ES2257964B1 - METHOD OF PRESERVATION OF CRUSTACEANS AGAINST MELANOSIS. - Google Patents
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Abstract
Método de preservación de crustáceos frente a la melanosis. Método de preservar un crustáceo frente a la melanosis, que consiste en poner en contacto los crustáceos con una solución que contiene una cantidad adecuada de bacterias ácido lácticas y su posterior almacenaje bajo condiciones adecuadas. Uso de bacterias ácido lácticas como agentes inhibidores de la melanosis en crustáceos y los crustáceos tratados con bacterias ácido lácticas para su uso alimenticio.Method of preservation of crustaceans against melanosis. Method of preserving a crustacean against melanosis, which involves contacting crustaceans with a solution that contains an adequate amount of lactic acid bacteria and subsequent storage under appropriate conditions. Use of lactic acid bacteria as inhibitors of melanosis in crustaceans and crustaceans treated with lactic acid bacteria for food use.
Description
Método de preservación de crustáceos frente a la melanosis.Method of preservation of crustaceans against melanosis
La presente invención se refiere al uso de bacterias ácido lácticas como agentes inhibidores de la melanosis. Así como a un método de preservar un crustáceo frente a la melanosis por el empleo de dichas bacterias y los crustáceos tratados con éstas para su uso alimenticio.The present invention relates to the use of lactic acid bacteria as melanosis inhibitors. As well as a method of preserving a crustacean against the melanosis due to the use of these bacteria and crustaceans treated with these for food use.
La melanosis o ennegrecimiento de los crustáceos, de las frutas y verduras y de los alimentos en general, es un proceso enzimático inherente a la fisiología de los productos del reino animal y vegetal, y como tal fenómeno se manifiesta negativamente, a partir del momento en que el animal muere o cuando la fruta o verdura se desprotege de su piel, se modifica su aspecto al cabo de pocos minutos, apareciendo una tonalidad marrón para las frutas y verduras y negra para el marisco (pardeamiento enzimático o melanosis). El hecho es que ha ocurrido un proceso de oxidación de los tejidos.Melanosis or blackening of crustaceans, fruits and vegetables and food in general, It is an enzymatic process inherent in the physiology of products of the animal and plant kingdom, and as such phenomenon manifests itself negatively, from the moment the animal dies or when the fruit or vegetable is deprived of its skin, its appearance is modified After a few minutes, a brown hue appears for the fruits and vegetables and black for seafood (enzymatic browning or melanosis). The fact is that an oxidation process has occurred of the tissues.
La melanosis en los crustáceos, se manifiesta mediante la aparición de manchas oscuras, ennegrecimiento en el cefalotórax y a lo largo de todo el cuerpo. Dicho ennegrecimiento ocurre principalmente como consecuencia de la oxidación catalítica, originada por la presencia del oxigeno del aire, con intervención de enzimas del tipo fenol-oxidasa (PPO), que acelera el proceso de oxidación de compuestos orgánicos tipo fenólico, como la tirosina, aminoácido esencial del que forma parte el elevado contenido proteínico del marisco, a o-quinonas las cuales polimerizan espontáneamente para formar un residuo oscuro, de alto peso molecular.Melanosis in crustaceans, manifests itself by the appearance of dark spots, blackening in the cephalothorax and throughout the entire body. Said blackening occurs mainly as a result of catalytic oxidation, caused by the presence of oxygen in the air, with the intervention of enzymes of the phenol oxidase (PPO) type, which accelerates the oxidation process of phenolic type organic compounds, such as tyrosine, essential amino acid of which the elevated part Protein content of seafood, o-quinones which polymerize spontaneously to form a dark residue, of high molecular weight
Varios métodos han sido desarrollados para prevenir el ennegrecimiento, incluyendo el calor para la inhibición de la PPO y varios tratamientos químicos tal como alterar el pH de los alimentos. La inactivación por calor no es un método apropiado para los alimentos frescos. Igualmente, bajando el pH por adición de un ácido, como el ácido cítrico, ácido fosfórico como ha sido descrito por Mc- Cord y Kilara en J. Food Science, 48: 1797-1483 (1983) puede conducir a los mismos efectos.Several methods have been developed to prevent blackening, including heat for inhibition of PPO and various chemical treatments such as altering the pH of the food. Heat inactivation is not an appropriate method For fresh food. Likewise, lowering the pH by adding an acid, such as citric acid, phosphoric acid as it has been described by Mc-Cord and Kilara in J. Food Science, 48: 1797-1483 (1983) can lead to them effects.
La actividad del enzima es elevada en distintas fases del crecimiento del tejido externo (esqueleto) de los crustáceos y en la fase post modem. La utilización de productos químicos como inhibidor de los procesos enzimáticos y no enzimáticos de oxidación es hasta ahora el método más extendido capaz de paliar el grave problema que tiene el sector marisquero a la hora de controlar el "ennegrecimiento" de los crustáceos.The activity of the enzyme is high in different phases of the growth of the external tissue (skeleton) of the crustaceans and in the post modem phase. The use of chemical products as an inhibitor of enzymatic and non-enzymatic oxidation processes is so far the most widespread method capable of alleviating the serious problem that the shellfish sector has when controlling the "blackening" of crustaceans.
El ácido bórico fue ampliamente utilizado, aunque desde hace dos décadas se prohibió su uso por razones sanitarias. Desde su prohibición, como agente conservador de crustáceos frente a la melanosis y el deterioro del marisco, han sido muchos los esfuerzos encaminados a encontrar alternativas de compuestos químicos, no tóxicos, capaces de inhibir esta actividad enzimática.Boric acid was widely used, although for two decades its use was banned for reasons sanitary Since his ban, as a conservative agent of Crustaceans against melanosis and seafood deterioration, have there have been many efforts to find alternatives to chemical compounds, non-toxic, capable of inhibiting this activity enzymatic
El empleo de los sulfitos en el tratamiento de la melanosis fue descrito por Zawistowski et al., en Can. Inst. Food Sci.Tech. J., (1987) 20(3): 162-165. Sin embargo su cantidad está limitada y regulada dependiendo de la naturaleza del alimento, dado que su ingestión, inhalación y el contacto con la piel, y en su manejo, presentan riesgos potenciales para la salud.The use of sulphites in the treatment of melanosis was described by Zawistowski et al. , in Can. Inst. Food Sci.Tech. J., (1987) 20 (3): 162-165. However, its quantity is limited and regulated depending on the nature of the food, since its ingestion, inhalation and contact with the skin, and in its management, present potential health risks.
