ES2262994T3

ES2262994T3 - Utilizacion de l-alfa-lisofosfatidilcolina para obtener la diferenciacion in vitro de monocitos en celulas dendriticas maduras.

Info

Publication number: ES2262994T3
Application number: ES03725275T
Authority: ES
Inventors: Vincent Lotteau; Patrice Andre
Original assignee: Biomerieux SA; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Biomerieux SA; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2002-03-11
Filing date: 2003-03-07
Publication date: 2006-12-01
Anticipated expiration: 2023-03-07
Also published as: FR2836829B1; DE60305167T2; US7368287B2; WO2003076602A2; JP2005530488A; FR2836829A1; ATE325866T1; US20110135684A1; DE60305167D1; WO2003076602A3; AU2003227822A8; EP1483374B1; EP1666039A1; JP4482683B2; US20080176820A1; EP1483374A2; US20050054095A1; AU2003227822A1

Abstract

Procedimiento para la diferenciación in vitro de monocitos en células dendríticas maduras según el cual A. se dispone de monocitos en un medio de cultivo apropiado, B. se induce la diferenciación de los monocitos en células dendríticas en presencia de un factor de diferenciación, C. se añade a dicho medio L--lisofosfatidilcolina y se obtienen unas células dendríticas maduras.

Description

Utilización de L-\alpha-lisofosfatidilcolina para obtener la diferenciación in vitro de monocitos en células dendríticas maduras.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la diferenciación de monocitos en células dendríticas maduras según el cual se dispone de monocitos en un medio apropiado que permite su diferenciación y se añade a dicho medio la L-\alpha-lisofosfatidilcolina.

Las células dendríticas están implicadas en el desarrollo de una respuesta inmune y en la iniciación de una respuesta linfocitaria T específica por reconocimiento, captura y presentación de los antígenos en particular los agentes infecciosos (Steinman et al. 1997, Immuno. Rev., 156: 25-37; Cella et al. 1997, Curr. Opin. Immunol., 9 : 10-16).

Si las células dendríticas inmaduras captan y digieren los antígenos de los agentes infecciosos de manera muy eficaz, algunas señales, como los agentes bacterianos o las citoquinas inflamatorias, pueden activarlos induciendo un proceso de maduración, que es la etapa inicial del disparo de la respuesta inmunitaria adaptativa. En efecto, en el curso de esta activación las células dendríticas adquieren la capacidad de emigrar hacia los órganos linfoides donde se encuentran los linfocitos T y la capacidad de transmitir unas señales de coestimulación indispensables para la activación de los linfocitos T naives. Cuando tiene lugar esta maduración, las células dendríticas sufren unas modificaciones funcionales y fenotípicas tales como:

\bullet: un aumento de moléculas de superficie implicadas en la activación de los linfocitos T (tales como CD40, CD80, CD83, CD86 y las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (CMH) de clase I y II),

\bullet: la producción de citoquinas proinflamatorias (tales como las iterleucinas IL-12, IL-1\beta, TNF\alpha y IL-6),

\bullet: la disminución de su capacidad para captar y para preparar el antígeno.

A parte de sus capacidades de desarrollo de una respuesta inmune y de iniciación de una respuesta linfocitaria T específica, las células dendríticas maduras presentan un interés terapéutico particular, en especial en los campos de vacunación antiinfecciosa y antitumoral y de inmunoterapia (Austin. 1998, Curr. Opin. Hematol. 5: 3-15; Reise Sousa et al. 1999, Curr. Opin. Immunol. 11 : 392-399). Estas células dendríticas, a parte de su capacidad para inducir una tolerancia inmunitaria son también una diana interesante cuando se desea inhibir la respuesta inmunitaria de un paciente, en particular para luchar contra enfermedades autoinmunes o inflamatorias.

In vitro, unas células dendríticas maduras pueden ser obtenidas a partir de monocitos en cultivo. Estos monocitos son in vivo unas células circulantes que, atravesando en particular la pared vascular endotelial, entran en contacto con factores ambientales influyendo su futuro de una forma aún desconocida. Esquemáticamente, se prevén entonces tres posibilidades para estos monocitos:

\bullet: la salida de los tejidos y el retorno hacia los ganglios linfáticos,

\bullet: la diferenciación en macrófagos,

\bullet: la diferenciación en células dendríticas inmaduras.

La primera etapa para obtener unas células dendríticas maduras a partir de monocitos en cultivo, consiste entonces en inducir la diferenciación de los monocitos en células dendríticas inmaduras por en particular la interleucina IL-4 y el factor GM-CSF (Granulocyte Macrophage-Stimulating factor). Al cabo de 6 días, 95% de las células en cultivo son unas células dendríticas inmaduras.

La segunda etapa consiste a continuación en una inducción de la maduración de las células dendríticas inmaduras en células dendríticas maduras por unos agentes exógenos, tales como unos agentes bacterianos o virales. Así, la proteína kpOmpA de Klebsiella pneumoniae es capaz de inducir la maduración de estas células dendríticas inmaduras en células dendríticas maduras (P. Jeannin et al., Nature Immunology, 2000, 1: 502-509). Se puede citar también la maduración de las células dendríticas inmaduras en células dendríticas maduras por otras moléculas exógenas, tales como los lipopolisacáridos de la membrana bacteriana (Dichman et al, Journal of Cellular Phisiology, 2000, 185: 394-400). Sin embargo, la utilización de moléculas exógenas derivadas de agentes infecciosos induce problemas de seguridad y financieros, (efectos secundarios directos o indirectos in vivo; necesidad de purificación muy importante según exigencias legales o reglamentarias muy estrictas...), haciendo la utilización de este tipo de moléculas delicado en el marco de la vacunología y de la inmunoterapia.

Más recientemente, se ha descrito por Perrin-Cocon et al en 2001 (The Journal of Immunology, 167 : 3785-3791) que la producción de células dendríticas maduras a partir de monocitos en diferenciación puede ser inducida por unas moléculas endógenas, tales como algunas lipoproteínas plasmáticas oxidadas, y más particularmente las lipoproteínas de baja densidad (LDL) oxidadas. Sin embargo, las LDL oxidadas son unas partículas complejas, compuestas de proteínas, de triacilgliceroles, de fosfolipoides, de colesterol libre y esterificado, y son, por ello difíciles de sintetizar artificialmente.

Así, la presente invención se propone resolver los inconvenientes del estado de la técnica presentando una molécula proinflamatoria, molécula endógena, fácil de sintetizar y poco costosa que estimula la diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras.

De manera sorprendente, la presente invención se refiere a la utilización de L-\alpha-lisofosfatidilcolina para la diferenciación de monocitos en células dendríticas maduras in vitro.

Por L-\alpha-lisofosfatidilcolina, se entiende una molécula cuya fórmula es la siguiente:

1

en la que

2

representa una cadena larga de ácidos grasos saturados que comprende de 12 a 20 átomos de carbono, preferentemente de 16 a 18.

