ES2258174T3

ES2258174T3 - Compuestos esteroideos para la inhibicion de la sulfatasa esteroidea.

Info

Publication number: ES2258174T3
Application number: ES02801418T
Authority: ES
Inventors: Barry V. L. Sterix Limited POTTER; Michael J. Sterix Limited REED; Lok Wai L. Sterix Limited WOO
Original assignee: Sterix Ltd
Current assignee: Sterix Ltd
Priority date: 2001-10-18
Filing date: 2002-10-17
Publication date: 2006-08-16
Anticipated expiration: 2022-10-17
Also published as: CA2463227A1; ATE408615T1; US7276513B2; US8124614B2; DK1448592T3; EP1657247B1; CA2463227C; HK1084955A1; US20080312266A1; DE60229009D1; ES2314760T3; EP1657247A1; US20050014776A1; US20070105886A1; US7098218B2

Abstract

Compuesto de Fórmula XII: (Ver fórmula) en la que R1 es un grupo sulfamato de fórmula (R4)(R5)NSO2-O-; R4 y R5 se seleccionan independientemente de entre hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alquenilo y arilo o combinaciones de éstos, o que representan conjuntamente alquileno, en la que el o cada alquilo o cicloalquilo o alquenilo contienen opcionalmente uno o más heteroátomos o grupos; G es H o un sustituyente seleccionado de entre OH o un grupo hidrocarbilo; en la que el sistema de anillo está opcionalmente sustituido presión con uno o más sustituyentes seleccionados de entre hidrógeno, alquilo, alcoxi, alquinilo y halógeno.

Description

Compuestos esteroideos para la inhibición de la sulfatasa esteroidea.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un compuesto. En particular la presente invención proporciona compuestos capaces de inhibir la sulfatasa esteroidea.

Antecedentes de la invención

El cáncer de mama es una enfermedad devastadora que continúa siendo una causa principal de muerte de mujeres en la mayoría de los países occidentales. Se estima que afecta aproximadamente a 1 millón de mujeres al año en todo el mundo.^{1}

Gran Bretaña presenta uno de los índices de mortalidad más elevados de cáncer de mama en el mundo con más de 35.000 mujeres diagnosticadas cada año que representan aproximadamente uno de cada cinco de todos los casos de cáncer. Se estima que 1 de cada 10 mujeres que vía hasta la edad de 85 años en Gran Bretaña desarrollará cáncer de mama durante el transcurso de su vida. Aunque los métodos modernos de tratamiento así como la detección precoz de la enfermedad han mejorado en gran medida las tasas de supervivencia, el cáncer de mama continúa siendo la causa principal de muerte en las mujeres de edades comprendidas entre 35 y 54 años.^{2}

Todas las mujeres están en riesgo de padecer cáncer de mama aunque se han identificado numerosos factores de riesgo, estando relacionados la mayoría de ellos con los antecedentes hormonales y reproductores de las mujeres así como sus antecedentes familiares de la enfermedad. Las mujeres con mayor riesgo son generalmente aquellas que presentan antecedentes familiares acusados de la enfermedad, comienzo precoz de menarquía, comienzo tardío de la menopausia o un primer embarazo completo después de la edad de 30 años.^{2}

En las etapas iniciales del cáncer de mama, la cirugía parece ser el tratamiento de elección. En la mayoría de los casos, las técnicas quirúrgicas que conservan el pecho, tal como una incisión local del bulto o bultos en el/los pecho(s), están implicadas en lugar de la masectomía. Para impedir cualquier recaída de la enfermedad, se prescribe con frecuencia la radioterapia, particularmente si las técnicas que conservan los pechos han estado implicadas.^{3} Se utiliza también para reducir los tumores grandes a un tamaño susceptible de operación de modo que pueda realizarse la cirugía de conservación.^{4}

Para los cánceres de mama avanzados, cuando el tumor se ha extendido o recaído, el objetivo del tratamiento no es ya curar sino alcanzar el control paliativo. Este es el caso cuando las metástasis del tumor han alcanzado posiciones tales como los huesos, la piel, la linfa, los ganglios o el cerebro. El tratamiento varía dependiendo del estado hormonal del paciente (si es una mujer antes o después de la menopausia la que debe tratarse) y dependiendo del tipo de tumor. De hecho se ha demostrado que determinados tumores están relacionados con estrógenos en su crecimiento y desarrollo, conduciendo a lo que se denomina un cáncer de mama dependiente de hormonas (HDBC, véase I-1). Aunque ningún HDBC se trata con quimioterapia, cuando el objetivo es destruir las células tumorales de forma diferencial que utilizan una combinación de agentes citotóxicos,^{5} es de esperar que los HDBC respondan a la terapia endocrina.

El concepto de tumores dependientes de hormonas aparece al principio de los años 60, cuando el modelo de acción de los estrógenos se introdujo por vez primera.^{6} Para que los estrógenos regulen el crecimiento celular y la función en los seres humanos, una proteína específica, denominada receptor de estrógenos humano (hER), debe estar presente.^{7} Esta proteína, localizada en el núcleo, interactúa con los estrógenos que resultan de la formación de un complejo de unión. Ésta actúa como factor de transcripción activando la producción de ARN-m de genes específicos, uno o más de los cuales son probablemente esenciales para el crecimiento eficaz de las células tumorales.

Los pacientes con un nivel mensurable de proteína receptora se clasifican como positivos al receptor del estrógeno (ER+) en oposición a los negativos al receptor del estrógeno (ER-). Aproximadamente el 50% de las mujeres premenopáusicas y el 75% de las mujeres postmenopáusicas están comprendidas en el grupo ER+^{8} en el que el desarrollo de los cánceres de mama puede estar directamente relacionado con la presencia de estrógenos. La terapia endocrina, en la que la utilización de fármacos produce una carencia de estimulación estrógena a las células, ha demostrado ser un método eficaz para el tratamiento de HDBC. Originalmente, se desarrollaron dos clases de fármacos, que responden a diferentes estrategias: antiestrógenos e inhibidores de aromatasa.

Los antiestrógenos, como antagonistas del receptor del estrógeno, han sido uno de los primeros tratamientos considerados para el HDBC. Su acción se basa en su capacidad para unirse de forma competitiva a la proteína hER del receptor específico, impidiendo de este modo el acceso de los estrógenos endógenos a su punto de unión específico. Por consiguiente, la hormona natural es incapaz de mantener el crecimiento tumoral.

De los antiestrógenos habitualmente utilizados en la terapia del cáncer de mama, el más ampliamente utilizado es tamoxifeno (a continuación) debido al perfil de toxicidad muy bajo de la molécula. A pesar de su estructura no esteroidea, el tamoxifeno posee una actividad agonista-antagonista mixta que limita su potencial terapéutico.^{9} Además, se han
descrito algunas formas de resistencia al fármaco en pacientes después del tratamiento con tamoxifeno a largo plazo.^{10}

Los nuevos fármacos antiestrógenos puros, tales como ICI 164384 (a continuación), han sido descubiertos desde hace tiempo pero la pérdida de potencia comparada con la de tamoxifeno sugiere la necesidad de diseñar mucho más dianas potentes.^{11}

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Desde hace algunos años, un nuevo tipo de antiestrógeno ha aparecido, combinando el agonismo del estrógeno en los tejidos diana tales como hueso o hígado y el antagonismo y/o agonismo mínimo en los tejidos reproductores tales como las mamas o el útero.^{12} Estos compuestos, diseñados como moduladores selectivos del receptor del estrógeno (SERM), no son únicamente potencialmente eficaces para reducir el riesgo del paciente de carcinoma de mama sino que también se ha demostrado que aumentan la densidad mineral del hueso y previenen la osteoporosis en las mujeres posmenopáusicas. El raloxifeno es el primero de esta clase de compuestos que se utiliza clínicamente.^{13} Más SERM están actualmente en pruebas clínicas y estas moléculas pueden sustituir un día al tamoxifeno como primera línea de tratamiento para mujeres con HDBC.

La utilización de agentes terapéuticos que inhiben una o varias enzimas de la serie de reacciones de la biosíntesis de esteroides representa otra estrategia importante para el control del desarrollo de los tumores dependientes del estrógeno.^{14} La enzima aromatasa, que convierte los esteroides C19 andrógenos en esteroides C18 estrógenos, ha sido el principal objetivo para reducir las concentraciones de estrógeno. Esta enzima compleja, que contiene una hemoproteína citocromo P450, cataliza la aromatización del anillo A del andrógeno con la subsiguiente pérdida del grupo metilo de C19 para proporcionar estrógenos.

La aminoglutetimida (a continuación) fue el primer inhibidor de aromatasa utilizado para el tratamiento del cáncer de mama. Sin embargo presentaba numerosos efectos secundarios indeseables dado su amplio espectro de efectos inhibidores en otras enzimas dependientes de P450 y los intentos para mejorar la estructura original han conducido a numerosos compuestos no esteroideos que introducen pruebas clínicas.^{15} La última generación desarrolló compuestos tales como letrozol, que combina gran potencia y gran sensibilidad para la enzima y también son mejor tolerados.

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Estructura de diferentes tipos de inhibidores de aromatasa. Generación I: aminoglutetimida, AG; generación III, letrozol.

Tradicionalmente, los inhibidores de aromatasa se reservan como segunda línea de tratamiento para pacientes de HDBC avanzado cuyas enfermedades no son ya controladas por tamoxifeno. Sin embargo, debido al perfil extremo de buena toxicidad de algunos de los más recientes inhibidores de aromatasa, se han realizado pruebas clínicas recientes para evaluar su idoneidad como tratamiento de primera línea para HDBC.

Durante la última década han aparecido pruebas fehacientes, tanto bioquímica como clínicamente, de que la única inhibición de la enzima aromatasa no puede proporcionar una reducción eficaz de la estimulación estrógena de HDBC, siendo la razón que otra serie de reacciones están involucradas en la biosíntesis del estrógeno. La serie de reacciones de la sulfatasa se considera actualmente que es la vía principal para la síntesis del estrógeno para el tumor de mama ya que se observó que la actividad de la sulfatasa proporciona 10 veces más estrógenos que la actividad de la aromatasa.^{16}

En la serie de reacciones de la sulfatasa, los estrógenos se sintetizan a partir del estrógeno-sulfato precursor muy disponible, mediante dos enzimas (esquema a continuación): la sulfatasa de estrona (STS) que hidroliza el sulfato de estrona en la estrona y la 17\beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa (17\beta-HSD) que reduce la estrona en el estradiol. Estas dos enzimas representan los últimos objetivos para las estrategias de carencia de estrógeno.

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Origen de estrógenos en células de mama normales y tumorales. AR, aromatasa; ST: sulfotransferasa esteroide; STS, sulfatasa esteroidea; 17\beta-HSD, 17\beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa; 3\beta-IS, 3\beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa \Delta^{5},\Delta^{4}-isomerasa; ER, receptor de estrógeno.

Se han identificado varios inhibidores potentes para la estrona sulfatasa. Todos comparten la propiedad estructural común de un anillo aromático que lleva un sustituyente que imita el anillo A fenólico del sustrato enzimático, sulfato de estrona. En el desarrollo de los inhibidores esteroideos, se ha introducido en C3 una amplia variedad de grupos químicos, de los cuales se descubrió que el 3-O-sulfamato era el más potente para la molécula de estrona. El compuesto resultante, estrona-3-O-sulfamato (a continuación) condujo a la identificación de la estructura de aril-O-sulfamato como un farmacóforo activo requerido para la inhibición potente de STS. Se demostró que EMATE inhibe la actividad de la sulfatasa esteroidea en función del tiempo y de la concentración^{17} y era activa in vivo en administración oral.^{18} Sin embargo al ser muy estrógeno se puso de manifiesto que aumentaba la necesidad de diseñar inhibidores STS desprovistos de actividad agonística sobre el hER.

Para evitar los problemas relacionados con un núcleo esteroide activo, se han sintetizado inhibidores basados en no esteroides. El sulfamato de cumarina tal como 4-metilcumarin-7-O-sulfamato (CUMATO, a continuación) donde se conserva el farmacóforo activo, han sido entre los primeros inhibidores de este tipo que se han identificado.^{19} Aunque CUMATO es menos potente que EMATE, presenta la ventaja de no ser estrógeno.^{20} Se han desarrollado y producido bien algunos sulfamatos a base de cumarina tricíclicos al ser mucho más potentes que CUMATO, aunque conservando su característica no estrógena.^{21} 667CUMATO, que es unas 3 veces más potente in vitro que el EMATE está actualmente en desarrollo preclínico para pruebas clínicas.^{22}

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Estructuras de los inhibidores de sulfatasa esteroidea EMATE, CUMATO y 667CUMATO.

El documento PCT/GB92/01587 da a conocer nuevos inhibidores de sulfatasa esteroidea y composiciones farmacéuticas que los contienen para su utilización en el tratamiento de tumores dependientes de estrona, especialmente el cáncer de mama. Estos inhibidores de sulfatasa esteroideas son ésteres de sulfamato, tales como estrona-3-sulfamato de N,N-dimetilo y, preferentemente, estrona-3-sulfamato (EMATE). Es conocido que el EMATE es un potente inhibidor de E1-STS ya que presenta más del 99% de inhibición de la actividad de E1-STS en células MCF-7 íntegras a 0,1 mM. El EMATE también inhibe la enzima E1-STS en función del tiempo y de la concentración, indicando que actúa como un inactivador dirigido al sitio activo. Aunque EMATE se diseñó originalmente para la inhibición de E1-STS, también inhibe la deshidroepiandrosterona sulfatasa (DHA-STS), que es una enzima que se cree que tiene una función esencial en la regulación de la biosíntesis del esteroide estrógeno androstenediol. Asimismo, no existen pruebas que sugieran que el androstenediol puede ser de importancia aún mayor como activador del crecimiento del tumor de mama. El EMATE es también activo in vivo ya que se produjo la inhibición casi completa de las actividades de E1-STS del hígado (99%) y de DHA-STS (99%) cuando se administra por vía oral o por vía subcutánea. Además, se ha demostrado que el EMATE tiene una memoria que potencia los efectos en ratas. Los estudios en ratones han sugerido una asociación entre la actividad de DHA-STS y la regulación de parte de la respuesta inmunitaria. Se cree que ésta puede también ocurrir en el hombre. El átomo de O en puente del resto de sulfamato en EMATE es importante para la actividad inhibidora. Por lo tanto, cuando el átomo de O en 3 se sustituye por otros heteroátomos como en el estrona-3-N-sulfamato y estrona-3-S-sulfamato, estos análogos son inactivadores más débiles independientes del tiempo.

Aunque la potencia óptima para la inhibición de E1-STS puede haberse alcanzado en el EMATE, es posible que la estrona pueda liberarse durante la inhibición de la sulfatasa y que el EMATE y su congénere estradiol puedan poseer actividad estrógena.

17\beta-HSD, que cataliza la etapa final en la biosíntesis de estrógenos y andrógenos, aparece asimismo como diana para las estrategias de carencia de estrógenos. Esta enzima es responsable de la interconversión de la forma oxidada (menos activa) y de la forma reducida (más activa) de los esteroides. Su actividad apoya directamente el crecimiento y desarrollo de tumores dependientes de estrógenos ya que preferentemente reduce la estrona en el estradiol^{25} y en menor extensión, mediante la conversión del andrógeno DHEA en androstenediol (Adiol), que se ha demostrado recientemente que presenta propiedades estrógenas y que es capaz de unirse al receptor del estrógeno.^{26}

17\beta-HSD pertenece a una familia de isoenzimas, 11 de las cuales se han identificado y clonado hasta ahora.^{27} Cada tipo presenta una afinidad selectiva al sustrato y una actividad direccional que significa que se ha conseguido la selectividad de la acción del fármaco. 17\beta-HSD de tipo 1 es el isotipo que cataliza la interconversión de estrona y estradiol.

A diferencia de los inhibidores de STS, se han descrito solamente unos pocos inhibidores de 17\beta-HSD. La mayoría de los inhibidores esteroideos para 17\beta-HSD de tipo 1 presentan en común una estructura modificada del anillo D. Se ha demostrado que los derivados de estradiol que contienen una cadena lateral con un grupo saliente bueno en la posición 16\alpha son una clase potente de inhibidores. En particular, se descubrió que 16\alpha-(bromoalquil)-estradiol^{28} en el que las cadenas laterales presentan gran reactividad hacia los restos de aminoácidos nucleofílicos en el punto activo de la enzima eran inhibidores irreversibles prometedores. Los análogos que contienen restos cortos de bromoalquilo en la posición 16 presentan la actividad mayor con 16\alpha-(bromopropil)-estradiol, seguido de 16\alpha-(bromobutil)-estradiol, el más potente de la serie (3 y 4). Ellos, sin embargo, resultaron ser agonistas puros del receptor del
estrógeno.

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Inhibidores 17\beta-HSD de tipo 1: 16\alpha-(bromopropil)-estradiol, 3;

16\alpha-(bromopropil)-estradiol, 4 y derivados de flavona, apigenina.

En un intento para eliminar la estrogenicidad intrínseca de los inhibidores potentes y posiblemente modificar al mismo tiempo las propiedades antiestrógenas en la molécula, se sintetizaron varios derivados de 16\alpha-(ampliamente)-estradiol que llevan la cadena lateral de C7\alpha-alquilamida del antiestrógeno conocido ICI 164384.^{29} Sin embargo, se obtuvo una inhibición bastante escasa de 17\beta-HSD de tipo 1, con propiedades estrógenas y antiestrógenas no anuladas o introducidas por completo respectivamente.

En paralelo, se han diseñado inhibidores no esteroideos de 17\beta-HSD de tipo 1. Los flavonoides que son estructuralmente similares a los estrógenos, son capaces de unirse al receptor del estrógeno con actividades estrógenas o antiestrógenas.^{30} Su acción sobre la actividad de la aromatasa está bien documentada y en estudios recientes, se observó que reducen la conversión de estrona en estradiol catalizada por 17\beta-HSD de tipo 1^{31}. Los derivados de flavona, tal como la apigenina (Figura 6) aparecieron en un estudio de SAR como compuestos prometedores con alguna actividad inhibidora en 17\beta-HSD de tipo 1 sin que sean estrógenos a la concentración inhibidora.^{32}

Ahmed et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 27 de enero 1997; 254(3):811-5) describen un estudio relacionado con la actividad de la estructura de inhibidores esteroideos y no esteroideos de STS.

Las deshidrogenasas esteroideas (DH) tales como las estradiol 17\beta-hidroxiesteroide deshidrogenasas (E2HSD) presentan funciones esenciales en la regulación de la disponibilidad de los ligandos para interactuar con el receptor del estrógeno. E2HSD de tipo I reduce la estrona (E1) al estrógeno biológicamente activo, estradiol (E2), mientras que E2HSD de tipo II inactiva E2 catalizando su oxidación a E1. Por lo tanto la identificación de los compuestos con actividad inhibidora de DH, en particular, los inhibidores de E2HSD de tipo I, podrían ser de valor terapéutico en la inhibición de la formación de E2.

Aspectos del sumario de la presente invención

La presente invención proporciona nuevos compuestos que son capaces de actuar como inhibidores eficaces de sulfatasa esteroidea. La presente invención identifica los compuestos de la presente solicitud como inhibidores eficaces de sulfatasa esteroidea.

La Figura 1 presenta algunas de las enzimas implicadas en la síntesis in situ de estrona a partir de sulfato de estrona, y estradiol. "STS" indica estrona sulfatasa, "E2DH de tipo I" indica estradiol 17\beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo I o estradiol 17\beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo 1, 3, 5 y/o 7 y "E2DH de tipo II" indica estradiol 17\beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo II o estradiol 17\beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo 2 y/o 8.

Como puede observarse, dos enzimas que están implicadas en la síntesis periférica de estronas son la enzima estradiol 17\beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa y la enzima estrona sulfatasa.

Se cree que la síntesis in situ del estrógeno realiza una importante contribución a las concentraciones elevadas de estrógenos en los tumores y por lo tanto los inhibidores específicos de la biosíntesis del estrógeno son de valor potencial para el tratamiento de los tumores dependientes del sistema endocrino.

Además, aun cuando la formación de estrógeno en la mama cancerosa y los tejidos endometriales a través de la serie de reacciones de sulfatasa realiza una contribución principal a la gran concentración de estrógenos, existen todavía otra serie de reacciones enzimáticas que contribuyen a la síntesis in vivo del estrógeno.

Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas terapias para el tratamiento de estos cánceres.

La presente invención por consiguiente pretende superar uno o más de los problemas asociados a los métodos de la técnica anterior de tratamiento de cánceres de mama y de endometrio.

En un aspecto, por consiguiente, la presente invención proporciona una utilización de un compuesto para la preparación de un medicamento que puede afectar, tal como inhibir sustancialmente, a la serie de reacciones de sulfato estrona (cuya serie de reacciones transforma la estrona en estradiol y desde éste) y/o afectan, tal como inhiben sustancialmente, la serie de reacciones de la esteroide deshidrogenasa, cuya serie de reacciones convierte la estrona en estradiol y a partir de éste.

Este aspecto de la presente invención presenta ventajas porque mediante la administración de un tipo de compuesto es posible bloquear la síntesis de estradiol a partir de estrona o E1S. Por consiguiente, la presente invención proporciona compuestos que presentan considerables ventajas terapéuticas, particularmente para tratar los cánceres de mama y de endometrio.

Los compuestos de la presente invención pueden comprender otros sustituyentes. Estos otros sustituyentes pueden, por ejemplo, aumentar más la actividad de los compuestos de la presente invención y/o aumentar la estabilidad (ex vivo y/o in vivo).

Aspectos detallados de la presente invención

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un compuesto de fórmula XII:

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en la que G es H o un sustituyente seleccionado de entre OH o un grupo hidrocarbilo, y en la que R^{1} es el grupo sulfamato.

Como es bien conocido en la materia, una estructura clásica de anillo esteroideo presenta la fórmula genérica siguiente:

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en la fórmula anterior, los anillos se han marcado de manera convencional.

Un ejemplo de un bioisostero es cuando uno cualquiera o más de los anillos A, B, C y D es un anillo heterocíclico y/o cuando uno cualquiera o más de los anillos A, B, C y D se ha sustituido y/o cuando uno cualquiera o más de los anillos A, B, C y D se ha modificado, pero en el que el bioisostero presenta propiedades esteroideas.

A este respecto, el sistema de anillo de la presente invención es análogo a una estructura en anillo esteroideo y puede ser un bioisóstero de estructura en anillo esteroideo.

A título de ejemplo, uno cualquiera o más de los anillos A', B', C' y D' puede sustituirse independientemente con grupos adecuados, tales como un grupo alquilo, un grupo arilo, un grupo hidroxi, un grupo halo, un grupo hidrocarbilo, un grupo oxihidrocarbilo, etc.

Preferentemente el compuesto contendrá, incluidos todos los sustituyentes, no más de 50 átomos de carbono aproximadamente, más frecuentemente no más de aproximadamente 30 a 40 átomos de carbono.

Grupo G

G se selecciona de entre H, OH y un grupo hidrocarbilo.

En algunos aspectos de la presente invención, preferentemente G o el grupo hidrocarbilo es un grupo hidrocarbonado opcionalmente sustituido. En otras palabras G es un grupo hidrocarbonado opcionalmente sustituido o se selecciona de entre H, OH y un grupo hidrocarbonado opcionalmente sustituido.

En algunos aspectos de la presente invención, preferentemente G o el grupo hidrocarbilo se selecciona de entre el grupo alquilo opcionalmente sustituido, el grupo aloalquilo opcionalmente sustituido, el grupo arilo, el grupo alquilarilo, el grupo alquilarilalquilo y el grupo alqueno.

En algunos aspectos de la presente invención, preferentemente G o el grupo hidrocarbilo es un grupo alquilo opcionalmente sustituido.

En algunos aspectos de la presente invención, preferentemente G o el grupo hidrocarbilo se selecciona de entre el grupo alquilo C_{1}-C_{10}, tal como el grupo alquilo C_{1}-C_{6} y el grupo alquilo C_{1}-C_{3}. Los grupos alquilo típicos incluyen alquilo C_{1}, alquilo C_{2}, alquilo C_{3}, alquilo C_{4}, alquilo C_{5}, alquilo C_{7} y alquilo C_{8}.

En algunos aspectos de la presente invención, preferentemente G o el grupo hidrocarbilo se selecciona de entre el grupo haloalquilo C_{1}-C_{10}, el grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, el grupo haloalquilo C_{1}-C_{3}, el grupo bromoalquilo C_{1}-C_{10}, el grupo bromoalquilo C_{1}-C_{6} y el grupo bromoalquilo C_{1}-C_{3}. Los grupos haloalquilo típicos incluyen haloalquilo C_{1}, haloalquilo C_{2}, haloalquilo C_{3}, haloalquilo C_{4}, haloalquilo C_{5}, haloalquilo C_{7}, haloalquilo C_{8}, bromoalquilo C_{1}, bromoalquilo C_{2}, bromoalquilo C_{3}, bromoalquilo C_{4}, bromoalquilo C_{5}, bromoalquilo C_{7} y bromoalquilo C_{8}.

En algunos aspectos de la presente invención, preferentemente G o el grupo hidrocarbilo se selecciona de entre grupos arilo, grupos alquilarilo, grupos alquilarilalquilo, -(CH_{2})_{1-10}-aril, -(CH_{2})_{1-10}-Ph, (CH_{2})_{1-10}-Ph-alquilo C_{1-10}, -(CH_{2})_{1-5}-Ph, (CH_{2})_{1-5}-Ph-alquilo C_{1-5}, -(CH_{2})_{1-3}-Ph, (CH_{2})_{1-3}-Ph-alquilo C_{1-3}, -CH_{2}-Ph y -CH_{2}-Ph-C(CH_{3})_{3}.

Cuando G o el grupo hidrocarbilo es o contiene un grupo arilo, el grupo aril o uno o más de los grupos arilo puede contener un heteroátomo. Por lo tanto el grupo arilo o uno o más de los grupos arilo puede ser carbocíclico o puede ser más heterocíclico. Los átomos hetero típicos incluyen O, N y S, en particular N.

En algunos aspectos de la presente invención, preferentemente G o el grupo hidrocarbilo se selecciona de
entre -(CH_{2})_{1-10}-cicloalquilo, -(CH_{2})_{1-10}-cicloalquilo C_{3-10}, -(CH_{2})_{1-7}-cicloalquilo C_{3-7}, -(CH_{2})_{1-5}-cicloalquilo C_{3-5},
-(CH_{2})_{1-3}-cicloalquilo C_{3-5} y -CH_{2}- cicloalquilo C_{3}.

En algunos aspectos de la presente invención, preferentemente G o el grupo hidrocarbilo es un grupo alqueno. Los grupos alqueno típicos comprenden el grupo alqueno C_{1}-C_{10}, el grupo alqueno C_{1}-C_{6}, el grupo alqueno C_{1}-C_{3}, tal como el grupo alqueno C_{1}, C_{2}, C_{3}, C_{4}, C_{5}, C_{6} o C_{7}. En un aspecto preferido el grupo alqueno contiene 1, 2 ó 3 enlaces C=C. En un aspecto preferido el grupo alqueno contiene 1 enlace C=C. En algún aspecto preferido por lo menos un enlace C=C o el único enlace C=C es el terminal C de la cadena alqueno, que es el enlace que está en el extremo distal de la cadena al sistema de anillo.

En algunos aspectos de la presente invención, preferentemente G es H.

Grupo R^{1}

El grupo R^{1} de los compuestos de la presente invención es un grupo sulfamato

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en el que R^{4} y R^{5} se seleccionan independientemente de entre H, alquilo, cicloalquilo, alquenilo y arilo, o combinaciones de éstos o que representan conjuntamente alquileno, en el que el o cada alquilo o cicloalquilo o alquenilo o contienen opcionalmente uno o más heteroátomos o grupos.

En algunos aspectos de la presente invención, preferentemente por lo menos uno de entre R^{4} y R^{5} es H.

En algunos aspectos de la presente invención, preferentemente R^{4} y R^{5} son H.

Sustituyentes

En términos generales el sistema de anillo A'B'C'D' de los presentes compuestos puede contener una variedad de sustituyentes que no interfieren. En particular, el sistema de anillo A'B'C'D' puede contener uno o más hidroxi, alquilo especialmente alquilo (C_{1}-C_{6}) inferior, por ejemplo metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo y otros isómeros de pentilo, y n-hexilo y otros isómeros de hexilo, alcoxi especialmente alcoxi (C_{1}-C_{6}) inferior, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, etc., alquinilo, por ejemplo etinilo, o halógeno, por ejemplo sustituyentes del flúor.

Para algunos compuestos de la presente invención, es preferible que el sistema de anillo se sustituya por un grupo hidrocarbilsulfamilo. Más preferentemente el anillo A' de sistema de anillo se sustituye con un grupo hidrocarbilsulfamilo. El término "hidrocarbilsulfamilo" hace referencia a un grupo que comprende por lo menos el grupo hidrocarbilo (como se define en la presente memoria) y sulfuro, preferentemente -S-hidrocarbilo, más preferentemente -S-hidrocarburo. Este grupo sulfuro puede estar opcionalmente oxidado.

Para algunos compuestos de la presente invención, es muy preferible que por lo menos la posición 2 del anillo A' del sistema de anillo esté sustituida con un grupo hidrocarbilsulfanilo.

Preferentemente el grupo hidrocarbilsulfanilo es -S-alquilo C_{1-10}, más preferentemente -S-alquilo C_{1-5}, más preferentemente -S-alquilo C_{1-3}, más preferentemente -S-CH_{2}CH_{2}CH_{3}, -S-CH_{2}CH_{3} o -SCH_{3}.

Para algunos compuestos de la presente invención, es muy preferible que el anillo A' del sistema de anillo esté sustituido con un grupo alcoxi.

Para algunos compuestos de la presente invención, es muy preferible que por lo menos la posición 2 del anillo A' del sistema de anillo esté sustituida con un grupo alcoxi.

Preferentemente el grupo alcoxi es metoxi.

Para algunos compuestos de la presente invención, es muy preferible que por lo menos el anillo A' del sistema de anillo esté sustituido con un grupo hidrocarbilo.

Para algunos compuestos de la presente invención, es muy preferible que por lo menos la posición 2 del anillo A' del sistema de anillo esté sustituido con un grupo alquilo.

Preferentemente el grupo alquilo es etilo.

Para algunos compuestos de la presente invención, es muy preferible que el compuesto comprenda por lo menos dos o más de entre el grupo sulfamato, un grupo fosfonato, un grupo tiofosfonato, un grupo sulfonato o un grupo sulfonamida.

Para algunos compuestos de la presente invención, es muy preferible que el compuesto comprenda por lo menos dos grupos sulfamato.

Para algunos compuestos de la presente invención, es muy preferible que el compuesto comprenda por lo menos dos grupos sulfamato, en el que dichos grupos sulfamato no están en el mismo anillo.

Para algunos compuestos de la presente invención, es muy preferible que el anillo A' del sistema de anillo comprenda por lo menos un grupo sulfamato y en el que el anillo D' del sistema de anillo comprenda por lo menos un grupo sulfamato.

En algunos aspectos de la presente invención, preferentemente el anillo A' contiene uno o más de un sustituyente alcoxilo y un sustituyente alquilo. Por lo tanto según un aspecto de la presente invención, se proporciona un compuesto de fórmula XVI

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En un aspecto preferido de la invención, se proporciona un compuesto de fórmula XIX:

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en la R^{2} y R^{3} se seleccionan independientemente de entre H y grupos hidrocarbilo, en la que por lo menos uno de R^{2} y R^{3} es un grupo hidrocarbilo.

Preferentemente por lo menos uno de R^{2} y R^{3} es un grupo alquilo. Preferentemente por lo menos uno de R^{2} y R^{3} es el grupo alquilo C_{1}-C_{10}, preferentemente el grupo alquilo C_{1}-C_{6}, preferentemente el grupo alquilo C_{1}-C_{3}. Preferentemente por lo menos uno de R^{2} y R^{3} es -CH_{3} o -CH_{2}CH_{3}.

En un aspecto preferentemente R^{2} es un grupo hidrocarbilo y R^{3} es H.

En otro aspecto, por lo menos uno de R^{2} y R^{3} es un grupo alcoxi. Preferentemente por lo menos uno de R^{2} y R^{3} es metoxi.

Los compuestos muy preferidos de la presente invención pueden seleccionarse de entre

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en la que

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Aspectos adicionales

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un compuesto según la presente invención para su utilización en medicina.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el compuesto según la presente invención opcionalmente mezclado con un portador, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un compuesto según la presente invención para la preparación de un medicamento destinado a su utilización en terapia de una afección o enfermedad relacionada con STS.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un compuesto según la presente invención para la preparación de un medicamento destinado a su utilización en terapia de una afección o enfermedad relacionada con concentraciones desfavorables de STS.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un compuesto según la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica destinado a inhibir la actividad de sulfatasa esteroidea (STS).

En algunas aplicaciones, preferentemente los compuestos no presentan efecto estrógeno mínimo.

En algunas aplicaciones, preferentemente los compuestos no presentan efecto estrógeno.

En algunas aplicaciones, preferentemente los compuestos presentan una acción irreversible.

En una forma de realización los compuestos de la presente invención son útiles para el tratamiento del cáncer de mama.

Los compuestos de la presente invención pueden estar en forma de sal.

La presente invención también comprende nuevos productos intermedios que son útiles para preparar los compuestos de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención comprende nuevos precursores alcohólicos para los compuestos. A título de ejemplo adicional, la presente invención comprende los precursores bioprotegidos para los compuestos. En la presente memoria se presentan ejemplos de cada uno de estos precursores. La presente invención también comprende un procedimiento que comprende cada uno o ambos de estos precursores para la síntesis de los compuestos de la presente invención.

Los inventores han identificado también que en algunos aspectos de la presente invención los presentes compuestos pueden inhibir también la actividad de la esteroide deshidrogenasa (HSD).

Esteroide deshidrogenasa o HSD significa 17\beta hidroxiesteroide deshidrogenasa. En un aspecto la 17\beta hidroxiesteroide deshidrogenasa es EC 1.1.1.62.

Preferentemente la HSD es del tipo 1, 3, 5 y/ó 7. Preferentemente la HSD transforma la estrona (cetona) en estradiol (hidroxi).

Preferentemente la HSD es del tipo 2 y/ó 8. Preferentemente la HSD transforma el estradiol (hidroxi) en estrona (cetona).

Por lo tanto en aspectos adicionales la presente invención proporciona:

\bullet: La utilización de un compuesto de la presente invención para la preparación de un medicamento destinado a su utilización en la terapia de una afección o enfermedad relacionada con la esteroide deshidrogenasa.

\bullet: La utilización de un compuesto de la presente invención para la preparación de un medicamento destinado a su utilización en la terapia de una afección o enfermedad relacionada con las concentraciones desfavorables de esteroide deshidrogenasa.

\bullet: La utilización de un compuesto de la presente invención para la preparación de un producto farmacéutico para inhibir la actividad de la esteroide deshidrogenasa.

\bullet: Un método que comprende (a) realizar un ensayo de esteroide deshidrogenasa con uno o más compuestos experimentales de la presente invención; (b) determinar si uno o más de dichos compuestos experimentales es capaz o son capaces de modular la actividad de la esteroide deshidrogenasa; y (c) seleccionar uno o más de dichos compuestos experimentales que es o capaz o sean capaces de modular la actividad del esteroide deshidrogenasa.

\bullet: Un compuesto identificado por los métodos anteriores, su utilización en medicina y la composición farmacéutica que comprende los compuestos mezclados opcionalmente con un portador, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

En algunos aspectos de la presente invención, es preferible que el esteroide deshidrogenasa sea esteroide deshidrogenasa de tipo I.

