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ES2260083T3 - Superficies microfluidicas. - Google Patents

Superficies microfluidicas.

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Publication number
ES2260083T3
ES2260083T3 ES00985154T ES00985154T ES2260083T3 ES 2260083 T3 ES2260083 T3 ES 2260083T3 ES 00985154 T ES00985154 T ES 00985154T ES 00985154 T ES00985154 T ES 00985154T ES 2260083 T3 ES2260083 T3 ES 2260083T3
Authority
ES
Spain
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cavity
microfluidic device
functional
skeleton
hydrophilic polymer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES00985154T
Other languages
English (en)
Inventor
Helene Derand
Anders Larsson
James Van Alstine
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gyros Patent AB
Original Assignee
Gyros Patent AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gyros Patent AB filed Critical Gyros Patent AB
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Publication of ES2260083T3 publication Critical patent/ES2260083T3/es
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Abstract

El uso de un revestimiento que expone un polímero hidrofílico no iónico para optimizar la adsorción no específica y la hidrofilicidad en un dispositivo microfluídico que consiste en un conjunto de una o más estructuras de microcanales cubiertas que son fabricadas en la superficie de un substrato planar hecho de plástico, donde cada una de dichas estructuras de microcanales: i) están ideadas para transportar solutos y/o partículas por un flujo líquido acuoso dirigido por fuerzas consistentes en fuerza capilar y/o fuerza centrípeta desde una parte funcional hasta otra en la misma estructura de microcanales y ii) están en estado seco y iii) tienen una o más partes funcionales seleccionadas entre (a) una cámara o cavidad de reacción, (b) una unidad definidora de volumen, (c) una cámara o cavidad de mezcla y (d) una cámara o cavidad de detección, estando presente dicho revestimiento sobre la superficie de una parte en al menos una de dichas una o más partes funcionales de cada estructura de microcanales del conjunto y siendo dicho líquido acuoso capaz de entrar en dicha parte funcional por autosucción cuando el líquido ha pasado la entrada de la parte funcional.

Description

Superficies microfluídicas.
Campo técnico
La invención se relaciona con un dispositivo microfluídico consistente en una o más, preferiblemente más de 5, estructuras de microcanales cubiertas fabricadas en la superficie de un substrato planar.
Mediante el término "cubiertas", se entiende que una tapa cubre las estructuras de microcanales, minimizando así o evitando la evaporación no deseada de líquidos. La cubierta/tapa puede tener microestructuras que se correspondan con cada estructura de microcanal en la superficie del substrato.
El término "fabricadas" significa que están presentes en la superficie microestructuras bidimensionales y/o tridimensionales. La diferencia entre una microestructura bidimensional y una tridimensional es que, en la primera variante, no hay barreras físicas que delineen la estructura, mientras que, en la última variante, las hay. Véase, por ejemplo, WO 9958245 (Larsson y col.).
La parte de la cubierta/tapa que mira hacia el interior de un microcanal está incluida en la superficie de una estructura de microcanal.
El substrato planar está típicamente hecho de material inorgánico y/u orgánico, preferiblemente de plásticos. Para ejemplos de diversos materiales inorgánicos y orgánicos, véase bajo el título "Material in the microfluidic device".
Un dispositivo microfluídico incluye el que hay un flujo de líquido que provoca el transporte en masa de solutos y/o de partículas dispersas en el líquido de una parte funcional de la estructura a otra. Sólo los capilares, posiblemente con un área para aplicación y un área para detección, tal como se usan en la electroforesis capilar, en la que se hace que los solutos migren por un campo eléctrico aplicado con fines de separación, no son dispositivos microfluídicos según se contempla en el contexto de la invención. Un capilar de electroforesis puede, sin embargo, ser parte de un dispositivo microfluídico si el capilar es parte de una estructura de microcanal en la que hay una o más partes funcionales adicionales desde y/o hacia la cual está teniendo lugar un transporte en masa de un soluto por un flujo líquido según se ha definido antes.
El líquido es polar y acuoso, tal como agua.
Antecedentes técnicos
Los dispositivos microfluídicos requieren que el flujo de líquido pase fácilmente a través de los canales y que la adsorción no específica de reactivos y analitos sea lo más baja posible, es decir, insignificante para las reacciones que se han de llevar a cabo.
Reactivos y/o analitos incluye proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, células, partículas celulares, bacterias, virus, etc. Las proteínas incluyen cualquier compuesto que exhiba estructura de poli- u oligopéptido.
La hidrofilicidad de superficies en estructuras de microcanales soportará la penetración reproducible y predeterminada de un líquido acuoso en las diversas partes de una estructura. Es deseable que, una vez que el líquido ha pasado una posible rotura en la entrada de una parte de la estructura, entonces el líquido entre espontáneamente en la parte por acción capilar (movimiento pasivo). Esto significa, a su vez, que la hidrofilicidad de las superficies en estructuras de microcanales se vuelve de una creciente importancia cuando se va de un macroformato a un microformato.
Por nuestra experiencia, pueden ser frecuentemente necesarios ángulos de contacto con el agua de alrededor de 20 grados o menos para conseguir un movimiento de fluido pasivo fiable a estructuras de microcanales. Sin embargo, no es simple fabricar superficies que tengan permanentemente dichos bajos ángulos de contacto con el agua. Existe con frecuencia una tendencia a un cambio en los ángulos de contacto con el agua durante el almacenamiento, lo que hace difícil comercializar dispositivos microfluídicos que tienen propiedades de flujo estandarizadas.
