ES2260790T3 - Estimulacion de los mecanismos de defensa del huesped contra los ataques virales. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UN PROCEDIMIENTO PARA ESTIMULAR LOS MECANISMOS DE DEFENSA ANFITRIONES EN UN MAMIFERO POR MEDIO DE LA ADMINISTRACION AL MAMIFERO DE UNA CANTIDAD TERAPEUTICAMENTE EFECTIVA DE UNA INTERFERONA POR MEDIO DEL CONTACTO OROMUCOSAL. LA CANTIDAD DE INTERFERONA ADMINISTRADA ES MENOR QUE LA CANTIDAD QUE INDUCE LA RESPUESTA PATOLOGICA CUANDO SE ADMINISTRA PARENTERALMENTE.

Description

Estimulación de los mecanismos de defensa del huésped contra los ataques virales.

Esta invención se refiere a procedimientos de estimulación de los mecanismos de defensa de un huésped contra los procesos patológicos en un huésped humano mediante la administración de interferón a través de la oromucosa. En particular, la invención se puede aplicar a procedimientos para el tratamiento de enfermedades víricas.

Antecedentes de la invención

El interferón-\alpha (IFN-\alpha) se usa ampliamente en el tratamiento de una variedad de trastornos, incluyendo la leucemia, los linfomas, el sarcoma de Kaposi relacionado con el SIDA, y la hepatitis. (Gutterman, J. U., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 91:1198-1205 (1994); US 5.286.748). El interferón-\beta (IFN-\beta) está autorizado para uso clínico en el tratamiento de la esclerosis múltiple remitente recurrente y de la infección crónica con el virus de la hepatitis B. El interferón-\alpha y el interferón-\beta son ambos interferones del Tipo I. Aunque habitualmente se emplean un cierto número de vías de administración, incluyendo la intravenosa, la subcutánea, la intramuscular, la tópica, y la inyección intralesional, para la administración de los interferones del Tipo I, la vía oral no se ha usado generalmente porque los interferones son proteínas que se considera que son inactivadas por los enzimas proteolíticos y que no se absorben de forma apreciable, en su forma nativa, en el tracto gastrointestinal. De hecho, un cierto número de estudios no han conseguido detectar interferones en la sangre tras la administración oral (Cantell y Pyhäla, J. Gen. Virol., 20:97-104 (1973); Wills et al., J. IFN Res., 4:399-409 (1984); Gilson et al., J. IFN Res., 5:403-408 (1985)).

Se ha observado que los inductores del interferón son capaces de proteger los ratones frente a la infección experimental con paludismo por Plasmodium berghei, y que esta protección es mucho más efectiva frente a la infección inducida por el esporocito que frente a la infección inducida por la formas sanguíneas del parásito (Jahiel et al., Science, 16:1802 (1986); Nature, 220:710 (1968); Amer. J. Trop. Med Hyg., 18:823 (1969)). Los ratones inyectados intraperitoneal o intravenosamente con interferón de sueros mezclados, procedentes de ratones infectados con el virus de la enfermedad de Newcastle, se protegieron frente al paludismo de Plasmodium berghei inducido por esporocito. Sin embargo, el interferón de suero de conejo no fue efectivo. La protección se obtuvo cuando el interferón se inyectó durante la fase pre-eritrocítica del desarrollo del parásito (es decir, tres horas antes o hasta aproximadamente 40 horas después de la inoculación del esporocito [Jahiel et al., Nature, 227:1350-1351 (1970)]).

Ha habido un cierto número de informes anecdóticos sobre la eficacia de dosis bajas de interferón administradas como un aerosol nasal o como una formulación líquida oral en el tratamiento de una variedad de procesos víricos, particularmente de la gripe. Sin embargo, en la mayoría de estos informes, las preparaciones de interferón eran relativamente brutas. Un ensayo controlado con placebo de interferón intranasal en dosis elevadas para el tratamiento de la infección con rinovirus mostró que el tratamiento era efectivo, pero que la incidencia de efectos secundarios era significativa (Hayden et al., J. Infect. Dis., 148:914-921(1983). De manera similar, aunque varios estudios, incluyendo dos ensayos clínicos aleatorizados de doble ciego (Douglas et al., New Engl. J. Med., 314:65-80 (1986); Hayden et al., New Engl. J. Med., 314:71-75 (1986)), han demostrado la eficacia de dosis elevadas administradas nasalmente de interferón-\alpha2 recombinante en la protección de sujetos expuestos frente a infecciones por rinovirus, estos estudios no proporcionaron ninguna evidencia de un efecto sistémico.

Más recientemente, una serie de documentos de patentes han descrito el uso de dosis bajas de interferón administrado oralmente para el tratamiento de la rinotraqueitis infecciosa ("fiebre de embarque") en el ganado, y de la leucemia felina, y también para el tratamiento de otros procesos patológicos, para una mejora de la eficacia de las vacunas; para mejorar la eficiencia en la utilización de la comida; y para la prevención de la theileriosis bovina. Ver respectivamente la patente estadounidense nº 4.462.985, la patente australiana nº 608.519, la patente australiana nº 583.332 y la patente estadounidense nº 5.215.741. En estas especificaciones, el interferón usado era interferón-\alpha humano preparado según el procedimiento de Cantell, administrado en solución salina tamponada con fosfato, en una dosis de 0,01 a 5 IU por libra de peso corporal. Aunque estas especificaciones sugieren que dosis tan bajas de interferón administradas a la mucosa orofaríngea, preferiblemente en una forma adaptada para un contacto prolongado con la mucosa oral, podrían ser eficaces para el tratamiento de una amplia variedad de procesos, la evidencia experimental para procesos distintos de la fiebre de embarque, la leucemia felina, el parvovirus canino y la theileriosis es mayoritariamente anecdótica.

Se han revisado estudios más recientes sobre los efectos de dosis muy bajas de interferón administradas a través de la mucosa orla u orofaríngea (Bocci, Clin. Pharmacokinet., 21:411-417 (1991); Critic. Rev. Therap. Drug Carrier Systems, 9:91-133 (1992); Cummins y Georgiades, Archivum Immun. Therap. Exp., 41:169-172 (1993)). Se ha propuesto que este tipo de tratamiento es particularmente útil para el tratamiento de la infección por VIH, y que al menos puede mejorar la calidad de vida en los pacientes del SIDA (Kaiser et al., AIDS, 6:563-569 (1992); Koech et al., Mol. Biol. Ther., 2:91-95 (1990)). Sin embargo, otros informes indican que tales tratamientos no proporcionan beneficio clínico. También se ha descrito un estudio de la Fase I sobre el uso de pastillas orales que contienen dosis bajas de interferón en el tratamiento de la hepatitis B (Zielinska et al., Archiv. Immunol Therap. Exp., 41:241-252 (1993)).

En cambio, la Solicitud de Patente Internacional Nº WO 95/27.499 de Brigham and Women's Hospital mostró que el interferón-\beta administrado mediante intubación gástrica podía suprimir, al menos parcialmente, el desarrollo de enfermedades autoinmunes, tales como la diabetes del Tipo I y la artritis autoinmune en modelos animales bien reconocidos, si se administraba antes del agente inductor. El interferón-\beta administrado mediante esta vía, o intraperitonealmente, conjuntamente con un antígeno "espectador" intragástrico, fue aún más efectivo para inducir la tolerancia. Esto sugiere que el interferón-\beta es efectivo para potenciar la inducción de la tolerancia oral, en lugar de inducir respuestas, bien humorales o celulares, contra antígenos exógenos.

