ES2259998T3

ES2259998T3 - Un tetrapeptido que demuestra el efecto gerontoprotector, sustancia farmacologica a base de el metodo de su utilizacion.

Info

Publication number: ES2259998T3
Application number: ES00905499T
Authority: ES
Inventors: Vladimir Khatskelevich Khavinson
Original assignee: Obschestvo S Ogranichennoi Otvetstvennostiju "klinika Instituta Bioregulyatsii I Gerontologii"
Current assignee: Obschestvo S Ogranichennoi Otvetstvennostiju "klinika Instituta Bioregulyatsii I Gerontologii"
Priority date: 1999-05-11
Filing date: 2000-01-20
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2020-01-20
Also published as: CA2373128C; CA2373128A1; JP3902406B2; AU2703400A; RU2157233C1; AU769847C; ATE321068T1; IL146432A; DE60026826T2; JP2003526622A; IL146432A0; EP1179008B1; US6727227B1; AU769847B2; WO2000068255A3; EP1179008A2; WO2000068255A2; DE60026826D1

Abstract

Un tetrapéptido L-alanil-L-glutamil-L-aspartil-glicina de fórmula general L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly.

Description

Un tetrapéptido que demuestra el efecto gerontoprotector, sustancia farmacológica a base de él y el método de su utilización.

Campo de la invención

La invención está relacionada con el campo de la medicina y puede ser empleada como sustancia gerontoprotectora para la prevención del envejecimiento prematuro del organismo.

Se sabe que algunos de los mecanismos principales del envejecimiento del organismo son: un incremento de lesiones moleculares causadas por radicales libres, alteraciones funcionales del sistema de defensa antioxidación y trastornos de las funciones fisiológicas de la epífisis (1, 2, 3).

Antecedentes de la invención

Como el tetrapéptido reivindicado de acuerdo con la invención presenta actividad biológica y, más concretamente, actividad gerontoprotectora, un grupo de compuestos que poseen propiedades antioxidación deben ser referidos como análogos en la solicitud. El suplemento alimentario ionol (2,6-di-ter-butil-4-metilfenol), que es un inhibidor bien conocido de los procesos de radicales, ha estimulado un incremento de la duración de la vida de la cepa de ratones LAF_{1} caracterizada por un envejecimiento acelerado (4). Sin embargo, el producto farmacéutico basado en el 2,6-di-ter-butil-4-metilfenol (dibunol) es fabricado en forma de linimento y es aplicado principalmente en la práctica de la urología para el tratamiento de pacientes con cáncer (5). La adición del antioxidante etoxiquina (santoquina) al alimento prolongó la duración de la vida de ratones de la cepa C3H (6). Un incremento de la duración de la vida de animales experimentales es estimulado también por el clorhidrato de 2-etil-6-metil-3-oxipiridina, un antioxidante soluble en agua de baja toxicidad, que es un análogo estructural de la vitamina B_{6} (7, 8). Una prolongación no significativa de la duración de la vida de animales experimentales fue proporcionada por 2-mercaptoetanolamina, butil hidroxitoluol, cisteína, 3-hidroxipiridina, centrofenoxina, ácido láctico y ácido glucónico y glutation (9, 10). Aún así, estos compuestos no son preparaciones farmacéuticas y no han encontrado utilización en medicina como sustancias gerontoprotectoras. La administración de vitaminas A, C, E tuvo también como resultado un incremento de la duración de la vida de animales experimentales (11, 12, 13). Sin embargo, la supersaturación del organismo con estas vitaminas puede influir desfavorablemente sobre las funciones de los órganos y sistemas y traer consigo un desarrollo intenso de hipervitaminosis. El \beta-catecol, una preparación cuya composición está formada por vitaminas y sustancias vegetales, se sabe que presenta actividad antioxidante (14). La administración de esta preparación a ratones de la cepa SAM-P8 que presentan un envejecimiento acelerado aumentó la tasa de supervivencia de los animales. Sin embargo, los mecanismos de su acción gerontoprotectora no han sido todavía estudiados suficientemente, limitando de este modo su integración en la práctica clínica. Después de que ratones de la cepa SAM, que están predispuestos a un envejecimiento acelerado, hubieron sido mantenidos bajo una dieta con una cantidad incrementada de carnosina (\beta-Ala-His) durante 7 meses, disminuyó su tasa de muerte (15).

Aún así, la carnosina no es una preparación farmacéutica y sus propiedades gerontoprotectoras no han sido estudiadas suficientemente todavía. Se produjo un pequeño incremento de la duración media de la vida de ratones por la aplicación de melatonina, una hormona epifisaria (16). El impacto de la melatonina está asociado con su propiedad antioxidante (17). No obstante, la exposición a melatonina de Drosophila melanogaster seleccionada por una elevada tasa de mortalidad embrionaria (cepa HEM), no produjo un efecto gerontoprotector, aunque estaba acompañada por un efecto antioxidante. La melatonina no es una preparación farmacéutica y es fabricada en forma de aditivo alimentario biológicamente activo.

El Gerovital, un fármaco que contiene Novocaína, es utilizado como sustancia gerontoprotectora. Los perjuicios de esta preparación consisten en su posible influencia negativa sobre las funciones del sistema cardiovascular, su impacto alérgico, a veces un deterioro del sueño, sentimiento de ansiedad, dolores musculares y articulares.

Descripción de la invención

La invención reivindicada está encaminada a obtener un nuevo compuesto biológicamente activo de origen peptídico capaz de presentar actividad gerontoprotectora.

El compuesto peptídico reivindicado - un tetrapéptido - no tiene análogos estructurales.

De acuerdo con la invención, se reivindica el tetrapéptido L-alanil-L-glutamil-L-aspartil-glicina de fórmula general L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly.

Con respecto a la invención, el tetrapéptido L-alanil-L-glutamil-L-aspartil-glicina con la secuencia de aminoácidos siguiente: L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly presenta actividad biológica, a saber actividad gerontoprotectora, debida a la estimulación de los índices del sistema de defensa antioxidación y debido al proceso de síntesis de melatonina en estructuras del sistema neuroendocrino difuso.

El tetrapéptido es obtenido mediante un método clásico de síntesis peptídica en solución (19).

La actividad gerontoprotectora del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly fue manifestada en ensayos experimentales. El estudio de la actividad gerontoprotectora fue realizado en Drosophila melanogaster analizando los índices de defensa antioxidación, la duración de la vida y la duración del periodo de reproducción, además de en ratas mediante el examen de la síntesis de melatonina extrapineal.

Con respecto a la invención, la sustancia farmacológica capaz de presentar actividad gerontoprotectora incluye como su base activa una cantidad eficaz del tetrapéptido de fórmula L-alanil-L-glutamil-L-aspartil-glicina (L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly) o de sus sales.

Con respecto a la invención, la sustancia farmacológica capaz de presentar actividad gerontoprotectora puede contener sales del grupo amino (acetato, clorhidrato y oxalato) o de los grupos carboxilo (las sales de metales - sodio, potasio, calcio, litio, zinc, magnesio y otros cationes orgánicos e inorgánicos - amonio, trietilamonio).

Con respecto a la invención, la sustancia farmacológica está indicada para administración parenteral, intranasal u oral, o para aplicación local.

La sustancia farmacológica reivindicada que presenta actividad gerontoprotectora es capaz de estimular los índices del sistema de defensa antioxidación y los procesos de síntesis de melatonina en estructuras del sistema neuroendocrino difuso que, a su vez, inhiben los procesos de envejecimiento y estimulan un incremento de la duración de la
vida.

El término "sustancia gerontoprotectora", utilizado en esta solicitud, implica a la sustancia que inhibe el envejecimiento y prolonga la vida por medio de la prevención del envejecimiento prematuro, que necesita la estimulación del sistema de defensa antioxidación y la influencia reguladora sobre procesos metabólicos en estructuras del sistema neuroendocrino difuso.

El término "sustancia farmacológica", utilizado en esta solicitud, implica el empleo de cualquier forma farmacológica que contenga el tetrapéptido o sus sales, que puede ser utilizada con fines profilácticos y/o terapéuticos en medicina como sustancia gerontoprotectora para el envejecimiento prematuro.

El término "cantidad eficaz", utilizado en esta solicitud, implica la utilización de tal cantidad de la base activa que, en conformidad con sus índices cuantitativos de actividad y toxicidad, así como con respecto al conocimiento disponible, debe ser eficaz en esta forma farmacológica.