La situación se complica por el hecho de que los métodos para preparar superficies con muy bajos ángulos de contacto con el agua no reducen necesariamente la capacidad de adsorber inespecíficamente reactivos y constituyentes de la muestra. La razón superficie/volumen aumenta cuando se va de un macroformato a formatos más pequeños. Esto significa que la capacidad de adsorción inespecífica de una superficie aumenta inversamente al volumen rodeado por la superficie. La adsorción inespecífica se vuelve, por lo tanto, más crítica en dispositivos de microformato que en dispositivos mayores.
Una adsorción inespecífica inaceptable de biomoléculas se asocia frecuentemente con la presencia de estructuras superficiales hidrofóbicas. Este problema particular, por lo tanto, es con frecuencia más grave en relación a superficies hechas de plásticos y de otros materiales hidrofóbicos en comparación con superficies de superficies de silicio nativas y otros materiales inorgánicos similares.
Existe una serie de métodos disponibles para tratar superficies y hacerlas hidrofílicas para reducir la adsorción inespecífica de diversos tipos de biomoléculas y otros reactivos. Sin embargo, estos métodos generalmente no conciernen al equilibrio de una adsorción inespecífica baja con un flujo líquido fiable y reproducible cuando se miniaturizan macroformatos a microformatos. Compárese, por ejemplo, Elbert y col. (Annu. Rev. Mater. Sci. 26 (1996),
365-394).
Se han descrito superficies a las que se ha hecho repelentes de biopolímeros en general revistiendo con aductos entre polietileniminas y polímeros hidrofílicos durante la última década (Brink y col. (EE.UU. 5.240.994), Bergström y col., EE.UU. 5.250.613; Holmberg y col., J. Adhesion Sci. Technol. 7(6) (1993), 503-517; Bergström y col., Polymer Biomaterials, Eds. Cooper, Bam-fors, Tsuruta, VSP (1995), 195-204; Holmberg y col., Mittal Festschrift, Eds. Van Ooij, Anderson, VSP 1998, pp. 443-460, y Holmberg y col., Biopolymers and Interfaces, Dekker 1998 (Surfactant Science Series 75), 597-626). La unión secuencial de una polietilenimina y un polímero hidrofílico ha sido también descrita (Kiss y col., Prog. Colloid Polym. Sci. 74 (1987), 113-119).
Se ha controlado la adsorción inespecífica y/o la electroendósmosis en la electroforesis capilar revistiendo la superficie interior del capilar usado con una capa hidrofílica, típicamente en forma de un polímero hidrofílico (v.g., van Alstine y col., EE.UU. 4.690.749; Ekström y Arvidsson, WO 9800709; Hjertén, EE.UU. 4.680.201 (polimetacrilamida); Karger y col., EE.UU. 5.840.388 (alcohol polivinílico (PVA)), y Soane y col., EE.UU. 5.858.188 y EE.UU. 6.054.034 (microcanales acrílicos)). La electroforesis capilar es un nombre común para técnicas de separación llevadas a cabo en un capilar estrecho utilizando un campo eléctrico aplicado para el transporte en masa y la separación de los analitos.
Larsson y col. (WO 9958245, Amersham Pharmacia Biotech) presenta, entre otros, un dispositivo microfluídico en el que se definen microcanales entre dos substratos planares por la interfase entre áreas hidrofílicas e hidrofóbicas en al menos uno de los substratos. Para líquidos acuosos, las áreas hidrofílicas definen las rutas de fluido. Se discuten varias formas de obtención de un patrón de superficies hidrofóbicas y hidrofílicas para diferentes fines, por ejemplo, el tratamiento con plasma, el revestimiento de una superficie hidrofóbica con un polímero hidrofílico, etc. Los polímeros de revestimiento hidrofílicos sugeridos pueden o no tener grupos arilo, lo que sugiere que Larsson y col. no se centran en la disminución del ángulo de contacto con el agua en lo posible o en evitar la adsorción no específica.
Larsson, Ocklind y Derand (WO 0056808) describen la producción de superficies altamente hidrofílicas hechas de plásticos. Las superficies retienen su hidrofilicidad incluso después de estar en contacto con líquidos acuosos. Una cuestión adicional en WO 0056808 es equilibrar una hidrofilicidad permanente con buenas propiedades de unión celular. Se sugiere primariamente que las superficies sean usadas en dispositivos microfabricados.
El polietilenglicol ha sido unido directamente a la superficie de un microcanal fabricado en silicona para estudiar la capacidad del polietilenglicol para evitar la adsorción de proteínas. Véase Bell, Brody y Yager (SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. (1998), 3258 (Micro- and Nanofabricated Structures and Devices for Biomedical Environmental Applications), 134-140).
Los objetivos de la invención
Un primer objetivo es conseguir un transporte en masa suficientemente fiable y reproducible de reactivos y constituyentes de muestras (v.g., analitos) en dispositivos microfluídicos.
Un segundo objetivo es permitir un flujo de líquido acuoso fiable y reproducible en los dispositivos microfluídicos.
Un tercer objetivo es optimizar la adsorción no específica y la hidrofilicidad en relación la una con la otra para superficies de rutas fluidas en dispositivos microfluídicos.
La invención
Hemos descubierto que, uniendo un polímero no iónico hidrofílico a la superficie de una estructura de microcanal en un dispositivo microfluídico, se pueden minimizar fácilmente los problemas antes mencionados también para los materiales de superficie más críticos. Este descubrimiento facilita la creación de superficies que permiten un transporte fiable y reproducible de reactivos y constituyentes de muestras en dispositivos microfluídicos.
Los principales aspectos de la invención son el uso según la reivindicación 1 y el dispositivo microfluídico según la reivindicación 16. Los rasgos característicos son aparentes gracias a las reivindicaciones.