Descripción resumida de la invención

Esta invención proporciona un procedimiento para estimular los mecanismos de defensa del huésped en un humano a través de la administración por vía oromucosa de un interferón. En un aspecto, la invención podría considerarse como un procedimiento de estimulación de la respuesta inmune en un humano mediante la administración al humano de una cantidad inmunoestimuladora de un interferón a través del contacto por vía oromucosa.

Esta invención proporciona un procedimiento para tratar enfermedades víricas en un mamífero a través de la administración al mamífero de un cantidad terapéuticamente efectiva de un interferón a través del contacto por vía oromucosa. La cantidad de interferón administrada es menor que la cantidad que induce una respuesta patológica cuando se administra parenteralmente. Esta invención proporciona un procedimiento para tratar enfermedades víricas, tales como el cáncer del cuello del útero, el herpes genital, la hepatitis B y C, el VIH, el VPH, y el VSH-1 y 2.

La administración por vía oromucosa podría implicar la administración de una dosis efectiva de interferón en una única dosis, o la dosis efectiva podría administrarse en un conjunto de dosis menores a lo largo de un período de tiempo suficiente para producir una estimulación de las defensas del huésped equivalente a la de una única dosis. De igual modo, la dosis efectiva de interferón podría administrarse continuamente a lo largo de un período de tiempo suficiente para producir una estimulación de las defensas del huésped equivalente a la de una única dosis.

El procedimiento podría realizarse administrando desde aproximadamente 1 \times 10^{4} IU hasta aproximadamente 20 \times 10^{6} IU de interferón por día, más preferiblemente desde aproximadamente 1 \times 10^{4} IU hasta aproximadamente 1 \times 10^{6} IU de interferón por día, a condición de que la dosis escogida no induzca una respuesta patológica cuando se administra parenteralmente, o sea inferior a una dosis que induciría una respuesta patológica cuando se administrara parenteralmente. Esos intervalos de dosis generalmente se refieren al interferón-\alpha homólogo en un humano. Un médico que trate a un paciente con un determinado interferón será capaz de identificar fácilmente el intervalo de dosis terapéutica apropiado según la invención.

Una composición farmacéutica para administración por vía oromucosa podría comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un interferón. La composición podría proporcionarse como una solución, comprimido, pastilla, gel, jarabe, pasta, o un sistema de suministro por vía oromucosa de liberación controlada. Opcionalmente, la composición podría contener tampones, estabilizantes, agentes espesantes, potenciadores de la absorción y viscosidad, y similares.

La composición farmacéutica podría proporcionarse en forma de dosis unitaria que contiene desde aproximadamente 1 \times 10^{4} IU hasta aproximadamente 20 \times 10^{6} IU de interferón, más preferiblemente desde aproximadamente 1 \times 10^{4} hasta aproximadamente 1 \times 10^{6} IU de interferón.

El procedimiento podría realizarse, bien como única estrategia terapéutica, bien conjuntamente con otra terapia, o con otras citocinas, tales como las interleucinas-2, -12 ó -15, o con inductores del IFN.

El procedimiento se lleva a cabo usando un interferón del Tipo I o II, seleccionado de entre los interferones \alpha, \beta, \gamma, \omega, y consenso, lo más preferiblemente con un IFN-\alpha recombinante.

Descripción detallada de la invención

La invención se describirá ahora en detalle, sólo a modo de referencia, usando las siguientes definiciones y ejemplos.

Definiciones

Tal y como se usa en la presente, "interferón" se refiere a un interferón del Tipo I o II, incluyendo aquéllos denominados habitualmente como \alpha, \beta, \gamma, y \omega, y mezclas de los mismos, incluyendo la secuencia consenso. Los interferones están disponibles a partir de una amplia variedad de fuentes comerciales y están aprobados para el tratamiento de numerosas indicaciones. El interferón podría proceder de fuentes naturales, pero preferiblemente es un producto recombinante. Para los objetivos de la invención, el término "interferón" incluye también los polipéptidos o sus fragmentos que tienen la actividad del interferón, y las formas quiméricas o mutantes del interferón en las cuales se han introducido modificaciones en la secuencia, por ejemplo, para potenciar la estabilidad, sin afectar la naturaleza de su actividad biológica, tal y como se describe en las patentes estadounidenses nº 5.582.824, 5.593.667, y 5.594.107, entre otras.

Aunque debe entenderse claramente que la invención es aplicable a cualquier estado patológico en el que la estimulación de los mecanismos de defensa o inmunoestimulación es beneficiosa, preferiblemente el estado patológico es una infección vírica. Se entenderá que para los propósitos de la invención, el interferón podría usarse solo o conjuntamente con otro agente o tratamiento.

Opcionalmente, el interferón podría administrarse de forma concurrente con un inductor de la síntesis y liberación del interferón. El inductor podría administrarse junto con el interferón, o podría administrarse por separado. Se conocen una variedad de inductores del interferón, por ejemplo, polinucleótidos, tales como el poli I:C; preferiblemente se usa un inductor de interferón que puede administrarse oralmente con peso molecular bajo. En la técnica, se conocen inductores apropiados, por ejemplo, el Tilorone (patente estadounidense nº 3.592.819; Albrecht et al., J. Med. Chem., 17:1150-1156 (1974)) y el derivado de quinolona Imiquimod (Savage et al., Brit. J. Cancer, 74:1482-1486 (1996)).

Los procedimientos y composiciones de la invención podrían usarse opcionalmente conjuntamente con uno o más de otros tratamientos para el proceso concreto, y el médico responsable será capaz de seleccionar fácilmente dicho otro tratamiento según podría ser apropiado para determinadas circunstancias.

El proceso vírico podría ser una infección aguda o fulminante, tal como el rinovirus, la gripe, herpes varicela, herpes zóster, fiebre del dengue, o la encefalitis vírica, incluyendo, pero no limitándose a la encefalitis del virus del sarampión, la encefalitis de Murray Valley, la encefalitis Japonesa B, la encefalitis transmitida por garrapatas y la encefalitis del herpes; las fiebres hemorrágicas, tales como el virus del ébola, el virus de Marburg, la fiebre de Lassa, las infecciones por virus Hanta, y el morbilivirus equino. En muchos de estos procesos, no hay tratamiento y/o vacuna disponible actualmente, y los tratamientos de apoyo podrían no ser apropiados. Alternativamente, el proceso vírico podría ser el resultado de una infección crónica, tal como la hepatitis B, la hepatitis C, la hepatitis D u otras formas de hepatitis vírica, y la infección por VMC, VIH, VPH, y VSH I y II. La hepatitis B y hepatitis C se tratan actualmente con interferón parenteral; el tratamiento a largo plazo con interferón en la infección con VIH que ha progresado a SIDA está en ensayo clínico.

De nuevo, el procedimiento y la forma de dosificación de la invención podrían usarse conjuntamente con otros tratamientos. Por ejemplo, para la infección con virus herpes podrían usarse el aciclovir o el ganciclovir. Para la infección con VIH, podrían usarse la azidotimidina (zidovudina) o uno o más de otros inhibidores de la transcriptasa inversa del VIH; y/o inhibidores de la proteasa del VIH.

En la preparación de las composiciones farmacéuticas para su utilización en esta invención podrían usarse una diversidad de vehículos y excipientes para el IFN, tal y como será evidente para el experto en la materia. La tecnología de formulación representativa se enseña, entre otros, en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 19ª edición, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995, y sus ediciones precedentes. La formulación del IFN podría comprender potenciadores de la estabilidad, tales como la glicina o la alanina, según se describió en la patente estadounidense nº 4.496.537, y/o uno o más portadores, tales como una proteína portadora. Por ejemplo, para el tratamiento de humanos se usa habitualmente albúmina sérica humana de grado farmacéutico, opcionalmente junto con solución salina tamponada con fosfatos como diluyente. Cuando el excipiente para el IFN es la albúmina del sérica humana, ésta podría derivarse del suero humano, o podría tener un origen recombinante. Normalmente, cuando se usa la albúmina sérica, está tendrá un origen homólogo.

