ES2257755T3

ES2257755T3 - Utilizacion de flupirtina para la profilaxis y la terapia de enfermedades asociadas con alteraciones del sistema celular hematopoyetico.

Info

Publication number: ES2257755T3
Application number: ES96945822T
Authority: ES
Inventors: Gabriela Pergande; Werner E. G. Muller
Original assignee: Viatris GmbH and Co KG
Current assignee: Meda Pharma GmbH and Co KG
Priority date: 1995-11-07
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 2006-08-01
Anticipated expiration: 2016-10-23
Also published as: CN1201391A; DE59611327D1; US6034111A; CA2189705A1; NO981898D0; KR19990067366A; NZ330414A; WO1997017072A2; ZA968783B; US6034112A; PL186537B1; KR100512673B1; HUP9901659A2; EP0859613A2; HU225742B1; DE19541405A1; PT859613E; WO1997017072A3; EP0859613B1; CZ128398A3

Abstract

LA INVENCION DESCRIBE EL USO DE FLUPIRTINA O DE SUS SALES COMO MEDICAMENTOS EN LA PROFILAXIS Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ASOCIADAS A UNA LESION DEL SISTEMA HEMATOPOYETICO CELULAR, POR EJEMPLO, DE LOS LINFOCITOS. ES PARTICULARMENTE IMPORTANTE EN EL TRATAMIENTO DE PACIENTES INFECTADOS POR EL VIH O PACIENTES CON SIDA.

Description

Utilización de flupirtina para la profilaxis y la terapia de enfermedades asociadas con alteraciones del sistema celular hematopoyético.

La presente invención se refiere a la utilización de flupirtina o de sus sales como medicamento destinado al tratamiento de una neutropenia/linfocitopenia inducida por medicamentos (tales como citostáticos, corticoesteroides), sustancias tóxicas, radiación, y por otras enfermedades o de una trombocitopenia inducida por medicamentos o infección (por ejemplo VIH).

La flupirtina es un analgésico conocido, introducido, de acción central y no opiáceo.

La flupirtina desarrolla sus acciones analgésicas a través de mecanismos de acción distintos de los analgésicos opiáceos/opioides (Nickel, B., Postgrad. Med. J. 63 (Supl.3), 19 (1987); Szelenyi, I., Nickel, B., Borbe, H. O., Brune, K., Br. J. Pharmacol. 143, 89 (1989)). En investigaciones electrofisiológicas, se ha demostrado que flupirtina es capaz de intervenir en los sucesos nociceptivos tanto al nivel supraspinal como al espinal (Carlsson, K. H., Jurna, I., Eur. J. Pharmacol. 143, 89 (1987); Bleyer, H., Carlsson, K. H., Erkel, H. J., Jurna, I., Eur. J. Pharmacol. 151, 259 (1988); Nickel, B., Aledter, A., Postgrad Med. J. 63 (Suppl.3) 41 (1987)).

La flupirtina se utiliza también para la terapia de los estados agudos de dolor causados por las enfermedades del aparato motriz.

Además, la flupirtina se utiliza con éxito en los pacientes que sufren de enfermedades degenerativas o reumáticas.

Además de buenas propiedades analgésicas, la flupirtina dispone de propiedades de relajación muscular, por lo cual flupirtina puede utilizarse también para el tratamiento de tensiones musculares o para las enfermedades basadas en las tensiones musculares (DE 40 22 442).

Además, en las investigaciones de la acción de relajación muscular de flupirtina en ratas, se ha hallado que la acción de la flupirtina puede ser inhibida por el aminoácido excitador N-metilo-D-aspartato (NMDA). Debido a dicha acción antagonista de NMDA, flupirtina es apta también para el tratamiento de las enfermedades del sistema nervioso central (SNC) mediadas por NMDA, tales como por ejemplo la isquemia cerebral, las enfermedades neurodegenerativas y los ataques epilépticos (DE 43 27 516).

Químicamente, la flupirtina es 2-amino-3-etoxicarbonilamino-6-(p-fluorbencilamino)-piridina.