El polímero hidrofílico no iónico puede unirse directamente a la superficie de la estructura de microcanal o a través de un esqueleto polimérico, que se une a su vez a la superficie por unión de múltiples puntos.
El polímero hidrofílico no iónico
El polímero hidrofílico no iónico contiene una pluralidad de grupos neutros hidrofílicos. Los grupos neutros excluyen grupos no cargados que pueden cargarse por un cambio de pH. Los grupos hidrofílicos neutros típicos incluyen un heteroátomo (oxígeno, azufre o nitrógeno) y pueden ser seleccionados entre hidroxi, éter, tal como etilenoxi (v.g., en óxido de polietileno), amidas que pueden estar N-substituidas, etc. El polímero como tal es también inerte hacia los reactivos y agentes químicos que se han de usar en el dispositivo microfluídico.
Los polímeros hidrofílicos no iónicos ilustrativos son preferiblemente hidrosolubles cuando no están unidos a una superficie. Su peso molecular está dentro del rango de desde aproximadamente 400 hasta aproximadamente 1.000.000 daltons, preferiblemente de desde aproximadamente 1.000 hasta aproximadamente 200.000 daltons, tal como por debajo de 100.000 daltons.
Los polímeros hidrofílicos no iónicos son ilustrados con polietilenglicol, u homo- y copolímeros más o menos aleatoriamente distribuidos o con distribución de bloques de óxidos de alquileno inferior (C_{1-10}, tal como C_{2-10}) o bisepóxidos de alquileno inferior (C_{1-10}, tal como C_{2-10}), en donde los grupos epóxido se unen entre sí por una cadena de carbono que tiene 2-10 carbonos sp^{3}. La cadena de carbono puede estar interrumpida en una o más posiciones por un oxígeno éter, es decir, que se inserta un oxígeno éter entre dos átomos de carbono. Un átomo de hidrógeno en uno o más de los grupos metileno puede estar substituido con grupos hidroxi o grupos alcoxi inferior (C_{1-4}). Por razones de estabilidad, a lo sumo un átomo de oxígeno estará unido a uno y el mismo átomo de carbo-
no.
Otros polímeros hidrofílicos no iónicos adecuados son polímeros polihidroxi que pueden ser completa o parcialmente naturales o completamente sintéticos.
Los polímeros polihidroxi completa o parcialmente naturales están representados por polisacáridos, tales como dextrano y sus derivados hidrosolubles, derivados hidrosolubles de almidón y derivados hidrosolubles de celulosa, tales como ciertos éteres de celulosa. Son éteres de celulosa potencialmente interesantes metilcelulosa, metilhidroxipropilcelulosa y etilhidroxietilcelulosa.
También son polímeros polihidroxi sintéticos de interés el alcohol polivinílico, posiblemente en forma parcialmente acetilada, los polímeros poli(hidroxialquil inferior éter), los polímeros obtenidos por polimerización de epiclorohidrina, el glicidol y monómeros bifuncionalmente reactivos similares que dan polímeros polihidroxi.
La polivinilpirrolidona (PVP), las poliacrilamidas, las polimetacrilamidas, etc. son ejemplos de polímeros en los que hay una pluralidad de grupos amida.
Otros polímeros hidrofílicos adecuados son los productos de reacción (aductos) entre óxido de etileno, eventualmente en combinación con óxidos de alquileno superior o bisepóxidos, o tetrahidrofurano y un compuesto dihidroxi o polihidroxi según se ilustra con glicerol, pentaeritritol y cualquiera de los polímeros polihidroxi a los que se hace referencia en los párrafos precedentes.
El polímero hidrofílico no iónico puede tener la misma estructura que la descrita para los prolongadores descritos en Berg y col. (WO 9833572). Contrariamente a Berg y col., no existe una necesidad imperativa en cuanto a la presencia de un ligando de afinidad sobre el polímero hidrofílico usado en la presente invención.
Se pueden utilizar una o más posiciones en el polímero hidrofílico no iónico para la unión. Con objeto de que el polímero hidrofílico sea flexible, el número de puntos de unión debe ser lo más bajo posible, por ejemplo una, dos o tres posiciones por molécula de polímero. Para polímeros de cadena lineal, tales como polímeros de óxido de alquileno inferior similares al óxido de polietileno, el número de puntos de unión es típicamente de uno o dos, con preferencia uno.
Dependiendo de la posición de una superficie de parte revestida en una estructura de microcanal, el polímero hidrofílico puede llevar un reactivo inmovilizado (frecuentemente llamado ligando cuando están implicadas reacciones de afinidad). Dependiendo del uso particular de una estructura de microcanal, dichos reactivos pueden ser también llamados reactivos de afinidad, que se usan para captar un analito o un reactivo añadido o un contaminante presente en la muestra. Los ligandos inmovilizados también incluyen enzimas inmovilizadas. Según la invención, este tipo de reactivos están preferiblemente presentes en cámaras/cavidades de reacción (véase lo que sigue).
El esqueleto
El esqueleto puede ser un polímero orgánico o inorgánico, catiónico, aniónico o neutro, de material inorgánico u orgánico.
Con respecto a los esqueletos inorgánicos, las variantes preferidas son polímeros tales como el óxido de silicio. Véase la parte experimental.
