ES2253672T3

ES2253672T3 - Utilizacion de ciclopamina en el tratamiento de la soriasis y de otros transtornos de la piel.

Info

Publication number: ES2253672T3
Application number: ES03723620T
Authority: ES
Inventors: Sinan Tas; Oktay Avci
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-04-19
Filing date: 2003-03-17
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2023-03-17
Also published as: KR20070108287A; US7605167B2; EP1496895A1; US20080090790A1; CA2452152A1; US7893078B2; BR0309396A; US20090286822A1; US20080089915A1; CN101642458A; KR20040102117A; JP2006512281A; KR20080094739A; AU2003230541A1; US20040072913A1; KR20080096605A; AU2003230541B2; US8025893B2; US7629352B2; EP1411938B1

Abstract

Utilización de ciclopamina o de una sal farmacéuticamente aceptable o derivado de la misma, y un corticoesteroide, para la manufacturación de una composición farmacéutica para el tratamiento de lesiones de la piel asociadas con la alteración de la diferenciación de las células epidérmicas.

Description

Utilización de ciclopamina en el tratamiento de la soriasis y de otros trastornos de la piel.

Antecedentes de la invención

La diferenciación celular desempeña un papel crítico en la generación de los organismos multicelulares. En el ser humano, no sólo durante el desarrollo sino también durante la vida postnatal, las células de muchos tejidos experimentan diferenciación para generar nuevos tipos celulares que resultan necesarios para el funcionamiento correcto del organismo. Las señales para la diferenciación de un tipo celular en otro pueden derivarse de otros componentes celulares y no celulares del tejido en el ambiente inmediatamente circundante y/o de otros tejidos y órganos distantes (por ejemplo en la forma de hormonas). La determinación de las respuestas de una célula a las señales entrantes también es compleja y depende de la naturaleza de la señal o conjunto de señales, así como de las características más intrínsecas de la célula en cuestión (por ejemplo de su estado de diferenciación y de la estructura de la cromatina). Durante la vida diaria de un ser humano, se pierden numerosas células por diversos mecanismos (debido a traumas y lesiones agudos y crónicos, y como resultado de la muerte celular programada debida a otros motivos). Estas células perdidas en general se sustituyen mediante la proliferación y diferenciación reguladas de sus precursores, las células progenitoras y células madre. La piel humana presenta una susceptibilidad relativamente mayor a los traumas ambientales (por ejemplo a traumatismos físicos) que muchos tejidos internos, pero se encuentra bien adaptada a las circunstancias y muestra una pérdida y sustitución constantes de la capa más externa. Las células muertas que se desprenden de la capa más externa de la epidermis normalmente resultan sustituidas por la proliferación de las células de la capa basal de la epidermis y por la diferenciación de estas células, produciendo las capas suprabasales. Las anormalidades en este proceso de diferenciación, debido a motivos ambientales y/o genéticos, resulta en diversas enfermedades cuyas manifestaciones en la piel en general se detectan fácilmente. Las enfermedades de la piel que implican trastornos de diferenciación de las células de la piel no epidérmicas también son variadas. Las diferencias en las causas subyacentes de estas enfermedades resulta en las diferentes manifestaciones y presentaciones clínicas, pero las anormalidades de la diferenciación celular son una característica unificadora de todas ellas. Entre los ejemplos no limitativos de enfermedades de la piel que es conocido que se manifiestan en anormalidades de la diferenciación celular se incluyen la ictiosis vulgar, la ictiosis lamelar, los queratodermas palmoplantares, la pitiriasis rubra pilaris, la enfermedad de Darier y varios tipos de tumores de la piel. Las causas de estas enfermedades de la piel en general no se entienden claramente. Sin embargo, la complejidad de la regulación de la diferenciación celular y la presencia de múltiples factores reguladores implica que las anormalidades de diferenciación en ocasiones pueden ser secundarios a las anormalidades que afectan principalmente a otros procesos. En ausencia de una comprensión clara de las causas y mecanismos, en general las estrategias de tratamiento disponibles para esta enfermedad resultan poco efectivas (Braun-Falco, O. et al. (2000) Dermatology, 2a. ed. Springer-Verlag, Berlin).