En efecto, una de las moléculas activas generadas durante la oxidación de las LDL es la L-\alpha-lisofosfatidilcolina, llamada a continuación LPC. Sin embargo, se ha demostrado que la fijación de la LPC sobre el receptor G2A, que es el receptor de alta afinidad de la LPC, inhibe en particular la proliferación y la activación de los linfocitos T, sugiriendo más bien una función de la LPC en la inhibición del disparo de una reacción inmunitaria (Carson & Lo, 2001, Science, 293 : 618-619 ). Además, también se ha demostrado que una alta concentración de LPC (50 \muM) inhibe la actividad del factor de transcripción NF-\kappaB (nuclear factor \kappaB), conocido no obstante para ser activado cuando tiene lugar la maduración de las células dendríticas. Además, la LPC está presente a alta concentración en el plasma, sugiriendo que no sería activa en el plasma, lo que no la predispone para ser elegida por el experto en la materia para una utilización terapéutica.

La invención se refiere a un procedimiento para la diferenciación in vitro de monocitos en células dendríticas maduras según el cual

A.: se dispone de monocitos en un medio de cultivo apropiado,

B.: se induce la diferenciación de los monocitos en células dendríticas en presencia de un factor de diferenciación,

C.: se añade a dicho medio la L-\alpha-lisofosfatidilcolina y se obtienen unas células dendríticas maduras.

Por medio de cultivo apropiado, se entiende un medio que comprende todos los elementos necesarios para la viabilidad de las células. Se puede citar a título de ejemplo el medio RPMI 1640 y sus derivados y cualquier medio de cultivo bien conocido por el experto en la materia. Este medio comprende en particular por lo menos un factor de diferenciación de los monocitos en células dendríticas. Los factores de diferenciación de los monocitos en células dendríticas son bien conocidos por el experto en la materia, y se pueden citar en particular las citoquinas tales como de manera no limitativa la interleucina IL4, el factor GM-CSF (Granulocyte Macrophage-Stimulating factor), la
IL-13, el TNF (tumor necrosis factor).

Cuando tiene lugar la etapa C) la L-\alpha-lisofosfatidilcolina es añadida en particular a dicho medio a una concentración final en el medio comprendida entre aproximadamente 10 y 80 \muM, preferentemente entre aproximadamente 20 y 60 \muM y ventajosamente entre 30 y 50 \muM. Siempre cuando tiene lugar la etapa C, la L-\alpha-lisofosfatidilcolina es añadida en dicho medio entre el 3er y 6º día de diferenciación de los monocitos, preferentemente entre el 4º y 5º día de diferenciación de los monocitos.

Según un modo particular de realización de la invención, se añade además en el medio de cultivo, cuando tiene lugar la etapa C), por lo menos un antígeno es decir una molécula (o un conjunto de moléculas) que es la diana de una respuesta inmunitaria o que permite la síntesis de esta diana. Este antígeno puede así ser elegido entre los antígenos de bacterias, de virus, de levaduras, de parásitos, de hongos, los antígenos tumorales, los lisados de células tumorales autologas y/o heterologas. Por células tumorales autologas, se entienden unas células de tumores que pertenecen al sujeto que recibe un medicamento determinado. Las células tumorales pueden ser obtenidas por extracción de tejidos cancerosos, en particular una biopsia o resección quirúrgica. Por células tumorales heterologas, se entienden unas células salidas de tumores que provienen de un sujeto diferente del que recibe un medicamento determinado. La utilización de células heterologas permite en particular obtener un medicamento que permite tratar unos pacientes afectados de cáncer de los que una extracción de células tumorales no es posible. Esto permite también utilizar una fuente estándar de antígenos tumorales. Por lisado celular, se entiende una mezcla de antígenos intracelulares y/o membranarios, obtenida por una lisis de células según un protocolo conocido por el experto en la materia, tal como una lisis mecánica, química o enzimática. Este antígeno puede también ser un ácido nucleico que codifica para por lo menos un antígeno elegido entre los antígenos de bacterias, de virus, de levaduras, de parásitos, de hongos, los antígenos tumorales. Por antígeno tumoral se entiende un antígeno salido de células tumorales, tal como un péptido tumoral, en particular un péptido que interactúa con las moléculas de clase I y presentado a los linfocitos T CD8. Se pueden citar a título no limitativo, los antígenos tumorales siguientes: MAGE-2, MAGE-3, MART, MUC-1, MUC-2, HER-2, GD-2, carcinoembryonic antigen (CEA), TAG-72, ovarian-associated antigens OV-TL3 y MOV18, TUAN, alpha-feto protein (AFP), OFP, CA-125, CA-50, CA-19-9, renal tumor-associated antigen G250, EGP-40 (o EpCAM), S 100 (malignant meanoma-associated antigen), p53, prostate tumor-associated antigens (por ejemplo, PSA y PSMA) y p21ras.

Así, la adición de este antígeno en el medio de cultivo permite obtener unas células dendríticas maduras que permiten entonces la activación de linfocitos T que son dirigidos contra un antígeno dado. Esas células dendríticas maduras, obtenidas in vitro, pueden entonces ser reinyectadas in vivo.

Además, se puede utilizar, cuando tiene lugar la etapa C, un compuesto equivalente de la L-\alpha-lisofosfatidilcolina, que es una molécula que actúa según los mismos mecanismos de acción celulares que la L-\alpha-lisofosfatidilcolina, es de decir por los mismos receptores membranarios, en particular unos receptores membranarios de proteínas G, tales como los receptores G2A, GPR4, receptor del PAF (factor de activación de plaquetas, platelet activating factor), y/o por los mismos receptores nucleares tales como los receptores PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor). Este compuesto equivalente puede así ser en particular ser un agonista de los receptores anteriormente citado (tal como en particular el O-metil-PAF, el carbamil-PAF, el 2-O-metil-PAF), pero también el propio PAF. Este compuesto puede ser también un agonista de los PPAR\delta tal como en particular el L 165041 (Merck Research), GW-501516 (Glaxo), carboprostaciclín (Cayman) o un antagonista de los PPAR\delta tal como en particular el bisfenol A diglicidil éter (Sigma), el Diclofenac®. Este compuesto equivalente de la L-\alpha-lisofosfatidilcolina puede ser utilizado solo o en sinergia con la L-\alpha-lisofosfatidilcolina. Según un modo preferido de realización de la invención, la L-\alpha-lisofosfatidilcolina es utilizada en sinergia con el factor de activación de plaquetas (PAF).

La invención se refiere también a un procedimiento para la activación de linfocitos T in vitro según el cual

A.: se dispone de monocitos en un medio de cultivo apropiado,

C.: se añade a dicho medio la L-\alpha-lisofosfatidilcolina y se obtienen unas células dendríticas maduras,

D.: se añade a dicho medio un antígeno, tal como el definido anteriormente, y se dirigen las células dendríticas maduras obtenidas en la etapa B contra dicho antígeno,

E.: se ponen en contacto las células dendríticas maduras dirigidas contra el antígeno según la etapa C con unos linfocitos T y se obtienen unos linfocitos T dirigidos contra el antígeno.

La etapa C) puede ser realizada tal como se ha descrito anteriormente. Un procedimiento de este tipo permite así obtener, in vitro, unos linfocitos T dirigidos contra un antígeno dado, que se puede a continuación reinyectar, in vivo, a un paciente, en particular inmunodeprimido. La invención se refiere también a un procedimiento para la maduración de células dendríticas in vitro según el cual

A.: se dispone de células dendríticas inmaduras en un medio de cultivo apropiado,

B.: se añade a dicho medio la L-\alpha-lisofosfatidilcolina y se obtienen unas células dendríticas maduras.

