ES2263147T3 - Transfusion plaquetaria. - Google Patents

Abstract

UN METODO DE INHIBIR REFRACTARIEDAD EN TRANSFUSION DE PLAQUETAS DE TERCERA PARTE QUE COMPRENDE ADMINISTRAR PLAQUETAS A UN PACIENTE CUYOS POLIPEPTIDOS DE GLUCOPROTEINA IB(ALFA) DE PLAQUETA EXPRESADOS A PARTIR DEL DNA DEL PACIENTE HAN SIDO DETERMINADOS PARA TENER RESIDUOS DE TREONINA O METIONINA, O AMBOS, EN LA POSICION 145 DEL RESIDUO DE SU AMINO ACIDO, TENIENDO DICHAS PLAQUETAS DE TERCERA PARTE EXPRESADOS EN LA POSICION 145 DEL RESIDUO DE SU POLIPEPTIDO DE GLUCOPROTEINA IB(ALFA) AMINO ACIDOS QUE SON LOS MISMOS QUE LOS EXPRESADOS SOBRE LOS POLIPEPTIDOS DE GLUCOPROTEINA IB(ALFA) DE LAS PLAQUETAS DEL PACIENTE. TAMBIEN, UN ANTICUERPO, O UN FRAGMENTO DE EL, EN FORMA SUSTANCIALMENTE PURA QUE TIENE COMO SU EPITOPE UN DOMINIO DE GLUCOPROTEINA IB(ALFA), LA AFINIDAD DE DICHO ANTICUERPO, O FRAGMENTO DE EL, PARA DICHO EPITOPE SIENDO DEPENDIENTE DE LA IDENTIDAD DEL RESIDUO AMINO ACIDO DE LA POSICION 145 DE DICHA GLUCOPROTEINA. ADICIONALMENTE, EN UN PROCESO PARA ALMACENAR UN SUMINISTRO DE PLAQUETAS PARAUSO TERAPEUTICO EN UN PACIENTE, LA MEJORA COMPRENDE SEGREGAR DICHAS PLAQUETAS EN TRES ACUMULACIONES DEPENDIENDO DE SI EL RESIDUO 145 DE POLIPEPTIDOS IB(ALFA) DE GLUCOPROTEINA DE DICHAS PLAQUETAS INCLUYE (A) TREONINA, (B) METIONINA, O (C) AMBAS TREONINA Y METIONINA. TAMBIEN, UN METODO DE INMUNOENSAYO QUE COMPRENDE PONER EN CONTACTO UNA MUESTRA DE SANGRE, O UNA COMPOSICION DERIVADA DE ELLA, CON FORMA THR O MET 145 HALOANTIGENICA DE GLUCOPROTEINA IB(ALFA), O UN FRAGMENTO DE ELLA, QUE CONTIENE DICHA POSICION THR/MET145, Y DETERMINAR SI ESTA PRESENTE UN COMPLEJO DE ANTICUERPO Y UNA FORMA DE DICHA GLUCOPROTEINA O UN FRAGMENTO DE ELLA.

Description

Transfusión plaquetaria.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la aportación a los pacientes de productos de sangre que minimizan tanto el reconocimiento como la respuesta frente a ellos por parte del sistema inmune del destinatario.

La función fundamental del sistema inmune del cuerpo humano incluye la detección de macromoléculas ajenas que han invadido el organismo (tales como aquellos producidos por o unidos a un microorganismo), distinguiéndoles de las moléculas producidas por el cuerpo (moléculas propias) y produciendo después células y moléculas (anticuerpos) específicas que se combinan con las macromoléculas ajenas para inactivarlas y finalmente destruirlas.

El sistema inmune funciona en parte mediante el mantenimiento de un repertorio de células, cada una de ellas capaz de producir un anticuerpo específico que se une a una macromolécula ajena específica, estando dicha macromolécula libre en solución o unida a una célula ajena. Un anticuerpo es una proteína que se une específicamente a una macromolécula ajena a nivel de un epítopo incluido en ella, lo que conduce a la inactivación de la macromolécula que contiene el epítopo. Un epítopo es un dominio estructural o una subregión de la macromolécula que tiene una estructura única (por ejemplo, una determinada distribución de cargas y conformación) que es reconocida y fijada como objetivo por el sistema inmune. Normalmente, los epítopos de las moléculas propias no son reconocidos, es decir, el sistema inmune no les identifica como estructuras ajenas frente a las cuales se tiene que generar una defensa.

Para que su funcionamiento sea eficaz, el sistema inmune tiene que ser sensible, es decir, tiene que ser capaz de detectar aquellas diferencias en la estructura (que son muchas veces muy sutiles) entre "moléculas propias" y "moléculas ajenas". Estas diferencias pueden incluir sustituciones de aminoácidos en proteínas y/o diferencias en el tipo u orientación de componentes de carbohidratos y lípidos unidos a las macromoléculas, incluyendo proteínas, glicoproteínas, glicolípidos y lipoproteínas.

A veces es clínicamente deseable dar a un paciente que ha sufrido pérdida de sangre asociada con cirugía o heridas productos de sangre ajenos incluyendo células tales como, por ejemplo, una transfusión de productos de sangre recogidos a partir de uno o más donantes. Un tipo de producto de sangre terapéutico comprende las plaquetas. Las plaquetas son estructuras similares a células, no nucleadas, discoideas, que tienen un diámetro de 2-5 micrómetros y que se derivan de células sanguíneas megacariocíticas. Son cruciales para la formación de coágulos, siendo asimismo necesarias para curar una herida en un vaso sanguíneo y a menudo se administran a los pacientes para facilitar la formación de coágulos.

Se cree que las plaquetas participan en la formación de coágulos como se describe a continuación. La restricción o la terminación del flujo sanguíneo dentro del sistema circulatorio en respuesta a una herida implica una serie compleja de reacciones que se pueden dividir en dos procesos, hemostasis primaria y secundaria.

La hemostasis primaria se refiere al proceso de recubrimiento de plaquetas o de formación de coágulos blandos. La hemostasis primaria eficaz se realiza mediante adhesión plaquetaria, es decir, la interacción de una plaqueta con la superficie de endotelio vascular dañado sobre el cual se exponen fibras de colágeno subyacentes y/o otras macromoléculas adhesivas tales como proteoglucanos y glicosaminoglucanos a los cuales se unen las plaquetas; y la agregación plaquetaria.

La hemostasis secundaria implica el refuerzo o entrecruzamiento del coágulo blando de plaquetas. Este procedimiento secundario se inicia por proteínas que circulan en el plasma (factores de coagulación) que se activan durante la hemostasis primaria en respuesta a una herida. La activación de estos factores resulta finalmente en la producción de una matriz polimérica de la proteína fibrinógeno (entonces denominado "fibrina") que refuerza el coágulo blando.

Sin embargo, existen problemas potenciales asociados con la administración de productos de sangre de una tercera parte al paciente que los necesita. Se ha reconocido que existe una variación genética natural en el ADN de los individuos que codifica los componentes proteicos de los productos sanguíneos, incluyendo aquellos que contienen plaquetas, o que codifica la proteína que cataliza el ensamblaje de dichos componentes macromoleculares, determinando por tanto su estructura. El sistema inmune de un individuo puede responder a las diferencias resultantes, tales como sustituciones de aminoácidos en proteínas interpretando que definen de epítopos ajenos. El rechazo del transplante de órganos es un resultado bien conocido de dicha respuesta. De acuerdo con esto, los productos de sangre son rutinariamente tipados, es decir, examinados en busca de determinados epítopos dentro de sus macromoléculas para mi-
nimizar la potencial respuesta adversa del sistema inmune de un destinatario a los productos sanguíneos de un donante.

Los grupos más ampliamente reconocidos de epítopos frente a los cuales los productos de sangre son tipados son: (A) el sistema ABO que se basa en las diferencias en el carbohidrato unido a las moléculas lipídicas grandes insertadas en la membrana plasmática de los glóbulos rojos y también de las plaquetas; y (B) los antígenos Rh. Aunque existe un número de epítopos relativamente raros, la gran mayoría de respuestas inmunes adversas a los glóbulos rojos del donante se explica mediante unos pocos epítopos bien conocidos. Esta invención está relacionada con la identificación de un importante epítopo de las plaquetas.