La forma usual de aplicación de los sulfitos es por espolvoreo, inmediatamente después de la captura de los crustáceos para retardar la aparición de la melanosis. La dosificación y homogeneidad del aditivo en las muestras es problemática siendo difícil conseguir de forma manual a bordo. Son muchos los ejemplos recogidos en la literatura científica de utilización de sulfitos como inhibidores de melanosis en crustáceos (Knowles, M.E. Chem. Ind. (London), (1971), 910-911; McWeeny, D.J., et al. J. Sci. Food Agric., (1974) 25, 735- 746; Wedzicha, B.L. et al. Food Chem., (1988) 27, 259-71) y así como de patentes que los utilizan (ES 2.112.798, US 5.882.688, FR 2.696.077, EP 141.875, GB 2.222.509, etc.). No obstante, ninguno de estos métodos ha resultado ser plenamente satisfactorios.The usual form of application of sulphites is by sprinkling, immediately after the capture of crustaceans to delay the onset of melanosis. The dosage and homogeneity of the additive in the samples is problematic being difficult to achieve manually on board. There are many examples in the scientific literature on the use of sulphites as inhibitors of melanosis in crustaceans (Knowles, ME Chem. Ind. (London), (1971), 910-911; McWeeny, DJ, et al. J. Sci. Food Agric., (1974) 25, 735-746; Wedzicha, BL et al. Food Chem., (1988) 27, 259-71) and of patents that use them (ES 2,112,798, US 5,882,688 , FR 2,696,077, EP 141,875, GB 2,222,509, etc.). However, none of these methods has proved to be fully satisfactory.
Labuza y cols. en Cereal Foods World, (1989) 34(4):353 describe el uso de proteasas especialmente ficina, en el control enzimático en el pardeamiento de ciertos alimentos. Este autor atribuye este efecto al ataque sobre la PPO de esta proteasa.Labuza et al. in Cereal Foods World, (1989) 34 (4): 353 describes the use of proteases especially ficin, in the enzymatic control in the browning of certain foods. This author attributes this effect to the attack on the PPO of this protease
La patente americana US 4.981.708 describe la utilización de una proteasa libre como inhibidor del pardeamiento de alimentos. En éste método, alimentos que son susceptibles de pardeamiento, incluyendo por ejemplo, ciertos crustáceos, frutos, vegetales, y bebidas, incluido jugos de frutos y vinos, son tratados con extracto de una cantidad suficiente de proteasa-libre inhibiendo la reacción de pardeamiento. El extracto de la proteasa-libre que se extrae del latex (ficus) es tan efectiva como el bisulfito sódico.US Patent 4,981,708 describes the use of a free protease as a browning inhibitor food. In this method, foods that are susceptible to browning, including, for example, certain crustaceans, fruits, vegetables, and drinks, including fruit and wine juices, are treated with extract of a sufficient amount of protease-free inhibiting the reaction of browning The protease-free extract that extracted from latex (ficus) is as effective as bisulfite sodium
Debido a que el fenómeno de la melanosis se manifiesta a las pocas horas cuando no se tratan los crustáceos con agentes antimelanósicos tradicionales, se ocasionan graves problemas de tipo económico al sector pesquero y a los comercializadores del marisco por la depreciación de su valor en el mercado.Because the phenomenon of melanosis is manifests within a few hours when crustaceans are not treated with traditional antimelanotic agents, serious causes economic problems for the fishing sector and seafood marketers for the depreciation of their value in the market.
Es por tanto deseable contar con un tratamiento de la melanosis o pardeamiento de alimentos y en especial de crustáceos que minimice los problemas e inconvenientes de los productos anteriores.It is therefore desirable to have a treatment of melanosis or browning of food and especially of Crustaceans that minimize the problems and disadvantages of previous products.
Los inventores sorprendentemente han encontrado que las bacterias ácido lácticas (BAL) pueden ser empleadas como agentes inhibidores de la melanosis en crustáceos. Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, ésta se refiere un método de preservación de crustáceos frente a la melanosis por su tratamiento con bacterias ácido lácticas.The inventors have surprisingly found that lactic acid bacteria (BAL) can be used as Melanosis inhibitors in crustaceans. Therefore of according to a first aspect of the present invention, it is refers a method of preservation of crustaceans against the melanosis due to its treatment with lactic acid bacteria.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, ésta se refiere al uso de bacterias ácido lácticas como agentes inhibidores de la melanosis en crustáceos.In accordance with a second aspect of the present invention, this refers to the use of lactic acid bacteria as Melanosis inhibitors in crustaceans.
De acuerdo con una realización preferida las bacterias ácido lácticas empleadas son de los géneros Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc y Pediococcus. Estas bacterias se han utilizado durante muchos años, en fermentaciones, en las que forman parte de cultivos mixtos naturales junto con otras bacterias, levaduras y mohos utilizadas para la producción de diversos alimentos humanos o animales tales como productos lácteos (quesos, mantequilla, yogurt, leches ácidas, etc.), vegetales fermentados (encurtidos, aceitunas, etc.), embutidos, panes ácidos, encurtidos y ensilados.According to a preferred embodiment the lactic acid bacteria employed are of the genera Lactobacillus , Lactococcus , Leuconostoc and Pediococcus . These bacteria have been used for many years, in fermentations, in which they are part of mixed natural crops along with other bacteria, yeasts and molds used for the production of various human or animal foods such as dairy products (cheeses, butter, yogurt, acidic milks, etc.), fermented vegetables (pickles, olives, etc.), sausages, sour breads, pickles and silages.
De acuerdo con una realización preferida, se emplean como starters microbianos Lactobacillus helveticus, Lactobacillus lactis, Carnobacterium piscícola, Lactobacillus plantarun, y Pediococcus acidilacti.According to a preferred embodiment, Lactobacillus helveticus , Lactobacillus lactis , Carnobacterium piscícola , Lactobacillus plantarun , and Pediococcus acidilacti are used as microbial starters.
Las bacterias ácido lácticas son bacterias cocoides o bacilares inmóviles, de forma bacilar, o esférica, unidas. En preparaciones para el microscopio aparecen aisladas o formando cadenas de cocos o de bacilos. Los hábitat son muy variados; flora normal de la superficie de material vegetal (frutas y verduras), alimentos ricos en azúcares, leche y derivados. Obtienen energía exclusivamente por fermentación de azúcares y requieren una gran cantidad de factores nutritivos (aminoácido, bases nitrogenadas, algunas vitaminas), teniendo unas posibilidades anabólicas muy limitadas lo que contribuyen a reducir el rendimiento de su crecimiento.Lactic acid bacteria are bacteria immobile, bacillary, or spherical cococides or bacillars, united. In preparations for the microscope they appear isolated or forming chains of coconuts or bacilli. The habitats are very varied; normal flora of the surface of plant material (fruits and vegetables), foods rich in sugars, milk and derivatives. They obtain energy exclusively by fermentation of sugars and require a lot of nutritional factors (amino acid, nitrogenous bases, some vitamins), having some possibilities very limited anabolic which contribute to reducing the growth performance.
Toleran bien concentraciones relativamente altas de ácidos y valores de pH más bajos que el resto de las bacterias por lo que pueden desplazarlas de los hábitats que colonizan.They tolerate relatively high concentrations well of acids and pH values lower than the rest of the bacteria so they can displace them from the colonizing habitats.
Incapaces de respirar por que no pueden sintetizar compuestos porfirínicos, y, por tanto, formar una cadena de trasporte de electrones. Carecen de ciclo de Krebs funcional y, son incapaces de sintetizar ATP por respiración, lo que es un reflejo de su incapacidad para sintetizar citocromos.Unable to breathe because they can't synthesize porphyrinic compounds, and therefore form a chain of electron transport. They lack a functional Krebs cycle and, they are unable to synthesize ATP by breathing, which is a reflection of its inability to synthesize cytochromes.