La ciclopamina es un alcaloide esteroideo que se encuentra naturalmente en las plantas del género Veratrum. La teratogenicidad de estas plantas sobre animales herbívoros en estado de gestación llevó a la identificación de la ciclopamina como compuesto activo (Keeler, R.F. (1969) Phytochemistry 8:223-225). El mecanismo por el cual la ciclopamina mostraba su teratogenicidad se identificó a partir del descubrimiento de que es un inhibidor de la ruta de transducción de señales hedgehog/smoothened (Incardona J.P. et al. (1988) Development 125:3553-3562; Cooper M.K. et al. (1998) Science 280:1603-1607). La proteína sonic hedgehog se ha descubierto que induce la diferenciación de precursores de las células ventrales en el sistema nervioso central en desarrollo (Goodrich L.V. et al. (1998) Neuron 21:1243-1257). WO 0041545, WO 9952534 y WO 0074706 se refieren a la ciclopamina como inhibidor de la ruta hedgehog, y se menciona la soriasis entre las enfermedades que pueden tratarse mediante inhibidores de este tipo. De este modo, la inhibición de la ruta hedgehog/smoothened de señalización por parte de la ciclopamina en el cerebro de pollo en desarrollo se relacionó con la prevención de la formación de células ventrales y, por lo tanto, con la holopresencefalia (Incardona J.P. et al. (1998) Development 125:3553-3562; Cooper M.K. et al. (1998) Science 280:1603-1607). Es conocido que la holopresenceflia es la malformación más común en los corderos de las ovejas que se alimentan de Veratrum (Binns W. et al. (1963) Am J. Vet. Res. 24:1164-1175). Se ha dado a conocer que la ciclopamina también inhibe la diferenciación celular en otros sistemas, incluyendo la diferenciación de las células de médula ósea para formar células eritroides (Detmer K. et al. (2000) Dev. Biol. 222:242) y la diferenciación del seno urogenital para formar la próstata (Berman D.M. et al. (2000) J. Urol. 163:204).

De manera imprevista y contrariamente a las enseñanzas resumidas anteriormente de la técnica anterior de que la ciclopamina actúa inhibiendo la diferenciación celular (Incardona J.P. et al. (1988) Development 125:3553-3562; Cooper M.K. et al. (1998) Science 280:1603-1607; Detmer K. et al. (2000) Dev. Biol. 222:242; Berman D.M. et al. (2000) J. Urol. 163:204), los solicitantes han descubierto que la ciclopamina induce la diferenciación de las células de carcinoma de las células basales que aparentemente habían detenido su diferenciación (Tas S. et al. (2001) PCT/TR01/00027, WO 02/078703). De manera similar, la ciclopamina permite que las células epidérmicas de la epidermis lesionada por soriaris reinicien su diferenciación normal (Tas S. et al. (2002) PCT/TR02/00017, WO 02/078704). Nuevamente de manera inesperada a partir de las informaciones anteriores de que la ciclopamina no tiene efectos adversos sobre la viabilidad de las células transformadas (Talpale J. et al. (2000) Nature 406:1005-1009), la diferenciación inducida por la ciclopamina de las células de carcinoma de las células basales se vio acompañada de una apoptosis masiva de estas células (Tas S. et al. (2001) PCT/TR01/00027, WO 02/078703).

Sumario de la invención

La ciclopamina es efectiva en la provocación de la diferenciación de células tumorales y en la apoptosis no sólo de los carcinomas de células basales sino también de otros tumores de la piel. Los tumores que se originan en el folículo piloso/linaje celular epidérmico (por ejemplo el tricoepitelioma) y en los melanocitos (por ejemplo los nevus melanocíticos) desaparecieron rápidamente bajo el tratamiento con ciclopamina. La eliminación inducida por ciclopamina de lesiones soriáticas de la piel de los pacientes con soriasis también se asoció con la inducción de la diferenciación celular en la epidermis lesionada. Los solicitantes dan a conocer que la efectividad de la ciclopamina en el tratamiento de la soriasis se incrementa adicionalmente en un grado significativo mediante la utilización de las composiciones terapéuticas que comprenden ciclopamina y un corticoesteroide y/o mediante el pretratamiento de las lesiones con un corticoesteroide.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1A muestra la apariencia de una lesión soriática (\sim7x8 mm) en la región antecubital de un hombre de
29 años de edad previamente al tratamiento.

La Fig. 1B muestra la misma lesión de la Fig. 1B después del tratamiento con la crema de ciclopamina durante
24 horas y del seguimiento sin tratamiento durante 44 horas (hora 68 desde el inicio del tratamiento).

La Fig. 1C muestra una lesión soriática (\sim9x11 mm) en la región deltoide de un hombre de 29 años de edad previamente al tratamiento.

La Fig. 1D muestra la misma lesión de la Fig. 1C en la hora 68 de tratamiento con una crema premezclada conteniendo volúmenes iguales de crema de ciclopamina y de una preparación de crema de 17-propionato de clobetasol (0,5 mg/g).