El experto en la materia conoce bien las células dendríticas y sus diferentes fases de maduración.

Cuando tiene lugar la etapa B) la L-\alpha-lisofosfatidilcolina es añadida en particular a dicho medio a una concentración final en el medio comprendida entre aproximadamente 10 y 80 \muM, preferentemente entre aproximadamente 20 y 60 \muM y ventajosamente entre 30 y 50 \muM.

Según un modo particular de realización de la invención, se añade además en el medio de cultivo, cuando tiene lugar la etapa B), por lo menos un agente biológico tal como el definido anteriormente.

La invención se refiere también a un medio de cultivo caracterizado porque comprende la L-\alpha-lisofosfatidilcolina a una concentración final comprendida entre aproximadamente 10 y 80 \muM, preferentemente entre aproximadamente 20 y 60 \muM y ventajosamente entre 30 y 50 \muM y por lo menos un factor de diferenciación tal como el definido anteriormente.

Según un modo particular de realización de la invención, el medio de cultivo comprende además un antígeno, tal como el definido anteriormente, que es en particular un antígeno de bacterias, de virus, de levaduras, de parásitos, de hongos, de lisados de células tumorales autologas y/o heterologas, un antígeno tumoral, un ácido nucleico que codifica para una antígeno de bacterias, de virus, de levaduras, de parásitos, de hongos, un ácido nucleico que codifica para un antígeno tumoral.

La invención se refiere también a la utilización de la L-\alpha-lisofosfatidilcolina como agente de activación del sistema inmunitario. Por agente de activación, se entiende una molécula que, en una composición farmacéutica, induce los efectos de una medicación o refuerza o completa los efectos de la medicación principal. En el caso de una composición vacunante, la L-\alpha-lisofosfatidilcolina desempeña entonces la función de adyuvante que estimula la respuesta inmunitaria del organismo huésped contra un antígeno dado. Así, la invención se refiere a una composición vacunante caracterizada porque comprende la L-\alpha-lisofosfatidilcolina como agente de activación del sistema inmunitario, que desempeña entonces la función de adyuvante y un antígeno tal como el definido anteriormente, contra el cual se desea estimular la respuesta inmunitaria del paciente.

Según un modo preferido de realización de la invención, se utiliza la L-\alpha-lisofosfatidilcolina como agente de activación del sistema inmunitario para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una infección de origen bacteriano, viral, fúngico, parasitario o provocada por una levadura, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de los cánceres. Como infección bacteriana, se pueden citar en particular las infecciones inducidas por los estafilococos, las micobacterias, las bacterias del género Neisseria, las legionelas, salmonelas...

Como infección viral, se pueden citar en particular las infecciones inducidas por el VIH (virus de la inmunodeficiencia humana), los virus de las hepatitis, del sarampión, la rubéola, los poliovirus, flavivirus...

Como infección fúngica, se puede citar en particular el aspergillosis, candidiasis...

Como infección parasitaria, se puede citar en particular el paludismo, la leichmaniosis...

Por cáncer, se entienden todas las enfermedades debidas a una multiplicación anormal de las células, y en particular de forma no limitativa, los mielomas, linfomas, leucemias, carcinomas del riñón, del cerebro, del colón, de la próstata, del recto, del páncreas, de los ovarios, del pulmón, del hígado, de mama, los cánceres cutáneos elegidos de entre los queratinomas y los carcinomas, los melanomas.

El medicamento según la invención puede presentarse en forma de una composición farmacéutica en asociación con por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable bien conocido por el experto en la materia. En las composiciones farmacéuticas según la invención, para la administración oral, sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, tópica, intratraqueal, rectal, transdérmica, la L-\alpha-lisofosfatidilcolina puede ser administrada en forma unitaria de administración o en mezcla con unos soportes farmacéuticos clásicos, y destinados a una administración por vía oral, por ejemplo en la forma de un comprimido, de una píldora, de una solución bebible, etc, o por vía rectal, en forma de un supositorio, por vía parenteral, en particular en forma de una solución inyectable, en particular por vía intravenosa, intradérmica, subcutánea, etc. según unos protocolos clásicos bien conocidos por el experto en la materia. Para la aplicación tópica, se puede utilizar la L-\alpha-lisofosfatidilcolina en unas cremas, pomadas, lociones, colirios.

Cuando se prepara una composición sólida en forma de comprimidos, se mezcla la L-\alpha-lisofosfatidilcolina con un excipiente farmacéuticamente aceptable también denominado vehículo farmacéutico, tal como la gelatina, el almidón, la lactosa, el estearato de magnesio, el talco, la goma arábiga o análogos. Se pueden recubrir los comprimidos de sacarosa, con un derivado celulósico, o de otras materias apropiadas. Se pueden también tratar de tales maneras que tengan una actividad prolongada o retardada y que liberen de una forma continua una cantidad predeterminada de L-\alpha-lisofosfatidilcolina. Se puede también obtener una preparación en cápsulas mezclando la L-\alpha-lisofosfatidilcolina con un diluyente y vertiendo la mezcla en unas cápsulas blandas o duras. Se puede también obtener una preparación en forma de jarabe o para la administración en forma de gotas, en la cual la L-\alpha-lisofosfatidilcolina está presente conjuntamente con un edulcorante, un antiséptico, tal como en particular el metilparabén y el propilparabén, así como un agente que da sabor o un colorante apropiado. Los polvos o los gránulos dispersables en agua pueden contener la L-\alpha-lisofosfatidilcolina en mezcla con unos agentes de dispersión o unos agentes humectantes, o unos agentes de puesta en suspensión, bien conocidos por el experto en la materia. Para una administración parenteral, se utilizan unas suspensiones acuosas, unas soluciones salinas isotónicas o unas soluciones estériles e inyectables que contienen unos agentes de dispersión, unos humectantes farmacológicamente compatibles, tales como en particular el propilenglicol o el butilenglicol.

La figura 1 representa las curvas de titulación que dan la absorbancia (Abs) en función del logaritmo de la dilución del suero del lote de ratas que reciben el LPC mezclado con lisozima de huevo de gallina (HEL, 1 mg/ml) o HEL sola.

Los ejemplos que siguen se dan a título de explicativo y no tienen ningún carácter limitativo. Permitirán comprender mejor la invención.

Ejemplo 1

Diferenciación de monocitos en cultivo en células dendríticas en presencia o ausencia de L-\alpha-lisofosfatidilcolina (LPC) Aislamiento, puesta en cultivo e iniciación de la diferenciación de los monocitos

Los monocitos son aislados de sangre periférica humana por una primera centrifugación según el gradiente de densidad (620 g; 20 minutos) en Ficoll-Hypaque, seguida de una segunda centrifugación (770 g; 20 minutos) en una solución al 50% en Percoll. Los monocitos son a continuación purificados por depleción inmunomagnética (Dynal, Oslo, Noruega), utilizando un cocktail de anticuerpos monoclonales anti-CD19 (hibridoma 4G7) (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA), anti-CD3 (OTK3, American Type Culture Collection, Rockeville, MD) y anti-CD56 (NKH1, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Los monocitos así obtenidos son entonces purificados a por lo menos 90%, como se ha mostrado por la ausencia de los marcadores CD1a y la presencia del marcador CD14. La diferenciación de los monocitos en células dendríticas es iniciada por 40ng/ml de gm-CSF (Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor) humano recombinado y 250 U/ml de interleucina IL-4 humana recombinada.