La catalasa (enzima que destruye el H_{2}O_{2}.) necesita un grupo porfirínico y, por tanto, este tipo de bacterias no tienen esta enzima, lo que permite la identificación del grupo. La tolerancia al oxígeno puede conseguirse por que acumulan gran cantidad de manganeso (Mn^{2+}) que actúa como una superóxido dismutasa.Catalase (enzyme that destroys the H2O2.) Needs a porphyrinic group and therefore this type of bacteria do not have this enzyme, which allows the group identification Oxygen tolerance can be achieved. because they accumulate a large amount of manganese (Mn 2+) that acts as a superoxide dismutase.
Todos estos organismos debido a la limitada capacidad biosintética, tienen requerimientos nutricionales altos, necesitando factores de crecimiento, vitaminas del grupo B, aminoácidos. Como consecuencia, las BAL se cultivan en medios que contienen peptona, extracto de levadura u otros hidrolizados de materiales vegetales o animales, con un glúcido fermentable que proporcione una fuente de energía.All these organisms due to the limited biosynthetic capacity, have high nutritional requirements, in need of growth factors, vitamins of group B, amino acids. As a consequence, LABs are grown in media that contain peptone, yeast extract or other hydrolysates of plant or animal materials, with a fermentable carbohydrate that Provide a source of energy.
El pequeño tamaño de las colonias es atribuible, en primer lugar, a los bajos rendimientos de crecimiento debido a su metabolismo fermentativo. Algunas especies pueden producir colonias grandes cuando se cultivan en medios que contienen sacarosa, como resultado de la síntesis masiva de polisacáridos extracelulares como los dextranos y levanos, correspondiendo gran parte del volumen de la colonia a estos azúcares. Otra característica fisiológica distintiva de estas bacterias, es su elevada tolerancia a los ácidos, consecuencia necesaria de su modo de metabolismo. Aunque las bacterias cocoides del ácido láctico pueden iniciar su crecimiento a pH neutros e incluso alcalinos, la mayoría de las formas bacilares no pueden crecer en medios con pH inicial menor a 6. El crecimiento de las BAL puede continuar hasta que el pH ha bajado a 4.5 o incluso menor. La capacidad de las BAL para producir y tolerar una concentración relativamente elevada de ácido láctico tiene un gran valor selectivo, ya que les permite eliminar la competencia de la mayoría de las otras bacterias, en ambientes ricos en nutrientes. Como resultado de su extrema especialización fisiológica, las BAL están confinadas a unos cuantos ambientes naturales característicos. Algunas viven en asociación con plantas y crecen a expensas de los nutrientes liberados tras la muerte y descomposición de los tejidos vegetales.The small size of the colonies is attributable, first of all, at the low growth rates due to Your fermentative metabolism. Some species can produce large colonies when grown in media containing sucrose, as a result of the massive synthesis of polysaccharides extracellular such as dextrans and levans, corresponding great part of the volume of the colony to these sugars. Other distinctive physiological characteristic of these bacteria, is their high acid tolerance, a necessary consequence of its mode of metabolism Although lactic acid cocoid bacteria they can start their growth at neutral and even alkaline pHs, the Most bacillary forms cannot grow in pH media initial less than 6. BAL growth can continue until that the pH has dropped to 4.5 or even lower. The capacity of the BAL to produce and tolerate a relatively high concentration of lactic acid has a great selective value, since it allows them eliminate competition from most other bacteria, in nutrient rich environments. As a result of its extreme physiological specialization, the BAL are confined to a few characteristic natural environments. Some live in association with plants and grow at the expense of nutrients released after death and decomposition of plant tissues.
S. Orla Jensen, en "Le clasication des bacterias lactiques". Lait 4. pag 468-474, señaló que las BAL podían dividirse en dos subgrupos bioquímicos, que se distinguen por los productos formados a partir de la glucosa. Los homofermentadores convierten la glucosa casi cuantitativamente en ácido láctico, y los heterofermentadores la convierten en una mezcla equimolecular de ácido láctico, etanol, ácido acético y CO_{2}.S. Orla Jensen, in "Le clasication des lactic bacteria ". Lait 4. pg 468-474, noted that LABs could be divided into two biochemical subgroups, that are distinguished by products formed from the glucose. Homofermentators convert glucose almost quantitatively in lactic acid, and heteofermenters the convert into an equimolecular mixture of lactic acid, ethanol, acetic acid and CO2.
Los homofermentadores desamilan la glucosa por la vía de Embden-Meyerhof. Sin embargo los heterofermentadores no pueden utilizar esta ruta ya que carecen de la enzima fructosa difosfato aldolasa, por lo tanto estos organismos desamilan la glucosa por la vía de las pentosas fosfato.Homofermentators deamilate glucose by the Embden-Meyerhof road. However, the Heterofermenters cannot use this route since they lack the fructose diphosphate aldolase enzyme, therefore these organisms deamilate glucose via pentose phosphate.
Es conocido, que los ácidos orgánicos inhiben las reacciones enzimáticas bajo ciertos rangos de pH. La polifenoloxidasa como cualquier otra enzima tienes unos valores de pH bajo los que actúa eficazmente, otros en los que cataliza con menos eficiencia y, finalmente, en ciertos rangos la reacción es prácticamente inexistente.It is known, that organic acids inhibit Enzymatic reactions under certain pH ranges. The polyphenoloxidase like any other enzyme you have values of pH under which it acts effectively, others in which it catalyzes with less efficiency and, finally, in certain ranges the reaction is virtually non-existent
La tirosinasa (polifenoloxidasa) es conocida por ser una enzima clave en la síntesis de melanina en plantas, microorganismos y células mamarias, y por poseer cobre en su estructura. Muchos compuestos como el ácido kójico y la arbutina, son inhibidores de la tirosinasa.Tyrosinase (polyphenoloxidase) is known for be a key enzyme in the synthesis of melanin in plants, microorganisms and mammary cells, and for having copper in their structure. Many compounds such as kojic acid and arbutin, They are tyrosinase inhibitors.
Es conocido el papel de ciertos metabolitos producidos por las BAL, por ejemplo:The role of certain metabolites is known produced by LABs, for example:
(i) ácido láctico: puede ser sintetizado como L(+), D(-), y bajo forma racémica. La forma D(-) no se metaboliza por los humanos, por lo que no es recomendado su ingesta, sobre todo en niños y en adolescentes. El ácido láctico, al igual que otros ácidos orgánicos, producen a nivel de la membrana citoplasmática de los microorganismos desajustes en el potencial de membrana e inhibe los procesos de transporte.(i) lactic acid: can be synthesized as L (+), D (-), and in racemic form. Form D (-) is not metabolized by humans, so its intake is not recommended, about All in children and adolescents. Lactic acid, like other organic acids, produced at the membrane level cytoplasmic microorganisms mismatches in the potential of membrane and inhibits transport processes.
(ii) peróxido de hidrógeno: las BAL no poseen catalasas, por lo que no pueden desdoblar el peróxido de hidrógeno, excretándolo al medio. Esta molécula es un fuerte oxidante, produciendo oxidaciones en los lípidos y proteínas de la membrana.(ii) hydrogen peroxide: BALs do not have catalases, so they cannot unfold hydrogen peroxide, excreting it in the middle. This molecule is a strong oxidant, producing oxidations in the lipids and proteins of the membrane.
