ES2254450T3 - Sistema de evaluacion para predecir la recidiva del cancer. - Google Patents
Sistema de evaluacion para predecir la recidiva del cancer.Info
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Abstract
Un método in vitro para la predicción de la recidiva del cáncer, que comprende las etapas de: (a) estudiar los niveles o patrones de expresión de dos o más genes y/o proteínas en las muestras preparadas procedentes de tejidos cancerosos de pacientes, en el que dichos genes y/o proteínas se seleccionan aplicando el criterio de Fisher sobre la base de los niveles o patrones de expresión de genes y/o proteínas de tejidos cancerosos de pacientes que presentan recidiva y de pacientes que no presentan recidiva; y, (b) predecir una recidiva del cáncer en los pacientes comparando los niveles o patrones de expresión de los genes y/o proteínas estudiados en la etapa (a) con los niveles o patrones de expresión de los genes seleccionados mediante análisis estadísticos sobre la base de los niveles o patrones de expresión de genes y/o proteínas de tejidos cancerosos de pacientes que presentan recidiva y de pacientes que no presentan recidiva.
Description
Sistema de evaluación para predecir la recidiva
del cáncer.
La presente invención se refiere a un método
in vitro para la predicción de la recidiva del cáncer. Más
en particular, la presente invención concierne a la selección de
genes y/o proteínas aplicando el criterio de Fisher, y a la
generación de fórmulas con los genes y/o proteínas seleccionados
para la predicción de la recidiva del cáncer midiendo de la
expresión de genes y/o proteínas de tumores humanos primarios en
pacientes que presentan recidiva del cáncer y en los que no
presentan recidiva del cáncer.
La presente invención también describe un
kit para llevar a cabo el método de la presente invención,
que comprende un chip de DNA, un chip de
oligonucleótidos, un chip de proteínas, péptidos,
anticuerpos, sondas y cebadores que son necesarios para hacer
micromatrices de DNA, micromatrices de oligonucleótidos, matrices
de proteínas, transferencias Northern, hibridación in situ,
ensayos de protección frente a RNasa, transferencias Western,
ensayos ELISA, transcripción inversa seguida de reacción en cadena
de la polimerasa (en lo sucesivo nombrada RT-PCR),
para estudiar la expresión de al menos 2 ó más genes y/o proteínas,
preferiblemente 4 o más genes y/o proteínas, más preferiblemente 6
o más genes y/o proteínas, y muy preferiblemente 12 o más genes y/o
proteínas, que son indicativos de la recidiva del cáncer.
El cáncer es una de las principales causas de
muerte en el mundo. La tasa de prevalencia global del cáncer es
aproximadamente del 1% de la población y la tasa de incidencia
anual es aproximadamente del 0,5%. Aproximadamente uno de cada diez
pacientes dados de alta de hospitales presentan un cáncer como
diagnóstico primario. Las principales modalidades de tratamiento
existentes son la resección quirúrgica, radioterapia, quimioterapia
y terapia biológica que incluye la terapia hormonal. Además,
tecnologías recientemente desarrolladas han ofrecido nuevas
modalidades de tratamiento, tales como la terapia génica. A pesar
de todo, el cáncer es una enfermedad temible porque en la mayoría de
los casos no se dispone de un tratamiento realmente eficaz. Una de
las mayores dificultades del tratamiento del cáncer es la capacidad
de las células cancerosas de hacerse resistentes a los fármacos y
de diseminarse a otras localizaciones tisulares, en las que generan
nuevos tumores, que con frecuencia producen una recidiva. Si una
recidiva del cáncer se puede predecir antes de que la recidiva se
produzca, ese cáncer se hace curable mediante tratamiento local con
cirugía.
Entre los diferentes tumores, el carcinoma
hepatocelular (en lo sucesivo mencionado HCC) es uno de los
cánceres mortales más comunes en el mundo y el número de casos va
en aumento en muchos países, incluyendo los EE.UU., Japón, China y
países europeos. Tanto las infecciones causadas por el virus B de
la hepatitis (en lo sucesivo mencionado HBV) como las infecciones
causadas por el virus C de la hepatitis (en lo sucesivo mencionado
HCV) pueden ser una causa del HCC. De hecho, el aumento de
pacientes con HCC va en paralelo a un aumento en la infección
crónica por HCV (El-Serag, H.B. y Mason, A.C.
Rising incidence of hepatocellular carcinoma in the Unites
States. N. England. J. Med. 340, 745-750
(1999) y Okuda, K. Hepatocellular carcinoma. J. Hepatol.
32, 225-237 (2.000)). A pesar del número
elevado de casos de HCC, no existe un tratamiento prometedor de
esta enfermedad. El principal problema en el tratamiento del HCC es
la metástasis intrahepática. Se han observado recidivas en del 30%
al 50% de los pacientes con HCC que habían sido sometidos a una
resección hepática (Iizuka, N. y col. NM23-H1 y
NM23-H2 messanger RNA abundance in human
hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 55,
652-657 (1995), Yamamoto, J. y col. Recurrence
of hepatocellular carcinoma after surgery. Br. J. Surg.
83, 1219-1222 (1996), y Poon, R.T. y col.
Different risk factors and prognosis for early and late
intrahepatic recurrence after resection of hepatocellular
carcinoma. Cancer 89, 500-507 (2999)).
Aunque el sistema anatomoclínico TNM de clasificación en estadios se
ha aplicado en el tratamiento del HCC, este sistema es poco
pronosticador de recidivas en pacientes que han experimentado una
resección hepática (Izumi, R. y col. Prognostic factors of
hepatocellular carcinoma in patients undergoing hepatic resection.
Gastroenterology 106, 720-727 (1994)). Se
han propuesto varias moléculas como marcadores pronósticos de los
HCC, ninguna de las cuales ha demostrado ser clínicamente útil
(Iuzuka, N. y col. NM23-H1 y
NM23-H2 messanger RNA abundance in human
hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 55,
652-657 (1995), Hsu, H.C. y col., Expression of
p53 gene in 184 unifocal hepatocellular carcinomas: association
with tumor growth invasiveness, Cancer Res. 53,
4691-4694 (1993), y Mathew, J. y col. CD44 is
expressed in hepatocellular carcinomas showing vascular invasion,
J. Pathol. 179, 74-79 (1996)). Por lo
tanto, cualquier método que prediga una recidiva sería muy valioso
para comprender los mecanismos del cáncer y también para establecer
los nuevos tratamientos para el cáncer. El documento WO 01/18542
concierne a métodos para evaluar si una paciente padece cáncer de
ovario comparando el nivel de expresión de un marcador en una
muestra de la paciente con el nivel normal en una muestra de
control de un cáncer no ovárico. La Patente de EE.UU. Núm.
