variables de fibronectina, donde la proporción fibronectina/fibrinógeno se puede ajustar como se desee dentro de determinados limites (por ejemplo por selección de los componentes según el Ejemplo 12 en una escala que va de 0,07 a 0,21); mediante la elección adecuada de las concentraciones de los componentes y la proporción de unos con respecto a otros, respectivamente.

Ejemplo 13

Se disolvió un crioprecipitado plasmático como en el Ejemplo 1, se ajustó el pH a 7,3 y se filtró hasta clarificación. De manera semejante al Ejemplo 1, se añadieron alícuotas de esta solución a soluciones que contenían \beta-alanina y sulfato de amonio, de manera que, en cada caso, se obtuvo una concentración de sulfato de amonio del 5% (w/v), y diferentes concentraciones de \beta-alanina en un rango entre 0,6-1,4 M. Se centrifugaron los precipitados formados de manera semejante al Ejemplo 1 y se analizaron. En la Fig.5 se representa gráficamente la proporción Fn/Fbg con relación a la concentración de \beta-alanina.

TABLA 6 Dependencia de la composición proteínica del precipitado con el contenido de \beta-alanina en la mezcla de precipitación (concentración de sulfato de amonio: 5%)

\beta-alanina (M)	Fn/Fbg
0,6	0,19
1,0	0,07
1,4	0,04

De manera semejante al Ejemplo 2, este ejemplo muestra que los agentes de precipitación de proteínas conocidos per se, como \beta-alanina, cuando se utilizan en combinación con sulfato de amonio, no actúan de ningún modo solamente como agentes de precipitación, sino que también pueden actuar, en determinadas condiciones, con \beta-alanina, como solubilizadores de fibrinógeno.

Los siguientes Ejemplos 14-16 muestran composiciones de preparados equiparables obtenidos según el estado de la técnica anterior.

Ejemplo 14

Se disolvió un crioprecipitado plasmático como en el Ejemplo 1. Se añadió \beta-alanina, agitando a temperatura ambiente hasta obtener una concentración final 2 M. Se centrífugo el precipitado de proteínas formado y se analizó como en el Ejemplo 1. El contenido relativo de fibrinógeno ascendía al 82% del total de proteínas, el contenido relativo de fibronectina era del 1%. La proporción Fn/Fbg era, por tanto, 0,01.

Ejemplo 15

Se disolvió un crioprecipitado plasmático como en el Ejemplo 1. Se añadió sulfato de amonio, agitando a temperatura ambiente hasta obtener una concentración final del 15% (w/v). Se centrífugo el precipitado de proteínas formado y se analizó como en el Ejemplo 1. El contenido relativo de fibrinógeno ascendía al 76% del total de proteínas, el contenido relativo de fibronectina era del 16%. La proporción Fn/Fbg era, por tanto, 0,21.

Ejemplo 16

Se disolvió un crioprecipitado plasmático como en el Ejemplo 1. Se añadió sulfato de amonio, agitando a temperatura ambiente hasta obtener una concentración final del 5% (w/v). Se centrífugo el precipitado de proteínas formado, se disolvió de nuevo y se añadió \beta-alanina a la solución agitando a temperatura ambiente hasta obtener una concentración final 2 M. Se centrífugo de nuevo el precipitado de proteínas formado y se analizó como en el Ejemplo 1. El contenido relativo de fibrinógeno ascendía al 84% del total de proteínas, el contenido relativo de fibronectina era del 1%. La proporción Fn/Fbg era, por tanto, 0,01.

Los ejemplos 14-16 muestran que con los métodos conocidos del estado de la técnica anterior no es posible llegar, en una etapa o incluso en varias etapas consecutivas, a mezclas de proteínas que tengan una proporción determinada de fibronectina/fibrinógeno, como cuando, por ejemplo, se utiliza, una combinación de \beta-alanina y sulfato de amonio en las concentraciones utilizadas en el Ejemplo 13, para llegar a una proporción que oscila entre 0,04-0,19.

Claims

1. Método para producir composiciones proteínicas que comprenden fibrinógeno y fibronectina, caracterizado porque la solución inicial que contiene fibrinógeno y fibronectina se trata con una composición de precipitación que comprende una combinación de

a): un poliol, en particular, un polialquilenglicol, o

b): un alcohol de hasta cuatro átomos de carbono, especialmente etanol, o

c): una sal orgánica, especialmente sulfato de amonio o de un metal alcalino y

un aminoácido, en particular glicina o alanina, de manera que en una única etapa de precipitación se forma un precipitado que contiene fibrinógeno y fibronectina.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el precipitado de la composición proteínica es formulado en una preparación farmacéutica, en particular en un adhesivo para tejidos, por métodos conocidos per se.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque como matera prima para preparar la solución inicial se utiliza plasma, en particular plasma humano o una fracción de plasma que comprende fibrinógeno y fibronectina, preferentemente una solución derivada de un crioprecipitado.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la composición de precipitación comprende un polialquilenglicol y el polialquilenglicol se añade a la solución inicial hasta una concentración final de entre el 1 y el 12% w/v.