Un grupo adicional de moléculas, las glicoproteínas HLA que se encuentran en la superficie de los glóbulos rojos y las plaquetas también se reconocen por el sistema inmune de los destinatarios de la transfusión. La respuesta del sistema inmune a la glicoproteína HLA disminuye claramente la probabilidad de supervivencia de los órganos transplantados o de los productos de sangre transferidos incluyendo las plaquetas. Aunque un correcto tipaje de las plaquetas con respecto a la glicoproteína HLA ha reducido la incidencia del rechazo de transfusión de plaquetas, existen ciertos componentes adicionales de superficie en las plaquetas en los cuales una variación en su estructura entre los donantes y los receptores afecta claramente la probabilidad de éxito de un programa de transfusión de plaquetas.

Esta invención identifica una de dichas diferencias estructurales en un componente de superficie de las plaquetas y se relaciona también con la administración de productos de sangre que contienen plaquetas, cuyo uso minimiza la respuesta inmune adversa en sus destinatarios. A continuación sigue una discusión corta sobre aquellos factores que determinan si una diferencia estructural genéticamente heredada en un componente de superficie de las plaquetas desencadenará una respuesta inmune por el receptor de una transfusión.

Generalmente, las diferencias, tales como sustituciones de aminoácidos, que definen las formas particulares de una proteína presente en diferentes especies, son mucho más grandes que aquellas diferencias que definen las formas de la proteína en diferentes individuos de la misma especie. En general, el sistema inmune detecta y responde con más probabilidad a las diferencias (reflejadas en epítopos modificados) que existen entre las especies. La variación genética entre individuos de la misma especie se refleja en "alelos", es decir, formas alternativas del gen que codifica una proteína. La variación en la secuencia aminoacídica de la proteína resulta de pequeñas diferencias (mutaciones) en la secuencia codificante del gen. Las formas diferentes de la proteína codificada por las formas alternativas del gen se denominan aloantígenos.

Si las variaciones aminoacídicas son tales que no alteran de manera significativa la carga o la conformación del dominio (epítopo) de la proteína en la cual se localizan o desencadenan un cambio conformacional en otra parte de la molécula, entonces el sistema inmune puede no reconocer la diferencia entre los productos (aloantígenos) de los dos alelos. Sin embargo, las formas de la proteína pueden ser suficientemente diferentes para que los anticuerpos (por ejemplo, en el receptor de una transfusión) puede "determinar" que un aloantígeno es "propio" y el otro ajeno. Los anticuerpos que responden así a la forma de un epítopo en un aloantígeno pero no a la forma del epítopo presente en otro aloantígeno se denominan "alotipos". Los anticuerpos alotípicos son particularmente importantes en la práctica de la invención puesto que se cree que basta la identificación de sólo unos pocos aloantígenos importantes en las plaquetas para proporcionar, en general, una transfusión eficaz de las plaquetas.

Desarrollos presentados

Una discusión detallada de los aloantígenos asociados a plaquetas se proporciona en Platelet Immunobiology, Molecular and Clinical Aspects. Kunicki, J. T. y George, J. N., capítulos 6 y 19, J. B. Lippincott, Philadelphia, 1989. Los sistemas de aloantígenos representativos ahí descritos incluyen P1^{A} y "Pen", ambos asignados a loci (posiciones en la secuencia aminoacídica) sobre la glicoproteína IIIa de plaquetas y "Bak", asignado a la glicoproteína IIb. El sistema de aloantígeno P1^{E} presentado por Shulman, N. R. et al., Prog. Hematol., 4: 222, (1964) se determinó más tarde que estaba asociado con un locus no identificado en la glicoproteína Ib\alpha. Sin embargo, el locus no se identificó y el individuo ya ha fallecido.

Un sistema de aloantígeno adicional Ko^{a}/Ko^{b} se ha asignado al complejo glicoproteico Ib-IX de las plaquetas, Kuijpers, R. et al., Blood, 74, 226ª, (1989) (resumen), pero no se determinó su locus.

Esta invención define el locus de un sistema de aloantígeno de plaquetas ahora descubierto, proporciona procedimientos de escrutinio diagnóstico para detectar ambas formas de la proteína y proporciona plaquetas tipadas con características funcionales mejoradas para su administración a los pacientes.

Sumario de la invención

Afirmado en líneas generales, esta invención se asocia con la identificación de un locus importante (posición en la secuencia aminoacídica) en una proteína de la superficie de la plaqueta que es responsable del rechazo a la transfusión de plaquetas. El locus se localiza en el residuo 145 de la glicoproteína Ib\alpha de las plaquetas y se encuentra en forma de un dimorfismo de aminoácidos treonina/metionina (abreviadas como "Thr/Met").

La invención incluye dentro de su ámbito varias estrategias mediante las cuales se puede detectar y evitar la potencial incompatibilidad de las plaquetas entre el donante y el receptor. Una estrategia importante implica el uso de un anticuerpo monoclonal o su fragmento en forma esencialmente pura que tiene como epítopo diana un dominio de la glicoproteína Ib\alpha, dependiendo la afinidad de dicho anticuerpo o su fragmento frente a dicho epítopo de la identidad del residuo aminoacídico en la posición 145 de dicha glicoproteína.

Un anticuerpo monoclonal de la invención en forma esencialmente pura está libre de contaminación por anticuerpos que tengan como epítopo los dominios de un polipéptido no-GPIb\alpha.

Es preferente en la práctica de la invención que los proveedores de sangre, por ejemplo, hospitales y bancos de sangre separasen sus provisiones de sangre en función del dimorfismo en el locus Thr/Met^{145}. Para este objetivo, la invención proporciona una provisión de producto de sangre que comprende plaquetas separadas en tres grupos, un grupo que contiene plaquetas que tienen un residuo de treonina en la posición 145 en su polipéptido de glicoproteína Ib\alpha, un segundo grupo que contiene plaquetas que tienen un residuo de metionina en la posición 145 en sus polipéptidos de glicoproteína Ib\alpha y un tercer grupo que contiene plaquetas que tienen residuos de metionina y treonina en la posición 145 en sus polipéptidos de glicoproteína Ib\alpha.

Otro aspecto de la presente invención abarca un procedimiento para proporcionar un anticuerpo monoclonal dirigido contra un dominio de la glicoproteína Ib\alpha, dependiendo el epítopo de dicho anticuerpo de la presencia de Met^{145} o Thr^{145} en dicha glicoproteína, dicho procedimiento comprendiendo: (A) la fusión de una mezcla de linfocitos y células de mieloma para formar hibridomas; siendo la fuente de dichos linfocitos células linfáticas recuperadas de un animal que estaba inmunizado con glicoproteína Ib\alpha o con un fragmento de ésta; (B) el aislamiento de un hibridoma que secreta un anticuerpo dirigido contra dicho epítopo; (C) el cultivo de dicho hibridoma y (D) la recolección del anticuerpo monoclonal producido en él.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un procedimiento de inmunoensayo que utiliza un anticuerpo monoclonal o un fragmento de éste para ensaya los polipéptidos de glicoproteína Ib\alpha humana para la presencia de un residuo Met^{145} o un residuo Thr^{145}, que comprenden el contacto de dicho anticuerpo monoclonal con polipéptidos de la glicoproteína Ib\alpha y la determinación de si dichos polipéptidos de la glicoproteína Ib\alpha incluyen un residuo Met^{145} o un residuo Thr^{145}.

Otro aspecto de la invención proporciona la determinación de si se ha administrado anteriormente a un paciente un producto de sangre con plaquetas que contuviese en la posición 145 de su polipéptido de la glicoproteína Ib\alpha un residuo aminoacídico diferente del residuo aminoacídico en la posición 145 del polipéptido de la glicoproteína Ib\alpha del paciente. De acuerdo con esto, se proporciona un procedimiento de inmunoensayo que comprende el contacto de una muestra de sangre o una composición derivada de ella, con una forma aloantigénica de Thr o Met^{145} de la glicoproteína Ib\alpha o un fragmento de ésta que contiene dicho locus Thr/Met^{145} y la determinación de si está presente el complejo de un anticuerpo y una forma de dicha glicoproteína o un fragmento de ella.

En una población de donantes del Sur de California, se determinó que el alelo Thr^{145} estaba presente en alrededor del 89% de las veces, mientras que la forma Met^{145} estaba presente en alrededor del 11%, dando lugar a una población en la cual aproximadamente el 80% de los individuos son homocigotos para Thr^{145}, el 2% son homocigotos para Met^{145} y el 18% son heterocigotos. Se indica así el potencial para el rechazo de una transfusión de plaquetas.

