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ES2253551T3 - Metodo de deteccion de la hibridacion de acidos nucleicos. - Google Patents

Metodo de deteccion de la hibridacion de acidos nucleicos.

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ES2253551T3
ES2253551T3 ES02758903T ES02758903T ES2253551T3 ES 2253551 T3 ES2253551 T3 ES 2253551T3 ES 02758903 T ES02758903 T ES 02758903T ES 02758903 T ES02758903 T ES 02758903T ES 2253551 T3 ES2253551 T3 ES 2253551T3
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ES
Spain
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nucleic acid
methyl
electrode
probe
baselineskip
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES02758903T
Other languages
English (en)
Inventor
Jong-Hoon Hahn
Nokyoung Park
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pohang University of Science and Technology Foundation
Posco Holdings Inc
Original Assignee
Posco Co Ltd
Pohang University of Science and Technology Foundation
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Filing date
Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
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Abstract

Método electroquímico para detectar la hibridación entre un ácido nucleico fijado sobre una superficie de electrodo (sonda de captación) y un ácido nucleico complementario a éste que se deriva de una muestra mediante una neutralización eléctrica de un ácido nucleico de doble cadena o un ácido nucleico de cadena única con un material de unión a ácidos nucleicos, en el que el método de detección comprende: (a) fijar la sonda de captación sobre una superficie de electrodo para obtener una capa de ácido nucleico; (b) poner en contacto la sonda de captación fijada sobre la superficie de electrodo con el ácido nucleico derivado de una muestra para inducir la hibridación; (c) hacer reaccionar simultanea o secuencialmente una sonda de captación hibridada o no hibridada con un tensioactivo y un material de unión a ácidos nucleicos, en el que el material de unión a ácidos nucleicos tiene carga positiva, para cambiar una cantidad de carga o estado de carga de la sonda de captación hibridada o no hibridada mediante la unión a éste; y (d) monitorizar una corriente eléctrica o cantidad de carga de la superficie de electrodo en una disolución de electrolito electroactivo para determinar si la sonda de captación se hibrida o no.

Description

Método de detección de la hibridación de ácidos nucleicos.
Antecedentes de la invención (a) Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método de detección de la hibridación de ácidos nucleicos, y más particularmente a un método de detección electroquímico de cambio del estado de carga de un ácido nucleico utilizando un material de unión a ácidos nucleicos específico para ácido nucleico de cadena única o para un ácido nucleico de doble cadena.
(b) Descripción de la técnica relacionada
La detección de la hibridación de ácidos nucleicos es la técnica más importante en el campo de chips de ácidos nucleicos. El método de detección general es un método de espectroscopia de fluorescencia inducida por láser, que detecta una luz estimulada mediante la irradiación con un láser de un ácido nucleico marcado con fluorescencia.
Affymetrix y Nanogen ofrecen chips de ADN que se han probado basándose en el método de espectroscopia de fluorescencia inducida por láser. Sin embargo, surgen varios problemas: (a) resulta complicado marcar ácidos nucleicos con moléculas fluorescentes; (b) el procedimiento es complejo; y (c) las moléculas fluorescentes son caras.
Recientemente se han estudiado métodos de detección de hibridación de ácidos nucleicos sin el uso de fluorescencia, y se han desarrollado métodos que utilizan resonancia de plasmón superficial, microbalanza de cristal de cuarzo, espectrometría de masas, y electroquímica.
Sin embargo, excepto por el método electroquímico, estos métodos todavía tienen problemas tales como costes elevados y procedimientos laboriosos, mientras que el método que utiliza la electroquímica es simple, de modo que todo el mundo puede llevarlo a cabo sin conocimiento profesional y la mayor parte del equipo utilizado puede encontrarse a bajo precio.
Sumario de la invención
Es un objeto de la presente invención proporcionar un método electroquímico para la detección de la hibridación de ácidos nucleicos.
Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método de detección de la hibridación de ácidos nucleicos que pueda emplearse de manera simple y con bajo coste.
Con el fin de alcanzar estos objetos, esta invención proporciona un método de detección de la hibridación de ácidos nucleicos que comprende:
(a) preparar una oligoplaca mediante la fijación de una sonda de captación sobre una superficie de un electrodo de trabajo;
(b) hibridar la sonda de captación con una sonda diana;
(c) hacer reaccionar un material de unión a ácidos nucleicos específico para un ácido nucleico de cadena única o para un ácido nucleico de doble cadena y
(d) medir el cambio del estado de carga sobre la superficie del electrodo de trabajo con un método electroquímico en una condición de electrolito electroactivo.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra esquemáticamente un esquema de preparación de una oligoplaca.