La Fig. 1E muestra una lesión soriática (\sim11x12 mm) en la región hipocondrial de un hombre de 29 años de edad tras 48 horas de tratamiento con una preparación de crema de 17-propionato de clobetasol (0,5 mg/g).

La Fig. 1F muestra la misma lesión de la Fig. 1E en la hora 24 de cambiar el tratamiento de 17-propionato de clobetasol (0,5 mg/g) a la crema de ciclopamina.

La Fig. 1G muestra el tejido de la piel no lesionado mediante detección inmunohistoquímica EGFR . Se observa que las células que muestra el EGFR en la epidermis se encuentran restringidas a la capa basal. Magnificación original 200X.

La Fig. 1H muestra tejido lesionado de piel soriática sin tratar mediante detección inmunohistoquímica de EGFR. Se observa que las células suprabasales en la epidermis lesionada muestran una expresión notablemente incrementada de EGFR. Magnificación original 200X.

La Fig. 1I muestra tejido lesionado de piel soriática que ha sido tratado con crema de ciclopamina durante 24 horas antes de la extirpación y que después se ha teñido inmunohistoquímicamente para EGFR. Se observa que las células de la epidermis que muestra el EGFR están restringidas a la capa basal. Magnificación original 200X.

La Fig. 2A muestra un tricoepitelioma y un nevus cercano en la mejilla de un hombre de 82 años de edad previamente al tratamiento.

La Fig. 2B muestra la misma región de la piel de la Fig. 2A tras 24 horas de tratamiento con ciclopamina.

La Fig. 2C muestra una sección de la región de piel extirpada mostrada en la Fig. 2B con células tumorales residuales. H&E, magnificación original 400X.

La Fig. 2D muestra otra área del mismo tejido de la Fig. 2C. Además de las numerosas células apoptóticas y la formación de estructuras quísticas debido a su eliminación, se observa que el tumor se encuentra infiltrado por células mononucleares. H&E magnificación original 400X.

La Fig. 3A muestra un BCC pigmentado en el párpado inferior de un hombre de 59 años de edad previamente al tratamiento.

La Fig. 3B muestra el mismo BCC de la Fig. 3A en el tercer día de tratamiento con ciclopamina.

La Fig. 3C muestra una sección de la región tratada del BCC mostrada en la Fig. 3B. H&E, magnificación original 400X.

La Fig. 3D muestra una vista ampliada de un área de células tumorales residuales en una sección de la región tratada del BCC mostrada en la Fig. 3B. H&E, magnificación original 400X.

La Fig. 3E muestra una sección de un material de biopsia con aguja obtenido del BCC mostrado en la Fig. 3A previamente al tratamiento. H&E, magnificación original 400X.

La Fig. 3F muestra una sección que contiene parte del nódulo del BCC señalado por la flecha en la Fig. 3A. Se extirpó el tejido tras 3 días de tratamiento y tras 6 días de seguimiento sin tratamiento. H&E, magnificación original 400X.

Impresiones fotográficas en color

Las impresiones fotográficas en color de las figuras de las páginas 14, 15 (Fig. 1A, Fig. 1B, Fig. 1C, Fig. 1D, Fig. 1E, Fig. 1F, Fig. 1G, Fig. 1H, Fig. 1I, Fig. 2A, Fig. 2B, Fig. 2C, Fig. 2D, Fig. 3A, Fig. 3B, Fig. 3C, Fig. 3D, Fig. 3E y Fig. 3F) se añaden como páginas 14a, 15a debido a que los datos y resultados inmunohistoquímicos, debido a su naturaleza, pueden transmitirse mejor en color que en escala de grises; respetuosamente solicitamos la consideración de este hecho a la autoridad de patentes y que se mantengan las páginas como parte de esta solicitud de patente. Sin embargo, las páginas 14a, 15a pueden retirarse de la solicitud de patente si la autoridad de patentes lo considera necesario.

Descripción detallada de la invención

Los solicitantes dan a conocer que la ciclopamina es efectiva en la inducción de la diferenciación de varios tipos celulares y que esta inducción de diferenciación puede obtenerse con suficiente selectividad in vivo (sin efectos adversos indebidos) bajo las condiciones que se dan a conocer, de modo que puede conseguirse una buena efectividad terapéutica en varias enfermedades que tienen la característica unificadora de estar asociadas con la inhibición de la diferenciación celular. Se da a conocer que en tumores (tumores tanto malignos como benignos), la inducción de la diferenciación de células tumorales por la ciclopamina está asociada comúnmente con la apoptosis (muerte programada) de las células tumorales, añadiéndose de esta manera a la efectividad terapéutica antitumoral de la ciclopamina. La efectividad terapéutica sin precedentes de la ciclopamina en la soriasis (dada a conocer anteriormente en PCT/TR02/00017, WO 02/078704) se incrementa todavía más mediante la utilización de composiciones terapéuticas que comprenden ciclopamina y un corticoesteroide en un portador farmacéutico adecuado.