Breve descripción de la ilustración

La Figura 1 muestra el patrón de restricción por AhaII (antes de la restricción (L) y después (R)) de ADN genómico humano que codifica la GPIIb\alpha que contiene codones para Thr^{145} y/o Met^{145}.

Descripción detallada de la Invención

Los términos "péptido" y "polipéptido" se utilizan aquí de manera intercambiable. Asimismo se entiende que la práctica de la invención concierne al uso de productos de sangre y proteínas de origen humano en pacientes humanos. La presente invención abarca también el uso de polipéptidos de la glicoproteína Ib\alpha o fragmentos de ésta, (y/o las secuencias de ADN codificantes correspondientes) que pueden contener, en relación con los polipéptidos y con las secuencias de ADN aquí descritas que reflejan el polimorfismo Thr/Met^{145}, mutaciones adicionales que no afectan a las propiedades biológicas o a la utilidad diagnóstica del epítopo aloantigénico que contiene Thr^{145} o Met^{145} en los polipéptidos.

También está en el ámbito de la invención la preparación de formas modificadas de los polipéptidos de la glicoproteína Ib\alpha de la invención, tales como mediante mutaciones adicionales o diferentes del ADN codificante o mediante su modificación química (por ejemplo sulfatación, glicosilación, esterificación, etc.). Con respecto a los polipéptidos GBIb\alpha que contienen mutaciones adicionales, dichos polipéptidos de GBIb\alpha (como las existentes en plaquetas de donante) se consideran equivalentes en la práctica de la invención si tienen las propiedades funcionales del aloantígeno del individuo receptor y no son reconocidas por el sistema inmune del receptor como ajenos. Asimismo se debería entender que la invención abarca diferencias biológicamente no importantes entre los ADNs reales y los polipéptidos utilizados en la práctica de la invención y las secuencias estructurales de aminoácidos o sus nucleótidos como se presenta aquí.

Introducción

En relación con el desarrollo de ésta invención, se ha descubierto que el dimorfismo treonina/metionina en el residuo 145 del polipéptido de la glicoproteína Ib\alpha de las plaquetas define un importante sistema de aloantígeno que es una causa del rechazo de transfusión de plaquetas, es decir, una alosensibilización a los antígenos encontrados en las plaquetas, de modo que una transfusión adicional de plaquetas no resulta en un aumento en el recuento de plaquetas.

Para los objetivos de fondo, se expone a continuación información relacionada con el polipéptido de la glicoproteína Ib\alpha de plaquetas y su papel en coagulación (hemostasis). La adhesión de plaquetas a los vasos dañados o enfermos ocurre a través de mecanismos que involucran receptores específicos de la membrana de las plaquetas que interaccionan con moléculas adhesivas especializadas. Uno de tales receptores de plaquetas es el complejo de glicoproteínas Ib-IX que consiste en una asociación no covalente de dos proteínas integrales de membrana, la glicoproteína Ib (GPIb) y la glicoproteína IX (GPIX). La GPIb, que es una molécula de dos cadenas que tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 160 kDa, se compone de una cadena pesada (alfa o "GPIb\alpha") que tiene una masa molecular de aproximadamente 145 kDa unida mediante puentes disulfuro a una cadena ligera (beta o GPIb\beta) que tiene una masa molecular de aproximadamente 22 kDa. La GPIb es una proteína integral de membrana y ambas cadenas alfa- y beta- arriba descritas tienen dominios de transmembrana. El término "glicocalicina" se refiere a un fragmento proteolítico soluble de la cadena pesada (\alpha) de GPIb que es generado mediante ruptura en una posición cercana al dominio de transmembrana de la molécula (Yamamoto, K. et al., Thromb. Res., 43, 41-55 (1986)). Ahora está claro que la glicocalicina comprende la mayoría de los dominios extracelulares de la GPIb\alpha de la cual se deriva.

El ligando adhesivo del complejo GPIb-IX es el factor proteico von Willebrand (``vWf) que se encuentra como un componente de la matriz subendotelial, como un componente de los gránulos \alpha segregados por las plaquetas activadas y también como una proteína circulante en plasma sanguíneo. El lugar de unión real del vWf sobre el receptor GPIb-IX se ha localizado en la región amino-terminal (His^{1}-Arg^{293}) de la cadena \alpha de la glicoproteína Ib. Esta región entre los residuos 1-293 del polipéptido se puede generar como un fragmento de la GPIb\alpha que tiene un peso molecular de 45 kDa utilizando, por ejemplo, tripsina para efectuar la ruptura proteolítica necesaria. La inhibición de la interacción vWf-GPIb\alpha resulta en la prevención de la hemostasis primaria y en la inducción de un estado anti-trombótico útil en la prevención de otras enfermedades en las cuales la oclusión de vasos sanguíneos juega un papel importante. Se cree que la interacción de GPIb\alpha con vWf no se ve afectada por el dimorfismo Thr/Met^{145} de polipéptido GPIb\alpha que es responsable de los fenómenos inmunes detectados en la práctica de esta invención. La secuencia aminoacídica del fragmento amino-terminal de 45 kDa de la GPIb\alpha (residuos His^{1}-Arg^{293}) ha sido descrita por Titani, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 5610-5614 (1987).

Un cDNA completo que codifica el polipéptido de la GPIb\alpha humana ha sido determinado por Lopez, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 5615-5617 (1987). Se ha clonado el gen de GPIb\alpha de una genoteca genómica en cósmidos utilizando un clon de cDNA parcial como sonda y su secuencia, incluyendo intrones, ha sido determinada por Wenger, R. H. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 156(1), 389-395 (1988). La secuencia de GPIb\alpha así predicha consiste de un péptido de señal de 16 aminoácidos, de Met^{-16} a Pro^{-1}, seguido por un péptido maduro de 610 aminoácidos o región polipeptídica, de His^{1} a Leu^{610}. (Se utiliza aquí el sistema de numeración de nucleótidos de Wenger). La estructura y las propiedades de GPIb\alpha se han revisado en Ruggeri, Z. M., The Platelet Glycoprotein Ib-IX Complex, en Progress in Hemostasis and Thrombosis, vol. 10, p. 3568, Coller, B.S. ed., W. B. Saunders Co., Philadelphia, 1991.

Descubrimiento del dimorfismo de Thr^{145}/Met^{145} de la GPIb\alpha

En relación con el trabajo para entender el defecto molecular de la glicoproteína Ib\alpha de plaquetas asociado con la enfermedad plaquetaria "Síndrome de Bernard-Soulier Tipo Bolzano" (una mutación Ala^{156}\rightarrowVal) se descubrió que el ADN genómico de un propositus del defecto contenía también una sustitución del codón Thr^{145}\rightarrowMet^{145}. Se confirmó que la sustitución era un dimorfismo aminoacídico que ocurría de manera natural que no afecta a la función de GPIb\alpha con respecto a su interacción con el factor de von Willebrand. Ware, J. et al., Blood, 78(10), abstract 278ª, diciembre 1991, abstract titulado "Ala^{156}\rightarrowVal Substitution in Platelet Glycoprotein Ib\alpha Impairs von Willebrand Factor Binding and is the Molecular Basis of Bernard-Soulier Syndrome Type Bolzano"; Ware, J. et al., Thrombosis and Hemostasis, 65(6), 770 (1991), abstract 347.

Práctica de la invención

Esta invención proporciona técnicas mejoradas de transfusión al receptor de productos de sangre de terceros que contienen plaquetas. La incidencia y la gravedad del rechazo a la transfusión de plaquetas se minimizan siguiendo la práctica de la invención. Tres técnicas importantes son representativas de los diversos aspectos de la invención: (A) un procedimiento para determinar (tipar) las formas aloantigénicas de la glicoproteína Ib\alpha de un paciente para que el paciente reciba una transfusión de plaquetas de un donante (tercera parte) que contenga formas aloantigénicas de GPIb\alpha idénticas respecto a su locus Thr/Met^{145}; (B) un procedimiento para determinar si un paciente que de otra manera se beneficiaría de las plaquetas por una tercera parte (como por ejemplo, en una transfusión) ha producido anticuerpos frente a plaquetas previamente administradas con respecto al locus Thr/Met^{145} de la glicoproteína Ib\alpha; y (C) un procedimiento para determinar en un donante la identidad de las formas aloantigénicas de GPIb\alpha para su locus de Thr/Met^{145}.