El término "composición farmacéutica", utilizado en esta solicitud, implica varias formas farmacológicas de la preparación.

Con el fin de obtener composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención, el tetrapéptido propuesto o sus derivados farmacéuticamente aplicables, es mezclado como ingrediente activo con un vehículo farmacéutico de acuerdo con los métodos de formación de compuestos aceptados en farmacia.

El vehículo puede tener varias formas, que dependen de la forma farmacológica de la preparación deseable para administración, por ejemplo: parenteral, intranasal u oral.

Todos los componentes farmacológicos conocidos pueden ser utilizados para la preparación de composiciones en dosis preferibles para administración oral.

Para administración parenteral (intranasal), el vehículo incluye normalmente agua estéril, aunque pueden incluirse otros ingredientes que contribuyan a la estabilidad o el mantenimiento de la esterilidad.

De acuerdo con la invención, el método incluye la exposición profiláctica o terapéutica de pacientes a la sustancia farmacológica reivindicada en dosis de 0,01 a 100 \mug/kg de peso corporal, al menos una vez al día durante un periodo necesario para conseguir un efecto terapéutico - de 10 a 40 días, dependiendo del carácter y de la gravedad del proceso patológico.

De acuerdo con la invención, el tetrapéptido es activo cuando es administrado en dosis de 0,01 a 100 \mug/kg de peso corporal, aunque pueden utilizarse también dosis menores (mayores), dependiendo del carácter y de la gravedad del proceso patológico.

Aplicación industrial

La invención está ilustrada por un ejemplo de síntesis del tetrapéptido, cuya fórmula es L-alanil-L-glutamil-L-aspartil-glicina (L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly) (Ejemplo 1), por los ejemplos de ensayos para determinar la toxicidad y la actividad biológica del tetrapéptido (Ejemplos 2-8) y también por ejemplos que muestran los resultados de la aplicación clínica del tetrapéptido, demostrando así sus propiedades farmacológicas y constatando la posibilidad de conseguir un efecto profiláctico y/o terapéutico (Ejemplos 9, 10).

Ejemplo 1 Síntesis del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly

1.: Nombre del producto: L-alanil-L-glutamil-L-aspartil-glicina.

2.: Fórmula estructural: H-Ala-Glu-Asp-Gly-OH.

1

3.: Fórmula molecular sin par iónico: C_{14}H_{22}N_{4}O_{9}

4.: Peso molecular sin par iónico: 390,35.

5.: Par iónico: acetato.

6.: Aspecto: polvo inodoro amorfo blanco.

7.: Método de síntesis: el péptido es obtenido mediante un método clásico de síntesis en solución mediante el esquema siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

Se utilizó como solvente N,N'-dimetilformamida. Mediante la adición de ácido aspártico, el grupo \alpha-COOH fue protegido mediante el método de salificación con la utilización de trietilamina. La eliminación del grupo protector BOC fue realizada con una solución de ácido trifluoroacético (TFA); la eliminación del grupo protector Z fue realizada mediante hidrogenación catalítica. La extracción y purificación del producto se llevaron a cabo mediante el método de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) preparativa en una columna con fase reversa.

Propiedades del producto final

\bullet

análisis de aminoácidos

\hskip0,5cm

Glu

\hskip0,5cm

Asp

\hskip0,5cm

Ala

\hskip0,5cm

Gly

\hskip4,9cm

1,02

\hskip0,5cm

1,00

\hskip0,4cm

1,01

\hskip0,4cm

1,00

\bullet: contenido peptídico: 98,4% (mediante HPLC, 220 nm)

\bullet: cromatografía en capa fina (TLC) - individual, R_{f} = 0,73 (acetonitrilo - ácido acético - agua, 5:1:3)

\bullet: contenido de humedad: 5%

\bullet: pH de la solución al 0,001%: 4,37.

\bullet: potencia rotatoria específica: [\alpha]_{D}^{22}: -32º (c = 1, H_{2}O).

Ejemplo de síntesis

1. BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (I), aspartato de N-ter.butiloxicarbonil-(\gamma-bencil)glutamil-(\beta-bencilo)

Se disuelven 4,3 g (0,0100 moles) del éster N-oxisuccinimida del ácido N-ter.butiloxicarbonil-(\gamma-bencil)glutámico (BOC-Glu(OBzl)-OSu) en 20 ml de dimetil formamida y se añaden 1,72 ml (0,0125 moles) de trietilamina y 2,80 g (0,0125 moles) de aspartato de \beta-bencilo. La mezcla es agitada durante 24 horas a temperatura ambiente. Posteriormente el producto es precipitado con ácido sulfúrico 0,5 N (150 ml), extraído con acetato de etilo (3 x 33 ml), lavado en ácido sulfúrico 0,5 N (2 x 20 ml), agua, solución al 5% de bicarbonato de sodio (1 x 20 ml), agua, ácido sulfúrico 0,5 N (2 x 20 ml), agua; la solución es secada sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. El acetato de etilo es eliminado por filtración y extraído in vacuo a 40ºC. El residuo es secado in vacuo sobre P_{2}O_{5}. Como resultado, se obtienen 5,68 g (\approx100%) de aceite. R_{f} = 0,42 (benceno-acetona 2:1, placas Sorbfil, Gel de Sílice 8-12 \mum, UV y revelado con cloro/bencidina).

2. TFA\cdotH-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (II), trifluoroacetato aspartato de (\gamma-bencil)glutamil-(\beta-bencilo)

Se disuelven 5,68 g (\approx0,01 moles) de aspartato de N-ter.butiloxicarbonil-(\gamma-bencil)glutamil-(\beta-bencilo) (I) en 20 ml de una mezcla de diclorometano-ácido trifluoroacético (3:1). En 2 horas se elimina el solvente a 40ºC. La eliminación es repetida con la adición de otra porción de diclorometano (2 x 10 ml), el residuo es secado in vacuo sobre NaOH. Se obtienen 5,80 g (\approx100%) de aceite. R_{f} = 0,63 (n-butanol-piridina-ácido acético-agua, 15:10:3:12).

3. Z-Ala-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (III), aspartato de N-carbobenzoxialanil-(\gamma-bencil)glutamil-(\beta-bencilo)

Se disuelven 5,65 g (0,01 moles) de trifluoroacetato aspartato de (\gamma-bencil)glutamil-(\beta-bencilo) (II) en 10 ml de dimetilformamida, se añaden 2,80 ml (0,02 moles) de trietilamina y 4,14 g (0,013 moles) del éster N-oxisuccinimida de N-carbobenzoxialanilo. La mezcla de reacción es agitada a temperatura ambiente durante 24 horas. El producto es precipitado con ácido sulfúrico 0,5 N (150 ml), extraído con acetato de etilo (3 x 30 ml), lavado en ácido sulfúrico 0,5 N (2 x 20 ml), agua, solución al 5% de bicarbonato de sodio (1 x 20 ml), agua, ácido sulfúrico 0,5 N (2 x 20 ml), agua. La solución es secada sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. El acetato de etilo es extraído por filtración, eliminado in vacuo a 40ºC. El residuo es recristalizado en el sistema de acetato de etilo/hexano. El producto es filtrado y secado in vacuo sobre P_{2}O_{5}. El rendimiento es 4,10 g (66%). El punto de fusión (T_{ml}) es 154ºC. R_{f} = 0,48 (benceno-acetona, 1:1), R_{f} = 0,72 (n-butanol-piridina-ácido acético-agua, 15:10:3:12).

4. Z-Ala-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl (IV), éster bencílico de N-carbobenzoxialanil (\gamma-bencil)glutamil-(\beta-bencil)aspartilglicina

Se suspenden 1,01 g (3 mmoles) del éster bencílico de tosilato de glicina TosOH\cdotH-Gly-OBzl en 15 ml de tetrahidrofurano y a ello se añaden 0,4 ml (3 mmoles) de trietilamina mientras se mezcla, posteriormente, en 5 minutos, se añaden 1,28 g (2 mmoles) de aspartato de N-carbobenzoxialanil-(\gamma-bencil)glutamil-(\beta-bencilo) (III) y 0,27 g (2 mmoles) de N-oxibenzotriazol. La mezcla es enfriada hasta 0ºC. Posteriormente, se añaden 0,42 g (2 mmoles) de una solución de N,N'-diciclohexilcarbodiimina en 5 ml de tetrahidrofurano enfriado a 0ºC. La mezcla es agitada a esta temperatura durante 2 horas y posteriormente se deja durante una noche a temperatura ambiente. El residuo de diciclohexilurea es extraído por filtración, el solvente es eliminado in vacuo y el residuo es disuelto en 30 ml de acetato de etilo. La solución es lavada en ácido sulfúrico 1 N, agua, solución al 5% de bicarbonato de sodio, agua, ácido sulfúrico 1 N, agua y secada sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. El solvente es eliminado in vacuo y el producto es recristalizado en el siste-
ma de acetato de etilo/hexano. El rendimiento es de 1,30 g (82%). T_{ml} = 146-148ºC. R_{f} = 0,75 (benceno-acetona, 2:1).