6.025.128 concierne a métodos para predecir la recidiva de un cáncer
de próstata generando parámetros de predicción para las células
prostáticas y prediciendo la recidiva del cáncer de próstata en las
muestras celulares mediante análisis estadístico de los parámetros
de predicción. No obstante, debido a que existen limitaciones
tecnológicas para predecir una recidiva aplicando los métodos
tradicionales, y otras limitaciones que pueden ser atribuibles a la
elevada heterogeneidad de los tumores entre los pacientes, es
necesario diseñar un nuevo método para caracterizar tumores y
predecir una recidiva del cáncer.
El desarrollo reciente de las tecnologías de las
micromatrices, que permiten realizar análisis de expresión
paralelos de un gran número de genes, ha abierto una nueva era en
la ciencia médica (Schena, M. y col. Quantitative monitoring of
gene expression patterns with a complementary DNA microarray.
Science 270, 467-470 (1995), y DeRisi,
J. y col. Use of a cDNA microarray to analyze gene expression
patterns in human cancer. Nature Genet. 14,
457-460 (1996)). En particular, estudios realizados
con micromatrices de cDNA de la expresión génica de tumores han
proporcionado conocimientos importantes de las propiedades de
tumores malignos, tales como el pronóstico y la sensibilidad frente
a fármacos (Alizadeh, A.A. y col. Distinct types of diffuse large
B-cell lymphoma identified by gene expression
profiling. Nature 403, 503-511 (2000) y
Scherf, U. y col. A gene expression data base for the molecular
pharmacology of cancer. Nature Genet. 24,
236-244 (2000)).
Recientemente, se ha introducido el aprendizaje
supervisado en el análisis de la expresión génica (Brazma, A. y
Vilo, J. Gene expression data analysis. FEBS Lett.
480, 17-24 (2000) y Kell, D.B. y King, R.D.
On the optimization of classes for the assignment of
unidentified reading frames in functional genomics programs: the
need of machine learning. Trends Biotechnol. 18,
93-98 (2000)). Utilizando muestras clasificadas, el
aprendizaje supervisado presenta la ventaja decisiva de una gran
parte del conocimiento a priori sobre la naturaleza de los
datos (Duda, R. O. y col. Pattern classification. John Wiley
& Sons (2001), y Jain, A.K. y col. Statistical pattern
recognition: A review. IEEE Trans. Pattern Analysis and Machine
Intelligence. 22, 4-37 (2000)). Sin
embargo, ninguno de los métodos de aprendizaje supervisado
previamente publicados, evalúa directamente la combinación de genes
y por ello ninguno de ellos puede utilizar información concerniente
a las características estadísticas, es decir, a la estructura de la
distribución de los genes (Golub, T.R. y col. Molecular
classification of cancer: class discovery and class prediction by
gene expression monitoring. Science 286,
531-537 (1999) y Brown, M.P. y col.
Knowledge-based analysis of microarray gene
expression data using support vector machines. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 97, 262-267 (2000)).
Los sistemas de evaluación que son
pronosticadores de la recidiva del cáncer se crean analizando los
datos obtenidos con micromatrices de DNA con el aprendizaje
supervisado en el reconocimiento de patrones estadísticos (Duda, R.
O. y col. Pattern classification. John Wiley & Sons
(2001)).
El aprendizaje supervisado en el reconocimiento
de patrones estadísticos se ha aplicado con éxito a la resolución
de diversos asuntos tales como la clasificación de documentos, el
reconocimiento de la voz, el reconocimiento biomédico y la
detección a distancia (Jain, A.K. y col., Statistical pattern
recognition: A review. IEEE Trans. Pattern Analysis and Machine
Intelligence. 22, 4-37 (2000)).
En la presente invención, los autores
proporcionan un método in vitro para predecir la recidiva
del cáncer analizando la expresión de genes y/o proteínas de
tumores humanos primarios aplicando el criterio de Fisher. Es decir,
la invención concierne a un método para la predicción de la
recidiva del cáncer que comprende medir la expresión de genes y/o
proteínas de tejidos tumorales humanos, y compararla con la
expresión de esos genes y/o proteínas de tumores humanos primarios
procedentes de pacientes que presentan una recidiva del cáncer y de
pacientes que no presentan una recidiva del cáncer.
La Figura 1 ilustra el procedimiento de selección
génica (Etapas 1-7) y de evaluación (Etapas
8-10) del sistema de valoración con el subconjunto
óptimo de genes.
La Figura 2 ilustra el número óptimo de
genes.
La Figura 3 ilustra las diferencias medias del
mRNA de los genes seleccionados para la predicción de la recidiva
temprana intrahepática. Las diferencias medias del mRNA de los 12
genes se compararon entre el Grupo A (indicado A) y el Grupo B
(indicado B).
La Figura 4 ilustra la relación entre el tipo de
virus, el estadio TNM y las valoraciones (valores de T) para la
predicción de una recidiva temprana intrahepática. Usando el
subconjunto óptimo de 12 genes, el sistema de valoración creado con
30 muestras de entrenamiento se evaluó con 3 muestras
experimentales. Esta operación se repitió 10 veces de manera
independiente. Se calcularon los valores de T de todas las muestras
experimentales. Se predijo una recidiva temprana intrahepática
cuando el valor de T era menor que cero. Independientemente del
estadio y de los tipos de virus, todos los HCC con un valor de T
negativo, presentaron recidivas tempranas intrahepáticas y todos los
HCC con un valor de T positivo no presentaron recidivas. Símbolos
coloreados, Grupo A (pacientes con recidiva temprana
intrahepática); Símbolos blancos, Grupo B (pacientes sin recidiva
temprana intrahepática); \medcirc, estadio I; \lozenge, estadio
II; \Delta, estadio IIIA; \square estadio IVA; B:
HBV-positivo; C: HCV-positivo; N:
HBV-HCV-doble negativo.
La Figura 5 ilustra el sistema de valoración.
En la presente invención, se utilizan tejidos
humanos procedentes de tumores, que incluyen tumores de cerebro,
pulmón, mama, estómago, hígado, páncreas, vesícula biliar, colon,
recto, riñón, vejiga, ovario, útero, próstata y piel. Después de
que los tejidos humanos se han extirpado en operaciones quirúrgicas,
es preferible que se congelen inmediatamente en nitrógeno líquido o
en hielo seco que contiene acetona, y que se almacenen a una
temperatura entre -70ºC y -80ºC hasta el momento de su utilización,
con o sin ser incluidos en compuesto O.C.T.
Sakura-Seiki, Tokio, Japón, Núm. de Catálogo
4583).