El IFN podría administrarse mediante cualquier medio que proporcione el contacto del IFN con la cavidad oromucosa del receptor. Por tanto, se entenderá claramente que la invención no está limitada a ningún tipo de formulación concreta. La presente invención describe la administración del IFN en el fondo de la cavidad oromucosa, esto podría conseguirse con líquidos, sólidos o aerosoles, así como con gotas o atomizadores nasales. Por tanto, la invención incluye, pero no se limita a, formulaciones de líquido, aerosol, jarabe, pastillas, comprimidos bucales, y nebulizadores. Una persona experta en la materia reconocerá que para las formulaciones de aerosol o nebulizador podría ser importante el tamaño de partícula de la preparación, y conocerá procedimientos apropiados mediante los cuales podría modificarse el tamaño de partícula.

En un aspecto, el interferón se administra en una única dosis. Alternativamente, el interferón se administra en un conjunto de dosis menores, distribuidas a lo largo del tiempo, de forma que el efecto neto sea equivalente a la administración de la dosis superior única. Una estrategia para este modo de administración es a través de la disposición de un dispositivo de liberación controlada o sostenida, adherido o implantado en la cavidad oromucosa, y diseñado para liberar el interferón a lo largo del tiempo en una cantidad equivalente a una dosis elevada única.

Las formulaciones de interferón representativas para su uso por vía oromucosa incluyen las siguientes (todos los % están en p/p):

Pastilla: 45% de dextrosa BP; 30% de gelatina BP; 11% de almidón de trigo BP; 5% de carmelosa sódica BP; 4% de albúmina de huevo BPC; 3% de leucina USP; 2% de propilenglicol BP; y 10^{6} IU de IFN-\alpha2. La pastilla podría usarse tal como es y dejar que se disolviera lentamente en la boca o podría disolverse en agua y mantenerse en la boca según fuera necesario.

Podría prepararse una pasta de interferón tal como se describe en la patente estadounidense nº 4.675.184, a partir de 45% de glicerina, 2% de CMC sódico, 25% de tampón citrato (pH 4,5), agua destilada hasta el 100%, y 10^{6} IU de IFN-\alpha2. La pasta de interferón podría adherirse a la mucosa bucal.

De igual modo, podría prepararse un gargarismo o un jarabe mediante la adición de la cantidad deseada de interferón a una formulación de enjuague bucal o de jarabe para la tos disponible comercialmente.

Dentro de los intervalos de dosis específicos mencionados anteriormente, el tratamiento óptimo en cualquier caso individual dependerá de la naturaleza del proceso concerniente, la etapa de la enfermedad, la terapia previa, otra terapia de continuación, el estado general de salud del paciente, la sensibilidad del sujeto al interferón, etc., y, por tanto, dependerá del criterio del médico teniendo en consideración todas estas circunstancias. La duración del tratamiento dependerá, por supuesto, del proceso que se esté tratando, por ejemplo, se esperara que el tratamiento de una infección aguda, tal como el virus del ébola, implique un curso de tratamiento diferente al tratamiento de una situación crónica, tal como la hepatitis.

La dosis efectiva descrita en la presente es una dosis que no genera respuesta patológica en el paciente cuando se administra parenteralmente. Una respuesta patológica podría ser aguda, crónica, o acumulativa, y podría manifestarse por cambios en la composición química de la sangre, tales como la leucopenia, depresión de la médula ósea, u otros parámetros histológicos. Tal como se usa en la presente, una respuesta patológica incluye efectos secundarios perjudiciales, tales como fiebre, malestar, o síntomas similares a los de la gripe, reacciones vasculares tales como la flebitis, y reacciones inflamatorias locales en el sitio de inyección. Tales respuestas variarán considerablemente entre la población de pacientes en vista a las variaciones individuales en la sensibilidad al interferón. Un ensayo sencillo para identificar una dosis baja de interferón aceptable para la terapia por vía oromucosa es inyectar al paciente con la dosis aceptable putativa, en base a consideraciones sobre su edad, peso, indicación, progresión, etc., y comprobar si la inyección produce una respuesta patológica según se ha definido más arriba, siendo la irritación local en el sitio de inyección el criterio más fácilmente comprobable. Si no se nota respuesta adversa alguna, entonces la misma dosis puede administrarse por vía oromucosa. Si hay una respuesta no deseable, entonces se repite el proceso con una dosis inferior hasta que se identifica una dosis no patológica.

Para muchos pacientes, se espera que la dosis por vía oromucosa será aproximadamente la misma que aquéllas que se sabe son bien toleradas y efectivas en protocolos parenterales aprobados. Por tanto, para los propósitos de especificidad, una dosis baja aceptable de interferón podría ser, desde aproximadamente 1 \times 10^{4} IU hasta aproximadamente 20 \times 10^{6} IU de interferón, más preferiblemente, la dosis es desde aproximadamente 1 \times 10^{4} IU hasta aproximadamente 1 \times 10^{6} IU de interferón, a condición de que la dosis sea una dosis que no induzca una respuesta patológica cuando se administra parenteralmente. En una realización, la dosis total podría administrarse en múltiples dosis menores a lo largo del tiempo, o incluso podría suministrarse continuamente o de forma pulsátil a partir de un dispositivo de liberación continuada adherido a o implantado en la oromucosa.

Interferones y formulaciones de interferón IFN-\alpha/\beta de ratón

El IFN-\alpha/\beta de ratón (Mu IFN-\alpha/\beta) se preparó a partir de cultivos de células C243-3 cells inducidas con el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) y se purificó tal como se había descrito previamente (Tovey et al., Proc. Soc. Exap. Biol. and Med., 146:809-815 (1974)). La preparación usada en este estudio tenía un título de 4 \times 10^{6} unidades internacionales (IU)/ml y una actividad específica de 5 \times 10^{7} IU/mg de proteína, tal como se ensayó sobre células 929 de ratón desafiadas con el virus de la estomatitis vesicular (VSV) según se había descrito previamente (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 146:809-815 (1974)). La preparación se estandarizó con respecto a la preparación de referencia internacional de IFN-\alpha/\beta de ratón de los National Institutes of Health (NIH) (G-002-9004-
5411).

IFN-\alpha 1-8 humano

El IFN-\alpha 1-8 humano recombinante (Hu IFN\alpha 1-8; BDBB lote nº CGP 35269-1, Ciba-Geigy, Basilea, Suiza) se preparó y purificó tal como se había descrito previamente (Meister et al., J. Gen. Virol., 67:1633-1643 (1986)). La preparación usada en este estudio tenía un título de 70 \times 10^{6} IU/ml sobre células WISH humanas homólogas desafiadas con VSV tal como se había descrito previamente (Tovey et al., Nature, 267:455-457 (1977)), y un título sobre células L929 de ratón heterólogas de 1 \times 10^{6} IU/ml. La preparación se estandarizó con respecto a ambas: la preparación de referencia internacional de IFN-\alpha humana de los NIH (G-023-901-527) y el estándar de IFN-\alpha/\beta de ratón de los NIH (G-002-9004-5411). La actividad específica de la preparación de IFN fue de 2 \times 10^{8} IU/mg pro-
teína.

Interferón-\alpha recombinante de ratón

El interferón-\alpha de ratón recombinante se compró a Life Technologies Inc. La preparación usada en este estudio (lote nº HKK404) tenía un título de 6 \times 10^{6} IU/ml y una actividad específica de 6 \times 10^{8} IU/mg proteína según se ensayó con células L929 de ratón desafiadas con VSV (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 146:406-415
(1974)).