5. H-Ala-Glu-Asp-Gly-OH (V), alanil-glutamil-aspartil-glicina

Se hidrogenan 1,25 g del éster bencílico de N-carbobenzoxialanil-(\gamma-bencil)glutamil(\beta-bencil)aspartilglicina (III) en el sistema de metanol-agua-ácido acético (3:1:1) sobre Pd/C. El progreso de la reacción es monitorizado mediante TLC en los sistemas de benceno-acetona (2:1) y acetonitrilo-ácido acético-agua (5:1:3). Después de la finalización de la reacción el catalizador es filtrado, el filtrado es eliminado in vacuo y el residuo es recristalizado en un sistema de agua-metanol. El producto es secado in vacuo sobre KOH. El rendimiento es de 520 mg (95%). R_{f} = 0,73 (acetonitrilo-ácido acético-agua, 5:1:3). Para la purificación, 390 mg del producto son disueltos en 4 ml de ácido trifluoroacético al 0,01% y sometidos a HPLC en una columna de fase reversa Diasorb-130-C-16T de 50 x 250 mm, 7 \mum. El cromatógrafo utilizado es Beckman System Gold, Módulo de Solvente 126, Módulo Detector de Diodo Array 168. Las condiciones de la cromatografía son A: TFA 0,1%; B: MeCN 50%/TFA 0,1%, gradiente B 0 \rightarrow 5% durante 80 minutos. El volumen de muestra es de 5 ml, la detección se lleva a cabo a 215 nm, barrido - de 190-600 nm, a una velocidad de flujo de 10 ml/minuto. La fracción es recogida en 54,0-66,0 minutos. El solvente es eliminado in vacuo a una temperatura no superior a 40ºC, se repite varias veces (5 veces) con 10 ml de una solución al 10% de ácido acético. Finalmente, el residuo es disuelto en 20 ml de agua desionizada y liofilizado. Como resultado, se obtienen 290 mg de producto purificado en forma de polvo blanco amorfo inodoro. El péptido obtenido en forma de acetato es convertido en forma libre mediante procesamiento del mismo con IRA anionita o con una sustancia análoga en forma (OH^{-}). Posteriormente, se obtienen sales del grupo amino por la adición posterior de un equivalente de un ácido correspondiente (clorhídrico u oxálico). La solución acuosa obtenida es liofilizada y analizada como producto final.

Con el fin de obtener las sales correspondientes de los grupos carboxilo, el tetrapéptido libre es añadido a una cantidad calculada de una solución acuosa del hidróxido del metal correspondiente (NaOH, KOH, Zn(OH)_{2}, LiOH, Ca(OH)_{2}, Mg(OH)_{2}, NH_{4}OH). Para obtener la sal trietilamonio, el procesamiento se lleva a cabo de manera similar, con la utilización de trietilamina como base.

6. Análisis del producto final

\bullet: El contenido peptídico es determinado mediante HPLC en una columna Surelco LC-18-DB, 4,6 x 250 mm, grad. LC-18-DB. A: 0,1% de TFA; B: 50% de MeCN/0,1% de TFA; grad. B 0 \rightarrow 20% durante 30 minutos. La velocidad de flujo es de 1 ml/minuto. Detección a 220 nm, barrido - de 190-600 nm, el volumen de muestra es de 20 \mul. Contenido peptídico - 98,45%.

\bullet: El análisis de aminoácidos se lleva a cabo en el analizador AAA"T-339" Prague. La hidrólisis se realiza en HCl 6 N a 125ºC durante 24 horas

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Glu \+ Asp \+ Ala \+ Gly\cr  1,02 \+ 1,00 \+ 1,01 \+
1,00\cr}

\bullet: TLC: individual, R_{f} = 0,73 (acetonitrilo-ácido acético-agua, 5:1:3). Placas Sorbfil, Gel de Sílice de 8-12 \mum, revelado en cloro/bencidina.

\bullet: Contenido de humedad: 5% (gravimétricamente según la masa perdida mediante secado, - 20 mg a 100ºC).

\bullet: pH de una solución al 0,001%: 4,37 (potenciométricamente).

\bullet Rotación específica: [\alpha]_{D}^{22}: -32º (c = 1, H_{2}O), "Polamat A", Carl ZeiB Jena.

Ejemplo 2 Análisis para determinar la toxicidad del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly

El estudio del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly para determinar la toxicidad general fue realizado de acuerdo con "Las reglas de estimación preclínica de la seguridad de sustancias farmacológicas" (BPL).

La finalidad del estudio es definir las dosis tóxicas tolerables de la preparación, estimar la etapa y el carácter de las alteraciones patológicas en varios órganos y sistemas del organismo e identificar la correlación entre la dosis tóxica y el efecto relacionado y la duración de la aplicación del fármaco.

La determinación de la toxicidad aguda del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly se llevó a cabo según Kerber. La investigación se realizó en 66 ratones blancos macho no consanguíneos que pesaban de 20 a 23 g, que fueron mantenidos bajo el régimen estándar y alimentados con raciones estándar en las condiciones del vivario. Los animales fueron divididos aleatoriamente en 6 grupos iguales, con 11 ratones en cada grupo. Los animales fueron expuestos a una única administración del fármaco intramuscularmente, 0,25 ml en dosis de 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg y 5 mg/kg (varios miles de veces mayores que la dosis terapéutica recomendada para ensayos clínicos). A los animales control se les administró la misma cantidad de cloruro de sodio.

En 72 horas y a los 14 días, no murió ningún animal en ninguno de los grupos. No se registraron alteraciones del estado general, el comportamiento, la actividad locomotora, el integumento del pelo y de la piel ni de los flujos fisiológicos de los animales.

Por tanto, el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly en dosis varios miles de veces mayores que la dosis terapéutica recomendada para ensayos clínicos, no induce reacciones tóxicas agudas, lo cual confirma una amplia aplicabilidad terapéutica de la preparación.

El estudio de la toxicidad subaguda del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly se llevó a cabo en 60 ratas blancas no consanguíneas con un peso corporal de 150 a 250 g. Los animales experimentales fueron expuestos diariamente a una única administración del fármaco intramuscularmente durante 90 días en dosis de 1 \mug/kg, 0,3 mg/kg, 3 mg/kg en 0,5 ml de solución de cloruro de sodio. A los animales de grupo control se les administró la misma cantidad de cloruro de sodio.

En el periodo completo del estudio los animales fueron observados diariamente. Se registró el comportamiento de los animales, su consumo de las raciones de alimento y de agua, el estado del tegumento del pelo y las membranas mucosas. Los animales fueron pesados semanalmente. Antes de la administración del fármaco y los días 30, 60 y 90 de la administración del fármaco, se examinaron la composición morfológica y las propiedades de la sangre periférica. Después de la finalización del experimento, se investigaron los índices bioquímicos y de coagulación de la
sangre.

La toxicidad crónica del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly, obtenido mediante el método reivindicado, fue estudiada mediante su administración de larga duración a ratas con un peso corporal de 150 a 250 g. Los animales fueron expuestos diariamente a una única administración del fármaco intramuscularmente en dosis de 1 \mug/kg, 0,1 mg/kg, 1 mg/kg en 0,5 ml de solución de cloruro de sodio durante 6 meses. Se registró el comportamiento de los animales, el consumo de sus raciones de alimento y de agua, el estado del integumento del pelo y las membranas mucosas. Los animales fueron pesados diariamente durante los 3 primeros meses del experimento y posteriormente una vez al mes. Se realizaron estudios hematológicos y bioquímicos durante 3 meses después del comienzo de la administración del fármaco y a la finalización del experimento. Se determinaron las funciones del sistema cardiovascular, del hígado, del páncreas, de los riñones y de las glándulas adrenales. Después de finalizar la administración del fármaco, algunos animales fueron sometidos a examen patomorfológico con el fin de estimar la condición de varias secciones del cerebro y la médula espinal, del corazón, la aorta, los pulmones, el hígado, los riñones y los órganos de los sistemas endocrino e inmune.