Los siguientes hechos deben considerarse en la administración de productos de sangre que contienen plaquetas a los pacientes. La práctica de la invención aumenta la flexibilidad de los tratamientos que los pacientes pueden recibir en la relación con esto. Como se ha mencionado previamente, las plaquetas de terceras partes que son una diana para sistema inmune del receptor puesto que contienen epítopos ajenos, no son efectivos como agentes de coagulación. Sin embargo, se sabe que en un paciente que no ha recibido previamente plaquetas de terceras partes, por ejemplo, que nunca ha tenido un accidente grave o un procedimiento quirúrgico, la respuesta inmune es lo suficientemente lenta, del orden de semanas, como para que el paciente tolerase la administración de dichas plaquetas de terceras partes en las cuales se expresan epítopos ajenos durante un periodo de tiempo, como el necesario para controlar la hemorragia tras un procedimiento quirúrgico. Esta flexibilidad es particularmente importante para la administración de tratamiento médico de urgencia cuando las existencias de plaquetas correctamente clasificadas y separadas pueden no encontrarse disponibles. Con respecto a los pacientes a los cuales se han administrado previamente plaquetas y en los cuales tuvo lugar una respuesta inmune, los procedimientos diagnósticos de la invención proporcionan una advertencia de las restricciones sobre las formas aloantigénicas (Thr/Met^{145}) para que puedan administrarse sin peligro. Para cumplir los objetivos arriba
mencionados, el tipaje de las plaquetas de terceros (donantes) se realiza de manera similar de acuerdo con la invención.

Adicionalmente, el correcto tipaje de las plaquetas es particularmente importante de cara al tratamiento de pacientes con cáncer, particularmente aquellos que tienen leucemia y están sometidos a quimioterapia y/o irradiación de la médula ósea y tienen niveles bajos de producción de plaquetas. Tales pacientes requieren una administración frecuente de plaquetas y están en riesgo de rechazo de la transfusión de plaquetas.

Preparación del Antígeno Purificado

Para fabricar los productos diagnósticos de la invención basados en anticuerpos monoclonales, es necesario disponer de polipéptidos antigénicos purificados contra los cuales los anticuerpos monoclonales de uso diagnóstico puedan ser preparados. El Ejemplo 1 de la invención describe la producción de tales fragmentos adecuados de glicoproteína Ib\alpha que incluyen un fragmento de His^{1}-Ala^{302} de la GPIb\alpha expresado a partir de células de mamífero, un fragmento tríptico de GPIb\alpha que consiste del dominio de 45 kDa de los residuos 1-293 de la GPIb\alpha, glicocalicina y péptidos glicosilados y no glicosilados derivados de la GPIb\alpha que incluyen su residuo 145. La Solicitud Internacional publicada PCT/US91/0087 describe la producción de un fragmento His^{1}-Ala^{302} (que contiene la Thr^{145}) de GPIb\alpha que mimetiza la estructura tridimensional correcta de este dominio tal como se expresa en la proteína GPIb\alpha completa en las plaquetas. Basado en su ADN codificante, también se puede expresar (Ejemplo 1) un fragmento His^{1}-Ala^{302} que codifica un residuo de Met^{145}.

Ambas formas de Thr^{145} y Met^{145} del fragmento His^{1}-Ala^{302} de GPIb\alpha expresado como se proporciona en el Ejemplo 1, mimetizan la correcta estructura tridimensional de sus dominios respectivos como estaría presente en sus formas alélicas respectivas de la GPIb\alpha sobre las plaquetas. Como se describe en el Ejemplo 2, la forma aloantigénica de Met^{145} de la GPIb\alpha proporciona el epítopo antigénico reconocido por el anticuerpo Sibª. Actualmente, no se sabe si el(los) epítopo(s) para el anticuerpo Sibª responde(n) al dominio de la GPIb\alpha que incluye el residuo 145 (en forma de metionina y no en forma de treonina) o responde(n) en su lugar a otro epítopo de la molécula (un epítopo neoantigénico que sólo está presente en GPIb\alpha cuando el residuo Met^{145} relativamente más raro está presente causando un cambio conformacional en la molécula que expone el nuevo dominio).

Con respecto a la producción de anticuerpos monoclonales frente a la forma aloantigénica de la GPIb\alpha (Thr/Met^{145}) en un paciente que recibe plaquetas de terceros o producidos para objetivos diagnósticos, se espera que tales anticuerpos puedan ser de ambas clases, es decir, dependientes de epítopos distantes del residuo 145 pero generados "conformacionalmente" por la presencia de metionina y también epítopos directamente definidos por el locus del residuo 145 y localizados cerca de éste. Con respecto a los anticuerpos que responden al último tipo de epítopo, se observa que los péptidos que siguen el patrón de la secuencia aminoacídica de la GPIb\alpha y que incluyen su residuo 145, sea en la forma glicosilada o no glicosilada, pueden servir como material antigénico fácil de sintetizar.

Producción de Anticuerpos Contra las Formas Aloantigénicas de Thr/Met^{145} de la GPIb\alpha

La producción de anticuerpos monoclonales frente a los aloantígenos de la invención se puede realizar siguiendo cualquiera de un elenco de procedimientos estándar. Los anticuerpos monoclonales apropiados para la práctica de la invención se pueden generar por cualquier elenco de procedimientos. Por ejemplo, se puede hacer referencia a Cellular and Molecular Inmunology, Abbas, A. K. et al., eds., Sanders Company, Philadelphia, 1991 y Eisen, H. N., General Inmunology, J.P. Lippincott Company, 4ª edición, Philadelphia, 1990. Un manual de referencia preferente para las técnicas de producción, escrutinio y caracterización de los anticuerpos es Harlow, E. y Lane, D., eds. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).

Con respecto a la producción de anticuerpos monoclonales de la invención, una estrategia preferente comprende la obtención de un clon que produce un anticuerpo monoclonal o la obtención de un grupo de clones tales que produzcan diferentes anticuerpos monoclonales que respondan a diferentes epítopos exactos dependientes de Thr^{145} o Met^{145}. La producción de tal anticuerpo se puede realizar mediante los procedimientos bien conocidos en la técnica tal como la de Köhler, et al., Eur. J. Immunol., 6, 292-295 (1976) en la cual se realiza una fusión de las células de mieloma con linfocitos animales que han sido inmunizados con un antígeno apropiado. Líneas celulares de mieloma adecuadas pueden derivarse de mielomas de ratón BALB/c MOPC 21 como se ha descrito por Köhler, et al. Típicamente, la fusión de células linfoides y células de mieloma se efectúa mediante la adición de una suspensión de células linfoides a las células de mieloma en el medio de crecimiento y centrifugando para formar un sedimento. Las células se incuban entonces en un medio de crecimiento que contiene el agente de fusión. Después se cultivan los hibridomas que sintetizan y secretan los anticuerpos para establecer proliferación continua de líneas celulares en cultivo de tejidos. Los hibridomas se segregan en clones individuales y el anticuerpo se recupera del cultivo de tejido resultante. Una referencia preferente sobre la producción de los anticuerpos monoclonales es Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow, E. y Lane, D., eds., supra en sus páginas 150-238.

Una segunda estrategia para la producción de anticuerpos monoclonales adecuados en la práctica de la invención comprende la inmunización de un animal con un péptido que incluye Met^{145} o Thr^{145}. El uso de un péptido pequeño en lugar de una glicoproteína grande minimiza la posibilidad de que el animal inmunizado produzca una gran fracción de sus anticuerpos frente a epítopos irrelevantes. Con respecto a la producción de anticuerpo utilizando como antígeno los péptidos que contienen un residuo Met o Thr^{145}, se prefiere que tales péptidos tengan un máximo aproximadamente de 30 aminoácidos de longitud comprendiendo los fragmentos de la GPIb\alpha en su forma glicosilada o no glicosilada. Para la metodología preferente, véase Harlow, E., y Lane, D., supra en sus páginas 72-121. Esto resulta en una población policlonal de anticuerpos.

Una tercera estrategia implica la generación de una respuesta policlonal en un conejo inmunizado, por ejemplo, con el fragmento del residuo 1-302 (con Met^{145}) haciendo uso de una depleción inmune del suero resultante con la forma Thr^{145} del fragmento.

Además de la molécula completa del anticuerpo monoclonal, se puede utilizar en la práctica de la invención cualquiera de sus fragmentos que contenga toda su región variable o una porción de ésta y por lo tanto retenga la capacidad de unirse al epítopo de la GPIb\alpha o a una parte de éste. Tales fragmentos adecuados incluyen los fragmentos Fab y F(ab'). Con respecto a las propiedades del anticuerpo monoclonal o su fragmento adecuados para la práctica de la invención, se debe considerar que es preferente que un anticuerpo monoclonal o su fragmento tenga una constante de afinidad de unión para la GPIb\alpha o para un fragmento de ésta que define el epítopo de por lo menos alrededor de 10^{5} litros/mol.