En algunos aspectos de la presente invención, es preferible que el esteroide deshidrogenasa sea esteroide deshidrogenasa de tipo II.

Los autores han identificado también que en algunos aspectos no es necesario que los compuestos de la presente invención estén sustituidos con uno de entre un grupo sulfamato, un grupo fosfonato, un grupo tiofosfato, un grupo sulfonato o un grupo sulfonamida, para inhibir la actividad de la esteroide deshidrogenasa (HSD). Por lo tanto en algunos aspectos la presente invención proporciona un compuesto como el definido en la presente memoria, en el que R1 es cualquier sustituyente. En este aspecto preferentemente R1 es H, OH o un grupo hidrocarbilo, más preferentemente OH.

Los datos que confirman este descubrimiento se proporcionan a continuación en la Tabla 2:

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Algunas ventajas

Una ventaja clave de la presente invención consiste en que los compuestos de la presente invención pueden actuar como inhibidores de STS.

Otra ventaja de los compuestos de la presente invención consiste en que pueden ser potentes in vivo.

Algunos de los compuestos de la presente invención pueden ser compuestos no estrógenos. Aquí, la expresión "no estrógeno" significa que no presentan ninguna actividad o sustancialmente ninguna actividad estrógena.

Otra ventaja consiste en que algunos de los compuestos pueden no ser capaces de ser metabolizados a compuestos que presentan o producen actividad hormonal.

Algunos de los compuestos de la presente invención presentan también ventajas porque pueden ser oralmente activos.

Algunos de los compuestos de la presente invención pueden ser útiles para el tratamiento del cáncer, tal como el cáncer de mama, así como (o como alternativa) afecciones no malignas, tal como la prevención de las enfermedades autoinmunitarias, particularmente cuando los productos farmacéuticos pueden necesitar administrarse desde una temprana edad.

Por lo tanto, se considera también que algunos de los compuestos de la presente invención tienen utilizaciones terapéuticas aparte del tratamiento de los cánceres dependientes del sistema endocrino, tal como el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.

Sulfatasa esteroidea

La sulfatasa esteroidea, que se denomina a veces sulfatasa esteroidea o esteril sulfatasa o "STS" para abreviar, hidroliza varios esteroides sulfatados, tal como el sulfato de estrona, el sulfato de deshidroepiandroesterona y el sulfato de colesterol. A STS se le ha asignado el número de enzima EC 3.1.6.2.

La STS ha sido clonada y expresada. Por ejemplo, véase Stein et al. (J. Biol. Chem. 264:13865-13872 (1989) y Yen et al. (Cell 49:443-454 (1987)).

La STS es una enzima que ha estado involucrada en numerosas enfermedades.

A título de ejemplo, los especialistas han descubierto que una deficiencia total en STS produce ictiosis. Según algunos investigadores, la insuficiencia de STS es apenas existente en Japón. Los mismos investigadores (Sakura et al., J. Inherit. Metab. Dis. noviembre de 1997; 20(6):807-10) han descrito también que las enfermedades alérgicas, tal como asma bronquial, rinitis alérgica o dermatitis atópica, pueden estar asociadas a una insuficiencia de sulfatasa esteroidea.

Además de los estados patológicos que están siendo provocados por una carencia total de actividad de STS, un aumento de nivel de la actividad de STS puede también estar provocando estados patológicos. A título de ejemplo, y como se indicó anteriormente, existen pruebas fidedignas que apoyan la función de STS en el crecimiento y metástasis del cáncer de mama.

La STS ha estado también implicada en otros estados patológicos. A título de ejemplo, Le Roy et al. (Behav. Genet. Mar. de 1999; 29(2):131-6) han determinado que puede existir una correlación genética entre la concentración de sulfatasa esteroidea y la iniciación del comportamiento atacante en los ratones. Los autores concluyen que la sulfatación de los esteroides puede ser el motor principal de una compleja red, que incluye los genes presentados que están implicados en agresión por mutagénesis.

Inhibición de STS

Se cree que algunas enfermedades asociadas a la actividad de STS son debidas a la conversión de una estrona sulfatada no activa a una estrona no sulfatada activa. En las enfermedades asociadas a la actividad de STS, sería deseable inhibir la actividad de STS.

En la presente memoria, el término "inhibe" incluye reduce y/o elimina y/o enmascara y/o impide la acción perjudicial de STS.

Inhibidor de STS

Según la presente invención, el compuesto de la presente invención es capaz de actuar como un inhibidor de STS.

En la presente memoria, el término "inhibidor" tal como se utiliza en la presente memoria con respecto al compuesto de la presente invención significa un compuesto que puede inhibir la actividad de STS, tal como reducir y/o eliminar y/o enmascarar y/o impedir la acción perjudicial de STS. El inhibidor de STS puede actuar como antagonista.

La capacidad de los compuestos para inhibir la actividad de la estrona sulfatasa puede evaluarse utilizando células MCF-7 intactas de cáncer de mama o microsomas de placenta. Además, puede utilizarse un modelo animal. En los siguientes apartados se presentan los detalles de los protocolos de ensayo adecuados. Obsérvese que podrían utilizarse otros ensayos para determinar la actividad de STS y por lo tanto la inhibición de STS. Por ejemplo, puede hacerse referencia también a lo dado a conocer en el documento WO-A-99/50453.

Preferentemente, para algunas aplicaciones, el compuesto se caracteriza además por la propiedad de que si el grupo sulfamato hubiera de ser sustituido por un grupo sulfato para formar un derivado de sulfato, entonces el derivado de sulfato sería hidrolizable por una enzima que presenta actividad de sulfatasa esteroidea (E.C. 3.1.6.2), es decir cuando se incuba con sulfatasa esteroidea EC 3.1.6.2 a pH 7,4 y 37ºC.

En una forma de realización preferida, si el grupo sulfamato del compuesto hubiera de ser sustituido por un grupo sulfato para formar un compuesto de sulfato entonces el compuesto de sulfato sería hidrolizable por una enzima que presenta actividad de sulfatasa esteroidea (E.C. 3.1.6.2) y proporcionaría un valor de K_{m} inferior a 200 mmolar, preferentemente inferior a 150 mmolar, preferentemente inferior a 100 mmolar, preferentemente inferior a 75 mmolar, preferentemente inferior a 50 mmolar, cuando se incuba con sulfatasa esteroidea EC 3.1.6.2 a pH 7,4 y 37ºC.

En una forma de realización preferida, si el grupo sulfamato del compuesto hubiera de ser sustituido por un grupo sulfato para formar un compuesto de sulfato entonces el compuesto de sulfato sería hidrolizable por una enzima que presenta actividad de sulfatasa esteroidea (E.C. 3.1.6.2) y proporcionaría un valor de K_{m} inferior a 200 \mumolar, preferentemente inferior a 150 \mumolar, preferentemente inferior a 100 \mumolar, preferentemente inferior a 75 \mumolar, preferentemente inferior a 50 \mumolar, cuando se incuba con sulfatasa esteroidea EC 3.1.6.2 a pH 7,4 y 37ºC.

En una forma de realización preferida, el compuesto de la presente invención no es hidrolizable por una enzima con actividad de sulfatasa esteroidea (E.C. 3.1.6.2).

Para algunas aplicaciones, preferentemente el compuesto de la presente invención tiene una selectividad de por lo menos aproximadamente 100 veces la de la diana deseada (por ejemplo STS), preferentemente una selectividad de por lo menos aproximadamente 150 veces la de la diana deseada, preferentemente una selectividad de por lo menos aproximadamente 200 veces la de la diana deseada, preferentemente una selectividad de por lo menos aproximadamente 250 veces la de la diana deseada, preferentemente una selectividad de por lo menos aproximadamente 300 veces la de la diana deseada, preferentemente una selectividad de por lo menos aproximadamente 350 veces la de la diana deseada.

Obsérvese que el compuesto de la presente invención puede presentar otras propiedades beneficiosas además de su capacidad para inhibir la actividad de DH o como alternativa a la misma.

Esteroide deshidrogenasa

La esteroide deshidrogenasa o "DH" en abreviatura puede clasificarse en dos tipos, tipo I y tipo II. Los dos tipos de enzima, como por ejemplo estradiol 17\beta-hidroxiesteroide deshidrogenasas (E2HSD), presentan funciones esenciales en la regulación de la disponibilidad de los ligandos para interactuar con el receptor estrógeno. El tipo I reduce la estrona (E1) al estrógeno biológicamente activo, estradiol (E2) mientras que E2HSD de tipo II inactiva E2 catalizando su oxidación a E1.

Inhibición de DH

Se cree que algunas enfermedades asociadas a la actividad de DH son debidas a la conversión de una estrona no activa en un estradiol activo. En las enfermedades asociadas a la actividad de DH, sería deseable inhibir la actividad de DH.

En la presente memoria, el término "inhibir" incluye reducir y/o eliminar y/o impedir la acción perjudicial de DH.

Inhibidor de DH

Según la presente invención, el compuesto de la presente invención es capaz de actuar como inhibidor de DH.

En la presente memoria, el término "inhibidor" como se utiliza en la presente memoria con respecto al compuesto de la presente invención significa un compuesto que puede inhibir la actividad de DH, tal como reducir y/o eliminar y/o enmascarar y/o impedir la acción perjudicial de DH. El inhibidor de DH puede actuar como antagonista.

La capacidad de los compuestos para inhibir la actividad de la esteroide deshidrogenasa puede evaluarse utilizando ya sea células T47D de cáncer de mama en las que la actividad de E2HSD de tipo I es abundante o células MDA-MB-231 para estudios con inhibidor de tipo II. En ambas líneas celulares la formación de productos es lineal con respecto al tiempo y al número de células. Los detalles sobre un protocolo de ensayo adecuado se presentan en el apartado Ejemplos.

Obsérvese que el compuesto de la presente invención puede presentar otras propiedades beneficiosas además de su capacidad para inhibir la actividad de STS o como alternativa a la misma.

Grupo sulfamato

En una forma de realización, el anillo X tiene un grupo sulfamato como sustituyente. El término "sulfamato" como se utiliza en la presente memoria incluye un éster del ácido sulfámico o un éster de un derivado N-sustituido de ácido sulfámico o una sal del mismo.

Si R^{1} es un grupo sulfamato entonces el compuesto de la presente invención se denomina compuesto sulfamato.

Normalmente, el grupo sulfamato presenta la fórmula:

(R^{4})(R^{5})N-S(O)(O)-O-

en la que preferentemente R^{4} y R^{5} se seleccionan independientemente de entre H, alquilo, cicloalquilo, alquenilo y arilo, o combinaciones de los mismos, o representan conjuntamente alquileno, en el que el o cada alquilo o cicloalquilo o alquenilo u opcionalmente contienen uno o más heteroátomos o grupos.

Cuando están sustituidos, los compuestos N-sustituidos de la presente invención pueden contener uno o dos sustituyentes de N-alquilo, N-alquenilo, N-cicloalquilo o N-arilo, que contienen preferentemente o que contiene cada uno un máximo de 10 átomos de carbono. Cuando R^{4} y/o R^{5} es alquilo, los valores preferidos son aquellos en los que R^{4} y R^{5} se seleccionan cada uno independientemente de entre los grupos alquilo inferior que contienen de 1 a 6 átomos de carbono, es decir metilo, etilo, propilo, etc. R^{4} y R^{5} pueden ser ambos metilo. Cuando R^{4} y/o R^{5} es arilo, los valores típicos son fenilo y tolilo (PhCH_{3}; o). En los que R^{4} y R^{5} representa cicloalquilo, los valores típicos son ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, etc. Cuando se unen R^{4} y R^{5} representan típicamente un grupo alquileno que proporciona una cadena de 4 a 6 átomos de carbono, opcionalmente interrumpida por uno o más heteroátomos o grupos, por ejemplo para proporcionar un heterociclo de 5 elementos, por ejemplo morfolino, pirrolidino o piperidino.

Dentro de los valores los grupos sustituidos con alquilo, cicloalquilo, alquenilo y arilo están incluidos conteniendo como sustituyentes en éstos uno o más grupos que no interfieren con la actividad inhibidora de la sulfatasa del compuesto en cuestión. Los sustituyentes ejemplares que no interfieren incluyen hidroxi, amino, halo, alcoxi, alquilo y arilo.

En algunas formas de realización, el grupo sulfamato puede formar una estructura en anillo estando fusionada a (o asociada a) uno o más átomos en o sobre el grupo X.

En algunas formas de realización, pueden existir más de un grupo sulfamato. A título de ejemplo, pueden existir dos sulfamatos (es decir, compuestos bis-sulfamato). Si estos compuestos están basados en un núcleo esteroideo, preferentemente el segundo (o por lo menos uno de los grupos adicionales) grupo sulfamato está situado en la posición 17 del núcleo esteroideo. Estos grupos no necesitan ser iguales.

En algunas formas de realización preferidas, por lo menos uno de entre R^{4} y R^{5} es H.

En algunas formas de realización más preferidas, cada uno de entre R^{4} y R^{5} es H.

Grupo fosfonato

Típicamente, el grupo fosfonato presenta la fórmula:

(R^{6})-P(O)(OH)-O-

en la que preferentemente R^{6} es H, alquilo, cicloalquilo, alquenilo o arilo, o combinaciones de éstos, en la que el o cada alquilo o cicloalquilo o alquenilo u opcionalmente contienen uno o más heteroátomos o grupos.

Cuando se sustituyen, los compuestos N-sustituidos de la presente invención pueden contener uno o dos sustituyentes N-alquilo, N-alquenilo, N-cicloalquilo o N-arilo, preferentemente que contienen o que cada uno contiene un máximo de 10 átomos de carbono. Cuando R^{6} es alquilo, R^{6} puede ser un grupo alquilo inferior que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, es decir metilo, etilo, propilo, etc. A título de ejemplo, R^{6} puede ser metilo. Cuando R^{6} es arilo, los valores típicos son fenilo y tolilo (PhCH_{3};o). Cuando R^{6} representa cicloalquilo, los valores típicos son ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, etc. R^{6} puede comprender incluso un grupo alquileno que proporciona una cadena de 4 a 6 átomos de carbono, opcionalmente interrumpida por uno o más heteroátomos o grupo, por ejemplo para proporcionar un heterociclo de 5 elementos, por ejemplo morfolino, pirrolidino o piperidino.

En algunas formas de realización, el grupo fosfonato puede formar una estructura en anillo estando fusionada a (o asociada a) uno o más átomos en o sobre el grupo X.

En algunas formas de realización, pueden existir más de un grupo fosfonato. A título de ejemplo, pueden existir dos fosfonatos (es decir, compuestos bis- fosfonato). Si estos compuestos se basan en un núcleo esteroideo, preferentemente el segundo (o por lo menos uno de los grupos adicionales) grupo fosfonato está situado en la posición 17 del núcleo esteroideo. Estos grupos no necesitan ser iguales.

Grupo tiofosfonato

Típicamente, el grupo tiofosfonato presenta la fórmula:

(R^{7})-P(S)(OH)-O-

en la que preferentemente R^{7} es H, alquilo, cicloalquilo, alquenilo o arilo, o combinaciones de éstos, en la que el o cada alquilo o cicloalquilo o alquenilo u opcionalmente contienen uno o más heteroátomos o grupos.

Cuando están sustituidos, los compuestos N-sustituidos de la presente invención pueden contener uno o dos sustituyentes N-alquilo, N-alquenilo, N-cicloalquilo o N-arilo, preferentemente que contienen o que cada uno contiene un máximo de 10 átomos de carbono. Cuando R^{7} es alquilo, R^{7} puede ser un grupo alquilo inferior que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, es decir metilo, etilo, propilo, etc. A título de ejemplo, R^{7} puede ser metilo. Cuando R^{7} es arilo, los valores típicos son fenilo y tolilo (PhCH_{3};o). Cuando R^{7} representa cicloalquilo, los valores típicos son ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, etc. R^{7} puede comprender incluso un grupo alquileno que proporciona una cadena de 4 a 6 átomos de carbono, opcionalmente interrumpida por uno o más heteroátomos o grupo, por ejemplo para proporcionar un heterociclo de 5 elementos, por ejemplo morfolino, pirrolidino o piperidino.

En algunas formas de realización, el grupo tiofosfonato puede formar una estructura en anillo estando fusionada a (o asociada a) uno o más átomos en o sobre el grupo X.

En algunas formas de realización, pueden existir más de un grupotio fosfonato. A título de ejemplo, pueden existir dos tiofosfonatos (es decir, compuestos bis-tiofosfonato). Si estos compuestos están basados en un núcleo esteroideo, preferentemente el segundo (o por lo menos uno de los grupos adicionales) grupo tiofosfonato está situado en la posición 17 del núcleo esteroideo. Estos grupos no necesitan ser iguales.

Grupo sulfonato

Típicamente, el grupo fosfonato presenta la fórmula:

(R^{6})-S(O)(O)-O-

en la que preferentemente R^{8} es H, alquilo, cicloalquilo, alquenilo o arilo, o combinaciones de éstos, en la que el o cada alquilo o cicloalquilo o alquenilo u opcionalmente contienen uno o más heteroátomos o grupos.

Cuando se sustituyen, los compuestos N-sustituidos de la presente invención pueden contener uno o dos sustituyentes N-alquilo, N-alquenilo, N-cicloalquilo o N-arilo, preferentemente que contienen o que cada uno contiene un máximo de 10 átomos de carbono. Cuando R^{8} es alquilo, R^{8} puede ser un grupo alquilo inferior que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, es decir metilo, etilo, propilo, etc. A título de ejemplo, R^{8} puede ser metilo. Cuando R^{8} es arilo, los valores típicos son fenilo y tolilo (PhCH_{3};o). Cuando R^{8} representa cicloalquilo, los valores típicos son ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, etc. R^{8} puede comprender incluso un grupo alquileno que proporciona una cadena de 4 a 6 átomos de carbono, opcionalmente interrumpida por uno o más heteroátomos o grupos, por ejemplo para proporcionar un heterociclo de 5 elementos, por ejemplo morfolino, pirrolidino o piperidino.

En algunas formas de realización, el grupo sulfonato puede formar una estructura en anillo estando fusionada a (o asociada a) uno o más átomos en o sobre el grupo X.

En algunas formas de realización, pueden existir más de un grupo sulfonato. A título de ejemplo, pueden existir dos sulfonatos (es decir, compuestos bis- sulfonato). Si estos compuestos se basan en un núcleo esteroideo, preferentemente el segundo (o por lo menos uno de los grupos adicionales) grupo fosfonato está situado en la posición 17 del núcleo esteroideo. Estos grupos no necesitan ser iguales.

Combinación de sulfonato/fosfonato/tiofosfonato/sulfamato

Para algunos compuestos de la presente invención pueden estar presentes uno de entre un sulfonato como se define en la presente memoria o un fosfonato como se define en la presente memoria o un tiofosfonato como se define en la presente memoria o un sulfamato como se define en la presente memoria; y otro sulfonato como se define en la presente memoria o un fosfonato como se define en la presente memoria o un tiofosfonato como se define en la presente memoria o un sulfamato como se define en la presente memoria. A título de ejemplo, el compuesto de la presente invención puede comprender un grupo sulfamato y un grupo fosfonato.

Hidrocarbilo

La expresión "grupo hidrocarbilo" tal como se utiliza en la presente memoria significa un grupo que comprende por lo menos C y H y puede comprender opcionalmente uno u otros más sustituyentes adecuados. Ejemplos de dichos sustituyentes pueden incluir halo, alcoxi, nitro, un grupo alquilo, un grupo cíclico, etc. Además de la posibilidad de los sustituyentes que constituyen un grupo cíclico, una combinación de sustituyentes puede formar un grupo cíclico. Si el grupo hidrocarbilo comprende más de un C entonces esos carbonos no necesitan necesariamente estar unidos entre sí. Por ejemplo, por lo menos dos de los carbonos pueden estar unidos mediante un elemento o grupo adecuado. Por lo tanto, el grupo hidrocarbilo puede contener heteroátomos. Los heteroátomos adecuados serán evidentes para los expertos en la materia e incluyen, por ejemplo, azufre, nitrógeno y oxígeno. Un ejemplo no limitativo del grupo hidrocarbilo es un grupo acilo.

Un grupo hidrocarbilo típico es un grupo hidrocarbonado. En la presente memoria el término "hidrocarbonado" significa uno cualquiera de entre un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, cuyos grupos pueden ser lineales, ramificados o cíclicos, o un grupo arilo. El término hidrocarburo también incluye aquellos grupos excepto en los que han sido opcionalmente sustituidos. Si el hidrocarburo es una estructura ramificada con sustituyente(s) en éste, entonces la sustitución puede ser en el eje central del hidrocarburo o en la ramificación; alternativamente las sustituciones pueden estar en el eje central del hidrocarburo y en la ramificación.

Oxihidrocarbilo

El término grupo "oxihidrocarbilo" tal como se utiliza en la presente memoria significa un grupo que comprende por lo menos C, H y O y puede comprender opcionalmente uno u otros más sustituyentes adecuados. Ejemplos de dichos sustituyentes pueden incluir halo, alcoxi, nitro, un grupo alquilo, un grupo cíclico, etc. Además de la posibilidad de los sustituyentes que constituyen un grupo cíclico, una combinación de sustituyentes puede formar un grupo cíclico. Si el grupo hidrocarbilo comprende más de un C entonces esos carbonos no necesitan necesariamente estar unidos entre sí. Por ejemplo, por lo menos dos de los carbonos pueden estar unidos mediante un elemento o grupo adecuado. Por lo tanto, el grupo oxihidrocarbilo puede contener heteroátomos. Los heteroátomos adecuados serán evidentes para los expertos en la materia e incluyen, por ejemplo, azufre y nitrógeno.

En una forma de realización de la presente invención, el grupo oxihidrocarbilo es un grupo oxihidrocarbonado.

En la presente memoria el término "hidrocarbonado" significa uno cualquiera de entre un grupo alcoxi, un grupo oxialquenilo, un grupo oxialquinilo, cuyos grupos pueden ser lineales, ramificados o cíclicos, o un grupo oxiarilo. El término oxihidrocarburo también incluye aquellos grupos excepto en los que han sido opcionalmente sustituidos. Si el oxihidrocarburo es una estructura ramificada con sustituyente(s) en éste, entonces la sustitución puede ser en el eje central del hidrocarburo o en la ramificación; como alternativa las sustituciones pueden estar en el eje central del hidrocarburo y en la ramificación.

Típicamente el grupo oxihidrocarbilo presenta la fórmula C_{1-6}O (tal como un C_{1-3}O).

Ensayo para la determinación de la actividad de sts que utiliza células cancerosas

Protocolo 1

Inhibición de la actividad de sulfatasa esteroidea en células MCF-7

La actividad de la sulfatasa esteroidea se mide in vitro utilizando células MCF-7 intactas de cáncer de mama humano. Esta hormona dependiente de la línea celular se utiliza ampliamente para estudiar el control del crecimiento de las células de cáncer de mama humano. Posee actividad significativa de sulfatasa esteroidea (MacIndoe et al., Endocrinology, 123, 1281-1287 (1988); Purohit y Reed, Int. J. Cancer, 50, 901-905 (1992)) y está disponible en los Estados Unidos en la American Type Culture Collection (ATCC) y en el Reino Unido (por ejemplo en The Imperial Cancer Research Fund).

Se mantienen las células en medio esencial mínimo (MEM) (Flow Laboratories, Irvine, Escocia) que contienen HEPES 20 mM, suero de ternero fetal al 5%, glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales y bicarbonato de sodio al 0,075%. Hasta 30 réplicas en matraces de cultivo de tejido de 25 cm^{2} se siembran con aproximadamente 1 \times 10^{5} células/matraz utilizando el medio anterior. Las células se cultivan a una confluencia del 80% y el medio se cambia cada tres días.

Monocapas íntegras de células MCF-7 en matraces de cultivo de tejido de 25 cm^{2} por triplicado se lavan con solución salina equilibrada de Eagle (EBSS de ICN Flow, High Wycombe, U.K) y se incuban durante 3 a 4 horas a 37ºC con 5 pmol (7 \times 10^{5} dpm) [6,7-3H]estrona-3-sulfato (actividad específica 60 Ci/moles de New England Nuclear, Boston, Mass., U.S.A.) en MEM exento de suero (2,5 ml) junto con estrona-3-sulfamato (11 concentraciones: 0; 1 fM; 0,01 pM; 0,1 pM; 1 pM; 0,01 nm; 0,1 nm; 1 nm; 0,01 mM; 0,1 mM; 1 mM). Tras la incubación cada matraz se enfría y el medio (1 ml) se pipetea en tubos separados que contienen [14C]estrona (7 \times 103 dpm) (actividad específica 97 Ci/moles de Amersham International Radiochemical Centre, Amersham, U.K.). La mezcla se agita intensamente durante 30 segundos con tolueno (5 ml). Los experimentos han demostrado que >90% de [14C]estrona y <0,1% de [3H]estrona-3-sulfato se elimina de la fase acuosa mediante este tratamiento. Una fracción (2 ml) de la fase orgánica se elimina, se evapora y el contenido de 3H y de 14C del residuo se determina por espectrometría de centelleo. Se calculó la masa de estrona-3-sulfato hidrolizada a partir de los recuentos de 3H obtenidos (corregidos para los volúmenes del medio y de la fase orgánica utilizada, y para recuperación de la [14C]estrona añadida) y la actividad específica del sustrato. Cada lote de experimentos incluye incubaciones y microsomas preparadas a partir de placenta humana positiva a sulfatasa (control positivo) y matraces sin células (para evaluar la hidrólisis no enzimática aparente del sustrato). Se determina el número de núcleos de células por matraz utilizando un contador Coulter después del tratamiento de las monocapas celulares con Zaponina. Se utiliza un matraz de cada lote para evaluar el estado de la membrana celular y la viabilidad utilizando el método de exclusión con azul de tripano (Phillips, H.J. (1973) en: Tissue culture and applications, [eds: Kruse, D.F. y Patterson, M.K.]; págs. 406-408; Academic Press, Nueva York).

Los resultados de la actividad de la sulfatasa esteroidea se expresan como la media \pm 1 S.D. del producto total (estrona + estradiol) formado durante el periodo de incubación (20 horas) calculado para 106 células y, para los valores que presentan significado estadístico, como reducción del porcentaje (inhibición) sobre incubaciones que no contienen estrona-3-sulfamato. Se utilizó la prueba de la t de Student para valores independientes para determinar el significado estadístico de los resultados.

Ensayo para la determinación de la actividad de STS que utiliza microsomas de placenta

Protocolo 2

Inhibición de la actividad de la sulfatasa esteroidea en microsomas de placenta

Placenta humana positiva a sulfatasa de embarazos de duración normal se pica minuciosamente con tijeras y se lava una vez con tampón de fosfato frío (pH 7,4, 50 mM) a continuación se vuelve a poner en suspensión en tampón de fosfato frío (5 ml/g de tejido). La homogenización se realiza con un homogenizador Ultra-Turrax utilizando tres arranques de 10 segundos separados por periodos de enfriamiento de 2 minutos en hielo. Se eliminan los núcleos y los residuos celulares por centrifugación (4ºC) a 2.000 g durante 30 minutos y las fracciones (2 ml) del sobrenadante se almacenan a 20ºC. La concentración de proteína de los sobrenadantes se determina por el método de Bradford (Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976)).

Se realizan incubaciones (1 ml) utilizando una concentración de proteína de 100 mg/ml, concentración del sustrato de 20 mM [6,7-3H]estrona-3-sulfato (actividad específica 60 Ci/moles de New England Nuclear, Boston, Mass., U.S.A.) y un periodo de incubación de 20 minutos a 37ºC. Si fuera necesario se emplean ocho concentraciones de compuestos: 0 (es decir, referencia); 0,05 mM; 0,1 mM; 0,2 mM; 0,4 mM; 0,6 mM; 0,8 mM; 1,0 mM. Tras la incubación cada muestra se enfría y el medio (1 ml) se pipetea en tubos separados que contienen [14C]estrona (7 \times 103 dpm) (actividad específica 97 Ci/moles de Amersham International Radiochemical Centre, Amersham, U.K.). La mezcla se agita intensamente durante 30 segundos con tolueno (5 ml). Los experimentos han demostrado que >90% de [14C]estrona y <0,1% de [3H]estrona-3-sulfato se elimina de la fase acuosa mediante este tratamiento. Una fracción (2 ml) de la fase orgánica se elimina, se evapora y se determina por espectrometría de centelleo el contenido de 3H y de 14C del residuo. Se calcula la masa de estrona-3-sulfato hidrolizada a partir de los recuentos de 3H obtenidos (corregidos para los volúmenes del medio y de la fase orgánica utilizada, y para recuperación de la [14C]estrona añadida) y la actividad específica del sustrato.

Modelo animal para ensayo para la determinación de la actividad de STS

Protocolo 3

Inhibición de la actividad de la estrona sulfatasa in vivo

Los compuestos de la presente invención pueden estudiarse utilizando un modelo animal, en particular en ratas ovarioectomizadas. En este modelo los compuestos que son estrógenos estimulan el crecimiento uterino.

El compuesto (10 mg/kg/día durante cinco días) se administró por vía oral a ratas, recibiendo otro grupo de animales vehículo (propilenglicol) solamente. Otro grupo recibió el compuesto EMATE por vía subcutánea en una cantidad de 10 \mug/día durante cinco días. Al final del estudio se obtuvieron muestras de tejido hepático y se ensayó la actividad de la estrona sulfatasa utilizando sulfato de 3H estrona como sustrato según se describió anteriormente (véase el documento PCT/GB95/02638).

Modelo animal de ensayo para la determinación de la actividad estrógena

Protocolo 4

Carencia de estrogenicidad in vivo

El compuesto (10 mg/kg/día durante cinco días) se administró por vía oral a ratas, recibiendo otro grupo de animales vehículo (propilenglicol) solamente. Otro grupo recibió el compuesto estrógeno EMATE por vía subcutánea en una cantidad de 10 \mug/día durante cinco días. Al final del estudio se obtuvieron úteros y se pesaron expresándose los resultados en peso uterino/peso corporal total \times 100.

Los compuestos que no presentan efecto significativo sobre el crecimiento uterino no son estrógenos.

Ensayos biotecnológicos para la determinación de la actividad de STS

Protocolo 5

La capacidad de los compuestos para inhibir la actividad de la estrona sulfatasa puede evaluarse también utilizando secuencias de aminoácido o secuencias de nucleótidos que codifican a STS, o fragmentos activos, derivados, homólogos o variantes de las mismas, por ejemplo en detecciones de alto rendimiento.

Puede utilizarse uno cualquiera o más de los objetivos apropiados, tal como una secuencia de aminoácidos y/o una secuencia de nucleótidos, para la identificación de un agente capaz de modular a STS en cualquier variedad de técnicas de identificación de fármacos. El objetivo empleado en dicha prueba puede estar libre en solución, fijado a un soporte sólido, soportado sobre una superficie celular o localizado intracelularmente. Puede medirse la supresión de la actividad del objetivo o la formación de complejos de enlace entre el objetivo y el agente que se está ensayando.

El análisis de la presente invención puede ser una identificación, mediante el cual se ensayan numerosos agentes. En un aspecto, el método de análisis de la presente invención es una identificación con alto rendimiento.

Las técnicas para la identificación de fármacos pueden basarse en el método descrito en Geysen, solicitud de patente europea 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984. En resumen, se sintetizan grandes cantidades de diferentes compuestos de ensayo de péptidos pequeños en un sustrato sólido, tales como alfileres de plástico o alguna otra superficie. Los compuestos del ensayo de péptidos se hacen reaccionar con una diana adecuada o fragmento de la misma y se lavan. Se detectan a continuación las entidades unidas, como por ejemplo por métodos que se adaptan de manera apropiada bien conocidos en la técnica. Una diana purificada también puede revestirse directamente sobre las placas para su utilización en técnicas de identificación de fármacos. Como alternativa, pueden utilizarse anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre un soporte sólido.

La presente invención también contempla la utilización de ensayos competitivos de identificación de fármacos en los que los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse a una diana compiten específicamente con un compuesto de ensayo para unirse a una diana.

Otra técnica de identificación proporciona identificación de alto rendimiento (HTS) de agentes con afinidad de enlace adecuada a los sustratos y se basa en el método descrito con detalle en el documento WO 84/03564.

Es de esperar que los métodos de ensayo de la presente invención sean adecuados para identificación tanto a pequeña como a gran escala de los compuestos de ensayo así como en análisis cuantitativos.

En un aspecto preferido, la presente invención se refiere a un método de identificación de agentes que modulan selectivamente a STS, cuyos compuestos presentan la fórmula (Ia).

Indicadores

Puede utilizarse una amplia variedad de indicadores en los métodos de análisis (así como identificaciones) de la presente invención con indicadores preferidos que proporcionan señales convenientemente detectables (por ejemplo, por espectroscopía). A título de ejemplo, un gen indicador puede codificar una enzima que cataliza una reacción que altera las propiedades de absorción de la luz.

Otros protocolos incluyen el ensayo inmunoabsorbente con enzima ligada (ELISA), radioinmunoanálisis (RIA) y clasificación celular fluorescente activada (FACS). Puede incluso utilizarse un inmunoanálisis monoclonal en dos puntos que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos con dos epítopos que no interfieren. Estos y otros análisis se describen, entre otros lugares, en Hampton R. et al. (1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN) y Maddox DE et al. (1983, J. Exp. Med. 15 8:121 1).

Ejemplos de moléculas indicadoras incluyen pero no se limitan a (\beta-galactosidasa, invertasa, proteína verde fluorescente, luciferasa, cloranfenicol, acetiltransferasa, (-) glucuronidasa, exoglucanasa y glucoamilasa. Por otra parte, pueden incorporarse nucleótidos radiomarcados o marcados con etiqueta fluorescente en transcritos activos que se identifican a continuación cuando se unen a sondas de oligonucleótido.

A título de otros ejemplos, numerosas compañías tales como Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) y U.S. Biochemical Corp. (Cleveland, OH) suministran kits comerciales y protocolos para procedimientos de análisis. Las moléculas o marcadores indicadores adecuados incluyen los radionucleidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromógenos así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares. Las patentes que dan a conocer la utilización de dichos marcadores incluyen la US-A-3.817.837; US-A-3.850.752; US-A-3.939.350;US-A-3.996.345; US-A-4.277.437; US-A-4.275.149 y US-A-4.366.241.

Células huésped

La expresión "célula huésped", en relación con la presente invención comprende cualquier célula que pudiera comprender la diana para el agente de la presente invención.

Por lo tanto, una forma de realización adicional de la presente invención proporciona células huésped transformadas o transfectadas con un polinucleótido que es o expresa a la diana de la presente invención. Preferentemente dicho polinucleótido se transporta en un vector para la replicación y expresión de los polinucleótidos que han de estar en la diana o han de expresar la diana. Las células se seleccionarán para que sean compatibles con dicho vector y por ejemplo pueden ser procarióticas (por ejemplo bacterianas), micóticas, levaduras o células vegetales.

La bacteria E. coli gram negativa es muy utilizada como anfitrión para la expresión del gen heterólogo. Sin embargo, grandes cantidades de proteína heteróloga tienden a acumularse en el interior de la célula. La purificación ulterior de la proteína deseada en el conjunto de las proteínas intracelulares de E. coli puede ser difícil a veces.

En contraste con E. coli, las bacterias del género Bacillus son muy adecuadas como anfitriones heterólogos debido a su capacidad para segregar proteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como anfitriones son las de los géneros Streptomyces y Pseudomonas.