La síntesis de flupirtina y de sus sales de utilización farmacéutica se ha descrito en las memorias de patentes DE 17 95 858, DE 31 33 519 y DE 34 16 609.

Sorprendentemente, se ha hallado ahora que la flupirtina es capaz de inhibir la muerte celular apoptótica de las células del sistema celular hematopoyético, por ejemplo de los linfocitos.

Con esto se abre el camino de utilizar flupirtina para el tratamiento de una neutropenia/linfocitopenia inducida por medicamentos (tales como citostáticos, corticoesteroides), sustancias tóxicas, radiación, y por otras enfermedades o de una trombocitopenia inducida por medicamentos o infección (por ejemplo VIH).

De importancia particular es el tratamiento de las enfermedades citadas anteriormente en los pacientes infectados con VIH/SIDA.

A continuación, la nueva acción según la invención se ilustrará con mayor detalle haciendo referencia a las investigaciones farmacológicas.

Investigaciones farmacológicas Materiales

Maleato de flupirtina [maleato de 2-amino-3-etoxicarbonilamino-6-(p-fluorbencilamino)-piridina], para la preparación de VIH-1-gp120 se utilizó la cepa de virus VIH-1 HTLV_{IIIB} (Popovic et al., 1984). La preparación de gp120 obtenida, aislada presentaba una pureza de más de un 95%, tal como se ha verificado por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida (Müller et al., 1988).

Preparación experimental antiretroviral

La metodología para la preparación de VIH-1 ya se ha descrito anteriormente (Sarin et al., 1987). Células de la línea humana de T-linfoblastos CEM (concentración de sembrado: 1 x 10^{5} células/ml) se suspendieron en el medio y se infectaron con el virus de VIH-1 (cepa HTLV_{IIIB}). A tal fin, se seleccionó una dosis de infección 50 veces más que la de un cultivo celular al 50% [CCID_{50}]. Una CCID_{50} es la dosis de infección a la que un 50% de las células por ml de suspensión celular se infectan. Cultivos de 1 ml se incubaron durante 5 días. Se adicionó flupirtina a las células en concentraciones distintas dos horas antes de la infección. El número de las células vivas se determinó utilizando el sistema colorimétrico bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio [MTT] (Scudiero et al., 1988). La evaluación se realizó con un lector ELISA, tal como se ha publicado anteriormente (Müller et al., 1991). Tras la incubación, las células CEM no infectadas realizaron 2,16 y las células infectadas 0,13 etapas de duplicación.

Muestras de sangre

Se tomaron muestras de sangre periférica humana de (I) 12 hombres homosexuales infectados con VIH-1 [edad media: 35 años; intervalo: 22-43 años], así como de (II) hombres sanos, seronegativos en VIH-1 y por lo demás del mismo riesgo de un grupo de edades casi idéntico (edad media: 30 años; intervalo: 23-35 años). Los pacientes se clasificaron según la clasificación del "Center for Disease Control" (CDC, 1992). Las investigaciones en los pacientes seropositivos en VIH-1 se realizaron con muestras de sangre procedentes de portadores de virus asintomáticos (CDC: A1, A2, número de células CD4 medio 407/\mul, intervalo 209-698/\mul).

Ninguno de los pacientes mostró señales de enfermedades tumorales, infecciones sintomáticas o había sido sometido a un tratamiento inmunosupresivo, por ejemplo por medio de corticoesteroides, 10 semanas antes de la toma de sangre.

Preparaciones celulares y su tratamiento

Células mononucleares [CMN] se obtuvieron a partir de sangre heparinizada por centrifugación a través de un gradiente de densidad Ficoll-Hypaque y se concentraron (Rossol et al., 1990). 0,5 x 10^{6} células se cultivaron en un medio de cultivo en un volumen final de 500 \mul; el medio utilizado era MEM enriquecido con un tampón HEPES 10 mM, un 2,6% de bicarbonato sódico, 100 U/l de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, 10% de suero de ternera fetal (STF) y glutamato 1 mM. Donde se haya indicado, las células se trataron inmediatamente tras su aislamiento con la sustancia química.