Los monocitos son puestos en cultivo en el medio RPMI 1640 (Life technologies, Rockeville, MD, USA) enriquecido por 2 mM de glutamina (Life technologies), 10 mM de Hepes (Life Technologies), 40 ng/ml de gentamicina (Life technologies) y 10% de suero de ternera fetal desprovisto de lipoproteínas (LPDS, Sigma, St Quentin-Fallavier, Francia).

Debe observarse que el medio de cultivo presentado en este ejemplo es un medio de cultivo LPDS. Unos resultados comparables pueden ser obtenidos por la utilización de otros medios de cultivo, tal como un medio FCS, es decir un medio que contiene 10% de suero de ternera fetal no desprovisto de lipoproteínas, o podrían ser obtenidos por la utilización de cualquier medio de cultivo sintético conocido por el experto en la materia.

Tratamiento de los monocitos por la LPC-5 días después del inicio de la diferenciación de los monocitos se añaden en el medio de cultivo 40 \muM de LPC durante 24 horas (L-\alpha-lisofosfatidilcolina; Sigma; St Quentin Fallavier, Francia). Unas células control son también obtenidas en ausencia de LPC en el medio de cultivo.

Se obtienen entonces unas células llamadas "controles" y unas células llamadas "LPC".

Ejemplo 2

Fenotipo de las células obtenidas según el ejemplo 1

Las células utilizadas en este análisis son las obtenidas al 6º día de diferenciación según el protocolo descrito en el ejemplo 1.

El fenotipo de las células "control" y "LPC" se analiza por citometría de flujo sobre un FACSCalibur (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA) por la utilización de conjugado FITC (isotiocianato de fluoresceína) anti-CD14, anti-HLA-DR, anti-CD80 y conjugado PE (ficoeritrina) anti-CD1a, anti-CD83, anti-CD86, anti-CD40 (Beckman Coulter). Según el estado de la técnica, los monocitos tienen preferentemente un fenotipo CD14+CD1a-, las células dendríticas inmaduras tienen preferentemente un fenotipo CD14- CD1a+ CD86-, las células dendríticas maduras tienen preferentemente un fenotipo CD-14-CD1a intermedio-CD86+.

Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 1.

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TABLA 1 Expresión de los marcadores CD83, HLA-DR y CD86 en ausencia (control) o en presencia de LPC

	CD83	HLA-DR	CD86
Control	5,79	78,76	117,77
LPC	11,74	146,31	759,69

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Las células "LPC" obtenidas después de la iniciación de la diferenciación de los monocitos en presencia de LPC, presentan un fenotipo comparable con el de las células dendríticas maduras, tal como demuestra en particular la inducción de los marcadores CD86, y el aumento de HLA-DR por comparación al fenotipo de las células "controles".

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Ejemplo 3

Capacidad de internalización de las células obtenidas según el ejemplo 1

Las células "control" y "LPC" utilizadas en este análisis son las obtenidas después de 6 días de diferenciación según el protocolo descrito en el ejemplo 1. Estas células son incubadas a 37ºC:

\bullet: durante 30 minutos con 1 mg/ml de FITC-T70-Dextran (Sigma) a fin de estimar la capacidad de internalización de estas células por endocitosis,

\bullet: durante 30 minutos con 1 mg/ml de Lucifer Yellow (ref. L0259, Sigma, St Quentin-Fallavier, Francia) a fin de estimar la capacidad de internalización de estas células por pinocitosis,

\bullet: durante 3 horas con carboxylate-modified yellow-green FluoSpheres (nombre comercial. 0,45 \mum, Molecular Probes, Leiden, The Netherlands) a fin de estimar la capacidad de internalización de estas células por macropinocitosis.

La internalización es parada sobre hielo por un tampón PBS frío que contiene 0,1% de BSA (Bovine serum Albumin, albúmina sérica bovina) y 0,05% de NaN_{3}. Las células "control" y "LPC "son lavadas 3 veces a 4ºC en este mismo tampón y la fluorescencia es cuantificada por FACScalibur (nombre comercial, Becton Dickinson).

Como muestra la tabla 2, las capacidades de internalización por endocitosis, pinocitosis y macropinocitosis están muy disminuidas por la adición de LPC en el medio de cultivo al 5º día de diferenciación de los monocitos con respecto a las células controles diferenciadas en ausencia de LPC.

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TABLA 2 Capacidad de internalización por endocitosis, pinocitosis y macropinocitosis de los monocitos diferenciados en ausencia (control) o en presencia de LPC

	Endocitosis	Pinocitosis	Macropinocitosis
Control	100%	100%	100%
LPC	53%	49%	66%

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La reducción de las capacidades de internalización es una de las características de las células dendríticas maduras. Estos resultados muestran que en presencia de LPC, los monocitos tienen una fuerte tendencia a diferenciarse en células dendríticas maduras.

Ejemplo 4

Capacidad de las células obtenidas según el ejemplo 1 para estimular los linfocitos T

Las células "control" y "LPC" utilizadas en este análisis son las obtenidas después de 6 días de diferenciación según el protocolo descrito en el ejemplo 1.

Los linfocitos T alogénicos naives son aislados de sangre periférica humana. Las células mononucleadas de la sangre periférica son aisladas por centrifugación (600 g, 20 minutos) según el gradiente de densidad en presencia de Ficoll-Hypaque. Después de eliminación de los monocitos sobre gradiente de Percoll, los linfocitos de la sangre periférica se sitúan en la fracción densa. Los linfocitos T son purificados por depleción inmunomagnética por la utilización de un cocktail de anticuerpos monoclonales anti-CD19 (anticuerpo 4G7) (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA), anti-CD16 (anticuerpo 3G8), anti-CD56 (anticuerpo NKH1), anti-glicoforin A (anticuerpo 11E4B7.6) y anti-CD14 (anticuerpo RMPO52), comercializados por Beckman Coulter.

Los linfocitos T purificados son cultivados en uno placas de cultivo de 96 pocillos con fondo plano con las células "control" o "LPC".

2X10^{5} células T son cultivadas en 200 \mul de medio de cultivo según una relación de 1:5, 1:10 ó 1:20 monocitos diferenciados en presencia o no de LPC/células T (relación DC/LT). Después de 4 días, 50 \mul del sobrenadante de cultivo son utilizados para determinar la secreción de IL-2 (interleucina 2) y de IFN\gamma (interferón gamma) por un kit ELISA (Endogen, Woburn, MA, USA).

\newpage

Como presenta la tabla 3, la secreción de IL2 y de IFN\gamma por los linfocitos T, expresada clásicamente según la relación células dendríticas/linfocito T, (relación DC/LT) está muy estimulada por las células que provienen de la diferenciación de monocitos en presencia de LPC añadida 5 días después de la iniciación de la diferenciación de los monocitos (células "LPC"), por comparación con los resultados controles (células "controles").