Dependiendo de la naturaleza del polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente invención y/o de la conveniencia para el tratamiento adicional de la proteína expresada, anfitriones eucarióticos tales como levaduras u otros hongos pueden ser preferibles. En general, se prefieren células de levadura sobre las células de hongos porque son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas se segregan poco en la célula de levadura, o en algunos casos no se procesan adecuadamente (por ejemplo, hiperglucosilación en levaduras). En estos ejemplos, debería seleccionarse un organismo anfitrión micótico diferente.

Ejemplos de anfitriones con expresión adecuada dentro del alcance de la presente invención son los hongos tales como la especie Aspergillus (tales como los descritos en los documentos EP-A-0184438 y EP-A-0284603) y la especie Trichoderma; bacterias tales como la especie Bacillus (tales como los descritas en los documentos EP-A-0134048 y EP-A-0253455), especie Streptomyces y especie Pseudomonas; y levaduras tales como la especie Kluyveromyces (tales como los descritos en los documentos EP-A-0096430 y EP-A-0301670) y especie de Saccharomyces. A título de ejemplo, los anfitriones con expresión típica pueden seleccionarse de entre Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus orvzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis y Saccharomyces cerevisiae.

La utilización de células huésped adecuadas, tales como células huésped de levaduras, de hongos y vegetales, pueden proporcionar modificaciones después de la traducción (por ejemplo miristoilación, glucosilación, truncado, lapidación y fosforilación de tirosina, serina o treonina) a medida que pueda necesitarse para comunicar una actividad biológica óptima en los productos con expresión recombinante de la presente invención.

Organismo

El término "organismo" en relación con la presente invención comprende cualquier organismo que pudiera comprender la diana según la presente invención y/o productos obtenidos a partir de ésta. Ejemplos de organismos pueden incluir un hongo, levadura o una planta.

La expresión "organismo transgénico" en relación con la presente invención incluye cualquier organismo que comprenda la diana según la presente invención y/o los productos obtenidos.

Transformación de células huésped/organismos huésped

Como se indicó al principio, el organismo huésped puede ser un organismo procariótico o eucariótico. Ejemplos de huéspedes procarióticos adecuados incluyen E. coli y Bacillus subtilis. Lo dado a conocer sobre la transformación de huéspedes procarióticos está bien documentado en la técnica, por ejemplo véase Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y Ausubel et al., Current Protocols in molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.

Si se utiliza un huésped procariótico entonces puede ser necesario modificar de manera adecuada la secuencia de nucleótidos antes de la transformación, tal como mediante la eliminación de intrones.

En otra forma de realización el organismo transgénico puede ser una levadura. A este respecto, la levadura se ha utilizado también ampliamente como vehículo para la expresión génica heteróloga. Las especies Saccharomyces cerevisiae tienen unos antecedentes de hace tiempo de utilización industrial, incluyendo su utilización para la expresión génica heteróloga. La expresión de los genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae ha sido estudiada por Goodey et al. (1987, Yeast Biotechnology, D. R. Berry et al., eds., págs. 401-429, Allen y Unwin, Londres) y por King et al. (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E. F. Walton y G. T. Yarronton, eds., págs. 107-133, Blackie, Glasgow).

Por varias razones Saccharomyces cerevisiae es muy adecuada para la expresión del gen heterólogo. En primer lugar, no es patógena para el hombre y es incapaz de producir determinadas endotoxinas. En segundo lugar, tienen unos antecedentes de hace tiempo de utilización segura después de siglos de explotación comercial para varios fines. Esto ha conducido a una gran aceptabilidad pública. En tercer lugar, la utilización comercial extensa y las investigaciones dedicadas al organismo ha producido una abundancia de conocimiento acerca de la genética y fisiología así como características de fermentación a gran escala de Saccharomyces cerevisiae.

Un estudio de los principios de la expresión génica heteróloga en Saccharomyces cerevisiae y de la secreción de los productos génicos se proporciona en E. Hinchcliffe E. Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, vol. 5, Anthony H. Rose y J. Stuart Harrison, eds. 2ª edición, Academic Press
Ltd.).

Están disponibles varios tipos de vectores de levadura, incluyendo los vectores integradores, que requieren combinación con el genoma huésped para su mantenimiento y vectores de plásmido que se replican de manera autó-
noma.

A fin de preparar el Saccharomyces transgénico, los montajes de expresión se preparan insertando la secuencia de nucleótidos en un montaje diseñado para la expresión en levaduras. Se han desarrollado varios tipos de montajes utilizados para la expresión heteróloga. Los montajes contienen un activador activo en levadura fusionada a la secuencia de nucleótidos, normalmente un activador de origen levadura, tal como el activador GAL1, se utilizan. Normalmente se utiliza una secuencia señal de origen levadura tal como la secuencia que codifica el péptido señal SUC2. Un terminador activo en la levadura finaliza el sistema de expresión.

Para la transformación de la levadura se han desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo, puede prepararse un Saccharomyces transgénico según la presente invención siguiendo lo dado a conocer por Hinnen et al. (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J. D. (1978, Nature, Londres, 275, 104); e Ito, H. et al. (1983, J. Bacteriology 153, 163-168).

Se seleccionan células de levadura transformadas utilizando varios marcadores selectivos. Entre los marcadores utilizados para la transformación están numerosos marcadores auxótrofos tales como LEU2, HIS4 y TRP1 y marcadores dominantes con resistencia a antibióticos tales como los marcadores para antibiótico con aminoglucósido, por ejemplo G418.

Otro organismo huésped es un vegetal. El principio básico en la construcción de plantas modificadas genéticamente consiste en insertar la información genética en el genoma de la planta a fin de mantener un mantenimiento estable del material genético insertado. Existen varias técnicas para insertar la información genética, siendo los dos principios principales la introducción directa de la información genética y la introducción de la información genética mediante la utilización de un sistema de vector. Un estudio de las técnicas generales puede encontrarse en los artículos de Potrykus (Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant mol. Biol. [1991] 42:205-225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech marzo/abril de 1994 17-27). Las directrices adicionales sobre la transformación de vegetales pueden encontrarse en el documento EP-A-0449375.

Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método de transformación de una célula huésped con una secuencia de nucleótidos que ha de estar en la diana o es para expresar la diana. Las células huésped transformadas con la secuencia de nucleótidos pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína codificada. La proteína producida por una célula recombinante puede desplegarse en la superficie de la célula. Si se desea, y como entenderán los expertos en la materia, los vectores de expresión que contienen secuencias de codificación pueden diseñarse con secuencias señal que dirigen la secreción de las secuencias de codificación a través de una determinada membrana celular procariótica o eucariótica. Otros montajes recombinantes pueden unir la secuencia de codificación a la secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de polipéptido que facilitará la purificación de las proteínas solubles (Kroll DJ et al. (1993) DNA Cell Biol. 12:441-53).

Variantes/homólogos/derivados

Además de las secuencias específicas de aminoácidos y de las secuencias de nucleótido mencionadas en la presente memoria, la presente invención también comprende la utilización de variantes, homólogos y derivados de las mismas. Aquí, el término "homología" puede considerarse equivalente a "identidad".

En el presente contexto, se considera que una secuencia homóloga incluye una secuencia de aminoácidos que puede ser por lo menos 75, 85 o 90% idéntica, preferentemente por lo menos 95 o 98% idéntica. Aunque la homología puede también considerarse en términos de similitud (es decir restos de aminoácidos con propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar homología en términos de identidad de secuencia.

Las comparaciones de homologías pueden realizarse a simple vista, o más habitualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas de ordenador disponibles en el mercado pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias.

El % de homología puede calcularse sobre secuencias contiguas, es decir una secuencia se alinea con otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un resto de una vez. Esto se denomina una alineación "sin huecos". Típicamente, dichas alineaciones sin huecos se realizan solamente sobre un número relativamente corto de restos.

Aunque éste es un método muy simple y coherente, no puede tener en consideración que, por ejemplo, en un par de secuencias idéntico por lo demás, una inserción o deleción dará lugar a que los restos de aminoácidos siguientes se coloquen fuera de la alineación, resultando de este modo potencialmente una gran reducción en el % de homología cuando se realiza una alineación global. Por consiguiente, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias se diseñan para producir alineaciones óptimas que tengan en consideración posibles inserciones y deleciones sin penalizar excesivamente la puntuación global de la homología. Esto se consigue insertando "huecos" en la alineación de la secuencia para tratar de maximizar la homología local.

Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones de hueco" a cada hueco que se produce en la alineación de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, una alineación de secuencia con tan pocos huecos como sea posible (reflejando la relatividad mayor entre las dos secuencias comparadas) conseguirá una puntuación mayor que una con muchos huecos. Se utilizan típicamente "costes afines del hueco" que cargan un coste relativamente alto para la existencia de un hueco y una penalización más pequeña para cada resto ulterior en el hueco. Éste es el sistema de puntuación de huecos utilizado más frecuentemente. Las penalizaciones grandes del hueco producirán desde luego alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de los programas de alineación permiten modificar las penalizaciones del hueco. Sin embargo, es preferible utilizar valores por defecto cuando se utiliza dicho programa informático para las comparaciones de la secuencia. Por ejemplo cuando se utiliza el paquete GCG Wisconsin Bestfit (véase a continuación) la penalización del hueco por defecto para las secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada extensión.

El cálculo del % de homología máximo por lo tanto requiere en primer lugar la producción de una alineación óptima, teniendo en consideración las penalizaciones por hueco. Un programa informático adecuado para realizar dicha alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Ejemplos de otro programa informático que pueden realizar las comparaciones de la secuencia incluyen, pero no se limitan al paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999 ibid. - capítulo 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. mol. Biol., 403-410) y la continuación GENEWORKS de herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para la investigación fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al. 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo es preferible utilizar el programa GCG Bestfit. Una referencia útil adicional es la encontrada en FEMS Microbiol Lett 15 de mayo de 1999; 174(2):247-50 (y una fe de erratas publicada aparece en FEMS Microbiol Lett 1 de agosto de 1999; 177(1):187-8).

Aunque el % de homología final puede medirse en términos de identidad, el proceso de alineación propio no está típicamente basado en una comparación del par todo o nada. En su lugar, se utiliza generalmente una matriz de puntuación de similitud a escala para asignar puntuaciones a cada comparación por pares basada en la similitud química o en la distancia evolutiva. Un ejemplo de dicha matriz utilizada normalmente es la matriz BLOSUM62, matriz por defecto para la continuación de BLAST de los programas. Los programas GCG Wisconsin utilizan generalmente los valores públicos por defecto o una tabla de comparación de símbolos habituales si se suministra (véase el manual de usuario para más detalles). Es preferible utilizar los valores públicos por defecto para el paquete GCG, o en caso de otro programa informático, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.

Una vez el programa informático ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el % de homología, preferentemente el % de identidad de secuencia. El programa informático normalmente realiza esto como parte de la comparación de la secuencia y genera un resultado numérico.

Las secuencias pueden presentar también deleciones, inserciones o sustituciones de restos de aminoácidos que producen un cambio imperceptible y dan como resultado una sustancia funcionalmente equivalente. Pueden hacerse sustituciones de aminoácidos deliberadas basándose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o la naturaleza anfótera de los restos siempre que se conserve la actividad de enlace secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa comprenden el ácido aspártico y el ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente comprenden lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos con cabeza polar no cargados con valores de hidrofilia similares comprenden leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.

Pueden hacerse sustituciones conservadoras, por ejemplo según la Tabla siguiente. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma línea en la tercera columna pueden sustituirse entre sí:

\newpage

Alifático	No polar	G A P
		I L V
	Polar no cargado	C S T M
		N Q
	Polar cargado	D E
		K R
Aromático		H F W Y

Vectores de expresión

La secuencia de nucleótidos para su utilización como diana o para expresar la diana puede incorporarse en un vector recombinante replicable. El vector puede utilizarse para replicar y expresar la secuencia de nucleótidos en una célula huésped compatible y/o desde ésta. La expresión puede controlarse utilizando secuencias de control que comprenden activadores/potenciadores y otras señales de regulación de la expresión. Pueden utilizarse activadores procarióticos y activadores funcionales en las células eucarióticas. Pueden utilizarse activadores específicos del tejido o específicos de estímulos. pueden también utilizarse activadores híbridos que comprenden elementos de la secuencia procedentes de dos o más activadores diferentes descritos anteriormente.

La proteína producida por una célula huésped recombinante por expresión de la secuencia de nucleótidos puede segregarse o puede estar contenida intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o del vector utilizado. Las secuencias de codificación pueden diseñarse con secuencias que dirigen la secreción de las secuencias de codificación de la sustancia a través de una determinada membrana celular procariótica o eucariótica.

Proteínas de fusión

La secuencia de aminoácidos diana puede producirse como una proteína de fusión, por ejemplo para ayudar en la extracción y purificación. Ejemplos de socios de proteína de fusión incluyen la glutation-S-transferasa (GST), 6\timesHis, GAL4 (dominios de unión al ADN y/o de activación de la transcripción) y (-)galactosidasa. Puede ser conveniente también incluir un punto de escisión proteolítico entre el socio de la proteína de fusión y la secuencia de proteínas de interés para permitir la eliminación de las secuencias de la proteína de fusión. Preferentemente la proteína de fusión no impedirá la actividad de la diana.

La proteína de fusión puede comprender un antígeno o un determinante antigénico fusionado con la sustancia de la presente invención. En esta forma de realización, la proteína de fusión puede ser una proteína de fusión no natural que comprende una sustancia que puede actuar como adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmunitario. El antígeno o determinante antigénico puede estar unido al terminal amino o carboxi de la sustancia.

En otra forma de realización de la invención, la secuencia de aminoácidos puede estar ligada a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para el cribado de bancos de péptido por agentes capaces de afectar la actividad de la sustancia, puede ser útil codificar una sustancia híbrida que exprese un epítopo heterólogo que es reconocido por un anticuerpo disponible en el mercado.

Terapia

Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse como agentes terapéuticos, es decir en aplicaciones terapéuticas.

El término "terapia" incluye los efectos curativos, los efectos de alivio y los efectos profilácticos.

La terapia puede ser en personas o animales, preferentemente animales hembra.

Composiciones farmacéuticas

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica, que comprende un compuesto según la presente invención y opcionalmente un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable (incluyendo las combinaciones de los mismos).

Las composiciones farmacéuticas pueden ser para uso humano o animal en medicina humana y veterinaria y comprenderán típicamente uno cualquiera o más de entre un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los portadores o diluyentes aceptables para utilización terapéutica son bien conocidos en la técnica farmacéutica y están descritos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). La elección del portador, excipiente o diluyente farmacéutico puede seleccionarse con respecto a una vía de administración deseada y a la práctica farmacéutica normal. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender tanto, o además, el portador, excipiente o diluyente cualquier o cualesquiera aglutinante(s), lubricante(s), agente(s) de suspensión, agente(s) de recubrimiento, agente(s) de solubilización adecuado(s).

Pueden proporcionarse conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso los agentes potenciadores de sabor en la composición farmacéutica. Ejemplos de conservantes incluyen el benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres del ácido p-hidroxibenzoico. También pueden utilizarse antioxidantes y agentes de suspensión.

Pueden existir diferentes requisitos de composición/formulación dependientes de los diferentes sistemas de administración. A título de ejemplo, la composición farmacéutica de la presente invención puede formularse para ser administrada utilizando una minibomba o por vía de mucosas, por ejemplo, como atomizador nasal o aerosol para inhalación o solución ingerible, o por vía parenteral en la cual la composición se formula mediante una forma inyectable, para administración, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Como alternativa, la formulación puede diseñarse para ser administrada por ambas vías.

Cuando el agente debe administrarse por vía de mucosas a través de la mucosa gastrointestinal, debería ser capaz de permanecer estable durante el tránsito a través del aparato digestivo; por ejemplo, podría ser resistente a la degradación proteolítica, estable a pH ácido y resistente a los efectos detergentes de la bilis.

Cuando proceda, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por inhalación, en forma de supositorio u óvulo vaginal, por vía tópica en forma de loción, solución, crema, pomada o polvos, mediante la utilización de un parche cutáneo, por vía oral en forma de comprimidos que contienen excipientes tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos ya sean solos o mezclados con excipientes, o en forma de elixires, soluciones o suspensiones que contienen agentes potenciadores del sabor o colorantes, o pueden inyectarse por vía parenteral, por ejemplo por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Para la administración parenteral, las composiciones pueden utilizarse mejor en forma de solución acuosa esterilizada que puede contener otras sustancias, por ejemplo suficientes sales o monosacáridos para preparar la solución isotónica con la sangre. Para la administración bucal o sublingual las composiciones pueden administrarse en forma de comprimidos o pastillas que pueden formularse de manera convencional.

Combinación farmacéutica

El compuesto de la presente invención puede utilizarse en combinación con uno o otros agentes activos más, tal como uno u otros agentes farmacéuticamente activos más.

A título de ejemplo, los compuestos de la presente invención pueden utilizarse en combinación con otros inhibidores de STS y/o otros inhibidores tal como un inhibidor de aromatasa (tal como por ejemplo, 4-hidroxiandrostenodiona (4-OHA)) y/o esteroides, tal como los esterneuroesteroides naturales sulfato de deshidroepiandroesterona (DHEAS) y sulfato de pregnenolona (PS) y/o otros compuestos orgánicos similares estructuralmente. Ejemplos de otros inhibidores de STS pueden encontrarse en las referencias anteriores. A título de ejemplo, los inhibidores de STS para su utilización en la presente invención incluyen EMATE, y uno de los dos o ambos compuestos 2-etil y 2-metoxi 17-desoxi que son análogos al compuesto 5 presentado en la presente memoria.

Asimismo, o como alternativa, el compuesto de la presente invención puede utilizarse en combinación con un modificador de la respuesta biológica.

La expresión modificador de la respuesta biológica ("BRM") comprende citocinas, moduladores inmunitarios, factores de crecimiento, factores reguladores de la hematopoyesis, factores estimulantes de colonias, factores quimiotácticos, hemolíticos y trombolíticos, receptores de la superficie celular, ligandos, moléculas de adhesión a leucocitos, anticuerpos monoclonales, vacunas preventivas y terapéuticas, hormonas, componentes de la matriz extracelular, fibronectina, etc. Para algunas aplicaciones, preferentemente, el modificador de la respuesta biológica es una citocina. Ejemplos de citocinas incluyen: interleucinas (IL), tal como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-19; factor de necrosis tumoral (TNF), tal como TNF-\alpha; Interferón alfa, beta y gamma; TGF-\beta. Para algunas aplicaciones, la citocina es preferentemente el factor de necrosis tumoral (TNF). En algunas aplicaciones, el TNF puede ser cualquier tipo de TNF, tal como TNF-\alpha, TNF-\beta, incluyendo los derivados o mezclas de los mismos. Más preferentemente la citocina es TNF-\alpha. Las directrices sobre TNF pueden encontrarse en la técnica, tal como el documento WO-A-98/08870 y el documento WO-A-98/13348.

Administración

Típicamente, un médico determinará la dosis actual que será la más adecuada para cada paciente y variará con la edad, peso y respuesta del paciente en concreto. Las dosificaciones siguientes son a título de ejemplo del caso medio. Pueden, desde luego, existir casos individuales en los que se merezcan intervalos de dosificación mayores o menores.

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse por inyección directa. La composición puede formularse para administración parenteral, por mucosas, intramuscular, intravenosa, subcutánea, intraocular o transdérmica. Dependiendo de la necesidad, el agente puede administrarse a una dosis comprendida entre 0,01 y 30 mg/kg de peso corporal, tal como entre 0,1 y 10 mg/kg, más preferentemente entre 0,1 y 1 mg/kg de peso corporal.

A título de ejemplo adicional, los agentes de la presente invención pueden administrarse de acuerdo con un régimen de 1 a 4 veces al día, preferentemente una a dos veces al día. El nivel de la dosis específica y la frecuencia de dosificación para cualquier paciente particular puede variarse y dependiendo de una variedad de factores que comprenden la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y la longitud de acción de este compuesto, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, modo y tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación farmacéutica, la gravedad de la enfermedad concreta y la terapia que experimenta el huésped.

Aparte de los modos típicos de administración, indicados anteriormente, el término "administrado" también comprende la administración por técnicas tales como la transfección mediada por lípidos, liposomas, inmunoliposomas, lipofectina, anfóteros faciales catiónicos (CFA) y combinaciones de los mismos. Las vías de dichos mecanismos de administración incluyen pero no se limitan a las vías a través de las mucosas, nasal, oral, parenteral, gastrointestinal, tópica o sublingual.

El término "administrado" incluye pero no se limita a la administración por vía de las mucosas, por ejemplo, como atomizador nasal o aerosol para inhalación o como solución ingerible; una vía parenteral en la que la administración es mediante una forma inyectable, tal como, por ejemplo, una vía intravenosa, intramuscular o subcutánea.

Por lo tanto, para la administración farmacéutica, los inhibidores de STS de la presente invención pueden formularse en cualquier manera adecuada que utilice técnicas de formulación farmacéutica convencionales y portadores, adyuvantes, excipientes, diluyentes farmacéuticos, etc. y normalmente para administración parenteral. Las cantidades de dosis efectiva aproximadas pueden estar comprendidas en el intervalo entre 1 y 1.000 mg/día, tal como entre 10 y 900 mg/día o incluso desde 100 a 800 mg/día dependiendo de las actividades individuales de los compuestos en cuestión y para un paciente de peso corporal (70 kg) promedio. Las cantidades de dosificación usuales para los compuestos preferidos y más activos estarán comprendidas en el intervalo entre 200 y 800 mg/día, más preferentemente 200 a 500 mg/día, aún más preferentemente entre 200 y 250 mg/día. Pueden administrarse en regímenes de dosis unitarias, regímenes de dosis divididas y/o en regímenes de dosis múltiples que duran varios días. Para la administración oral pueden formularse en comprimidos, cápsulas, solución o suspensión que contiene entre 100 y 500 mg del compuesto por dosis unitaria. Como alternativa y preferentemente los compuestos se formularán para administración parenteral en un portador adecuado parenteralmente administrable y paraproporcionar cantidades de dosis diarias individuales comprendidas en el intervalo de 200 a 800 mg, preferentemente de 200 a 500, más preferentemente de 200 a 250 mg. Dichas dosis diarias eficaces variarán, sin embargo, dependiendo de la actividad inherente del ingrediente activo y del peso corporal del paciente, estando dichas variaciones dentro de la experiencia y criterio del
médico.

Ciclo celular

Los compuestos de la presente invención pueden ser útiles en el método de tratamiento de un trastorno del ciclo celular.

Como se expuso en "Molecular Cell Biology" 3ª ed. Lodish et al. páginas 177-181 diferentes células eucarióticas pueden crecer y dividirse a velocidades completamente diferentes. Las células de levadura, por ejemplo, pueden dividirse cada 120 min., y las primeras divisiones de huevos fertilizados en las células embrionarias de erizos de mar e insectos tardaron solamente 1.530 min. debido a que se subdivide una gran célula preexistente. Sin embargo, la mayoría de las plantas en crecimiento y de las células animales tardan 10 a 20 horas en duplicarse y algunos duplicados a mucha menor velocidad. Muchas células en adultos, tal como las células nerviosas y las células del músculo estriado, no se dividen completamente; otras, como los fibroblastos que asisten en la cicatrización de heridas, crecen bajo demanda pero están por lo demás latentes.

Aún así, cada célula eucariótica que se divide debe estar dispuesta para donar el material genético igual a dos células hermanas. La síntesis del ADN en eucariotas no tiene lugar en todo el ciclo de la división celular pero está restringida a una parte de su anterior división celular.

La relación entre la síntesis del ADN eucariótico y la división celular ha sido analizada a fondo en cultivos de células de mamífero que eran capaces todos de crecimiento y división. En contraste con las bacterias, se encontraron células eucarióticas que pasan solamente una parte de su tiempo en la síntesis del ADN, y se completa horas antes de la división celular (mitosis). Por lo tanto, un intervalo de tiempo trascurre después de la síntesis del ADN y antes de la división celular; se halló que otro intervalo trascurre después de la división y antes de la ronda siguiente de síntesis de ADN. Este análisis conduce a la conclusión de que el ciclo celular eucariótico consta de una fase M (mitósica), una fase G_{1} (el primer intervalo), la fase S (síntesis del ADN), una fase G_{2} (el segundo intervalo) y vuelve a M. Las fases entre mitosis (G_{1}, S y G_{2}) son conocidas colectivamente como interfase.

Muchas células que no se dividen en los tejidos, por ejemplo, todos los fibroblastos potentes (suspenden el ciclo tras la mitosis y justo antes de la síntesis del ADN); tales como células "en descanso" se dice que han salido del ciclo celular y están en el estado G_{0}.

Es posible identificar células cuando están en una de las tres etapas de la interfase del ciclo celular, utilizando un clasificador celular fluorescente activado (FACS) para medir su contenido relativo en ADN: una célula que está en G_{1} (antes de la síntesis del ADN) tiene una cantidad x definida de ADN; durante S (replicación del ADN) tiene entre x y 2x; y cuando en G_{2} (o M) tiene 2x del ADN.

Las etapas de la mitosis y de la citocinesis en una célula animal son las siguientes:

(a) Interfase. La etapa G_{2} de la interfase precede inmediatamente al comienzo de la mitosis. El ADN cromosómico se ha replicado y unido a la proteína durante la fase S, pero no se observan todavía cromosomas como estructuras diferenciadas. El nucleolo es la única estructura nuclear que es visible al microscopio óptico. En una célula diploide antes de la replicación del ADN existen dos cromosomas morfológicos de cada tipo, y la célula se dice que es 2n. En G_{2}, después de la replicación del ADN la célula es 4n. Existen cuatro copias de cada ADN microsómico. Como los cromosomas hermanos no se han separado todavía entre sí, se denominan cromátidas hermanos.

(b) Profase inicial. Los centriolos, cada uno con un centriolo hijo recién formado, comienza a moverse hacia los polos opuestos de la célula; los centrosomas pueden observarse como filamentos alargados. La membrana nuclear comienza a desagregarse en vesículas pequeñas.

(c) Profase media y última. La condensación del cromosoma se completa; cada estructura de cromosoma visible se compone de dos cromátidas mantenidas unidas a sus centrómeros. Cada cromátida contiene una de las dos moléculas de ADN hijas recién replicadas. El huso microtubular comienza a radiar en las zonas precisamente adyacentes a los centriolos, que se mueven más cerca de sus polos. Algunas fibras del huso alcanzan de polo a polo; la mayoría va a las cromátidas y se une en los cinetocoros.

(d) Metafase. Los cromosomas se mueven hacia el ecuador de la célula, donde se alinearán en el plano ecuatorial. Las cromátidas hermanas no se han separado todavía.

(e) Anafase. Las dos cromátidas hermanas se separan en cromosomas independientes. Cada una contiene un centrómero que está unido a una fibra del huso a un polo, en el cual se mueve. De este modo una copia de cada cromosoma se da a cada célula hija. Simultáneamente la célula se alarga, a medida que lo hacen los husos de polo a polo. La citocinesis comienza a medida que empieza a formarse la escisión del surco.

(f) Telofase. Se forman nuevas membranas alrededor de los núcleos hijos; se desenredan los cromosomas y se hacen menos diferenciados, el nucleolo se vuelve visible de nuevo y la membrana nuclear se forma alrededor de cada núcleo hijo. La citocinesis es casi completa y desaparece el huso a medida que se despolimerizan los microtúbulos y otras fibras. En toda la mitosis el centriolo "hijo" en cada polo se desarrolla hasta su longitud completa. En la telofase se completa la duplicación de cada uno de los centrilos originales y se generarán nuevos centriolos hijos durante la siguiente interfase.

(g) Interfase. En la terminación de la citocinesis, la célula se introduce en la fase G_{1} del ciclo celular y procede de nuevo alrededor del ciclo.

Debe apreciarse que el ciclo celular es un proceso celular sumamente importante. Las desviaciones del ciclo celular normal pueden producir numerosos trastornos médicos. El ciclo celular aumentado y/o no limitado puede producir cáncer. El ciclo celular reducido puede producir enfermedades degenerativas. La utilización del compuesto de la presente invención puede proporcionar un medio para tratar dichos trastornos y enfermedades.

Por lo tanto, el compuesto de la presente invención puede ser adecuado para su utilización en el tratamiento de los trastornos del ciclo celular tales como cánceres, incluyendo los cánceres dependientes de hormonas e independientes de hormonas.

Además, el compuesto de la presente invención puede ser adecuado para el tratamiento de cánceres tales como el cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, sarcomas, melanomas, cáncer de próstata, cáncer pancreático, etc. y otros tumores sólidos.

En algunas aplicaciones, el ciclo celular se inhibe y/o impide y/o interrumpe, preferentemente en las que el ciclo celular está impedido y/o interrumpido. En un aspecto el ciclo celular puede estar inhibido y/o impedido y/o interrumpido en la fase G_{2}/M. En un aspecto el ciclo celular puede estar irreversiblemente impedido y/o inhibido y/o interrumpido, preferentemente en el que el ciclo celular está irreversiblemente impedido y/o interrumpido.

La expresión "irreversiblemente impedido y/o inhibido y/o interrumpido" significa que después de la aplicación de un compuesto de la presente invención, en la eliminación del compuesto los efectos del compuesto, a saber la prevención y/o inhibición y/o interrupción del ciclo celular, son todavía observables. Más particularmente la expresión "irreversiblemente impedido y/o inhibido y/o detenido" significa que cuando se analizó según el protocolo del ensayo del ciclo celular presentado en la presente memoria, las células tratadas con un compuesto de interés presentan menos crecimiento después de la etapa 2 del protocolo I que las células de referencia. Los detalles en este protocolo se presentan a continuación.

Por lo tanto, la presente invención proporciona compuestos que: producen inhibición del crecimiento de las células de cáncer de mama positivas al receptor del estrógeno (ER+) y negativas a ER (ER-) in vitro mediante prevención y/o inhibición y/o interrupción del ciclo celular; y/o producen regresión de los tumores de mamífero producidos por la nitroso-metil urea (NMU) en los animales íntegros (es decir no ovarioctomizados) y/o impedir y/o inhibir y/o detener el ciclo celular en células cancerosas; y/o actuar in vitro para impedir y/o inhibir y/o interrumpir el ciclo celular y/o actuar como un agonista del ciclo celular.

Ensayo de ciclo celular

Protocolo 6

Procedimiento

Etapa 1

Se siembran células MCF-7 de cáncer de mama en placas de cultivo multipocillo a una densidad de 105 células/pocillo. Se dejan las células adherirse y desarrollarse hasta aproximadamente el 30% de confluencia cuando se tratan de la forma siguiente:

Referencia - sin tratamiento

Compuesto de interés (COI) 20 \mum

Se cultivan las células durante 6 días en medio de cultivo que contiene el COI con cambios de medio/COI cada 3 días. Al final de este periodo se cuenta el número de células utilizando un contador de células Coulter.

Etapa 2

Después del tratamiento de las células durante un periodo de 6 días con las células COI se vuelven a sembrar a una densidad de 10^{4} células/pocillo. No se añaden más tratamientos. Se deja que las células continuen desarrollándose durante 6 días más en presencia de medio de cultivo. Al final de este periodo el número de células se cuenta de nuevo.

Análisis para determinar la actividad de dh utilizando células cancerosas

Protocolo 7

Se midió la conversión de estrona a estradiol (E1 \rightarrow E2, E2DH tipo I) y estradiol a estrona (E2 \rightarrow E1, E2DH tipo II) en monocapas de células íntegras de células de cáncer de mama T47D y MDA-MB-231 respectivamente. Se cultivaron las células en matraces hasta que fueron confluentes del 80 al 90%. Se añadieron ^{3}H-E1 o ^{3}H-E2 (6 pmoles, \sim90 Ci/mmoles) a cada matraz en ausencia (referencia) o presencia de varios compuestos de la prueba (10 \mum) en 2,5 ml de medio. Se añadió también sustrato a los matraces sin células y se incubó en paralelo (blancos).

Después de la incubación con células T47D durante 30 min. o de células MDA durante 3 h. a 37ºC, se añadieron 2 ml del medio a los tubos de ensayo que contenían ^{14}C-E2 o ^{14}C-E1 (\sim5.000 cpm) y 50 \mug de E2 o E1 respectivamente. Se extrajeron los esteroides del medio acuoso con éter dietílico (4 ml). Se decantó la fase etérea en tubos separados después de congelar la fase acuosa en una mezcla sólida de dióxido de carbono-metanol. Se evaporó el éter a sequedad bajo una corriente de aire a 40ºC. Se disolvió el residuo en un volumen pequeño de éter dietílico y se aplicó a las placas TLC que contienen un indicador fluorescente. Se separaron E1 y E2 por TLC utilizando DCM-acetato de etilo (4:1 v/v). La posición del producto en cada matraz de incubación se marcó en la placa de TLC después de observación bajo luz UV. Las zonas marcadas se cortaron y se colocaron en viales de centelleo que contenían metanol (0,5 ml) para eluir el producto. Se calculó la cantidad de producto con ^{3}H formado y ^{14}C-E1 o ^{14}C-E2 recuperado después de la espectrometría de centelleo. Se corrigieron las pérdidas del procedimiento en la cantidad de producto formado y el número de células en cada matraz.

Cáncer

Como se indica, los compuestos de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento de un trastorno cíclico celular. Un trastorno cíclico celular concreto es el cáncer.

El cáncer continúa siendo la causa principal de mortalidad en la mayoría de los países occidentales. Las terapias contra el cáncer desarrolladas hasta ahora han incluido el bloqueo de la acción o la síntesis de hormonas para inhibir el crecimiento de los tumores dependientes de hormonas. Sin embargo, actualmente se emplea una quimioterapia más agresiva para el tratamiento de los tumores independientes de hormonas.

Por lo tanto, el desarrollo de un producto farmacéutico para el tratamiento anticanceroso de tumores dependientes de hormonas y/o independientes de hormonas, que carezca todavía de algunos o todos de los efectos secundarios asociados a la quimioterapia, representaría un avance terapéutico principal.

Es conocido que los estrógenos experimentan numerosas reacciones de hidroxilación y conjugación después de su síntesis. Hasta ahora se creía que dichas reacciones formaban parte de un proceso metabólico que proporcionaba finalmente estrógenos solubles en agua y aumentaba su eliminación del cuerpo. Actualmente es evidente que algunos hidroximetabolitos (por ejemplo 2-hidroxi y 16alfa-hidroxi) y conjugados (por ejemplo sulfato de estrona, E1S) son importantes en la determinación de algunas de las acciones complejas que los estrógenos presentan en el cuerpo.

Los investigadores han investigado la formación de estrógenos 2- y 16-hidroxilados en relación con las enfermedades que alteran el riesgo de cáncer de mama. Existen actualmente pruebas de que los factores que aumentan la actividad de 2-hidroxilasa están asociados a un riesgo de cáncer reducido, mientras que los que aumentan la hidroxilación en 16alfa pueden aumentar el riesgo de cáncer de mama. El interés adicional en la función biológica de los metabolitos estrógenos ha sido estimulado por el cuerpo creciente de la prueba de que 2-metoxiestradiol es un metabolito endógeno con propiedades antimitóticas. 2-MeOE2 se forma a partir de 2-hidroxi estradiol (2-OHE2) por la catecol estrógeno metiltransferasa, una enzima que está ampliamente distribuida en todo el cuerpo.

Los investigadores han demostrado que 2-MeOE2 inhibe in vivo el desarrollo de tumores que aparecen en la inyección subcutánea de sarcoma Meth A, melanoma B16 o las células de cáncer de mama negativas al receptor del estrógeno (ER-) MDA-MB-435. También inhibe la proliferación y migración de las células endoteliales y la angiogénesis in vitro. Se sugirió que la capacidad de 2-MeOE2 para inhibir el crecimiento tumoral in vivo puede ser debida a su capacidad para inhibir la angiogénesis provocada por el tumor en lugar de la inhibición directa de la proliferación de células tumorales.