(iii) dióxido de carbono: es producido por las BAL heterofermentativas, creando un ambiente anaerobio en el medio, lo cual podría dañar a ciertas bacterias aerobias. También produce descenso del pH a ambos lados de la membrana citoplasmática.(iii) carbon dioxide: it is produced by Heterofermentative BAL, creating an anaerobic environment in the middle, which could damage certain aerobic bacteria. Also produces pH decrease on both sides of the cytoplasmic membrane.
(iv) diacetilo: es en producto del metabolismo del ácido cítrico, y es el responsable del sabor característico de algunos alimentos como mantequillas y otros productos lácteos fermentados siendo producido por ciertas bacterias de los géneros Leuconostoc, Lactococcus, Pediococcus y Lactobacillus. Dicha producción es inhibida cuando existen hexosas metabolizables en el medio. Las bacterias Gram-, los hongos y las levaduras son más sensibles que las Gram+ al diacetilo. AI parecer su mecanismo de acción esta basado en interferencias en la utilización del aminoácido arginina por parte de estos microorganismos.(iv) diacetyl: it is a product of the metabolism of citric acid, and is responsible for the characteristic flavor of some foods such as butters and other fermented dairy products being produced by certain bacteria of the genera Leuconostoc , Lactococcus , Pediococcus and Lactobacillus . Said production is inhibited when there are metabolizable hexoses in the medium. Gram- bacteria, fungi and yeasts are more sensitive than Gram + to diacetyl. Its mechanism of action seems to be based on interference in the use of the amino acid arginine by these microorganisms.
(v) reuterina: es producida por Lactobacillus reuteri en un medio con una mezcla de glucosa y glicerol ó gliceraldehido. Tiene un espectro antimicrobiano general afectando a virus, hongos, protozoos y bacterias. Esta actividad se produce, al inhibir la ribonucleótido reductasa.(v) reuterine: it is produced by Lactobacillus reuteri in a medium with a mixture of glucose and glycerol or glyceraldehyde. It has a general antimicrobial spectrum affecting viruses, fungi, protozoa and bacteria. This activity occurs, by inhibiting ribonucleotide reductase.
En Enzyme and microbiological Technology, 1999, pag 87-107, se indica que el medio empleado para el crecimiento de las BAL es determinante para la cantidad de ácido láctico que será producido.In Enzyme and microbiological Technology, 1999, page 87-107, it is indicated that the medium used for the BAL growth is decisive for the amount of acid lactic that will be produced.
Las BAL tienen la capacidad de soportar pH de 5 e inferiores, lo que les confiere una ventaja selectiva sobre otras bacterias. La temperatura óptima de crecimiento está entre 20 y 45ºC. Muchas de ellas son consideradas beneficiosas para el consumo humano, pero otras pueden llegar a ser tóxicas como algunos streptococos. BAL tienen complejos requerimientos nutricionales, por su limitada capacidad de sintetizar vitaminas del grupo B, y aminoácidos.BALs have the ability to withstand pH of 5 and lower, which gives them a selective advantage over other bacteria The optimum growth temperature is between 20 and 45 ° C. Many of them are considered beneficial for the human consumption, but others can become toxic like some streptococci. BALs have complex nutritional requirements, for its limited ability to synthesize vitamins of group B, and amino acids.
Las BAL pueden usar los glúcidos fermentándolos hasta un solo producto final (homofermentadores) o varios productos finales (heterofermentadores). En los homofermentadores el producto principal y casi único, es el ácido láctico, mientras que los heterofermentadores sintetizan ácido láctico, etanol, dióxido de carbono (CO_{2}), y acetatos. La cantidad de etanol y acetato formado depende del potencial redox del medio. Todas las BAL pueden usar la vía de las pentosas fosfatos, es decir llevar a cabo una heterofermentación, excepto lactobacilos del tipo I como por ejemplo Lactobacillus delbrueckii. Una mezcla de ácidos se produce por homofermentadores como los lactococos, cuando disminuye la concentración de glucosa en el medio, y durante el crecimiento en otros azúcares como Lactobacilus lactis en maltosa, lactosa y galactosa, o cuando aumenta el pH y disminuye la temperatura.BALs can use the carbohydrates by fermenting them to a single final product (homofermentadores) or several final products (heterofermentadores). In homofermentators the main and almost unique product is lactic acid, while heteofermenters synthesize lactic acid, ethanol, carbon dioxide (CO2), and acetates. The amount of ethanol and acetate formed depends on the redox potential of the medium. All LABs can use the pentose phosphate pathway, that is, carry out heterofermentation, except for lactobacilli type I, such as Lactobacillus delbrueckii . A mixture of acids is produced by homofermentadores such as lactococci , when the concentration of glucose in the medium decreases, and during growth in other sugars such as Lactobacillus lactis in maltose, lactose and galactose, or when the pH increases and the temperature decreases.
Por ejemplo, Lactobacilus amylophilus crece a 15ºC y 45ºC, pero la mayor producción la lleva a 25 y 37ºC. Para Lactobacilus casei y Lactobacilus paracasei entre 37 y 44ºC, lo cual es contradictorio, ya que estas bacterias crecen a 15ºC y no a 45ºC. Lactobacilus lactis y Lactobacilus rhamnosus exhibieron las mayores productividades a 33-35ºC y a 41-45ºC.For example, Lactobacilus amylophilus grows at 15 ° C and 45 ° C, but the highest production leads to 25 and 37 ° C. For Lactobacilus casei and Lactobacilus paracasei between 37 and 44ºC, which is contradictory, since these bacteria grow at 15ºC and not at 45ºC. Lactobacilus lactis and Lactobacilus rhamnosus exhibited the highest productivity at 33-35ºC and 41-45ºC.
Dada la competencia que las BAL pueden ejercer con bacterias del género Pseudomonas, Proteus, Flavobacterium, Enterobacter, Shewanella etc. estas bacterias serian desplazadas del medio por las condiciones tan extremas en las que pueden vivir las bacterias lácticas.Given the competition that LABs can exert with bacteria of the genus Pseudomonas , Proteus , Flavobacterium , Enterobacter , Shewanella etc. These bacteria would be displaced from the environment by the extreme conditions in which lactic bacteria can live.
Ciertas aminas se forman en el marisco después de su captura, aún conservando a bajas temperaturas, debido a que bacterias de los géneros anteriormente mencionados, producen la descarboxilación de aminoácidos libres. La formación de aminas como la histamina, putrescina y cadaverina, es paralela al crecimiento de estos microorganismos, produciendo malos olores, basificación del medio y produciendo en algunos consumidores reacciones alérgicas.Certain amines form in shellfish after of its capture, still keeping at low temperatures, because bacteria of the aforementioned genera produce the decarboxylation of free amino acids. The formation of amines as histamine, putrescine and cadaverine, is parallel to growth of these microorganisms, producing bad smells, basification of the environment and producing reactions in some consumers allergic
De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, ésta se refiere al uso de bacterias ácido lácticas en la eliminación de otras bacterias que producen la formación de ciertas aminas biogénicas, no deseables en crustáceos.In accordance with a third aspect of this invention, this refers to the use of lactic acid bacteria in the elimination of other bacteria that produce the formation of certain biogenic amines, undesirable in crustaceans.