El examen del estado general de los animales, los índices morfológicos y bioquímicos de la sangre periférica, el estado morfológico de los órganos intrínsecos, el estado del sistema cardiovascular y del sistema respiratorio, las funciones hepáticas y renales, no mostraron alteraciones patológicas.

El estudio de toxicidad subaguda y crónica del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly confirma la ausencia de efectos colaterales en el caso de una aplicación del fármaco de larga duración en dosis que eran 100-1000 veces mayores que la dosis terapéutica.

Ejemplo 3 Impacto del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre la tasa de envejecimiento y los procesos de radicales libres en Drosophila melanogaster de la cepa HEM seleccionada por una elevada tasa de mortalidad embrionaria

El tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly fue aplicado a larvas de Drosophila melanogaster de la 2ª edad de la cepa HEM seleccionada por una elevada tasa de envejecimiento (20). La cepa HEM se caracteriza por una dinámica única de mortalidad embrionaria, que consiste en una frecuencia incrementada de desenlaces letales embrionarios tempranos de un 65% en el 1^{er} día de la puesta de huevos hasta un 95% en el 4º día, en una duración media de la vida reducida (29 días) y en una intensidad incrementada de oxidación de peróxidos lipídicos.

El tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly fue añadido en una proporción del 0,00001% del peso del medio de cultivo, que es una dosis extremadamente baja. Las dosis indicadas en la literatura acerca de la influencia de varias sustancias sobre Drosophila melanogaster variaban normalmente del 0,001 al 0,01%. Dosis más bajas no producen normalmente ningún efecto.

Se estudiaron parámetros bioquímicos en moscas de 14 días de edad. Entre ellos se analizaron la actividad catalasa y la intensidad de quimioluminiscencia tisular (21, 22, 23). La catalasa es el enzima básico de la defensa antioxidante. El grado de su actividad sugiere la capacidad del organismo para soportar el estrés oxidativo. La quimioluminiscencia dependiente de luminol, inducida por peróxido de hidrógeno, refleja el estado de las formas activas de oxígeno en los tejidos. Por tanto, una disminución de la intensidad de la quimioluminiscencia indica un incremento de la capacidad del organismo para resistir el estrés oxidativo.

Los resultados obtenidos están mostrados en la Tabla 1. Debido a que se han revelado distinciones significativas entre sexos en los índices estudiados, los datos de las hembras y los machos se presentan separadamente.

Los datos presentados proporcionan pruebas de que el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly estimula un aumento significativo de la actividad catalasa en moscas macho y hembra experimentales en comparación con los controles.

La actividad antioxidación general de los tejidos, caracterizada por el grado de quimioluminiscencia, aumentó bajo la influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly solamente en hembras.

TABLA 1 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre la actividad catalasa y la quimioluminiscencia tisular en Drosophila melanogaster de la cepa HEM

Variante del experimento	Actividad Catalasa	Quimioluminiscencia
	(mmoles H_{2}O_{2}/mg de proteína por minuto)	(unidades conv./mg de proteína)
H
E
M	Control	85,5 \pm 2,78	14,7 \pm 1,44
B	Tetrapéptido	98,8 \pm 1,62*	7,9 \pm 0,91*
R	L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly
A
S
M
A	Control	115,4 \pm 9,88	1,59 \pm 0,121
C	Tetrapéptido	132,3 \pm 3,68*	2,03 \pm 0,182
H	L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly
O
S
* - P < 0,05 en comparación con los índices del control.

\vskip1.000000\baselineskip

La Tabla 2 presenta los resultados del análisis de la duración de la vida en diferentes grupos experimentales.

TABLA 2 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre los parámetros de duración de la vida en Drosophila melanogaster de la cepa HEM

Variante del experimento	ALS	Me	90%	R\cdot10^{-2}	MRDT
	(días)	(días)	(días)	(días^{-1})
H
E
M	Control	38 \pm 1,6	43,5	67	6,7 \pm 0,11	3,4
B	Tetrapéptido	48 \pm 1,5**	48,0	76	4,0 \pm 0,29**	3,9
R	L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly
A
S
M
A	Control	40 + 1,5	43,5	64	5,5 + 0,27	3,6
C	Tetrapéptido	42 + 1,3	38,0	62	4,5 + 0,37*	3,8
H	L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly
O
S
\begin{minipage}[t]{155mm} Nota: ALS - duración media de la vida; Me - mediana de la duración de la vida; 90% - la edad que alcanza el 90% de los individuos; R \cdot 10^{-2} - el parámetro de la ecuación de Gomperz; MRDT - tiempo de duplicación de la tasa de mortalidad. \end{minipage}
* - P < 0,05 en comparación con los índices del control;
** - P < 0,001 en comparación con los índices del control.

Como está demostrado en la Tabla 2, el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly produce un pronunciado efecto gerontoprotector. En hembras, prolonga significativamente la duración media de la vida (P<0,001) y disminuye la tasa de envejecimiento (R) (P<0,001). En machos, disminuye ligeramente la tasa de envejecimiento (P<0,05).

Por tanto, el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly incrementa la duración media de la vida en un 26% y reduce la tasa de envejecimiento real de la población, estimada mediante el valor del parámetro de Gomperz, en un 40%.

Ejemplo 4 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre las funciones reproductoras de Drosophila melanogaster de la cepa HEM, seleccionada por una elevada tasa de mortalidad embrionaria

Se analizó la influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre Drosophila melanogaster en la etapa larvaria de la 2ª-3ª edad, mediante la adición de la preparación al medio de cultivo en una dosis del 0,00001% del peso del medio, que constituye aproximadamente 0,015 mg/100 ml. Las moscas, eclosionadas el 1^{er} día, fueron colocadas en tubos de ensayo, 5 parejas en cada uno, y transferidas a medio fresco cada 3 a 6 días. Se consideraron los factores siguientes:

\bullet: La proporción de tubos de ensayo (con respecto a su cantidad inicial), que contenía hembras vivas (en la Tabla 3 - la proporción de cultivos vivos).

\bullet: La proporción de tubos de ensayo (del número de cultivos vivos), en los que se daba descendencia (en la Tabla 3 - la proporción de cultivos fértiles).

En cada variante experimental se analizaron 75 parejas parentales. Las distinciones entre los índices de fertilidad fueron definidas por el medio del criterio exacto de Fischer para tablas de ajuste de 2 x 2 (24).

Los resultados del experimento están mostrados en la Tabla 3. Para cada variante experimental se presentan las proporciones de cultivos vivos y fértiles. Según se muestra en la Tabla, comenzando a partir del día 19, la proporción de cultivos fértiles procesados con tetrapéptido supera a la proporción análoga del control. Se demuestra que la proporción de cultivo fértil en la variante del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly era notablemente superior (P<0,05) que en los controles a la edad de 32 días.

Los coeficientes de regresión lineal están presentados en la Tabla 4. Según se muestra en la Tabla, los coeficientes de la recta de regresión control difieren significativamente de los de la recta experimental. El coeficiente "a" (que refleja la pendiente de la línea recta) en el control es 1,8 veces mayor que el coeficiente de regresión de la variante experimental.

Por tanto, se demuestra que la proporción de cultivos fértiles en la variante control se reduce dos veces más rápidamente en comparación con la variante del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly. La duración del periodo reproductor ascendía a 30 días para los cultivos no expuestos al tetrapéptido y a 47 días para los cultivos expuestos al tetrapéptido. Se muestra que el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly prolonga el periodo de reproducción 1,5 veces.

Los datos obtenidos sobre la duración de la vida fueron analizados en la misma medida. Los datos sobre el análisis de regresión están mostrados en la Tabla 5.

Según se deduce de la Tabla, la proporción de cultivos vivos (esto es, los cultivos en los que están presentes hembras vivas) disminuye de media 1,5 veces más deprisa que en los controles. La mediana calculada de la duración de la vida (esto es, la edad a la cual muere el 50% de los individuos) y la que se alcanza realmente (esto es, la duración máxima de la vida en diferentes variantes del experimento) están mostradas en la Tabla 6.