El mecanismo por el cual 2-MeOE2 ejerce sus potentes efectos antimitógeno y antiangiógeno está siendo aclarado todavía. Existen pruebas de que a altas concentraciones puede inhibir la polimerización microtubular y actuar como un inhibidor débil de colchicina que se une a tubulina. Recientemente, sin embargo, a concentraciones que bloquean la mitosis, no se encontraron filamentos de tubulina en las células que deben despolimerizarse pero que presentan una morfología idéntica a la observada después del tratamiento con taxol. Es posible, por consiguiente, que como taxol, fármaco que se utiliza para la terapia de cáncer de mama y de ovario, 2-MeOE2 actúe estabilizando la dinámica microtubular.

Aunque la identificación de 2-MeOE2 como una nueva terapia para el cáncer representa un importante avance, la biodisponibilidad de los estrógenos administrados por vía oral es escasa. Además, pueden experimentar metabolismo extenso durante su primer paso a través del hígado. Como parte de un programa de investigación para desarrollar un inhibidor de sulfatasa esteroidea para la terapia del cáncer de mama, se identificó la estrona-3-O-sulfamato (EMATE) como un potente inhibidor activo dirigido al sitio. De manera inesperada, EMATE demostró poseer potentes propiedades estrógenas con su actividad uterótrofa oral en ratas que son 100 veces mayores que la del estradiol. Su aumento de estrogenicidad se cree que procede de la absorción por los glóbulos rojos (rdc) que le protegen de la inactivación durante el paso a través del hígado y que actúan como depósito para su liberación lenta durante un periodo prolongado de tiempo. Se sintetizaron numerosos análogos modificados por el anillo A y se probaron, incluyendo 2-metoxiestrona-3-O-sulfamato. Aunque este compuesto era equipotente con EMATE como un inhibidor de sulfatasa esteroidea, estaba desprovisto de estrogenicidad.

Los autores creen que el compuesto de la presente invención proporciona un medio para el tratamiento de cánceres y, especialmente, del cáncer de mama.

Además o como alternativa el compuesto de la presente invención puede ser útil en el bloqueo del crecimiento de cánceres incluyendo las leucemias y tumores sólidos tales como tumores de mama, de endometrio, de próstata, de ovario y pancreático.

Terapia referente a estrógenos

Los autores consideran que algunos de los compuestos de la presente invención pueden ser útiles en el control de las concentraciones de estrógenos en el cuerpo, en particular en hembras. Por este motivo, algunos de los compuestos pueden ser útiles proporcionando un medio de control de fertilidad, tal como un comprimido, píldora, solución o pastilla anticonceptivo oral. Como alternativa, el compuesto puede estar en forma de implante o de parche.

Por lo tanto, los compuestos de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades hormonales asociadas a estrógenos.

Además o como alternativa el compuesto de la presente invención puede ser útil en el tratamiento de enfermedades hormonales además de las asociadas a estrógenos. Por lo tanto, el compuesto de la presente invención puede también ser capaz de afectar la actividad hormonal y puede también ser capaz de afectar a una respuesta inmunitaria.

Enfermedades neurodegenerativas

Los autores consideran que algunos de los compuestos de la presente invención pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y afecciones similares.

A título de ejemplo, se considera que los inhibidores de STS pueden ser útiles en la potenciación de la función de la memoria de pacientes que padecen de enfermedades tales como la amnesia, las lesiones cerebrales, la enfermedad de Alzheimer, la demencia epiléptica, la demencia presenil, la demencia postraumática, la demencia senil, la demencia vascular y la demencia tras la apoplejía o los individuos que de otro modo buscan la potenciación de la memoria.

TH1

Los autores consideran que algunos de los compuestos de la presente invención pueden ser útiles en implicaciones de TH1.

A título de ejemplo, se considera que la presencia de los inhibidores de STS en el macrófago o en otras células que presentan al antígeno puede conducir a una disminución de capacidad de los linfocitos T sensibilizados para montar una respuesta a TH1 (IL-2 alto, IFN\gamma bajo en IL-4). Por consiguiente predominaría la influencia reguladora normal de otros esteroides tales como los glucocorticoides.

Enfermedades inflamatorias

Los autores consideran que algunos de los compuestos de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento de las enfermedades inflamatorias, tales como las enfermedades asociadas con una cualquiera o más de entre las siguientes: autoinmunidad, incluyendo por ejemplo, artritis reumatoide, diabetes tipo I y II, lupus eritematoso diseminado, esclerosis múltiple, miastenia grave, tiroiditis, vasculitis, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, trastornos de la piel, por ejemplo, psoriasis y dermatitis de contacto; enfermedad injerto contra huésped; eccema; asma y rechazo del órgano después del trasplante.

A título de ejemplo, se considera que los inhibidores de STS pueden impedir el efecto fisiológico normal de DHEA o de los esteroides relacionados sobre las respuestas inmunitaria y/o inflamatoria.

Los compuestos de la presente invención pueden ser útiles para la preparación de un medicamento para poner de manifiesto un efecto de tipo glucocorticoide endógeno.

Otras terapias

Se entiende también que el compuesto/composición de la presente invención puede tener otras implicaciones médicas importantes.

Por ejemplo, el compuesto o composición de la presente invención puede ser útil en el tratamiento de los trastornos mencionados en el documento WO-A-99/52890, a saber:

Además o como alternativa, el compuesto o composición de la presente invención puede ser útil en el tratamiento de los trastornos mencioandos en el documento WO-A-98/05635. Con el fin de facilitar su referencia, parte de esta lista se proporciona ahora: cáncer, inflamación o enfermedad inflamatoria, trastornos dermatológicos, fiebre, efectos cardiovasculares, hemorragia, coagulación y respuesta en fase aguada, caquexia, anorexia, infección aguda, infección por VIH, estados de choque, reacciones injerto contra huésped, enfermedad autoinmunitaria, lesión por reperfusión, meningitis, jaqueca y antitrombosis dependiente de la aspirina; crecimiento tumoral, invasión y diseminación, angiogénesis, metástasis, cáncer, ascitis y efusión pleural maligna, isquemia cerebral, cardiopatía isquémica, osteoartritis, artritis reumatoide, osteoporosis, asma, esclerosis múltiple, neurodegeneración, enfermedad de Alzheimer, aterosclerosis, apoplejía, vasculitis, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa; periodontitis, gingivitis; psoriasis, dermatitis atópica, úlceras crónicas, epidermólisis vesicular; ulceración corneal, retinopatía y cicatrización quirúrgica de heridas; rinitis, conjuntivitis alérgica, eccema, anafilaxis, restenosis, insuficiencia cardiaca congestiva, endometriosis, aterosclerosis o endosclerosis.

Asimismo, o como alternativa, el producto o composición de la presente invención puede ser útil en el tratamiento de trastornos enumerados en el documento WO-A-98/07859. Con el fin de facilitar su referencia, parte de lo que se relaciona se proporciona a continuación: citocina y proliferación celular/actividad de diferenciación; actividad inmunosupresora o inmunoestimulante (por ejemplo, para tratar la insuficiencia inmunitaria, incluyendo la infección con el virus de la insuficiencia inmunitaria humana; regulación del crecimiento de linfocitos; tratamiento del cáncer y muchas enfermedades autoinmunitarias, y para impedir el rechazo del trasplante o provocar inmunidad tumoral); regulación de la hematopoyesis (por ejemplo, tratamiento de enfermedades mieloides o linfoides; estimular el crecimiento del hueso, del cartílago, del tendón, de ligamentos y del tejido nervioso, por ejemplo para la curación de heridas, tratamiento de quemaduras, úlceras y enfermedad periodontal y neurodegeneración; inhibición de la activación de la hormona estimulante del folículo (modulación de la fertilidad); actividad quimiotáctica/quimiocinética (por ejemplo para movilizar los tipos de células específicos a las zonas de lesión o infección); actividad hemostática y trombolítica (por ejemplo para tratar la hemofilia y la apoplejía); actividad antiinflamatoria (para el tratamiento por ejemplo del choque séptico o de la enfermedad de Crohn); como antimicrobianos; moduladores por ejemplo de metabolismo o del comportamiento; como analgésicos; tratamiento específico de los trastornos de insuficiencia; tratamiento por ejemplo de la psoriasis, en medicina humana o veterinaria.

Asimismo, o como alternativa, la composición de la presente invención puede ser útil en el tratamiento de trastornos enumerados en el documento WO-A-98/09985. Con el fin de facilitar su referencia, parte de esta lista se proporciona a continuación: macrófago inhibidor y/o actividad inhibidora de linfocitos T y por lo tanto, actividad antiinflamatoria, actividad autoinmunitaria, es decir efectos inhibidores contra una respuesta celular y/o inmunitaria humoral, incluyendo una respuesta no asociada a la inflamación; inhiben la capacidad de los macrófagos y linfocitos T para adherirse a los componentes de la matriz extracelular y a la fibronectina, así como la expresión del receptor fas regulado por incremento en los linfocitos T; inhiben la reacción inmunitaria indeseable y la inflamación incluyendo la artritis, que incluye artritis reumatoide, inflamación asociada con hipersensibilidad, reacciones alérgicas, asma, lupus eritematoso diseminado, enfermedades del colágeno y otras enfermedades autoinmunitarias, inflamación asociada a la aterosclerosis, arteriosclerosis, cardiopatía aterosclerótica, lesión por reperfusión, paro cardiaco, infarto de miocardio, trastornos inflamatorios vasculares, síndrome de la disnea respiratoria u otras enfermedades cardiopulmonares, inflamación asociada a la úlcera péptica, colitis ulcerosa y otras enfermedades del aparato digestivo, fibrosis hepática, cirrosis hepática u otras enfermedades hepáticas, tiroiditis u otras enfermedades glandulares, glomerulonefritis u otras enfermedades renales y urológicas, otitis u otras enfermedades otorrinolaringológicas, dermatitis u otras enfermedades dérmicas, enfermedades periodontales u otras enfermedades dentales, orquitis o epidídimo-orquitis, infertilidad, trauma orquídeo u otras enfermedades testiculares inmunorrelacionadas, disfunción de la placenta, insuficiencia de la placenta, aborto habitual, eclapsia, preeclamsia y otras enfermedades ginecológicas inmunitarias y/o inflamatorias, uveítis posterior, uveítis intermedia, uveítis anterior, conjuntivitis, coriorretinitis, uveorretinitis, neuritis óptica, inflamación intraocular, por ejemplo retinitis o edema macular cistoide, oftalmia simpática, escleritis, retinitis pigmentosas, componentes inmunitarios e inflamatorios de la enfermedad degenerativa del fondo, componentes inflamatorios del trauma ocular, inflamación ocular producida por infección, vitreorretinopatías proliferantes, neuropatía óptica isquémica aguda, cicatrización excesiva, por ejemplo, tras la operación de filtración del glaucoma, la reacción inmunitaria y/o de inflamación contra implantes oculares y otras enfermedades oftálmicas inmunitarias e inflamatorias, inflamación asociada a las enfermedades o afecciones o trastornos autoinmunitarios en la que, tanto el sistema nervioso central (SNC) como cualquier otro órgano, la supresión inmunitaria y/o la inflamación serían beneficiosas, la enfermedad de Parkinson, complicación y/o efectos secundarios del tratamiento de la enfermedad de Parkinson, demencia compleja relacionada con el SIDA, encefalopatía relacionada con VIH, enfermedad de Devic, corea de Sydenham, enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades, afecciones o trastornos degenerativos del SNC, componentes inflamatorios de apoplejía, síndrome posterior a la polio, componentes inmunitarios e inflamatorios de trastornos psiquiátricos, mielitis, encefalitis, panencefalitis esclerosante subaguda, encefalomielitis, neuropatía aguda, neuropatía subaguda, neuropatía crónica, síndrome de Guillaim-Barre, corea de Sydenham, miastenia grave, encefalitis pseudotumoral, síndrome de Down, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, componentes inflamatorios de la compresión del SNC o del traumatismo del SNC o de las infecciones del SNC, componentes inflamatorios de las atrofias y distrofias musculares y enfermedades inmunitarias e inflamatorias de los sistemas nervioso central y periférico, inflamación postraumática, choque séptico, enfermedades infecciosas, complicaciones inflamatorias o efectos secundarios de la cirugía, trasplante de médula ósea u otras complicaciones y/o efectos secundarios del trasplante, complicaciones inflamatorias y/o inmunitarias y efectos secundarios de la terapia génica, por ejemplo debido a la infección con un portador vírico, o a la inflamación asociada al SIDA, para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria humoral y/o celular, para tratar o mejorar las enfermedades proliferantes por monocitos o leucocitos, por ejemplo leucemia, reduciendo la cantidad de monocitos o leucocitos, para la prevención y/o tratamiento del rechazo del trasplante en los casos de trasplante de células naturales o artificiales, tejido y órganos tales como la córnea, médula ósea, órganos, cristalinos, marcapasos, tejido de piel natural o artificial.

Preparación del compuesto sulfamato

Los compuestos de sulfamato de la presente invención pueden prepararse haciendo reaccionar un alcohol apropiado con un cloruro adecuado. A título de ejemplo, los compuestos de sulfamato de la presente invención pueden prepararse haciendo reaccionar un alcohol apropiado con un cloruro de sulfamoílo adecuado, de fórmula R^{4}R^{5}NSO_{2}Cl.

Las condiciones típicas para realizar la reacción son las siguientes.

Se añaden hidruro de sodio y cloruro de sulfamoílo a una solución agitada del alcohol en dimetilformamida anhidra a 0ºC. Posteriormente, la reacción se deja calentar a temperatura ambiente tras lo cual se continúa la agitación durante 24 horas más. La mezcla de reacción se vierte en una solución saturada fría de bicarbonato de sodio y la fase acuosa resultante se extrae con diclorometano. Los extractos orgánicos combinados se secan sobre mgSO_{4} anhidro. La filtración seguida de evaporación del disolvente al vacío y evaporado conjuntamente con tolueno proporciona un residuo en bruto que se purifica más por cromatografía de flash.

Preferentemente, el alcohol se modifica, cuando proceda, antes de la reacción con el cloruro de sulfamoílo. Cuando sea necesario, los grupos funcionales en el alcohol pueden protegerse de manera conocida y el grupo o grupos protectores se eliminan al final de la reacción.

Preferentemente, los compuestos de sulfamato se preparan según lo dado a conocer por Page et al. (1990 Tetrahedron 46; 2059-2068).

Los compuestos de fosfonato pueden prepararse combinando de manera adecuada lo dado a conocer por Page et al. (1990 Tetrahedron 46; 2059-2068) y el documento PCT/GB92/01586.

Los compuestos de sulfonato pueden prepararse adaptando de manera adecuada lo dado a conocer por Page et al. (1990 Tetrahedron 46; 2059-2068) y el documento PCT/GB92/01586.

Los compuestos de tiofosfonato pueden prepararse combinando de manera adecuada lo dado a conocer por Page et al. (1990 Tetrahedron 46; 2059-2068) y el documento PCT/GB91/00270.

Las preparaciones preferidas se presentan también en el texto siguiente.

Sumario

En resumen, la presente invención proporciona compuestos para su utilización como inhibidores de sulfatasa esteroidea y/o inhibidores esteroide deshidrogenasa y composiciones farmacéuticas para los mismos.

Ejemplos

La presente invención se describirá a continuación únicamente a título de ejemplo.

Ejemplo

Se estudió la inhibición de E1S \rightarrow E1 para numerosos compuestos. El grado de inhibición se determinó según los Protocolos definidos en la presente memoria. Los datos obtenidos se presentan a continuación en forma de Tabla 1. En cada análisis se introdujo también Cumato 667 como referencia. Se proporcionan también los grados correspondientes de inhibición para este compuesto.

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Se proporcionan a continuación las estructuras de los compuestos adicionales según la presente invención y citadas en la presente memoria.

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Los compuestos adicionales según la presente invención se sintetizaron y se obtuvieron los datos biológicos en los siguientes estudios.

Estudios adicionales

Se han desarrollado asimismo moléculas que combinan propiedades tanto de los inhibidores de STS como de los inhibidores HSD (y en algunos aspectos antiestrógenos). Basándose en el hecho de que una cadena lateral de alquilamida puede bloquear la activación del receptor de estrógeno,^{23} se han sintetizado los derivados 3-O-sulfamatos de estradiol que llevan cadenas laterales de 17\beta-(N-alquilcarbamoil) y 17\beta-(N-alcanoil).^{24} El grupo alquil/alcanoil se diseña como zona de inserción de la membrana que debería aumentar la afinidad por la enzima y disminuir la estrogenicidad por el esteroide. Las nuevas moléculas representan agente terapéutico potencial para el tratamiento de HDBC ya que se observó que la actividad de los análogos 1 y 2 de heptilo (a continuación) era similar a la del EMATE con respecto a la inhibición de la sulfatasa de estrona, sin ser estrógena.

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Estructuras de 3-O-sulfamatos-C17-derivados de estrona que llevan cadenas laterales de N-alquilcarbamoilo.

Aunque la investigación en el área de STS ha generado varios inhibidores muy potentes, uno de los cuales se está introduciendo en la clínica, el diseño del inhibidor 17\beta-HSD continúa siendo un campo todavía maduro para el desarrollo. Para los autores, el 16\alpha-(bromopropil)-estradiol es el inhibidor más potente de 17\beta-HSD de tipo 1, lo que sugiere que el anillo D del esqueleto esteroideo puede desempeñar un papel principal en el reconocimiento del sustrato por la enzima. Sin embargo, el 16\alpha-(bromopropil)-estradiol es estrógeno y la mayoría de los intentos para reducir su estrogenicidad ha fracasado o dado como resultado una disminución de su actividad.

Un inhibidor potente de 17\beta-HSD de tipo 1, exento de actividad agonista pero que posee actividad antiestrógena, sería un nuevo tipo de agente para el tratamiento de HDBC ya que actuaría como supresor doble de la síntesis y acción del estrógeno. Se propone por consiguiente que los intentos para desarrollar dicho agente podrían enfocarse alrededor de las propiedades estructurales de 3 (o 4) con la adición de algunas modificaciones específicas que aspiran a producir propiedades no estrógenas o antiestrógenas.

A fin de reducir la afinidad de la molécula diana del receptor del estrógeno y minimizar las probabilidades producidas por el agonismo del estrógeno por el fármaco, se propuso sustituir la función 17\beta-hidroxilo por un grupo carbonilo. El estradiol presenta realmente un efecto proliferante mayor de 10 veces en las células tumorales del pulmón que la estrona lo que sugiere la estrogenicidad de los compuestos 17\beta-hidroxilados.^{33} La optimización de las propiedades no estrógenas de estos compuestos puede también realizarse introduciendo una función metoxi en la posición 2 del anillo A ya que los 2-metoxiestrógenos son conocidos por ser menos estrógenos que sus estrógenos precursores. Pudieron también comunicar propiedades adicionales a los compuestos diana ya que pueden inhibir el crecimiento del tumor y la angiogénesis.^{34}

Aunque la cadena lateral en el anillo D tenía que conservarse ya que es responsable de la actividad, la estrategia para producirla tenía que permitir más versatilidad lo que sugiere la necesidad de modificar el propio anillo D. Las cadenas laterales que deben introducirse incluyen los grupos alquilo cortos a largos o los sustituyentes hidrófobos voluminosos cuyos efectos sobre la actividad de la enzima pueden estar relacionados con la presencia/ausencia de una cavidad hidrófoba. Otros tipos de cadenas laterales tales como los grupos bromoalquilo o ciclopropilo pudieron interactuar potencialmente con un resto de aminoácido nucleófilo de la cadena activa y las instauraciones pudieron comunicar rigidez a las cadenas laterales cuya orientación en la zona activa debe ser un factor determinante para la inhibición de la enzima.

A fin de conseguir estos requisitos resumidos anteriormente, se propuso el compuesto 5 (a continuación) como un buen candidato. Un anillo D modificado estructuralmente, proporciona un método nuevo para la inhibición de 17\beta-HSD de tipo 1 que presenta también la ventaja sobre el anterior derivado de estradiol de permitir una introducción muy fácil de cadenas laterales en el átomo N-imido del anillo D. Puede también ser accesible en una etapa desde el ácido bencil marrianólico^{35} que se ha sintetizado en el grupo de los autores en otro proyecto.

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3-hidroxi-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imido, 5 (R = R' = H) y sus precursores (R = cadena lateral y R´= H o SO_{2}NH_{2}).

Estrategias de síntesis

Para crear una relación de actividad estructural para la familia de moléculas procedentes de 5, tendría que desarrollarse una serie de reacciones de síntesis eficaz, permitiendo una introducción fácil y eficaz de una amplia variedad de cadenas laterales en el anillo D.

El método más lógico, que permite la versatilidad durante la síntesis de las dianas, consiste en considerar la introducción de las cadenas laterales en el anillo D después de su conversión en un grupo piperidindiona. Se propuso por consiguiente que, una vez protegido en su posición C3, el compuesto 5 sería un producto intermedio clave para la síntesis de las dianas ya que la introducción de las cadenas laterales puede realizarse fácilmente en una etapa mediante la N-alquilación. La desprotección posterior y sulfamoilación proporcionarían a continuación los compuestos fenólicos y los derivados de sulfamatos finales. Suponiendo que el producto intermedio clave (enmarcado) sea accesible partiendo de la estrona, en el Esquema 1 se propone una serie de reacciones de síntesis en
bruto.

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Esquema 1

Método de síntesis propuesto para acceder a las moléculas diana de estrona disponible en el mercado

26

P = grupo protector, R = cadena lateral, R' = H o SO_{2}NH_{2}.

(a) modificación, protección del anillo D; (b) alquilación; (c) desprotección, sulfamoilación.

La utilización de transposiciones para modificar el anillo D de los esteroides se ha descrito con frecuencia en la bibliografía. Jindal et al. han propuesto el acceso al derivado acetilado de 5 a partir de una transposición de Beckmann de la 16-oximino-estrona 6 (Esquema 2)^{37}, que los autores decidieron investigar.

Esquema 2

Método de la bibliografía para la síntesis de 7

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Reactivos: (a) KOC(CH_{3})_{3}, (CH_{3})_{2}CH(CH_{2})_{2}ONO; (b) Ac_{2}O/ACOH, a reflujo.

Se realizó la desprotonación de la estrona a temperatura ambiente bajo la acción del terc-butóxido de potasio, recién preparado disolviendo potasio metálico en 2-metil-propan-2-ol anhidro. La adición de un exceso de nitrito de isoamilo proporcionó la cetooxima 6 con un rendimiento del 63%. La transposición de Beckmann de esta última se realizó en condiciones de reflujo de una mezcla de ácido acético y anhídrido acético, para dar 7, aislado con un rendimiento del 57%.

Se demostró completamente la estructura modificada del anillo D de 7 y se confirmó utilizando métodos espectroscópicos. Las bandas de vibración características para el sistema imida se presentan a 1.725 y 1.690 cm^{-1} en el espectro IR del compuesto y el protón intercambiable de NH apareció a 10,64 ppm como un singlete en el espectro de ^{1}H RMN. Los carbonos cuaternarios C17 y C18 presentaban unos desplazamientos químicos campo abajo característicos a 171,9 y 178,7 ppm en el espectro de ^{13}C RMN.

Aunque la transposición de Beckmann de 6 presenta la ventaja del rendimiento del producto intermedio 7 en dos etapas a partir de estrona, el rendimiento global (36%) es algo pobre, aunque comparable con los descritos en la literatura. Se decidió por consiguiente desarrollar otra estrategia que proporcionaría 7 en rendimientos mucho mayores.

Las modificaciones del anillo D a través de su escisión posterior y cierre se propusieron como alternativa para acceder a los derivados de 5. El anillo D de la estrona protegida puede realmente abrirse mediante la reacción con haloformo^{35} y se cerró por condensación térmica con una amina para proporcionar derivados de estrona con anillo D de piperidindiona. El Esquema 3 resume la serie de reacciones prevista así como las cadenas laterales que deben introducirse por N-alquilación.

Esquema 3

Método alternativo para la síntesis de 10-21 mediante el ácido bencil marrianólico 9

28

Reactivos: (a) NaH/DMF, BnBr, 80ºC; (b) I_{2}, KOH, MeOH luego reflujo de KOH; (c) urea, 180ºC; (d) NaH/DMF, RX; (e) RNH_{2}, 180ºC; (f) Pd/C, H_{2}, MeOH/THF; (g) CISO_{2}NH_{2}/DMA.

Haciendo reaccionar bencil-estrona 8, que se preparó fácilmente por bencilación de estrona, con un exceso de base (hidróxido de potasio) y yodo, la función metilencetona se bis-halogenó, a continuación se escindió. Se consiguió la conversión completa en el ácido dicarboxílico calentando a reflujo en una solución concentrada de KOH. El ácido bencil marrianólico 9, que se aisló con un rendimiento optimizado del 75%, se sometió a continuación a una ciclación térmica en presencia de urea. Esta reacción de condensación, que conduce a la formación de un anillo de 6 elementos favorecido, tiene lugar cuando se calientan los reactivos a 180ºC durante un corto periodo de tiempo. El esteroide 10 modificado por el anillo D resultante se obtuvo con alto rendimiento (80 a 89%) dando un rendimiento global para la síntesis del producto intermedio 10 de 55%. Por lo tanto, a pesar de la presencia de una etapa adicional, este método alternativo representa una mejora significativa sobre el método de la bibliografía.

Ya que las imidas son bases demasiado débiles para atacar los haluros de alquilo, deben primero transformarse en sus bases conjugadas antes de experimentar la N-alquilación. Con esta finalidad, se desprotonó 10 utilizando hidruro de sodio en DMF antes de reaccionar, mediante probablemente una reacción S_{N}2, con varios agentes alquilantes. Siguiendo este método, se han introducido con éxito un gran número de cadenas laterales. Se obtuvieron los compuestos 11-21 con rendimientos comprendidos entre 75 y el 97% y un tiempo de reacción medio de 2 horas.

Los compuestos N-alquilados pueden también ser directamente accesibles desde el ácido bencil marrianólico cuando este último se calienta en presencia de una alquilamina. El derivado 21 (R = bencilo) se sintetizó de esta manera, sin embargo, el rendimiento de la reacción fue moderado (65%). Se propuso por lo tanto que el método directo del BMA se emplease cuando excepcionalmente los haluros de alquilo no estén disponibles en el mercado o se estimen que no son reactivos con respecto a la N-alquilación de 10.

El éter bencílico de los compuestos 11-21 se escindió a continuación por hidrogenación catalítica utilizando Pd/C para dar la serie de dianas hidroxiladas 22-32 con altos rendimientos.

Para la introducción de las cadenas laterales insaturadas, habría de desarrollarse otra estrategia ya que la última etapa del Esquema 3 implica una hidrogenólisis que es probablemente para desbencilar e hidrogenar el grupo insaturado simultáneamente. Aunque se ha informado de algunos métodos selectivos para la reducción de la función hidroxilo protegida por bencilo, la proteccion de 5 con el grupo terc-butil-dimetilsililo antes de la N-alquilación es un método alternativo eficaz sencillo.

Se realizó la protección de la función fenol de 5 en presencia de cloruro de terc-butil-dimetilsililo e imidazol mediante la formación de una especie reactiva intermedia. La alquilación del compuesto 33 protegido resultante con bromuro de alilo proporcionó fácilmente 34, que se desprotegió con fluoruro de tetrabutilamonio. Este método particular (Esquema 4), desarrollado para la introducción de un grupo alilo, sería también aplicable para producir otros grupos insaturados en el átomo de N.

Esquema 4

Síntesis del derivado N-alilo de 5

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Reactivos: (a) TBDMSCI/imidazol, DMF; (b) NaH/DMF, CH_{2}CHCH_{2}Br; (c) TBAF/THF.

Se realizó la sulfamoilación de los compuestos hidroxilados siguiendo un procedimiento reciente descrito por Okada et al.^{39} en el cual la sulfamoilación de los compuestos fenólicos se realiza en el disolvente aprótico dimetilacetamida en ausencia de base. En general, este método, que requiere solamente un ligero exceso de cloruro de sulfamoílo, proporciona un rendimiento mejor de sulfamatos que el procedimiento habitual en el que se emplean NaH/DMF. Se propone que DMF pueda experimentar una reacción secundaria con cloruro de sulfamoílo, que no puede producirse con DMA, debido a la indisponibilidad de un protón del formilo. Se observó también que la eliminación de una base en las condiciones de reacción conduce a los mayores rendimientos y que probablemente DMA actuó como base moderada.

Siguiendo un procedimiento desarrollado en el grupo de los autores, se sulfamoilaron los derivados hidroxilados 5, 22-32 y 35 en presencia de 2,2 equivalentes de cloruro de sulfamoílo en DMA. Se obtuvieron los compuestos 36-48 en su mayoría con altos rendimientos tras un periodo corto de reacción. Sin embargo, la sulfamoilación de 28 ha de realizarse según el método inicial NaH/DMF ya que se produjo una reacción secundaria entre la cadena lateral de bromobutilo y el cloruro de sulfamoílo cuando DMA era el disolvente. Inesperadamente, se observó que el producto secundario era un sulfamato de 5 que lleva una cadena lateral de clorobutilo. El análisis HPLC del producto en bruto demostró que el producto secundario se formó en las mismas proporciones que el producto 43 esperado. A pesar de la presencia de dos picos bien separados a 5,5 min. y 6,50 min. (elución con MeOH/H_{2}O 68:32) en la serie de HPLC, fracasó el intento para separar ambos productos por cromatografía de flash o recristalización. Por consiguiente se aislaron utilizando HPLC de preparación y se caracterizaron por ^{1}H RMN y espectroscopía de masas de precisión.

Al realizar la reacción utilizando NaH/DMF y 6 equivalentes de cloruro de sulfamoílo, se aisló 43 con un rendimiento del 81% como único producto de la reacción. En esta reacción, el cloro resultante del ataque nucleófilo del ión fenolato sobre el cloruro de sulfamoílo está ocluido con HCl y por consiguiente es incapaz de reaccionar con la cadena lateral de bromobutilo.

Por último, se sintetizaron un derivado 2-metoxi de 5 y su sulfamato siguiendo la misma secuencia de reacción que la descrita en el Esquema 3, partiendo de 2-metoxi-estrona. Este último se preparó según una síntesis en dos etapas eficaz desarrollada en el grupo de los autores, donde la introducción de un grupo metoxi en la posición 2 se basa en el desplazamiento nucleófilo de un átomo de halógeno por un anión metóxido.

Con esta finalidad, se preparó 2-yodo-estrona 49 tratando la estrona con acetato mercúrico y yodo en ácido acético.^{40} La halogenación selectiva en la posición 2 se terminó a las dos horas a temperatura ambiente con un rendimiento global del 56% después de sucesivas recristalizaciones. Se hizo reaccionar a continuación 2-yodo-estrona con un exceso grande de una solución recién preparada de metóxido de sodio, en presencia de cloruro de cobre en piridina a reflujo^{41} y proporcionó 2-metoxi-estrona 50 con un rendimiento del 75%. Este método presenta la ventaja de no implicar ningún grupo protector y proporciona un buen rendimiento global (42%) para la síntesis de 2-metoxi-estrona en dos etapas de estrona.

Después de la bencilación, el compuesto 51 resultante se sometió a la reacción de haloformo. Una solubilidad limitada de 51 en metanol condujo a un rendimiento escaso, no optimizado del 18% para la síntesis de 52. El cierre del anillo en presencia de urea proporcionó 53 con un rendimiento del 59% y la desprotección ulterior proporcionó los productos finales 54. La sulfamoilación de 54 se tuvo que realizar utilizando NaH/DMF con un gran exceso de cloruro de sulfamoílo ya que se observó la falta de reactividad cuando se realizó la reacción en DMA. Esto puede ser debido al impedimento estérico de la posición 3 debido a la presencia del grupo metoxi en la posición 2.

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Esquema 5

Síntesis del derivado 2-metoxi de 5 y su sulfamato

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Reactivos: (a) Hg(OAc)_{2}, I_{2}, AcOH/THF; (b) CuCl_{2}/piridina, NaOMe, a reflujo;

(c) KOC(CH_{3})_{3}/DMF, BnBr; (d) I_{2}, KOH, MeOH después KOH a reflujo; (e) urea, 180ºC;

(f) Pd/C, H_{2}, MeOH/THF; (g) CISO_{2}NH_{2}/DMA.

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Resultados y exposición

Se presentan a continuación los datos de inhibición in vitro de la actividad de sulfatasa para los compuestos 36, 37, 39, 41, 45 y 47. Se observa que los restantes compuestos son inhibidores de STS. Se observa también que cada uno de los compuestos descritos en la presente memoria inhiben HSD.

Se examinó la capacidad de los compuestos 36, 37, 39, 41, 45 y 47 para inhibir la actividad de estrona sulfatasa en los microsomas de placenta humana. La incubación de [^{3}H]-estrona a microsomas de la placenta con o sin el inhibidor a varias concentraciones, seguida de aislamiento del producto mediante extracción en tolueno proporcionó los resultados presentados en la Tabla 2. A título de comparación, se incluyó además la actividad de EMATE en los diferentes análisis. Se calcularon también los valores de IC_{50}, que se utilizan para comparar las potencias inhibidoras de estos esteroides modificados en el anillo D.

TABLA 2 % de inhibición a diferentes concentraciones y valores de IC_{50} para la inhibición de la sulfatasa esteroidea de la placenta humana para varios esteroides modificados en el anillo D

Compuesto	Media del % de inhibición \pm SD
	0,1 nm	1 nm	10 nm	100 nm	1 \mum	10 \mum	IC_{50} (nM)
EMATE	-	-	-	-	-	-	8
36	-6,5\pm3,6	-2,5\pm3,0	17,4\pm32,3	72,6 + 3,1	93,8\pm4,2	98,7\pm2,7	20
37	4,7\pm3,0	15,0\pm2,6	46,4\pm6,0	81,9 + 3,3	96,4\pm5,1	99,1\pm0,2	12
39	21,2\pm0,8	49,3\pm1,2	64,1\pm4,6	84,6 + 1,3	96,8\pm0,8	99,3\pm1,1	1
41	2,9\pm3,6	-11,2\pm7,8	-5,1\pm4,0	41,3 + 3,3	90,7\pm1,6	98,5\pm0,5	150

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De los diferentes compuestos probados, los esteroides que llevan un grupo propilo, un bencilo y un 2-metil piridilo en el átomo de nitrógeno del anillo D de la piperidin diona fueron los más potentes con IC50 entre 1 nm y 3 nm. Por lo tanto ellos son más potentes que el EMATE, en particular con el compuesto 45 que es 18 veces más potente. El compuesto 36, que no presenta sustitución en el átomo N y 37 el derivado N-metílico no fueron tan potentes como 39. Sus valores IC50 de 20 nm y 12 nm respectivamente sugieren sin embargo que sus potencias son similares a las del EMATE. Inesperadamente, el compuesto 41, cuya cadena lateral es un grupo n-pentilo, presentó una disminución drástica en la potencia con un valor de IC50 de 150 nm. Esta pérdida de potencia es algo pronunciada lo que sugiere que la enzima no está adaptada para ningún sustituyente N hidrófobo largo y es muy sensible al cambio de su
tamaño.