Las figuras 2 y 3 muestran una matriz múltiple.
La figura 4a muestra una oligoplaca con ácido nucleico hibridado.
La figura 4b muestra un efecto de neutralización de cargas negativas sobre una superficie de electrodo mediante intercalación.
La figura 5a muestra una reacción de oxidación/reducción sobre una superficie de electrodo en la que se neutraliza la carga negativa mediante intercalación.
La figura 5b muestra la repulsión electrostática de una superficie de electrodo cargada negativamente frente a [Fe(CN)_{6}]^{3-}.
La figura 6a es un voltamograma cíclico de un electrodo de trabajo antes de la intercalación.
La figura 6b es un voltamograma cíclico de un electrodo de trabajo fijado con ADN de cadena única después de la intercalación.
La figura 6c es un voltamograma cíclico de un electrodo de trabajo fijado con un híbrido de ADN después de la intercalación.
La figura 7 es un voltamograma cíclico de un electrodo de trabajo después de la intercalación mediante un compuesto de acridina.
Descripción detallada de la presente invención
La presente invención se refiere a un método de detección de la hibridación de ácidos nucleicos que comprende intercalar un ácido nucleico de cadena única o un ácido nucleico de doble cadena fijado sobre una superficie de un electrodo de trabajo con un material de unión a ácidos nucleicos específico, y medir el cambio de la carga negativa del ácido nucleico de cadena sencilla o el ácido nucleico de doble cadena.
El ácido nucleico de la presente invención es ADN o ARN.
El término "híbrido" se refiere a un ácido nucleico de doble cadena que tiene una unión complementaria.
El material de unión a ácidos nucleicos de la presente invención es un compuesto químico que puede unirse de manera covalente o no covalente a un ácido nucleico de doble cadena o un ácido nucleico de cadena única. El material de unión a ácidos nucleicos puede seleccionarse del grupo que consiste en un producto químico que puede insertarse en los surcos de un dúplex de ADN, un producto químico que puede dar intercalación entre un par de bases apiladas, un producto químico de unión específica a ácidos nucleicos de cadena única, un producto químico de unión específica a ácidos nucleicos de doble cadena y producto químico de unión específica a un surco mayor o menor de un dúplex de ADN. Los materiales de unión a ácidos nucleicos son moléculas cargadas y, por tanto, su unión a los ácidos nucleicos cambia el estado de carga de la superficie del electrodo de trabajo y más preferiblemente, el material de unión a ácidos nucleicos es un producto químicos que tiene una carga positiva y especificidad entre un ácido nucleico de doble cadena y un ácido nucleico de cadena única.
Ejemplos del material de unión a ácidos nucleicos es un intercalante, un colorante fluorescente de intercalación, un compuesto de acridina, cloroquina, quinina, novanatrona, doxorrubicina, una proteína de unión a cadena única y proteína Rec A.
El intercalante tiene una especificidad para ácidos nucleicos de doble cadena e incluye un colorante fluorescente de intercalación, un compuesto de acridina, cloroquina, quinina, novanatrona y doxorrubicina.
El colorante fluorescente de intercalación puede seleccionarse del grupo que consiste en tetrayoduro de 1,1'-[1,3-propanodiilbis[(dimetiliminio)-3,1-propanodiil]]bis[4-[(3-metil-2(3H)benzoxazoliliden)metilo]] (YOYO-1), tetrayoduro de 1,1'-[1,3-propanodiilbis[(dimetiliminio)-3,1-propanodiil]]bis[4-[3-(3-metil-2(3H)benzoxazoliliden)-1-propenilo]] (YOYO-3), diyoduro de 4-[(3-metil-2(3H)benzoxazoliliden)metil]-1-[3-(trimetilamonio)propilo] (YO-PRO-1), diyoduro de 4-[3-(3-metil-2(3H)-benzoxazoliliden)-1-propenil]-1-[3-(trimetilamonio)propilo] (YO-PRO-3), tetrayoduro de 2,2'-[1,3-propanodiilbis[(dimetiliminio)-3,1-propanodiil-1(4H)-piridinil-4-ilidenmetilidin]]bis[3-metilo] (POPOTM-1), tetrayoduro de 2,2'-[1,3-propanodiilbis[(dimetiliminio)-3,1-propanodiil-1(4H)-piridinil-4-iliden-1-propen-1-il-3-iliden]]bis[3-metilo] (POPOTM-3), EtBr (bromuro de 3,8-diamino-5-etil-6-fenilo), diyoduro de 3-metil-2-[[1-[3-(trimetilamonio)propil]-4(1H)-piridiniliden]metilo] (PO-PRO^{TM}-1, diyoduro de 3-metil-2-[3-[1-[3-(trimetilamonio)propil]-4(1H)-piridiniliden]-1-propenilo] (PO-PRO^{TM}-3) y SYBR Green (Molecular Probes). El compuesto de acridina puede seleccionarse del grupo que consiste en 3,6-diaminoacridina, cloruro de 3,6-diamino-10-metilacridinio, naranja de acridina y amarillo de acridina.