Según se demuestra en la Tabla, además de un incremento de la mediana de la duración de la vida, en la variante procesada con el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly, se alcanzó un aumento máximo récord de la duración de la vida (en las cepas de Drosophila melanogaster con una elevada tasa de envejecimiento) - 100 días.

TABLA 3 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre la dinámica de la proporción de cultivos vivos y fértiles en Drosophila melanogaster de la cepa HEM

	Control	Tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly
Días	Proporción de cultivos
	Vivos	Fértiles	Vivos	Fértiles
0	100-0,8	100-0,8	100-0,8	100 + 0,8
6	100-0,8	100-0,8	100-0,8	100 + 0,8
10	100-0,8	86 \pm 9,3	100-0,8	93 \pm 6,9
13	100-0,8	79 \pm 11,0	100-0,8	93 \pm 6,9

TABLA 3 (continuación)

	Control	Tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly
Días	Proporción de cultivos
	Vivos	Fértiles	Vivos	Fértiles
19	100-0,8	50 \pm 13,4	100-0,8	86 \pm 9,4*
23	100-0,8	29 \pm 12,1	100-0,8	43 \pm 13,2
27	93 \pm 6,9	15 \pm 10,0	93 \pm 6,9	31 \pm 12,9
32	93 \pm 6,9	0 + 0,8	85 \pm 10,0	36 \pm 14,5**
38	93 \pm 6,9	0 + 0,8	85 \pm 10,0	9 \pm 8,7
44	71 \pm 12,0	0 + 0,8	85 \pm 10,0	9 \pm 8,7
50	7 + 6,9	0 + 0,8	36 \pm 12,8	9 \pm 8,7
54	7 + 6,9	0 + 0,8	36 \pm 12,8	0 + 0,9
60	7 + 6,9	0 + 0,8	29 \pm 12,1	0 + 0,9
66	7 + 6,9	0 + 0,8	29 \pm 12,1	0 + 0,9
69	7 + 6,9	0 + 0,8	21 \pm 10,9	0 + 0,9
73	7 + 6,9	0 + 0,8	7 \pm 6,9	0 + 0,9
76	0 + 0,8	0 + 0,8	7 \pm 6,9	0 + 0,9
84	0 + 0,8	0 + 0,8	7 \pm 6,9	0 + 0,9
87	0 + 0,8	0 + 0,8	7 \pm 6,9	0 + 0,9
100	0 + 0,8	0 + 0,8	0 + 0,8	0 + 0,9
* - P < 0,06 en comparación con los índices del control;
** - P < 0,05 en comparación con los índices del control.

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TABLA 4 Coeficientes de regresión lineal para la dependencia de la edad de la proporción de cultivos fértiles (y = B + A_{x})

Coeficientes	Control	Tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly
B	133 \pm 4,2	115 \pm 11,4
A	-4,4 \pm 0,22	-2,5 \pm 0,37*
* - P < 0,001 en comparación con los índices del control.

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TABLA 5 Coeficientes de regresión lineal para la dependencia de la edad de la proporción de cultivos vivos (y = B + A_{x})

Coeficientes	Control	Tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly
B	160 \pm 22,8	137 \pm 10,6
A	-2,4 \pm 0,43	-1,6 \pm 0,17*
* - P < 0,001 en comparación con los índices del control.

TABLA 6 Parámetros de la duración de la vida en diferentes variantes experimentales (días)

Índices	Control	Tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly
Duración media de la vida	46	54
Mediana de la duración de la vida	75	100

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Ejemplo 5 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre la tasa de envejecimiento y sobre los procesos de radicales libres en Drosophila melanogaster de la cepa de baja actividad (LA) seleccionada por una baja actividad sexual de los machos

Se estudiaron el efecto del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre la actividad catalasa, el contenido de productos procedentes de la oxidación de peróxidos lipídicos (LPO), la duración de la vida y la tasa de envejecimiento en Drosophila melanogaster de la cepa LA.

Moscas de un día de edad fueron colocadas en tubos de ensayo, 10 individuos del mismo sexo en cada uno. Cada 2 días fueron transferidas a un medio fresco teniendo en consideración el número de individuos muertos. Se determinaron la duración media y la duración máxima de la vida. La tasa de envejecimiento fue calculada utilizando los parámetros de la ecuación de Gomperz.

El tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly fue aplicado a larvas de la 3ª edad a una dosis de 0,00001% del peso del medio de cultivo, que constituía aproximadamente 0,015 mg/100 ml. La actividad catalasa fue calculada mediante métodos aceptados de manera general en los homogenados de moscas adultas de 14 días de edad. El experimento se llevó a cabo con una repetición posterior.

Los análisis de regresión y de dispersión sirvieron como técnica básica del procesamiento estadístico. La autenticidad de las diferencias fue confirmada mediante el método de la diversidad relevante mínima.

Se encontró que el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly en hembras no inducía ninguna alteración de la duración media de la vida, pero incrementaba la duración máxima de la vida (LS_{máx}). Al mismo tiempo, la sustancia prolongaba significativamente la ALS en machos. El análisis de las curvas de la tasa de supervivencia y de las gráficas de Gomperz mostró que el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly en hembras servía como gerontoprotector del 1^{er} tipo (ALS y LS_{máx} incrementaron, aunque la tasa de envejecimiento no cambió en comparación con el control). En los machos, sin embargo, actuó como gerontoprotector del 3^{er} tipo (la ALS incrementó, la LS_{máx} no cambió, además de lo cual se observó una tendencia a aumentar la tasa de envejecimiento). Al mismo tiempo, el análisis de la tasa de supervivencia de las moscas sin tener en consideración sus distinciones entre sexos, mostró que la LS_{máx} se prolongaba notablemente bajo la influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly.

La aplicación del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly a machos incrementaba significativamente la actividad catalasa, mientras que en las hembras el contenido de los productos de LPO disminuyó considerablemente. La supresión de las distinciones entre sexos confirmó una elevada actividad antioxidación del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly.

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TABLA 7 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre los parámetros de duración de la vida en hembras de Drosophila melanogaster de la cepa LA

Variante del	ALS	Me	LS_{máx}	LnR_{0}	G 10^{2}	MRDT
Experimento	(días)	(días)		(días^{-1})	(días^{-1})
Control	22 \pm 1,0	28,5	36 \pm 1,9	-4,322 \pm 0,4334	6,7 \pm 1,78	3,4
Tetrapéptido
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	20 \pm 1,3	17	44 \pm 1,9*	-3,806 \pm 0,2580	4,3 \pm 0,90	3,8
Nota: LS_{máx} - duración máxima de la vida; LnR_{0} y G 10^{2} - los parámetros de la ecuación de Gomperz.
* - P < 0,05 en comparación con los índices del control.

TABLA 8 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre los parámetros de duración de la vida en machos de Drosophila melanogaster de la cepa LA

Variante del	ALS	Me	LS_{máx}	LnR_{0}	G 10^{2}	MRDT
Experimento	(días)	(días)		(días^{-1})	(días^{-1})
Control	19 \pm 1,2	28,5	31 \pm 0,9	-4,579 \pm 0,840	7,5 \pm 4,62	3,3
Tetrapéptido
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	24 \pm 0,96*	28,5	33 \pm 0,9	-5,496 \pm 0,711	10,9 \pm 3,45	2,9
* - P < 0,01 en comparación con los índices del control.

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La aplicación del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly en moscas presentó el efecto de inhibición del envejecimiento.

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TABLA 9 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre los índices bioquímicos de procesos de radicales libres en Drosophila melanogaster de la cepa LA

Variante del experimento	Actividad específica de catalasa	Contenido de hidroperóxidos conjugados
	(\mumoles de H_{2}O_{2}/mg de	(nmoles/g de tejido)
	proteína por minuto)
Control (hembras)	43,31	1,469
Control (machos)	49,27	1,247
Tetrapéptido
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	42,57	1,290*
(hembras)
Tetrapéptido
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	57,44*	1,202
(machos)
* - P < 0,05 en comparación con los índices del control.

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Ejemplo 6 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre la tasa de envejecimiento y sobre los procesos de radicales libres en Drosophila melanogaster de la cepa de adaptación al entorno (EA) seleccionada por una baja adaptabilidad al entorno

Drosophila melanogaster de la cepa EA sirvió como modelo para estudiar la influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre la actividad catalasa, la quimioluminiscencia tisular y la duración de la vida.