A partir de los diferentes datos obtenidos para las cadenas laterales lineales de alquilo, se ha dibujado un gráfico con la relación de la actividad estructural limitada (Figura 2 - Relación actividad-estructura para diversas longitudes de la cadena lateral frente la inhibición de la conversión de sulfato de estrona en la estrona cataliza por sulfatasa esteroidea), en la que la IC_{50} de cada compuesto se representa en función del número de átomos de carbono en la cadena lateral. Esto subraya claramente la diferencia de actividad entre el compuesto 41 y el grupo de compuestos 36, 37 y 39.

La pérdida de actividad observada para 41 es algo inesperada ya que la mayoría de los inhibidores esteroideos potentes de STS son, como 41, derivados de EMATE y contienen cadenas laterales hidrófobas voluminosas. El ejemplo más reciente lo constituyen los derivados 3-O-sulfamatos de estradiol que llevan una cadena lateral de 17\beta-alquilamida (1 y 2) cuya actividad se observó que era óptima cuando el grupo alquilo estaba en el resto heptilo. Su potencia, similar a la del EMATE, subraya claramente la presencia de una cavidad hidrófoba en el punto activo de la enzima correspondiente con la dirección del sustituyente 17\beta.

Una inhibición más débil de STS por 41 por consiguiente sugiere que la orientación de la cadena lateral situada en el átomo N del anillo D (de 6 elementos), es bastante diferente a la de la cadena lateral 17\beta de 1 o 2 (anillo D de 5 elementos) para producir una disminución de afinidad con el punto activo de la enzima. Se puede proponer que, aunque exista una cavidad hidrófoba en el punto activo de la enzima para los sustituyentes en 17\beta, la configuración del punto activo alrededor de la posición N de un anillo de 6 elementos podría ser más restrictiva para los sustituyentes voluminosos. Para corroborar esta hipótesis, el modelado molecular constituiría una herramienta de
selección.

A fin de aclarar la orientación de los átomos en el anillo D y en la cadena lateral, así como de reunir los datos para posibles estudios de modelado molecular futuros, se determinó la estructura cristalina del derivado 39 de estrona muy potente. Se utilizó para la recogida de datos un cristal (dimensiones aprox. 0,20\times0,17\times0,08 mm) obtenido en la recristalización lenta en acetona/hexano.

Se presenta a continuación la representación ORTEP de la unidad asimétrica de 41 junto con el esquema de marcado utilizado. El grupo sulfamato, los cuatro anillos, y las propiedades clave del anillo D modificado son claramente visibles. Como era de esperar, el anillo D está en conformación de media silla ya que la función imida conlleva la posición de los átomos C13, C17, N y C1' así como C15, C16, N y C1' en el mismo plano.

31

Esquema ORTEP de la estructura cristalina por rayos X de 41. Los elipsoides se muestran en xx% de nivel de probabilidad.

Al comparar con la representación ORTEP de la estructura cristalina por rayos X de EMATE,^{42} parece claramente que la orientación C17\beta de EMATE y la orientación N-alquílica del anillo de 6 elementos de 41 son diferentes, interactuando por consiguiente con diferentes áreas del punto activo de STS.

La buena inhibición de STS por 45, y en menor extensión por 47, parece indicar la presencia de un área de enlace hidrófobo en el punto activo, aun cuando no parece ser adaptable a un grupo pentilo. Sin embargo, es conocido también que los grupos bencilo (y los grupos relacionados con bencilo) son más hidrófobos y menos restrictivos estéricamente con un total de 7 carbonos que constituirían una cadena lateral lineal de heptilo. Esto podría explicar la diferencia de potencia entre los compuestos 45 o 47 y 41, todos con sustituyentes hidrófobos. La actividad mayor obtenida para 45 podría sugerir también la presencia de donantes de enlace de hidrógeno entre los restos de aminoácidos del punto activo.

Son necesarios, por consiguiente, resultados biológicos adicionales para interpretar totalmente los datos obtenidos hasta ahora. La actividad de los compuestos 38, 40 y 42 (derivados de etilo, butilo y hexilo respectivamente) representarían los datos útiles que deben permitir la interpretación de los valores IC_{50} obtenidos hasta ahora desde el punto de vista de la configuración del punto activo.

Por el momento, los parámetros de la estructura cristalina de 41 serán útiles en la exploración de las interacciones de este tipo de molécula con proteínas por modelado molecular asistido por ordenador y asisten el diseño de nuevas moléculas potentes.

Sumario

El cáncer de mama es la enfermedad de mayor importancia en Europa y en Norteamérica. En Gran Bretaña, mata más gente que cualquier otro tipo de cáncer. El cáncer de mama dependiente de hormonas representa aproximadamente dos tercios de estos casos en la mujer posmenopáusica, corresponde a un tipo de cáncer de mama en el que los tumores dependen de estrógenos para su crecimiento y desarrollo.

La terapia endocrina, en la que los niveles de circulación del estrógeno se controlan mediante la utilización de fármacos que inhiben una o varias series de reacciones enzimáticas en la biosíntesis del estrógeno, constituye la respuesta para HDBC. Pueden considerarse diferentes objetivos y se ha realizado la mayoría del trabajo alrededor de los antiestrógenos y los inhibidores de aromatasa. Las enzimas sulfatasa esteroidea y 17\beta-HSD de tipo 1 han surgido después como potentes dianas.

Aunque se han desarrollado varios inhibidores potentes para STS, la 17\beta-HSD de tipo 1 no ha levantado mucho interés y solamente se han descrito pocas moléculas activas. Basándose en el hecho de que los derivados con anillo D de EMATE son potentes inhibidores de 17\beta-HSD de tipo 1, se inició el diseño y la síntesis de análogos de EMATE con estrogenicidad reducida. Esto ha conducido a una serie de compuestos en los que el anillo D es un resto piperidindiona y en los que el átomo de N lleva una variedad de cadenas laterales.

La experimentación biológica contra STS, que se realizó en las células de cáncer de mama, puso de manifiesto una actividad muy elevada para los derivados que llevan un propilo o una cadena lateral de picolilo. Con un IC50 de 1 nm, son mucho más potentes que el EMATE.

Parte experimental 1 - Métodos generales

Todos los productos químicos se adquirieron en Aldrich Chemical Co. (Gillingham, Dorset, UK) o Lancaster Synthesis (Morecambe, Lancashire, UK). Todos los disolventes orgánicos de calidad A. R. fueron suministrados por Fisons plc (Loughborough, UK). La N,N-dimetilformamida (DMF) y la N,N-dimetilacetamida (DMA) anhidras, se utilizaron respectivamente para todas las N-alquilaciones y las reacciones de sulfamoilación, se adquirieron en Aldrich y se almacenaron a presión positiva de N_{2} después de su utilización. Se preparó cloruro de sulfamoílo mediante una adaptación del método de Apel y Berger^{48} y se almacenó como solución en tolueno tal como describe Woo et al.^{16} Un volumen apropiado de esta solución se concentró reciente al vacío inmediatamente antes de su utilización.

E1S y E1 se adquirieron en Sigma Chemical Co. (Poole, UK). [6,7-^{3}H]E1S (actividad específica, 50 Ci/mmoles) y [4-^{14}C]E1 (actividad específica, 52 mCi/mmol) se adquirieron en New England Nuclear (Boston, MA). [6,7-^{3}H]E1 (actividad específica, 97 Ci/mmol) se adquirió en el Amersham International Radiochemical Centre (Amersham, UK).

Se realizó la cromatografía en capa fina (TLC) en placas revestidas previamente (gel de sílice 60 F_{254} en hojas de aluminio para TLC de Merck, Art. nº 5554). Se detectaron el/los producto(s) y el material de partida (SM) observándolos bajo luz ultravioleta o tratando con solución metanólica de ácido fosfomolíbdico seguido de calentamiento. Se realizó la cromatografía en columna de flash sobre gel de sílice (Sorbsil C60). Se determinaron los espectros IR como discos de KBr utilizando un FT-IR Spectrum RXI de Perkin-Elmer y las posiciones del pico se expresan en cm^{-1}. Se registraron los espectros ^{1}H RMN y ^{13}C RMN editados en DEPT con los espectrómetros de RMN JMN-GX 400 y los desplazamientos químicos se describen en partes por millón (ppm, \delta) correspondientes a tetrametilsilano (TMS) como patrón interno. Para describir las resonancias en los espectros ^{1}H RMN y ^{13}C RMN se utilizan las abreviaturas siguientes: br, ancha; s, singlete; d, doblete; t, triplete; q, cuarteto; m, multiplete y combinaciones tales como dd, doblete de dobletes. Los desplazamientos químicos para los sistemas AB (\delta_{A} y \delta_{B}) se aproximaron tomando la media de cada doblete y la correspondiente constante de acoplamiento marcada J_{AB} o J_{BA}. Como ejemplo, se calcularon \delta_{A} y \delta_{B} siguiendo la fórmula mostrada en el apéndice 2 para el compuesto 21. Se realizó el análisis por HPLC en un instrumento Waters Millenium^{32} equipado con un detector Waters 996 PDA. Se registraron los vestigios en una columna Waters Radialpack C18, de 8\times100 mm con un gradiente de metanol/agua a 2 ml/min. Se registraron los espectros de masas en el Mass Spectrometry Service Center, Universidad de Bath. Se realizó la FAB-MS utilizando alcohol m-nitrobencílico (NBA) como matriz, y el Microanálisis Service, Universidad de Bath realizó los análisis elementales. Se determinaron los puntos de fusión utilizando un bloque Thermo Galen Kofler de Reichert-Jung y son incorrectos. El estudio cristalográfico por rayos X de 39 fue realizado por el Dr. M. Mahon en el Departamento de Química, Universidad
de Bath.

1 - 1 - Ensayos biológicos

Todos los ensayos se realizaron en el Departamento de Endocrinología y Medicina metabólica del Imperial College School of Medicine, St. Mary's Hospital, Londres por y en colaboración con el Dr. A. Purohit y Pr. M. Reed.

Se examinó la capacidad de los compuestos sintetizados para inhibir la actividad de la sulfatasa esteroidea utilizando preparaciones microsómicas de placenta. Se prepararon microsomas de placenta (fracción de 100.000 g) a partir de una placenta humana positiva-positiva de un embarazo de duración normal.^{49} Para determinar los IC_{50} para la inhibición de estrona sulfatasa, se midió la actividad en presencia del inhibidor (0,05-1,0 \mum) utilizando [^{3}H]E1S (4\times10^{5} dpm) ajustada a 20 \mum con sustrato no marcado.^{14} Después de la incubación del sustrato \pm inhibidor con microsomas de placenta (125 \mug de proteína/ml) durante 30 minutos, se aisló el producto formado de la mezcla por extracción con tolueno (4 ml), utilizando [4-^{14}C]E1 para controlar las pérdidas del procedimiento.

1 - 2 - Preparación de cloruro de sulfamoílo

Se añadió gota a gota ácido fórmico (6 ml, 150 mmoles) a una solución agitada de isocianato de clorosulfonilo (25 g, 150 mmoles) en 150 ml de tolueno recién destilado a 0ºC bajo una atmósfera de N_{2}. La suspensión blanca resultante se agitó toda la noche a temperatura ambiente bajo N_{2} y se filtró el insoluble de la solución bajo N_{2} utilizando una cánula. El filtrado se concentró al vacío para dar un producto en bruto marrón claro de cloruro de sulfamoílo. Se preparó a continuación una solución patrón (aprox. 0,70 M) de cloruro de sulfamoílo disolviendo el producto cristalino en bruto en tolueno recién destilado y se almacenó en el frigorífico bajo N_{2}. Antes de la reacción, se agitó el ácido fórmico durante la noche con anhídrido bórico y recién destilado bajo N_{2}.

1 - 3 - Método general de alquilación

Se añadió hidruro de sodio (dispersión al 60% en aceite mineral, 1,2 eq) a una solución agitada de 10 en DMF anhidra (15 ml) a 0ºC bajo una atmósfera de N_{2}. Una vez hubo cesado la evolución del hidrógeno, se añadió agente alquilante precursor (2 eq.). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente y se vertió en agua (50 ml). Se extrajo la solución resultante en acetato de etilo (50 ml). Después de más lavados exhaustivos con salmuera (4\times25 ml), se secó (MgSO_{4}) la capa orgánica, se filtró y se evaporó al vacío. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash proporcionó los compuestos precursores 11-21.

1 - 4 - Método general de hidrogenólisis

Se añadió Pd-C (10%) a una solución de 10-21 en MeOH/THF y la suspensión resultante se hidrogenó a temperatura ambiente utilizando un balón relleno de hidrógeno. Tras la eliminación del catalizador en soporte por filtración y evaporación del filtrado al vacío, el producto obtenido se purificó parcial (muestra analítica) o totalmente para dar los compuestos precursores 5 y 22-32.

1 - 5 - Método general de sulfamoilación

A una solución agitada de cloruro de sulfamoílo (2,2 eq.) en DMA a 0ºC bajo una atmósfera de N_{2} se añadió 5, 22-32 y 35. La mezcla de reacción se agitó bajo nitrógeno en cuyo momento se dejó calentar a la temperatura ambiente. Se vertió a continuación en salmuera fría (15 ml) y se extrajo la solución resultante con acetato de etilo (2\times20 ml). Se combinaron las capas orgánicas, se lavaron con salmuera (6\times20 ml), se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron a presión reducida. El producto en bruto que se obtuvo se fraccionó por cromatografía de flash y/o se recristalizó.

2 - Síntesis 2 - 1 - Síntesis del grupo esteroideo modificado en el anillo D 16-oximino-estrona 6

A una solución agitada de terc-butóxido de potasio bajo una atmósfera de N_{2}, recién preparada disolviendo potasio metálico (80 mg, 2,05 mmoles) en 2 ml de terc-butanol, se anadió estrona (200 mg, 740 mmoles). Se agitó a continuación la mezcla de reacción durante 1 hora a temperatura ambiente bajo N_{2} y se añadió gota a gota nitrito de isoamilo (180 \mumoles, 1,34 mmoles). La mezcla rojo oscuro obtenida se agitó durante la noche y a continuación se vertió en agua (20 ml). La solución resultante se extrajo con éter (2\times20 ml) y la capa acuosa se acidificó con ácido acético glacial (100 ml) para dar un precipitado amarillo claro. Éste se dejó separar durante dos horas después de las cuales se filtró el sólido (140 mg, 63%): p.f. 223-225ºC (lit. 226-227ºC);^{43} TLC (cloroformo/acetona, 9:1) R_{f} 0,27 cf. R_{f} 0,69 (E1); IR (KBr) 3385 (NOH), 2920-2860 (alif. CH), 1735 (C=O), 1605-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (DMSO-d_{6}, 400 MHz) 0,89 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,30-2,85 (11H, m), 2,70-2,81 (2H, m, C-6-H_{2}), 6,46 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 6,52 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,4 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,3 Hz, C-2-H), 7,05 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,2 Hz, C-1-H), 9,05 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, OH) y 12,39 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, NOH); \delta_{C} (DMSO-d_{6}, 100,4 MHz) 14,09 (q, C-18), 25,09 (t), 25,46 (t), 26,18 (t), 29,02 (t), 30,92 (t), 37,20 (d), 43,20 (d), 44,59 (d), 48,50 (s, C-13), 112,70 (d), 114,83 (d), 125,82 (d), 129,59 (s), 136,88 (s), 154,84 (s, C-3 o C-16), 155,23 (s, C-3 o C-16) y 204,64 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 453,2 [30, (M+H+NBA)^{+}], 300,1 [100, (M+H)^{+}]; MS m/z (FAB-) 451,3 [38, (M-H+NBA)^{-}],
298,2 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 300,15963, C_{18}H_{22}NO_{3} requiere 300,15997. CHN.

3-acetoxi-16-oximino-estrona

Una suspensión de 6 (150 mg, 501 mmoles) en una mezcla de 4,5 ml de ácido acético glacial y 7,5 ml de anhídrido acético se calentó a reflujo bajo una atmósfera de N_{2} durante 20 horas. La mezcla disolvente se eliminó a continuación a presión reducida y se añadió agua. Tras la gasificación con NaOH acuoso, la solución resultante se extrajo con acetato de etilo (2\times20 ml). Se separó la capa orgánica, se calentó con agua (2\times15 ml), a continuación salmuera (2\times15 ml), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró a presión reducida. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo como eluyente dio 7 como un sólido amarillo claro (97 mg, 57%): p.f. 189-193ºC (lit. 196-198ºC);^{43} CHN TLC (cloroformo/acetona, 9:1) R_{f} 0,68 cf. R_{f} 0,31 (6); IR (KBr) 3205 (NH), 2940-2860 (alif. CH), 1760 (OCOCH_{3}), 1725 (C=O), 1690 (C=O), 1610-1495 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (DMSO-d_{6}, 400 MHz) 1,11 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,20-2,72 (11H, m), 2,77-2,84 (2H, m, C-6-H_{2}), 2,23 (3H, s, OAc), 6,81 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,87 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,4 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,5 Hz, C-2-H), 7,32 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,2 Hz, C-1-H) y 10,64 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, NH); \delta_{C} (DMSO-d_{6}, 100,4 MHz)^{c} 15,96 (q, C-18), 20,68 (q, COCH_{3}), 24,76 (t), 24,86 (t), 28,79 (t), 32,18 (t), 32,55 (t), 37,29 (d), 40,30 (d), 41,89 (d), 118,62 (d), 120,94 (d), 125,91 (d), 136,46 (s), 137,12 (s), 147,91 (s, C-3), 168,85 (s, COCH_{3}), 171,93 s, C=O) y 178,71 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 495,2 [10, (M+H+NBA)^{+}], 342,1 [100, (M+H)^{+}], 299,1 [40, (M+H-Ac)^{+}]; MS m/z (FAB-) 647,3 [12, (M+2NBA)^{-}], 493,2 [34, (M-H+NBA)^{-}], 340,1 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 342,17046, C_{20}H_{24}NO_{4} requiere 342,17053.

^{c}La señal C-13 está oculta bajo los picos de disolvente.

Éter 3-bencílico de estrona (8)

Se añadió hidruro de sodio (dispersión al 60% en aceite mineral, 0,68 g, 20,34 mmoles) a una solución agitada de E1 (5,0 g, 18,49 mmoles) en DMF anhidro (50 ml), a 0ºC bajo una atmósfera de N_{2}. Después de agitar la mezcla resultante durante 15 minutos adicionales, se añadió bromuro de bencilo (2,42 ml, 20,34 mmoles) y la mezcla de reacción se calentó a 80ºC durante 4 horas. El exceso de hidruro de sodio restante se enfrió vertiendo la mezcla de reacción en agua con hielo. La fracción orgánica que se separó se extrajo en acetato de etilo (150 ml) y además se lavó exhaustivamente con agua (4\times50 ml), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó al vacío. El residuo amarillo pálido obtenido se recristalizó en alcohol isopropílico para dar 8 como cristales blancos deleznables (4,73 g, 71%): p.f. 129-131ºC (lit. 130-131ºC) ref; TLC (cloroformo/acetato de etilo, 4:1) R_{f} 0,83 cf. R_{f} 0,61 (E1); IR (KBr) 3100 (arom. CH), 2950-2840 (alif. CH), 1730 (C=O), 1600, 1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz), 0,91 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,41-2,54 (13H, m), 2,86-2,93 (2H, m, C-6-H_{2}), 5,04 (2H, s, OCH_{2}Ar), 6,73 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 6,80 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H), 7,20 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H) y 7,30-7,44 (5H, m, C_{6}H_{5}).

Ácido 3-bencil-marrianólico (9)

Se añadieron gota a gota una solución de yodo (7,6 g, 29,94 mmoles) en 95 ml de MeOH y una solución de KOH (13,7 g) en 27 ml de agua y 61 ml de MeOH y alternativamente a una solución agitada de éter 3-bencílico de estrona (8) (3,8 g, 10,54 mmoles) en MeOH (1 l) de modo que el color de la mezcla permanece naranja/marrón. Se realizó la adición durante 45 minutos y la solución amarilla clara resultante se agitó durante la noche a temperatura ambiente en una atmósfera de N_{2} para dar una solución amarilla clara transparente. La mezcla se concentró a continuación al vacío y se vertió en agua (800 ml). Tras la acidificación con HCl 5 M se extrajo la fracción orgánica en éter (600 ml) y se lavó la capa etérea con tiosulfato de sodio acuoso (4\times100 ml), a continuación con agua (4\times100 ml), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó al vacío. La espuma amarilla (4,54 g) resultante se disolvió a continuación en una solución de KOH (7,6 g) en MeOH/H_{2}O (1:2, 228 ml) y se calentó a reflujo durante 4 horas. La mezcla naranja que se obtuvo se vertió en agua (800 ml) y después de acidificación con HCl 5 M se extrajeron las fracciones orgánicas en acetato de etilo (300 ml). Después de más lavados exhaustivos con salmuera (4\times200 ml), se secó (MgSO_{4}) la capa orgánica, se filtró y se evaporó al vacío para dar un residuo amarillo (4,32 g). Éste se recristalizó en CHCl_{3}/hexano 5:3 para dar 9 como un polvo cremoso (2,291 g, 53%). Una recogida más del producto (958 mg) se obtuvo a partir del residuo de la solución madre en la recristalización en CHCl_{3}/hexano 5:3 (rendimiento global 75%): p.f. 212-215ºC (lit. 226-227ºC);^{42} TLC (cloroformo/metanol, 5:1) R_{f} 0,37 cf. R_{f} 0,88 (8); IR (KBr) 3050-2650 (CO_{2}H), 1700 (C=O), 1600-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (DMSO-d_{6}, 400 MHz) 1,02 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,20-2,78 (11H, m), 2,72-2,76 (2H, m, C-6-H_{2}), 5,05 (2H, s, OCH_{2}Ar), 6,68 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,75 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,3 Hz, C-2-H), 7,18 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,9 Hz, C-1-H), 7,30-7,42 (5H, M, C_{6}H_{5}) y 12,14 (2H, s, intercambiado con D_{2}O, CO_{2}H); \delta_{C} (DMSO-d_{6}, 100,4 MHz) 15,37 (q, C-18), 25,84 (t), 26,53 (t), 29,73 (t), 35,77 (t), 36,10 (t), 40,73 (d), 41,84 (d), 42,55 (D), 46,21 (s, C-13), 68,93 (t, OCH_{2}Ar), 112,35 (d), 114,02 (d), 126,32 (d), 127,29 (2\timesd), 127,49 (d), 128,19 (2\timesd), 131,64 (s), 137,18 (2\timess), 155,96 (s, C-3), 173,93 (s, CO_{2}H) y 178,60 (s, CO_{2}H); MS m/z (FAB+) 408,2 [41, M^{+}], 91,1 [100, (CH_{2}Ar)^{+}]; Acc MS m/z (FAB+) 408,19404, C_{25}H_{28}O_{5} requiere 408,19367.

3-benciloxi-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (10)

El ácido 3-bencil-marrianólico (9) (3,25 g, 7,96 mmoles) y urea (3,25 g, 54,11 mmoles) se calentaron a 180ºC bajo una atmósfera de N_{2} durante 45 minutos. El residuo marrón resultante se trituró a continuación y se añadió acetona (200 ml) para dar una suspensión marrón. Esta mezcla se concentró a aprox. 100 ml, se añadió gel de sílice y se eliminó el disolvente para dar un polvo beis homogéneo que se transfirió a una columna de cromatografía de flash rellena en húmedo (cloroformo). La elución con cloroformo/acetona (96:4) dio 10 como un residuo blanco (2,75 g, 89%): p.f. 225-226ºC; TLC (cloroformo/acetona, 9:1) R_{f} 0,62 cf. R_{f} 0,14 (9); IR (KBr) 3260 (NH), 2900-2870 (alif. CH), 1720 (C=O), 1700 (C=O), 1600-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (DMSO-d_{6}, 400 MHz) 1,09 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,20-2,72 (11H, m), 2,76-2,80 (2H, m, C-6-H_{2}), 5,05 (2H, s, OCH_{2}Ar), 6,72 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 6,76 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,5 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H), 7,19 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 9,0 Hz, C-1-H), 7,31-7,44 (5H, m, C_{6}H_{5}) y 10,63 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, NH); \delta_{C} (DMSO-d_{6}, 100,4 MHz) 16,16 (q, C-18), 25,06 (t), 25,25 (t), 29,25 (t), 32,37 (t), 32,72 (t), 37,82 (d), 40,32 (d), 40,49 (s), 41,91 (d), 68,89 (t, OCH_{2}Ar), 112,25 (d), 114,08 (d), 126,00 (d), 127,27 (2\timesd), 127,45 (d), 128,16 (2\timesd), 131,51 (s), 137,01 (s), 137,12 (s), 155,97 (s, C-3), 172,09 (s, C=O) y 178,89 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 543,3 [8, (M+H+NBA)^{+}], 390,2 [58, (M+H)^{+}], 91,1 [100, (CH_{2}Ar)^{+}]; Acc MS m/z (FAB+) 390,20586, C_{25}H_{28}NO_{3} requiere 390,20692. Para el análisis HPLC y CHN, se recristalizó una muestra en EtOH para dar agujas incoloras. HPLC (metanol/agua, 85:15; \lambda_{max} = 278,1 nm) Rt = 8,15 min, 100%. Obtenido: C, 76,90; H, 6,99; N, 3,73. C_{25}H_{27}NO_{3} requiere: C, 77,09; H, 6,99; N, 3,60.

2 – 2- Introducción de varias cadenas laterales en el anillo D mediante N-alquilaciones 3-benciloxi-N-metil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (11)

Siguiendo las condiciones de alquilación (véase VI-1-3), se trató 10 (500 mg, 1,28 mmoles) con NaH (62 mg, 1,54 mmoles) y la reacción ulterior con yoduro de metilo (160 \mul, 2,57 mmoles) se completó en 45 minutos. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo como diluyente dio 11 como un residuo blanco (432 mg, 83%): p.f. 118-121ºC; IR (KBr) 3160-3060 (arom. CH), 2920-2870 (alif. CH), 1720 (C=O), 1670 (C=O), 1600-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 1,17 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,26-3,00 (11H, m), 2,86-2,91 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,15 (3H, s, N-CH_{3}), 5,04 (2H, s, OCH_{2}Ar), 6,72 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,80 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H), 7,21 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H) y 7,32-7,45 (5H, m, C_{6}H_{5}); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 16,64 (q, C-18), 25,58 (t), 25,83 (t), 26,98 (q, C-1'), 29,73 (t), 33,50 (t), 33,83 (t), 38,55 (d), 40,42 (d), 41,53 (s, C-13), 42,57 (d), 69,95 (t, OCH_{2}Ar), 112,56 (d), 114,51 (d), 126,14 (d), 126,29 (2\timesd), 127,75 (d), 128,42 (2\timesd), 131,49 (s), 137,01 (s), 137,16 (s), 156,82 (s, C-3), 171,81 (s, C=O) y 178,68 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 404,4 [79, (M+H)^{+}], 91,1 [100, (CH_{2}Ar)^{+}]; Acc MS m/z (FAB+) 404,22174, C_{26}H_{30}NO_{3} requiere 404,22257. Para análisis de HPLC y CHN, se recristalizó una muestra en EtOH para dar cristales incoloros. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 278,1 nm) Rt = 3,93 min, 100%. Obtenido: C, 77,30; H, 7,22; N, 3,48. C_{26}H_{29}NO_{3} requiere: C, 77,39; H, 7,24; N, 3,47.

3-benciloxi-N-etil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (12)

Siguiendo las condiciones de alquilación (véase VI-1-3), 10 (500 mg, 1,28 mmoles) se trató con NaH (62 mg, 1,54 mmoles) y la reacción ulterior con yoduro de etilo (205 \mul, 2,57 mmoles) se terminó en 1 hora. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo como eluyente dio 12 como un residuo blanco (502 mg, 94%): p.f. 93-95ºC; IR (KBr) 2975-2865 (alif. CH), 1715 (C=O), 1665 (C=O), 1605-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 1,11 (3H, t, J = 7,2 Hz, C-2'-H_{3}), 1,16 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,31-2,98 (11H, m), 2,85-2,90 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,81 (2H, m, N-CH_{2}), 5,04 (2H, s, OCH_{2}Ar), 6,72 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,81 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H), 7,22 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H) y 7,30-7,44 (5H, m, C_{6}H_{5}); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 13,15 (q, C-2'), 16.43 (q, C-18), 25,49 (t), 25,69 (t), 29,61 (t), 33,52 (t), 33,63 (t), 35,03 (t, C-1'), 38,54 (d), 40,22 (d), 41,28 (s, C-13), 42,42 (d), 69,84 (t, OCH_{2}Ar), 112,44 (d), 114,41 (d), 126,00 (d), 127,15 (2\timesd), 127,61 (d), 128,28 (2\timesd), 131,41 (s), 136,91 (s), 137,05 (s), 156,70 (s, C-3), 171,15 (s, C=O) y 178,03 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 418,3 [90, (M+H)^{+}], 91,0 [100, (CH_{2}Ar)^{+}]; Acc MS m/z (FAB+) 417,23061, C_{27}H_{31}NO_{3} requiere 417,23039. Para análisis de HPLC y CHN, se recristalizó una muestra en EtOH para dar cristales incoloros. HPLC (metanol/agua, 85:15; \lambda_{max} = 278,1 nm) Rt = 8,15 min, 100%. Obtenido: C,; H,; N,. C_{27}H_{31}NO_{3} requiere: C, 77,67; H, 7,48; N, 3,35.

3-benciloxi-N-propil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (13)

Siguiendo las condiciones de alquilación (véase VI-1-3), 10 (500 mg, 1,28 mmoles) se trató con NaH (62 mg, 1,54 mmoles) y la reacción ulterior con yoduro de propilo (205 \mul, 2,57 mmoles) se terminó en 2 horas. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo como eluyente dio 13 como un residuo blanco (524 mg, 94%): p.f. 95-98ºC; IR (KBr) 3035 (arom. CH), 2960-2870 (alif. CH), 1720 (C=O), 1660 (C=O), 1610-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,89 (3H, t, J = 7,6 Hz, C-3'-H_{3}), 1,16 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,32-2,98 (13H, m), 2,83-2,88 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,64-3,80 (2H, m, N-CH_{2}), 5,03 (2H, s, OCH_{2}Ar), 6,72 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} =
2,7 Hz, C-4-H), 6,80 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H), 7,21 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H) y 7,30-7,44 (5H, m, C_{6}H_{5}); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 11,44 (q, C-3'), 16.65 (q, C-18), 21,30 (t), 25,63 (t), 25,83 (t), 29,76 (t), 33,68 (t), 33,81 (t), 38,68 (d), 40,37 (d), 41,50 (s, C-13), 41,56 (t, C-1'), 42,54 (d), 69,97 (t, OCH_{2}Ar), 112,56 (d), 114,52 (d), 126,15 (d), 127,29 (2\timesd), 127,76 (d), 128,42 (2\timesd), 131,54 (s), 137,03 (s), 137,20 (s), 156,83 (s, C-3), 171,49 (s, C=O) y 178,43 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 432,4 [88, (M+H)^{+}], 91,1 [100, (CH_{2}Ar)^{+}]; Acc MS m/z (FAB+) 432,25223, C_{28}H_{34}NO_{3} requiere 432,25387. Para análisis de HPLC y CHN, se recristalizó una muestra en EtOH para dar cristales blancos. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 278,1 nm) Rt = 5,50 min, 100%. Obtenido: C, 77,60; H, 7,68; N, 3,26. C_{28}H_{33}NO_{3} requiere: C, 77,93; H, 7,71; N, 3,25.

3-benciloxi-N-butil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (14)

Siguiendo las condiciones de alquilación (véase VI-1-3), 10 (500 mg, 1,28 mmoles) se trató con NaH (62 mg, 1,54 mmoles) y la reacción ulterior con bromobutano (276 \mul, 2,57 mmoles) se terminó en 4 horas. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo como eluyente dio 14 como un residuo blanco (513 mg, 90%): p.f. 100-103ºC; IR (KBr) 2960-2870 (alif. CH), 1720 (C=O), 1665 (C=O), 1615-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,92 (3H, t, J = 7,2 Hz, C-4'-H_{3}), 1,16 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,28-2,99 (15H, m), 2,84-2,89 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,75 (2H, m, N-CH_{2}), 5,04 (2H, s, OCH_{2}Ar), 6,72 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 6,81 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H), 7,22 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H) y 7,29-7,45 (5H, m, C_{6}H_{5}); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 13,76 (q, C-4'), 16.48 (q, C-18), 20,15 (t), 25,49 (t), 25,69 (t), 29,60 (t), 30,01 (t), 33,54 (t), 33,67 (t), 38,54 (d), 39,75 (t, C-1'), 40,24 (d), 41,35 (s, C-13), 42,40 (d), 69,83 (t, OCH_{2}Ar), 112,42 (d), 114,40 (d), 126,00 (d), 127,14 (2\timesd), 127,60 (d), 128,28 (2\timesd), 131,41 (s), 136,90 (s), 137,05 (s), 156,69 (s, C-3), 171,30 (s, C=O) y 178,25 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 446,3 [97, (M+H)^{+}], 91,0 [100, (CH_{2}Ar)^{+}]; Acc MS m/z (FAB+) 446,26912, C_{29}H_{36}NO_{3} requiere 446,26952. Para análisis de HPLC y CHN, se recristalizó una muestra en EtOH para dar agujas blancas. HPLC (metanol/agua, 85:15; \lambda_{max} = 278,1 nm) Rt = 8,15 min, 100%. Obtenido: C, 77,80; H, 7,89; N, 3,13. C_{29}H_{36}NO_{3} requiere: C, 78,17; H, 7,92; N, 3,14. (ligeramente fuera)

3-benciloxi-N-pentil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (15)

Siguiendo las condiciones de alquilación (véase VI-1-3), 10 (500 mg, 1,28 mmoles) se trató con NaH (62 mg, 1,54 mmoles) y la reacción ulterior con bromuro de pentilo (318 \mul, 2,57 mmoles) se terminó en 5 horas. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo como eluyente dio 15 como un residuo blanco (550 mg, 93%): p.f. 104-107ºC; IR (KBr) 3100-3000 (arom. CH), 2960-2870 (alif. CH), 1720 (C=O), 1660 (C=O), 1610-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,89 (3H, t, J = 7,2 Hz, C-5'-H_{3}), 1,16 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,20-2,98 (17H, m), 2,83-2,89 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,66-3,82 (2H, m, N-CH_{2}), 5,03 (2H, s, OCH_{2}Ar), 6,72 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,80 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H), 7,21 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H) y 7,30-7,44 (5H, m, C_{6}H_{5}); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 14,10 (q, C-5'), 16,63 (q, C-18), 22,46 (t), 25,63 (t), 25,81 (t), 27,72 (t), 29,16 (t), 27,75 (t), 33,68 (t), 33,79 (t), 38,68 (d), 40,10 (t, C-1'), 40,35 (d), 41,48 (s, C-13), 42,54 (d), 69,96 (t, OCH_{2}Ar), 112,55 (d), 114,51 (d), 126,15 (d), 127,29 (2\timesd), 127,76 (d), 128,42 (2\timesd), 131,54 (s), 137,02 (s), 137,20 (s), 156,81 (s, C-3), 171,45 (s, C=O) y 178,39 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 460,2 [78, (M+H)^{+}], 91,1 [100, (CH_{2}Ar)^{+}]; Acc MS m/z (FAB+) 460,28447, C_{30}H_{38}NO_{3} requiere 460,28517. Para análisis de HPLC y CHN, se recristalizó una muestra en EtOH para dar agujas incoloras. HPLC (metanol/agua, 92:8; \lambda_{max} = 276,9
nm) Rt = 6,46 min, 97,7%. Obtenido: C, 78,20; H, 8,08; N, 3,01. C_{30}H_{37}NO_{3} requiere: C, 78,40; H, 8,11; N, 3,05.