En particular, la presente invención se refiere a
las siguientes realizaciones:
(1) Un método in vitro para la predicción
de la recidiva del cáncer, que comprende las etapas de:
- (a)
- estudiar los niveles o patrones de expresión de dos o más genes y/o proteínas en las muestras preparadas procedentes de tejidos cancerosos de pacientes, en el que dichos genes y/o proteínas se seleccionan aplicando el criterio de Fisher sobre la base de los niveles o patrones de expresión de genes y/o proteínas de tejidos cancerosos de pacientes que presentan recidiva y de pacientes que no presentan recidi- va;
- y,
- (b)
- predecir una recidiva del cáncer de los pacientes comparando los niveles o patrones de expresión de genes y/o proteínas estudiados en la etapa (a) con los niveles o patrones de expresión de los genes seleccionados mediante análisis estadísticos sobre la base de los niveles o patrones de expresión de genes y/o proteínas de tejidos cancerosos de pacientes que presentan recidiva y de pacientes que no presentan recidiva.
(2) El método in vitro según (1), en el
que el número de genes y/o proteínas seleccionados mediante
análisis estadísticos es 4 o más de 4.
(3) El método in vitro según (1), en el
que el número de genes y/o proteínas seleccionados mediante
análisis estadísticos es 6 o más de 6.
(4) El método in vitro según (1), en el
que el número de genes y/o proteínas seleccionados mediante
análisis estadísticos es 12 o más de 12.
(5) El método in vitro según de (1) a (4),
en el que la recidiva del cáncer es una recidiva temprana de cáncer
intrahepático.
(6) El método in vitro según de (1) a (5),
en el que los genes y/o proteínas que se han de estudiar son los
genes indicados con los números de registro del banco de datos
M21574, M59465, U51240, X00274, X75042, X82200, Y10032, L08895,
AC000063, U59321, Z19554 y D13639.
(7) El método in vitro según de (1) a (6),
en el que la recidiva del cáncer es una recidiva temprana de cáncer
intrahepático y los genes y/o proteínas que se han de estudiar son
los genes indicados con los números de registro del banco de datos
M21574, M59465, U51240, X00274, X75042, X82200, Y10032, L08895,
AC000063, U59321, Z19554 y D13639.
(8) El método in vitro según (1) - (7), en
el que los tejidos cancerosos son tejidos cancerosos de hígado.
(9) El método in vitro según (1) - (8), en
el que la expresión de genes y/o proteínas de tejidos cancerosos
humanos, y la expresión de genes y/o proteínas de tejidos
cancerosos primarios humanos de pacientes que presentan recidiva y
de pacientes que no presentan recidiva, se estudian por medio de
micromatrices de DNA, transcripción inversa seguida de reacción en
cadena de la polimerasa o matrices de proteínas.
La expresión de genes y/o proteínas de tejidos
tumorales de pacientes que se someten a estudio para determinar la
probabilidad de una recidiva del cáncer, se analiza midiendo los
niveles de RNA y/o proteínas. En muchos casos, los niveles de RNA
y/o proteínas se determinan midiendo la fluorescencia de sustancias
que incluyen fluoresceína y rodamina, la quimioluminiscencia
derivada de luminol, las radiactividades de materiales radiactivos
que incluyen ^{3}H, ^{14}C, ^{35}S, ^{33}P, ^{32}P y
^{125}I y densidades ópticas. Los niveles de expresión de RNA y/o
proteínas se determinan con métodos conocidos que incluyen
micromatrices de DNA (Schena, M. y col. Quantitative monitoring
of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.
Science 270, 467-470 (1995) y Lipshutz,
R.J. y col. High density synthetic oligonucleotide arrays.
Nature Genet. 21, 20-24 (1999)),
RT-PCR (Weis, J.H. y col. Detection of rare
mRNAs via quantitative RT-PCR. Trends Genetics
8, 263-264 (1992) y Bustin, S.A. Absolute
quantification of mRNA using real-time reverse
transcription polimerase chain reaction assays. J. Mol.
Endocrinol. 25, 169-193 (2000)),
transferencia Northern e hibridación in situ (Parker, R.M. y
Barnes, N.M. mRNA: detection in situ and Northern
hibridization. Methods Mol. Biol. 106, 247-283
(1999)), ensayo de protección frente a RNasa (Hod, Y.A.
Simplified ribonuclease protection assay. Biotechniques
13, 852-854 (1992), Saccomanno, C.F. y col.
A faster ribonuclease protection assay. Biotechniques
13, 846-850 (1992)), transferencia Western
(Towbin, H. y col. Electrophoretic transfer of proteins from
poliacrilamide gels to nitrocellulose sheets. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 76, 4350-4354 (1979), Burnette, W.N.
Western blotting: Electrophoretic transfer of proteins from
sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gels to
unmodified nitrocellulose and radioiodinated protein A. Anal.
Biochem. 112, 195-203 (1981)), ensayos
ELISA (Engvall, E. y Perlman, P. Enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA): Quantitative assay of immunoglobulin
G. Immunochemistry 8:871-879 (1971)), y
matrices de proteínas (Merchant, M. y Weinberger, S.R. Review:
Recent advancements in surface enhanced laser desorption/ionization
time of flight-mass spectrometry.
Electrophoresis 21, 1164-1177 (2000),
Paweletz, C.P. y col. Rapid protein display profiling of cancer
progression directly from human tissue using a protein biochip.
Drug Development Research 49, 34-42
(2000)).
La expresión de genes y/o proteínas de tumores
procedentes de pacientes con cáncer que presentan una recidiva
temprana y la de pacientes con cáncer que no presentan una recidiva
temprana, se determinan de la misma manera que en el caso de los
pacientes que se someten a estudio para determinar la probabilidad
de recidiva.
Aunque la recidiva temprana del cáncer varía
entre los diferentes tipos de cáncer, normalmente se produce dentro
del plazo de uno o dos años después de la resección. Por lo tanto,
los tumores de pacientes con cáncer que presentan recidiva dentro
del plazo de uno o dos años después de la resección, se pueden usar
considerados como los tumores de pacientes con recidiva temprana, y
los de pacientes que no presentan recidiva antes de uno o dos años
después de la resección se pueden usar considerados como los
tumores de pacientes sin recidiva tempra-
na.
na.
Las diferencias en los niveles o patrones de
expresión de genes y/o proteínas de tumores entre pacientes con
cáncer que presentan recidiva temprana y de pacientes con cáncer
que no presentan recidiva temprana, se pueden analizar y detectar
mediante métodos conocidos de análisis estadístico. El aprendizaje
supervisado en el reconocimiento de patrones estadísticos se puede
usar para el análisis estadístico de los patrones de expresión de
genes y/o proteínas de los tumores. Aplicando el aprendizaje
supervisado en el reconocimiento de patrones estadísticos, entre los
genes y/o proteínas estudiados, se seleccionan 2 o más genes y/o
proteínas cuya expresión es indicativa de una recidiva del
cáncer.
Algunos genes y/o proteínas que son indicativos
de una recidiva del cáncer, se seleccionan en primer lugar mediante
aplicación de criterios unidimensionales. Después, los subconjuntos
óptimos de genes y/o proteínas se seleccionan de entre estos genes
y/o proteínas por medio de una búsqueda exhaustiva con el método
denominado "dejar uno fuera" que tiene en consideración todas
las combinaciones posibles de genes y/o proteínas.