Inducción de la apoptosis con oxígeno reactivo

Se prepararon radicales de oxígeno reactivos utilizando el sistema hipoxantina [HX] y xantinoxidasa [XOD] (Bruck et al., 1994).

CMN se suspendieron durante 24 horas en un volumen total de 500 \mul del medio MEM (tal como se ha descrito anteriormente).

A dicha preparación se adicionaron 0 a 80 mU/ml de XOD y HX 1 mM. A una concentración de 80 mU/ml de XOD (Sigma, Múnich, Alemania), > 90% de los linfocitos sufrieron la muerte celular apoptótica.

A menos que se indique otra cosa, se utilizaron 10 mU/ml de la enzima XOD y HX 1 mM para los siguientes estudios. En dichas condiciones de incubación, aproximadamente un 50% de las células sufrieron una apoptosis. Resulta favorable mantener dicho nivel de apoptosis si el objetivo es averiguar si un compuesto determinado constituye un inhibidor potencial y/o estimulante de la muerte celular apoptótica. Flupirtina se adicionó a las células 6 horas antes de la adición del sistema que genera el radical de oxígeno; la incubación se finalizó tras un
día.

Análisis de las células por citometría de flujo

La apoptosis se midió en un citómetro de flujo FACScan (Becton-Dickinson) con excitación por láser de argón a una longitud de ondas de 488 nm según el método publicado (Schmid et al., 1994). Los linfocitos se separaron por métodos ópticos y se caracterizaron de esta manera. Esto se efectuó por una combinación de una dispersión de luz hacia adelante como medida del tamaño de las células [FSC] con una dispersión rectangular como medida de la condición superficial [SSC]. Para la coloración de las células CMN apoptóticas, las mismas se incubaron juntas con 20 \mug/ml de 7-aminoactinomicina D [7-AAD] (Sigma), disuelta en PBS, a 4ºC durante 20 minutos con exclusión de luz. A continuación, era posible analizar las células con el citómetro de flujo en la solución de colorante. La fluorescencia roja, causada por 7-AAD, se detectó mediante un filtro de la longitud de ondas de 650 nm.

El 7-AAD penetra en las células apoptóticas debido a una desintegración de la membrana celular y, a continuación, colorea el ADN a través de un proceso de intercalación. El análisis de datos se realizó por medio del programa LYSIS II.

Los números de canales medios se convirtieron en intensidad de fluorescencia media, tamaño celular y condición superficial.

Marcaje fluorescente in-situ por medio de la preparación TdT así como marcaje superficial

Con el fin de definir una subpoblación celular determinada que pasa por un proceso apoptótico, se trataron las células con el sistema transferasa terminal [TdT]. Se utilizó el método según Gorczyca et al. (1993) con pequeñas modificaciones. Células presentes en una suspensión se lavaron dos veces en PBS (Gibco) y, a continuación, se fijaron en paraformaldehído al 1% (Riedel de Haen) a 4ºC durante 10 minutos. A continuación, las células se lavaron dos veces en PBS [al cual se había adicionado un 5% de suero AB y un 0,5% de albúmina de suero bovino (ASB)]. Además, las células se pelletizaron y se volvieron a suspender en 50 \mul de una solución de cloruro de cobalto 2,5 mM, a la cual se adicionó biotina-16-dUTP 0,5 nM y 25 U de TdT. Dicha preparación estaba tamponada con cacodilato potásico 200 mM, Tris-HCl 25 mM y 0,25 mg/ml de ASB; la incubación se realizó a 37ºC durante 30 minutos según las especificaciones del fabricante Boehringer, Mannheim, Alemania). A continuación, las células se lavaron dos veces en PBS [un 5% de suero AB y un 0,5% de ASB] y se volvieron a suspender en 100 \mul de una solución tamponada de colorante que contenía 5 \mug/ml de avidina [pureza para análisis de células] marcada con isotiocianato de fluoresceina [FITC]. Para el marcaje superficial simultáneo, se trataron las células adicionalmente con 20 \mug/ml de anticuerpo anti-CD3 monoclonal marcado con ficoeritrina (Becton-Dickinson).