Moscas de un día de edad fueron colocadas en tubos de ensayo, 10 individuos del mismo sexo en cada uno. Cada 5 a 7 días fueron transferidas a un medio nuevo, teniendo en cuenta el número de individuos muertos. Se definieron la duración media y la duración máxima de la vida. La tasa de envejecimiento fue calculada mediante los parámetros de la ecuación de Gomperz.

El tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly fue aplicado en las larvas de la 3ª edad en una dosis del 0,00001% del peso del medio de cultivo, que constituía aproximadamente 0,015 mg/100 ml. Se calculó la actividad catalasa y la intensidad de la quimioluminiscencia en homogenados de moscas adultas de 7 días de edad mediante métodos aceptados de manera general. El experimento fue llevado a cabo con una repetición posterior.

Los análisis de regresión y dispersión sirvieron como técnica básica del procesamiento estadístico. La autenticidad de las diferencias fue confirmada mediante el método de la diversidad relevante mínima.

Los resultados del experimento están mostrados en las Tabla 10-13.

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TABLA 10 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre los parámetros de duración de la vida en hembras de Drosophila melanogaster de la cepa EA (Experimento 1)

Variante	n	ALS	LS_{máx}	LnR_{0}	G 10^{2}
		(días)	(días)	(días^{-1})	(días^{-1})
Control	84	10,5 \pm 0,76	26	-2,6 \pm 0,18	7,7 \pm 1,57
Tetrapéptido
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	72	16,4 \pm 1,68**	39	-3,1 \pm 0,21	3,6 \pm 0,61*
* - P < 0,05 en comparación con los índices del control;
** - P < 0,01 en comparación con los índices del control.

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Se encontró que el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly produce un efecto sobre la quimioluminiscencia dependiente de luminol (Tabla 14). La reducción de este índice indica la activación del sistema de defensa antioxidación en las moscas. El incremento de la intensidad de la defensa antioxidación en los tejidos está presumiblemente asociado en este caso con la activación de antioxidantes endógenos de bajo peso molecular tales como glutation, tocoferol y similares.

Se observó una prolongación de la duración media y máxima de la vida solamente en casos de viabilidad disminuida y de envejecimiento acelerado en el control. Según muestran los datos presentados, está muy claro que el tetrapéptido investigado ejerce un efecto gerontoprotector preciso.

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TABLA 11 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre los parámetros de duración de la vida en machos de Drosophila melanogaster de la cepa EA (Experimento 1)

Variante	n	ALS	LS_{máx}	R_{0}	G 10^{2}
		(días)	(días)	(días^{-1})	(días^{-1})
Control	80	14,2 \pm 1,31	39	-4,9 \pm 0,44	9,2 \pm 1,97
Tetrapéptido
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	100	10,8 \pm 1,09	39	-2,3 \pm 0,26	3,3 \pm 2,25

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 12 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre los parámetros de duración de la vida en hembras de Drosophila melanogaster de la cepa EA (Experimento 2)

Variante	n	ALS	LS_{máx}	R_{0}	G 10^{2}
		(días)	(días)	(días^{-1})	(días^{-1})
Control	132	18,4 \pm 0,62	41	-4,7 \pm 0,37	14,5 \pm 2,26
Tetrapéptido
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	115	16,7 \pm 0,70	41	-3,6 \pm 0,41	4,2 \pm 1,68

TABLA 13 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre los parámetros de duración de la vida en machos de Drosophila melanogaster de la cepa EA (Experimento 2)

Variante	n	ALS	LS_{máx}	R_{0}	G 10^{2}
		(días)	(días)	(días^{-1})	(días^{-1})
Control	150	19,4 \pm 1,20	45	-4,2 \pm 0,15	7,6 \pm 0,58
Tetrapéptido
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	120	17,4 \pm 0,88	45	-3,0 \pm 0,28	4,7 \pm 0,94*
* - P < 0,01 en comparación con los índices del control.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 14 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre los índices bioquímicos de procesos de radicales libres en Drosophila melanogaster de la cepa EA

Variante del experimento	Actividad específica de catalasa	Intensidad de quimioluminiscencia
	(\mumoles de H_{2}O_{2}/mg de proteína	(unidades conv./mg de proteína
	por minuto)	por minuto)
Control (hembras)	83,65 \pm 1,355	4,04 \pm 0,135
Control (machos)	102,10 \pm 2,095	8,16 \pm 0,090
Tetrapéptido
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	82,78 \pm 2,957	4,61 \pm 0,395
(hembras)
Tetrapéptido
L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	100,39 \pm 3,807	4,93 \pm 0,109*
(machos)
* - P < 0,05 en comparación con los índices del control.

Ejemplo 7 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre la duración de la vida de Drosophila melanogaster de la cepa "salvaje" Canton-S

En este experimento, se emplearon Drosophila melanogaster de la cepa "salvaje" Canton-S.

El tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly en forma de solución fue introducido en el medio de cultivo proporcionado para el crecimiento de los insectos, que había sido enfriado hasta 50-60ºC con una cuidadosa agitación posterior, y depositado en tubos de ensayo.

Con el fin de hacer que las condiciones de desarrollo de la población control y de la población experimental fueran idénticas, una cantidad de cloruro de sodio igual a la utilizada para la solución del tetrapéptido L-Ala-L-
Glu-L-Asp-Gly fue introducida en el medio de cultivo del control. La concentración de todas las sustancias emplea-
das fue calculada por la proporción respecto a la masa del medio de cultivo proporcionado para la repro-
ducción.

Moscas hembra de 4 días de edad fueron sometidas a apareamiento seleccionado aleatoriamente con machos durante 72 horas, una pareja en cada tubo de ensayo, después de lo cual las parejas parentales fueron retiradas de los tubos de ensayo. Para formar cada nueva generación, se utilizó la descendencia de 50 a 80 parejas.

Se investigó la duración de la vida (LS) en poblaciones de laboratorio, constando cada una de ellas de 90 individuos de cada sexo. Inmediatamente después de la eclosión de los huevos, las moscas fueron colocadas aleatoriamente en tubos de ensayo, 10 individuos en cada uno. La sustitución del medio de cultivo se llevó a cabo 3 veces a la
semana.

Los valores medios (ALS) y los errores estándar calculados mediante el método tradicional fueron aplicados como parámetros de distribución de la duración de la vida. Los valores medios fueron comparados unos con otros utilizando el Test t de Student.

La Tabla 15 muestra los resultados de las características de la distribución de la duración de la vida (valores medios y errores estándar de estos valores medios) para todos los grupos experimentales y el control.

Para el estudio experimental, se seleccionaron 6 concentraciones del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly: 0,01x, 0,1x, 1x, 5x, 7,5x y 12,5 x 10^{-6}% del peso del medio de cultivo.

El tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly administrado a machos a las 4 concentraciones más bajas (0,01x a 5 x 10^{-6}%) ejercía un efecto gerontoprotector significativo: la ALS en los grupos experimentales mostraba un aumento estadísticamente relevante. La prolongación relativa de la ALS de los machos fue del 3,3 al 10,8%.

En los experimentos realizados en hembras, el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly ejercía un efecto gerontoprotector solamente a las concentraciones de 0,01x y 0,1x 10^{-6}%, con un incremento significativo de la ALS correspondiente al 13,4% (P<0,004) y al 11,8% (P<0,03).

La eficacia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly aplicado en concentraciones superbajas, según se muestra por los datos obtenidos, no tiene precedentes. Debe señalarse que la aplicación del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly en Drosophila melanogaster no alteró la duración de sus etapas de desarrollo, lo cual, en general, reflejaba la ausencia de un efecto genotóxico producido por la sustancia estudiada.