Interferón-\beta recombinante de ratón

El interferón-\beta de ratón recombinante se compró a R & D Systems Inc. La preparación usada en este estudio (lote nº 1976-01S) tenía un título de 3,2 \times 10^{4} IU/ml y una actividad específica de 8 \times 10^{6} IU/mg proteína según se ensayó con células L929 de ratón desafiadas con VSV (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 146:406-415 (1974)).

Interferón-\gamma recombinante de ratón

El interferón-\gamma de ratón recombinante se compró a R & D Systems Inc. La preparación usada en este estudio (2580-03SA) tenía un título de 2 \times 10,5 IU/ml y una actividad específica de 1 \times 10,7 IU/mg proteína según se ensayó con células L929 de ratón desafiadas con VSV (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 146:406-415 (1974)).

Todas las preparaciones de interferón se valoraron simultaneamente en el mismo ensayo y se estandarizaron con respecto a la preparación de referencia internacional de interferón-\alpha/\beta de ratón de los National Institutes of Health (NIH) (G-002-9004-5411).

Tanto el interferón \alpha/\beta de ratón y los interferones de ratón recombinantes se prepararon en el excipiente Ferimmu-
ne^{TM} antes de su administración.

Excipiente

Las preparaciones de interferón se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía albúmina del suero bovina (BSA). La fracción V de la albúmina de suero bovina (categoría RIA; libre de inmunoglobulina; nº de catálogo A7888; Sigma; EE.UU.) se disolvió a una concentración final de 100 \mug/ml en PBS (pH 7,4) y se esterilizó mediante filtración (0,2 \mul, Millex-GV, Millipore, USA).

En los experimentos descritos en la presente, las preparaciones de interferón se diluyeron en un excipiente privado. El excipiente usado fue como sigue, proporcionado en forma de comprimidos (Ferimmune^{TM}, Pharma Pacific):

	% p/p	mg/comprimido
Dextrosa (Glucosa) BP**	\hskip0,5cm 44,67***	55,84
Gelatina BP**	30,06		37,58
Almidón de trigo BP**	11,31		14,14
Carmelosa Sódica BP**	4,96		6,20
Albúmina de huevo BPC**	4,03		5,04
Leucina USP	3,00		3,75
Propilenglicol BP	1,88		2,35
Dextrano 40**	0,06		0,08
(como inyección de Dextrano 40 BP)
Fosfato Sódico BP	0,03		0,04
Cloruro Sódico BP	0,01		0,01
Fosfato ácido de sodio BP	0,01		0,01
Total	100,02		125,04
** Calculado para una forma anhidra
*** Derivado de:
\hskip0,8cm Dextrosa (Glucosa) BP (anhidra) 44,64%
\hskip0,8cm Glucosa BP (como inyección de Dextrano 40 BP) 0,03%

Se disolvió una tableta en 1,5 ml de solución salina tamponada con fosfato, se centrifugó a 16.000 g durante 15 m, y a continuación se esterilizó mediante filtración (0,2 \mu, Millex-GV, Millipore, USA), y se almacenó a 4ºC antes de su uso. El excipiente se preparó a diario antes de su uso.

Sistema de suministro del interferón

Experimentos preliminares mostraron que la aplicación de 5 \mul de cristal violeta a cada fosa nasal de un ratón adulto normal usando una micropipeta Eppendorf P20 resultaba en una distribución casi inmediata del colorante sobre toda la superficie de la cavidad orofaríngea. La tinción de la cavidad orofaríngea era aún evidente unos 30 minutos después de la aplicación del colorante. Se obtuvieron resultados esencialmente similares usando IFN-\alpha 1-8 humano recombinante marcado con ^{125}I y aplicado de la misma forma. Por tanto, se usó este procedimiento de administración en todos los experimentos subsiguientes.

Para los propósitos de los experimentos con animales descritos en esta especificación, se entenderá claramente que la expresión "intranasal/oral" o "intranasal más oral" o "in/or" u "oromucosa" u "orofaríngeo" en referencia a la vía de administración del IFN debe entenderse que significa la administración de la preparación de IFN profundamente en la cavidad nasal, de forma que se distribuya rápidamente en la cavidad orofaríngea, es decir, en la boca y garganta del mamífero receptor, de forma que haga contacto con la mucosa que recubre esta cavidad.

Emcv (virus de la encefalomiocarditis)

Partida:

Lote nº 095001

Fecha de caducidad:

diciembre de 1997

Preparación:

La cepa JH del EMCV se propagó en células L929 de ratón usando procedimientos descritos previamente (Gresser I., Bourali C., Thomas M. T., Falcoff E., Effect of repeated inoculation of interferon preparations on infection of mice with Encephalomyocarditis virus. Proc Soc Exp Biol Med, 127:491-496 (1968)).

Caracterización:

El provisión de virus usada en este estudio tenía un título de 5 \times 10^{8\text{.}62} TCID_{50} en células L929 de ratón.

Almacenamiento:

La provisión de EMCV se almacenó a -70ºC. Un polvo cortado el día 1 de la valoración del virus necesitó temporalmente una transferencia al depósito de reserva a aproximadamente la misma temperatura. El material permaneció congelado en todo momento. El día +8 de la valoración del virus, se incrementó la temperatura del congelador de -70ºC hasta -60ºC. El EMCV diluido se preparó inmediatamente antes de su uso y se mantuvo en hielo o en el frigorífico del estabulario hasta su uso.

Animales

Los ratones usados en este estudio se obtuvieron a partir de una colonia libre de patógenos específicos (IFFA CREDO, Francia). Éstos se alojaron en un servicio animal libre de patógenos específicos en el Institut Federatif CNRS en Villejuif de acuerdo con los estándares de la EEC.

Bioensayo del interferón

El interferón se ensayó de acuerdo con un procedimiento convencional. De forma resumida, las muestras (20 \mul) se diluyeron en 80 \mul de Medio Esencial Mínimo de Eagle (MEM) (Gibco, Francia) que contenía un 2% de Suero Bovino Fetal (FCS) inactivado mediante calor (Gibco, Francia), y se añadió a cada pocillo de una placa de microvaloración (Falcon, nº de catálogo 3072) usando un micropipeta multicanal (Finnpipette, Labsystem, 50-300 \mul). Se añadieron células WISH ó L929 (2 \times 10^{4} células/pocillo) en 100 \mul de MEM que contenía un 2% de FCS y se incubaron durante la noche a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2} en aire (incubador de CO_{2} Forma 3029). A continuación se examinaron las células en busca de cualesquier signos de toxicidad usando un microscopio invertido Olympus IM GLDW equipado con un objetivo 10\times. Las muestras que no mostraban una toxicidad detectable se sometieron a continuación a diluciones a la mitad en serie, empezando desde una dilución inicial 1:10 en un volumen total de 200 \mul de MEM de Eagle que contenía un 2% de FCS, mediante la transferencia de 100 \mul de material diluido hacia adelante, con una micropipeta multicanal, en una microplaca que contenía en cada pocillo 100 \mul de MEM de Eagle recién preparado conteniendo un 2% de FCS. También se prepararon las diluciones apropiadas, a la mitad y en serie, del estándar de referencia del IFN-\alpha humano de los NIH (G-023-901-527) o del estándar de referencia del IFN-\alpha/\beta de ratón de los NIF (G002-9004-5411). A continuación se añadieron células WISH ó L929 (2 \times 10^{4} células/pocillo) en 100 \mul de MEM de Eagle conteniendo un 2% de FCS a cada placa donde correspondía, y se incubaron durante la noche a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2} en aire. Las monocapas de células se comprobaron a continuación en busca de cualesquier signos de toxicidad y, en ausencia de ninguna toxicidad evidente, se aspiró el cultivo y se remplazó con 200 \mul de MEM de Eagle conteniendo un 2% de FCS que contenía 100 TCID_{50} de VSV (2 \times 10^{-4} VSV_{23} para las células WISH, ó 10^{-5} VSV_{23} para las células L929). Las placas se incubaron a continuación durante la noche a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2} en aire. Las monocapas de células se examinaron a continuación en busca de un efecto citopático vírico específico usando un microscopio invertido Olympus IM ULWD. Los títulos del interferón se determinaron a partir del inverso de la dilución que proporcionó un 50% de protección con respecto al efecto citopático vírico específico, y se expresan en unidades de referencia internacional/ml
(IU/ml).