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TABLA 3 Estimulación de la secreción de IL2 y de IFN\gamma por linfocitos T inducida por los monocitos diferenciados en ausencia (control) o en presencia de LPC

Relación DC/LT		0,05	0,1	0,2
Control	IL-2	6 \pm 8	15 \pm 6	35 \pm 11
	IFN\gamma	41 \pm 14	51 \pm 4	119 \pm 9
LPC	IL-2	23 \pm 1	47 \pm 26	173 \pm 31
	IFN\gamma	73 \pm 47	439 \pm 108	795 \pm 19

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Estos resultados muestran un aumento de las capacidades de los monocitos diferenciados en presencia de LPC para estimular los linfocitos T alogénicos, lo que es una característica de las células dendríticas maduras. A título indicativo, unos resultados comparables se obtienen cuando la LPC está disuelta en etanol o en forma de emulsión lipídica.

Ejemplo 5

Propiedades de las células obtenidas según el ejemplo 1: comparación con unas células dendríticas maduras obtenidas por diferenciación de monocitos en presencia de LDL oxidadas

El objetivo de este ejemplo es demostrar que los mecanismos de acción puestos en juego cuando tiene lugar la diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras en presencia de LPC podrían ser diferentes de los puestos en juego cuando tiene lugar la diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras en presencia de LDL oxidadas (Perrin-Cocon et al. The Journal of Immunology, 167: 3785-3891, 2001).

En este ejemplo se utilizan unas células "control" y "LPC" tales como las obtenidas en el ejemplo 1, así como unas células "LDLox", obtenidas tal como se ha descrito en la publicación científica (Perrin-Cocon et al. The Journal of Immunology, 167: 3785-3891, 2001) es decir después de diferenciación de monocitos en cultivo en presencia de LDL oxidadas añadidas en el medio 5 días después de la iniciación de la diferenciación.

Los inventores han investigado si los inhibidores de la acción de las LDL oxidadas sobre la diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras inhibían también la acción de la LPC sobre la diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras.

Así, una solución de Intralipid® (50 \mug/ml de fosfolípidos, Fresenius Kabi, Sèvres, Francia), o una solución de moléculas sintéticas de naturaleza lipídica (lipoid E-80®, Lipoid Ag, Ludwigshafen, Alemania, 50 \mug/ml de fosfolípidos) han sido añadidas en el medio de cultivo al 5º día de diferenciación. La expresión de CD86 de las células "LPC" y "LDLox" en presencia de estos inhibidores es analizada según el protocolo descrito en el ejemplo 2, y los resultados se presentan en la tabla 4.

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TABLA 4 Inhibición (en %) de la expresión de CD86 de las células LPC y LDLox por el Intralipid® y el lipoid E-80

	Intralipid®	Lipoid E-80
LDLox	88% \pm 10	81% \pm 14
LPC	86% \pm 12	24% \pm 19

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La adición de Intralipid® inhibe la diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras por las LDL oxidadas y por la LPC de una forma comparable (inhibición del orden de 80%).

Por el contrario, de una forma sorprendente, la adición de lipoid E-80 induce una inhibición de la expresión de los CD86 de 81% cuando los monocitos son cultivados en presencia de LDL oxidadas, mientras que esta inhibición es de solamente 24% cuando los monocitos son cultivados en presencia de LPC.

Estos resultados sugieren que los mecanismos de acción de la LPC para la diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras serían diferentes de los mecanismos de acción de las LDL oxidadas.

Ejemplo 6

Mecanismos celulares implicados en la diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras en presencia de LPC

A fin de ir más adelante en la búsqueda de los mecanismos celulares de la acción de la LPC en la diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras, los inventores han buscado cuáles son los receptores que podrían estar implicados. En un primer tiempo, a fin de determinar si los receptores implicados en la acción de la LPC cuando tiene lugar la diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras pertenecían a la familia de los receptores acoplados a una proteína G, PTX (toxina pertussis; 100 ng/ml), conocida para bloquear las proteínas Gi, es añadida durante 3 horas en el medio de cultivo. El medio de cultivo es a continuación cambiado y la LPC es añadida tal como se ha descrito en el ejemplo 1.

Los resultados presentados en la tabla 5 muestran que la preincubación de los monocitos por la PTX bloquea el aumento de CD86 inducido por la LPC, sugiriendo que la acción de la LPC implica unos receptores con proteínas Gi.

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TABLA 5 Inhibición de la expresión de CD86 de las células "LPC" por la "PTX"

	Inducción de CD86
LPC	100%
LPC + PTX	10%

Estos captadores podrían ser en particular los receptores siguientes:

\bullet: receptor G2A (G2A-R): se ha demostrado recientemente que la LPC era un ligante de alta afinidad para la proteína G2A, una proteína G acoplada a un receptor expresado en los linfocitos. Además, la estimulación de G2A por la LPC induce la fosforilación de una quinasa extracelular (ERK1/2: extracelular signal-related quinases). Esta fosforilación puede por otra parte ser observada cuando tiene lugar la adición de LPC en el medio de cultivo sugiriendo la implicación del receptor G2A en la diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras por la LPC.

\bullet: receptor PAF (PAF-R) como se ha descrito anteriormente, algunos efectos de la LPC podrían implicar el receptor del PAF en diversos tipos de células,

\bullet: receptor GPR4: la LPC es también un ligante de la proteína GPR4, otra proteína G acoplada a un receptor que tiene una alta afinidad para la esfingosilfosforilcolina.

A continuación, los inventores han buscado los factores de transcripción implicados en el proceso de maduración inducido por la LPC. A fin de determinar si los PPAR están implicados en la maduración inducida por la LPC, la capacidad de enlace de los dos factores de transcripción PPAR\gamma y PPAR\delta ha sido analizada por la técnica de retardo sobre el gel. Existen 3 isotipos de receptores nucleares PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor): \alpha, \gamma y \delta. Los PPAR\gamma son las dianas de moléculas de la clase de las tiazolindionas como la Ciglitizone, utilizadas en el tratamiento de la diabetes de tipo II. Los PPAR\delta tienen un expresión más amplia y pueden ser represor de los PPAR\gamma. Los monocitos en curso de diferenciación han sido incubados durante dos horas con una solución de LPC (40 \muM) (células llamadas "LPC"). Unas células llamadas "control" son también obtenidas en ausencia de LPC en el medio de cultivo. Después de recolección de las células, las proteínas nucleares han sido extraídas con el kit Nuclear Extract Kit (SIGMA). Las proteínas nucleares han sido a continuación puestas en contacto con una sonda marcada radioactivamente que contiene un elemento de respuesta reconocido por los PPARs. Después de migración sobre un gel no desnaturalizante, una banda que contiene PPAR\gamma y un doblete que contiene PPAR\delta han sido identificados con la ayuda de anticuerpos por la técnica de Supershift. La actividad de enlace de los PPAR ha sido determinada por medición de la intensidad de estas bandas. Estas actividades están expresadas en porcentaje con respecto a las células llamadas "control".

TABLA 6 Modulación de la actividad de los PPAR\gamma y PPAR\delta por la LPC

	PPAR\gamma	PPAR\delta
Control	100%	100%
LPC	0%	263%

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El tratamiento por LPC induce una fuerte reducción de la actividad de enlace de PPAR\gamma que puede conducir a una desaparición total y estimula en gran manera la actividad de PPAR\delta.