5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque el polialquilenglicol se añade a la solución inicial hasta una concentración final de entre el 4 y el 8% w/v.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los aminoácidos se añaden a la solución inicial en una concentración final entre 0,5 a 3 M, preferentemente entre 0,75 a 2 M.

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque los aminoácidos se añaden en una concentración final comprendida entre 0,75 a 1,5 M.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la composición de precipitación se añade en forma líquida.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se utiliza una composición de precipitación en la que el plasminógeno es reducido con respecto al fibrinógeno y/o fibronectina, en comparación con la materia prima, en el precipitado.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque también los ingredientes adicionales de la materia prima, en particular factor XIII, precipitan mediante una composición de precipitación.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque se comprueba la ausencia de agentes patógenos, en particular de virus y/o priones, en la materia prima y/o en la solución inicial.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque se realiza al menos un paso para inactivar o debilitar posibles agentes patógenos presentes antes o después de la precipitación.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque para la inactivación se efectúa un tratamiento térmico, un tratamiento con un disolvente, un tratamiento con un detergente o una combinación de dichos tratamientos.

14. Método según la reivindicación 12 o 13, caracterizado porque el debilitamiento se realiza mediante filtración, en particular ultrafiltración, preferentemente en presencia de agentes ligantes virales.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque los ingredientes adicionales, en particular inhibidores de fibrinolisis, factor XIII, antibióticos, factores de crecimiento, analgésicos, agentes antiinflamatorios o mezclas de los mismos, se añaden a la composición proteínica después de la etapa única de precipita-
ción.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque la composición proteínica o la preparación farmacéutica se congela completamente o se liofiliza en el transcurso de procesos posteriores.

17. Composición proteínica que comprende fibrinógeno o fibronectina en una proporción fibronectina/fibrinógeno comprendida entre 0,02 a 0,5, caracterizada porque

a): como solución contiene al menos 70 mg de fibrinógeno/ml o puede ser reconstituida o licuada, respectivamente, en dicha solución

b): a 20ºC tiene una viscosidad máxima de 350 cSt, preferentemente a una osmolaridad inferior a 500 mOsm, en especial inferior a 400 mOsm,

c): después de mezclarla con una solución de trombina-CaCl_{2} forma un coágulo opaco con estructura fisiológica de fibrina y

d): no contiene una adición de una sustancia que mejore la solubilidad con un grupo que contenga benceno, piridina, piperidina, pirimidina, morfolina, pirrol, imidazol, pirazol, furano, tiazol o purina.

18. Composición proteínica que comprende fibrinógeno y fibronectina en una proporción fibronectina/fibrinógeno de 0,02 a 0,5 caracterizada porque

b): a 20ºC tiene una viscosidad máxima de 150 cSt, preferentemente a una osmolaridad inferior a 500 mOsm, en especial inferior a 400 mOsm,

c): después de mezclarla con una solución de trombina-CaCl_{2} forma un coágulo opaco con estructura fisiológica de fibrina y contiene una o varias sustancias solubilizantes con un grupo que contiene benceno, piridina, piperidina, pirimidina, morfolina, pirrol, imidazol, pirazol, furano, tiazol o purina en una concentración total máxima de 150 mM.

19. Composición proteínica según la reivindicación 17 o 18, caracterizada porque se puede obtener según un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

20. Composición proteínica según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizada porque está presente en forma liofilizada, líquida o líquida totalmente congelada.

21. Composición proteínica según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, caracterizada porque al menos contiene un inhibidor de fibrinolisis.

22. Composición proteínica según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, caracterizada porque contiene factor XIII.

23. Composición proteínica según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, caracterizada porque la proporción fibronectina/fibrinógeno está comprendida entre 0,02 a 0,25, preferentemente también entre 0,02 a 0,2, en especial entre 0,04 a 0,16, en particular de 0,1.

24. Composición proteínica según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, caracterizada porque su contenido en plasminógeno es a lo sumo de 1,6 mg/g de fibrinógeno, preferentemente inferior a 0,8 mg/g de fibrinógeno, en especial inferior a 0,3 mg/g de fibrinógeno.

25. Composición proteínica según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, caracterizada porque contiene sustancias activas, factores de crecimiento o analgésicos o combinaciones de los mismos.

26. Utilización de una composición proteínica según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25 para la preparación de un medicamento para la adhesión de tejidos, la hemostasia y/o para cicatrizar heridas.

27. Utilización de una composición proteínica según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 26 para producir un material vehículo basado en fibrina para el crecimiento de celular (biomatriz).

28. Utilización según la reivindicación 27, caracterizada porque la biomatriz se forma como una lámina, un no tejido y/o como una esponja.

29. Utilización según la reivindicación 27 o 28, caracterizada porque la biomatriz es apropiada para el crecimiento de células, en particular de células humanas.

30. Utilización de la biomatriz según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29 para la preparación de un medicamento para curar heridas y/o como sustituto de tejidos, en particular como sustituto de la piel.

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31. Biomatriz que se puede obtener a partir de una composición proteínica según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25.

32. Preparación farmacéutica que comprende una composición proteínica según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 26.