Asimismo debe tenerse en cuenta que existen técnicas disponibles para producir moléculas de anticuerpo monoclonal a partir de células bacterianas recombinantes y que dichas moléculas de anticuerpo monoclonal o sus fragmentos que contengan su región variable son también adecuadas en la práctica de la invención.

Antígenos Adicionales

Aunque la invención ha sido descrita principalmente en el contexto de un dimorfismo en el residuo 145 de la GPIb\alpha, se debe tener en cuenta que pueden llegar a conocerse alelos adicionales que codifiquen especies aminoacídicas adicionales en la posición del residuo 145 y que los procedimientos generales de escrutinio de ADN de la invención (véase, por ejemplo, Ejemplo 2) se pueden utilizar para caracterizar el ADN de tales individuos. Procedimientos similares son efectivos en todas las demás posiciones de secuencia aminoacídica de la GPIb\alpha para identificar los loci aloantigénicos y para proporcionar procedimientos clínicos para compensar el polimorfismo aminoacídico que crea tales epítopos "ajenos".

Procedimientos Diagnósticos de Representación

Con respecto a los procedimientos de ensayos inmunológicos de la invención, se debe tener en cuenta que cualquier procedimiento adecuado que permita la valoración cuantitativa o cualitativa de la unión de un anticuerpo dirigido a un epítopo de GPIb\alpha dependiente de su locus Thr/Met^{145} es efectivo en la práctica de la invención. Tales procedimientos adecuados están explicados en los Ejemplos 3 y 4 a continuación.

Adicionalmente, se describe a continuación un procedimiento para el doble escrutinio del sobrenadante de cultivos de tejidos de células de hibridoma para identificar anticuerpos monoclonales que sean específicos para Thr^{145} o Met^{145}. Se puede utilizar un elenco de estrategias diferentes, como ejemplo la captura de anticuerpo o la captura de antígeno (véase Antibodies: A Laboratory Manual en las páginas 174-195). A continuación se describe una captura de anticuerpo.

Puesto que los antígenos (pMW2/Thr^{145} y pMW2/Met^{145} recombinantes) están disponibles en grandes cantidades, una captura de anticuerpo es una manera conveniente para investigar la línea celular de hibridoma requerida. Ambos antígenos se depositan en gotas sobre nitrocelulosa (NC o dot-blot) o se aplican sobre una placa multiensayo de cloruro de polivinilo. El NC o la placa se bloquea con una solución de proteína de por lo menos 1 \mug/ml. Aproximadamente 1 \mul de sobrenadante del cultivo de tejido del hibridoma se añade a cada cuadrado (NC) o bien se añaden 200 \mul al pocillo de cada placa. Tras una incubación de 1 hora, el NC o los pocillos se lavan tres veces con la misma solución de bloqueo. Se detecta el anticuerpo unido mediante una segunda incubación con una inmunoglobulina anti-ratón generada en conejo marcada con ^{125}I (utilizando aproximadamente 50.000 cpm por gota de NC o por pocillo). Los pocillos se entonces lavan 3 veces en la misma solución de bloqueo y se exponen a autorradiografía (NC) o a recuento de rayos gamma en un espectómetro gamma. Este procedimiento permitirá una identificación de clones que estén secretando anticuerpos monoclonales específicos bien para la forma Thr^{145} o bien para la forma Met^{145} de GPIb\alpha.

Almacenamiento y Manipulación de los Productos de Sangre que Contienen Plaquetas

Los procedimientos arriba descritos son eficaces para el objetivo de proporcionar un anticuerpo monoclonal útil para la determinación de si un paciente ha sido o no previamente expuesto a un producto de sangre de una tercera parte que contenía plaquetas, siendo el GPIb\alpha de dicho producto de formas aloantigénicas diferentes respecto a su locus de Thr/Met^{145} a la del paciente. Los medios efectivos son, por lo tanto, revelados por lo cual los servicios que proporcionan atención sanitaria y/o almacenan productos de sangre que contiene plaquetas pueden minimizar las reacciones inmunes adversas a éstos en pacientes y maximizar la eficacia de los productos de transfusión que contienen plaquetas. Tales procedimientos incluyen el uso de reactivos diagnósticos proporcionados por la invención para tipar a los donantes y a los receptores y para separar las provisiones de plaquetas en función de la identificación del residuo aminoacídico en la posición 145 de su GPIb\alpha.

En consistencia con la práctica de la invención, un banco de sangre o un servicio de atención médica debería separar los productos de sangre que contienen plaquetas en diferentes grupos, un grupo que contenga sólo plaquetas con GPIb\alpha que tengan la forma Thr^{145} de dicha proteína, un segundo grupo que contenga plaquetas que tengan sólo su forma Met^{145} y (opcionalmente) puede prepararse un tercer grupo que contenga ambas formas de metionina y treonina 145 de los polipéptidos de la GPIb\alpha y que sean adecuados para su administración a individuos heterocigotos.

El uso terapéutico del surtido de plaquetas así separado comprende un procedimiento preferente para inhibir la hemorragia en un paciente en el que los productos de sangre anteriormente mencionados permanecerán siendo eficaces en el paciente durante periodos más largos que los productos que se administran actualmente, perdurando, por ejemplo, durante un tiempo más largo sin ser eliminados de la circulación por los riñones o convirtiéndose, como resultado de reacciones inmunológicas, en inservibles para un paciente.

La distribución de los alelos que codifican Thr^{145} y Met^{145} en la población humana subraya la importancia de la invención. La administración de los productos de sangre de terceros que contienen plaquetas obtenidos a partir de un individuo que expresa ambos alelos del gen que codifica la GPIb\alpha hace probable una reacción inmunológica adversa en una proporción significativa de la población humana. Similarmente, los individuos que son homocigotos para Met^{145} están en grave riesgo de sufrir efectos clínicos adversos cuando reciben plaquetas de la población general.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la práctica de la invención.

Ejemplo 1

Preparación del polipéptido GPIb\alpha y/o sus fragmentos adecuados como aloantígenos para la producción del anticuerpo alotípico

A continuación se describe la producción de las formas aloantigénicas de la GPIb\alpha y sus fragmentos a partir de las cuales se pueden producir los anticuerpos monoclonales alotípicos adecuados para propósitos diagnósticos y que tienen como su epítopo bien la forma Thr^{145} o la Met^{145} de la GPIb\alpha.

(A) Fragmento His^{1}-Ala^{302} de la GPIb\alpha recombinante

La construcción, la caracterización y la utilización del plásmido de expresión pMW2/Thr^{145} que dirige la secreción del fragmento His^{1} -Ala^{302} de la GPIb\alpha a partir de células de mamífero, por ejemplo células CHO-K1, han sido descritas. Murata M. et al., J. Biol. Chem., 266, 15474-15480 (1991). Más detalles de la caracterización de pMW2/Thr^{145}, del polipéptido resultante y de los procedimientos para su expresión se proporcionan en la publicada Solicitud Internacional PCT/US91/0087, archivada el 4 de enero, 1991, que incluye los Ejemplos del 9 al 14. Las publicaciones arriba mencionadas demuestran que este fragmento de la GPIb\alpha tiene una conformación terciaria indicativa de la una ausencia de expresión correcta del plegamiento de la mitad C-terminal del polipéptido GPIb\alpha completo de 610 residuos. Como se describe en la Solicitud Internacional '0087 se espera que también existan las líneas celulares recombinantes hospedadoras que permitan la expresión eficaz del polipéptido completo His^{1} - Leu^{610} y su correcto plegamiento y glicosilación.

La estrategia de mutagénesis dirigida de Murata, M. et al., (siguiendo a Kunkel, T. A., Methods, Enzymol., 154. 367-383 (1987)) se utilizó para preparar la forma de la Met^{145} codificada por el plásmido pMW2 en la cual un codón de Met^{145} se ha sustituido por un codón de Thr^{145}. Los plásmidos pMW2/Thr^{145} y pMW2/Met^{145} pueden transfectarse entonces en células CHO-K1 utilizando un procedimiento de transfección mediado por fosfato cálcico. Siguiendo el procedimiento de Murata, M. et al., líneas celulares estables resistentes al antibiótico Geneticin® fueron entonces investigadas para la producción del antígeno GPIb\alpha utilizando dos anticuerpos monoclonales murinos, LJ-Ib\alpha1 y LJ-P3 que reconocen epítopos dentro del fragmento tríptico de 45 kDa amino-terminal (residuos 1-293) de la GPIb\alpha. Véase Handa, M. et al., J. Biol. Chem., 261, 12579-12585 (1986), Vicente, V. et al., J. Biol. Chem., 265, 274-280 (1990).