Se crean fórmulas que predicen la recidiva del
cáncer usando los subconjuntos óptimos de al menos 2 o más de los
genes y/o proteínas, preferiblemente 4 o más de los genes y/o
proteínas, más preferiblemente 6 o más de los genes y/o proteínas,
y muy preferiblemente 12 o más de los genes y/o proteínas, cuya
expresión es indicativa de una recidiva del cáncer. Para crear las
fórmulas, se usan clasificadores sencillos tales como un
clasificador lineal (Duda, R. O. y col. Pattern classification.
John Wiley & Sons (2001), y Jain, A.K. y col.
Statistical pattern recognition: A review. IEEE Trans. Pattern
Analysis and Machine Intelligence. 22,
4-37 (2000)) que operan bien incluso cuando el
número de muestras es pequeño comparado con el número de genes y/o
proteínas.
Aquí se describen kits para llevar a cabo
los métodos de la presente invención. Los kits para estudiar
los patrones de expresión de 2 o más de los genes y/o proteínas que
son indicativos de una recidiva del cáncer, consisten en los
componentes que incluyen reactivos para la extracción del RNA,
enzimas para las síntesis de cDNA y cRNA, chips de DNA, chips de
oligonucleótidos, chips de proteínas, sondas y cebadores para los
análisis, fragmentos de DNA de genes de control y anticuerpos
dirigidos contra diferentes proteínas. Los componentes de los
kits se encuentran fácilmente disponibles en el mercado. Por
ejemplo, los chips de oligonucleótidos, el reactivo de
guanidina-fenol, la transcriptasa inversa, la
RNA-polimerasa de T7 y la
Taq-polimerasa se pueden adquirir y agrupar para
constituir los kits de la presente invención.
Los siguientes ejemplos ilustran simplemente el
método preferido para la predicción de la recidiva del cáncer, de
la presente invención, y no deben ser interpretados como
limitativos de la misma.
Se ha publicado que las recidivas tempranas
intrahepáticas (dentro del plazo de un año) después de una cirugía
provienen principalmente de metástasis intrahepáticas, mientras que
las recidivas tardías es más probable que sean de aparición
multicéntrica (Poon, R.T. y col. Different risk factors and
prognosis for early and late intrahepatic recurrence after resection
of hepatocellular carcinoma. Cancer 89,
500-507 (2000)). Además, es muy conocido que la
respuesta de los pacientes con recidiva intrahepática, es peor que
la de pacientes con aparición multicéntrica (Yamamoyo, J. y col.
Recurrence of hepatocellular carcinoma after surgery, Br. J.
Surg. 83, 1219-1222 (1996) y Poon, R.T.
y col. Different risk factors and prognosis for early and late
intrahepatic recurrence after resection of hepatocellular
carcinoma. Cancer 89, 500-507 (2000)).
Por ello los patrones de expresión génica ligados a la recidiva
temprana intrahepática se investigaron en el plazo de un año
después de la cirugía.
Treinta y tres pacientes fueron sometidos a
tratamiento quirúrgico por HCC en el Yamaguchi University
Hospital entre mayo de 1.997 y enero de 2.000. Se obtuvo un
consentimiento informado por escrito en todos los casos antes de la
cirugía. El protocolo del estudio fue aprobado por el
Institutional Review Board for Human Use en la Yamaguchi
University School of Medicine en mayo de 1.996. Un diagnóstico
histopatológico de HCC se realizó en todos los pacientes después de
la cirugía. El estudio histopatológico reveló la ausencia de
tumores residuales (R0) en la totalidad de las 33 muestras de HCC.
La Tabla 1 muestra las características anatomoclínicas de los 33
pacientes, basadas en la clasificación TNM de la Union
Internationale Contre le Cancer (UICC) (Sobin, L.H. y
Wittekind, C. TNM classification of Malignant Tumors, 5ª ed.,
UICC, Wiley-Liss, 74-77 (1997)).
Desde el punto de vista serológico, 7 pacientes fueron positivos al
antígeno de superficie de la hepatitis B, 22 pacientes fueron
positivos al anticuerpo anti-HCV y los 4 pacientes
restantes fueron negativos a ambos. Los 33 pacientes se sometieron
a seguimiento con respecto a la recidiva del cáncer con ecografía,
tomografía computerizada y medida del nivel de
alfa-fetoproteína cada 3 meses después de la
resección hepática. Siempre que se consideró necesario, se
añadieron un análisis de imágenes por resonancia magnética y una
angiografía hepática. De los 33 pacientes con HCC, se encontraron
recidivas tempranas intrahepáticas en 12 de ellos (36%). En 11 de
estos 12 pacientes, se detectaron HCC recidivantes en forma de
nódulos múltiples o en forma de diseminación difusa en el hígado
remanente. En uno de los pacientes, se detectó un tumor nuevo en
forma de un nódulo único en el segmento adyacente a la lesión
primaria extirpada, nueve meses después de la cirugía, y después se
observaron múltiples metástasis pulmonares. Ninguno de los 21
pacientes restantes presentaron recidivas intrahepáticas ni otras
metástasis distales en el plazo de un año después de la cirugía.
Estos pacientes se dividieron en dos grupos: los pacientes que
habían presentado recidivas intrahepáticas en el plazo de un año en
el Grupo A (n = 12) y los pacientes que no las habían presentado en
el Grupo B (n = 21) (Tabla 1). La prueba de \chi^{2} y la
prueba exacta de Fisher se usaron para elucidar las diferencias en
factores anatomoclínicos entre los 2
grupos.
grupos.
Trozos de tejidos (de aproximadamente 125
mm^{3}) se suspendieron en TRIZOL (Life Technologies,
Gaithersburg, USA, Núm. de Catálogo 15596-018) o en
Sepasol-RNAI (o Sepasol-RNAI
(Nacalai tesque, Kyoto, Japón, Núm. de Catálogo
306-55) y se homogeneizaron dos veces con un
Polytron (Kinematica, Littau, Suiza) (5 s a velocidad máxima).
Después de la adición de cloroformo, los homogeneizados de los
tejidos se centrifugaron a 15.000 x g durante 10 min, y se
recogieron las fases acuosas que contenían el RNA. El RNA celular
total se precipitó con alcohol isopropílico, se lavó una vez con
etanol al 70% y se suspendió en agua tratada con DEPC (Life
Technologies, Gaithersburg, USA, Núm. de Catálogo
10813-012). Después de que el RNA se hubo tratado
con 1,5 unidades de DNasaI (Life Technologies, Gaithersburg,
USA, Núm. de Catálogo 18068-015), el RNA se extrajo
de nuevo con TRIAZOL/cloroformo, se precipitó con etanol y se
disolvió en agua tratada con DEPC. Seguidamente, se retiraron los
nucleótidos de bajo peso molecular usando un RNeasy Mini Kit
(QIAGEN, Hilden, Alemania, Núm. de Catálogo 74104) conforme al
manual de instrucciones del fabricante. La calidad del RNA total se
juzgó por la proporción de RNA ribosómico 28S y de RNA ribosómico
18S después de una electroforesis en gel de agarosa. El RNA total
purificado se almacenó a -80ºC en una disolución de etanol al 70%
hasta el momento de su uso.