Un método de detección preferido de la hibridación de ácidos nucleicos de la presente invención comprende (a) preparar una oligoplaca mediante la fijación de sondas de captación sobre una superficie de un electrodo de trabajo, (b) hibridar las sondas de captura con sondas diana, (c) hacer reaccionar un material de unión a ácidos nucleicos específico para un ácido nucleico de cadena única o para un ácido nucleico de doble cadena y (d) medir el cambio del estado de carga sobre la superficie del electrodo de trabajo con un método electroquímico en una condición de electrolito electroactivo.
El método de detección de la hibridación de ácidos nucleicos comprende además una etapa de hacer reaccionar la oligoplaca con un tensioactivo antes de la etapa (c). El tensioactivo puede utilizarse como un líquido, disuelto en el mismo tampón utilizado en la disolución de intercalación. La concentración del tensioactivo no está limitada, pero es preferiblemente de aproximadamente 10 mM. El tensioactivo utilizado puede ser un tensioactivo común, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio o Triton-X.
La oligoplaca se explica con más detalle con referencia al ejemplo de la figura 1. La oligoplaca puede prepararse mediante la fijación de las sondas (\ding{193}) de captación al la superficie (\ding{192}) del electrodo de trabajo o mediante la unión química entre la superficie de electrodo y un grupo (\ding{194}) tiol o un grupo amina unido al extremo terminal 5' o 3' de las sondas de captación. Además, con el fin de evitar un contacto directo entre la sonda de captación y la superficie del electrodo de trabajo, se inserta adicionalmente un conector ("linker") (\ding{195}) de cadena carbonada entre ellos. El número de átomos de carbono del conector de cadena carbonada no está limitado, pero es preferiblemente de 6 a 12.
La sonda de captación y la sonda diana son ADN o ARN y el electrodo de trabajo es un metal conductor seleccionado del grupo que consiste en oro, platino, plata, carbono, níquel, cromo y paladio. El electrodo de trabajo puede ser una película fina o una barra y puede prepararse mediante metalizado de una matriz común de un biochip con el metal.
El electrodo de trabajo de la presente invención puede tener una sonda de captación por electrodo, fijada al mismo. Por tanto, para la fijación de varias sondas de captación, puede prepararse una matriz múltiple (figuras 2 y 3) con múltiples capas. La matriz múltiple puede tener electrodos (\ding{196}) auxiliares a intervalos regulares. El electrodo auxiliar también se conoce como contraelectrodo y es un electrodo blanco sin una sonda de captación unida a él, y pueden utilizarse oro o platino como la matriz. El electrodo auxiliar evita una caída de tensión entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo durante una reacción química, y es conductor para suministrar una tensión constante y precisa al electrodo de trabajo. El electrodo de referencia proporciona un patrón que puede controlar la magnitud de la tensión y normalmente está fabricado con plata/cloruro de plata (Ag/AgCl), producido dopando plata con AgCl. El electrodo de referencia puede situarse en otros lugares en la disolución. El electrodo de referencia también mantiene una tensión constante independientemente de estar alrededor de una reacción eléctrica.
En la hibridación de la etapa (b) del método de detección de la hibridación de un ácido nucleico, cuando se hace reaccionar la sonda diana con una sonda de captación que se fija sobre la superficie de un electrodo de trabajo, una sonda de captación complementaria para una sonda diana genera un híbrido de ácido nucleico (figura 4a), pero una sonda de captación que no es complementaria no se une con la sonda diana, de modo que se mantiene un ácido nucleico de cadena única.
La reacción de hibridación puede realizarse según la naturaleza de la sonda, su tamaño, etcétera, y más preferiblemente, la reacción de hibridación se lleva a cabo mediante un protocolo general. Con el fin de estabilizar el híbrido de ácido nucleico entre la sonda de captación y la sonda diana, puede utilizarse un tampón que contiene cloruro de sodio. Tras la hibridación, se eliminan la sonda diana de unión no específica y la sonda diana restantes.