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De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, ésta se refiere a los crustáceos tratados con starters microbianos consistentes en BAL.According to a fourth aspect of the invention, this refers to crustaceans treated with starters microbes consisting of BAL.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el uso de bacterias ácido lácticas como Lactobacillus helveticus, Lactobacillus lactis, Carnobacterium piscicola, Lactobacillus plantarun, y Pediococcus acidllacti, produce la inhibición de manera drástica de la aparición de la melanosis en los crustáceos, post-mortem, una vez tratados por inmersión.According to an embodiment of the present invention, the use of lactic acid bacteria such as Lactobacillus helveticus , Lactobacillus lactis , Carnobacterium piscicola , Lactobacillus plantarun , and Pediococcus acidllacti , dramatically inhibits the onset of melanosis in crustaceans, post -mortem , once treated by immersion.
Otros aspectos y ventajas del tratamiento por inmersión de los crustáceos con soluciones de bacterias ácido lácticas son:Other aspects and advantages of treatment by immersion of crustaceans with acid bacteria solutions Lactic are:
- (i)(i)
- distribución homogénea del agente antimelanósico en los crustáceos por inmersión en la solución que contiene las BAL.homogeneous agent distribution antimelanosic in crustaceans by immersion in the solution that It contains the BAL.
- (ii)(ii)
- el método de la inmersión en la disolución establece el control de la concentración efectiva del agente antimelanósico beneficioso en la parte comestibles de los crustáceos.he method of immersion in the solution establishes control of the effective concentration of the beneficial antimelanosic agent in the Edible part of crustaceans.
- (iii)(iii)
- una vez que se instalan las bacterias ácido lácticas en los crustáceos, su acción sobre el enzima (PPO-Cu), sustrato proteínico, etc., perdura una vez que cesa el proceso de tratamiento por inmersión de los crustáceos.once the lactic acid bacteria in crustaceans, their action on the Enzyme (PPO-Cu), protein substrate, etc., endures once the immersion treatment process of the crustaceans.
Una vez que los crustáceos se sacan del contenedor que contiene la solución de bacterias ácido lácticas, las propiedades organolépticas (el aspecto, presencia, color, sabor) prácticamente no se alteran, lo que proporciona notables ventajas sobre los métodos tradicionales de espolvoreo de los sulfitos, (productos agresivos) los cuales permanecen en contacto con los crustáceos durante semanas, meses, provocando decoloración del esqueleto externo, sequedad, mal sabor etc.,Once the crustaceans are removed from the container containing the solution of lactic acid bacteria, Organoleptic properties (appearance, presence, color, taste) practically do not alter, which provides remarkable advantages over traditional sprinkling methods of sulphites, (aggressive products) which remain in contact with crustaceans for weeks, months, causing discoloration of the external skeleton, dryness, bad taste etc.,
De acuerdo con una realización preferida, la concentración de bacterias ácido lácticas empleada está entre aproximadamente 80 UFC/ml y 140 UFC/ml. De modo más preferido, entre 100 UFC/ml y 110 UFC/ml, siendo aún más preferido entre 106 UFC/ml y 108 UFC/ml.According to a preferred embodiment, the lactic acid bacteria concentration used is between approximately 80 CFU / ml and 140 CFU / ml. More preferably, between 100 CFU / ml and 110 CFU / ml, with 106 being even more preferred CFU / ml and 108 CFU / ml.
Los medios de cultivo adecuados para la realización del método de acuerdo con la presente invención, son aquellos medios selectivos de bacterias lácticas, en el cual las bacterias crecen satisfactoriamente. Entre los medios más adecuados se encuentran:The appropriate culture media for embodiment of the method according to the present invention, are those selective means of lactic bacteria, in which the Bacteria grow satisfactorily. Among the most appropriate means they find each other:
- Medio Esencial Mínimo (MEM): Cloruro sódico (NaCl) (0.7%) y D(+) glucosa (2%), peptona (5%), sulfato de magnesio heptahidratado (0,005%). pH inicial entre 6-6.3.Essential Medium Minimum (MEM): Sodium chloride (NaCl) (0.7%) and D (+) glucose (2%), peptone (5%), magnesium sulfate heptahydrate (0.005%). pH Initial between 6-6.3.
- Medio Pobre (MP): Cloruro sódico (NaCl) (0.7%) y D(+) glucosa (5%), pH inicial entre 6 y 6.5.Half poor (MP): Sodium chloride (NaCl) (0.7%) and D (+) glucose (5%), initial pH between 6 and 6.5.
- Medio MRS: caldo citrato diamónico comercia; extracto de carne en polvo, extracto de levadura, D(+) Glucosa, sulfato magnésico, sulfato de manganeso (II), peptona bacteriológica, fosfato dipotasio, acetato sódico, y tween 80. Este medio tiene un pH inicial de 6,2 aproximadamente.MRS medium: broth diamonic citrate trades; meat extract, extract yeast, D (+) Glucose, magnesium sulfate, manganese sulfate (II), bacteriological peptone, dipotassium phosphate, sodium acetate, and tween 80. This medium has an initial pH of 6.2 approximately.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, se emplea como caldo de cultivo un medio seleccionado entre Medio Esencial Mínimo, Medio Pobre, MRS y el medio de cultivo sintetizado por ellas mismas, utilizando glucosa como solución nutritiva. En una realización más preferida el medio de cultivo es Medio Pobre.According to a preferred embodiment of the In the present invention, a medium is used as culture medium selected from Minimum Essential Medium, Poor Medium, MRS and the culture medium synthesized by themselves, using glucose As a nutritious solution. In a more preferred embodiment the medium of culture is Poor Medium.
De acuerdo con una realización preferida, el tiempo establecido de inmersión de los crustáceos en la solución de bacterias ácido lácticas es de entre 5 y 120 minutos. En una realización más preferida el tiempo de inmersión es de entre 10 y 60 minutos. Según una realización aún más preferida el tiempo de inmersión es de entre 15 y 45 minutos, siendo especialmente preferido un tiempo de inmersión de aproximadamente 30 minutos.According to a preferred embodiment, the established time of immersion of the crustaceans in the solution of Lactic acid bacteria is between 5 and 120 minutes. In a most preferred embodiment the immersion time is between 10 and 60 minutes According to an even more preferred embodiment the time of immersion is between 15 and 45 minutes, being especially preferred an immersion time of about 30 minutes.