La determinación cuantitativa de la fluorescencia se realizó por medio de citometría de flujo, tal como fue descrita por Halliwell (1987).

Resultados Tratamiento de células CEM infectadas con VIH-1 con flupirtina

Las células CEM se sometieron a un tratamiento previo con flupirtina durante 2 horas y, a continuación, quedaron sin infectar o se infectaron en una preparación en paralelo con VIH-1.

Tras cinco días, se determinaron los números de células en las preparaciones correspondientes. Tal como puede apreciarse por la Figura 1, la concentración de las células cambió no sólo en los cultivos no infectados, sino también en los cultivos infectados en función del tratamiento con flupirtina de forma no significante (P > 0,1).

La flupirtina se adicionó a las preparaciones en concentraciones comprendidas entre 0,1 y 30 \mug/ml. La concentración celular en las preparaciones no infectadas era de 446.880 \pm 31.020 células/ml y de 108.420 \pm 6.710 células/ml en las preparaciones infectadas con VIH-1.

Estos resultados muestran que la flupirtina no ejerce un efecto tóxico sobre las células, pero además tampoco ejerce efecto alguno sobre la infección con VIH-1 in vitro en las condiciones de incubación utilizadas.

Ajuste del sistema hipoxantina/xantina-oxidasa

La concentración de xantin-oxidasa [XOD] se seleccionó de tal manera que se obtuvo un porcentaje en células apoptóticas de aproximadamente un
50%.

Las células apoptóticas presentan una intensidad fluorescente de > 10 números de canales arbitrarios. A 0 mU de XOD, sólo un 6,6 \pm 2,1% se situaban por encima de dicha línea "cut-off" de > 10 números de canales arbitrarios, es decir, un 6,6% eran apoptóticas. A medida que aumenta la concentración de XOD, el porcentaje de células apoptóticas incrementó y alcanzó un valor de un 93,2 \pm 6,8% de células apoptóticas a 80 mU de XOD. A 10 mU de XOD, aproximadamente un 50% (exactamente un 54,6 \pm 6,1%) de las células pasó por un proceso apoptótico.

En ausencia de XOD, las células presentaban un modelo de distribución FSC/SSC de la siguiente manera:

Tamaño celular 349 \pm 27 (número de canal arbitrario) frente a una condición superficial de 112 \pm 15. A una concentración enzimática de 80 mU, el tamaño celular descendió y alcanzó un valor de 256 \pm 22, mientras que el grado de condición superficial aumentó a 180 \pm 29. Cambios de este tipo muestran una apoptosis característica, causada por las modificaciones morfológicas de las células. A 10 mU de XOD, las células presentaban un modelo de distribución que se situaba aproximadamente en el medio entre dichos valores extremos representados anteriormente. A menos que se indique otra cosa, se utilizaron 10 mU de enzima.

Efecto de flupirtina sobre la tasa de apoptosis espontánea en linfocitos humanos

CMN de sangre periférica tanto de sujetos sanos como de pacientes infectados con VIH-1 se examinaron con relación a una apoptosis espontánea. Las células se analizaron un día tras tomar la sangre de los sujetos.

Tal como puede apreciarse por la Figura 2, un 6,32 \pm 0,82% de las células CMN de los grupos de control de sujetos no infectados presentan una apoptosis tras dicho periodo, mientras que un 28,42 \pm 7,84% de las células de pacientes infectados con VIH-1 pasaron por una apoptosis. Las CMN de ambos grupos se trataron con flupiritna en concentraciones comprendidas entre 0,1 y 30 \mug/ml durante 24 horas. Tal como se ha recopilado en la Figura 2, la tasa de apoptosis espontánea de linfocitos cambió bajo el efecto de flupirtina de forma no significante (P > 0,1). Esto vale tanto para las células de sujetos sanos como para los pacientes infectados con VIH-1.