3-benciloxi-N-hexil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (16)

Siguiendo las condiciones de alquilación (véase VI-1-3), 10 (500 mg, 1,28 mmoles) se trató con NaH (62 mg, 1,54 mmoles) y la reacción ulterior con bromuro de hexilo (360 \mul, 2,57 mmoles) se terminó en 1,5 horas. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo como eluyente dio 16 como un residuo blanco (575 mg, 94%): p.f. 108-111ºC; IR (KBr) 2960-2860 (alif. CH), 1720 (C=O), 1665 (C=O), 1615-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,87 (3H, t, J = 6,6 Hz, C-6'-H_{3}), 1,16 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,28-2,98 (19H, m), 2,84-2,89 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,74 (2H, m, N-CH_{2}), 5,04 (2H, s, OCH_{2}Ar), 6,72 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,81 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H), 7,22 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H) y 7,29-7,44 (5H, m, C_{6}H_{5}); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 14,13 (q, C-6'), 16.63 (q, C-18), 22,63 (t), 25,64 (t), 25,84 (t), 26,69 (t), 29,99 (t), 29,76(t), 31,56 (t), 33,69 (t), 33,82 (t), 38,70 (d), 40,14 (t, C-1'), 40,39 (d), 41,50 (s, C-13), 42,55 (d), 69,99 (t, OCH_{2}Ar), 112,58 (d), 114,55 (d), 126,15 (d), 127,29 (2\timesd), 127,76 (d), 128,42 (2\timesd), 131,57 (s), 137,05 (s), 137,20 (s), 156,84 (s, C-3), 171,44 (s, C=O) y 178,38 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 474,3 [68, (M+H)^{+}], 91,0 [100, (CH_{2}Ar)^{+}]; Acc MS m/z (FAB+) 473,29238, C_{31}H_{39}NO_{3} requiere 473,29299. Para análisis de HPLC y CHN, se recristalizó una muestra en EtOH para dar agujas blancas. HPLC (metanol/agua, 85:15; \lambda_{max} = 278,1 nm) Rt = 8,15 min, 100%. Obtenido: C, 78,10; H, 8,16; N, 2,98. C_{31}H_{39}NO_{3} requiere: C, 78,61; H, 8,30; N, 2,96. (ligeramente fuera)

3-benciloxi-N-bromobutil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (17)

Siguiendo las condiciones de alquilación (véase VI-1-3), 10 (500 mg, 1,28 mmoles) se trató con NaH (62 mg, 1,54 mmoles) y la reacción ulterior con 1,4-dibromobutano (310 \mul, 2,57 mmoles) se terminó en 1,5 horas. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo como eluyente dio 17 como un residuo blanco (569 mg, 84%): p.f. 113-116ºC; IR (KBr) 2935-2860 (alif. CH), 1720 (C=O), 1670 (C=O), 1605-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 1,17 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,30-3,00 (15H, m), 2,84-2,90 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,42 (2H, t, J = 6,8 Hz, CH_{2}Br), 3,79 (2H, m, N-CH_{2}), 5,04 (2H, s, OCH_{2}Ar), 6,72 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,81 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H), 7,21 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H) y 7,30-7,45 (5H, m, C_{6}H_{5}); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 17,02 (q, C-18), 25,92 (t), 26,14 (t), 27,12 (t), 30,08 (t), 30,51 (t), 33,54 (t), 33,95 (t), 34,08 (t), 38,96 (d), 39,35 (t, C-1'), 40,62 (d), 41,85 (s, C-13), 42,85 (d), 70,27 (t, OCH_{2}Ar), 112,88 (d), 114,83 (d), 126,45 (d), 127,64 (2\timesd), 128,12 (d), 128,77 (2\timesd), 131,77 (s), 137,30 (s), 137,50 (s), 157,12 (s, C-3), 171,83 (s, C=O) y 178,76 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 524,1 [42, (M+H)^{+}], 91,0 [100, (CH_{2}Ar)^{+}]; Acc MS m/z (FAB+) 525,17157, C_{29}H_{34}^{81}BrNO_{3} requiere 525,17016 y 524,17384, C_{29}H_{34}BrNO_{3} requiere 524,18003. Para el análisis de HPLC y CHN, se recristalizó una muestra en EtOH para dar cristales blancos. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 278,1 nm) Rt = 6,04 min, 99,7%. Obtenido: C, 66,30; H, 6,51; N, 2,56. C_{29}H_{34}BrNO_{3} requiere: C, 66,41; H, 6,53; N, 2,67.

3-benciloxi-N-ciclopropilmetil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (18)

Siguiendo las condiciones de alquilación (véase VI-1-3), 10 (500 mg, 1,28 mmoles) se trató con NaH (62 mg, 1,54 mmoles) y la reacción ulterior con 1,4-dibrometilciclopropano (246 \mul, 2,57 mmoles) se terminó en 3 horas. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo como eluyente dio 18 como un residuo blanco (536 mg, 94%): p.f. 96-99ºC; IR (KBr) 2920-2860 (alif. CH), 1720 (C=O), 1670 (C=O), 1610-1495 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,29-0,34 (2H, m, C-3'-H_{2}), 0,40-0,45 (2H, m, C-4'-H_{2}), 1,15 (1H, m, C-2'-H), 1,18 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,25-3,01 (11H, m), 2,85-2,90 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,67 (2H, m, N-CH_{2}), 5,04 (2H, s, OCH_{2}Ar), 6,73 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 6,81 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H), 7,22 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H) y 7,29-7,45 (5H, m, C_{6}H_{5}); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 3,94 (t, C-3'), 4,02 (t, C-4'), 10,52 (d, C-2'), 16,96 (q, C-18), 25,96 (t), 26,15 (t), 30,08 (t), 34,03 (t), 34,14 (t), 39,06 (d), 40,65 (d), 41,86 (s, C-13), 42,86 (d), 44,59 (t, C-1'), 70,31 (t, OCH_{2}Ar), 112,90 (d), 114,87 (d), 126,45 (d), 127,60 (2\timesd), 128,06 (d), 128,73 (2\timesd), 131,91 (s), 137,37 (s), 137,52 (s), 157,16 (s, C-3), 171,99 (s, C=O) y 178,98 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 887,3 [58, (2M+H)^{+}], 444,1 [98, (M+H)^{+}], 91,0 [100, (CH_{2}Ar)^{+}]; Acc MS m/z (FAB+) 443,24533, C_{29}H_{33}NO_{3} requiere 443,24604. Para el análisis de HPLC y CHN, se recristalizó una muestra en EtOH para dar agujas blancas. HPLC (metanol/agua, 85:15; \lambda_{max} = 278,1 nm) Rt = 8,15 min, 100%. Obtenido: C, 78,30; H, 7,47; N, 3,18. C_{29}H_{33}NO_{3} requiere: C, 78,52; H, 7,50; N, 3,16.

3-benciloxi-N-(3-picolil)-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (19)

Se añadió hidruro de sodio (dispersión al 60% en aceite mineral, 31 mg, 770 \mumoles) a una solución agitada de 10 (250 mg, 642 \mumoles) en DMF anhidro (10 ml) a temperatura ambiente bajo una atmósfera de N_{2}. Una vez cesó la evolución del hidrógeno, se añadió hidrobromuro de 3-(bromometil)piridina (325 mg, 1,28 mmoles) para dar una mezcla naranja intensa. Ésta se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente, a continuación se añadieron a la mezcla 2 equivalentes de hidruro de sodio (52 mg, 1,28 mmoles). Ésta se agito durante la noche a temperatura ambiente y se vertió en agua (40 ml). Se extrajo la mezcla roja oscura resultante en acetato de etilo (40 ml). Después de un lavado exhaustivo adicional con salmuera (4\times20 ml), se secó la capa orgánica (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó al vacío. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo/acetona (9:1) como eluyente dio 19 como un residuo blanco que se purificó más mediante una segunda columna de flash con cloroformo/acetona (95:5) Se obtuvo un polvo blanco (230 mg, 75%): p.f. 170-172ºC; IR (KBr) 2925-2870 (alif. CH), 1720 (C=O), 1670 (C=O), 1610-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 1,14 (3H, S, C-18-H_{3}), 1,28-3,04 (11H, m), 2,84-2,88 (2H, m, C-6-H_{2}), 4,92 (1H, d, J_{BA} = 13,7 Hz, N-CH_{\underline{A}}H_{B}Py), 4,98 (1H, d, J_{AB} = 14,1 Hz, N-CH_{A}H_{\underline{B}}Py), 5,03 (2H, s, OCH_{2}Ar), 6,71 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,79 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H), 7,17-7,45 (7H, m, C_{6}H_{5}, C-1-H y C-4''-H), 7,69 (1H, td, J_{C-4''-H, C-3''-H} = 7,8 Hz, J_{C-5''-H, C-3''-H} = J_{C-1''-H, C-3''-H} = 1,9 Hz, C-2''-H), 8,50 (1H, dd, JC-4''-H, C-5''-H = 5,1, JC-3''-H, C-5''-H = 1,6 Hz, C-5''-H) y 8,63 (1H, d, J_{C-3''-H, C-1''-H} = 1,9 Hz, C-1''-H); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 16,49 (q, C-18), 25,51 (t), 25,77 (t), 29,68 (t), 33,56 (t), 33,66 (t), 38,52 (d), 40,14 (d), 40,85 (t, C-1'), 41,58 (s, C-13), 42,43 (d), 69,93 (t, OCH_{2}Ar), 112,55 (d), 114,47 (d), 123,19 (d), 126,12 (d), 127,26 (2\timesd), 127,75 (d), 128,41 (2\timesd), 131,35 (s), 132,80 (s), 136,37 (d), 137,10 (2\timess), 148,59 (d), 150,03 (d), 156,80 (s, C-3), 171,36 (s, C=O) y 178,31 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 481,3 [100, (M+H)^{+}], 91,1 [47, (CH_{2}Ar)^{+}]; Acc MS m/z (FAB+) 481,25036, C_{31}H_{33}N_{2}O_{3} requiere 481,24912. Para el análisis de HPLC y CHN, se recristalizó una muestra en EtOH para dar agujas incoloras. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Obtenido: C, 77,00; H, 6,75; N, 5,73. C_{32}H_{33}N_{2}O_{3} requiere: C, 77,47; H, 6,71; N, 5,83.

3-benciloxi-N-terc-butil-bencil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (20)

Siguiendo las condiciones de alquilación (véase VI-1-3), 10 (500 mg, 1,28 mmoles) se trató con NaH (62 mg, 1,54 mmoles) y la reacción ulterior con 1,bromometil-4-terc-butilbenceno (472 \mul, 2,57 mmoles) se terminó en 30 minutos. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo como eluyente dio 20 como un residuo blanco (667 mg, 97%): p.f. 199-200ºC; IR (KBr) 2965-2870 (alif. CH), 1720 (C=O), 1670 (C=O), 1605-1505 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 1,16 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,28 (9H, s, C(CH_{3})_{3}), 1,30-3,01 (11H, m), 2,84-2,90 (2H, m, C-6-H_{2}), 4,88 (1H, d, J_{BA} = 13,7 Hz, N-CH_{\underline{A}}CH_{B}), 4,94 (1H, D, J_{AB} = 14,1 Hz, N-CH_{A}CH_{\underline{B}}), 5,03 (2H, s, OCH_{2}Ar), 6,72 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,80 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H), 7,21 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H) y 7,24-7,44 (9H, m, C_{6}H_{5}, C-2''-H, C-3''-H, C-5''-H y C-6''-H); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 16,60 (q, C-18), 25,60 (t), 25,79 (t), 29,73 (t), 31,40 (3\timesq, C(CH_{3})_{3}), 33,67 (t), 33,77 (t), 34,53 (s, C(CH_{3})_{3}), 38,63 (d), 40,15 (d), 41,55 (s, C-13), 42,48 (d), 42,88 (t, C-1'), 69,93 (t, OCH_{2}Ar), 112,53 (d), 114,47 (d), 125,20 (2\timesd), 126,15 (d), 127,30 (2\timesd), 127,77 (d), 128,02 (2\timesd), 128,42 (2\timesd), 131,48 (s), 134,20 (s), 136,98 (s), 137,17 (s), 149,91 (s), 156,79 (s, C-3), 171,42 (s, C=O) y 178,37 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 1071,5 [32, (2M+H)^{+}], 536,2 [80, (M+H)^{+}], 91,0 [100, (CH_{2}Ar)^{+}]; MS m/z (FAB-) 534,3 [72, (M-H)^{-}], 195,0 [100], 276,0 [100] Acc MS m/z (FAB+) 535,30865, C_{36}H_{41}NO_{3} requiere 535,30864. Para el análisis de HPLC y CHN, se recristalizó una muestra en EtOH para dar agujas blancas. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Obtenido: C,; H,; N,. C_{29}H_{35}NO_{3} requiere: C, 80,71; H, 7,71; N, 2,61.

3-benciloxi-N-bencil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (21)

Se agitó el ácido 3-bencil-marrianólico (9) (500 mg, 1,22 mmoles) con bencilamina (6,25 g, 57,22 mmoles) y se calentó a 180ºC bajo una atmósfera de N_{2} durante 3 horas. Después de enfriar, la mezcla marrón resultante se vertió en agua (250 ml), se acidificó con HCl 5M y se extrajeron las fracciones orgánicas en acetato de etilo (50 ml). Tras un lavado exhaustivo adicional con agua (1\times25 ml), la salmuera (3\times25 ml), se secó la capa orgánica (MgSO_{4}), se filtró y de evaporó al vacío. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo/hexano (8/2) como eluyente dio 21 como un polvo cremoso (385 mg, 65%): p.f. 144-146ºC; IR (KBr) 3100 (arom. CH), 2940-2850 (alif. CH), 1720 (C=O), 1670 (C=O), 1615-1560 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 1,15 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,25-3,01 (11H, m), 2,84-2,89 (2H, m, C-6-H_{2}), 4,91 (1H, d, J_{BA} = 13,7 Hz, N-CH_{\underline{A}}H_{B}Ar), 4,98 (1H, d, J_{AB} = 13,7 Hz, N-CH_{A}H_{\underline{B}}Ar), 5,03 (2H, s, OCH_{2}Ar), 6,72 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,80 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H), 7,21 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,2 Hz, C-1-H) y 7,24-7,43 (10H, m, 2\timesC_{6}H_{5}); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 16,54 (q, C-18), 25,59 (t), 25,80 (t), 29,73 (t), 33,66 (t), 33,75 (t), 38,64 (d), 40,17 (d), 41,54 (s, C-13), 42,48 (d), 43,22 (t, C-1'), 69,93 (t, OCH_{2}Ar), 112,54 (d), 114,48 (d), 126,14 (d), 127,19 (d), 127,29 (d), 127,76 (d), 128,27 (d), 128,39 (d), 128,42 (d), 131,47 (s), 136,98 (s), 137,16 (s), 137,25 (s), 156,80 (s, C-3), 171,39 (s, C=O) y 178,31 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 480,2 [52, (M+H)^{+}], 91,1 [100, (CH_{2}Ar)^{+}]; Acc MS m/z (FAB+) 480,25223, C_{32}H_{34}NO_{3} requiere 480,25387. Para el análisis de HPLC y CHN, se recristalizó una muestra a partir de MeOH para dar agujas incoloras. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 220,0 nm) Rt = 5,83 min, 99,0%. Obtenido: C, 80,10; H, 6,91; N, 2,94. C_{32}H_{33}NO_{3} requiere: C, 80,14; H, 6,94; N, 2,92.

2 - 3 - Desprotección de los precursores 3-hidroxi-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (5) (STX 187)

Siguiendo las condiciones de hidrogenación (véase 1-4), se hidrogenó durante 5 horas una suspensión de 10 (350 mg, 899 \mumoles) y Pd-C (10%, 100 mg) en MeOH/THF 1:1 (50 ml) para dar 5 como un sólido blanco (246 mg, 91%). Se recristalizó una muestra analítica en CHCl_{3}/hexano 2:1 para dar cristales blancos: p.f. 297-300ºC; TLC (cloroformo/acetona, 8:2) R_{f} 0,39 cf. R_{f} 0,58 (10); IR (KBr) 3410 (OH), 3180-3085 (arom. CH), 2955-2870 (alif. CH), 1715 (C=O), 1680 (C=O), 1615-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (DMSO-d_{6}, 400 MHz) 1,09 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,15-2,66 (11H, m), 2,69-2,73 (2H, m, C-6-H_{2}), 6,44 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,52 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,4 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H), 7,07 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H), 9,05 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, OH) y 10,63 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, NH); \delta_{C} (DMSO-d_{6}, 100,4 MHz) 16,21 (q, C-18), 25,17 (t), 25,38 (t), 29,19 (t), 32,40 (t), 32,77 (t), 38,00 (d), 40,36 (d), 40,53 (s, C-13), 41,45 (d), 112,74 (d), 114,51 (d), 125,88 (d), 129,48 (s), 136,71 (s), 154,81 (s, C-3), 172,16 (s, C=O) y 178,97 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 453,1 [17, (M+H+NBA)^{+}], 300,0 [100, (M+H)^{+}], 213,1 [16], 159,1 [20], 133,0 [29], 111,1 [36], 97,1 [60]; MS m/z (FAB-) 605,4 [20, (M+2NBA)^{-}], 451,3 [58, (M-H+NBA)^{-}], 298,2 [100, (M-H)^{-}], 276,1 [21], 188,1 [25], 139,1 [19]; Acc MS m/z (FAB+) 300,15853, C_{18}H_{22}NO_{3} requiere 300,15997. HPLC (metanol/agua, 60:40; \lambda_{max} = 279,3 nm) Rt = 3,06 min, 100%. Obtenido: C, 61,80; H, 5,85; N, 3,86. C_{18}H_{21}NO_{3} + (CHCl_{3})_{1/2} requiere: C, 61,88; H, 6,04; N, 3,90.

3-hidroxi-N-metil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (22) (STX 188)

Siguiendo las condiciones de hidrogenación (véase VI-1-4), se hidrogenó durante 2 horas una suspensión de 11 (400 mg, 992 \mumoles) y Pd-C (10%, 200 mg) en MeOH/THF 2:1 (30 ml) para dar 22 como un sólido blanco (253 mg, 81%). Se recristalizó una muestra analítica en acetato de etilo para dar cristales blancos: p.f. 328-330ºC; IR (KBr) 3460 (OH), 2940-2860 (alif. CH), 1715 (C=O), 1655 (C=O), 1610-1510 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (DMSO-d_{6}, 400 MHz) 1,09 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,19-2,97 (11H, m), 2,68-2,73 (2H, m, C-6-H_{2}), 2,98 (3H, s, N-CH_{3}), 6,44 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} =
2,3 Hz, C-4-H), 6,52 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,4 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,3 Hz, C-2-H), 7,06 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H) y 9,05 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, OH); \delta_{C} (DMSO-d_{6}, 100,4 MHz)^{a} 16,32 (q, C-18), 25,19 (t), 26,37 (q, C-1'), 29,11 (t), 32,78 (t), 33,55 (2\timest), 37,83 (d), 40,90 (d), 41,86 (d), 112,71 (d), 114,50 (d), 125,81 (d), 129,40 (s), 136,68 (s), 154,80 (s, C-3), 171,35 (s, C=O) y 178,24 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 314,1 [78, (M+H)^{+}], 97,1 [100]; Acc MS m/z (FAB+) 314,17487, C_{19}H_{24}NO_{3} requiere 314,17562. HPLC (metanol/agua, 70:30; \lambda_{max} = 279,3 nm) Rt = 3,24 min, 100%. Obtenido: C, 72,60; H, 7,16; N, 4,35. C_{19}H_{23}NO_{3} requiere: C, 72,82; H, 7,40; N, 4,47.

^{a}La señal C-13 está oculta bajo los picos de disolvente.

3-hidroxi-N-etil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (23) (STX 275)

Siguiendo las condiciones de hidrogenación (véase VI-1-5), se hidrogenó durante 4,5 horas una suspensión de 12 (470 mg, 1,13 \mumoles) y Pd-C (10%, 200 mg) en MeOH/THF 2:1 (30 ml) para dar 23 como un sólido blanco (183 mg, 50%). Éste se lavó con acetona para dar un polvo blanco (121 mg, 33%): p.f. 306-308ºC; IR (KBr) 3450 (OH), 2915-2860 (alif. CH), 1715 (C=O), 1655 (C=O), 1610-1505 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 1,11 (3H, t, J =
7,0 Hz, C-2'-H_{3}), 1,16 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,22-2,98 (11H, m), 2,81-2,87 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,82 (2H, s, N-CH_{2}), 4,62 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, OH), 6,57 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,66 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H) y 7,17 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB+) 328,2 [100, (M+H)^{+}], 481,2 [13, (M+H+NBA)^{+}]; Acc MS m/z (FAB+) 328,19062, C_{20}H_{26}NO_{3} requiere 328,19127. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Obtenido: C, 72,90; H, 7,68; N, 4,09. C_{20}H_{25}NO_{3} requiere: C, 73,17; H, 7,70; N, 4,28. (ligeramente fuera)

3-hidroxi-N-propil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (24) (STX 189)

Siguiendo las condiciones de hidrogenación (véase VI-1-5), se hidrogenó durante 3 horas una suspensión de 13 (400 mg, 927 \mumoles) y Pd-C (10%, 100 mg) en MeOH/THF 2:1 (30 ml) para dar 24 como un sólido blanco (256 mg, 81%). Se recristalizó una muestra analítica en metanol para dar cristales incoloros: p.f. 183-186ºC; IR (KBr) 3445 (OH), 3050 (arom. CH), 2940-2860 (alif. CH), 1725 (C=O), 1655 (C=O), 1585-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,90 (3H, t, J = 7,4 Hz, C-3'-H_{3}), 1,17 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,30-2,98 (13H, m), 2,82-2,86 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,64-3,80 (2H, m, N-CH_{2}), 4,73 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, OH), 6,58 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,66 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H), 7,17 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 11,43 (q, C-3'), 16,64 (q, C-18), 21,29 (t), 25,62 (d), 25,76 (t), 29,56 (t), 33,65 (t), 33,75 (t), 38,66 (d), 40,32 (d), 41,51 (s, C-13), 41,63 (t, C-1'), 42,48 (d), 112,97 (d), 114,98 (d), 126,30 (d), 131,15 (s), 137,39 (s), 153,66 (s, C-3), 171,76 (s, C=O) y 178,59 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 342,3 [100, (M+H)^{+}], 133,2 [17], 111,2 [23], 97,2 [45]; MS m/z (FAB-) 494,4 [43, (M-NBA)^{-}], 340,3 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 342,20756, C_{12}H_{28}NO_{3} requiere 342,20692. HPLC (metanol/agua, 70:30; \lambda_{max} = 279,3 nm) Rt = 6,55 min, 100%. Obtenido: C, 73,90; H, 7,98; N, 4,20. C_{21}H_{27}NO_{3} requiere: C, 73,37; H, 7,97; N, 4,10.

3-hidroxi-N-butil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (25) (STX 277)

Siguiendo las condiciones de hidrogenación (véase VI-1-5), se hidrogenó durante 2 horas una suspensión de 14 (480 mg, 1,08 mmoles) y Pd-C (10%, 200 mg) en MeOH/THF 2:1 (30 ml) para dar 25 como un sólido blanco (361 mg, 94%). Se recristalizó éste en metanol para dar agujas incoloras (193 mg, 50%) y una recolección más del producto (49 mg) se obtuvo del residuo de la solución madre en la recristalización en metanol (rendimiento total 63%): p.f. 212-214ºC; IR (KBr) 3445 (OH), 2940-2870 (alif. CH), 1715 (C=O), 1655 (C=O), 1585-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,92 (3H, m, C-4'-H_{3}), 1,16 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,26-2,99 (15H, m), 2,81-2,88 (2H, m, C-6-H_{3}), 3,75 (2H, m, N-CH_{2}), 4,75 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, OH), 6,58 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,66 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H) y 7,17 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 13,76 (q, C-4'), 16,49 (q, C-18), 20,15 (t), 25,51 (t), 25,66 (t), 29,43 (t), 30,01 (t), 33,54 (t), 33,66 (t), 38,57 (d), 39,83 (t, C-1'), 40,24 (d), 41,39 (s, C-13), 42,37 (d), 112,86 (d), 114,86 (d), 126,16 (d), 131,08 (s), 137,26 (s), 153,54 (s, C-3), 171,54 (s, C=O) y 178,40 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 509,3 [5, (M+H+NBA)^{+}], 356,2 [100, (M+H)^{+}]; MS m/z (FAB-) 508,2 [35, (M+NBA)^{-}], 354,2 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 356,22247, C_{22}H_{30}NO_{3} requiere 356,22257. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Obtenido: C, 74,20; H, 8,21; N, 3,88. C_{22}H_{29}NO_{3} requiere: C, 74,33; H, 8,22; N, 3,94.

3-hidroxi-N-pentil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (26) (STX 190)

Siguiendo las condiciones de hidrogenación (véase VI-1-5), se hidrogenó durante 3 horas una suspensión de 15 (520 mg, 1,13 mmoles) y Pd-C (10%, 100 mg) en MeOH/THF 2:1 (30 ml) para dar 26 como un sólido blanco (347 mg, 83%). Se recristalizó una muestra aalítica en metanol para dar cristales blancos: p.f. 181-184ºC; IR (KBr) 3445 (OH), 2955-2870 (alif. CH), 1715 (C=O), 1660 (C=O), 1610-1505 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,89 (3H, t, J = 7,4 Hz, C-5'-H_{3}), 1,16 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,20-2,98 (17H, m), 2,81-2,86 (2H, m, C-6-H_{3}), 3,65-3,82 (2H, m, N-CH_{2}), 4,77-4,79 (1H, m, intercambiado con D_{2}O, OH), 6,58 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,65 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} =
8,2 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H) y 7,17 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,2 Hz, C-1-H); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 14,10 (q, C-5'), 16,63 (q, C-18), 22,46 (t), 25,64 (t), 25,77 (t), 27,71 (t), 29,15 (t), 29,75 (t), 33,66 (t), 33,76 (t), 38,67 (d), 40,16 (t, C-1'), 40,32 (d), 41,50 (s, C-13), 42,49 (d), 112,97 (d), 114,98 (d), 126,31 (d), 131,19 (s), 137,40 (s), 153,65 (s, C-3), 171,67 (s, C=O) y 178,52 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 739,1 [50, (2M+H)^{+}], 523,0 [20, (M+H+NBA)^{+}], 370,1 [100, (M+H)^{+}] 97,0 [15]; MS m/z (FAB-) 737,6 [20, (2M-H)^{-}], 675,4 [8, (M+2NBA)^{-}], 522,4 [30, (M+NBA)^{-}], 368,3 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 370,23940, C_{23}H_{32}NO_{3} requiere 370,23822. HPLC (metanol/agua, 80:20; \lambda_{max} = 279,3 nm) Rt = 5,42 min, 100%. Obtenido: C, 74,90; H, 8,38; N, 3,73. C_{23}H_{31}NO_{3} requiere: C, 74,96; H, 8,46; N, 3,79.

3-hidroxi-N-hexil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (27) (STX 276)

Siguiendo las condiciones de hidrogenación (véase VI-1-5), se hidrogenó durante 3 horas una suspensión de 16 (540 mg, 1,14 mmoles) y Pd-C (10%, 200 mg) en MeOH/THF 2:1 (45 ml) para dar 27 como un sólido blanco (384 mg, 88%). Se recristalizó éste en metanol para dar cristales blancos (218 mg, 50%) y una recolección más del producto (45 mg) se obtuvo del residuo de la solución madre en la recristalización en metanol (rendimiento total 60%): p.f. 157-159ºC; IR (KBr) 3435 (OH), 2930-2865 (alif. CH), 1715 (C=O), 1660 (C=O), 1585-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,87 (3H, t, J = 6,8 Hz, C-6'-H_{3}), 1,16 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,23-2,98 (19H, m), 2,81-2,87 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,74 (2H, m, N-CH_{2}), 4,68 (1H, m, intercambiado con D_{2}O, OH), 6,58 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 6,66 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,2 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H) y 7,17 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 14,00 (q, C-6'), 16,48 (q, C-18), 22,48 (t), 25,46 (t), 25,59 (t), 26,53 (t), 27,82 (t), 29,41 (t), 31,39 (t), 33,49 (t), 33,58 (t), 38,48 (d), 40,06 (t, C-1'), 40,12 (d), 41,33 (s, C-13), 42,31 (d), 112,81 (d), 114,82 (d), 126,16 (d), 130,98 (s), 137,23 (s), 153,48 (s, C-3), 171,58 (s, C=O) y 178,40 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 767,6 [48, (2M+H)^{+}], 384,3 [100, (M+H)^{+}]; MS m/z (FAB-) 765,5 [8, (2M-H)^{-}], 536,3 [10, (M+NBA)^{-}], 382,2 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 384,25350, C_{24}H_{34}NO_{3} requiere 384,25387. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Obtenido: C, 75,40;H, 8,65; N, 3,71. C_{24}H_{33}NO_{3} requiere: C, 75,16;H, 8,67; N, 3,65.

3-hidroxi-N-bromobutil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (28) (STX 235)

Siguiendo las condiciones de hidrogenación (véase VI-1-5), se hidrogenó durante 2 horas una suspensión de 17 (210 mg, 381 \mumoles) y Pd-C (10%, 100 mg) en MeOH/THF 2:1 (30 ml) para dar 28 como un sólido blanco (146 mg, 84%). Se recristalizó éste en metanol para dar cristales blancos (98 mg, 57%): p.f. 165-167ºC; IR (KBr) 3450 (OH), 2910-2860 (alif. CH), 1715 (C=O), 1660 (C=O), 1610-1505 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 1,18 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,29-3,01 (15H, m), 2,82-2,88 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,42 (2H, t, J = 6,6 Hz, CH_{2}Br), 3,72,-3,87 (2H, m, N-CH_{2}), 4,63 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, OH), 6,58 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 6,66 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,4 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,3 Hz, C-2-H) y 7,17 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H); \delta_{C} (DMSO-d_{6}, 100,4 MHz) 17,01 (q, C-18), 25,92 (t), 26,09 (t), 27,11 (t), 29,87 (t), 30,51 (t), 33,47 (t), 33,94 (t), 34,06 (t), 38,96 (d), 39,38 (t, C-1'), 40,62 (d), 41,86 (s, C-13), 42,80 (d), 113,29 (d), 115,28 (d), 126,62 (d), 131,53 (s), 137,73 (s), 153,87 (s, C-3), 171,93 (s, C=O) y 178,81 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 869,2 [64], 587,1 [46, (M+H+NBA)^{+}], 434,1 [100, (M+H)^{+}]; Acc MS m/z (FAB+) 436,12874, C_{22}H_{29}^{81}BrNO_{3} requiere 436,13103 y 434,12822, C_{22}H_{29}BrNO_{3} requiere 434,13308. HPLC (metanol/agua, 70:30; \lambda_{max} = 279,3 nm) Rt = 7,73 min, 98,3%. Obtenido: C, 61,30; H, 6,60; N, 3,17. C_{22}H_{28}BrNO_{3} requiere: C, 60,83; H, 6,50; N, 3,22.

3-hidroxi-N-ciclopropilmetil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (29) (STX 278)

Siguiendo las condiciones de hidrogenación (véase VI-1-5), se hidrogenó durante 2,5 horas una suspensión de 18 (500 mg, 1,13 mmoles) y Pd-C (10%, 200 mg) en MeOH/THF 2:1 (45 ml) para dar 29 como un sólido blanco (356 mg, 89%). Se recristalizó éste en metanol para dar cristales blancos (181 mg, 45%) y una recolección más del producto (73 mg) se obtuvo del residuo de la solución madre en la recristalización en metanol (rendimiento total 64%): p.f. 238-240ºC; IR (KBr) 3440 (OH), 2940-2865 (alif. CH), 1715 (C=O), 1655 (C=O), 1610-1505 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,29-0,34 (2H, m, C-3'-H_{2}), 0,40-0,45 (2H, m, C-4'-H_{2}), 1,13 (1H, m, C-2'-H), 1,19 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,30-3,02 (11H, m), 2,82-2,89 (2H, m, C-6-H_{3}), 3,66 (2H, m, N-CH_{2}), 4,70 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, OH), 6,58 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,66 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,2 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H) y 7,17 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 3,95 (t, C-3'), 4,03 (t, C-4'), 10,51 (d, C-2'), 16,95 (q, C-18), 25,97 (t), 26,10 (t), 29,88 (t), 31,10 (t), 34,00 (t), 39,05 (d), 40,62 (d), 41,88 (s, C-13), 42,81 (d), 44,65 (t, C-1'), 113,30 (d), 115,31 (d), 126,61 (d), 131,56 (s), 137,73 (s), 153,96 (s, C-3), 172,21 (s, C=O) y 179,10 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 707,3 [29, (2M+H)^{+}], 507,1 [72, (M+H+NBA)^{+}], 354,1 [100, (M+H)^{+}]; MS m/z (FAB-) 658,3 [13, (M-H+2NBA)^{-}], 505,2 [32, (M-H+NBA)^{-}], 352,1 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 354,20686, C_{22}H_{28}NO_{3} requiere 354,20692. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Obtenido: C,; H,; N,. C_{22}H_{27}NO_{3} requiere: C, 74,76; H, 7,70; N, 3,96.

3-hidroxi-N-(3-picolil)-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (30) (STX 234)

Siguiendo las condiciones de hidrogenación (véase VI-1-5), se hidrogenó durante 20 horas una suspensión de 19 (190 mg, 395 \mumoles) y Pd-C (10%, 100 mg) en MeOH/THF 2:1 (30 ml) para dar 30 como un sólido cremoso (141 mg, 91%). Se precipitó una muestra analítica de acetato de etilo para dar un polvo blanco: p.f.; IR (KBr) 3380 (OH), 2940-2865 (alif. CH), 1720 (C=O), 1670 (C=O), 1610-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (DMSO-d_{6}, 400 MHz) 1,11 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,14-2,94 (11H, m), 2,67-2,75 (2H, m, C-6-H_{2}), 4,82 (1H, d, J_{BA} = 14,8 Hz, N-CH_{\underline{A}}H_{B}), 4,87 (1H, d, J_{AB} =
14,8 Hz, N-CH_{A}H_{\underline{B}}), 6,44 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 6,52 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,4 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,3 Hz, C-2-H) y 7,07 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H), 7,33 (1H, dd, JC-3''-H, C-4''-H = 7,8 Hz, JC-5''-H, C-4''-H = 4,7 Hz, C-4''-H), 7,59 (1H, m, C-3''-H), 8,42-8,47 (2H, m, C-1''-H y C-5''-H) y 9,05 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, OH); MS m/z (FAB+) 544,3 [6, (M+H+NBA)^{+}], 391,2 [88, (M+H)^{+}] 273,1 [18], 156,1 [40], 135,1 [46], 119,1 [48], 95,1 [70]; MS m/z (FAB-) 542,3 [50, (M-H+NBA)^{-}], 389,3 [100, (M-H)^{-}], 276,1 [43], 258,1 [37], 195,1 [42], 124,1 [34], 92,0 [27]; Acc MS m/z (FAB+) 391,20190, C_{24}H_{27}NO_{3} requiere 391,20217.