Con respecto a los esqueletos orgánicos, las variantes preferidas son polímeros catiónicos, tales como una poliamina, es decir, un polímero que contiene dos o más grupos amina primaria, secundaria o terciaria o grupos amonio cuaternario. Las poliaminas preferidas son polialquileniminas, es decir, polímeros en los que los grupos amina están interconectados por cadenas de alquileno. Las cadenas de alquileno son, por ejemplo, seleccionadas entre cadenas de alquileno C_{1-6}. Las cadenas de alquileno pueden llevar grupos hidrofílicos neutros, por ejemplo hidroxi (HO) o grupos poli- (incluyendo oligo) alquilenoxi inferior [-O-((C_{2}H_{4})_{n}O)_{m}H, donde n es 1-5 y m es desde 1 hasta, por ejemplo,
\leq 100 o \leq 50)], grupos amida, acilo, aciloxi, alquilo inferior (por ejemplo, C_{1-5}) y otros grupos neutros y/o grupos que no son reactivos en las condiciones que se han de aplicar en el dispositivo microfluídico.
El peso molecular preferido del esqueleto, incluyendo los esqueletos de poliamina, está dentro del margen de 10.000-3.000.000 daltons, preferiblemente de aproximadamente 50.000-2.000.000 daltons. La estructura del esqueleto puede ser lineal, ramificada, hiperramificada o dendrítica. El esqueleto preferido de poliamina es polietilenimina, un compuesto que se puede conseguir, v.g., por polimerización de etilenimina, dando normalmente cadenas hiperramificadas.
Unión del polímero hidrofílico no iónico
La introducción de los grupos poliméricos hidrofílicos no iónicos en las superficies del canal puede ser realizada según principios bien conocidos en el campo, por ejemplo uniendo directamente el polímero hidrofílico a la superficie de la parte deseada o a través del tipo de esqueleto discutido anteriormente. El aducto entre el esqueleto y el polímero hidrofílico no iónico puede (i) formarse por separado antes de unirlo a la superficie o (ii) estar sobre la superficie uniendo primeramente el esqueleto y luego el polímero hidrofílico. Alternativamente, (ii) puede ser llevado a cabo por (a) injerto de un polímero hidrofílico no iónico preparado previamente en el esqueleto o (b) polimerización de injerto de monómeros adecuados.
Tanto el polímero hidrofílico no iónico como el esqueleto pueden ser estabilizados en las superficies subyacentes por enlaces covalentes, interacción electrostática, etc. y/o por entrecruzamiento in situ o posterior. Se puede unir, por ejemplo, un esqueleto de poliamina covalentemente por reacción de sus funciones amina con grupos reactivos con amina que están originalmente presentes o que han sido introducidos sobre la superficie del substrato sin revestir.
Es importante que la superficie de la parte desnuda que se ha de revestir según la invención tenga grupos que permitan una interacción estable entre el polímero hidrofílico no iónico y la superficie y entre el esqueleto y la superficie. Los esqueletos catiónicos, por ejemplo poliaminas, requieren la exposición de grupos negativamente cargados o cargables o grupos por lo demás capaces de unirse a grupos amina, típicamente hidrofílicos, sobre la superficie. Se pueden introducir fácilmente grupos polares y/o cargados o cargables sobre superficies de plásticos, por ejemplo por tratamiento con plasmas que contienen O_{2} y ácido acrílico, por oxidación con permanganato o bicromato en ácido sulfúrico concentrado, por revestimiento con polímeros que contienen este tipo de grupos, etc. En otras palabras, por técnicas bien conocidas en la literatura científica y de patentes. La superficie de plástico, como tal, puede también contener este tipo de grupos sin ningún pretratamiento, es decir, obteniéndose por polimerización de monómeros que llevan el tipo antes mencionado de grupos o grupos que, después de la polimerización, pueden ser fácilmente transformados en tales grupos.
Si la superficie que se ha de revestir está hecha de un metal, por ejemplo de oro o de platino, y el polímero hidrofílico no iónico o el esqueleto tiene grupos tiol, se puede realizar la unión por enlaces que son parcialmente covalentes.
Si el polímero hidrofílico no iónico o el esqueleto tienen grupos hidrocarbonados, por ejemplo grupos alquilo o grupos fenilo puros, se puede contemplar que la unión a la superficie del substrato pueda tener lugar por interacciones hidrofóbicas.
Ángulos de contacto con el agua
El ángulo óptimo de contacto con el agua depende de los análisis y reacciones que haya que llevar a cabo en la estructura de los microcanales, de las dimensiones de los microcanales y de las cámaras de las estructuras, de la composición y de la tensión superficial de los líquidos usados, etc. Como regla empírica, la capa de la invención debe ser seleccionada de manera que proporcione un ángulo de contacto con el agua que sea \leq 30º, tal como \leq 25º o \leq 20º. Estas cifras se refieren a valores obtenidos a la temperatura de uso, primariamente a la temperatura ambiente.
Hasta ahora, las superficies más superiores han sido las basadas en aductos entre polietilenimina y polietilenglicol con unión de monositio (monogrupo terminal) del polímero hidrofílico no iónico al esqueleto de polietilenimina. El mejor modo hasta la fecha de esta variante preferida es facilitado en la parte experimental (ejemplo 1).
Espesor del revestimiento
El espesor del revestimiento hidratado proporcionado por los polímeros hidrofílicos no iónicos debe ser \leq 50%, por ejemplo \leq 20%, de la distancia más pequeña entre dos lados opuestos de una parte de la estructura del microcanal que comprende la superficie revestida según la invención. Esto significa típicamente que un espesor óptimo estará dentro del intervalo 0,1-1.000 nm, por ejemplo 1-100 nm, con la condición de que el revestimiento permita el paso a su través de un flujo deseado.
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Estructuras en el dispositivo microfluídico
El dispositivo microfluídico puede tener forma de disco de varias geometrías, siendo la forma redonda la variante preferida (forma de CD).