Los inventores han utilizado a continuación un agonista de los PPAR\gamma, la Ciglitizone. Una solución de Ciglitizone (Sigma, 50 \muM) ha sido añadida al medio de cultivo al quinto día de diferenciación de los monocitos, como se ha descrito en el ejemplo 1, 15 minutos antes de la adición de una solución de LPC (40 \muM durante 2 horas). Las células obtenidas se denominan "LPC + Ciglitizone". Unas células llamadas "Ciglitizone" han sido obtenidas según el mismo protocolo pero en ausencia de LPC y unas células llamadas "LPC" han sido obtenidas como se ha descrito en el ejemplo 1, en ausencia de Ciglitizone.

La actividad de los factores de transcripción PPAR\gamma y PPAR\delta ha sido medida en estas células por la técnica de gel retard, como se ha descrito anteriormente.

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TABLA 7 La Ciglitizone bloquea la inactivación de PPAR\gamma y reduce el aumento de PPAR\delta inducido por LPC

	PPAR\gamma	PPAR\delta
Control	100%	100%
Ciglitizone	237%	106%
LPC + Ciglitizone	115%	147%

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Estos resultados indican que la Ciglitizone que activa PPAR\gamma, inhibe en gran manera el efecto de la LPC sobre los PPAR\gamma y PPAR\delta, y bloquea por ello la maduración de las células dendríticas inducida por LPC.

Las capacidades funcionales de estas células ("control", "Ciglitizone" y "LPC + Ciglitizone") para estimular unos linfocitos T (LT) han sido a continuación analizadas. Estas células han sido cultivadas como se ha descrito en el ejemplo 4, en presencia de linfocitos T alogénicos purificados. La secreción de IFN\gamma ha sido medida como en el ejemplo 4.

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TABLA 8 Reacción leucocitaria mixta: medición de la secreción de IFN\gamma por los linfocitos T inducida por las células dendríticas

Relación DC/LT	0,05	0,1	0,2
Control	54 \pm 82	69 \pm 4	364 \pm 27
LPC	750 \pm 184	899 \pm 124	1326 \pm 248
LPC + Ciglitizone	93 \pm 7	169 \pm 105	484 \pm 229

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El conjunto de estos resultados subraya una función importante de los PPAR en la maduración de las células dendríticas inducida por LPC así como la importancia de la relación PPAR\gamma / PPAR\delta en la génesis de células dendríticas funcionalmente maduras. Esta relación es modulada por la LPC y la Ciglitizone.

Ejemplo 7

Diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras en presencia de compuestos equivalentes a la LPC

Los inventores han determinado si unos compuestos equivalentes a la LPC, es decir que implican los mismo mecanismos de acción celulares a través de los mismos receptores membranarios o intracelular, podían también inducir la diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras.

Para ello, los inventores han buscado si la adición de PAF en el medio de cultivo podía aumentar la acción de la LPC sobre la diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras.

Así, una solución de PAF (Sigma, 5 \muM) ha sido añadida en el medio de cultivo al 5º día de diferenciación de los monocitos. La expresión de CD86 de las células "control", y de las células "LPC", obtenidas en presencia o en ausencia de PAF, es analizada según el protocolo descrito en ele ejemplo 2, y los resultados se presentan en la
tabla 9.

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TABLA 9 Expresión del marcador CD86 (intensidad media de fluorescencia) de las células "controles" y "LPC" en presencia o en ausencia de PAF

	CD86
Control	49,02
PAF	102,88
LPC	287,11
LPC + PAF	676,88

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Estos resultados sugieren que el PAF solo induce una ligera sobreexpresión de CD86 contrariamente a la LPC que induce un aumento de la expresión de CD86 de 470%. Por el contrario, es importante observar que el PAF actúa en sinergia con la LPC, puesto que la acción de los dos compuestos induce un aumento de la expresión de CD86 de más de 1200%. A fin de reforzar la implicación del receptor al PAF, los inventores han estudiado la acción de un antagonista de este receptor sobre la diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras por la
LPC.

Así, una solución del antagonista BN52021 del PAF (Biomol, Plymouth Meeting, USA, 100 \muM) ha sido añadida en el medio de cultivo al 5º día de diferenciación de los monocitos. La expresión de CD86 de las células "controles" y "LPC", obtenidas en presencia o en ausencia de BN52021, es analizada según el protocolo descrito en el ejemplo 2, y los resultados se presentan en la tabla 10.

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TABLA 10 Expresión de CD86 de las células "LPC" en presencia del antagonista BN52021

	CD86
LPC	100%
LPC + BN52021	54%

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Estos resultados sugieren que la acción de la LPC implica bien el receptor del PAF pero sugieren también que la acción de la LPC podría implicar otros receptores.

A título indicativo, los inventores han demostrado también que el antagonista BN52021 añadido en el medio de cultivo al 5º día de diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras inducidas por unas LDL oxidadas inducía una inhibición de 100% de la acción de las LDL oxidadas, sugiriendo aquí también, que los mecanismos de acción de la LPC y de las LDL oxidadas serían diferentes.

Ejemplo 8

Estimulación in vivo de la respuesta inmune contra un antígeno por la LPC

El objetivo de este ejemplo es demostrar que la LPC es una molécula adyuvante del sistema inmunitario, que puede ser utilizada en el marco de la inmunización para aumentar la respuesta T específica contra un antígeno.

La LPC es un producto inflamatorio. En este ejemplo, una solución de LPC de 100 a 500 nmol disuelta en 50 \mul de PBS son inyectados en el cojín plantar de ratas BALB/c (Charles River Laboratoires) el día 0. Los cojines plantares son medidos con la ayuda de un micrómetro antes y después de la inyección, hasta el 10º día, y comparado con los cojines plantares de ratas "controles", obtenidos por inyección de PBS (50 \mul). La intensidad de la inflamación es traducida por el engruesado de la pata. El máximo de engruesado es observado al 1er día, 24 horas después de la inyec-
ción.

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TABLA 11 Inflamación del cojín plantar inducida por la LPC - engruesado de la pata después de 24 h (en mm)

	Engruesado de la pata (mm)
PBS	0,025
LPC 100 nmol	0,35
LPC 200 nmol	0,55
LPC 300 nmol	0,725
LPC 400 nmol	1,125
LPC 500 nmol	1,075

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Estos resultados muestran que la LPC induce una inflamación que depende de la dosis inyectada.

A fin de demostrar que la PLC induce in vivo la maduración y por tanto la emigración de las células dendríticas hacia los ganglios drenantes, una solución de LPC (0,1 M en dibutil-ftalato) ha sido aplicada sobre la piel de las orejas de ratas BALB/c (Charles River Laboratoires), 10 minutos antes de la aplicación de una solución de FITC (Sigma) al 1,5% en dibutil-ftalato/acetona 1:1. Este marcador fluorescente es capturado por las células dendríticas de la piel. Después de 24 h, los ganglios auriculares y maxilares son extraídos y las células son puestas en suspensión. La suspensión celular es enriquecida con células dendríticas por centrifugación sobre gradiente de metrizamida (Sigma). Las células son marcadas por un anticuerpo (Pharmingen) que reconoce las moléculas de clase II del Complejo Principal de Histocompatibilidad (CMH) y el análisis en citometría de flujo permite cuantificar el porcentaje de células de gran tamaño (células dendríticas), que expresan las moléculas de clase II del CMH y que contiene FITC. Estas células son unas células presentadoras que han capturado el FITC en la periferia y que han emigrado hacia los
ganglios.