La ciclopamina puede disolverse en etanol o en otro disolvente adecuado y puede mezclarse con un portador farmacéutico adecuado dependiendo del modo de aplicación deseado. Para las aplicaciones tópicas, la ciclopamina puede disolverse en etanol o en otro disolvente adecuado y puede ser mezclada con una crema base, pomada o gel adecuados. La ciclopamina también puede encapsularse en hidrogeles o en otras formas farmacéuticas que permitan la liberación controlada y puede adsorberse sobre parches dérmicos. Los efectos mostrados en las figuras Fig. 1A a Fig. 1I y Fig. 2A a Fig. 2D y Fig. 3A a Fig. 3F se han obtenido mediante preparaciones de crema obtenidas mezclando una solución de ciclopamina en etanol con una crema base de modo que se obtienen las concentraciones finales indicadas de ciclopamina. La crema base utilizada se prepara principalmente a partir de aceite pesado de parafina (10% p/p), vaselina (10% p/p), alcohol estearílico (8% p/p), polioxilesteareth-40 (3% p/p) y agua (68% p/p), aunque también resulta posible utilizar otra crema base adecuadamente formulada. Las similitudes entre las características de solubilidad en lípidos y en agua y las estructuras moleculares de la ciclopamina y de los corticoesteroides (siendo ambas moléculas esteroideas) facilita su mezcla en el mismo portador farmacéutico. Las concentraciones óptimas de ciclopamina y de un corticoesteroide en una forma farmacéutica, así como la dosificación y programas de aplicación óptimos evidentemente pueden resultar afectados por factores tales como la forma farmacéutica particular, el corticoesteroide particular, y la localización y características de las lesiones a tratar; sin embargo, estos factores pueden determinarse a partir de procedimientos publicados y bien conocidos de optimización. El corticoesteroide utilizado para obtener los efectos mostrados en las figuras Fig. 1C y Fig. 1D era el 17-propionato de clobetasol a una concentración final
de \sim0,55 mmM en la crema base (la concentración de ciclopamina en la misma crema fue de \sim9 mM). El corticoesteroide utilizado para el pretratamiento de la lesión mostrada en la Fig. 1E fue 17-propionato de clobetasol a una concentración final de \sim1,1 mM en la crema base. Se obtuvieron actividades corticoesteroides similares mediante la sustitución del 17-propionato de clobetasol en esta crema con \sim50 mM de hidrocortisona. También se contempla que otras moléculas de corticoesteroide bien conocidas en la técnica también resulten adecuadas y capaces de sustituir las moléculas de corticoesteroide anteriormente indicadas a concentraciones adecuadas (los intervalos de concentración adecuados para un corticoesteroide dado también son conocidas en la técnica).

La Fig. 1A muestra una placa soriática en la región antecubital de un hombre de 29 años de edad previamente al tratamiento. Se aplicaron aproximadamente 20 \mul de la crema de ciclopamina (ciclopamina 18 mM en la crema base indicada anteriormente) sobre esta lesión cada cuatro horas durante 24 horas. A continuación se interrumpió el tratamiento y se realizó el seguimiento de la lesión. La lesión mostró una reducción del eritema transcurridas ocho horas desde el inicio del tratamiento y posteriormente una regresión continua, también durante el seguimiento sin tratamiento, hasta alcanzar el estado mostrado en la Fig. 1B al tercer día, siendo indetectable al cuarto día.