En dispositivos que tienen formas redondas, las estructuras de microcanales pueden estar dispuestas radialmente con una dirección de flujo pretendida desde un área de aplicación interna radialmente hacia la periferia del disco. En esta variante, las formas más prácticas de dirigir el flujo es por acción capilar, fuerza centrípeta (girando el disco) y/o hidrodinámicamente.
Cada estructura de microcanal consiste en uno o más canales y/o una o más cavidades en el microformato. Diferentes partes de una estructura pueden tener diferentes funciones discretas. Por lo tanto, puede haber una o más partes que funcionen como (a) cámara/cavidad/área de aplicación, (b) conducto para el transporte de líquidos, (c) cámara/cavidad de reacción, (d) unidad definidora de volumen, (e) cámara/cavidad de mezcla, (f) cámara para separar los componentes de la mezcla, por ejemplo por electroforesis capilar, cromatografía y similares, (g) cámara/cavidad de detección, (h) conducto/cámara/cavidad de desechos, etc. Según la invención, al menos una de estas partes puede tener el revestimiento de la invención sobre su superficie, es decir, que corresponde a la superficie de la parte discutida anteriormente.
Cuando se usa la estructura, se aplican los reactivos necesarios y/o la muestra que incluye el analito a un área de aplicación y se transportan corriente abajo en la estructura por un flujo líquido aplicado. Algunos de los reactivos pueden haber sido predispensados a una cámara/cavidad. El flujo de líquido puede ser dirigido por fuerzas capilares y/o fuerza centrípeta, diferencias de presión aplicadas externamente sobre una estructura de microcanal y también otras fuerzas no electrocinéticas externamente aplicadas y que causan el transporte del líquido y de los analitos y reactivos en la misma dirección. El flujo de líquido puede ser también dirigido por la presión generada por electroendoósmosis creada en la estructura. El flujo de líquido transportará así reactivos y analitos y otros constituyentes desde un área/cavidad/cámara de aplicación a una secuencia consistente en un orden particular de partes preseleccionadas (b)-(h). El flujo de líquido puede hacer una pausa cuando un reactivo y/o analito han alcanzado una parte preseleccionada en la que se someten a un cierto procedimiento, por ejemplo electroforesis capilar en una parte de separación, una reacción en una parte de reacción, detección en una parte de detección, etc.
Los métodos analíticos y preparativos que utilizan el dispositivo microfluídico de la invención con transporte de líquido, reactivos y analitos como se describe en el párrafo precedente constituyen un aspecto separado de la invención.
Microformato significa que al menos un conducto de líquido en la estructura tiene una profundidad y/o anchura que está en el rango de microformato, es decir, < 10^{3} \mum, preferiblemente < 10^{2} \mum. Cada estructura de microcanal se prolonga en un plano común del material del substrato planar. Además, puede haber prolongaciones en otras direcciones, primariamente perpendiculares al plano común. Esas otras prolongaciones pueden funcionar como áreas de aplicación de muestra o de líquido o conexiones con otras estructuras de microcanales que no se localizan en el plano común, por ejemplo.
La distancia entre dos paredes opuestas en un canal es \leq 1.000 \mum, tal como \leq 100 \mum o incluso \leq 10 \mum, tal como \leq 1 \mum. Las estructuras pueden contener también una o más cámaras o cavidades conectadas a los canales y que tienen volúmenes de \leq 500 \mul, tal como \leq 100 \mul e incluso \leq 10 \mul, tal como \leq 1 \mul. Las profundidades de las cámaras/cavidades pueden estar típicamente en el intervalo de \leq 1.000 \mum, tal como \leq 100 \mum, tal como \leq 10 \mum o incluso \leq 1 \mum. El límite inferior es significativamente mayor que el mayor de los reactivos usados. Los límites inferiores de cámaras y canales están típicamente en el margen de 0,1-0,01 \mum para dispositivos que han de ser administrados en forma seca.
Se cree que las variantes preferidas de los dispositivos microfluídicos de la invención serán entregadas al cliente en estado seco. Las superficies de las estructuras de microcanales del dispositivo, por lo tanto, deben tener una hidrofilicidad suficiente para permitir usar un líquido acuoso para penetrar en las diferentes partes de los canales de la estructura por fuerzas capilares (autosucción).
Puede haber conductos que permitan la comunicación líquida entre estructuras de microcanales individuales dentro de un conjunto.
Material en el dispositivo microfluídico
La superficie que se ha de revestir según la invención está típicamente hecha de un material inorgánico y/u orgánico, preferiblemente de plástico. Se incluyen material de diamante y otras formas de carbono elemental en el término material orgánico. Entre los materiales de superficie inorgánicos adecuados, se pueden mencionar superficies metálicas, v.g., hechas de oro, platino, etc.
Los plásticos que se han de revestir según la invención pueden haber sido obtenidos por polimerización de monómeros que contienen insaturación, tal como dobles enlaces carbono-carbono y/o triples enlaces carbono-carbono.
\newpage
Los monómeros pueden, por ejemplo, ser seleccionados entre compuestos mono-, di- y poli/oligo-insaturados, v.g., compuestos de vinilo y otros compuestos que contengan insaturación. Son monómeros ilustrativos:
(i)
alquenos/alcadienos (tales como etileno, butadieno y propileno e incluyendo formas substituidas, tales como éteres vinílicos), cicloalquenos, hidrocarburos polifluorovinílicos (por ejemplo, tetrafluoroetileno), ácidos que contienen alquenos, ésteres, amidas, nitrilos, etc., por ejemplo diversos compuestos de metacrilato/acrilo, y
(ii)
compuestos vinilarílicos (tales como mono-, di- y trivinilbencenos) que pueden estar eventualmente substituidos, por ejemplo, con grupos alquilo inferior (C1-6), etc.