3-hidroxi-N-terc-butil-bencil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (31) (STX 279)

Siguiendo las condiciones de hidrogenación (véase VI-1-5), se hidrogenó durante 5 horas una suspensión de 20 (620 mg, 1,16 mmoles) y Pd-C (10%, 200 mg) en MeOH/THF 2:1 (30 ml) para dar 31 como un sólido cremoso (550 mg). Se recristalizó éste en metanol para dar cristales blancos deleznables (417 mg, 81%) y una recolección más del producto (31 mg) se obtuvo del residuo de la solución madre en la recristalización en metanol (rendimiento total 87%): p.f. 128-130ºC; IR (KBr) 3415 (OH), 2955-2870 (alif. CH), 1725 (C=O), 1655 (C=O), 1610-1505 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 1,16 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,28 (9H, s, C(CH_{3})_{3}), 1,30-3,02 (15H, m), 2,81-2,87 (2H, m, C-6-H_{3}), 4,77 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, OH), 4,88 (1H, d, J_{BA} = 14,0 Hz, N-CH_{A}H_{B}), 4,95 (1H, d, J_{AB} = 14,0 Hz, N-CH_{A}H_{B}), 6,57 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,65 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,2 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H) y 7,16 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H) y 7,24-7,32 (4H, m, C-2''-H, C-3''-H, C-5''-H y C-6''-H); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 16,93 (q, C-18), 25,94 (t), 26,07 (t), 29,88 (t), 31,74 (3\timesq, C(CH_{3})_{3}), 33,99 (t), 34,07 (t), 34,87 (s, C(CH_{3})_{3}), 38,96 (d), 40,44 (d), 41,90 (s, C-13), 42,76 (d), 43,27 (t, C-1'), 113,30 (d), 115,30 (d), 125,55 (2\timesd), 126,64 (d), 128,35 (2\timesd), 131,45 (s), 134,44 (s), 137,71 (s), 150,30 (s), 153,95 (s, C-3), 172,01 (s, C=O) y 178,85 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 891,4 [80, (2M+H)^{+}], 599,2 [35, (M+H+NBA)^{+}], 446,2 [100, (M+H)^{+}]; MS m/z (FAB-) 889,5 [42, (2M-H)^{-}], 751,4 [87, (M+2NBA)^{-}], 598,3 [30, (M+NBA)^{-}], 444,2 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 445,26176, C_{29}H_{35}NO_{3} requiere 354,20692. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Obtenido: C,; H,; N,. C_{22}H_{27}NO_{3} requiere: C, 74,76; H, 7,70; N, 3,96.

3-hidroxi-N-bencil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (32) (STX 233)

Siguiendo las condiciones de hidrogenación (véase VI-1-5), se hidrogenó durante 2 horas una suspensión de 21 (230 mg, 479 \mumoles) y Pd-C (10%, 100 mg) en MeOH/THF 2:1 (30 ml) para dar 32 como un sólido blanco (170 mg, 91%). Se lavó éste en MeOH en ebullición para dar un precipitado blanco (122 mg, 65%): p.f. 298-301ºC; IR (KBr) 3430 (OH), 2950-2890 (alif. CH), 1720 (C=O), 1655 (C=O), 1610-1505 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (DMSO-d_{6}, 400 MHz) 1,12 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,18-2,92 (11H, m), 2,68-2,75 (2H, m, C-6-H_{2}), 4,79 (1H, d, J_{BA} = 14,8 Hz, N-CH_{\underline{A}}H_{B}), 4,85 (1H, d, J_{AB} = 14,8 Hz, N-CH_{A}H_{\underline{B}}), 6,45 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 6,53 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,4 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,3 Hz, C-2-H), 7,07 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H), 7,17-7,32 (5 H, m, C_{6}H_{5}) y 9,05 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, OH); \delta_{C} (DMSO-d_{6}, 100,4 MHz)^{b} 16,27 (q, C-18), 25,16 (2\timest), 29,12 (t), 32,88 (t), 33,46 (t), 37,96 (d), 40,98 (s, C-13), 41,75 (d), 42,30 (t, C-1'), 112,72 (d), 114,51 (d), 125,82 (d), 126,63 (d), 126,84 (2\timesd), 128,08 (2\timesd), 129,41 (s), 136,69 (s), 137,36 (s), 154,81 (s, C-3), 172,21 (s, C=O) y 177,97 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 390,3 [30, (M+H)^{+}], 133,2 [43], 111,2 [57], 97,2 [100], 80,1 [23]; Acc MS m/z (FAB+) 390,20622, C_{25}H_{28}NO_{3} requiere 390,20692. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Obtenido: C,75,60; H,7,01; N,3,34. C_{25}H_{27}NO_{3} + (H_{2}O)_{1/2} requiere: C, 75,35; H, 7,08; N, 3,51.

^{b} un doblete oculto bajo los picos del disolvente.

2 - 4 - Síntesis de los derivados de N-alilo 3-terc-butil-dimetilsilil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (33)

A una solución agitada de 5 (350 mg, 1,17 mmoles) en DMF (20 ml) a temperatura ambiente bajo N_{2} se añadió imidazol (96 mg, 1,40 mmoles) y cloruro de terc-butil-dimetilsililo (194 mg, 1,29 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo N_{2} durante 2 horas y se añadieron otros 2 eq. de imidazol y TBDMSCl para permitir la terminación de la reacción después de otras 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla se vertió a continuación en agua (150 ml) y la solución resultante se extrajo con acetato de etilo (150 ml). Se separó la capa orgánica, se lavó con H_{2}O (4\times80 ml), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró a presión reducida. El sólido blando obtenido se recristalizó en EtOH/H_{2}O para dar 33 como cristales blancos (336 mg, 70%) y una recogida más del producto (40 mg) se obtuvo del residuo de la solución madre en la recristalización en EtOH/H_{2}O (rendimiento global 78%): p.f. 261-264ºC; TLC (cloroformo/acetona, 8:2) R_{f} 0,65 cf. R_{f} 0,40 (5); IR (KBr) 3210 (NH), 3090 (arom. CH), 2950-2860 (alif. CH), 1730 (C=O), 1680 (C=O), 1610-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,19 (6 H, s, Si(CH_{3})_{2}), 0,97 (9H, s, C(CH_{3})_{3}), 1,23 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,31-2,96 (11H, m), 2,80-2,87 (2H, m, C-6-H_{2}), 6,57 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 6,64 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H), 7,13 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H) y 7,72 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, NH); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) -4,23 (2\timesq, Si(CH_{3})_{2}), 16,55 (q, C-18), 18,28 (s, C(CH_{3})_{3}), 25,37 (t), 25,78 (3\timesq, C(CH_{3})_{3}), 26,06 (t), 29,55 (t), 32,84 (t), 32,92 (t), 38,55 (d), 41,22 (s, C-13), 41,61 (d), 42,67 (d), 117,50 (d), 119,67 (d), 125,97 (d), 131,52 (s), 136,92 (s), 153,53 (s, C-3), 171,61 (s, C=O) y 178,36 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 827,6 [50, (2M+H^{+}], 414,2 [100, (M+H)^{+}], 356,2 [45, (M-C(CH_{3})_{3})^{+}], 72,9 [50]; MS m/z (FAB-) 719,4 [10, (M+2NBA)^{-}], 565,3 [24, (M-H+NBA)^{-}], 412,2 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 414,24527, C_{24}H_{36}NO_{5}Si requiere 414,24645. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Obtenido: C,69,90; H,8,46; N,3,40. C_{24}H_{35}NO_{5}Si_{ }requiere: C, 69,69; H, 8,53; N, 3,39.

3-terc-butil-dimetilsilil-N-alil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (34)

Siguiendo las condiciones de alquilación (véase VI-1-3), se trató 33 (500 mg, 725 mmoles) con NaH (35 mg, 870 \mumoles) y la reacción ulterior con bromuro de alilo (126 \mul, 1,45 mmoles) se completó en 7 horas. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo como diluyente dio 34 como un aceite cremoso (302 mg, 92%): TLC (cloroformo/acetona, 8:2) R_{f} 0,86 cf. R_{f} 0,66 (33); IR (KBr) 2930-2860 (alif. CH), 1725 (C=O), 1676 (C=O), 1610-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,19 (6H, s, Si(CH_{3})_{2}), 0,98 (9H, s, C(CH_{3})_{3}), 1,19 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,29-3,02 (11H, m), 2,80-2,86 (2H, m, C-6-H_{2}), 4,37 (2H, m, N-CH_{2}), 5,16 (2H, m, C-3'-H_{2}), 5,80 (1H, m, C-2'-H), 6,56 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,64 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,4 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H) y 7,13 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,2 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB+) 454,3 [100, (M+H)^{+}], 396,2 [35, (M+H-C(CH_{3})_{3})^{+}], 72,9 [54]; MS m/z (FAB-) 606,3 [32, (M+NBA)^{-}], 452,2 [100, (M-H)^{-}], 412,2 [56, (M-H-C_{3}H_{4})^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 454,27597, C_{27}H_{40}NO_{5}Si requiere 454,27775. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. CNH.

3-hidroxi-N-alil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (35) (STX 274)

Se añadió fluoruro de tetrabutilamonio hidratado (183 mg, 701 \mumoles) a una solución agitada de 34 (265 mg, 584 \mumoles) en DMF anhidro (10 ml) a temperatura ambiente bajo una atmósfera de N_{2}. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 horas y se añadieron otros 1,2 eq. de TBAF para permitir la terminación de la reacción. Después de 5 horas, se vertió la mezcla en agua (40 ml) y el precipitado blanco formado se filtró, se lavó y se secó con aire para dar un polvo blanco (172 mg, 87%). La purificación del producto en bruto que se obtuvo por recristalización en acetato de etilo dio 35 como cristales blancos (101 mg, 51%) y se obtuvo una recogida adicional del producto (13 mg) del residuo de la solución madre en la recristalización en acetato de etilo (rendimiento global 58%): p.f. 147-149ºC; TLC (cloroformo/acetona, 8:2) R_{f} 0,63 cf. R_{f} 0,80 (34); IR (KBr) 3445 (OH), 2920-2860 (alif. CH), 1720 (C=O), 1660 (C=O), 1610-1500 (arom. C=C) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 1,18 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,30-3,02 (11H, m), 2,82-2,87 (2H, m, C-6-H_{2}), 4,37 (2H, ddt, ^{4}J_{C-3'-H,C-1'-H} = 1,4 Hz, ^{3}J_{C-2'-H,C-1'-H} = 5,5 Hz, ^{1}J_{C-1'-H,C-1'-H} = 14,8 Hz, N-CH_{2}), 4,72 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, OH), 5,11-5,21 (2H, m, C-3'-H_{2}), 5,80 (1H, m, C-2'-H), 6,58 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 6,65 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,4 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H) y 7,17 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,2 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB+) 340,2 [100, (M+H)^{+}], MS m/z (FAB-) 491,1 [50, (M-H+NBA)^{-}], 338,1 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 340,19159, C_{21}H_{26}NO_{5} requiere 340,19159. HPLC (metanol/agua, 70:30; \lambda_{max} = 279,3 nm) Rt = 3,91 min, 100%. Obtenido: C, 73,90; H, 7,37; N, 4,11. C_{21}H_{25}NO_{5} requiere: C, 74,31; H, 7,42; N, 4,13.

2 - 5 - Síntesis de los compuestos precursores sulfamoilados 3-sulfamoil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (36) (STX 211)

Siguiendo las condiciones de sulfamoilación (véase VI-1-5), la reacción de 5 (100 mg, 334 \mumoles) con cloruro de sulfamoílo en 1 ml de DMA dio después de 4 horas el producto en bruto 36 (94 mg). Éste se lavó con acetona hirviendo y el sólido blanco insoluble se filtró (56 mg, 44%): p.f. 242-244ºC; TLC (cloroformo/acetona, 9:1) R_{f} 0,09 cf. R_{f} 0,17 (5); IR (KBr) 3250 (NH_{2}), 3090 (arom. CH), 2940-2850 (alif. CH), 1690 (C=O), 1695 (C=O), 1640-1560 (arom. C=C), 1370 (SO_{2}), 1170 (SO_{2}) cm^{-1}; \delta_{H} (DMSO-d_{6}, 400 MHz) 1,10 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,19-2,72 (11H, m), 2,81-2,85 (2H, m, C-6-H_{2}), 6,98 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 7,03 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} =
2,3 Hz, C-2-H) 7,38 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H), 7,91 (2H, s, intercambiado con D_{2}O, NH_{2}) y 10,65 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, NH); \delta_{C} (DMSO-d_{6}, 100,4 MHz) 16,18 (q, C-18), 24,97 (t), 25,03 (t), 29,05 (t), 32,38 (t), 32,72 (t), 37,50 (d), 40,31 (d), 40,49 (s, C-13), 42,10 (d), 119,19 (d), 121,46 (d), 126,43 (d), 137,54 (s), 137,62 (s), 147,82 (s, C-3), 172,11 (s, C=O) y 178,87 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 532,3 [23, (M+H+NBA)^{+}], 379,3 [94, (M+H)^{+}], 157,2 [32], 133,2 [56], 97,2 [100], 82,2 [28]; MS m/z (FAB-) 531,2 [37, (M+NBA)^{-}], 377,2 [100, (M-H)^{-}], 78 [17]; Acc MS m/z (FAB+) 379,13314, C_{18}H_{23}N_{2}O_{5}S requiere 379,13277. HPLC (metanol/agua, 50:50; \lambda_{max} = 266,3 nm) Rt =
5,70 min, 100%. Obtenido: C, 56,80; H, 5,83; N, 7,19. C_{18}H_{22}N_{2}O_{5}S requiere: C, 57,13; H, 5,86; N, 7,40.

3-sulfamoil-N-metil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (37) (STX 212)

Siguiendo las condiciones de sulfamoilación (véase VI-1-5), la reacción de 22 (100 mg, 319 \mumoles) con cloruro de sulfamoílo en 1 ml de DMA dio después de 3 horas el producto en bruto 37 (102 mg). Éste se recristalizó en cloroformo para dar 37 como cristales blancos (60 mg, 48%) y se obtuvo una recolección más del producto (24 mg) del residuo de la solución madre en la cristalización en cloroformo (rendimiento global 67%): p.f. 219-222ºC; IR (KBr) 3300 (NH_{2}), 3230 (NH_{2}), 3100 (arom. CH), 2945-2865 (alif. CH), 1710 (C=O), 1655 (C=O), 1605-1500 (arom. C=C), 1390 (SO_{2}), 1190 (SO_{2}) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 1,18 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,32-3,02 (11H, m), 2,89-2,93 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,16 (3H, s, N-CH_{3}), 4,85 (2H, s, intercambiado con D_{2}O, NH_{2}), 7,06 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 7,11 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,8 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,3 Hz, C-2-H) 7,33 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,2 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB+) 546,0 [10, (M+H+NBA)^{+}], 393,0 [100, (M+H)^{+}], 313,0 [12, (M+H-NH_{2}SO_{2})^{+}], 165,0 [25], 133,0 [22], 109,0 [43], 81,0 [64, (SO_{2}NH_{2}+H)^{+}]; MS m/z (FAB-) 783,42 [9, (2M-H)^{-}], 545,3 [38, (M+NBA)^{-}], 391,2 [100, (M-H)^{-}], 78,0 [16]; Acc MS m/z (FAB+) 393,14718, C_{19}H_{25}N_{2}O_{5}S requiere 393,14842. HPLC (metanol/agua, 60:40; \lambda_{max} = 266,3 nm) Rt =
4,72 min, 100%. Obtenido: C, 58,30; H, 6,17; N, 7,19. C_{19}H_{24}N_{2}O_{5}S requiere: C, 58,15; H, 6,16; N, 7,14.

3-sulfamoil-N-etil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (38) (STX 281)

Siguiendo las condiciones de sulfamoilación (véase VI-1-5), la reacción de 23 (70 mg, 214 \mumoles) con cloruro de sulfamoílo en 1 ml de DMA dio después de 1,5 horas el producto en bruto 38 (86 mg). Éste se recristalizó en acetato de etilo/hexano 1:2 para dar 38 como cristales de color crema (72 mg, 83%): p.f. 215-217ºC; IR (KBr) 3415 (NH_{2}), 3305 (NH_{2}), 2970-2870 (alif. CH), 1715 (C=O), 1665 (C=O), 1375 (SO_{2}), 1190 (SO_{2}) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 1,11 (3H, t, J = 7,0 Hz, C-2'-H_{3}), 1,17 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,24-2,99 (11H, m), 2,88-2,95 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,74-3,88 (2H, m, N-CH_{2}), 4,89 (2H, s, intercambiado con D_{2}O, NH_{2}), 7,06 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 7,12 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,4 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,5 Hz, C-2-H) y 7,33 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB+) 813,3 [40, (2M+H)], 560,1 [70, (M+H+NBA)^{+}], 407,1 [100, (M+H)^{+}]; MS m/z (FAB-) 811,4 [72, (2M-H)^{-}], 712,3 [47, (M+2NBA)^{-}], 559,2 [30, (M+NBA)^{-}], 405,1 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 407,16455, C_{20}H_{27}N_{2}O_{5}S requiere 407,16407. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Obtenido: C,; H,; N,. C_{20}H_{27}N_{2}O_{5}S requiere: C, 59,09; H, 6,45; N, 6,89.

3-sulfamoil-N-propil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (39) (STX 213)

Siguiendo las condiciones de sulfamoilación (véase VI-1-5), la reacción de 24 (100 mg, 293 \mumoles) con cloruro de sulfamoílo en 1 ml de DMA dio después de 6 horas el producto en bruto 39 (156 mg). El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con acetato de etilo/hexano (95:5) como eluyente dio 39 como un residuo blanco (107 mg, 87%). Se recristalizó una muestra analítica en acetona/hexano (1:2) para dar cristales blancos: p.f. 202-204ºC; IR (KBr) 3365 (NH_{2}), 3255 (NH_{2}), 3095 (arom. CH), 2965-2880 (alif. CH), 1710 (C=O), 1660 (C=O), 1600-1500 (arom. C=C), 1380 (SO_{2}), 1180 (SO_{2}) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,90 (3H, t, J = 7,4 Hz, C-3'-H_{3}), 1,17 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,32-3,00 (13H, m), 2,88-2,93 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,64-3,80 (2H, m, N-CH_{2}), 4,90 (2H, s, intercambiado con D_{2}O, NH_{2}), 7,06 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 7,11 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H) y 7,33 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,2 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB+) 574,0 [8, (M+H+NBA)^{+}],
421,0 [100, (M+H)^{+}], 341,0 [12, (M+H-NH_{2}SO_{2})^{+}], 109,0 [52], 97,0 [45], 81,0 [74, (SO_{2}NH_{2}+H)^{+}], 67,0 [60]; MS m/z (FAB-) 573,3 [34, (M+NBA)^{-}], 419,3 [100, (M-H)^{-}], 276,2 [10], 78 [16]; Acc MS m/z (FAB+) 421,18002, C_{21}H_{29}N_{2}O_{5}S requiere 421,17972. HPLC (metanol/agua, 70:30; \lambda_{max} = 266,3 nm) Rt = 4,61 min, 100%. Obtenido: C, 60,00; H, 6,60; N, 6,49. C_{21}H_{28}N_{2}O_{5}S requiere: C, 59,98; H, 6,71; N, 6,66.

3-sulfamoil-N-butil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (40) (STX 283)

Siguiendo las condiciones de sulfamoilación (véase VI-1-5), la reacción de 25 (90 mg, 253 \mumoles) con cloruro de sulfamoílo en 1 ml de DMA dio después de 1,5 horas el producto en bruto 40 (109 mg). El producto en bruto obtenido se recristalizó en acetona/hexano 1:2 para dar 40 como cristales blancos (67 mg, 61%) y se obtuvo una recolección más del producto (11 mg) en el residuo de la solución madre en la cristalización en acetona/hexano 1:2 (rendimiento global 71%): p.f. 194-196ºC; IR (KBr) 3335 (NH_{2}), 3250 (NH_{2}), 2940-2870 (alif. CH), 1710 (C=O), 1650 (C=O), 1385 (SO_{2}), 1190 (SO_{2}) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,92 (3H, t, J = 7,2 Hz, C-4'-H_{3}), 1,17 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,25-2,99 (15H, m), 2,88-2,92 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,75 (2H, m, N-CH_{2}), 4,91 (2H, s, intercambiado con D_{2}O, NH_{2}), 7,06 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 7,12 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,8 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,3 Hz, C-2-H) y 7,34 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB+) 869,2 [78, (2M+H)^{+}] 588,1 [78, (M+H+NBA)^{+}], 435,1 [100, (M+H)^{+}]; MS m/z (FAB-) 587,2 [32, (M+NBA)^{-}], 433,2 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 435,19598, C_{22}H_{31}N_{2}O_{5}S require 435,19537. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Obtenido: C,; H,; N,. C_{22}H_{30}N_{2}O_{5}S requiere: C, 60,81; H, 6,96; N, 6,45.

3-sulfamoil-N-pentil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (41) (STX 214)

Siguiendo las condiciones de sulfamoilación (véase VI-1-5), la reacción de 26 (100 mg, 271 \mumoles) con cloruro de sulfamoílo en 1 ml de DMA dio después de 3,5 horas el producto en bruto 41 (120 mg). El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo:acetona (95:5) como eluyente dio 41 como una espuma blanca (111 mg, 92%). Se recristalizó una muestra analítica en acetato de etilo/hexano (1:2) para dar cristales blancos: p.f. 159-161ºC; IR (KBr) 3345, 3255 (NH_{2}), 3095 (arom. CH), 2930-2870 (alif. CH), 1720 (C=O), 1655 (C=O), 1600-1500 (arom. C=C), 1385 (SO_{2}), 1190 (SO_{2}) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 100 MHz) 0,89 (3H, t, J = 7,4 Hz, C-5'-H_{3}), 1,17 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,21-2,98 (17H, m), 2,90-2,94 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,66-3,81 (2H, s, N-CH_{2}), 4,94 (2H, s, intercambiado con D_{2}O, NH_{2}), 7,06 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 7,11 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,3 Hz, C-2-H) y 7,33 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 13,95 (q, C-5'), 16,44 (q, C-18), 22,31 (t), 25,33 (2\timest), 27,54 (t), 29,00 (t), 29,32 (t), 33,46 (t), 33,55 (t), 38,06 (d), 40,02 (t, C-1'), 40,19 (d), 41,24 (s, C-13), 42,52 (d), 119,02 (d), 121,59 (d), 126,47 (d), 137,98 (s), 138,13 (s), 147,82 (s, C-3), 171,28 (s, C=O) y 178,09 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 602,0 [8, (M+H+NBA)^{+}], 449,0 [100, (M+H)^{+}], 369,1 [12, (M+H-NH_{2}SO_{2})^{+}], 133,0 [33], 111,0 [32], 97,0 [46]; MS m/z (FAB-) 601,4 [34, (M+NBA)^{-}], 447,3 [100, (M-H)^{-}], 276,2 [18]; Acc MS m/z (FAB+) 449,21109, C_{23}H_{33}N_{2}O_{5}S requiere 449,21102. HPLC (metanol/agua, 80:20; \lambda_{max} = 266,3
nm) Rt = 3,70 min, 97,9%. Obtenido: C, 61,70; H, 7,30; N, 6,22. C_{23}H_{32}N_{2}O_{5}S requiere: C, 61,58; H, 7,19; N, 6,24.

3-sulfamoil-N-hexil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (42) (STX 282)

Siguiendo las condiciones de sulfamoilación (véase VI-1-5), la reacción de 27 (130 mg, 339 \mumoles) con cloruro de sulfamoílo en 2,5 ml de DMA dio después de 2 horas el producto en bruto 42 (157 mg). El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo/acetona (9:1) como eluyente dio una espuma blanca (127 mg, 81%). Ésta se recristalizó en acetato de etilo/hexano 1:2 para dar 42 como cristales incoloros (77 mg, 49%): p.f. 112-115ºC; IR (KBr) 3310, (NH_{2}), 3190 (NH_{2}), 2925-2860 (alif. CH), 1720 (C=O), 1655 (C=O), 1390 (SO_{2}), 1185 (SO_{2}) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,88 (3H, t, J = 6,6 Hz, C-6'-H_{3}), 1,19 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,24-2,99 (19H, m), 2,88-2,94 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,66-3,82 (2H, m, N-CH_{2}), 4,91 (2H, s, intercambiado con D_{2}O, NH_{2}), 7,06 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 7,11 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H) y 7,33 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 14,15 (q, C-6'), 16,58 (q, C-18), 22,63 (t), 25,46 (t), 26,67 (t), 27,95 (t), 29,46 (t), 31,53 (2\timest), 33,59 (t), 33,68 (t), 38,18 (d), 40,19 (t, C-1'), 40,32 (d), 41,37 (s, C-13), 42,65 (d), 119,18 (d), 121,74 (d), 126,61 (d), 138,12 (s), 138,26 (s), 147,94 (s, C-3), 171,46 (s, C=O) y 178,24 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 925,3 [64, (2M+H)^{+}], 616,2 [20, (M+H+NBA)^{+}], 463,1 [100, (M+H)^{+}]; MS m/z (FAB-) 1077,5 [70, (2M+NBA)^{-}], 615,3 [70, (M+NBA)^{-}], 462,2 [100, M)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 463,22629, C_{24}H_{35}N_{2}O_{5}S requiere 463,22667. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Obtenido: C, 62,60; H, 7,43; N, 6,20. C_{24}H_{34}N_{2}O_{5}S requiere: C, 62,31; H, 7,41; N, 6,06.

3-sulfamoil-N-bromobutilil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (43) (STX 286)

Se añadió hidruro de sodio (dispersión al 60% en aceite mineral, 14 mg, 359 \mumoles) a una solución agitada de 28 (130 mg, 299 \mumoles) en DMF anhidro (2 ml) a 0ºC bajo una atmósfera de N_{2}. Una vez cesó la evolución del hidrógeno, se añadió cloruro de sulfamoílo (6 eq.). La mezcla de reacción se agitó a continuación bajo N_{2} durante 2 horas en cuyo momento se dejó calentar a temperatura ambiente. Se vertió la mezcla en salmuera (30 ml) y la solución resultante se extrajo con acetato de etilo (2\times30 ml). Se separó la capa orgánica, se lavó con salmuera (5\times25 ml), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró a presión reducida. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo (188 mg) por cromatografía de flash con cloroformo/acetona (9:1) como eluyente dio 43 como una espuma blanca (154 mg, 100%). Éste se recristalizó en acetona/hexano 1:2 para dar cristales blancos (113 mg, 73%) y se obtuvo una recolección más del producto (12 mg) del residuo de la solución madre en la recristalización en acetato de etilo/hexano 1:2 (rendimiento global: 81%): p.f. 162-165ºC; IR (KBr) 3380 (NH_{2}), 3260 (NH_{2}), 2945-2870 (alif. CH), 1720 (C=O), 1650 (C=O), 1565-1495 (arom. C=C), 1388 (SO_{2}), 1180 (SO_{2}) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 1,18 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,22-3,00 (15H, m), 2,86-2,97 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,42 (2H, t, J = 6,6 Hz, CH_{2}Br), 3,79 (2H, m, N-CH_{2}), 4,89 (2H, s, intercambiado con D_{2}O, NH_{2}), 7,06 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 7,12 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} =
8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H) y 7,33 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz) 16,63 (q, C-18), 25,42 (t), 26,46 (t), 26,74 (t), 29,44 (t), 30,14 (t), 33,20 (t), 33,55 (t), 33,66 (t), 38,16 (d), 39,07 (t, C-1'), 40,29 (d), 41,41 (s, C-13), 42,64 (d), 119,18 (d), 121,73 (d), 126,62 (d), 138,09 (s), 138,20 (s), 147,95 (s, C-3), 171,42 (s, C=O) y 178,24 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 513,1 [100, (M+H)^{+}], 435,2 [46, (M-Br+H)^{+}]; Acc MS m/z (FAB+) 513,10382, C_{22}H_{30}^{79}BrN_{2}O_{5}S requiere 513,10588 y 515,10385 C_{22}H_{30}^{81}BrN_{2}O_{5}S requiere 515,10383. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Obtenido: C,; H,; N,. C_{22}H_{29}BrN_{2}O_{5}S requiere: C, 51,46; H, 5,69; N, 5,46.

3-sulfamoil-N-ciclopropilmetil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (44) (STX 284)

Siguiendo las condiciones de sulfamoilación (véase VI-1-5), la reacción de 29 (100 mg, 283 \mumoles) con cloruro de sulfamoílo en 1 ml de DMA dio después de 1,5 horas el producto en bruto 44 (157 mg). Éste se recristalizó en aectona/hexano 1:2 para dar 44 en forma de cristales blancos (84 mg, 69%) y se obtuvo una recolección más del producto del residuo de la solución madre en la recristalización en acetona/hexano 1:2 (rendimiento global 92%): p.f. 202-204ºC; IR (KBr) 3280 (br, NH_{2}), 2960 (alif. CH), 1700 (C=O), 1660 (C=O), 1395 (SO_{2}), 1185 (SO_{2}) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,29-0,34 (2H, m, C-3'-H_{2}), 0,40-0,45 (2H, m, C-4'-H_{2}), 1,08.1,16 (1H, m, C-1'-H), 1,19 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,32-3,02 (11H, m), 2,88-2,96 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,66 (2H, m, N-CH_{2}), 4,93 (2H, s, intercambiado con D_{2}O, NH_{2}), 7,07 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 7,12 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H) y 7,34 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB+) 865,1 [55, (2M+H)^{+}], 586,1 [45, (M+H+NBA)^{+}], 433,0 [100, (M+H)^{+}]; MS m/z (FAB-) 863,4 [13, (2M-H)^{-}], 585,2 [30, (M+NBA)^{-}], 431,2 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 433,17944, C_{22}H_{29}N_{2}O_{5}S requiere 433,17972. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Obtenido: C, 61,00; H, 6,85; N, 5,91. C_{22}H_{28}N_{2}O_{5}S requiere: C, 61,09; H, 6,52; N, 6,48.

3-sulfamoil-N-(3-picolil)-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (45) (STX 237)

Siguiendo las condiciones de sulfamoilación (véase VI-1-5), la reacción de 30 (55 mg, 154 \mumoles) con cloruro de sulfamoílo en 0,5 ml de DMA dio después de 2 horas el producto en bruto 45 (50 mg). El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo/acetona (7:3) como eluyente dio 45 como un polvo blanco (27 mg, 41%). Éste se lavó con acetona hirviendo y el precipitado blanco se filtró (10 mg, 15%): p.f. 215-218ºC; IR, \delta_{H} (DMSO-d_{6}, 400 MHz) 1,10 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,15-2,98 (11H, m), 2,79-2,84 (2H, m, C-6-H_{2}), 4,81 (1H, d, J_{BA} = 14,8 Hz, N-CH_{A}H_{B}), 4,86 (1H, d, J_{AB} = 14,8 Hz, N-CH_{A}H_{B}), 6,96 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,7 Hz, C-4-H), 7,01 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H), 7,31 (1H, dd, J_{C-3''-H,C-4''-H} = 7,8 Hz, J_{C-5''-H,C-4''-H} =
4,7 Hz, C-4''-H), 7,36 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H), 7,57 (1H, m, C-3''-H), 7,89 (2H, s, intercambiado con D_{2}O, NH_{2}) y 8,41-8,44 (2H, m, C-1''-H y C-5''-H); MS m/z (FAB+) 470,3 [48, (M+H)^{+}], 133,2 [38], 111,2 [52], 97,1 [100]; MS m/z (FAB-) 622,3 [52, (M+NBA)^{-}], 468,3 [100, (M-H)^{-}], 276,2 [62], 198 [48], 139,1 [46], 93,1 [40]; Acc MS m/z (FAB+) 470,17666, C_{24}H_{28}N_{3}O_{5}S requiere 470,17497. HPLC (metanol/agua, 60:40; \lambda_{max} = 260,4 nm) Rt = 4,84 min, 100%. Obtenido: C, 60,00; H, 5,86; N, 8,57. C_{24}H_{27}N_{3}O_{5}S + (H_{2}O)_{1/2} requiere: C, 60,03; H, 5,90; N, 8,78.

3-sulfamoil-N-terc-butil-bencil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (46) (STX 285)

Siguiendo las condiciones de sulfamoilación (véase VI-1-5), la reacción de 31 (200 mg, 449 \mumoles) con cloruro de sulfamoílo en 2 ml de DMA dio después de 6,5 horas el producto en bruto 46 (235 mg). Éste se recristalizó en acetato de etilo/hexano 1:2 para dar 46 como cristales blancos (199 mg, 85%): p.f. 227-230ºC; IR (KBr) 3320 (NH_{2}), 3240 (NH_{2}), 2960-2870 (alif. CH), 1720 (C=O), 1660 (C=O), 1385 (SO_{2}), 1180 (SO_{2}) cm^{-1}; \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 1,16 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,29 (9H, s, C(CH_{3})_{3}), 1,30-3,02 (H, m), 2,87-2,93 (2H, m, C-6-H_{2}), 4,87 (2H, s, intercambiado con D_{2}O, NH_{2}), 4,87-4,96 (2H, m, N-CH_{A}H_{B}) 7,06 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 7,11 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H) y 7,24-7,34 (5H, m, C-1-H, C-2''-H, C-3''-H, C-5''-H y C-6''-H); \delta_{C} (CDCl_{3}, 100,4 MHz), 16,39 (q, C-18), 25,31 (t), 25,28 (t), 29,29 (t), 31,24 (3\timesq, C(CH_{3})_{3}), 33,46 (t), 33,53 (t), 34,39 (s, C(CH_{3})_{3}), 38,02 (d), 40,02 (d), 41,31 (s, C-13), 42,47 (d), 42,78 (t, C-1'), 119,03 (d), 121,58 (d), 125,07 (2\timesd), 126,46 (d), 127,84 (2\timesd), 133,93 (s), 137,94 (s), 138,07 (s), 147,80 (s), 149,85 (s, C-3), 171,23 (s, C=O) y 178,06 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 1049,3 [70, (2M+H)^{+}], 678,1 [20, (M+H+NBA)^{+}], 525,1 [100, (M+H)^{+}]; MS m/z (FAB-) 1047,5 [80, (2M-H)^{-}], 677,3 [22, (M+NBA)^{-}], 523,2 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 524,23309, C_{29}H_{36}N_{2}O_{5}S requiere 524,23449. HPLC (metanol/agua, 90:10; \lambda_{max} = 259,2 nm) Rt = 3,90 min, 100%. Obtenido: C,; H,; N,. C_{29}H_{36}N_{2}O_{5}S requiere: C, 66,39; H, 6,92; N, 5,34.

3-sulfamoil-N-bencil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (47) (STX 236)

Siguiendo las condiciones de sulfamoilación (véase VI-1-5), la reacción de 32 (150 mg, 385 \mumoles) con cloruro de sulfamoílo en 1,5 ml de DMA dio después de 3 horas el producto en bruto 47 (205 mg). El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo/acetona (9:1) como eluyente dio 47 como un polvo blanco (151 mg, 84%). Éste se lavó con acetona/hexano 1:2 para dar cristales blancos (133 mg, 74%): p.f. 208-210ºC; IR (KBr) 3340 (NH_{2}), 3230 (NH_{2}), 3100-3050 (arom. CH), 2950-2870 (alif. CH), 1715 (C=O), 1655 (C=O), 1610-1495 (arom. C=C), 1385 (SO_{2}), 1195 (SO_{2}) cm^{-1}; \delta_{H} (DMSO-d_{6}, 400 MHz) 1,13 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,17-2,96 (11H, m), 2,81-2,87 (2H, m, C-6-H_{2}), 4,80 (1H, d, J_{BA} = 14,8 Hz, N-CH_{\underline{A}}H_{B}), 4,86 (1H, d, J_{AB} = 14,4 Hz, N-CH_{A}H_{\underline{B}}), 6,99 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 7,04 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,4 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,3 Hz, C-2-H) 7,19-7,40 (6H, m, C_{6}H_{5} y C-1-H) y 7,92 (2H, s, intercambiado con D_{2}O, NH_{2}); MS m/z (FAB+) 469,2 [100, (M+H)^{+}] 389,2 [7, (M+H-SO_{2}NH_{2})^{+}], 97,1 [17]; MS m/z (FAB-) 935,3 [10, (2M-H)^{-}], 621,3 [38, (M+NBA)^{-}], 467,2 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 469,17892, C_{25}H_{29}N_{2}O_{5}S require 469,17972. HPLC (metanol/agua, 70:30; \lambda_{max} = 266,3 nm) Rt = 5,14 min, 100%. Obtenido: C, 63,90; H, 6,12; N, 5,86. C_{25}H_{28}N_{2}O_{5}S requiere: C, 64,08; H, 6,02; N, 5,98.