Ejemplo 1 Efecto del interferón por vía oromucosa contra la infección vírica

La infección intraperitoneal de ratones con el virus de la encefalimiocarditis (EMCV) originó una enfermedad fatal de progreso rápido caracterizada por la implicación del SNC y la encefalitis (Rueckart, R. R., en Virology, editor Fields, 705-738, 1985, Raven Press, Nueva York). Se ha mostrado que el IFN-\alpha es efectivo en la protección de los ratones frente a la infección letal con EMCV cuando se administra de forma profiláctica o incluso cuando se administra después de que ya haya ocurrido la replicación del virus en los órganos diana (Finter, N. B.; Front. of Biol., 2:135-147 (1973)). Por tanto, en estos estudios se determinó el efecto de las dosis bajas, bien de IFN natural o recombinante, administradas a través de la oromucosa, sobre la supervivencia de los ratones inyectados con una dosis letal de EMCV, es decir, en un ensayo riguroso de la actividad antivírica.

La cepa (JH) del virus de la encefalomiocarditis se propagó en células L929 de ratón tal como se ha descrito previamente (Gresser et al., Proc. Soc. Exp. Biol and Med., 127:491-496 (1968)). La reserva de virus usada en este estudio (EMC-\alpha) tenía un título de 5 \times 10^{8,62} TCID_{50} en células L929 de ratón.

El tratamiento de ratones con 200 ó 2000 IU de Mu IFN-\alpha/\beta ó Hu IFN-\alpha 1-8 a través de la vía in/or incrementó el tiempo de supervivencia promedio de los ratones infectados con una dosis letal de EMCV (300 LD_{50}). En la totalidad de los 6 experimentos (Tablas 1 y 2) el Hu IFN-\alpha/\beta 1-8 fue tan efectivo como el Mu IFN-\alpha/\beta.

La administración de los IFN mediante la vía in/or resultó en un incremento estadísticamente significativo en el tiempo de supervivencia promedio en 6 de los 9 experimentos realizados en este estudio. Más aún, la tendencia global fue hacia la eficacia en todos los experimentos realizados.

La administración mediante la vía ip (200 \mul por inyección) resultó en un incremento significativo en el tiempo de supervivencia promedio en 7 de los 8 experimentos realizados en este estudio usando la administración ip (Tablas 1 y 2).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

Efecto del interferón sobre la supervivencia de los ratones a continuación de la infección con ECMV
IFN	Dosis IU/	Excipiente	Vía	Nº de	Día de la	% de	Promedio del
	ratón			ratones	muerte	supervivencia	día de la
							muerte \pm se
Ninguno		ninguno		5	5,5,5,6,6	0	5,4 \pm 0,2
Mu-\alpha/beta	10.000	BSA	ip	5	- - - - -	100	-
Mu-\alpha/beta	2000	BSA	ip	5	- - - - -	100	-
Mu-\alpha/beta	200	BSA	ip	5	7, - - - -	80	-
Mu-\alpha/beta	2000	BSA	in/or	5	7,7,7,8, 10	0	7,8 \pm 0,6
Mu-\alpha/beta	200	BSA	in/or	5	7,10, - - -	60	-
Hu I \alpha-8	2000	BSA	ip	5	- - - - -	100	-
Hu I \alpha-8	200	BSA	ip	5	7,10, - - -	60	-
Hu I \alpha-8	2000	BSA	in/or	5	5,7,11, - -	40	-
Hu I \alpha-8	200	BSA	in/or	5	5,7,7, - -	40	-
\begin{minipage}[t]{155mm} El interferón o el excipiente se administraron una vez al día en los días -2, -1, 0, +1, +2 y +3 en relación al desafío con EMCV del día 0 \end{minipage}

TABLA 2

El efecto de la profilaxis y del tratamiento con IFN-a sobre la supervivencia de ratones Swiss

inyectados con 375 LD_{50} de ECMV

Número de animales supervivientes/por grupo

(días posteriores a la inyección)

Grupo del

Dosis

Vía

4

5

6

7

8

9

10

12

13

14

26

tratamiento

No tratados

5/5

5/5

1/5

0/5

Mu IFN-\alpha/\beta

200 IU

in/or

5/5

4/5

4/5

4/5

2/5

2/5

2/5

1/5

1/5

1/5

1/5

Mu IFN-\alpha/\beta

2000 IU

in/or

5/5

5/5

5/5

4/5

3/5

2/5

2/5

2/5

1/5

1/5

1/5

Hu IFN-\alpha 1-8

200 IU

in/or

4/4

4/4

3/4

3/4

1/4

1/4

1/4

0/4

Hu IFN-\alpha 1-8

2000 IU

in/or

5/5

3/5

1/5

1/5

0/5

Mu IFN-\alpha/\beta

200 IU

ip

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

Mu IFN-\alpha/\beta

2000 IU

ip

5/5

5/5

5/5

5/5

4/5

4/5

4/5

4/5

4/5

4/5

4/5

Mu IFN-\alpha/\beta

10^{4} IU

ip

4/4

4/4

4/4

4/4

4/4

4/4

4/4

4/4

4/4

4/4

4/4

Hu IFN-\alpha 1-8

200 IU

ip

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

4/5

4/5

4/5

4/5

4/5

4/5

Hu IFN-\alpha 1-8

2000 IU

ip

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

5/5

El interferón se administró dos veces al día en los días -2, -1, 0, +1, +2 y +3 en relación al desafío con EMCV del día 0

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3

Efecto del interferón sobre la supervivencia a continuación de la infección con ECMV
IFN	Dosis	Vía	Nº de	Día de la	% de	Día promedio
	IU/ratón		ratones	muerte	supervivencia	de la muerte \pm se
Ninguno		in/or	6	4,4,5,5,6,6	0	5,0 \pm 0,4
Hu \alpha 1-8	2000	ip	5	15,17, - - -	60	-
Hu \alpha 1-8	200	ip	5	9,10,16,17, 17	0	13,8 \pm 1,8
Hu \alpha 1-8	2000	in/or	5	5,6,7,7,21	0	9,2 \pm 2,3
Hu \alpha 1-8	200	in/or	5	5,6,6,7,9	0	6,6 \pm 0,7
El interferón se administró dos veces al día en los días 0, +1, +2, +3 y +4 en relación al desafío con EMCV del día 0

Está claro, a partir de los datos en las Tablas 1 y 2, que, cuando la administración ip e in/or pueden compararse directamente, la vía ip es de forma marginal más efectiva (7/16 casos) o no significativamente diferente (9/16 casos).

Nuestros datos preliminares sugieren que la administración de IFN dos veces al día por cualquiera de las rutas no parece incrementar significativamente la eficacia del tratamiento para proteger los ratones contra la infección (Tabla 3) en relación a la administración del IFN una vez al día (Tablas 1 y 2).