De acuerdo con una realización preferida, la temperatura a la que se lleva a cabo el tratamiento de los crustáceos está comprendida entre 0ºC y 35ºC. De acuerdo con una realización más preferida, la temperatura de tratamiento es de 3ºC.According to a preferred embodiment, the temperature at which the treatment of the Crustaceans is between 0ºC and 35ºC. According to a most preferred embodiment, the treatment temperature is 3 ° C
Una vez tratados los crustáceos en las condiciones fijadas, los crustáceos se refrigeran para posteriormente ser distribuidos para su consumo en fresco, o bien se congelan si su consumo se dilata en el tiempo. La suspensión microscópica de las bacterias ácido lácticas en el medio de cultivo es apta para repetir varios ciclos de tratamiento de los crustáceos por inmersión. Esta forma de proceder se puede extrapolar indefinidamente siempre que se mantenga prácticamente la concentración de las bacterias ácido lácticas para que no se resienta el proceso de melanización y la calidad de los crustáceos. La posibilidad de realización de estos ciclos de tratamiento por inmersión, hace que el proceso de utilización de la las bacterias ácido lácticas como inhibidor de melanosis sea tecnológicamente rentable.Once treated crustaceans in the fixed conditions, crustaceans are refrigerated to subsequently be distributed for fresh consumption, or They freeze if their consumption expands over time. The suspension microscopic lactic acid bacteria in the culture medium It is suitable to repeat several cycles of treatment of crustaceans By immersion. This way of proceeding can be extrapolated indefinitely as long as the concentration of lactic acid bacteria so it doesn't resents the process of melanization and the quality of crustaceans. The possibility of carrying out these treatment cycles by immersion, makes the process of using the bacteria lactic acid as a melanosis inhibitor be technologically profitable.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Las descripciones en el resumen de esta solicitud se incorporan aquí como referencia. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants not they intend to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. The descriptions in the summary of this Application are incorporated here for reference. For experts in matter, other objects, advantages and characteristics of the invention will come off in part from the description and in part from The practice of the invention.
Fig. 1 Representación de la actividad enzimática de la enzima Polifenol Oxidasa de Parapenaeus longirostis, mediante diferentes curvas de absorbancia (A) y pH en función del tiempo (t).Fig. 1 Representation of the enzymatic activity of the Polyphenol Oxidase enzyme of Parapenaeus longirostis , using different absorbance curves (A) and pH as a function of time (t).
Se observa en la gráfica que a medida que el pH del medio es más ácido la absorbancia es menor y por consiguiente se desarrolla menos color, que es el objetivo que se persigue con la producción de ácido láctico producido por las bacterias lácticas, en nuestro caso Lactobacilus helveticus.It is observed in the graph that as the pH of the medium is more acidic, the absorbance is lower and therefore less color develops, which is the objective pursued with the production of lactic acid produced by lactic bacteria, in our case Lactobacillus helveticus .
Fig. 2. Se representa comparativamente el porcentaje de actividad de inhibición de la PPO del crustáceo Parapenaeus longirostris, a la que no se le efectúa ningún tratamiento (barra con rayas inclinadas), frente a muestras tratadas con las bacterias Lactobacillus lactis (I), Carnobacterium piscicola (II), Lactobacillus plantarum (III), Lactobacillus helveticus (IV) y Pediococus acidilactici (V), en medios en medio pobre (barra con cuadrícula) y en medio esencial mínimo (barra con rayas horizontales).Fig. 2. The percentage of PPO inhibition activity of the crustacean Parapenaeus longirostris , which is not treated (bar with inclined stripes), is compared compared to samples treated with the bacteria Lactobacillus lactis (I), Carnobacterium piscicola (II), Lactobacillus plantarum (III), Lactobacillus helveticus (IV) and Pediococus acidilactici (V), in medium in poor medium (bar with grid) and in minimal essential medium (bar with horizontal stripes).
Fig. 3. Representación gráfica de la medida de la absorbancia (A) frente al tiempo (t) de la velocidad de aparición de Dopacromo.Fig. 3. Graphical representation of the measurement of the absorbance (A) versus the time (t) of the velocity of Dopachrome appearance.
Los siguientes modos de realización se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.The following embodiments will be provided by way of illustration, and are not intended to be Limitations of the present invention.
Ejemplo 1Example one
Uno de los factores esenciales de actuación de las BAL es la competencia con otras bacterias que aceleran el proceso de melanosis. Para el estudio microbiológico se utiliza el sistema de tiras API, el cual es un sistema de identificación estandarizado, que utiliza distintos tests bioquímicos miniaturizados y una base de datos. Consta de diez microtubos que contienen sustratos deshidratados. Estos test se inoculan con una suspensión bacteriana, que reconstituye los medios. Durante la incubación, se producen cambios de color espontáneo o revelado por adición de reactivos.One of the essential performance factors of BAL is the competition with other bacteria that accelerate the melanosis process For the microbiological study the API strip system, which is an identification system standardized, which uses different biochemical tests miniaturized and a database. It consists of ten microtubes that They contain dehydrated substrates. These tests are inoculated with a Bacterial suspension, which reconstitutes the media. During the incubation, spontaneous color changes or revealed by reagent addition.
Después de una incubación de 18-24 horas a 35-37ºC, la lectura de reacciones se visualiza contrastando lista de perfiles, o con un software de identificación.After an incubation of 18-24 hours at 35-37 ° C, the reading of reactions are displayed contrasting profile list, or with a identification software
La extracción de la flora bacteriana del marisco se realizó, usando agua de peptona tamponada, esterilizada en autoclave 121ºC durante 20 minutos, con un 0.01% de Tritón X-100 en un agitador magnético, a 37ºC durante 12 horas. En ese tiempo las bacterias se despegan de su huésped, y pasan a la solución de agua peptonada. A continuación, se procedió al aislamiento de las cepas que habitan en el medio líquido, pasando a utilizar un medio sólido, general, no específico, donde cualquier bacteria, puede crecer. Este medio es el TSA (Triptona Soja Agar). Se realizaron en placas de petri, siembras "por agotamiento", con triplicado, se incubaron a 37ºC durante 24 horas. Al día siguiente se pudo observar como han crecido en las placas decenas de colonias, en la mayoría de los casos entre 3 y 4 colonias distintas, por lo que cabe de esperar que en el marisco de forma natural en descomposición, estén instaladas predominantemente este mismo número de bacterias.Extraction of bacterial shellfish flora was performed, using buffered peptone water, sterilized in 121 ° C autoclave for 20 minutes, with 0.01% Triton X-100 on a magnetic stirrer, at 37 ° C for 12 hours. At that time the bacteria take off from their host, and They pass into the solution of peptonated water. He then proceeded to the isolation of the strains that inhabit the liquid medium, going on to use a solid, general, non-specific medium, where Any bacteria can grow. This medium is the TSA (Triptona Soy agar). They were made in petri dishes, seeded "by depletion ", in triplicate, were incubated at 37 ° C for 24 hours. The next day you could see how they have grown in the dozens of colonies plaques, in most cases between 3 and 4 different colonies, so expect that in the shellfish of naturally decomposing, are predominantly installed This same number of bacteria.
Los crustáceos, una vez capturados, y después de quince días de almacenamiento en frigorífico a la temperatura de 0-5ºC no presenta melanosis y durante un tiempo indefinido (de 1 a 10 meses) a la temperatura de -18ºC, cuando fueron tratados con starters microbianos como Lactobacillus helveticus, Lactobacillus Lactis, Carnobacterium piscicola, Lactobacillus plantarun, y Pediococcus acidilacti.Crustaceans, once captured, and after fifteen days of storage in a refrigerator at a temperature of 0-5ºC, do not present melanosis and for an indefinite period (1 to 10 months) at a temperature of -18ºC, when treated with starters microbes such as Lactobacillus helveticus , Lactobacillus Lactis , Carnobacterium piscicola , Lactobacillus plantarun , and Pediococcus acidilacti .