El cDNA se sintetizó usando el sistema reverse
SuperScript Choice System (Life Technologies,
Gaithersburg, USA, Núm. de Catálogo 18090-019)
conforme al manual de instrucciones del fabricante. Cinco
microgramos del RNA total purificado se hibridaron con un cebador
oligo-dT (Sawady Technology, Tokio, Japón)
que contenía las secuencias del promotor de T7 y 200 unidades de la
transcriptasa inversa SuperScriptII y se incubaron a 42ºC
durante 1 h. El cDNA resultante se extrajo con fenol/cloroformo y
se purificó con Phase Lock Gel Light (Eppendorf, Hamburg,
Alemania, Núm. de Catálogo 0032 005.101).
También se sintetizó cRNA usando el MEGAscript
T7 kit (Ambion, Austin, USA, Núm. de Catálogo 1334) y el cDNA
como molde conforme a las instrucciones del fabricante.
Aproximadamente 5 \mug del cDNA, se incubaron con 2 \mul de una
mezcla enzimática que contenía la polimerasa de T7, una
concentración 7,5 mM de adenosina-trifosfato (ATP)
y de guanosina-trifosfato (GTP), una concentración
5,625 mM de citidina-trifosfato (CTP) y de uridina
trifosfato (UTP), y una concentración 1,875 mM de
Bio-11-CTP y de
Bio-16-UTP (ENZO Diagnostics,
Farmingdale, USA, Núm. de Catálogo 42818 y 42814, respectivamente)
a 37ºC durante 6 h. Los mononucleótidos y los oligonucleótidos
cortos se retiraron mediante cromatografía en columna en una
columna CHROMA SPIN+STE-100 (Clontech, Palo Alto,
USA, Núm. de Catálogo K1302-2), y el cRNA presente
en los eluidos se sedimentó añadiendo etanol. La calidad del cRNA
se juzgó por la longitud del cRNA después de una electroforesis en
gel de agarosa. El cRNA purificado se almacenó a -80ºC en una
disolución de etanol al 70% hasta el momento de su utiliza-
ción.
ción.
La expresión génica de tumores primarios humanos
procedentes de pacientes con cáncer de hígado se estudió con
micromatrices de alta densidad de oligonucleótidos (HuGeneFL
array, Affymetrix, Santa Clara, EE.UU, Núm. de Catálogo 510137)
(Lipshutz, R.L. y col. High density synthetic oligonucleotide
arrays, Nature Genet. 21, 20-24 (1999)).
Para la hibridación con los oligonucleótidos dispuestos sobre los
chips, el cRNA se fragmentó a 95ºC durante 35 min en un tampón que
contenía Tris 40 mM (Sigma, St. Louis, EE.UU, Núm de Catálogo
T1503) - ácido acético (Wako, Osaka, Japón, Núm. de Catálogo
017-00256) (pH 8,1), acetato de potasio 100 mM
(Wako, Osaka, Japón, Núm. de Catálogo 160-03175), y
acetato de magnesio 30 mM (Wako, Osaka, Japón, Núm. de Catálogo
130-00095). La hibridación se realizó en 200 \mul
de un tampón que contenía ácido
2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) 0,1 M
(Sigma, St. Louis, EE.UU., Núm de Catálogo M-3885)
(pH 6,7), NaCl 1 M (Nacalai tescque, Tokio, Japón, Núm. de
Catálogo 313-20),
poli(10)(oxileno-octilfenil)éter al 0,01%
(Wako, Osaka, Japón, Núm. de Catálogo 168-11805), 20
\mug de DNA de esperma de arenque (Promega, Madison, EE.UU., Núm.
de Catálogo D181B), 100 \mug de albúmina de suero bovino
acetilada (Sigma, St. Louis, EE.UU., Núm. de Catálogo
B-8894), 10 \mug del cDNA fragmentado, y
oligonucleótidos de control biotinilados,
biotina-5'-CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3'
(Sawady Technology, Tokio, Japón) a 45ºC durante 12 h.
Después de lavar los chips con un tampón que contenía MES 0,01 M
(pH 6,7), NaCl 0,1 M,
poli(10)(oxileno-octilfenil)éter al 0,001%,
los chips se incubaron con anticuerpo
anti-estreptavidina biotinilado (Funakoshi, Tokio,
Japón, Núm. de Catálogo BA0500) y se tiñeron con estreptavidina
R-ficoeritrina (Molecular Probes, Eugene,
EE.UU., Núm. de Catálogo S-866) para incrementar
las señales de hibridación según se describe en el manual de
instrucciones (Affymetrix, Santa Clara, EE.UU.). Cada nivel de
píxeles se recogió con un escáner láser (Affymetrix, Santa Clara,
EE.UU.) y los niveles de expresión de cada uno de los cDNA y la
fiabilidad (llamada presente/llamada ausente) se calcularon con los
programas Affymetrix GeneChip versión 3.3 y Affymetrix
Microarray Suite versión 4.0. En estos experimentos, se
determina la expresión de 6.000 genes de tumores primarios humanos
de pacientes con cáncer de hígado.