En la reacción de la etapa (c), un material de unión a ácidos nucleicos específico para un ácido nucleico de cadena única o específico para un ácido nucleico de doble cadena reacciona con la sonda de captación o el híbrido nucleico sobre la superficie del electrodo de trabajo. Por tanto, el material de unión a ácidos nucleicos cargado positivamente se une específicamente con el híbrido nucleico o el ácido nucleico de cadena única para reducir las cargas negativas (figura 4b).
Mientras tanto, se aplica un tensioactivo, calor, una tensión o una onda sónica de modo que se minimice la unión no específica tras la etapa (c). Por ejemplo, se inserta un intercalante específico para un ácido nucleico de doble cadena a un par de bases apiladas, pero esto también tiene una tendencia a generar una interacción iónica con un ácido nucleico de cadena única. Esta unión no específica puede eliminarse aplicando un tensioactivo, calor, ondas sónicas o una tensión en la superficie del electrodo. La temperatura del calor es preferiblemente de 65 a 95ºC, el tratamiento con ondas sónicas puede realizarse mediante un método general o mediante sonicación y puede suministrarse una tensión al electrodo.
En la etapa (d), la oligoplaca se sumerge en una condición electrolítica para medir el cambio del estado de carga sobre la superficie del electrodo de trabajo mediante un método electroquímico. En este momento, si se reduce o neutraliza la carga negativa de los nucleótidos existentes sobre el electrodo de superficie mediante un material de unión a ácidos nucleicos, se deja que un electrolito cargado negativamente se desplace próximo a la superficie de electrodo, de modo que la concentración en la superficie del electrolito cargado negativamente aumente y se produzca la oxidación/reducción. Pero si la carga negativa de los nucleótidos no se ha reducido o neutralizado, el electrolito cargado negativamente es expulsado por la repulsión electrostática de la superficie del electrodo y no se produce la oxidación/reducción (figura 5b).
El electrolito es un compuesto negativo, y es preferiblemente una disolución que contiene [Fe(CN)^{6}]^{3-}. Un ejemplo del electrolito es un tampón que incluye NaCl 50 mM, fosfato 10 mM (pH 7,0) y K_{3}Fe(CN)_{6} 3 mM.
Ejemplos del método electroquímico son voltametría cíclica, amperimetría y cronoculombimetría. La voltametría cíclica es una técnica electroquímica para estudiar el potencial variable en un electrodo, que implica la aplicación de un barrido de potencial seguido por un barrido de vuelta a través de la región de potencial que se acaba de cubrir, produciendo una forma de onda triangular. La amperimetría usa técnicas que implican medir corrientes eléctricas y la cronoculombimetría es un electroanálisis realizado midiendo la tasa de cambio de la corriente frente al tiempo en un electrodo de trabajo.
Como ejemplos, cuando se mide un cambio de corriente en un electrodo de trabajo mediante voltametría cíclica, se produce un voltamograma cíclico en un electrodo de trabajo antes de la intercalación, como en la figura 6a, se produce un voltamograma cíclico en un electrodo de trabajo fijado con una cadena de ADN no intercalado tras la intercalación, como en la figura 6b, y se produce un voltamograma cíclico en un electrodo de trabajo fijado con una cadena de ADN intercalado, como en la figura 6c. Es decir, una sonda de captación intercalada tiene la carga negativa sobre la superficie del electrodo neutralizada o reducida, de modo que el electrolito cargado negativamente puede aproximarse fácilmente a la superficie del electrodo y es fácil la producción de la oxidación/reducción.
Por tanto, cuando se hace reaccionar un intercalante específico para un ácido nucleico de doble cadena con una sonda de captación, si se obtiene un voltamograma cíclico como en la figura 6b, quiere decir que la sonda de captación no es complementaria a la sonda diana. Pero si se obtiene un voltamograma cíclico como en la figura 6c, quiere decir que la sonda de captación es complementaria a la sonda diana.
Tal como se mencionó anteriormente, el método de detección de la hibridación de ácidos nucleicos de la presente invención proporciona un método electroquímico para detectar la hibridación de ácidos nucleicos, y esta técnica puede utilizarse para un chip o biochips de ADN, con bajo coste y un procedimiento simple.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar adicionalmente la presente invención. Sin embargo, estos ejemplos se muestran solamente para la mejor comprensión de la presente invención sin limitar su alcance.
Ejemplo 1 Preparación de una oligoplaca
Se utilizó una barra de oro como electrodo de trabajo.