Ejemplo 2Example 2
Los estudios se basan todos ellos en el crustáceo Parapenaeus longirostris, conocido como "gamba blanca de Huelva". Este artrópodo tiene cutícula y apariencia con tonalidades claras, por lo que los efectos de la melanosis será más acusada. Los ejemplares siempre fueron frescos y sin tratamiento químico, ni otro de cualquier naturaleza anterior a nuestros ensayos.The studies are all based on the crustacean Parapenaeus longirostris , known as the "white prawn of Huelva". This arthropod has cuticle and appearance with light tones, so the effects of melanosis will be more pronounced. The specimens were always fresh and without chemical treatment, nor any other of any nature prior to our tests.
Se encargaron al Centro Español de Cultivos Tipo las bacterias Lactobacillus helveticus, CECT 4305 T. Estas cepas se presentan liofilizadas en pequeñas ampollas, a las que se le añadió 0,3 mililitros del medio MRS, y resuspendió con pipeta Pasteur, y se inocularon con 200 ml del mismo medio contenido en matraz aforado. Este caldo se incubó durante 24 horas a 37ºC, y al cabo de este tiempo, se obtuvieron concentraciones de Lactobacillus helveticus de 100 a 1000 millones de células por mililitro en un medio que alcanza un pH entre 4,20 y 4, 50.The Lactobacillus helveticus bacteria, CECT 4305 T. were entrusted to the Spanish Type Culture Center. These strains are lyophilized in small blisters, to which 0.3 milliliters of the MRS medium was added, and resuspended with Pasteur pipette, and inoculated with 200 ml of the same medium contained in a volumetric flask. This broth was incubated for 24 hours at 37 ° C, and after this time, Lactobacillus helveticus concentrations of 100 to 1000 million cells per milliliter were obtained in a medium that reaches a pH between 4.20 and 4.50.
Se tomaron muestras de cefalotorax, lugar donde la enzima es más abundante, se pesó el extracto del tejido tomado y se procedió a su homogenización con nitrógeno líquido y con 3 mililitros de los distintos tampones utilizados. Se centrifugó a 13240 gs durante 30 minutos y se desechó el precipitado, separando la fase soluble donde se encuentra la enzima. A continuación se preparó una solución de tripsina al 5% en agua destilada, y una solución de DL- Dopa 25 mM en tampón fosfato pH 6,5.Cephalothorax samples were taken, where the enzyme is more abundant, the tissue extract taken was weighed and it was homogenized with liquid nitrogen and with 3 milliliters of the different buffers used. It was centrifuged at 13240 gs for 30 minutes and the precipitate was discarded, separating the soluble phase where the enzyme is found. Then you prepared a 5% trypsin solution in distilled water, and a 25 mM DL-Dopa solution in pH 6.5 phosphate buffer.
Se midió la absorbancia producida en el espectrofotómetro a la longitud de onda (\lambda de 390 manómetros), cada 2 minutos, durante 20 minutos, de máxima actividad de la PPO. Los resultados se recogen en la Tabla 1.The absorbance produced in the wavelength spectrophotometer (λ 390 pressure gauges), every 2 minutes, for 20 minutes, maximum PPO activity. The results are shown in Table 1.
Se observó que a partir de los 8 minutos la reacción enzimática dejaba de ser lineal. El estudio de esta zona, en la que la reacción de formación de producto con respecto al tiempo es lineal nos permite calcular la pendiente de la recta que representa la cinética de la reacción, y que nos sirve para cuantificar la actividad enzimática.It was observed that after 8 minutes the Enzymatic reaction ceased to be linear. The study of this area, in which the product formation reaction with respect to time is linear allows us to calculate the slope of the line that represents the kinetics of the reaction, and that serves us to Quantify enzyme activity.
- 1.one.
- pH= 4. No existe reacción. La pendiente es igual a 0.pH = 4. There is no reaction. The slope is equal to 0.
- 2.2.
- pH= 5. Y = 0.0042x + 0.058.pH = 5. Y = 0.0042x + 0.058.
- 3.3.
- pH= 6. Y = 0.0084x + 0.011.pH = 6. Y = 0.0084x + 0.011.
- 4.Four.
- pH= 7. Y= 0.0108x + 0.0002.pH = 7. Y = 0.0108x + 0.0002.
- 5.5.
- pH= 8. Y= 0.0106x + 0.001.pH = 8. Y = 0.0106x + 0.001.
- 6.6.
- pH= 9. Y= 0.0276x + 0.089.pH = 9. Y = 0.0276x + 0.089.
Aplicando la ecuación de la Actividad Enzimática Específica:Applying the Enzyme Activity equation Specific:
Act. \ Enz. \ Esp. = \frac{Abs. \cdot Vol. \ Tampón \ extracción \ (ml)}{Vol. \ muestra \ (ml) \cdot (min) \cdot peso \ fresco} \ e^{-1} \ \cdot \ d^{-1}Act. \ Enz. \ Esp. = \ Frac {Abs. \ cdot Vol. \ Buffer \ extraction \ (ml)} {Vol. \ sample \ (ml) \ cdot (min) \ cdot weight \ fresh} \ e ^ {- 1} \ \ cdot \ d <-1>
e = coeficiente de extinción molar 3600 M^{-1} \cdot cm^{-1}e = molar extinction coefficient 3600 M <-1> cm -1
d = camino óptico = 1 cmd = optical path = 1 cm
obtenemos los siguientes resultados:We obtain the following results:
Para pH 4, no existe actividad enzimática.For pH 4, there is no enzymatic activity.
Para pH 5, tenemos una actividad enzimática específica de 3,80 x 10 elevado a la menos 6 micromoles/min x gramo peso fresco.For pH 5, we have an enzymatic activity specific 3.80 x 10 raised to at least 6 micromoles / min x gram fresh weight.
Para pH 6, 7,60 x 10 elevado a menos 6 micromoles/min x gramo peso frescoFor pH 6, 7.60 x 10 raised to minus 6 micromoles / min x gram fresh weight
Para pH 7, 9,76 x 10 elevado a menos 6 micromoles/min x gramo peso frescoFor pH 7, 9.76 x 10 raised to minus 6 micromoles / min x gram fresh weight
Para pH 8, 9,58 x 10 elevado a la menos 6 micromoles/min x gramo peso fresco.For pH 8, 9.58 x 10 raised to at least 6 micromoles / min x gram fresh weight.
Para pH=9, 24,95 x 10 elevado a la menos 6 micromoles/min x gramo peso fresco.For pH = 9, 24.95 x 10 raised to at least 6 micromoles / min x gram fresh weight.
Para el desarrollo de la actividad enzimática "in situ" se utilizaron los siguientes tampones:For the development of the enzymatic activity " in situ " the following buffers were used:
Para pH de 4 y 5 usamos el sistema tamponado acético/acetato.For pH 4 and 5 we use the buffered system acetic / acetate.
Para pH de 6 y 7 usamos el sistema tamponado fosfato potásico monobásico/fosfato potásico dibásico.For pH 6 and 7 we use the buffered system monobasic potassium phosphate / dibasic potassium phosphate.