Reducción de la apoptosis inducida en células mononucleares a consecuencia de flupirtina

CMN tanto de sujetos sanos como de pacientes infectados con VIH-1 se trataron con el sistema HX/XOD (formación de radicales de oxígeno) para la inducción de la apoptosis. Flupirtina se adicionó a las preparaciones de células en concentraciones distintas 6 horas antes de la exposición al inductor. Tal como se ha representado en la Figura 3, flupirtina en concentraciones comprendidas entre 0,1 y 3,0 \mug/ml dio lugar a una reducción significante de la muerte celular apoptótico (P < 0,001). A una concentración de flupirtina de 10 \mug/ml, el efecto protector sólo era significante en ensayos con linfocitos de sujetos infectados. A concentraciones comprendidas entre 0,3 y 3,0 \mug/ml de flupirtina, el efecto protector del medicamento era más pronunciado e inhibió la apoptosis inducida en mayor grado. La reducción de la apoptosis inducida en las preparaciones que contenían linfocitos de sujetos sanos era de aproximadamente un 40% y en las de pacientes infectados con VIH-1 aproximadamente un 60%.

La apoptosis se detectó en los linfocitos también a través del método de fragmentación de ADN. Tras incubación de las células con el sistema HX/XOD, se extrajo el ADN de las células, se separó en gel de agarosa por tamaño y a continuación se transfirió a un blot.

El ADN desintegró en un modelo en forma de escalera constituido por fragmentos por 180 pares de bases y múltiples de los mismos. Un modelo de fragmentación de este tipo es característico de la destrucción del ADN, observada en procesos apoptóticos (Wyllie, 1980). En cambio, las células que fueron tratadas con 1 \mug/ml de flupirtina no mostraban una fragmentación del ADN.

Dot-blots representativos, que muestran el efecto de flupirtina sobre las células que pasan por una apoptosis tanto espontánea como inducida, también están disponibles.

Para la realización de dicha serie de experimentos, se indujo una apoptosis en las CMN por medio del sistema HX/20 mU de XOD. En estas condiciones, en ausencia de flupirtina, -64,2 \pm 7,9% de las células llegaron a ser apoptóticas.

Sin embargo, si dichas células se trataban con flupirtina durante 24 horas, el porcentaje de las células apoptóticas disminuyó de forma significante a un 18,3 \pm 5,8%.

Estos resultados demuestran claramente que flupirtina es un medicamento prometedor, por ejemplo para el tratamiento de la muerte celular apoptótica inducida de linfocitos en los pacientes de SIDA.

En el documento DE-A-43 27 516, se describe el efecto neuroprotector de flupirtina, por ejemplo para la isquemia cerebral, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, enfermedades de neurodegeneración inducidas por infección tales como la encefalopatía de SIDA o la enfermedad de Jakob-Creutzfeld.

La indicación de encefalopatía de SIDA a medida que progresa la demencia constituye una complicación neurológica de la enfermedad de SIDA. Se cree que la causa de la formación de la encefalopatía de SIDA es, entre otras, la liberación de neurotoxinas inducida por VIH(gp 120) que actúan como antagonistas de NMDA, tales como el ácido quinólico a partir de macrófagos infectados, que al fin y al cabo provocan la muerte de las células nerviosas.

La encefalopatía de SIDA y la enfermedad de SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida) son enfermedades relacionadas con sistemas orgánicos distintos. La primera enfermedad es, como ya se ha expuesto, una complicación neurológica de la enfermedad de SIDA (apoptosis de células nerviosas), mientras que la segunda enfermedad representa una "inmunodeficiencia adquirida", que se basa en un trastorno del sistema inmune celular con una disminución pronunciada de las células ayudadoras T (apoptosis de un componente del sistema celular hematopoyético).

El efecto de flupirtina que provoca una inhibición de la apoptosis inducida de las células del sistema celular hematopoyético, por ejemplo de linfocitos, era tanto más sorprendente puesto que la existencia de receptores de NMDA fuera del sistema nervioso central no se había detectado hasta la actualidad. Por ello, los expertos en la materia tampoco podían suponer que la protección de las células por flupirtina diera lugar a una protección de las células del sistema celular hematopoyético.