La Fig. 1C muestra otra placa soriática localizada en la región deltoide de la piel del mismo paciente previamente al tratamiento. Se aplicaron aproximadamente 20 \mul de una preparación de crema que contenía ciclopamina \sim9 mM y 17-propionato de clobetasol \sim0,55 mM (en la crema base) sobre esta lesión cada cuatro horas. Esta lesión también mostró una reducción del eritema transcurridas ocho horas, siendo indetectable al tercer día (la Fig. 1D muestra su apariencia en la hora 68). En el mismo paciente otras lesiones soriáticas que se cubrieron con una preparación de crema que contenía 17-propionato de clobetasol \sim1,1 mM (pero nada de ciclopamina) cada cuatro horas o cada ocho horas no mostraron cambios detectables durante el mismo periodo (es decir, las lesiones persistían al tercer día). La respuesta terapéutica mejorada a la ciclopamina, incluso a la mitad de la concentración utilizada en otras lesiones del mismo paciente, estimuló una evaluación adicional de las composiciones terapéuticas que comprenden ciclopamina y un corticoesteroide. Los solicitantes evaluaron además el pretratamiento de las lesiones soriáticas con un corticoesteroide tópico, seguido del tratamiento con la crema de ciclopamina (ciclopamina 18 mM en la crema base). La Fig. 1E muestra una placa soriática en la región hipocondrial del mismo paciente previamente a las aplicaciones de ciclopamina. Esta lesión se trató con la crema de corticoesteroide sola durante 48 horas, seguidamente se interrumpió la administración de corticoesteroide y el tratamiento se sustituyó por aplicaciones de \sim20 \mul de crema de ciclopamina (ciclopamina 18 mM en la crema base) cada cuatro horas. La Fig. 1F muestra la lesión a las 24 horas de las aplicaciones de crema de ciclopamina y muestra la casi completa desaparición de la lesión llegado
este tiempo.

La severidad de las lesiones soriáticas puede evaluarse en una escala semicuantitativa proporcionando puntuaciones separadas para eritema, elevación y escamación de una lesión, y después sumando las puntuaciones para obtener un índice denominado EES de dicha lesión (Bowman P.H. et al. (2002) J. Am. Acad. Dermatol. 46:907-913). La Tabla I muestra las comparaciones entre las respuestas terapéuticas obtenidas con diversas formas de tratamiento, evaluadas mediante el índice EES. Se observa que la utilización de una composición farmacéutica que comprende ciclopamina y un corticoesteroide en el tratamiento de lesiones soriáticas mejora la efectividad terapéutica significativamente en comparación con la utilización de una composición que únicamente contiene ciclopamina como ingrediente activo. El pretratamiento de las lesiones con corticoesteroide durante un día, seguido del tratamiento con la crema de ciclopamina (ciclopamina 18 mM en la crema base) mejora la efectividad terapéutica de manera similar. La Tabla I muestra que las lesiones soriáticas tratadas durante un día con una composición que contiene ciclopamina y de la que después se realizó un seguimiento sin ningún tratamiento, también retrocedieron, aunque en general a un ritmo relativamente más lento. Aunque esta última propiedad podría resultar de alguna utilidad en la práctica clínica, es previsible que la mayoría de pacientes prefieran la eliminación más rápida de sus lesiones.

La crema de ciclopamina sola provocó la regresión y eliminación de las lesiones soriáticas a ritmos mucho más rápidos que los obtenidos mediante los tratamientos convencionales, tal como se ha descrito anteriormente (PCT/TR 02/00017, WO 02/078704) y en la presente memoria. Sin embargo, resulta posible una mejora adicional de la respuesta terapéutica cuando se utiliza la ciclopamina conjuntamente con corticoesteroides, o tras un breve pretratamiento con los mismos. Esta propiedad incrementa la utilidad clínica del tratamiento con ciclopamina y puede relacionarse en parte con los efectos antiinflamatorios de los corticoesteroides. Se ha establecido en numerosos estudios la contribución de las células inflamatorias y citoquinas al desarrollo de las lesiones soriáticas (Krueger J.G. et al. (1990) J. Invest. Dermatol. 94:135S-140S). Las expresiones de tanto el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) como de uno o más de sus ligandos (por ejemplo el factor de crecimiento transformante alfa) es conocido que se encuentran a niveles notablemente incrementados en la epidermis soriática lesionada. Éstos podrían establecer un bucle de estimulación autocrina, a la que contribuiría adicionalmente la inducción de un incremento del EGFR epidérmico por la inflamación (Krueger J.G. et al. (1990) J. Invest. Dermatol. 94:135S-140S). Sin embargo, la inesperadamente rápida respuesta terapéutica a la crema de ciclopamina sola (pero no al corticoesteroide solo) y, en efecto, la regresión continua de las lesiones soriáticas tras la interrupción de las aplicaciones de ciclopamina, son consistentes con la intervención efectiva con ciclopamina (pero no con corticoesteroides) en los sucesos patogénicos proximales/clave. Debido a que la sobreexpresión del EGFR en las capas suprabasales de la epidermis soriática lesionada podría establecer un bucle de estimulación autocrina y debido a que el retorno de la expresión del EGFR a la capa basal de la epidermis se considera uno de los primeros indicios de la efectividad del tratamiento de la soriasis según diversas modalidades (King L.E. Jr et al. (1990) J. Invest. Dermatol. 95:10S-12S), se evaluó la respuesta del patrón de expresión del EGFR al tratamiento con ciclopamina. Con este fin, se utilizó el anticuerpo monoclonal de ratón EGFR.113 (Novocastra Labs. Ltd. Reino Unido) contra el EGFR humano como anticuerpo primario y se llevó a cabo el ensayo inmunohistoquímico según recomendación del fabricante. La Fig. 1I muestra que la aplicación de crema de ciclopamina sobre lesiones soriáticas provoca la rápida normalización del patrón de expresión del EGFR y que el EGFR detectado inmunohistoquímicamente nuevamente queda restringido en su mayor parte a la capa basal de la epidermis transcurridas
24 horas de tratamiento (Fig. 1I). El patrón de expresión del EGFR tras el tratamiento con ciclopamina de la lesión (Fig. 1I) era indistinguible del observado en la piel no lesionada (Fig. 1G). Por otra parte, la piel con lesiones soriáticas tratada con la crema de placebo (es decir, la crema base sin ciclopamina), continuó mostrando en marcado contraste el patrón patológico y la sobreexpresión del EGFR en las capas suprabasales de la epidermis (Fig. 1H). De este modo, el tratamiento con ciclopamina tuvo un efecto terapéutico rápido sobre las lesiones soriáticas, también según el criterio de la expresión del EGFR (King L.E. Jr et al. (1990) J. Invest. Dermatol. 95:10S-12S).