La expresión de los genes también se determina
mediante un RT-PCR cinética. La
RT-PCR cinética se realizó con un sistema de PCR en
tiempo real que utiliza fluorescencia. La amplificación por PCR
usando un instrumento LightCycler (LightCycler System,
Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania, Núm. de Catálogo
2011468) se llevó a cabo en 20 \mul de una mezcla de reacción que
consistió en una mezcla maestra y un tampón (LightCycler DNA
Master hybridization probes, Roche Diagnostics,
Mannheim, Alemania, Núm. de Catálogo 2158825), cloruro de magnesio
4 mM (Nacalai tescque, Tokio, Japón, Núm. de Catálogo
77-91-18-6)), 10
pmoles de los cebadores de PCR (Sawady Technology, Tokio,
Japón), 4 pmoles de sondas de hibridación fluorescentes (Nihon
Genome Research Laboratories, Sendai, Japón), que se habían
diseñado para que se hibriden con las secuencias diana en una
ordenación cabeza-cola sobre la cadena de los
productos amplificados, y 2 \mul de cDNA molde en un
LightCycler capillary (Roche Diagnostics, Mannheim,
Alemania, Núm. de Catálogo 1909339). La sonda dadora estaba marcada
con fluorescencia en el extremo 3', mientras que la sonda aceptora
estaba marcada con LC-Red640 en el extremo 5' y se
había modificado en el extremo 3' mediante fosforilación para
bloquear la extensión. El hueco entre el extremo 3' de la sonda
dadora y el extremo 5' de la sonda aceptora fue de entre 1 y 3
bases. Antes de la amplificación, a la mezcla de reacción se
añadieron 0,16 \mul de anticuerpo TaqStart (Clontech, Palo
Alto, EE.UU., Núm. de Catálogo 5400-1), a lo que
siguió la incubación a temperatura ambiente durante 10 min para
bloquear la extensión del cebador. A continuación, el anticuerpo se
inactivó mediante la incubación a 95ºC durante 90 s, y la
amplificación se realizó en el LightCycler con 40 ciclos de
incubación a 95ºC durante 0 s para la desnaturalización, a 57ºC -
60ºC durante 3 s -10 s para la reasociación y a 72ºC durante 10 s
para la extensión, con una pendiente de temperaturas de 20ºC/s. El
seguimiento de la PCR en tiempo real se realizó midiendo las
señales fluorescentes al final de la fase de reasociación en cada
uno de los ciclos de amplificación. Para cualificar la integridad
del DNA aislado y para normalizar el número de copias de secuencias
diana, un análisis de RT-PCR cinética de la
gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa
(GAPDH) (del inglés,
" GlycerAldehyde-3-Phosphate
DeHydrogenase") se llevó también a cabo usando
sondas de hibridación. Se prepararon estándares externos del mRNA
diana y del mRNA de GDPH con diluciones seriadas de razón 10 veces
(de 10^{3} a 10^{8}) de DNA plasmídico. La cuantificación de
mRNA en cada una de las muestras se realizó automáticamente con
referencia a la curva estándar construida en cada uno de los puntos
de tiempo conforme al programa LightCycler software
(LightCycler software versión 3, Roche Diagnostics,
Mannheim,
Alemania).
Alemania).
La recidiva temprana intrahepática tiende a estar
asociada con el número de tumores primarios y con el estadio TNM
con valores de p de 0,041 y 0,006 respectivamente, pero no con
otros factores anatomoclínicos (Tabla 1). El número de tumores
primarios en el momento de la cirugía distinguió el grupo A del
grupo B solamente con la sensibilidad y la especificidad limitadas
(62% y 75% respectivamente). La clasificación por estadios TNM
presentó también una sensibilidad (67%) y una especificidad (83%)
limitadas con respecto a la separación de los grupos A y B. Por lo
tanto, parece que estas clasificaciones tradicionales no son
pronósticas de la recidiva temprana intrahepá-
tica.
tica.
El aprendizaje supervisado en el reconocimiento
de patrones estadísticos se aplicó para analizar los datos de
micromatrices de alta densidad de oligonucleótidos. El sistema de
valoración se diseñó con las muestras de entrenamiento y su
ejecución se validó con las muestras experimentales (Fig. 1). Con
el fin de mantener la independencia de las muestras de entrenamiento
y de las muestras experimentales, se adoptó la estrategia de las
validaciones cruzadas en la que las muestras de entrenamiento y las
muestras experimentales se intercambiaron. Las treinta y tres
muestras disponibles se dividieron en 30 muestras de entrenamiento
y 3 muestras experimentales aplicando la estrategia de las
validaciones cruzadas (Fig. 1, Etapa 1). Sobre la base de la
probabilidad a priori, se crearon diez conjuntos de las
muestras de entrenamiento que consistían en 11 muestras del grupo A
y 19 muestras del Grupo B. Como resultado, se crearon diez
conjuntos de tres muestras experimentales que consistían en una
muestra de Grupo A y dos muestras del Grupo B.
Se seleccionaron cincuenta genes útiles para
crear el sistema de valoración pronóstico entre la totalidad de los
genes estudiados que presentaban una media de las diferencias
medias de más del doble entre el Grupo A y el Grupo B usando el
criterio de Fisher (Fig. 1, Etapas 2 - 3), que se obtuvo aplicando
la siguiente Fórmula (I):
F(i) =
\frac{(\mu_{A} (i) - \mu_{B} (i))^{2}}{P(A) \sigma_{A}^{2}
(i) + P(B) \sigma_{B}^{2}
(i)}
en la que \mu_{A}(i) es
el componente i-ésimo del vector \mu_{A} de la media de las
muestras del Grupo A, \sigma_{A}^{2}(i) es el elemento
diagonal i-ésimo de la matriz \sum_{A} de la covarianza de las
muestras del Grupo A, y P(A) es la probabilidad a
priori del Grupo
A.
Por lo tanto, el subconjunto óptimo de los genes
para el sistema de valoración se identificó como se menciona a
continuación.
El clasificador lineal de Fisher asigna una
muestra experimental x a que sea clasificada en el Grupo A con la
siguiente Fórmula (II),
si
F_{A} (x) <
F_{B}
(x)
en la
que
F_{A} (x) =
\frac{1}{2} (x - \mu_{A})^{T} \sum_{W}^{-1} (x - \mu_{A}) - In \
P(A)
\sum_{W} =
P(A) \sum_{A} + P(B)
\sum_{B}
En el método conocido como "dejar uno
fuera", el vector de la media de las muestras, la matriz de la
covarianza de las muestras y la probabilidad a priori se
estimaron usando 20 muestras como muestras de entrenamiento.
Después, el clasificador lineal de Fisher resultante se aplicó sobre
la muestra restante considerada como muestra
pseudo-experimental. Esta operación se repitió 30
veces. La tasa de error se calculó para cada uno de los posibles
subconjuntos de genes. Por ejemplo, cuando se seleccionan 5 genes
entre 50, el número de subconjuntos que ha de ser estudiado es de
dos millones.
A continuación, se seleccionaron los subconjuntos
de genes candidatos que minimizan la tasa de error (Fig. 1, Etapa
4). Este estudio se repitió 10 veces de manera independiente (Fig.
1, Etapa 5).
Entre los subconjuntos de genes candidatos, el
subconjunto de genes que apareció con más frecuencia a lo largo de
los 10 estudios se seleccionó como el subconjunto óptimo de genes
para la discriminación de los dos grupos (Fig. 1, Etapa 6). Usando
el subconjunto óptimo de los genes seleccionados, el valor de T se
obtiene con la siguiente Fórmula (III).
T(x) =
F_{A}(x) -
F_{B}(x)
En este sistema de valoración, todos los HCC con
un valor de T negativo se clasificaron en el Grupo A (grupo con
recidiva temprana intrahepática) y todos los HCC con un valor de T
positivo se clasificaron en el Grupo B (grupo que no presenta
recidiva).
El número óptimo de genes se determinó conforme
al criterio J que se obtuvo con la siguiente fórmula (IV) (Fig. 1,
Etapa 7).