Otro tipo de plásticos se basa en polímeros de condensación en los que se seleccionan los monómeros entre compuestos que exhiben dos o más grupos seleccionados entre grupos amino, hidroxi, carboxi, etc. Son monómeros particularmente enfatizados monómeros poliamino, monómeros policarboxi (incluyendo los correspondientes haluros, ésteres y anhídridos reactivos), monómeros polihidroxi, monómeros aminocarboxi, monómeros aminohidroxi y monómeros hidroxicarboxi, en donde poli significa dos, tres o más grupos funcionales. Los compuestos polifuncionales incluyen compuestos que tienen un grupo funcional que es reactivo dos veces, por ejemplo ácido carbónico o formaldehído. Los plásticos contemplados son típicamente policarbonatos, poliamidas, poliaminas, poliéteres, etc. Los poliéteres incluyen los correspondientes análogos de silicio, tales como el caucho de silicona.
Los polímeros de los plásticos pueden estar en forma entrecruzada.
Los plásticos pueden ser una mezcla de dos o más polímero(s)/copolímero(s) diferentes.
Son plásticos particularmente interesantes los que tienen una fluorescencia no significativa para longitudes de onda de excitación en el intervalo de 200-800 nm y longitudes de onda de emisión en el intervalo de 400-900 nm. Por fluorescencia no significativa se entiende que la intensidad de fluorescencia en el intervalo de longitud de onda de emisión antes dado debe ser inferior al 50% de la intensidad de fluorescencia para un plástico de referencia (= un policarbonato de bisfenol A sin aditivos fluorescentes). De hecho, no perjudica en caso de que la intensidad de fluorescencia del plástico sea incluso menor, tal como < 30% o < 15%, tal como < 5% o < 1%, de la intensidad de fluorescencia del plástico de referencia. Los plásticos típicos que tienen una fluorescencia aceptable se basan en polímeros de monómeros alifáticos que contienen dobles enlaces carbono-carbono polimerizables, tales como polímeros de cicloalquenos (v.g., norborneno o norbornenos substituidos), etileno, propilenos, etc., así como otros polímeros no aromáticos de elevada pureza, v.g., ciertos grados de polimetacrilato de metilo.
En variantes preferidas de la invención, se aplican también los mismos límites para la fluorescencia a la estructura microfluídica después de haber sido revestida según la invención.
Aplicaciones en las que se puede usar el dispositivo microfluídico de la invención
El uso primario de los dispositivos microfluídicos de la invención es en sistemas químicos y bioquímicos analíticos y preparativos.
Los sistemas analíticos típicos en los que se pueden usar los sistemas microfluídicos aquí descritos pueden incluir como etapas principales una o más de (a) preparación de la muestra, (b) reacciones de ensayo y (c) detección. Preparación de la muestra significa la preparación de una muestra para hacerla adecuada para las reacciones de ensayo y/o la detección de una cierta actividad o entidad molecular. Esto puede significar, por ejemplo, que las substancias que interfieren con las reacciones de ensayo y/o la detección son eliminadas o de algún otro modo neutralizadas, que las substancias son amplificadas y/o derivatizadas, etc. Son ejemplos típicos (1) la amplificación de una o más secuencias de ácido nucleico en una muestra, por ejemplo por reacción en cadena de polimerasa (PCR); (2) la eliminación de especies que tienen reacción cruzada con un analito en ensayos que implican reacciones de afinidad, etc. Las condiciones de ensayo típicas son (i) reacciones que implican a células; (ii) reacciones de afinidad, por ejemplo afinidad bioespecífica, incluyendo reacciones inmunes, reacciones enzimáticas, hibridación/recocido, etc.; (iii) reacciones de precipitación; (iv) reacciones químicas puras que conllevan la formación o la ruptura de enlaces covalentes, etc. La reacción de detección puede incluir fluorometría, quimioluminometría, espectrometria de masas, nefelometría, turbidometría, etc. La reacción de detección aspira a la detección del resultado de la(s) reacción(es) del ensayo y a relacionar un resultado esperado con la presencia cualitativa o cuantitativa de una actividad en la muestra original. La actividad puede ser una actividad biológica, química, bioquímica, etc. Puede ser como la presencia de un compuesto como tal o simplemente como una actividad de un compuesto conocido o desconocido. Si el sistema es utilizado con fines de diagnóstico, el resultado en la etapa de detección es además correlacionado con el estado medicinal del individuo del que deriva la muestra. Los sistemas analíticos aplicables pueden así consistir en ensayos de afinidad, tales como ensayos inmunes, ensayos de hibridación, ensayos de biología celular, detección de mutaciones, caracterización del genoma, ensayos enzimáticos, ensayos de rastreo para hallar nuevos pares de afinidad, etc. También se incluyen métodos para el análisis del contenido en la muestra de proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos y otras moléculas, con particular énfasis de otras moléculas
bioorgánicas.
\newpage
El dispositivo microfluídico de la presente invención puede también hallar uso para el montaje de librerías de compuestos, incluyendo librerías de péptidos y oligonucleótidos sintéticos, por ejemplo por síntesis en fase sólida. La síntesis de las así llamadas librerías combinatorias de compuestos queda también incluida.
La invención será ahora descrita en relación a experimentos no limitativos que funcionan como prueba de principio.