Los elementos necesarios para la preparación de los polipéptidos antigénicos adecuados de la invención son: (A) las secuencias de ADN que codifican los residuos His^{1}-Leu^{610}, His^{1}-Ala^{302} o dominios similares del polipéptido GPIb\alpha que contengan el/los epítopo/s que refleja(n) el dimorfismo de Thr/Met^{145}; (B) un plásmido de expresión o un vector de expresión viral capaz de dirigir en una célula eucariótica la expresión de los dominios anteriormente mencionados; y (C) una célula hospedadora eucariótica en la cual se puede efectuar dicha expresión.

Se espera que los polipéptidos de GPIb\alpha así expresados no sean secretados de las células hospedadoras por la falta de incorporación de un péptido señal al polipéptido naciente de GPIb\alpha. Se espera que la purificación de las proteínas expresadas en dichas células y la extracción de cantidades farmacológicamente útil de éstas sean más difíciles que si se pudiese inducir la secreción del polipéptido al medio de cultivo de las células hospedadoras.

De acuerdo con esto, en la práctica preferente de la invención se proporciona una secuencia de ADN que codifica la GPIb\alpha para su inserción en una célula hospedadora adecuada en la cual se inserta, en dirección 5' desde la secuencia que codifica los residuos 1-610 o 1-302, una secuencia de ADN que codifica el péptido señal de la GPIb\alpha. Los péptidos señal que corresponden a otras especies de proteína pueden mostrarse igualmente eficaces para causar la secreción de la GPIb\alpha. Von Heijne, G., J. Mol. Biol., 184, 99-105 (1985). Cuando está unido al extremo amino-terminal de los residuos 1-610 o 1-302 del polipéptido de GPIb\alpha, el péptido señal causa que se reconozca el polipéptido por las estructuras celulares como un polipéptido del tipo que debe ser procesado para completar su secreción de la célula con la escisión concomitante del polipéptido señal del polipéptido maduro de GPIb\alpha.

Una amplia variedad de plásmidos de expresión o de vectores de expresión virales son adecuados para la expresión de los polipéptidos de GPIb\alpha o de sus regiones amino-terminales. Un factor de importancia en la selección de un sistema de expresión es la existencia de un promotor de alta eficacia de transcripción directamente adyacente al inserto clonado de GPIb\alpha. Otro factor de importancia en la selección de un plásmido de expresión o de un vector de expresión viral es la existencia de un gen marcador de resistencia a antibióticos para que se pueda aplicar la selección continua de células eucarióticas hospedadoras transformantes estables.

Ejemplos de plásmidos adecuados en la práctica de la invención incluyen pCDM8, pCDM8^{neo}, pcADN1, pcADN^{neo}, pMAM^{neo} y Rc/CMV. Los plásmidos cuyo uso en la práctica de la invención es preferente, incluyen pCDM8^{neo}, pcADN1^{neo}, pMAM^{neo} y Rc/CMV. Una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de GPIb\alpha o un fragmento de éste se puede también insertar en un plásmido o en un vector adecuados para causar la expresión del polipéptido en un sistema bacteriano.

Se pueden utilizar varios sistemas de vectores de expresión viral en la práctica de la invención, incluyendo por ejemplo, aquellos basados en retrovirus y aquellos basados en el baculovirus de la polihidrosis nuclear de Autographa californica.

Las células hospedadoras representativas que comprenden líneas celulares permanentes adecuadas para la práctica de la invención incluyen células de ovario de hámster chino CHO-K1, ATCC-CCL·61; células COS-1, células de riñón de mono verde africano transformadas por SV-40, ATCC-CRL 1650; células murinas pituitarias ATT 20; células \beta pancreáticas de rata RIN-5F; células del insecto Spodoptera frugiperda cultivadas; o levaduras (Saccharomyces).

(B) Preparación de fragmentos de GPIb\alpha adicionales adecuados como aloantígenos

Se ha descrito previamente la producción del fragmento de 45 kDa (residuos del 1 al 293) de la GPIb\alpha de la sangre, Vicente, V. et al., J. Biol. Chem., 265(1), 274-280 (1990). La preparación de glicocalicina se ha descrito por Handa, M. et al., J. Biol. Chem., 261, 12579-12585 (1986). La forma Thr^{145} del fragmento de 45 kDa o de la glicocalicina puede proceder de individuos homocigotos para la GPIb\alpha que contengan Thr^{145} (que corresponde a primer alelo descubierto, Lopez, J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 5615-5617 (1987)). Las formas Met^{145} de los fragmentos anteriores se pueden preparar de la GPIb\alpha de individuos homocigotos para la forma Met^{145}. Los polipéptidos de individuos heterocigotos se pueden separar utilizando, por ejemplo, cromatografía de inmunoafinidad sensible a la diferencia relevante en epítopo o conformación.

Los péptidos sintéticos que contienen hasta alrededor de 30 aminoácidos y que comprenden fragmentos de glicoproteína Ib\alpha (que contienen una posición del residuo equivalente a bien Met^{145} o bien Thr^{145}) se pueden preparar, por ejemplo, siguiendo el procedimiento de Houghten, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 5131-5135 (1985) con una purificación adicional como se describe en Vicente, V. et al., J. Biol. Chem., 265(1), 274-280 (1990).

La glicosilación se puede añadir a tales péptidos sintéticos mediante el acoplamiento en los sitios apropiados para mimetizar la glicosilación natural. Alternativamente, se pueden producir cantidades suficientes de péptido para servir como antígeno a partir de otros fragmentos de la GPIb\alpha de los productos de sangre, producidos de éstos, por ejemplo, mediante una escisión proteolítica múltiple y la purificación subsiguiente, por ejemplo, mediante cromatografía líquida a alta presión.

Ejemplo 2

Determinación de la identidad de aminoácido(s), Thr/Met, en la posición 145 del polipéptido de la GPIb\alpha de un paciente o donante utilizando análisis de restricción de ADN

Se aisló el ADN genómico tras consentimiento informado, de los linfocitos de sangre periférica de donantes de sangre sanos reclutados en el servicio del Centro de Investigación Clínica General de la Scripps Clinic, La Jolla, CA, siguiendo procedimientos bien conocidos en esta técnica. Véase, Blin, N. et al., Nucleic Acid Res., 3, 2303 (1976). Se explotó la falta de los intrones dentro de la secuencia codificante de la GPIb\alpha para permitir la amplificación de los fragmentos de ADN genómico del gen de la GPIb\alpha para determinar el rasgo alélico del locus del residuo 145 y para identificar la base genética del antígeno Sibª. Se utilizaron dos cebadores oligonucleotídicos, Ib\alpha-3 (5'-GGACG- - - - - - - - - - -CGGC-3') correspondiente a los residuos 106-112 de la GPIb\alpha y que representa los nucleótidos 898-918 de acuerdo con el sistema de Wenger, R. H. et al., y también Ib\alpha-4 (5'-GCTTT- - - - - - - - - - -TGAC-3') correspondiente a los residuos 296-302 de la GPIb\alpha y que representa los nucleótidos 1470-1489, en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para generar un fragmento de 591 pares de bases que corresponde a la secuencia de la región codificante de la GPIb\alpha para los residuos 106-302 del polipéptido. El fragmento de ADN se amplificó utilizando un termociclador de DNA (Perkin Elmer-Cetus, Berkeley, CA) en un volumen final de 100 \mul conteniendo Tris 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,3 mM, 0,01% de gelatina, 0,2 mM de cada desoxinucleótido trifosfato, 0,5 \mug de ADN genómico y 2,5 U de Taq polimerasa. El fragmento se generó a partir de una PCR que comprendía 30 ciclos que consistían en 94ºC durante 30 segundos(s), 52ºC durante 30 s y 72ºC durante 60 s. Se realizó la clonación de los fragmentos amplificados en el bacteriófago M13mp18, así como el subsiguiente análisis de secuencia de ADN, utilizando las técnicas estándar.