J =
\frac{1}{30} \left[\sum\limits_{x\in B} T(x) -
\sum\limits_{x\in A}
T(x)\right]
El criterio J mide la separabilidad entre el
Grupo A y el Grupo B. La media y el intervalo de confianza del 95%
de los valores de J en 10 conjuntos de entrenamiento diferentes se
calcularon para un número distinto de genes (Fig. 2). La
separabilidad mejoró en paralelo a un incremento en el número de
los genes. El noventa y cinco por ciento del intervalo de confianza
se hizo casi similar cuando el número de genes llegó a 10 y 12, lo
que indica que 12 es el número de genes más apropiado para la
separabilidad los dos grupos (Fig. 2).
Conforme al algoritmo anteriormente descrito, se
identificó el subconjunto óptimo de los 12 genes que discrimina al
Grupo A del Grupo B. El subconjunto óptimo de genes consistió en
los genes del receptor alfa del factor de crecimiento derivado de
plaquetas (PDGFRA) (del inglés,
" Platelet-Derived Growth Factor
Receptor Alpha"), proteína A20 inducible por
el factor alfa de necrosis tumoral (TNF-\alpha),
proteína multitransmembrana asociada a lisosomas (LAPTm5), cadena
pesada alfa de HLA-DR, el
proto-oncogén rel, Staf50, la proteína quinasa de
serina/treonina putativa, el factor de transcripción de la familia
MADS/MEF2 (MEF2C), el clon LUCA19 de cósmidos humanos HUMLUCA19
procedente de 3p21.3, la proteína p72 con la caja DEAD, vimentina
y el gen KIAK0002 (Tabla 2). De los 12 genes seleccionados, la
expresión de once estuvo regulada por disminución en el Grupo A; la
media de las diferencias medias de estos genes en el Grupo A fue de
menos de la mitad de la de estos genes en el Grupo B (Fig. 3). En
cambio, la expresión del gen HUMLUCA19 estaba regulada por aumento
en el Grupo A; la media de las diferencias medias del gen HUMLUCA19
en el Grupo A estaba incrementada en más de 3 veces en comparación
con la del Grupo B (Fig. 3). La precisión de la evaluación para la
predicción de la recidiva temprana intrahepática se evaluó con los
10 conjuntos diferentes de 3 muestras experimentales (Fig. 4). Se
predice una recidiva temprana del HCC calculando los valores de T
de los 12 genes de los pacientes con HCC. La recidiva dentro del
plazo de un año después de la cirugía es muy probable que tenga
lugar cuando el valor de T es menor que cero, y la recidiva dentro
del plazo de un año después de la cirugía es bastante improbable
que tenga lugar cuando el valor de T es mayor que cero. El sistema
de valoración fue perfectamente capaz de predecir la recidiva
temprana intrahepática de 3 muestras experimentales en los 10
estudios. El sistema de valoración fue independiente de patrones de
infecciones víricas, y fue mucho más preciso que el sistema TNM de
clasificación por estadios (Fig. 4). El sistema de valoración que
toma como base los 33 HCC utilizando los 12 genes anteriormente
mencionados (Fig. 5) incluye la siguiente fórmula (V).
- \quad
- T(x) = 0,053862x_{1} + 0,038848x_{2} + 0,030176x_{3} + 0,001824x_{4} + 0,096997x_{5} \ +
- \quad
- 0,017259x_{6} + 0,015908x_{7} + 0,103081x_{8} - 0,0937746x_{9} \ +
- 0,024031x_{10} - 0,005417x_{11} - 0,119177x_{12} - 11,046007
- Fórmula (V)
en la que x_{1}, x_{2},
x_{3}, x_{4}, x_{5}, x_{6}, x_{7}, x_{8}, x_{9},
x_{10}, x_{11} y x_{12} son las diferencias medias
normalizadas de los mRNA del receptor alfa del factor de crecimiento
derivado de plaquetas (PDGFRA), proteína A20 inducible por el
factor alfa de necrosis tumoral (TNF-\alpha),
proteína multitransmembrana asociada a lisosomas (LAPTm5), cadena
pesada alfa de HLA-DR, el
proto-oncogén rel, Staf50, la proteína quinasa de
serina/treonina putativa, el factor de transcripción de la familias
MADS/MEF2 (MEF2C), el clon LUCA19 de cósmidos humanos HUMLUCA19
procedente de 3p21.3, la proteína p72 con la caja DEAD, vimentina
y el gen KIAK0002 (Tabla
2).
Los 12 genes seleccionados en la presente
invención están implicados en una amplia variedad de procesos
biológicos. De estos genes, los genes relacionados con respuestas
inmunológicas, tales como el de la cadena pesada alfa de
HLA-DR, el de la proteína A20 inducible por
TNF-\alpha y el de Staf50, estaban regulados por
disminución en los HCC con recidiva temprana intrahepática. Debido
a que la cadena pesada alfa de HLA-DR se considera
que desempeña un papel importante en la presentación de antígenos
por los macrófagos (Tissot, C. y Mechti, N. Molecular cloning
of a new interferon-induced factor that represses
human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat expression.
J. Biol. Chem. 270, 14891-14898 (1995)),
su regulación por disminución en tejidos tumorales pudiera
facilitar el escape de células tumorales de la vigilancia
inmunológica del hospedador. El proto-oncogén rel,
que está implicado en la ruta de señalización intracelular al igual
que NF-\kappaB, también estaba regulado por
disminución en los HCC con recidiva temprana intrahepática. Además,
se ha publicado que la expresión de rel/NF-\kappaB
está asociada con la activación de las células T (Mora, A. y col.
NF-kappaB/Rel participation in the
lymphokine-dependent proliferation of T lymphoid
cells. J. Immunol. 166, 2218-2217
(2000)). Por lo tanto, parece que varios genes que se habían
seleccionado para usar en la predicción de la recidiva temprana
intrahepática por la presente invención, están implicados en la
debilitamiento de las respuestas inmunológicas del hospedador
frente a células de HCC que poseen altos potenciales de
metástasis.