La inducción de la diferenciación de las células del carcinoma de las células basales por la ciclopamina se ha descubierto que se encuentra asociada con su apoptosis (muerte programada) (PCT/TR01/00027, WO 02/078703). Las figuras Fig. 2A a Fig. 2D muestran que estos efectos de la ciclopamina no se encuentran restringidos a los carcinomas de las células basales. El tricoepitelioma es un tumor asociado con cambios genéticos que provocan una señalización incrementada de la ruta hedgehog-smoothened (Vorechovsky I et al. (1997) Cancer Res. 57:4677-4681; Nilsson M. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3438-3443). La Fig. 2A muestra un tricoepitelioma en la mejilla de un hombre de 82 años de dad previamente al tratamiento, y la Fig. 2B muestra la misma área de piel tras sólo 24 horas de exposición a la crema de ciclopamina (ciclopamina 18 mM en la crema base; se aplicaron \sim25 \mul de crema cada tres horas directamente sobre el tumor). Debido a la rápida regresión, se interrumpió el tratamiento a las 24 horas y el área entera de piel correspondiente al tumor original se extirpó para su investigación. Las Fig. 2C y Fig. 2D muestran la región de tejido que contenía células tumorales residuales transcurridas 24 horas y revelan una notable actividad apoptótica entre estas células tumorales residuales. Se observa el espacio quístico resultante de la eliminación apoptótica de las células tumorales (Fig. 2C y Fig. 2D), así como la infiltración de células mononucleares en el tumor (Fig. 2D). Otro resultado que cabe mencionar en este paciente es el tamaño y pigmentación reducidos de un lunar situado cerca del tumor tratado transcurridas 24 horas de tratamiento (Fig. 2B en comparación con Fig. 2A). Debido a que la ciclopamina podría haberse difundido desde el área contigua de aplicación, el lunar (un tumor melanocítico benigno) aparentemente es sensible a concentraciones relativamente bajas de ciclopamina. En efecto, el tratamiento de los nevus melanocíticos con la crema de ciclopamina (ciclopamina 18 mM en la crema base) en otro voluntario también provocó una despigmentación similarmente rápida y la desaparición de los nevus (datos
no mostrados).