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TABLA 12 Estimulación de la emigración de las células dendríticas por la LPC

	Células dendríticas FITC^{+}
FITC	7,1 \pm 1,7%
LPC + FITC	19,3 \pm 3,3%

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Estos resultados muestran que la aplicación de LPC estimula la emigración de las células dendríticas por la piel hacia los ganglios drenantes.

La LPC estimula la respuesta T específica de un antígeno soluble coinyectado. La LPC disuelta en PBS (250 o 500 nmol en 50 \mul) es mezclada con lisozima de huevo de gallina (HEL, 50 \mug) y esta mezcla es inyectada en el cojín plantar de ratas BALB/c. Después de 7 días, los ganglios popliteos son extraídos, y sus células son reestimuladas en triplicado in vitro, en un medio de cultivo que contiene 30 \muM de antígeno HEL o en ausencia de HEL. Después de 3 días, la proliferación de los linfocitos T es medida por incorporación de timidina tritiada durante 16 h.

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TABLA 13 Proliferación de las células T específicas de HEL (incorporación de timidina tritiada en CPM; mediana de los triplicados)

Condiciones de inmunización	Proliferación en ausencia de HEL	Reestimulación por HEL (30 \muM)
HEL	1315 \pm 275	5370 \pm 1983
HEL + LPC 250 nmol	1608 \pm 7	10885 \pm 2861
HEL + LPC 500 nmol	2101 \pm 87	23739 \pm 4265

Estos resultados muestran que la LPC coinyectada con el antígeno favorece la activación in vivo de los linfocitos T específicos de este antígeno.

La LPC estimula la producción de anticuerpos específicos contra un antígeno soluble coinyectado. La LPC disuelta en PBS (350 nmol en 50 \mul) es mezclada con lisozima de huevo de gallina (HEL, 1 mg/ml) y esta mezcla es inyectada en el cojín plantar de ratas BALB/c. El lote de ratas denominado "HEL + LPC" recibe 50 \mul de esta mezcla en los cojines de las dos patas posteriores. El lote de ratas llamado "HEL" recibe 50 \mul de solución HEL (1 mg/ml en PBS) en las dos patas. Después de 15 días, se realiza una inyección de recuerdo en subcutáneo en los 2 flancos. El lote "HEL + LPC" recibe en cada flanco 100 \mul de una solución de LPC (5 mM) y de HEL (1 mg/ml) en PBS. El lote "HEL" recibe en cada flanco 100 \mul de una solución de HEL (1 mg/ml) en PBS. Dos semanas más tarde, la sangre de las ratas es extraída y los IgG específicos del antígeno HEL son dosificados por ELISA con respecto a una gama de solución estándar de IgG. Las curvas de titración que dan la absorbancia (Abs) en función del logaritmo de la dilución del suero están representadas en la figura 1. Estos resultados sugieren que la LPC coinyectada con el antígeno favorece la activación del sistema inmunitario e induce la síntesis de anticuerpos específicos del antígeno mientras que la inyección del antígeno solo no induce respuesta. La LPC induce una respuesta humoral contra el antígeno, demostrando su capacidad de adyuvante.

La LPC puede inducir una respuesta de los linfocitos T CD8+in vivo. En este ejemplo, ha sido utilizado un test de hipersensibilidad retardada de contacto a los haptenos. En este modelo, unas ratas BALB/c son sensibilizadas por la aplicación de un hapteno, el DNFB (1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno, solución a 0,5% en aceite de oliva/acetona 1:1), sobre la espalda. Cinco días más tarde, una dosis no irritante de DNFB (solución al 0,2% en aceite de oliva/acetona 1:1) es aplicada en la oreja izquierda mientras que la oreja derecha recibe el solvente. En esta fase de revelado de los linfocitos T CD8^{+} específicos de las proteínas haptenizadas son reclutados e inflitran la oreja, segregando IFN\gamma y produciendo un edema.

Un lote de ratas llamado "control" ha sido sensibilizado por el DNFB solo y otro lote (ratas "LPC") ha recibido 500 nmol de LPC por aplicación sobre la piel de la espalda de 20 \mul de una solución etanólica de LPC, 10 minutos antes de la aplicación del DNFB. Cinco días más tarde, los dos lotes han sido tratados de la misma manera para la fase de revelado y el engruesado de las orejas ha sido medido con la ayuda de un micrómetro 48 h después de esta aplicación.

TABLA 14 Medición del edema de la oreja

	Engruesado de la oreja derecha	Engruesado de la oreja izquierda
	(\mum)	(\mum)
Control	0 \pm 4	67 \pm 32
LPC	0 \pm 3	149 \pm 31

Estos resultados demuestran que la aplicación de LPC 10 minutos antes del hapteno cuando tiene lugar la fase de sensibilización aumenta el edema inducido cuando tiene lugar la 2ª aplicación del hapteno (revelado). Esto significa que la LPC estimula la respuesta producida por los linfocitos T CD8+.

Ejemplo 9

Acción de una emulsión lipídica tal como el Intralipid® sobre la diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras

Puesto que se ha demostrado en el ejemplo 5 que una emulsión lipídica tal como el Intralipid® bloquea la génesis de células dendríticas maduras inducida por LPC, los inventores han buscado también si este bloqueo provenía de una acción indirecta de esta emulsión lípidica a través de un inhibición de la acción de la LPC y/o de una acción directa de esta emulsión lipídica.

El Intralipid® regula in vitro los PPAR. En un primer tiempo, una solución de Intralipid® (50 \mug/ml de fosfolípidos) ha sido añadida al medio de cultivo al 5º día de diferenciación de los monocitos, según un protocolo comparable con el descrito en el ejemplo 6. Las células han sido recolectadas después de 1h, 2h u 8h de incubación con el Intralipid®, las proteínas nucleares han sido extraídas y la actividad de los PPAR\gamma y PPAR\delta ha sido determinada como se ha descrito en el ejemplo 6.

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TABLA 15 Modulación de la actividad de los PPAR\gamma y PPAR\delta de los monocitos en curso de diferenciación por el Intralipid®

Tiempo de incubación con el Intralipid (h)	PPAR\gamma	PPAR\delta
0	100%	100%
1	130%	94%
2	160%	94%
8	170%	77%

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Estos resultados demuestran que el Intralipid® solo, activa PPAR\gamma e inhibe la actividad de PPAR\delta. Esta acción del Intralipid® es opuesta a la de la LPC.

En un segundo tiempo, una solución de Intralipid® (50 \mug/ml de fosfolípidos) ha sido añadida en el medio de cultivo al 5º día de diferenciación de los monocitos, 15 min antes de la adición de una solución de LPC (40 \muM) (células llamadas "LPC + Intralipid"). Unas células llamadas "Intralipid" han sido también obtenidas en ausencia de LPC. Unas células llamadas "LPC" han sido obtenidas en ausencia de Intralipid®. Las células han sido recolectadas después de 2h de incubación, las proteínas nucleares han sido extraídas y la actividad de los PPAR\gamma y PPAR\delta ha sido determinada como se ha descrito en el ejemplo 6.