El patrón de expresión génica de otros pacientes
con HCC cuyo periodo de seguimiento acababa de alcanzar un año, se
analizó también con micromatrices de oligonucleótidos, y las
evaluaciones de la expresión de los 12 genes se calcularon conforme
a la fórmula anteriormente descrita. Los valores de T de los
pacientes que vivieron más de un año después de la cirugía sin
presentar recidiva fueron positivos (valor más) y el del otro
paciente que presentó recidiva intrahepática en el plazo de un año
después de la cirugía fue negativo (menos). Por lo tanto, el
sistema de valoración constituido por el conjunto de 12 genes
obtenidos entre 6.000, fue capaz de predecir con precisión una
recidiva temprana intrahepática. La aplicación del aprendizaje
supervisado en el reconocimiento de patrones estadísticos a
especímenes clínicos, puede proporcionar una información clave por
adelantado para la protección, diagnóstico y tratamientos de otras
enfermedades así como de los HCC. Además, no solamente las
micromatrices de DNA sino también otros métodos como la
RT-PCR, se pueden usar para determinar la expresión
de los conjuntos óptimos de genes.
| Factores | Grupo A | Grupo B | Valor de P |
| (n=12) | (n=21) | ||
| Sexo | N.S. | ||
| \hskip0,5cm Hombre | 8 | 16 | |
| \hskip0,5cm Mujer | 4 | 5 | |
| Edad | N.S. | ||
| \hskip0,5cm \leq 60 | 5 | 7 | |
| \hskip0,5cm > 60 | 7 | 14 | |
| Infección vírica | N.S. | ||
| \hskip0,5cm HBV | 3 | 4 | |
| \hskip0,5cm HCV | 8 | 14 | |
| \hskip0,5cm No B, No C | 1 | 3 | |
| Lesión primaria | 0,041 | ||
| \hskip0,5cm Tumor único | 3 | 13 | |
| \hskip0,5cm Tumores múltiples | 9 | 8 | |
| Tamaño del tumor (cm) | N.S. | ||
| \hskip0,5cm < 2,0 | 0 | 5 | |
| \hskip0,5cm 2,0 - 5,0 | 8 | 14 | |
| \hskip0,5cm >5,0 | 4 | 2 | |
| Estadio * | 0,006 | ||
| \hskip0,5cm I/II | 2 | 14 | |
| \hskip0,5cm IIIA/IVA | 10 | 7 | |
| Graduación histológica* | N.S. | ||
| \hskip0,5cm G1 | 0 | 2 | |
| \hskip0,5cm G2 | 9 | 17 | |
| \hskip0,5cm G3 | 3 | 2 | |
| Invasión venosa* | N.S. | ||
| \hskip0,5cm (-) | 7 | 18 | |
| \hskip0,5cm (+) | 5 | 3 | |
| Hígado no canceroso | N.S | ||
| \hskip0,5cm Cambio inespecífico | 1 | 1 | |
| \hskip0,5cm Hepatitis crónica | 2 | 10 | |
| \hskip0,5cm Cirrosis hepática | 9 | 10 | |
| *, Evaluación basada en la clasificación TNM de UICC | |||
| HBV: virus de la hepatitis B, HCV: virus de la hepatitis C, no B, no C = ni HBV ni HCV | |||
| Grupo A: recidiva temprana intrahepática (+) | |||
| Grupo B: recidiva temprana intrahepática (-) | |||
| N.S.: No significativo |
| T(x) | = | 0,053862x_{1} | + | 0,038848x_{2} | + | 0,030176x_{3} | + | 0,001824x_{4} | + | 0,096997x_{5} | + |
| 0,017259x_{6} | + | 0,015908x_{7} | + | 0,103081x_{8} | - | 0,0937746x_{9} | + | 0,024031x_{10} | - | ||
| 0,005417x_{11} | - | 0,119177x_{12} | - | 11,046007 | |||||||
| GB* | Descripción | ||||||||||
| x_{1} | M21574 | receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRA) | |||||||||
| x_{2} | M59465 | proteína A20 inducible por el factor alfa de necrosis tumoral | |||||||||
| x_{3} | U51240 | proteína multitransmembrana asociada a lisosomas (LAPTm5) | |||||||||
| x_{4} | X00274 | cadena pesada alfa de HLA-DR (antígeno de clase II) | |||||||||
| x_{5} | X75042 | proto-oncogén rel | |||||||||
| x_{6} | X82200 | Staf50 | |||||||||
| x_{7} | Y10032 | proteína quinasa de serina/treonina putativa | |||||||||
| x_{8} | L08895 | factor de transcripción de la familia MADS/MEF2 (MEF2C) | |||||||||
| x_{9} | AC000063 | clon LUCA19 de cósmidos humanos HUMLUCA19 procedente de 3p21.3 | |||||||||
| x_{10} | U59321 | proteína p72 con la caja DEAD | |||||||||
| x_{11} | Z19554 | vimentina | |||||||||
| x_{12} | D13639 | gen KIAK0002 | |||||||||
| GB*: Número de registro en el banco de genes |
Claims (9)
1. Un método in vitro para la predicción
de la recidiva del cáncer, que comprende las etapas de:
(a) estudiar los niveles o patrones de expresión
de dos o más genes y/o proteínas en las muestras preparadas
procedentes de tejidos cancerosos de pacientes, en el que dichos
genes y/o proteínas se seleccionan aplicando el criterio de Fisher
sobre la base de los niveles o patrones de expresión de genes y/o
proteínas de tejidos cancerosos de pacientes que presentan recidiva
y de pacientes que no presentan recidiva; y,
(b) predecir una recidiva del cáncer en los
pacientes comparando los niveles o patrones de expresión de los
genes y/o proteínas estudiados en la etapa (a) con los niveles o
patrones de expresión de los genes seleccionados mediante análisis
estadísticos sobre la base de los niveles o patrones de expresión de
genes y/o proteínas de tejidos cancerosos de pacientes que
presentan recidiva y de pacientes que no presentan recidiva.
2. El método in vitro según la
reivindicación 1,en el que el número de genes y/o proteínas
seleccionados mediante análisis estadísticos es 4 o más de 4.
3. El método in vitro según la
reivindicación 1, en el que el número de genes y/o proteínas
seleccionados mediante análisis estadísticos es 6 o más de 6.
4. El método in vitro según la
reivindicación 1, en el que el número de genes y/o proteínas
seleccionados mediante análisis estadísticos es 12 o más de 12.
5. El método in vitro según las
reivindicaciones de 1 a 4, en el que la recidiva del cáncer es una
recidiva temprana de cáncer intrahepático.
6. El método in vitro según las
reivindicaciones de 1 a 5, en el que los genes y/o proteínas que se
han de estudiar son los genes indicados con los números de registro
del banco de datos M21574, M59465, U51240, X00274, X75042, X82200,
Y10032, L08895, AC000063, U59321, Z19554 y D13639.
7. El método in vitro según las
reivindicaciones de 1 a 6, en el que la recidiva del cáncer es una
recidiva temprana de cáncer intrahepático y los genes y/o proteínas
que se han de estudiar son los genes indicados con los números de
registro del banco de datos M21574, M59465, U51240, X00274, X75042,
X82200, Y10032, L08895, AC000063, U59321, Z19554 y D13639.
8. El método in vitro según las
reivindicaciones 1-7, en el que los tejidos
cancerosos son tejidos cancerosos de hígado.
9. El método in vitro según las
reivindicaciones 1-8, en el que la expresión de
genes y/o proteínas de tejidos cancerosos humanos y la expresión de
genes y/o proteínas de tejidos cancerosos primarios humanos de
pacientes que presentan recidiva y de pacientes que no presentan
recidiva, se estudian por medio de micromatrices de DNA,
transcripción inversa seguida de reacción en cadena de la
polimerasa o matrices de proteínas.
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|---|---|---|---|
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