Entre las enfermedades que se mencionaban como tratables de forma profiláctica y terapéutica debido a la eficacia según la invención de flupirtina se incluyen:

-: neutropenia/linfocitopenia inducida por medicamentos (tales como citostáticos, corticoesteroides), sustancias tóxicas, radiación y por otras enfermedades

-: trombocitopenia inducida por medicamentos o por infección (por ejemplo VIH).

La flupirtina puede administrarse para la profilaxis y terapia de manera conocida en las siguientes formas de aplicación:

Los comprimidos, comprimidos recubiertos de película, cápsulas de gelatina dura, cápsulas de gelatina blanda, pellets, granulados, grageas, supositorios, microcápsulas, suspensiones acuosas o aceitosas, soluciones aceitosas, soluciones para la inyección para la administración intramuscular, soluciones para la inyección para la administración intravenosa.

Las sales que son aptas para la preparación del medicamento son todas las sales fisiológicamente compatibles de flupirtina. Son aptas por ejemplo el clorhidrato, maleato, sulfato y gluconato de flupirtina.

Los contenidos en flupirtina de los medicamentos según la invención están comprendidos entre 0,1 mg y 3000 mg, preferentemente entre 10 mg y 500 mg. Las dosis individuales citadas del medicamento pueden administrarse 1 a 5 veces, preferentemente 1 a 3 veces al día.

Las dosis citadas se refieren siempre a flupirtina como base. Si se utilizan sales de flupirtina, su cantidad debe convertirse por cálculo según su peso molecular.

La manipulación farmacéutica y galénica de los compuestos según la invención se realizará según los métodos estándares convencionales. Por ejemplo, flupirtina y los vehículos y/o auxiliares se mezclan intensamente por agitación o homogeneización, utilizándose por lo general temperaturas comprendidas entre 20 y 80ºC, preferentemente 20 y 50ºC.

Descripción de las figuras

Figura 1

Incubación de células CEM no infectadas [\circ] e infectadas con VIH-1 [\bullet] con concentraciones distintas de flupirtina. Los valores medios de 10 experimentos paralelos se han indicado; las desviaciones estándares no eran más de un 10%.

Figura 2

Efecto de la flupirtina sobre la apoptosis espontánea de linfocitos, obtenidos a partir de sujetos no infectados [barras abiertas] y de pacientes infectados con VIH-1 [barras con rayas diagonales]. Tras un día, las células se analizaron por citometría de flujo. Los linfocitos de 12 pacientes infectados y 8 sujetos no infectados se investigaron; se han indicado los valores medios y las desviaciones estándares.

Figura 3

Reducción de la muerte apoptótica inducida de linfocitos tras el tratamiento con flupirtina. CMN de sujetos no infectados [barras abiertas] y de pacientes infectados con VIH-1 [barras con rayas diagonales] se llevaron a la muerte apoptótica por medio del sistema HX/XOD. Flupirtina se adicionó a las células 6 horas antes del sistema que genera radicales de oxígeno. Un día más tarde, las células se analizaron por medio de citometría de flujo. Se determinaron los valores para la apoptosis total, de los cuales se restaron los valores para la apoptosis espontánea. Por tanto, los valores representados indican el grado de apoptosis inducida. Los linfocitos de 12 pacientes infectados y 8 sujetos no infectados se investigaron; se han indicado los valores medios y las desviaciones estándares.

Claims

1. Utilización del principio activo flupirtina o de sus sales de utilización farmacéutica para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una neutropenia/linfocitopenia inducida por fármacos, tales como citostáticos, corticoesteroides, sustancias tóxicas, radiación, y por otras enfermedades o de una trombocitopenia inducida por fármacos o infecciones, por ejemplo VIH.

2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque la flupirtina o sus sales se combinan con vehículos y/o auxiliares farmacéuticamente adecuados para las formas de aplicación correspondientes.