TABLA 15 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre los parámetros de duración de la vida en Drosophila melanogaster de la cepa "salvaje" Canton-S

1. Machos
Nº	Sustancia	Concentración	ALS \pm	Alteraciones	t-Student
	administrada	x10^{-6}%	errores	de la ALS %	P <
			estadísticos
1.	Control		32,55 \pm 1,14
2.	L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	0,01	36,47 \pm 1,09	+ 12,0	0,02
3.	Control		31,44 \pm 1,35
4.	L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	0,1	34,85 \pm 1,18	+ 10,8	0,05
5.	Control		32,45 \pm 1,41
6.	L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	1,0	36,77 \pm 1,44	+ 13,3	0,04
7.	Control		33,90 \pm 1,14
8.	L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	5,0	37,74 \pm 1,16	+ 11,3	0,02
9.	Control		39,99 \pm 0,97		Estadís. no
10.	L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	7,5	39,98 \pm 0,99	-0,03	significat.
11.	Control		37,32 \pm 0,83
12.	L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	12,5	33,96 \pm 1,01	-9,0	0,02

2. Hembras
Nº	Sustancia	Concentración	ALS \pm	Alteraciones	t-Student
	administrada	x10^{-6}%	errores	de la ALS %	P <
			estadísticos
13.	Control		31,22 \pm 0,91
14.	L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	0,01	35,41 \pm 1,07	+ 13,4	0,004
15.	Control		31,22 \pm 0,91
16.	L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	0,1	35,41 \pm 1,07	+ 11,8	0,03

(Continuación)

Nº	Sustancia	Concentración	ALS \pm	Alteraciones	t-Student
	administrada	x10^{-6}%	errores	de la ALS %	P <
			estadísticos
17.	Control		36,17 \pm 1,23		Estadís. no
18.	L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	1,0	35,76 \pm 1,35	-1,1	significat.
19.	Control		36,87 \pm 1,40		Estadís. no
20.	L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	5,0	38,04 \pm 1,56	+ 3,2	significat.
21.	Control		33,74 \pm 1,23		Estadís. no
22.	L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	7,5	31,16 \pm 1,21	-7,6	significat.
23.	Control		35,09 \pm 1,36		Estadís. no
24.	L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly	12,5	37,06 \pm 1,12	+ 5,6	significat.

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Ejemplo 8 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre la síntesis extrapineal de melatonina en ratas tras epifisectomía

La investigación se llevó a cabo en ratas Wistar macho que pesaban 130-140 g. El número total de animales (23) fue dividido en 5 grupos. El 1^{er} grupo (control) incluía animales intactos. Los animales de los grupos 2-5 fueron sometidos a epifisectomía (EE). Tres semanas después de la cirugía (en el día 21) los animales del 2º y del 3^{er} grupo fueron inyectados subcutáneamente con cloruro de sodio a una dosis de 0,5 ml durante los 10 días siguientes. A los animales de los grupos 4 y 5 se les administró el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly a una dosis de 0,5 \mug según el mismo esquema.

El sacrificio de los animales y el aislamiento de sus órganos se llevaron a cabo durante el día desde las 10 a.m. hasta las 12 del mediodía con la utilización de anestesia por Nembutal (50 mg/kg). Los animales de los grupos 1, 2 y 4 fueron sacrificados a los 3 días después de la última administración del fármaco (el día 33 después de la operación y del comienzo del experimento), mientras que los animales de los grupos 3 y 5 fueron sacrificados a los 12 días (el día 42 después de la epifisectomía). Se examinaron los órganos principales del sistema neuroendocrino difuso (DNES): estómago, glándula tiroides y páncreas.

La cirugía - epifisectomía - fue realizada bajo anestesia etérea según la técnica elaborada. Se realizó una incisión de 1-1,5 cm de longitud a lo largo de la línea central de la cabeza. Después de descubrir el casquete del cráneo, se taladró una abertura sobre el punto de confluencia del seno por medio de un taladro hueco de 0,5 cm de diámetro, que fue fabricado especialmente para el experimento a partir de un tubo metálico. La epífisis fue extraída por medio de pinzas oftálmicas a través de la abertura del cráneo. La abertura de la trepanación fue cubierta con un fragmento óseo. La incisión de la piel fue suturada con hilo de seda.

Fragmentos de los órganos extraídos fueron fijados durante 24 horas en líquido de Bouin ácido para examen en el microscopio óptico y según Karnovsky para microscopía electrónica. La deshidratación de los especímenes y la inclusión en parafina para microscopía óptica, así como la mezcla expone para el examen ultraestructural, se realizaron de acuerdo con técnicas aceptadas de manera general. Secciones de parafina (7 \mum) fueron colocadas en un portaobjetos del microscopio cubierto con una película de poli-L-lisina (Sigma). Secciones ultrafinas
(100 nm) preparadas con un microtomo LKB-7A (LKB) fueron teñidas con acetato de uranilo y citrato de
plomo.

Los exámenes histológicos e inmunohistoquímicos se llevaron a cabo utilizando un microscopio Jenamed-2 (Zeiss). El examen de microscopía electrónica se realizó utilizando un microscopio electrónico JEM-100S (JEOL).

Para la tinción se aplicó hematoxilina-eosina. La población total de APUD-citos de las secciones pilórica y fúndica del estómago fue demostrada de acuerdo con el método histoquímico de tinción con plata de Grimelius (25).

La detección inmunohistoquímica de células enterocromafines (células EC) se realizó mediante la aplicación de anticuerpos monoclonales de ratón contra serotonina (Dako, título 1:15). Los anticuerpos monoclonales fueron identificados según el método de la avidina-biotina-peroxidasa (ABP) (kit de Vectastaína) con el fin de detectar las inmunoglobulinas séricas de ratón.

Los estudios cuantitativos se llevaron a cabo por medio de un sistema de análisis por ordenador de impresiones microscópicas (Imstar) con la utilización de los programas de ordenador autorizados aplicados Morphostar y Colquant (Imstar), de acuerdo con los principios básicos de estereología y morfometría (26).

Se calculó la densidad cuantitativa de las células enteroendocrinas (END) (N_{END}/1 mm^{2}) y de las células positivas para serotonina (N_{ser}/1 mm^{2}) en 10 campos visuales. El área de ensayo (S) era de 5 mm^{2}.

Para el procesamiento estadístico de los datos obtenidos, se aplicó el criterio no paramétrico de la U de Mann/Whit-
ney.

Los resultados de los estudios de morfología funcional de DNES realizados en ratas epifisectomizadas con la aplicación del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly, mostraron que el tetrapéptido estimulaba el metabolismo tisular y celular.

Se encontró que la administración del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly ejercía un efecto compensatorio sobre la organización estructural y funcional de las células del DNES en los animales expuestos a epifisectomía. Su efecto se manifestó 3 días después de la finalización de la administración del tetrapéptido a través de la supresión completa del impacto de la epifisectomía y se mantuvo durante 12 días, esto es, hasta la finalización del experimento, con respecto a todos los órganos examinados.

Los datos confirman que el punto principal de la aplicación del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly son las células EC gástricas, en las cuales el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly estimula la síntesis extrapineal de serotonina y melatonina (Tabla 16), proporcionando de este modo, en esencia, una compensación completa de la epífisis extraída.

Por tanto, los resultados de la investigación experimental demostraron que el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly no presentaba toxicidad, normalizaba los índices de defensa antioxidación y regulaba procesos metabólicos en las estructuras productoras de melatonina de varios tejidos.

TABLA 16 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre las características cuantitativas de los parámetros examinados en varias secciones del estómago de ratas epifisectomizadas

Grupo de animales	N_{END}/1 mm^{2}	N_{ser}/1 mm^{2}
	Sec. Pilórica	Sec. del Fundus	Sec. Pilórica
Animales intactos	20 \pm 1	48 \pm 5	26 \pm 2
Control
(animales epifisectomizados + solución de cloruro de sodio)
El 3^{er} día después de la finalización de la administración	30 \pm 1*	76 \pm 1*	32 \pm 3*
del fármaco
Control
(animales epifisectomizados + solución de cloruro de sodio)
El 12º día después de la finalización de la administración	15 \pm 1*	41 \pm 4	19 \pm 1*
del fármaco
Control
(animales epifisectomizados + L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly)
El 3^{er} día después de la finalización de la administración	21 \pm 1**	64 \pm 5**	26 \pm 2**
del fármaco
Control
(animales epifisectomizados + L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly)
El 12º día después de la finalización de la administración	19 \pm 1**	47 \pm 9	26 \pm 3**
del fármaco
* - P < 0,05 en comparación con los índices de los animales intactos;
** - P < 0,05 en comparación con los índices del control.
\begin{minipage}[t]{155mm} Nota: N_{END}/1 mm^{2} - densidad de células enteroendocrinas; N_{ser}/1 mm^{2} - densidad de células positivas para serotonina. \end{minipage}

Las propiedades del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly reveladas en el experimento preclínico demuestran su aplicación profiláctica y/o terapéutica manifestaba como sustancia gerontoprotectora.

Ejemplos de los resultados recibidos en los ensayos clínicos del tetrapéptido propuesto demuestran sus propiedades farmacológicas y confirman que la invención puede ser integrada en la práctica médica.