Ejemplo 2 Eficacia relativa del tratamiento profiláctico y terapéutico frente a la infección oral con EMCV

El tiempo de supervivencia promedio de los ratones tratados in/or o ip con 200 ó 2000 IU de Hu IFN-\alpha 1-8 no fue significativamente mayor cuando el tratamiento con IFN se inició el día de la infección con EMCV y continuó durante 4 días después de la infección, respecto a cuando el tratamiento con IFN se inició 4 días antes de la infección con el virus y se detuvo el día de la infección (Tabla 3).

Nuestros resultados muestran que la administración de dosis bajas de IFN mediante la vía oromucosa ejerce un incremento estadísticamente significativo sobre la supervivencia de los ratones infectados con una dosis letal de virus EMCV, tal como se determinó mediante el ensayo \chi^{2} de rangos de logaritmos (Mantel, 1966).

Ejemplo 3 Efecto del interferón por vía oromucosa contra el virus de la estomatitis vesicular

Se infectaron intranasalmente grupos de diez ratones de 6 semanas de edad, procedentes de una colonia de cría libre de patógenos, con 100 LD50 de virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Tovey et al., Proc. Soc. Exp. Biol Med., 146:406-415 (1974)), en un volumen de 10 \mul. Siete horas después de la infección con el virus, los ratones se dejaron sin tratar, o se trataron una vez al día durante 4 días por la vía intranasal/oral con una determinada dosis de interferón alfa/beta en un volumen de 10 \mul de excipiente Ferimmune^{TM}, o con 10 \mul de excipiente solo (control).

El tratamiento de los ratones adultos con interferón \alpha/\beta de ratón resultó en un marcado incremento en el porcentaje de animales que sobrevivían la infección con una dosis letal de VSV. Así pues, el 30% de los animales tratados con 10.000 IU de interferón \alpha/\beta estaban vivos 21 días después de su infección con una dosis letal de VSV, en condiciones en las que todos los animales infectados con virus, no tratados o tratados con excipiente control, estaba muertos a los 10 días. Las observaciones clínicas sugieren que la mayoría de los animales tratados con interferón y que están vivos a los 21 días sobrevivirán.

Ejemplo 4 Efecto del interferón por vía oromucosa sobre la expresión de proteínas celulares

Se sabe que el IFN-\alpha induce la expresión de un cierto número de proteínas celulares a continuación de la unión de la proteína a su receptor en la superficie celular. Se cree que estas proteínas proporcionan un marcador útil de la acción del IFN.

Evaluamos el efecto del IFN-\alpha administrado a través de la vía in/or sobre la expresión de tres proteínas inducidas por el IFN, los antígenos de clase I del MHC, el antígeno Ly6-A/E y la sintetasa de 2'-5'-oligoadeninalato.

El tratamiento de ratones DBA-2 (H-2K^{d}) con hasta 20.000 IU de Mu IFN-\alpha por la vía in/or no incrementó significativamente la expresión de H-2-K^{d} sobre los linfocitos, monocitos o granulocitos de la sangre periférica en condiciones en las que tan poco como 20 IV de Mu IFN-\alpha administradas ip incrementaban marcadamente la expresión de los antígenos de H-2-K^{d} en ambos, los monocitos y los granulocitos de la sangre periférica. Más aún, la expresión en monocitos estaba ligeramente suprimida.

De forma similar, el tratamiento de ratones con hasta 20.000 IU de IFN-\alpha a través de la vía in/or no tuvo efecto significativo sobre la expresión de los antígenos Ly6-A/E, cuya expresión está marcadamente potenciada sobre la superficie de una variedad de células linfoides a continuación del tratamiento parenteral con IFN del Tipo I (Dumont et al., J. Immunol, 137:201-210 (1986)). Se obtuvieron resultados similares con 200 ó 20.000 IU de Mu IFN-\alpha o Hu IFN-\alpha 1-8 a través de la vía in/or.

El tratamiento de ratones Swiss o DBA/2 con tan poco como 20 IU de Mu IFN-\alpha inyectado ip resultó en un marcado incremento en la actividad sintetasa de 2'-5'-oligoadenilato en ambos, células mononucleares de la sangre periférica y esplenocitos. Por contra, en el mismo experimento, el tratamiento de los ratones con hasta 20.000 IU de Mu IFN-\alpha a través de la vía in/or no incrementó significativamente la expresión de la actividad de la sintetasa de 2'-5'-oligoadenilato. Además, el tratamiento con 200 ó 20.000 IU de Mu IFN-\alpha o Hu IFN-\alpha 1-8 mediante la vía in/or no tuvo efecto significativo sobre la actividad sintetasa de 2'-5'-oligoadenilato en ninguno de los instantes ensayados hasta 10 días después del inicio del tratamiento con IFN.

Ejemplo 5 Biodisponibilidad del interferón a continuación de la administración por vía oromucosa

Con objeto de examinar la biodisponibilidad y farmacocinética del IFN, se trataron ratones, que tenían la proporción droga-volumen de sangre más favorable para tales estudios, con una única dosis de IFN-\alpha recombinante marcado con ^{125}I hasta la máxima radiactividad específica posible.

Una preparación pura de 70 \times 10^{6} IU de Hu IFN-\alpha 1-8 se disolvió en 1,4 ml de PBS, y se yodó tal como describieron Mogensen et al., (Int. J Cancer, 28:575-582 (1981)) usando una modificación del procedimiento de la cloramina-T descrito por Hunter y Greenwood (Nature, 194:495-496 (1962)).

El Hu IFN-\alpha 1-8 marcado con ^{125}I (lote nº CGP35269-1) presentó una actividad biológica de 2 \times 10^{7} IU/ml cuando se ensayó en células WISH humanas desafiadas con VSV, y 1 \times 10^{6} IU/ml cuando se ensayó en células L929 de ratón desafiadas con VSV.

Se inyectaron ratones Swiss hembra de seis a siete semanas de edad iv, ip, o se trataron in/or con 2 \times 10^{7} IU equivalentes a 1 \times 10^{6} IU de ratón de ^{125}I Hu IFN-\alpha 1-8 (1,0369 \times 10^{7} c.p.m./ratón). En los instantes indicados, se sacrificaron tres ratones por grupo, se recogió la sangre, y se determinó el volumen. Se extrajeron los riñones, el hígado, los pulmones, el bazo, y el estómago/esófago, se secaron, y se pesaron hasta una precisión de \pm 1,0 \mug. La radiactividad de cada muestra se determinó individualmente usando un contador de gamma. A continuación se separó la sangre completa mediante centrifugación (800 g \times 10 min., 4ºC), se recuperó el suero, se contó y se congeló a -80ºC. El suero se analizó entonces para determinar el contenido de IFN usando un bioensayo estándar en ambas, células WISH humanas y células L929 de ratón, tal como se describió más arriba. El material radiactivo presente en las muestras de suero se aisló a continuación mediante inmunoprecipitación por afinidad, y se analizó mediante SDS-PAGE.

Se detectaron niveles muy elevados de radiactividad (>2 \times 10^{6} c.p.m./ml) en la sangre periférica de los animales 5 minutos después de la inyección mediante embolada iv de 1,0369 \times 10^{7} c.p.m./ratón de Hu IFN-\alpha 1-8 marcado con ^{125}I. La cantidad de radiactividad presente en la sangre completa declinó a continuación progresivamente a los 15 y 30 minutos. Los niveles de radiactividad detectados en la sangre periférica de los animales 5 minutos después de la inyección ip de 1,0369 \times 10^{7} c.p.m. de ^{125}I Hu IFN-\alpha 1-8 eran aproximadamente veinte veces inferiores a los niveles detectados a continuación de un bolo iv. Los niveles de radiactividad incrementaron entonces progresivamente a los 15 y 30 minutos después de la inyección. Los niveles de radiactividad detectados en la sangre animales a los 5, 10 ó 15 minutos después de la administración in/or de ^{125}I IFN-\alpha 1-8 eran significativamente inferiores a los detectados en un instante determinado a continuación de la inyección ip de la misma cantidad de IFN marcado radiactivamente. Se detectaron niveles más elevados de radiactividad en suero que en sangre completa para las tres vías de administración a continuación de la administración in/or de IFN-\alpha 1-8 marcado con ^{125}I. Los niveles más bajos de radiactividad detectados por ml de sangre completa en comparación con el mismo volumen de suero reflejan el mayor volumen de suero contado después de suprimir el componente celular de la sangre completa.