La Fig. 3A muestra un carcinoma pigmentado de células basales (BCC) en el párpado inferior de un hombre de
59 años de edad previamente al tratamiento. La crema de ciclopamina (ciclopamina 18 mM en la crema base) se aplicó en este paciente sobre todos los nódulos excepto sobre uno, señalado con una flecha. Este nódulo, que podría haber recibido ciclopamina únicamente por difusión desde una región contigua tratada, estaría expuesto a una concentración relativamente más baja de ciclopamina. Debido a que la naturaleza pigmentada de este tumor facilitaba el seguimiento clínico, se interrumpió el tratamiento (la aplicación de \sim20 \mul de crema de ciclopamina cada cuatro horas) al tercer día, cuando el tumor en la región tratada había revertido en gran parte pero todavía contenía partes visibles (Fig. 3B). A continuación, se realizó un seguimiento del tumor sin tratamiento para el estudio de los posibles efectos tardíos. No se observó ninguna regresión clínica adicional clara en ausencia de tratamiento y el área de piel correspondiente al tumor original se extirpó al sexto día de seguimiento (el noveno día desde el inicio del tratamiento). Las secciones teñidas con hematoxilina-eosina de la región tratada del tumor revelaron muchos espacios quísticos que carecían de células tumorales (Fig. 3C). La ausencia de un epitelio que recubriese estos quistes (Fig. 3C) es consistente con que estos quistes representan las áreas de tejido que anteriormente se encontraban ocupadas por las células tumorales. En este punto del tiempo (el sexto día de seguimiento sin tratamiento), las secciones de tejido mostraban una relativa escasez de células apoptóticas (Fig. 3C), consistente con la conocida rapidez de la desaparición de las células en apoptosis en los tejidos vivos. Por otra parte, las células tumorales residuales, particularmente cerca de los bordes de los quistes, mostraban frecuencias notablemente elevadas de células con características de diferenciación en células espinosas (por ejemplo el área hacia el extremo inferior izquierdo de la Fig. 3C; que se observa más claramente a magnificación más alta, tal como se ejemplifica mediante otra área en la Fig. 3D). No se observaron áreas similares de diferenciación o de quistes en el material de biopsia con aguja obtenido del mismo tumor previamente al inicio del tratamiento (Fig. 3E). El nódulo tumoral que recibió una concentración relativamente más baja de ciclopamina (señalado con la flecha en la
Fig. 3A) tenía un gran centro quístico al sexto día de seguimiento (Fig. 3F). La periferia residual del nódulo, sin embargo, continuaba teniendo células con típica morfología de BCC, aunque la frecuencia de las células con características de diferenciación (por ejemplo con un citoplasma agrandado y más eosinofílico) nuevamente se encontraba incrementado y se detectaron quistes más pequeños dentro de esta periferia (Fig. 3F). De este modo, aunque la respuesta del tumor a concentraciones óptimas de ciclopamina era relativamente rápida, la exposición a concentraciones subóptimas permitía que persistiesen células tumorales durante el periodo de seguimiento.

Dichos ejemplos ilustran adicionalmente la efectividad del tratamiento descrito en la inducción de la diferenciación y la apoptosis de las células tumorales y en la obtención de una rápida regresión clínica de los tumores que muestran señalización incrementada de la ruta hedgehog-smoothened. La efectividad sobre varios tumores independientes en pacientes no relacionados con diferentes genotipos es consistente con la utilidad general del tratamiento descrito. El tratamiento con ciclopamina bajo las condiciones descritas no ha revelado la existencia de efectos adversos indebidos en los componentes del tejido normal (incluyendo las células madre putativas) según los criterios histológicos/inmunohistoquímicos, tal como los solicitantes asimismo han dado a conocer anteriormente (PCT/TR01/00027, WO 02/078704). Además, los sitios de la piel anteriormente indicados en los que se había aplicado ciclopamina y que habían sido sometidos a seguimiento durante más de 2 años en el momento de la presente solicitud continuaban mostrando una apariencia normal de la piel y el pelo, sugiriendo que las células madre se habían conservado funcionalmente y que el tratamiento es seguro a largo plazo.

La mayoría de los efectos biológicos y terapéuticos de la ciclopamina que se han dado a conocer en la presente memoria y en la técnica anterior (WO 02/078703, WO 02/078704) tienen una característica unificadora en el aspecto de que están relacionadas con las causas de la diferenciación celular. Por lo tanto, se contempla específicamente que puedan derivarse otras moléculas a partir de la ciclopamina o sintetizarse de tal modo que ejerzan propiedades similares de unión a receptores y efectos biológicos y terapéuticos iguales a los de la ciclopamina. Estas moléculas se denominan en la presente memoria "derivados de ciclopamina". El término "derivados de ciclopamina", tal como se utiliza en la presente memoria, se define de la manera siguiente:

Una molécula que contiene la región de la molécula de ciclopamina implicada en la unión de la ciclopamina a su objetivo biológico pero que además contiene modificaciones de la molécula parental de la ciclopamina de modo que la nueva molécula derivada continúa siendo capaz de unirse específicamente al mismo objetivo biológico (es decir, la proteína smoothened), ejerciendo los efectos biológicos de la ciclopamina dados a conocer en esta invención y en WO 02/078703 y WO 02/078704. Estas modificaciones de la ciclopamina pueden incluir una o más sustituciones o deleciones permisibles de un grupo molecular en la molécula de ciclopamina o con adición de un grupo molecular (particularmente un grupo molecular pequeño, tal como el grupo metilo) a la molécula de ciclopamina, con la condición de que la molécula resultante sea estable y posea la capacidad de unión específica al mismo objetivo biológico que la ciclopamina, ejerciendo los efectos biológicos de la ciclopamina dados a conocer en la presente invención y en WO 02/078703 y WO 02/078704. Los expertos en la materia pueden conseguir fácilmente la derivación de dichas nuevas moléculas a partir de la ciclopamina y también pueden determinar fácilmente la persistencia o anulación de los efectos biológicos de la ciclopamina en la molécula nuevamente derivada, por ejemplo mediante el análisis de los efectos biológicos dados a conocer en la presente solicitud y en WO 02/078703 y
WO 02/078704.