La digestión de los fragmentos de ADN derivados de los donantes se realizó con la enzima de restricción AhaII (New England Bio-Labs, Beverly, MA). La digestión del ADN con esta enzima se realizó durante 3 horas a 37º C y los productos resultantes se separaron y visualizaron en un gel de agarosa al 2%. La Figura 1 ilustra de manera esquemática la estrategia de PCR utilizada para generar un fragmento de 591 pares de bases (pb) del gen GPIb\alpha que codifica los residuos aminoacídicos 106-302 y el análisis de restricción de éste. El dimorfismo en el aminoácido Thr/Met^{145} es el resultado de una única transición de nucleótidos que cambia el codón de Thr (ACG) al codón Met (ATG). El genotipo de cualquier individuo en este locus puede ser determinado mediante la digestión con una enzima de restricción de ADN genómico amplificada puesto que la transición nucleotídica identificada (Thr-Met) destruye el sitio de restricción de AhaII, 5'-G(G/A)CG(T/C)C-3', (nucleótidos 1016-1021, GACGCC a GATGCC) dentro del ADN que codifica la GPIb\alpha. De esta manera, se puede analizar el polimorfismo mediante el patrón de restricción de AhaII (Figura 1).

Para determinar la frecuencia de alelos que codifican Thr/Met^{145} en la población normal, el ADN genómico de 61 donantes de sangre sanos fue sometido a análisis de PCR y a digestión con AhaII. Un análisis representativo en gel de agarosa (Figura 1) muestra los genotipos observados. Dentro del muestreo de una población normal, se observaron los tres genotipos esperados en relación al codón 145. Algunos individuos contenían dos alelos que codificaban Met^{145}, algunos contenían dos alelos que codificaban Thr^{145} y algunos eran heterocigotos conteniendo un alelo que codifica Met^{145} y un alelo que codifica Thr^{145}. Los resultados acumulativos revelaron unas frecuencias alélicas de 89% y 11% para los codones de Thr^{145} y Met^{145}, respectivamente. Las frecuencias alélicas dentro de una población de origen étnico restringido pueden diferenciarse de las aquí presentadas.

Asimismo se realizaron PCRs sobre ADN genómico aislado de varios individuos sanos cuyas plaquetas reaccionaron con el anticuerpo anti-Sibª. Los fragmentos de ADN amplificados se clonaron en M13mp18 para el análisis de la secuencia del ADN. En comparación con la secuencia nucleotídica publicada de GPIb\alpha (Lopez, J. A. et al.), el análisis de secuencia reveló una transición de citosina a timina en la posición nucleotídica 1018 en varios de los fragmentos clonados de estos individuos. La transición nucleotídica observada demuestra que el codón ACG para la treonina^{145} que se ajusta a la secuencia publicada de GPIb\alpha, está sustituído por un codón ATG para metionina^{145} en los individuos que muestran respuesta a este anticuerpo.

Ejemplo 3

Uso del anticuerpo anti-Sibª para la detección del antígeno Sibª sobre las plaquetas

Un suero que contiene el anticuerpo anti-Sibª utilizado en este estudio se obtuvo del propositus original presentado por Saji, H. et al., Vox Sang, 56, 283 (1989) y fue una donación del Dr. Hiroh Saji, Kyoto Red Cross Blood Center, Kyoto, Japón. La reactividad de la plaquetas con el anticuerpo anti-Sibª se evaluó utilizando un procedimiento de captura de antígeno mediante ELISA modificado. Ichida, F. et al., Blood, 78, 1722 (1991).

Para realizar las pruebas, cien microlitros de plaquetas lavadas (1 x 10^{8}/ml) a ensayar se mezclaron con 5-20 \mul del suero anti-Sibª durante 1 hora a 22-25ºC y las plaquetas se lisaron con "PBS", tampón fosfato salino que consiste de Na_{2}HPO_{4} 10 mM, NaCl 0,14 M y también contiene EDTA 10 mM y 1% de Triton X-100. El lisado se centrifugó (11.750 g) para eliminar los restos insolubles y el sobrenadante se incubó (60 min.) en una placa de microensayo recubierta con el anticuerpo monoclonal SZ1 anti-GPIb-IX. El anticuerpo SZ1 (adquirido de Immunotech, Marseille, Francia) se dirige contra un epitopo en el complejo GPIb-IX humano y había sido adsorbido previamente en los pocillos de las placas de microensayo mediante una incubación durante la noche (3 \mug/ml) a 4ºC, seguida por un lavado con PBS que también contenía Tween 20 al 0,05%. La cantidad de complejo inmune de anticuerpo anti-Sibª/antígeno Sibª unido a SZ1 se determinó utilizando una IgG anti-humana de cabra biotinilada (Tago, Burlingame, CA) y la incubación subsiguiente con fosfatasa alcalina-streptavidina (Zymed, San Francisco, CA). El desarrollo de color se monitorizó tras la adición de substrato para determinar la DO_{405} en un lector de microplacas (Bio-Rad, Richmond, CA). Los resultados se expresaron como una razón de DO definida como (DO de la muestra - la media de las DO de los controles negativos)/la DO media de los controles negativos de acuerdo con el procedimiento de Ichida, F. et al.

Puesto que se ha determinado el antígeno Sibª (véase Ejemplo 2 más arriba) para representar el polipéptido de la GPIb\alpha incluyendo Met^{145} en su locus Thr/Met^{145}, otros anticuerpos, además de Sibª que se dirijan a un epitopo de la GPIb\alpha dependientes de la presencia de un residuo Met^{145} o Thr^{145} en dicho polipéptido, se pueden utilizar de manera similar en el ensayo. Tales anticuerpos pueden ser un anticuerpo monoclonal o una población policlonal tales como las prcedentes de suero humano.

Ejemplo 4

Inmunoreactividad del anticuerpo anti-Sibª con fragmentos de GPIb\alpha recombinante

El medio de cultivo de células CHO-K1 transfectadas con el plásmido pMW2/Thr^{145} o bien con el plásmido pMW2/Met^{145} se ensayó para el contenido del antígeno GPIb\alpha mediante una técnica dot-blot utilizando un aparato comercial (Pierce Chemical Co.). El procedimiento implicado (Murata, M. et al., J. Biol. Chem., 266, 15474 (1991)) se basa en la unión de cantidades definidas de la muestra del ensayo que contiene el antígeno a discos circulares de membrana de nitrocelulosa.

Primero, se midió la cantidad total del antígeno de GPIb\alpha para determinar su reactividad con un anti-suero específico de conejo obtenido mediante inmunización con un péptido sintético que corresponde a los residuos Gly^{271}-Glu^{285} de la GPIb\alpha (Vicente, V. et al., 1990). El uso de este epítopo permite la cuantificación del antígeno sin referencia a la afinidad de unión a -o por causa de- la Thr^{145} o la Met^{145}. La membrana recubierta de antígeno se incubó durante 2 horas a 22-25ºC con el suero anti-GPIb\alpha^{271-285} diluido 1:200 en Blotto (una solución compuesta de 50 mg/ml de leche desnatada, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,25 mM, NaCl 0,15 M en PBS). Al final de la incubación, la membrana se lavó 3 veces en Blotto, se incubó durante 1 hora con IgG anti-conejo de cabra marcada con ^{125}I y otra vez se lava 3 veces en Blotto. Se cortaron discos de membrana de nitrocelulosa correspondientes a la posición de cada pocillo de aplicación y se determinó la cantidad de radiactividad unida con un espectómetro de centelleo \gamma. La cantidad radiactividad unida a cada pocillo de aplicación fue proporcional a la cantidad de antígeno GPIb\alpha unido a la membrana de nitrocelulosa. Según los resultados de este ensayo, los medios de cultivo de células CHO-K1 en las cuales estaban presentes los fragmentos de los residuos del 1 al 302 de la GPIb\alpha (como formas de Thr o Met^{145}) se diluyeron (normalizaron) para obtener cantidades idénticas de antígeno GPIb\alpha.

Tras la normalización de los niveles de antígeno recombinante, se ensayaron los medios de cultivo para su reactividad con el anticuerpo anti-Sibª (véase Ejemplo 3) utilizando la misma técnica de dot-blot. Los medios de cultivo se extrajeron a vacío a través de una membrana de nitrocelulosa, bloqueada con Blotto durante 2 horas a 22-25ºC y después de incubaron durante 2 horas con suero que contenía el anticuerpo anti-Sibª o suero normal (diluciones 1:20). Tras 3 ciclos de lavado en la tampón Tris salino (TBS:Tris10 mM pH 7,5, NaCl 140 mM) que también contenía un 5% de leche desnatada en polvo, la membrana se transfirió a una solución de IgG anti-humana de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (1:500, Zymed, San Francisco, CA) durante 2 horas. Finalmente, la membrana se lavó 3 veces con TBS y se incubó en una solución que contenía O-fenilenodiamina (Zymed) y el peróxido de hidrógeno para desarrollar el color siguiendo las instrucciones del productor.