Las muestras de suero procedentes de todos los ratones en el estudio se ensayaron para determinar la presencia de IFN biológicamente activo usando un bioensayo estándar, tal como se describió más arriba, y mostraron niveles fácilmente detectables de IFN biológicamente activo en el suero de todos los animales inyectados iv o ip con ^{125}I Hu IFN-\alpha 1-8 en todos los instantes ensayados. Por contra, no se detectó IFN biológicamente activo en el suero de ninguno de los animales, en ninguno de los instantes ensayados, a continuación de la administración in/or de IFN, a pesar de la presencia de niveles relativamente elevados de radiactividad en el suero de estos animales.

Con objeto de determinar si el material radiactivo detectado en el suero de los animales tratados con ^{125}I Hu IFN-\alpha 1-8 representaba efectivamente el IFN nativo, las muestras se inmunoprecipitaron con Proteína A-G agarosa, con objeto de precipitar las inmunoglobulinas presentes en las muestras, se trataron con un anticuerpo anti-IFN-\alpha policlonal purificado mediante afinidad, y se inmunoprecipitaron adicionalmente. A continuación se sometieron las muestras a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) tal como se describió más arriba.

El análisis mediante SDS-PAGE del material radiactivo en el suero a continuación de la inyección iv o ip de ^{125}I Hu IFN-\alpha 1-8 reveló una única banda homogénea que migraba con una movilidad electroforética idéntica a la del ^{125}I Hu IFN-\alpha 1-8 no inyectado. El peso molecular aparente del material se estimó que era aproximadamente de 20.000 daltones, lo que corresponde exactamente con el peso molecular del Hu IFN-\alpha 1-8 nativo. Por contra, ninguna de las muestras de suero procedentes de ratones tratados in/or con ^{125}I IFN-\alpha 1-8 contenía material alguno con un peso molecular aparente similar al del IFN nativo, aunque se cargó en cada gel una cantidad idéntica de material radiactivo.

La distribución en tejidos del material radiactivo relevó niveles muy elevados de radiactividad en los riñones, niveles elevados en el hígado, pulmones y bazo de los animales 5 minutos después de la inyección iv de ^{125}I IFN-\alpha 1-8. A continuación se halló que el nivel de radiactividad presente en cada uno de estos cuatro órganos menguaba progresivamente a los 15 y 30 minutos. Por contra, el nivel de radiactividad en el estómago incrementó progresivamente a los 15 y 30 minutos hasta alcanzar un nivel comparable al presente en el suero de los animales 30 minutos después de un bolo iv.

La administración de ^{125}I IFN-\alpha 1-8 mediante inyección ip resultó en un niveles máximos de radiactividad en todos los tejidos examinados antes de 15 minutos, seguidos por una mengua a los 30 minutos. De forma similar, la administración in/or de ^{125}I Hu IFN-\alpha 1-8 resultó en niveles máximos de radiactividad en todos los tejidos estudiados después de 15 minutos, con cierta mengua en los niveles de radiactividad presente a los 30 minutos. Los niveles de radiactividad presentes en el estómago/esófago eran un orden de magnitud superiores a los detectados en cualquier otro órgano a continuación de la administración in/or de IFN-\alpha 1-8 marcado con ^{125}I, y eran marcadamente mayores que los niveles presentes en estos tejidos a continuación de la administración parenteral de la misma cantidad de Hu IFN-\alpha 1-8 marcado radiactivamente por cualquiera de las rutas iv o ip.

Ejemplo 6 Farmacocinética del interferón a continuación de la administración intranasal/oral

Para una determinación precisa de la farmacocinética del Hu IFN-\alpha 1-8, se trataron los ratones iv, ip ó in/or con 1,0369 \times 10^{7} c.p.m./ratón de Hu IFN-\alpha 1-8 marcado con ^{125}I, y se determinaron los niveles de radiactividad presentes en ambos, la sangre completa y el suero, a una serie de intervalos durante un período de 24 horas.

El perfil farmacocinético del Hu IFN-\alpha 1-8 marcado con ^{125}I presente en la sangre de ratones después de un bolo iv reseguía fielmente una curva de eliminación logarítmica. Esto coincidía con los resultados de un estudio previo realizado en ratones usando una molécula estrechamente relacionada, la \alpha A/D (Bgl) humana recombinante (Bohoslawed et al., J. IFN Res., 6:207-213 (1986)). La cantidad de biomaterial disponible, calculado a partir del área bajo la curva de concentración respecto el tiempo, fue también similar a la de la \alpha A/D humana. Se observó una curva de eliminación bifásica de consumo con el tiempo a continuación de una inyección iv de un bolo de ^{125}I IFN-\alpha 1-8, la cual es característica de sustancias que se eliminan a través de los riñones, en concordancia con los resultados del Ejemplo 4. La farmacocinética del IFN-\alpha 1-8 marcado con ^{125}I a continuación de una inyección ip se parecía estrechamente a las descritas previamente para IFN administrados im.

En el suero de todos los animales había niveles fácilmente detectables de IFN activo a continuación de un bolo iv o una inyección ip de IFN-\alpha 1-8 marcado con ^{125}I. Aunque no pudo detectarse la actividad antivírica en el suero de los animales a continuación de la administración in/or de ^{125}I IFN-\alpha 1-8, se observó, no obstante, un grado de protección estadísticamente significativo frente a la infección con una dosis letal de EMCV en estos animales (Tabla 4).

TABLA 4

El efecto de un único tratamiento con ^{125}I-IFN-a sobre la supervivencia de ratones Swiss

inyectados con ECMV

Número de animales supervivientes/por grupo

(días posteriores a la inyección)

Grupo del

Dosis

Vía

3

4

5

6

7

8

9

10

15

30

tratamiento

No tratados

6/6

4/6

2/6

0/6

Hu IFN-\alpha 1-8

1,4 \times 10^{5} IU

in/or

6/6

5/6

4/6

3/6

1/6

1/6

1/6

1/6

1/6

1/6

Mu IFN-\alpha/\beta

6,4 \times 10^{5} IU

in/or

6/6

5/6

5/6

4/6

3/6

2/6

2/6

2/6

1/6

1/6

Discusión

Nuestros resultados obtenidos en un modelo preclínico bien definido de infección vírica aguda proporcionaron una evidencia inequívoca para apoyar el "prueba de principio" para el uso de dosis bajas de IFN por vía oromucosa para la terapia de infecciones víricas sistémicas agudas en humanos, y muestran que tanto una mezcla natural de múltiples subtipos de IFN-\alpha como un único isotipo de IFN-\alpha recombinante (por ejemplo, el Mu IFN-\alpha) ejercen una actividad antivírica estadísticamente significativa en este modelo. El Mu IFN-\alpha/\beta y el Hu IFN-\alpha 1-8 naturales parecen ser igualmente efectivos cuando se administran por vía oromucosa. El Mu IFN-\beta y el Mu IFN-\gamma recombinantes también muestran una actividad antivírica similar.