TABLA I Evaluación semicuantitativa de las respuestas de lesiones soriáticas a diferentes tipos de tratamiento

		Valores EES* de lesiones soriáticas antes y
		en el día 4 de tratamiento (media \pm S.D.)
	Número de lesiones
Tratamiento	puntuadas	Pre-tratamiento	Día 4
Crema base	5	6,6 \pm 1,0	6,0 \pm 0,6
Crema de ciclopamina	4	6,5 \pm 0,4	0,4 \pm 0,2
Crema (Ciclopamina + CS)	5	6,7 \pm 0,9	0 \pm 0
Crema de ciclopamina, sólo 1 día	6	6,8 \pm 1,7	0,9 \pm 0,3
Crema (Ciclopamina + CS), sólo 1 día	7	6,7 \pm 1,3	0,4 \pm 0,3

* \begin{minipage}[t]{155mm}Suma de las puntuaciones de eritema, elevación y escamación (cada una en una escala de 0 a 4 con incrementos de 0,5, tal como describen Bowman P.H. et al. (2002) J. Am. Acad. Dermatol. 46:907-913). En los tratamientos de "sólo 1 día", el tratamiento con ciclopamina se continuó durante únicamente 1 día. A continuación, se realizó un seguimiento de las lesiones sin tratamiento y se determinaron los valores EES. Se muestra el número de lesiones registrado en cada categoría de tratamiento. Las puntuaciones de las lesiones extirpadas antes del día 4 para los análisis histopatológicos/inmunohistoquímicos no se incluyen en esta evaluación ni en los cálculos. La crema (ciclopamina + CS) se refiere al tratamiento con una preparación de crema que contiene ciclopamina \sim9 mM y 17-propionato de clobetasol \sim0,55 mM o al tratamiento con una preparación de crema que contiene ciclopamina \sim18 mM tras un día de pretratamiento con una preparación de crema que contiene 17-propionato de clobetasol \sim1,1 mM. Los resultados de estos dos tipos de tratamiento fueron similares y por lo tanto se calcularon como un único grupo. \end{minipage}

Claims

1. Utilización de ciclopamina o de una sal farmacéuticamente aceptable o derivado de la misma, y un corticoesteroide, para la manufacturación de una composición farmacéutica para el tratamiento de lesiones de la piel asociadas con la alteración de la diferenciación de las células epidérmicas.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el corticoesteroide es 17-propionato de clobetasol o hidrocor-
tisona.

3. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que las lesiones de la piel son soriáticas.

4. Composición farmacéutica que comprende ciclopamina o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado de la misma, y un corticoesteroide.

5. Composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el corticoesteroide es 17-propionato de clobetasol o hidrocortisona.

6. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, en la que la composición se encuentra en la forma de una crema, pomada, gel, hidrogel o forma farmacéutica que permite la liberación controlada, o en solución en etanol o en otro disolvente adecuado, o se encuentra adsorbida sobre un parche dérmico.

7. Composición farmacéutica según la reivindicación 4, que comprende ciclopamina o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado de la misma, a una concentración comprendida entre 10 mM y 20 mM, y 17-propionato de clobetasol a una concentración comprendida entre 0,5 mg/g y 1,0 mg/g, o hidrocortisona a una concentración comprendida entre 10 mM y 50 mM.

8. Utilización de ciclopamina o de una sal farmacéuticamente aceptable o derivado de la misma, para la manufacturación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos de la piel, estando asociados con la alteración de la diferenciación celular, seleccionados de entre el grupo que consiste en tumores melanocíticos, ictiosis vulgar, ictiosis lamelar, queratodermas palmoplantares, pitiriasis rubra pilaris y enfermedad de Darier.

9. Utilización según la reivindicación 8, en la que el tumor melanocítico es un nevus.

10. Utilización de ciclopamina o de una sal farmacéuticamente aceptable o derivado de la misma, para la manufacturación de una composición farmacéutica para la aplicación en pacientes que tienen trastornos de la piel asociados con la pigmentación incrementada.