3-sulfamoil-N-alil-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (48) (STX 280)

Siguiendo las condiciones de sulfamoilación (véase VI-1-5), la reacción de 35 (150 mg, 345 \mumoles) con cloruro de sulfamoílo en 2 ml de DMA dio después de 3 horas el producto en bruto 48 (85 mg). El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo/acetona (9:1) como eluyente dio 48 como un polvo blanco (85 mg, 99%). Éste se recristalizó en acetona/hexano 1:2 para dar cristales blancos (75 mg, 87%): p.f. 210-213ºC; TLC (cloroformo/acetona, 9:1) R_{f} 0,33 cf. R_{f} 0,52 (35); IR (KBr) 3385 (NH_{2}), 3275 (NH_{2}), 2935-2870 (alif. CH), 1715 (C=O), 1670 (C=O), 1600-1495 (arom. C=C), 1385 (SO_{2}), 1185 (SO_{2}) cm^{-1}; \delta_{H} (DMSO-d_{6}, 400 MHz) 1,13 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,25-2,89 (11H, m), 2,81-2,87 (2H, m, C-6-H_{2}), 4,24 (2H, m, N-CH_{2}), 4,97-5,08 (2H, m, C-3'-H_{2}), 5,75 (1H, m, C-2'-H), 6,99 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,3 Hz, C-4-H), 7,04 (1H, dd, J_{C-1-H,C-2-H} = 8,6 Hz y J_{C-4-H,C-2-H} = 2,7 Hz, C-2-H) 7,38 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,6 Hz, C-1-H), 7,91 (2H, s, intercambiado con D_{2}O, NH_{2}); \delta_{C} (DMSO-d_{6}, 100,4 MHz)^{c} 16,33 (q, C-18), 24,85 (t), 25,04 (t), 29,04 (t), 32,83 (t), 33,46 (t), 37,45 (d), 40,93 (s, C-13), 41,08 (t, C-1'), 41,99 (d), 115,58 (t, C-3'), 119,22 (d), 121,51 (d), 126,44 (d), 132,75 (d), 137,49 (s), 137,63 (s), 147,83 (s, C-3), 170,81 (s, C=O) y 177,56 (s, C=O); MS m/z (FAB+) 837,4 [48, (2M+H)^{+}], 725,3 [12, (M+H+NBA)^{+}], 572,2 [68, (M+H+NBA)^{+}], 419,1 [100, (M+H)^{+}], 80,9 [18, (SO_{2}NH_{2}+H)^{+}]; MS m/z (FAB-) 571,1 [30, (M+NBA)^{-}], 417,1 [100, (M-H)^{-}], Acc MS m/z (FAB+) 419,16347, C_{21}H_{27}N_{2}O_{5}S requiere 419,16407. HPLC (metanol/agua, 70:30; \lambda_{max} = 266,3 nm) Rt = 3,25 min, 100%. Obtenido: C, 60,30; H, 6,32; N, 6,56. C_{21}H_{26}N_{2}O_{5}S requiere: C, 60,27; H, 6,26; N, 6,69.

^{c} un doblete oculto bajo los picos del disolvente.

2-6 - Síntesis de compuestos precursores sulfamoilados 2-yodo-estrona (49)

A una solución agitada de estrona (10 g, 36,98 mmoles) en una mezcla de ácido acético (570 ml) y tetrahidrofurano (280 ml) calentada a 55ºC, se añadió acetato mercúrico (5,89 g, 18,49 mmoles). Tras 15 minutos, se añadió yodo (8,70 g, 34,37 mmoles) para dar una solución naranja transparente que se agitó durante dos horas a temperatura ambiente. La mezcla amarilla clara resultante se concentró a continuación a presión reducida y se añadió una solución de yoduro potásico (acuosa al 5%, 300 ml). Se extrajo la fracción orgánica con acetato de etilo (2\times300 ml), se lavó con solución acuosa de tiosulfato sódico (3\times200 ml) y salmuera (1\times200 ml), se secó (MgSO_{4}), se filtró y evaporó al vacío. El sólido marrón en bruto que se obtuvo se recristalizó en primer lugar en ácido acético para dar 49 como un sólido azul (6,42 g, 44%) y se obtuvo una recolección más del producto (3,00 g) a partir del residuo de la solución madre por recristalización en etanol (rendimiento total "en bruto" 64%). Se recristalizaron ambas recolecciones en etanol para dar cristales exfoliables de color gris claro (8,20 g, rendimiento total 56%): p.f. 213-215ºC (dec) (lit. ºC);^{43} \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,91 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,36-2,57 (13H, m), 2,83-2,86 (2H, m, C-6-H_{2}), 5,09 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, OH), 6,74 (1H, s, C-4-H) y 7,52 (1H, s, C-1-H).

2-metoxi-estrona (50)

2-yodoestrona 49 (4 g, 10,09 mmoles) y cloruro de cobre (452 mg, 3,365 mmoles) se agitaron a temperatura ambiente bajo una atmósfera de N_{2} en piridina anhidra (35 ml) durante 30 minutos. Una solución 5,1 M recién preparada de metóxido de sodio (0,101 moles, 19,7 ml) se añadió a continuación a una mezcla y la solución azul se calentó a reflujo durante 45 minutos bajo N_{2}. Tras el enfriamiento, se vertió la solución naranja resultante en hielo y se acidificó con HCl 5 M. Se extrajo la capa orgánica con acetato de etilo (3\times200 ml), se lavó con solución saturada de bicarbonato de sodio (2\times200 ml) y salmuera (2\times200 ml), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó al vacío. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con acetato de etilo/hexano (3:17 a 5:15) como eluyente dio 50 como un residuo cremoso (2,58 g, 78%): p.f. 167-170ºC (lit. ºC);^{43} \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz), 0,92 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,38-2,54 (13H, m), 2,80-2,84 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,86 (3H, s, OCH_{3}), 5,45 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, OH), 6,66 (1H, s, C-4-H) y 6,79 (1H, s, C-1-H).

2-metoxi-3-benciloxi-estrona (51)

A una solución agitada de 50 (1,51 g, 6,36 mmoles) en DMF (20 ml) a 0ºC bajo una atmósfera de N_{2}, se añadió en porciones terc-butóxido de potasio (1,07 mg, 9,54 mmoles). Se agitó la suspensión naranja resultante bajo N_{2} durante 2 horas, en cuyo momento se dejó calentar a temperatura ambiente. Se añadió a continuación bromuro de bencilo (1,13 ml, 9,54 mmoles) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente, bajo N_{2} durante dos horas. La solución naranja resultante se vertió en agua (50 ml) y se extrajo la fracción orgánica con acetato de etilo (2\times50 ml), se lavó con agua (2\times50 ml), salmuera (2\times50 ml), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó al vacío. Se recristalizó el producto en bruto obtenido para dar 51 como un polvo naranja claro (2,3 g). Éste se recristalizó más para dar en etanol para dar un polvo de color crema (1,52 g, 61%) y se obtuvo una recolección más del producto (0,29 g) a partir del residuo de la solución madre por recristalización en metanol (rendimiento total 73%): p.f. 120-123ºC (lit. ºC);^{43} \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 0,92 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,36-2,55 (13H, m), 2,74-2,85 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,86 (3H, s, OCH_{3}), 5,11 (2H, s, OCH_{2}Ar), 6,64 (1H, s, C-4-H), 6,84 (1H, s, C-1-H) y 7,29-7,46 (5H, m, C_{6}H_{5}); MS m/z (FAB+) 495,2 [10, (M+H+NBA)^{+}], 342,1 [100, (M+H)^{+}], 299,1 [40, (M+H-Ac)^{+}]; MS m/z (FAB-) 647,3 [12, (M+2NBA)^{-}], 493,2 [34, (M-H+NBA)^{-}], 340,1 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 342,17046, C_{20}H_{24}NO_{4} requiere 342,17053.

Ácido 2-metoxi-3-benciloxi-marrianólico (52)

Éste se preparó de manera similar a la del ácido bencil marrianólico 9. Se añadieron gota a gota y alternativamente una solución de yodo (2,81 g, 11,07 mmoles) en 35 ml de MeOH y una solución de KOH (5,05 g) en 10 ml de agua y 22 ml de MeOH a una solución agitada de 2-metoxi-3-benciloxi-estrona (51) (1,52 g, 3,89 mmoles) en MeOH (700 ml). La espuma naranja en bruto resultante (1,80 g) se disolvió a continuación en una solución de KOH (2,8 g) en MeOH/H_{2}O (1:2, 84 ml) y se calentó a reflujo durante 4 horas. El residuo naranja (4,32 g) que se obtuvo se fraccionó por cromatografía de flash con cloroformo/metanol (95:5) como eluyente y dio 52 como un residuo naranja (311 mg, 18%): \delta_{H} (CDCl_{3}, 400 MHz) 1,02 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,21-2,38 (11H, m), 2,64-2,70 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,72 (3H, s, OCH_{3}), 5,01 (2H, s, OCH_{2}Ar), 6,70 (1H, s, C-4-H), 6,85 (1H, s, C-1-H) 7,30-7,45 (5H, m, C_{6}H_{5}) y 12,20 (2H, br. s, intercambiado con D_{2}O, CO_{2}H); MS m/z (FAB+) 495,2 [10, (M+H+NBA)^{+}], 342,1 [100, (M+H)^{+}], 299,1 [40, (M+H-Ac)^{+}]; MS m/z (FAB-) 647,3 [12, (M+2NBA)^{-}], 493,2 [34, (M-H+NBA)^{-}], 340,1 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 342,17046, C_{20}H_{24}NO_{4} requiere 342,17053.

2-metoxi-3-benciloxi-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (53)

Éste se preparó de manera similar a la de 10 presión reacción del ácido 2-metoxi-3-benciloxi-marrianólico (52) (300 mg, 684 mmoles) con urea (300 mg, 4,99 mmoles) a 180ºC. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo se fraccionó por cromatografía de flash con cloroformo/acetona (95:5) como eluyente dio 53 como un polvo amarillo claro (170 mg, 59%):p.f. 84-87ºC; \delta_{H} (DMSO-d_{6}, 400 MHz) 1,10 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,14-2,66 (11H, m), 2,67-2,72 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,73 (3H, s, OCH_{3}), 5,02 (2H, s, OCH_{2}Ar), 6,73 (1H, s, C-4-H), 6,86 (1H, s, C-1-H) y 7,30-7,46 (5H, m, C_{6}H_{5}) y 10,64 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, NH); MS m/z (FAB+) 495,2 [10, (M+H+NBA)^{+}], 342,1 [100, (M+H)^{+}], 299,1 [40, (M+H-Ac)^{+}]; MS m/z (FAB-) 647,3 [12, (M+2NBA)^{-}], 493,2 [34, (M-H+NBA)^{-}], 340,1 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 342,17046, C_{20}H_{24}NO_{4} requiere 342,17053.

2-metoxi-3-hidroxi-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (54) (STX 325)

Siguiendo las condiciones de hidrogenación (véase VI-1-4), se hidrogenó durante 4 horas una suspensión de 53 (150 mg, 357 \mumoles) y Pd-C (10%, 80 mg) en MeOH/THF 2:1 (15 ml) para dar 54 como un polvo amarillo claro (115 mg, 97%). Se recristalizó en metanol una muestra analítica para dar cristales blancos: p.f. 202-205ºC; \delta_{H} (DMSO-d_{6}, 400 MHz) 1,10 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,13-2,42 (11H, m), 2,63-2,69 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,71 (3H, s, OCH_{3}), 6,45 (1H, s, C-4-H), 6,78 (1H, s, C-1-H), 8,67 (1H,S, intercambiado con D_{2}O, OH) y 10,63 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, NH); MS m/z (FAB+) 495,2 [10, (M+H+NBA)^{+}], 342,1 [100, (M+H)^{+}], 299,1 [40, (M+H-Ac)^{+}]; MS m/z (FAB-) 647,3 [12, (M+2NBA)^{-}], 493,2 [34, (M-H+NBA)^{-}], 340,1 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 342,17046, C_{20}H_{24}NO_{4} requiere 342,17053.

2-metoxi-3-sulfamoíl-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (55) (STX 326)

Se añadió hidruro de sodio (dispersión al 60% en aceite mineral, 8 mg, 200 \mumoles) a una solución agitada de 54 (55 mg, 167 \mumoles) en DMF anhidro (1 ml) a 0ºC bajo una atmósfera de N_{2}. Una vez cesó la evolución del hidrógeno, se añadió cloruro de sulfamoílo (6 eq.). Se agitó a continuación la mezcla de reacción bajo N_{2} durante la noche en cuyo momento se dejó calentar a temperatura ambiente. Se vertió la mezcla en salmuera (20 ml) y la solución resultante se extrajo con acetato de etilo (2\times20 ml). Se separó la capa orgánica, se lavó con salmuera (4\times20 ml), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró a presión reducida. El fraccionamiento del producto en bruto que se obtuvo por cromatografía de flash con cloroformo/acetona (8:2) como eluyente dio 55 como una espuma blanca (30 mg, 48%). Éste se recristalizó en acetona/hexano 1:2 para dar cristales blancos (23 mg, 37%): p.f. 225-230ºC; \delta_{H} (DMSO-d_{6}, 400 MHz) 1,11 (3H, s, C-18-H_{3}), 1,21-2,47 (11H, m), 2,71-2,75 (2H, m, C-6-H_{2}), 3,77 (3H, s, OCH_{3}), 7,00 (1H, s, C-4-H o C-1-H) 7,02 (1H, s, C-1-H o C-4-H), 7,84 (2H, s, intercambiado con D_{2}O, NH_{2}) y 10,65 (1H, s, intercambiado con D_{2}O, NH); MS m/z (FAB+) 495,2 [10, (M+H+NBA)^{+}], 342,1 [100, (M+H)^{+}], 299,1 [40, (M+H-Ac)^{+}]; MS m/z (FAB-) 647,3 [12, (M+2NBA)^{-}], 493,2 [34, (M-H+NBA)^{-}], 340,1 [100, (M-H)^{-}]; Acc MS m/z (FAB+) 342,17046, C_{20}H_{24}NO_{4} requiere 342,17053.

Abreviaturas

\ring{A}: Ángstrom

Ac: acetilo

Acc MS: espectrometría de masas de precisión

Adiol: androstenediol

Adiona: androstenodiona

AG: aminoglutetimida

aq: acuosa

Ar: arilo

arom: aromático

BMA: ácido 3-bencil-marrianólico

Bn: bencilo

br: amplia

ºC: grados Celsius

^{13}C RMN: RMN de carbono

ca: aproximadamente

cm: centímetros

CUMATO: 4-metilcumarina-7-O-sulfamato

\delta: desplazamiento químico en ppm

d: doblete

dd: doblete de dobletes

DHEA: deshidroepiandrosterona

DMF: N,N-dimetilformamida

DMSO: sulfóxido de dimetilo

E1: estrona

E2: estradiol

EMATE: estrona-3-O-sulfamato

ER: receptor de estrógeno

eq: equivalente

FAB: bombardeo atómico rápido

g: gramo(s)

h: hora(s)

hER: receptor de estrógeno humano

1H RMN: RMN de protones

HPLC: cromatografía líquida a alta presión

17\beta-HSD: 17\beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa

Hz: hercios

IC_{50}: concentración que produce el 50% de inhibición

IR: infrarrojo

J: acoplamiento constante en Hz

\lambda_{max}: longitud de onda de absorción máxima

lit.: referencia bibliográfica

\mu: micro

m: multiplete

M: mol por litro

m-NBA: alcohol meta-nitrobencílico

ARN-m: ácido ribonucleico mensajero

MHz: megahercio

min: minuto

mmol: milimol

mol: mol

p.f.: punto de fusión

MS: espectrometría de masas

m/z: relación masa a carga

NADPH: fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido

nM: nanomol

RMN: resonancia magnética nuclear

ppm: partes por millón

R_{f}: factor de retención

t.a.: temperatura ambiente

S. D.: desviación típica

Pd-C: paladio-carbón activo

TBAF: fluoruro de tetrabutilamonio

TBDMS: terc-butil-dimetilsililo

THF: tetrahidrofurano

TLC: cromatografía en capa fina

TMS: tetrametilsilano

v: frecuencia de una señal en hercios

vs: frente a.

Referencias

(1) Saunders, C. M.; Baum, M. Management of early breast cancer. Oncol. in Pract 1994, 3, 4-8

(2) Nicholls P. J. Breast cancer management: science and care together. Pharm. J. 1997, 259, 459-470

(3) Miller, B. A.; Kolonel, L. N.; Bernstein, L.; Young, Jr. J. L.; Swanson, G. M.; West, D.; Key, C. R.; Liff, J. M.; Glover, C. S.; Alexander, G. A.; et al. (eds). Raciat/Ethnic patterns of cancer in the united states 1988-1992. National Cancer Institute 1996

(4) (a) Kaae, S. y Johansen, H. Does simple mastectomy followed by irradiation offer the survival comparable to radical procedures? International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 1977, 2, 1163-1166 (b) Holli, K.; Saaristo, R.; Isola, J.; Joensuu, H. y Hakama, M. Lumpectomy with or without postoperative radiotherapy for breast cancer with favourable prognostic features: results of a randomised study. Br. J. Cancer 2001, 84(2), 164-169

(5) Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group. Effects of adjuvant Tamoxifen and of cytotoxic therapy on mortality in early breast cancer. N. Eng. J. Med. 1988, 319, 1681-1692

(6) Gorski, J.; Toft, D.; Shyamala, G.; Smith, D.; Notides, A. Hormones receptors: studies on the interaction of estrogens with the uterus. Recent Prog. Horm. Res. 1968, 24, 45-80

(7) Gorski, J. y Gannon F. Current models of steroid hormone action: a critique. Ann. Rev. Physiol. 1976, 38, 425-450

(8) Coulson, C. J. Steroid biosynthesis and action, 2nd edition. Molecular Mechanism of Drug Action. 1994, 95-122

(9) (a) Horwitz, K. B. y McGuire, W. L. Nuclear mechanism of estrogen action: effects of oestradiol and anti-estrogens on estrogens receptors and nuclear receptor processing. J. Biol. Chem. 1978, 253, 8185-8191 (b) Horwitz, K. B.; Koseki, Y. y McGuire, W. L. Oestrogen control of progesterone receptor in human breat cancer: role of oestradiol and antiestrogen. Endocrinology 1978, 103, 1742-1751

(10) (a) Jordan, V. C. The strategic use of antiestrogens to control the development and growth of breast cancer. Cancer. 1992, 70, 977-982 (b) Powles, T. J. Breast cancer prevention Breast Cancer Res. 2000, 2, 10-12

(11) Wakeling, A. E.; Bowler, J. Steroidal pure antiestrogens. J. Endocrinol. 1987, 112, R7-R10

(12) Sexton, M. J.; Gherman, R. B. Selective estrogen receptor modulators: the ideal estrogen replacement? Prim. Care. Update Ob/Gyns 2001, 8(1), 25-30

(13) Agnusdei, D.; Liu-Leage, S.; Augendre-Ferrante, B. Ann. Endocrinol. 1999, 60 (3), 242-246

(14) John Smith, H.; Nicholls, P. J.; Simons, C.; Le Lain, R. Inhibitors of steroidogenesis as agents for the treatment of hormone-dependent breast cancer. Exp. Opin. Ther. Patents 2001, 11, 789-824

(15) (a) Castiglione-Gertsch, M. New aromatase inhibitors: more selectivity, less toxicity, unfortunately, the same activity. Eur. J. Cancer 1996, 32A, 393-395 (b) Miller, W. R. Aromatase inhibitors - where are we now? Br. J. Cancer 1996, 73, 415-417

(16) Santner, S. J.; Feil, P. D y Santen, R. J. In situ estrogen production via the oestrone sulphatase pathway in breast tumour: relative importance vs the aromatase pathway. J. Clin. Endocrin. Metab. 1984, 59, 29-33

(17) Purohit, A. Williams, G. J.; Howarth, N. M.; Potter, B. V. L. y Reed, M. J. Inactivation of steroid sulphatase by an active site-directed inhibitor, estrone-3-O-sulfamate. Biochem. 1995, 34, 11508-11514

\newpage

(18) Purohit, A.; Williams, G. J.; Roberts, C. J.; Potter, B. V. L.; Reed, M. J. In vivo inhibition of oestrone sulphatase and dehydroepiandrosterone sulphatase by estrone-3-O-sulfamate. Int. J. Cancer 1995, 62, 106-111

(19) Woo, L. W. L.; Howarth, N. M.; Purohit, A.; Hejaz, H. A. M.; Reed, M. J. y Potter, B. V. L. Steroidal and nonsteroidal sulfamates as potent inhibitors of steroid sulphatase. J. Med. Chem. 1998, 41, 1068-1083.

(20) Purohit, A.; Woo, L. W. L.; Singh, A.; Winterborn, C. J.; Potter, B. V. L. y Reed, M. J. In vivo activity of 4-methylcoumarin-7-O-sulfamate, a non steroidal, non estrogenic steroid sulphatase inhibitor. Cancer Res. 1996, 56, 4950-4955

(21) (a) Woo, L. W. L.; Purohit, A.; Malini, B.; Reed, M. J. y Potter, B. V. L. Potent active site-directed inhibition of steroid sulphatase by tricyclic coumarin-based sulfamates. Chemistry & Biology 2000, 7, 773-791 (b) Malini, B.; Purohit, A.; Ganeshapillai, D.; Woo, L. W. L.; Potter, B. V. L.; Reed, M. J. Inhibition of steroid sulphatase activity by tricyclic coumarin sulfamates. J. Steroid Biochem. molec. Biol. 2000, 75, 253-25 (c) Purohit, A.; Woo, L. W. L.; Barrow, D.; Hejaz, H. A. M.; Nicholson, R. I.; Potter, B. V. L.; Reed, M. J. Non-steroidal and steroidal sulfamates: new drugs for cancer therapy. mol. Cell. Endocrinol. 2001, 171, 129-135

(22) Purohit, A.; Woo, L. W. L.; Potter, B. V. L.; Reed, M. J. In vivo inhibition of oestrone sulphatase activity and growth of nitrosomethylurea-induced mammary tumours by 667 COUMATE. Cancer Res. 2000, 60, 3394-
3396

(23) Claussner, A.; Nédelec, L.; Nique, F.; Philibert, D.; Teush, G.; Van de Velde, P. 11b-Amidoalkylestradiols as new series of pure anti-estrogens. J. Steroid. Biochem. 1992, 41, 609-614

(24) Li, P-K.; Chu, G-C.; Guo, J. P.; Selcer, K. W. Development of potent non-estrogenic oestrone sulphatase inhibitors. Steroids 1998, 63, 425-432

(25) (a) Jin, J-Z.; Lin, S-X. Human estrogenic 17b-hydroxysteroid dehydrogenase: predominance of oestrone reduction and its induction by NADPH. Biochem. Biophys. Res. 1999, 259, 489-493 (b) Penning, T. M. molecular endocrinology of hydroxysteroid dehydrogenases. Endocrine Reviews 1997, 18, 281-305

(26) (a) Labrie, F. At the cutting edge. Intracrinology. mol. Cell. Endocrinol. 1991, 78, C113-C118 (b) Poulin, R.; Labrie, F. Stimulation of cell proliferation and estrogenic response by adrenal C19-?5-steroids in the ZR-75-1 Human Breast Cancer Cell Line. Cancer Res. 1986, 46, 4933-4937

(27) (a) Peltoketo, H.; Luu-The, V.; Simard, J.; Adamski, J. 17b-hydroxysteroid dehydrogenase (HSD)/17-ketosteroid reductase (KSR) family; nomenclature and main characteristics of the 17 HSD/KSR enzymes. J. mol. Endocrinol. 1999, 23, 1-11 (b) Peltoketo, H.; Isomaa, V.; Maentausta, O.; Vihko, R. Complete amino acid sequence of human placental 17b-hydroxysteroid dehydrogenase deduced from cDNA. FEBS Lett. 1988, 239, 73-77 (c) Wu, L.; Einstein, M.; Geissler, W. M.; Chan, H. K.; Elliston, K. O.; Andersson, S. Expression cloning and characterization of human 17b-hydroxysteroid dehydrogenase type 2, a microsomal enzyme possessing 20a-hydroxysteroid dehydrogenase activity. J. Biol. Chem. 1993, 268, 12964-12969 (d) Geissler, W. M.; Davis, D. L.; Wu, L.; Bradshaw, K. D.; Patel, S.; Mendonca, B. B.; Elliston, K. O.; Wilston, J. D.; Russell, D. W.; Andersson, S. Male pseudohermaphroditism caused by mutation of testicular 17b-hydroxysteroid dehydrogenase 3. Nat. Genet. 1994, 7, 34-39 (e) Adamski, J.; Normand, T.; Leenders F.; Monte, D.; Begue, A.; Stehelin, D.; Jungblut, P. W.; de Launoit, Y. molecular cloning of a novel widely expressed human 80 kDa 17b-hydroxysteroid dehydrogenase IV. Biochem. J. 1995, 311, 437-443 (f) Deyashiki, Y.; Ohshima, K.; Nakanishi, M.; Sato, K.; Matsuura, K.; Hara, A. molecular cloning and characterization of mouse oestradiol 17b-dehydrogenase (A-specific), a member of the aldoketoreductase family. J. Biol. Chem. 1995, 270, 10461-10467

(28) Tremblay, M. R.; Auger, S. y Poirier, D. Synthesis of 16-(bromoalkyl)-estradiols having inhibitory effect on human placental oestradiol 17b-hydroxysteroid dehydrogenase (17b-HSD type 1). Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 505-523

(29) Tremblay, M. R.; Poirier, D. Overview of a rational approach to design type I 17b-hydroxysteroid dehydrogenase inhibitors without estrogenic activity: chemical synthesis and biological evaluation. J. Steroid. Biochem. 1998, 66, 179-191

(30) Collins, B. M.; Mac Lachlan, J. A.; Arnold, S. F. The estrogenic and anti-oestrogenic activities of phytochemicals with the human estrogen receptor expressed in yeast. Steroids 1997, 62, 365-372

(31) (a) Makela, S.; Poutanen, M.; Kostian, M. L.; Lehtimaki, N.; Strauss, L.; Santti, R.; Vihko, R. Inhibition of 17 beta-hydroxysteroid oxidoreductase by flavonoids in breast and prostate cancer cells. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1998, 217, 310-316

(32) LeBail, J. C.; Laroche, T.; Marre-Foumier, F.; Habrioux, G. Aromatase and 17b-hydroxysteroid dehydrogenase inhibition by flavonoids. Cancer Lett. 1998, 133, 101-106

(33) Coldham, N. G.; James, V. H. T. A possible mechanism for increased breast cell proliferation by progestins through increased reductive 17b-hydroxysteroid dehydrogenase activity. Int. J. Cancer 1990, 45, 174-178

(34) Purohit, A.; Hejaz, H. A. M.; Walden, J.; MacCarthy-Marrogh, L.; Packam, G.; Potter, B. V. L.; Reed, M. J. The effect of 2-methoxyestrone-3- O-sulphamate on the growth of breast cancer cells and induced mammary tumours. Int. J. Cancer 2000, 85, 584-589

(35) Heer, J.; Miescher, K. Über Steroide. Marrianol- und Doisynoisciure. Über oestrogene carbonsäuren II. Helv. Chim. Acta 1945, 28, 156-165

(36) (a) Matkovics, B.; Taródi, B.; Baláspiri, L. Rearangement of steroids, VII. Schmidt reaction and Beckmann rearrangement of oestrone and its derivatives. Acta Chim. Acad. Scien. Hung. 1974, 80, 79-87 (b) Regan, B. M.; Newton Hayes, F. 17- and 17-Aza-D-homosteroids. J. Am. Chem. Soc. 1956, 78, 639-643

(37) Gupta, R. y Jindal, D. P. Synthesis and biological activity of some D-ring modified oestrone derivatives. Ind. J. Chem. 1999, 38B, 563-571

(38) Love, B. y Dawson, C. R. Alkylphenols related to the poison ivy principle. An improved method of synthesis involving the Na-Butanol cleavage of benzyl ethers. J. Am. Chem. Soc. 1956, 78, 6095-6101

(39) Okada, M.; Iwashita, S.; Koizumi, N. Efficient general method for suffamoylation of a hydroxyl group. Tet. Lett. 2000, 41, 7047-7051.

(40) C. A. Hioruchi & J. Y. Satoh, Regioselective 2-lodination of Estradiol, Estriol & Oestrone, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1982, 671-672.

(41) M. Numazawa y Y. Ogura, J. Chem Soc., Chem, Commun. 1983, 9, 533.

(42) Williams, G. J.; Woo, L. W. L.; Mahon, M. F.; Purohit, A.; Reed, M. J.; Potter, B. V. L. X-ray crystal structure and mechanism of action of oestrone 3-O-sulphamate, a synthetic active site-directed inhbitor of oestrone sulphatase. Pharm. Sci. 1996, 2, 11-16

(43) Ghosh, D.; Pletnev, V. Z.; Zhu, D-W. et al. Structure of the human estrogenic 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase at 2.20 A resolution. Structure, 1995, 3, 503-513

(44) (a) Lin, S. X.; Han, Q.; Azzi, A.; Zhu, D-W.; Gongloff, A.; Campbell, R. L. 3D structure of human estrogenic 17b-HSD: binding with various steroids. J. Steroid Biochem. mol. Biol. 1999, 69, 425-429 (b) Puranen, T.; Poutanen, M.; Ghosh, D.; Vihko, R. y Vihko, P. Origin of substrate specificity of human and rat 17b-hydroxysteroid dehydrogenase Type 1, using chimeric enzymes and site-directed substitutions. Endocrinology 1997, 138, 3532-3539

(45) Breton, R.; Housset, D.; Mazza, C.; Fontecilla-Camps, J. C. The structure of a complex of human 17b-hydroxysteroid dehydrogenase with oestradiol and NADP+ identifies two principal targets for the design of inhibitors. Structure (Lond) 1996, 4, 905-915

(46) Apel, R.; Berger, G. Über das hydrazidosulfamid Chem. Ber. 1958, 91, 1339-1341

(47) Woo, L. W. W.; Lightowler, M.; Purohit, A.; Reed, M. J.; Potter, B. V. L. Heteroatom-substituted analogues of the active-site directed inhibitor estra-1,3,5(10)-trien-17-one-3-sulphamate inhibit oestrone sulphatase by different mechanism. J. Steroid Biochem mol. Biol. 1996, 57, 79-88

(48) Duncan, L.; Purohit, A.; Howarth, N. M.; Potter, B. V. L.; Reed, M. J. Inhibition of oestrone sulphatase activity by estrone-3-methyl-thiophosphonate: a potential therapeutic agent in breast cancer Cancer Res. 1993, 53, 298-303.

Claims

1. Compuesto de Fórmula XII:

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32

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en la que R^{1} es un grupo sulfamato de fórmula (R^{4})(R^{5})NSO_{2}-O-;

R^{4} y R^{5} se seleccionan independientemente de entre hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alquenilo y arilo o combinaciones de éstos, o que representan conjuntamente alquileno, en la que el o cada alquilo o cicloalquilo o alquenilo contienen opcionalmente uno o más heteroátomos o grupos;

G es H o un sustituyente seleccionado de entre OH o un grupo hidrocarbilo;

en la que el sistema de anillo está opcionalmente sustituido presión con uno o más sustituyentes seleccionados de entre hidrógeno, alquilo, alcoxi, alquinilo y halógeno.

2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que G o el grupo hidrocarbilo es un grupo hidrocarbonado opcionalmente sustituido.

3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que G o el grupo hidrocarbilo es un grupo alquilo opcionalmente sustituido.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que G o el grupo hidrocarbilo se selecciona de entre el grupo alquilo C_{1}-C_{10}, tal como el grupo alquilo C_{1}-C_{6} y el grupo alquilo C_{1}-C_{3}.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que G o el grupo hidrocarbilo se selecciona de entre el grupo haloalquilo C_{1}-C_{10}, el grupo haloalquilo C_{1}-C_{6}, el grupo haloalquilo C_{1}-C_{3}, el grupo bromoalquilo C_{1}-C_{10}, el grupo bromoalquilo C_{1}-C_{6}, el grupo bromoalquilo C_{1}-C_{3}.

6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que G o el grupo hidrocarbilo se selecciona de entre -(CH_{2})_{1-10}-arilo, -(CH_{2})_{1-10}-Ph, (CH_{2})_{1-10}-Ph-alquilo C_{1-10}, -(CH_{2})_{1-5}-Ph, (CH_{2})_{1-5}-Ph-alquilo C_{1-5}, -(CH_{2})_{1-3}-Ph, (CH_{2})_{1-3}-Ph-alquilo C_{1-3}, -CH_{2}-Ph y -CH_{2}-Ph-C(CH_{3})_{3}.

7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que G o el grupo hidrocarbilo se selecciona de entre -(CH_{2})_{1-10}-cicloalquilo, -(CH_{2})_{1-10}-cicloalquilo C_{3-10}, -(CH_{2})_{1-7}-cicloalquilo C_{3-7}, -(CH_{2})_{1-5}-cicloalquilo C_{3-5}, -(CH_{2})_{1-3}-cicloalquilo C_{3-5} y -CH_{2}- cicloalquilo C_{3}.

8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que G o el grupo hidrocarbilo es un grupo alqueno.

9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que G o el grupo hidrocarbilo se selecciona de entre el grupo alqueno C_{1}-C_{10}, el grupo alqueno C_{1}-C_{6} y el grupo alqueno C_{1}-C_{3}.

10. Compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en el que G es H.

11. Compuesto según la reivindicación 1, en el que por lo menos uno de entre R^{4} y R^{5} es H.

12. Compuesto según la reivindicación 11, en el que R^{4} y R^{5} son H.

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13. Compuesto que es

33

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14. Compuesto que es

34

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15. Compuesto de Fórmula XII:

35

en la que G se selecciona de entre H, OH, alquilo C_{1}-C_{10}, haloalquilo C_{1}-C_{10}, -(CH_{2})_{1-10}-arilo, -(CH_{2})_{1-10}-cicloalquilo y alqueno C_{1}-C_{10};

en la que R^{1} es OH

en la que R^{4} y R^{5} se seleccionan independientemente de entre H, alquilo, cicloalquilo, alquenilo y arilo o combinaciones de éstos, o que representan conjuntamente alquileno, en la que el o cada alquilo o cicloalquilo o alquenilo contienen opcionalmente uno o más heteroátomos o grupos.

16. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, mezclado opcionalmente con un portador, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

17. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su utilización en medicina.

18. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para la preparación de un medicamento destinado a su utilización en la terapia de una dolencia o enfermedad asociada a la sulfatasa esteroidea (STS).

19. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para la preparación de un medicamento destinado a su utilización en la terapia de una dolencia o enfermedad asociada a niveles de STS desfavorables.

20. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para la preparación de un producto farmacéutico destinado a inhibir la actividad de la sulfatasa esteroidea (STS).

21. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para la preparación de un producto farmacéutico destinado al tratamiento del cáncer.

22. Utilización según la reivindicación 21, en la que el cáncer es el cáncer de mama.