La comparación del grado de protección obtenido cuando se administraba un determinado tipo y dosis de IFN mediante la vía oromucosa, comparado con los resultados obtenidos a continuación de la administración sistémica (inyección ip), mostró que la administración parenteral del IFN era marginalmente más efectiva en algunos casos, y que en otros casos no era más efectiva que la administración por vía oromucosa.

Los resultados del estudio piloto de biomarcador (EJEMPLO 4) mostraron claramente que ninguno de los tres biomarcadores ensayados (antígeno de la Clase I del MHC, antígeno Ly6-A/E, y actividad de la sintetasa de 2'-5'-oligoadenilato) reflejan de forma adecuada la muy marcada actividad antiviral mostrada por el IFN-\alpha administrado por la vía in/or.

Es sorprendente el contraste entre el incremento muy marcado en la expresión de las tres proteínas inducidas por el IFN, observado en todos los experimentos realizados a continuación de la inyección ip de tan poco como 20 IU de IFN-\alpha, y la ausencia de ningún efecto detectable a continuación de la administración de hasta 20.000 IU de IFN-\alpha a través de la vía oromucosa.

Aunque no podemos excluir la posibilidad de que un efecto sobre uno u otro de los biomarcadores se hubiera observado en un instante más temprano o intermedio, esto parece ser improbable, ya que el IFN actúa sobre la transcripción de los genes que codifican estas proteínas y, por tanto, no se esperaría observar efecto alguno sobre estos biomarcadores hasta un cierto número de horas después del tratamiento con IFN.

De nuevo, aunque no podemos excluir la posibilidad de que un efecto sistémico sobre una de las otras numerosas proteínas inducidas por el IFN se hubiera observado a continuación del tratamiento con IFN-\alpha por la vía in/or, esto parece improbable, ya que implicaría una regulación diferencial de la expresión de ciertos genes inducidos por el IFN. Sin embargo, es completamente posible que pudiera observarse localmente un efecto de un biomarcador del IFN, por ejemplo, en los linfocitos nasales a continuación de la administración del IFN a través de la vía in/or.

En concordancia con la ausencia de un efecto detectable sobre los biomarcadores detectados, no se observó un efecto consistente sobre ninguno de los parámetros hematológicos o de la composición química de la sangre monitorizados durante la terapia con IFN por vía oromucosa, incluso en animales tratados con hasta 20.000 IU de
IFN-\alpha.

Los resultados del estudio de farmacocinética-bioactividad muestran bastante claramente que puede obtenerse un efecto antivírico estadísticamente significativo a continuación de la administración por vía oromucosa de una única dosis de Hu IFN-\alpha 1-8 marcado radiactivamente, en condiciones en las que no puede detectarse IFN circulante en la sangre periférica usando procedimientos de detección que son un orden de magnitud más sensibles que los usados previamente. En concordancia con estos resultados, el alcance de la actividad antivírica ejercida por el IFN administrado por vía oromucosa parecía seguir una relación clásica de dosis-respuesta.

Se hallaron niveles de material marcado radiactivamente detectables fácilmente en ambos, la sangre completa y el suero de los animales a continuación de la administración in/or de IFN-\alpha 1-8 marcado radiactivamente. Estos resultados contrastan con los resultados de estudios previos, los cuales no consiguieron detectar el IFN en el suero de los animales incluso después de la administración oral de grandes cantidades de IFN sin marcar. Sin embargo, el material radiactivo detectado tanto en la sangre completa como en el suero a continuación de la administración in/or era biológicamente inactivo. Además, los resultados del análisis mediante SDS-PAGE mostraron que este material tenía un peso molecular bajo, y los más probablemente reflejaba la absorción de productos de degradación a continuación de la digestión del IFN en el estómago e intestino delgado. El análisis de la distribución en tejidos del material marcado radiactivamente, a continuación de la administración in/or, reveló niveles de radiactividad marcadamente más elevados en el estómago que en cualquiera de los otros órganos ensayados. Nuestros resultados muestran bastante claramente que, incluso aunque el IFN biológicamente activo no se absorbió a continuación de la administración in/or, este tratamiento ejerce no obstante una actividad antivírica in vivo estadísticamente significativa.

Sin querer circunscribirnos a ningún mecanismo propuesto para los efectos beneficiosos, nuestros resultados sugieren que el IFN administrado por vía oromucosa ejerce sus efectos contra los virus a través de un mecanismo novedoso actualmente no definido, el cual no implica una acción directa del IFN administrado exógenamente, o la inducción del IFN endógeno. Esto está apoyado por la ausencia de niveles detectables de IFN circulante o de los tres biomarcadores ensayados. Parece que este mecanismo podría actuar, al menos parcialmente, mediante la estimulación del abundante tejido linfoide que rodea las cavidades nasofaríngea y oral. Puesto que hemos mostrado que el IFN por vía oromucosa es al menos comparable en eficacia con el IFN administrado sistémicamente, nuestros resultados proporcionan una fuerte evidencia para la administración del IFN por la vía oromucosa en el tratamiento de infecciones víricas agudas. Esto podría tener importantes implicaciones para el uso clínico del IFN.

Claims (16)

1. Utilización del interferón humano en la preparación de un medicamento para contacto por vía oromucosa para estimular los mecanismos de defensa del huésped frente a un proceso vírico en un paciente humano, cuyo medicamento comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del interferón, siendo dicha cantidad desde aproximadamente 10^{4} IU hasta 20 \times 10^{6} IU por día, en donde dicho proceso vírico es una infección vírica crónica, o una infección vírica aguda, seleccionada de entre el grupo consistente en el virus de la gripe, el herpes varicela, el herpes zóster, la fiebre del dengue, o las encefalitis víricas, incluyendo la encefalitis del virus del sarampión, la encefalitis de Murray Valley, la encefalitis Japonesa B, la encefalitis transmitida por garrapatas y la encefalitis del herpes, las fiebres hemorrágicas, incluyendo el virus del Ébola, el virus de Marburg, la fiebre de Lassa, las infecciones por virus Hanta, y el morbilivirus equino.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la cual el medicamento comprende una única dosis del interferón.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la cual el medicamento comprende un conjunto de dosis menores del interferón, suficientes para producir una estimulación equivalente a la de una única dosis.

4. Utilización según la reivindicación 1 ó 3, en la cual el medicamento proporciona la administración continuada de una dosis no tóxica a lo largo de un período de tiempo suficiente para producir una estimulación equivalente a la de una única dosis.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el cual el medicamento comprende otra citocina o un inductor del interferón.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el cual el medicamento se adapta para administrar una dosis diaria total desde 1 \times 10^{4} IU hasta 1 \times 10^{6} IU de interferón.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en el cual el medicamento incluye otro agente terapéutico para una terapia simultánea, separada o secuencial.

8. Utilización según la reivindicación 7 en el cual el agente terapéutico es otro agente antivírico.

9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en el cual el interferón es un interferón del Tipo I.

10. Utilización según la reivindicación 9 en el cual el interferón se selecciona de entre el grupo consistente en IFN-\alpha, IFN-\beta, IFN-\omega, IFN consenso, y mezclas de los mismos.

11. Utilización según la reivindicación 10 en el cual el IFN es IFN-\alpha recombinante.

12. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en el cual el interferón es un interferón del Tipo II.

13. Utilización según la reivindicación 12 en el cual el interferón del Tipo II es el IFN-\alpha.

14. Utilización según la reivindicación 8 ó 12 en el cual el IFN es material recombinante.

15. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1-14 en el cual el mecanismo de defensa del huésped contrarresta la encefalitis, el herpes genital, la hepatitis B y C, el VIH, el VPH, y el VSH-1 y 2.

16. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1-15 en donde dicho medicamento es para contacto por vía oromucosa mediante su administración a través de la nariz.