Ejemplo 9 Eficacia de la aplicación de la sustancia farmacológica que contiene el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly para prevenir el envejecimiento prematuro en pacientes con alteraciones del sistema de defensa antioxidación

La sustancia farmacológica estudiada fue administrada a 14 pacientes (de 34 a 69 años de edad) con patología relacionada con la edad (enfermedad hipertensiva, enfermedad isquémica cardíaca, gastritis crónica, diabetes mellitus no dependiente de insulina) y con una reducción de los índices de defensa antioxidación en sangre.

La sustancia que contenía el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly fue administrada intramuscularmente en forma de una solución para inyección en una única dosis diaria de 10 \mug por inyección durante 10 días.

En los casos de aplicación del fármaco, se observaron un aumento significativo de la actividad superóxido dismutasa y una disminución del contenido de productos procedentes de la oxidación de peróxidos lipídicos (Tabla 17).

TABLA 17 Influencia del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly sobre los índices sanguíneos de defensa antioxidación en patologías relacionadas con la edad

Índice	Antes del tratamiento	Después del tratamiento
Actividad superóxido dismutasa, unidades conv./mg de proteína	0,26	0,61*
Productos procedentes de la oxidación espontánea de peróxidos
lipídicos, \muM/l:
\hskip0,5cm - hidroperóxidos conjugados;	7,3 \pm 0,6	2,5 \pm 0,2*
\hskip0,5cm - bases de Schiff	4,6 \pm 0,3	2,9 \pm 0,2*
* - P < 0,05 en comparación con los índices pretratamiento.

Los resultados de la terapia demuestran el efecto restaurador sobre el sistema de defensa antioxidación del organismo de la sustancia farmacológica que contiene el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly.

Ejemplo 10 Eficacia de la sustancia farmacológica que contiene el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly aplicada para la prevención del envejecimiento prematuro en pacientes con alteraciones de la síntesis de melatonina

La sustancia farmacológica fue administrada a 11 pacientes con una edad de 39 a 63 años que padecían asma bronquial por aspirina. La característica principal de esta enfermedad consiste en la asociación de episodios de asfixia con intolerancia al ácido acetilsalicílico y a otras sustancias antiinflamatorias no esteroideas. Se sabe que la N-acetil-5-metoxiquinurenamina (N-AMK), un análogo del ácido acetilsalicílico en su estructura química, se forma en el organismo a través del metabolismo de la melatonina, una hormona epifisaria. La síntesis de melatonina y, por consiguiente, el nivel de N-AMK endógena están significativamente disminuidos en pacientes con asma bronquial por aspirina, lo cual se confirma por la baja excreción urinaria de 6-sulfatoximelatonina, el metabolito básico de la melatonina.

Esto justificaba un nuevo abordaje patogénico del tratamiento del asma bronquial por aspirina por medio de la corrección del nivel de melatonina en el organismo con la sustancia farmacológica que contiene el tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly.

La sustancia fue administrada intramuscularmente en forma de una solución para inyección diariamente por la mañana a una dosis de 10 \mug durante 10 días.

Los pacientes fueron tratados durante la fase de atenuación del empeoramiento o de remisión de la enfermedad junto con una terapia antiasmática permanente, que incluía glucocorticoides por inhalación y orales.

Antes del tratamiento, durante el mismo y posteriormente una vez al mes, los pacientes estimaron subjetivamente su estado de salud según síntomas tales como tos, eliminación de esputos, dificultad para respirar, congestión del pecho, sibilancias, ataques de asfixia e intolerancia a la actividad física, frío y olores. El efecto clínico producido por la preparación fue estimado inmediatamente después del tratamiento y en los 7 meses siguientes sobre la base de los análisis informados por los pacientes, que incluían los datos sobre la dinámica de su estado de salud, la capacidad de trabajo, la condición psicológica, alteraciones del sueño y las dosis diarias de los fármacos antiasmáticos tomados.

Antes del comienzo del tratamiento e inmediatamente después de la administración de la última dosis del fármaco, se estimó la función respiratoria externa de todos los pacientes con referencia a los parámetros siguientes: capacidad respiratoria vital (VBC), volumen total de la respiración (TV), capacidad pulmonar total (TLC), capacidad respiratoria vital forzada (FVBC), tasa de exhalación volumétrica máxima (MVexhR), tasa de exhalación volumétrica máxima para el 50% y el 75% de la VBC forzada (VBC_{50} y VBC_{75}), volumen de exhalación forzada por segundo (FEV_{1}). Estos parámetros fueron medidos como porcentaje de los valores iniciales. Adicionalmente, se midió la conducción específica del árbol bronquial en cm de una columna de agua. El complejo total de análisis se repitió 15 minutos después de una inhalación de Berotek. La dinámica de MVR, VBC_{50} y VBC_{75} después de la inhalación de Berotek fue calculada como porcentaje de los valores iniciales. El índice FEV_{1} en todos los pacientes antes del tratamiento era inferior al 80% del valor debido.

El contenido de 6-sulfatoximelatonina, el metabolito básico de la melatonina, fue medido antes, inmediatamente después y a los 10 días después del tratamiento en la orina recogida durante el día (desde las 9 a.m. hasta las 21 p.m.) y por la noche (desde las 21 p.m. hasta las 9 a.m.), de acuerdo con el Método Immunofermental por medio de kits "DRG Instrument GmbH" (Marburg, Alemania).

Los resultados de las investigaciones confirmaron que se observó una mejora del estado clínico al final del tratamiento en la inmensa mayoría de los pacientes tratados con la sustancia farmacológica estudiada. Se registró una frecuencia reducida de los síntomas de asma durante el día, una intolerancia disminuida al trabajo físico, a olores fuertes y al aire frío, así como una recuperación del sueño. El examen objetivo de los pacientes reveló una disminución, o una desaparición absoluta, de las sibilancias de los pulmones - los síntomas de obstrucción bronquial. El examen de la función respiratoria externa inmediatamente después de la finalización del tratamiento no reveló ninguna alteración esencial de VBC, MVexhR, FEV_{1}, TV/TLC. Sin embargo, los pacientes que fueron expuestos a la sustancia farmacológica que contenía el tetrapéptido mostraron una mejora de la reacción a Berotek a nivel de los bronquios distales. La excreción de 6-sulfametoximelatonina en orina aumentó, indicando un incremento de la producción de melatonina no sólo por la noche sino también durante el día.

Referencias

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Claims

1. Un tetrapéptido L-alanil-L-glutamil-L-aspartil-glicina de fórmula general L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly.

2. Un tetrapéptido L-alanil-L-glutamil-L-aspartil-glicina de fórmula general L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly, para ser utilizado como sustancia productora de un efecto gerontoprotector.

3. Una composición que contiene una base activa y un vehículo farmacológicamente aceptable, en la cual la base activa comprende una cantidad eficaz del tetrapéptido L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly o de una sal del mismo.

4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la sal es una sal del grupo amino.

5. Una composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la sal es seleccionada del grupo que consta de acetato, clorhidrato y oxalato.

6. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la sal es una sal del grupo carboxilo.

7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la sal es seleccionada del grupo que consta de sodio, potasio, calcio, litio, zinc, magnesio, amonio y trietilamonio.

8. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, presentada en una forma adecuada para administración parenteral.

9. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, presentada en una forma adecuada para administración intranasal.

10. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, presentada en una forma adecuada para administración oral.

11. Utilización de un tetrapéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2, o de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10 para preparar un medicamento.

12. Utilización de un tetrapéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2, o de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en la fabricación de un medicamento para la prevención del envejecimiento prematuro.

13. Utilización de acuerdo con la reivindicación 12, en la que dicha prevención comprende el incremento de la actividad superóxido dismutasa, la disminución de productos procedentes de la oxidación de peróxidos lipídicos y el incremento de la producción de melatonina.

14. Utilización de un tetrapéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2, o de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del asma bronquial producido por aspirina.

15. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en la que la composición comprende una sal del tetrapéptido y la sal es una sal del grupo amino.

16. Utilización de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la sal es seleccionada del grupo que consta de acetato, clorhidrato y oxalato.

17. Utilización de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la sal es una sal del grupo carboxilo.

18. Utilización de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la sal es seleccionada del grupo que consta de sodio, potasio, calcio, litio, zinc, magnesio, amonio y trietilamonio.

19. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, presentada en una forma adecuada para aplicación local.