Puesto que se ha determinado que el antígeno Sibª (véase el Ejemplo 2 arriba descrito) representa el polipéptido de la GPIb\alpha que incluye Met^{145} en su locus Thr/Met^{145}, otros anticuerpos, además de Sibª que se dirijan a un epítopo de la GPIb\alpha dependientes de la presencia de un residuo Met^{145} o Thr^{145} en dicho polipéptido, se pueden utilizar de manera similar en el ensayo. Tales anticuerpos pueden ser un anticuerpo monoclonal o una población policlonal, tal como la obtenida de suero humano. Las propiedades antigénicas de otros fragmentos de la GPIb\alpha que expresen un epítopo dependiente del locus Thr/Met^{145}, pueden ser ensayados de manera similar siempre que estén adheridos a la nitrocelulosa y puedan ser reconocidos ahí por el anticuerpo.

Depósito de Cepas Útiles en la Práctica de la Invención

Un depósito de cultivos biológicamente puros de la cepa siguiente se hizo bajo el Tratado de Budapest con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, el número de acceso indicado fue asignado tras una prueba de viabilidad positiva y se pagaron las cuotas requeridas.

El acceso a dicho cultivo será disponible mientras esté pendiente la solicitud de la patente a alguien determinado por el Comisario de la Oficina de Patentes y Marcas Registradas de los Estados Unidos para que se le dé derecho a ello bajo 37 C. F. R. \NAK 1.14 y 35 U.S.A. \NAK 122 o si y cuando tal acceso se requiera por el Tratado de Budapest. Todas las restricciones sobre la disponibilidad del dicho cultivo al público serán irrevocablemente eliminadas en el momento de la garantía de una patente basada en la solicitud y dicho cultivo permanecerá permanentemente disponible para un periodo de por lo menos cinco años tras la solicitud más reciente para facilitar una muestra y en cualquier caso para un periodo de por lo menos 30 años después de la fecha del depósito. Si el cultivo llegara a ser inviable o fuera destruido sin querer, será reemplazado con un/os cultivo/s viable/s de idéntica descripción taxonómica.

Cepa/Plásmido	ATCC N^{o}.	Fecha de depósito
E. coli XS127 pMW2 (Met^{145}) 278,0	ATCC 68886	2/1/92

Claims (15)

1. Un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de éste, capaz de distinguir entre las formas aloantigénicas de la glicoproteína Ib\alpha, teniendo dicho anticuerpo o fragmento de éste como epítopo diana un dominio de la glicoproteína Ib\alpha, siendo dependiente la afinidad del dicho anticuerpo o de un fragmento de éste para dicho epítopo de la identidad del aminoácido en la posición 145 de dicha glicoproteína.

2. El anticuerpo, o un fragmento de éste, de la reivindicación 1 para el cual la posición 145 de la glicoproteína Ib\alpha, del cual depende la afinidad de dicho anticuerpo o un fragmento de éste por dicho epítopo es bien treonina o metionina.

3. El anticuerpo, o un fragmento de éste, de la reivindicación 1 que reconoce un epítopo neoantigénico, siendo dependiente la existencia de dicho epítopo neoantigénico de la presencia de metionina en la posición del residuo 145 de la glicoproteína Ib\alpha.

4. Un anticuerpo que tiene como epítopo diana la región variable de un anticuerpo monoclonal o un fragmento de éste, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3.

5. Un procedimiento de tipaje in vitro para distinguir entre las formas aloantigénicas de la glicoproteína Ib\alpha, comprendiendo dicho procedimiento las plaquetas proporcionadas, incluyendo dichas plaquetas polipéptidos de la glicoproteína Ib\alpha y la determinación, utilizando anticuerpos monoclonales o fragmentos de éstos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, si dichas plaquetas incluyen residuos de treonina o metionina, o ambos, en la posición 145 de dichos polipéptidos de la glicoproteína Ib\alpha.

6. Un producto de sangre que comprende plaquetas separadas en tres grupos según la forma aloantigénica del polipéptido de la glicoproteína Ib\alpha, un grupo conteniendo plaquetas que tienen en la posición 145 un residuo de treonina en su polipéptido de la glicoproteína Ib\alpha, un segundo grupo conteniendo plaquetas que tienen en la posición 145 un residuo de metionina en su polipéptido de la glicoproteína Ib\alpha, y el tercer grupo conteniendo plaquetas que tienen en la posición 145 residuos de metionina y treonina en su polipéptido de la glicoproteína Ib\alpha, y los medios, utilizando los anticuerpos monoclonales o fragmentos de éstos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, asociados con cada uno de dichos grupos para distinguir un grupo de los otros, para identificar un grupo dado para su uso por un paciente que necesita una transfusión de plaquetas.

7. Un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3 que comprende el paso de inmunización de un animal con un péptido que contiene hasta 30 aminoácidos, consistiendo dicho péptido de un fragmento del polipéptido de la glicoproteína Ib\alpha, en forma glicosilada o no glicosilada y conteniendo un residuo de Met^{145} o Thr^{145}.

8. Un proceso para el almacenaje de un suministro de plaquetas para su uso terapéutico en un paciente que comprende, determina, utiliza anticuerpos monoclonales o fragmentos de éstos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, si el residuo 145 de los polipéptidos de su glicoproteína Ib\alpha incluye treonina, metionina o treonina y metionina y separa dichas plaquetas en estos tres grupos respectivamente.

9. Un procedimiento para proporcionar un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, comprendiendo dicho procedimiento: (A) la fusión de una mezcla de células linfoides y células de mieloma para formar hibridomas; siendo la fuente de dichas células linfoides aquellas obtenidas de un animal que ha sido inmunizado con glicoproteína Ib\alpha o con un fragmento de ésta; (B) el aislamiento de un hibridoma que secreta un anticuerpo dirigido contra dicho epítopo; (C) el cultivo de dicho hibridoma y (D) la recolección del anticuerpo monoclonal producido a partir de él.

10. Un procedimiento in vitro de inmunoensayo, utilizando un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, para ensayar los polipéptidos de la glicoproteína Ib\alpha humana para la presencia en ellos de un residuo de Met^{145} o un residuo de Thr^{145} que comprende la puesta en contacto de dicho anticuerpo monoclonal con polipéptidos de la glicoproteína Ib\alpha y la determinación de si dichos polipéptidos de la glicoproteína Ib\alpha incluyen un residuo Met^{145} y/o un residuo Thr^{145}.

11. El procedimiento de la reivindicación 10 en el cual dicho anticuerpo monoclonal tiene una constante de afinidad de unión para dicha glicoproteína Ib\alpha de por lo menos 10^{5} litros/mol.

12. Una composición que comprende una línea celular estable híbrida capaz de producir un anticuerpo monoclonal o un fragmento de éste de una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3.

13. La composición de la reivindicación 12, en la cual la célula híbrida estable es una célula bacteriana recombinante.

14. Un procedimiento de inmunoensayo que comprende la puesta en contacto de una muestra de sangre o una composición derivada de ella con una forma aloantigénica de Thr^{145} o Met^{145} de la glicoproteína Ib\alpha y la determinación de si está presente un complejo de anticuerpo y una forma de dicha glicoproteína, de modo que la forma aloantigénica de Thr^{145} o Met^{145} de la glicoproteína Ib\alpha utilizada para determinar la presencia del anticuerpo de anti-glicoproteína Ib\alpha se selecciona del grupo constituido por:

(A)

la forma de Thr^{145} o Met^{145} de un fragmento de la glicoproteína Ib\alpha que comprende sus residuos del 1 al 300;

(B)

la forma de Thr^{145} o Met^{145} de glicocalicina; y

(C)

la forma de Thr^{145} o Met^{145} de un péptido que contiene hasta 30 aminoácidos, estando constituido dicho péptido por un fragmento del polipéptido de la glicoproteína Ib\alpha, en la forma glicosilada o no glicosilada y que contiene el residuo 145 de la glicoproteína Ib\alpha.

15. Un anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, habiendo sido dicho anticuerpo producido utilizando el procedimiento de la reivindicación 7.