Para pH de 8 y 9 usamos el sistema tamponado con Tris.For pH of 8 and 9 we use the buffered system with Tris
Todos los medios se emplean a la concentración de 0,1 molar.All media are used at the concentration 0.1 molar
Si representamos los datos obtenidos veremos como existe una zona lineal en la que la variación de la absorbancia es prácticamente constante, es en esta zona donde calculamos la pendiente y con ella la actividad específica de la PPO, aplicando la ecuación de la Actividad Enzimática Específica.If we represent the data obtained we will see as there is a linear zone in which the variation of the absorbance is practically constant, it is in this area where we calculate the slope and with it the specific activity of the PPO, applying the Enzyme Activity equation Specific.
La actividad de la fenoloxidasa (PPO) se expresa como moles de DL-DOPA transformados por minuto y por mg a 475 nm, a diferentes pH y a temperatura ambiente en las condiciones descritas. La oxidación de la DOPA a DOPACROMO, catalizada por la PPO conlleva un apreciable cambio de color que es lo que medimos en el espectrofotómetro a 475 nm.Phenoloxidase (PPO) activity is expressed as moles of DL-DOPA transformed per minute and per mg at 475 nm, at different pH and at room temperature in the conditions described. Oxidation of DOPA to DOPACROMO, catalyzed by the PPO entails a noticeable color change that is what we measured in the spectrophotometer at 475 nm.
De una muestra de cabeza de gamba se obtuvo el extracto, el cual fue incubado con tripsina 1% durante 15 minutos en agitación y se midió a lo largo del tiempo la variación de absorbancia a 475 nm frente a DL-DOP.From a sample of shrimp head the extract, which was incubated with 1% trypsin for 15 minutes under stirring and the variation in time was measured absorbance at 475 nm against DL-DOP.
Los valores presentados en la Tabla 2 son la media de 3 ensayos \pm la desviación estándar (SD), los cuales representamos gráficamente y obtenemos la actividad enzimática específica de la zona lineal de la Figura 3The values presented in Table 2 are the mean of 3 tests ± standard deviation (SD), which we represent graphically and obtain the enzymatic activity specific to the linear zone of Figure 3
zona lineal en la que la variación de la absorbancia es prácticamente constante, es en esta zona donde calculamos la pendiente y con ella la actividad específica de la PPO, aplicando la siguiente fórmula:linear zone in which the variation of the absorbance is practically constant, it is in this area where we calculate the slope and with it the specific activity of the PPO, applying the following formula:
Pendiente de la recta=0.0339, R2=0,994Slope of the line = 0.0339, R2 = 0.994
Actividad \ \text{específica}=30,65 \ x \ 10^{-6} \ \mu moles.min-1.mg-1Activity \ \ text {specific} = 30.65 \ x \ 10 ^ {- 6} \ \ mu moles.min-1.mg-1
Se ensayaron medios de cultivo diferentes, selectivos de bacterias lácticas, en el cual las bacterias crecen satisfactoriamente tales como Medio Esencial Mínimo (MEM), Medio MRS y Medio Pobre (MP).Different culture media were tested, Selective lactic bacteria, in which bacteria grow satisfactorily such as Minimum Essential Medium (MEM), Medium MRS and Poor Medium (MP).
Cuando se incubaron estos microorganismos a 37ºC, en estos medios, al cabo de 24 horas se obtuvieron concentraciones entre 100 y 1.000 millones de bacterias por mililitro de medio, siendo el nuevo pH entre 3.5 y 4.0, de lo que se deduce que el metabolismo bacteriano ha sido el que ha generado esa bajada drástica de pH.When these microorganisms were incubated at 37 ° C, in these media, after 24 hours they were obtained concentrations between 100 and 1 billion bacteria per milliliter of medium, the new pH being between 3.5 and 4.0, of which it follows that the bacterial metabolism has been the one that has generated that drastic drop in pH.
Tanto MEM como MRS, proporcionaron medios adecuados para el desarrollo del cultivo, sin embargo el medio MP es el que otorgó una mayor inhibición enzimática y ausencia de ennegrecimiento del marisco, y con propiedades organolépticas de los crustáceos excelentes.Both MEM and MRS provided media suitable for crop development, however the MP medium it is the one that granted a greater enzymatic inhibition and absence of blackening of shellfish, and with organoleptic properties of The crustaceans excellent.
Se tomó una solución salina de cloruro sódico 0,7% y D(+) glucosa (2%), peptona (5%), sulfato de magnesio heptahidratado (0,005%), pH inicial 6.2. y se inoculó con bacterias ácido lácticas de Lactobacillus helveticus y se incubaron a 37ºC, observándose un crecimiento lento de dichas bacterias. A las 76 horas la disolución presentó concentraciones deseadas para nuestro ensayo, concretamente de 10 a 100 millones de bacterias por mililitro de medio. El pH inicial del medio era de 5,82, mientras que a las 76 horas de incubación de las bacterias el pH es de 3.3, en todos los ensayos. El medio es inodoro e incoloro, no apreciándose mal sabor. El marisco se trató a temperaturas de refrigeración, concretamente a 3ºC, a diferentes tiempos de residencia; 10, 20, 30, 60 y 120 minutos por inmersión en el medio bacteriogénico descrito. Una vez extraído los crustáceos de la disolución se procede a repetir ciclos de inmersión hasta cinco veces consecutivas. A continuación se procedió a estudiar la evolución de la melanosis, observando que a las 24 horas el marisco tratado permanece inalterado, a temperatura ambiente 18-20ºC, mientras que en el marisco control (marisco sin ningún tratamiento) ya se observan principios de melanosis en cabeza e incluso en las patas. Después de 12 días de permanecer los crustáceos en el refrigerador a 3-5ºC no se apreció aparición de melanosis. La Figura 3 representa el tanto por ciento de inhibición de las bacterias ensayadas en diferentes medios de cultivo como Medio Pobre (MP) y Medio Esencial Mínimo (MEM).A saline solution of 0.7% sodium chloride and D (+) glucose (2%), peptone (5%), magnesium sulfate heptahydrate (0.005%), initial pH 6.2 was taken. and inoculated with lactobacillus helveticus lactic acid bacteria and incubated at 37 ° C, observing a slow growth of said bacteria. At 76 hours the solution presented desired concentrations for our assay, specifically 10 to 100 million bacteria per milliliter of medium. The initial pH of the medium was 5.82, while at 76 hours of incubation of the bacteria the pH is 3.3, in all tests. The medium is odorless and colorless, not appreciating bad taste. The seafood was treated at refrigeration temperatures, specifically at 3 ° C, at different residence times; 10, 20, 30, 60 and 120 minutes by immersion in the bacteriogenic medium described. Once the crustaceans have been removed from the solution, the immersion cycles are repeated up to five consecutive times. Next, we proceeded to study the evolution of melanosis, observing that at 24 hours the treated shellfish remains unchanged, at room temperature 18-20 ° C, while in the control shellfish (shellfish without any treatment) principles of melanosis are already observed in head and even in the legs. After 12 days of keeping the crustaceans in the refrigerator at 3-5ºC, no appearance of melanosis was observed. Figure 3 represents the percent inhibition of the bacteria tested in different culture media such as Poor Medium (MP) and Minimum Essential Medium (MEM).
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2006
- 2006-01-27 WO PCT/ES2006/000039 patent/WO2006082267A1/en not_active Ceased
Patent Citations (3)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2006082267A1 (en) | 2006-08-10 |
| ES2257964A1 (en) | 2006-08-01 |
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