Parte experimental A. Revestimiento de aducto PEG-PEI a. Síntesis de aducto PEG-PEI
Se disolvieron 0,43 g de polietilenimina (Polymin SN de BASF, Alemania) en 45 ml de tampón borato de sodio 50 mM (pH 9,5) a 45ºC. Se añadieron 5 g del éter glicidílico de monometoxipolietilenglicol (Mp 5.000) durante la agitación y se agitó la mezcla durante 3 h a 45ºC.
b. Tratamiento de superficie
Se puso un disco CD de policarbonato (policarbonato de bisfenol A, Macrolon DP-1265, Bayer AG, Alemania) con un patrón de microcanales rebajado en un reactor de plasma (Plasma Science PS0500, BOC Coating Technology, EE.UU.) y se trató con un plasma de oxígeno a 5 sccm de flujo gaseoso y a una potencia de 500 W RF durante 10 minutos. Después de evacuar el reactor, se sumergió el disco en una solución al 0,1% del aducto PEG-PEI en tampón borato, pH 9,5, durante 1 h. Se aclaró entonces el disco con agua destilada, se insufló a sequedad con nitrógeno y se midió el ángulo de contacto con el agua (gota sésil) en un banco goniómetro manual Ramé-Hart. La media de seis mediciones en equilibrio (tres gótulas) era de 24 grados. Un espectro XPS de la superficie tratada dio la siguiente composición elemental molar: 73,2% C, 3,7% N, 23,1% O, mostrando que la superficie estaba esencialmente cubierta por el aducto PEG-PEI adsorbido.
c. Humectación capilar
Se trató otro disco CD de policarbonato del mismo material que antes con un patrón de microcanales rebajado como en el ejemplo 2. Se cubrió entonces con una delgada tapa de caucho de silicona, con un orificio situado sobre un microcanal. Cuando se puso una gotita de agua en el orificio con una micropipeta, el agua fue arrastrada por fuerzas capilares y penetró en todo el sistema de canales accesible.
d. Ejemplos comparativos de tratamientos de superficie
a)
Se sumergió un disco de policarbonato del mismo material que antes con un patrón de microcanales rebajado en una solución acuosa al 0,5% de fenildextrano (grado de substitución: 0,2 por unidad monosacárida de dextrano, Mp 40.000) durante 1 hora. Después de aclarar con agua, se insufló el disco a sequedad con nitrógeno. El ángulo de contacto con el agua era de 30 grados. Cuando se puso una tapa de caucho de silicona sobre el disco con un orificio sobre un canal, la gotita no fue espontáneamente arrastrada al interior. Cuando se aplicó vacío al canal a través de otro orificio en la tapa, la gotita pudo introducirse, sin embargo, por succión.
b)
Se sumergió un disco de policarbonato del mismo material que antes con un patrón de microcanales rebajado durante la noche en una solución acuosa al 1% de un copolímero de tribloques de etilenglicol-"polipropilengli-col"-polietilenglicol (Pluronic F108 de BASF). Después de aclarar con agua, se insufló el disco a sequedad con nitrógeno. El ángulo de contacto con el agua era de 60 grados. Cuando se puso una tapa de caucho de silicona sobre el disco con un orificio sobre un canal, la gotita no resultó espontáneamente arrastrada al interior. Al aplicar vacío al canal a través de otro orificio en la tapa, la gotita pudo introducirse, sin embargo, por succión.
B. Revestimiento de poli(acrilamida) a) Activación de la superficie
Se usó como tapa una lámina de PET (tereftalato de polietileno, Melinex®, ICI), revestida por evaporación con una fina película de óxido de silicio. Se lavó el lado del óxido de silicio de la lámina de PET con etanol y se trató a continuación con UV/Ozono (limpiador UVO, Modelo Nº 144A X-220, Jelight Company, EE.UU.) durante 5 minutos. Se mezclaron silano Bind de 15 mm (3-metacriloloxipropiltrimetoxisilano, Amersham-Pharmacia Biotech), 1,25 ml de ácido acético al 10% y 5 ml de etanol y se aplicaron a continuación sobre la lámina usando un pincel. Tras la evaporación del solvente, se lavó la lámina con etanol y se insufló a sequedad con nitrógeno. Se midió el ángulo de contacto con el agua (gota sésil) en un goniómetro manual Ramé-Hart. La media de mediciones repetidas era de 62 grados.
\newpage
b. Injertación de poliacrilamida en la superficie activada
Se mezclaron 8,5 ml de acrilamida 3 M en agua y 1,5 ml de Irgacure 184 100 mM (disuelto en etilenglicol, Ciba-Geigy). Se dispersó la solución resultante sobre una placa de cuarzo y se puso encima la lámina de PET activado. La solución monomérica fue iluminada con UV durante 20 minutos a través de la placa de cuarzo. Se lavó entonces la lámina de PET a conciencia en agua y el ángulo de contacto medio de mediciones repetidas era de 17 grados.
c. Humectación capilar
Se puso una pieza de caucho de silicona de vulcanización a temperatura ambiente (Memosil, Wacker Chemie) que tenía una estructura de microcanales y dos orificios sobre la lámina de PET injertada con poliacrilamida (tapa) (según b anterior). Cuando se puso una gotita de agua en el orificio con una micropipeta, el agua fue arrastrada por fuerzas capilares.
d. Ejemplo comparativo de humectación capilar
Se puso una pieza de caucho de silicona de vulcanización a temperatura ambiente (Memosil, Wacker Chemie) que tenía un patrón de microcanales y dos orificios sobre la lámina de PET activada (tapa) (según a anterior). Cuando se puso una gotita de agua en el orificio con una micropipeta, no hubo arrastre de agua hacia el interior por fuerzas capilares. Cuando se aplicó vacío al canal a través del otro orificio, la gotita fue succionada al canal.