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TABLA 16 El Intralipid® bloquea la generación de células dendríticas maduras inducida por LPC modulando la actividad de los PPAR\gamma y PPAR\delta

	PPAR\gamma	PPAR\delta
Control	100%	100%
Intralipid	156%	99%
LPC	1%	160%
LPC + Intralipid	40%	80%

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El Intralipid® bloquea también la acción de la LPC modulando la actividad de los PPAR\gamma y PPAR\delta.

EL Intralipid® bloquea in vivo la inflamación y la respuesta inmune inducida por LPC. En este ejemplo, 3 lotes de ratas BALB/c son inmunizadas contra el antígeno de lisozima de huevo de gallina (HEL) por inyección de 50 \mul de solución en el cojín plantar. El lote control "HEL" recibe 50 \mug de HEL, el lote "HEL + Intralipid" recibe una mezcla de Intralipid® (45 \mul) y de 50 \mug de HEL (5 \mul de una solución con 10 mg/ml). El lote "HEL +LPC" recibe 50 \mug de HEL con 350 nmol de LPC disuelta en PBS. El lote "HEL + LPC+ Intralipid" recibe 50 \mug de HEL mezclado con 350 nmol de LPC disuelta en 45 \mul de Intralipid®. Después de 24 horas, el espesor de los cojines es medido con la ayuda de un micrómetro y comparado con la medida realizada antes de la inyección. La diferencia de espesor es proporcional a la intensidad de la inflamación.

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TABLA 17 El Intralipid reduce la inflamación inducida in vivo por LPC

	Engruesado medio de la pata a 24 h (mm)
HEL + Intralipid	0,19 \pm 0,04
HEL + LPC	1,07 \pm 0,19
HEL + LPC + Intralipid	0,45 \pm 0,04

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Estos resultados muestran que la inyección de Intralipid® al mismo tiempo que la LPC reduce un 70% la inflamación del cojín plantar inducida por LPC.

Siete días después de la inyección, los ganglios popliteos son extraídos y sus células son reestimuladas in vitro en triplicado, en un medio de cultivo que contiene 10 \muM de HEL o en ausencia de HEL. Después de 3 días, la proliferación de los linfocitos T específicos de HEL es medida por incorporación de timidina tritiada durante 16 h.

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TABLA 18 Proliferación de las células T específicas de HEL (mediana de las ratas)

Condiciones de inmunización	Proliferación en ausencia de HEL	Reestimulación por HEL
	(cpm)	(10 mM) (cpm)
HEL	370 \pm 212	738 \pm 408
HEL + LPC	2568 \pm 1570	11340 \pm 4426
HEL + LPC + Intralipid	1124 \pm 541	3959 \pm 2103

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Estos resultados muestran que el Intralipid® inyectado al mismo tiempo que la LPC bloquea la estimulación de la respuesta T inducida por LPC.

El conjunto de estos resultados muestra que el Intralipid® bloquea la génesis de células dendríticas maduras inducida por LPC, por una acción indirecta del Intralipid® a través de una inhibición de la acción de la LPC pero también por una acción directa del Intralipid® sobre los PPAR, antagonista de la LPC. Estos resultados muestran que el Intralipid® solo tiene una función antiinflamatoria. El conjunto de estos resultados muestra la importancia de la relación PPAR\gamma/PPAR\delta en la génesis de células dendríticas funcionalmente maduras. Esta relación es modulada por la LPC, pero también, de una forma inversa, por una emulsión lipídica tal como el Intralipid® y la ciglitizone.

Claims

1. Procedimiento para la diferenciación in vitro de monocitos en células dendríticas maduras según el cual

A.: se dispone de monocitos en un medio de cultivo apropiado,

C.: se añade a dicho medio L-\alpha-lisofosfatidilcolina y se obtienen unas células dendríticas maduras.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 según el cual, cuando tiene lugar la etapa B) la L-\alpha-lisofosfatidilcolina es añadida a dicho medio a una concentración final en el medio comprendida entre aproximadamente 10 y 80 \muM.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2 según el cual, cuando tiene lugar la etapa B) la L-\alpha-lisofosfatidilcolina es añadida en dicho medio entre el 3º y 6º día de diferenciación de los monocitos

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque, cuando tiene lugar la etapa C), se añade además, en el medio de cultivo por lo menos un antígeno.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque el antígeno es un antígeno de bacterias, de virus, de levaduras, de parásitos, de hongos, de lisados de células tumorales autologas y/o heterologas, un antígeno tumoral, un ácido nucleico que codifica para una antígeno de bacterias, de virus, de levaduras, de parásitos, de hongos, un ácido nucleico que codifica para un antígeno tumoral.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque, cuando tiene lugar la etapa C), se añade además, en el medio de cultivo un factor de activación de las plaquetas (PAF).

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el factor de diferenciación se elige entre la interleucina 4, el GM-CSF, la interleucina 13, el TNF.

8. Procedimiento para la activación de linfocitos T in vitro según el cual

A.: se dispone de monocitos en un medio de cultivo apropiado,

C.: se añade a dicho medio L-\alpha-lisofosfatidilcolina y se obtienen unas células dendríticas maduras,

D.: se añade a dicho medio un antígeno y se dirigen las células dendríticas maduras obtenidas en la etapa C contra dicho antígeno,

E.: se ponen en contacto las células dendríticas maduras dirigidas contra el antígeno según la etapa D con unos linfocitos T y se obtienen unos linfocitos T dirigidos contra el antígeno.

9. Procedimiento para la maduración de las células dendríticas in vitro según el cual

B.: se añade a dicho medio L-\alpha-lisofosfatidilcolina y se obtienen unas células dendríticas maduras.

10. Medio de cultivo, caracterizado porque comprende L-\alpha-lisofosfatidilcolina a una concentración final en el medio comprendida entre 10 y 80 \mum y por lo menos un factor de diferenciación de los monocitos en células dendríticas.

11. Medio de cultivo según la reivindicación 10, caracterizado porque comprende además un antígeno.

12. Medio de cultivo según la reivindicación 11, caracterizado porque el antígeno es un antígeno de bacterias, de virus, de levaduras, de parásitos, de hongos, de lisados de células tumorales autologas y/o heterologas, un antígeno tumoral, un ácido nucleico que codifica para un antígeno de bacterias, de virus, de levaduras, de parásitos, de hongos, un ácido nucleico que codifica para un antígeno tumoral.

13. Medio de cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque el factor de diferenciación se elige entre la interleucina 4, el GM-CSF, la interleucina 13, el TNF.

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14. Utilización de L-\alpha-lisofosfatidilcolina como agente de activación del sistema inmunitario para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una infección de origen bacteriano, viral, fúngico, parasitario o provocada por una levadura.

15. Utilización de L-\alpha-lisofosfatidilcolina como agente de activación del sistema inmunitario para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de los cánceres.

16. Composición vacunante, caracterizada porque comprende L-\alpha-lisofosfatidilcolina como agente de activación del sistema inmunitario y un antígeno.