Claims (24)

1. El uso de un revestimiento que expone un polímero hidrofílico no iónico para optimizar la adsorción no específica y la hidrofilicidad en un dispositivo microfluídico que consiste en un conjunto de una o más estructuras de microcanales cubiertas que son fabricadas en la superficie de un substrato planar hecho de plástico, donde cada una de dichas estructuras de microcanales:
i)
están ideadas para transportar solutos y/o partículas por un flujo líquido acuoso dirigido por fuerzas consistentes en fuerza capilar y/o fuerza centrípeta desde una parte funcional hasta otra en la misma estructura de microcanales y
ii)
están en estado seco y
iii)
tienen una o más partes funcionales seleccionadas entre (a) una cámara o cavidad de reacción, (b) una unidad definidora de volumen, (c) una cámara o cavidad de mezcla y (d) una cámara o cavidad de detección,
estando presente dicho revestimiento sobre la superficie de una parte en al menos una de dichas una o más partes funcionales de cada estructura de microcanales del conjunto y siendo dicho líquido acuoso capaz de entrar en dicha parte funcional por autosucción cuando el líquido ha pasado la entrada de la parte funcional.
2. El uso de la reivindicación 2, caracterizado por incluir dicha al menos una parte funcional una unidad definidora de volumen.
3. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado por incluir dicha al menos una parte funcional una o más de (a) una cámara o cavidad de reacción, (b) una cámara o cavidad de mezcla y (c) una cámara o cavidad de detección.
4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado por el hecho de que el polímero no hidrofílico no iónico está unido a un esqueleto polimérico que está unido a la superficie.
5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado por incluir el conjunto más de cinco estructuras de microcanales cubiertas.
6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado por tener cada estructura de microcanal una microcavidad que tiene un volumen \leq 1 \mul.
7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado por el hecho de que el dispositivo es un disco redondo.
8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado por seleccionar el polímero no iónico entre polímeros que contienen una pluralidad de grupos hidroxi, grupos etilenoxi y/o grupos amida.
9. El uso de la reivindicación 8, caracterizado por seleccionar el polímero hidrofílico no iónico entre polisacáridos y derivados hidrosolubles de los mismos, alcoholes polivinílicos y polímeros de poli(éter hidroxilalquilvinílico).
10. El uso de la reivindicación 8, caracterizado por ser el polímero hidrofílico no iónico polietilenglicol o monometoxipolietilenglicol.
11. El uso de la reivindicación 8, caracterizado por ser el polímero hidrofílico no iónico un polimerizado/copoli-
merizado con monómeros seleccionados entre al menos acrilamida, metacrilamida y vinilpirrolidona.
12. El uso de la reivindicación 4, caracterizado por ser dicho esqueleto una poliamina.
13. El uso de la reivindicación 12, caracterizado por ser dicho esqueleto una polietilenimina.
14. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 4 y 12, caracterizado por tener el esqueleto un peso molecular de 10.000-3.000.000 daltons.
15. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-1, caracterizado por haber hidrofilizado la superficie del substrato sin el revestimiento por tratamiento con plasma o por un agente de oxidación antes de unir el revestimiento sobre la superficie de dicha parte.
16. Un dispositivo microfluídico que consiste en un conjunto de una o más estructuras de microcanales cubiertas fabricadas en la superficie de un substrato planar hecho de plástico, donde cada una de dichas estructuras de microcanales:
\newpage
i)
tiene como fin el transporte de un soluto y/o de partículas por un flujo líquido acuoso desde una parte funcional hasta otra en la misma estructura de microcanal;
ii)
tiene una o más partes funcionales seleccionadas entre (a) una cámara o cavidad de reacción, (b) una unidad definidora de volumen, (c) una cámara o cavidad de mezcla y (d) una cámara o cavidad de detección, y
iii)
está en un estado seco que es capaz de ser rehidratado,
caracterizado por
A)
el hecho de que una superficie de parte en al menos una de dichas partes funcionales de cada estructura de microcanal de un conjunto tiene un revestimiento que expone un polímero hidrofílico no iónico que tiene uno o más bloques de cadenas de polioxietileno y que se une covalentemente a un esqueleto polimérico unido a dicha superficie de parte de dicha al menos una parte funcional de la superficie y
B)
ser capaz el líquido acuoso de entrar en dicha parte funcional por autosucción cuando el líquido ha pasado la entrada de la parte funcional.
17. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 16, caracterizado por incluir dicha al menos una parte funcional una unidad definidora de volumen.
18. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 17, caracterizado por incluir dicha al menos una parte funcional una cámara o cavidad de reacción, una cámara o cavidad de mezcla y una cámara o cavidad de detección.
19. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 16-18, caracterizado por incluir el conjunto más de 5 estructuras de microcanales.
20. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 16-19, caracterizado por ser el esqueleto polimérico una poliamina.
21. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 16-20, caracterizado por haber sido hidrofilizada dicha superficie de dicha al menos una parte funcional sin revestimiento por tratamiento con plasma o por un agente de oxidación para introducir grupos funcionales que permiten una posterior unión del revestimiento.
22. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 16-21, caracterizado por ser el polímero hidrofílico no iónico polietilenglicol o monometoxipolietilenglicol covalentemente unido en uno de sus extremos al esqueleto.
23. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 16-22, caracterizado por ser el esqueleto polimérico polietilenimina.
24. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 17-24, caracterizado por dirigir el flujo de líquido en la estructura de microcanal por una fuerza centrípeta y por autosucción.
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