En primer lugar se pulió la barra de oro con papel de lija nº 1500 y 2000 y luego se pulió en serie con pastas de alúmina de diámetros de partícula de 5 \mum, 1 \mum y 0,05 \mum, seguido por sonicación en agua desionizada durante 5 min.
Se llevó a ebullición la superficie del electrodo en una disolución saturada de hidróxido de potasio durante 1 hora, se empapó con ácido sulfúrico durante 24 horas y se lavó profundamente con agua desionizada. En lugar de empaparla con ácido sulfúrico, puede empaparse la superficie del electrodo con una disolución Piranha durante 3 - 4 horas.
Se adquirieron oligonucleótidos que incluyen un grupo tiol unido al extremo 5' para sondas de captación de Sigma-Aldrich, con la secuencia facilitada en la SEQ ID NO: 1.
Se disolvieron 10 ng/ml de sonda de captación en agua destilada o 10 mM de una disolución de fosfato (pH 7,0) que contiene 50 mM de NaCl. La mezcla se dejó caer gota a gota sobre la superficie del electrodo de oro y se incubó durante más de 8 horas, seguido por aclarado con agua destilada. Entonces se empapó el electrodo de oro con 10 mM de una disolución de fosfato (pH 7,0) que contiene 50 mM de NaCl y tras 24 horas se lavó con la misma disolución, preparándose así oligoplaca.
Ejemplo 2 Hibridación
Se utilizaron oligonucleótidos complementarios para una sonda de captación como sonda diana, y la sonda diana tenía la secuencia facilitada en la SEQ ID NO: 2.
Se añadieron 10 \mug/ml de la sonda diana a un tampón (1X TE, NaCl 400 mM; pH 7,0) para preparar la disolución de sonda diana. Se sumergió la oligoplaca preparada en el ejemplo 1 en la disolución de sonda diana durante 15 horas, a 45ºC. Tras reducir la temperatura, se lavó la oligoplaca con 10 mM de un tampón fosfato (pH 7,0) que contiene NaCl 50 mM, y tras empaparse la oligoplaca con 1X TBE (pH 7,0) que contiene SDS 7 mM o tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contiene NaCl 50 mM y SDS 7 mM, se lavó con 1X TBE (pH 7,0).
Se empapó la oligoplaca con 1X TBE (pH 7,0) que contiene 10^{-7} M de SYBR Green durante 10 min., y se lavó con fosfato 10 mM (pH 7,0) que contiene NaCl 50 mM.
Ejemplo 3
Se utilizaron oligonucleótidos no complementarios para una sonda de captación como sonda diana, y la sonda diana tiene la secuencia facilitada en la SEQ ID NO: 3. Se hizo reaccionar la sonda diana de SEQ ID NO: 3 con la oligoplaca del ejemplo 1 mediante el mismo método descrito en el ejemplo 2.
Ejemplo 4
Se llevó a cabo el método de voltametría cíclica sobre los electrodos del ejemplo 2 y el ejemplo 3 utilizando un potenciostato/galvanostato EG&G modelo 273A (Princeton Applied Research) a temperatura ambiente. Se utilizaron un electrodo de referencia de Ag/AgCl [NaCl 3 M] (BAS) y electrodos auxiliares de hilo de platino para la medición de la voltametría cíclica, y se utilizó una disolución de [Fe(CN)_{6}]^{3-} que contiene NaCl 50 mM, fosfato 10 mM (pH 7,0) y K_{3}Fe(CN)_{6} como disolución tampón. El intervalo de barrido de tensión fue de 0,6 V \sim -0,5 V (frente a un electrodo de referencia de Ag/AgCl) y la velocidad de barrido fue de 100 mV/s. se eliminó el oxígeno de la disolución de
[Fe(CN)_{6}]^{3-} burbujeando nitrógeno en ella durante 5 minutos antes del experimento.
Las figuras 6a-c muestran voltamogramas cíclicos, en los que la figura 6a es un voltamograma cíclico de un electrodo de oro no recubierto, la figura 6b es un voltamograma cíclico del electrodo del ejemplo 3 y la figura 6c es un voltamograma cíclico del electrodo del ejemplo 2.
En las figuras 6a-c, se muestra que la sonda de captación se hibridó con la sonda diana del ejemplo 2, pero que la sonda de captación no pudo hibridarse con la sonda diana no complementaria del ejemplo 3 y la sonda de captación permaneció como un ADN de cadena sencilla. Estos resultados son tal como se predicen.
Ejemplo 5 Detección de la hibridación mediante un compuesto de acridina
Se preparó una oligoplaca mediante el mismo método descrito en el ejemplo 1, y se llevó a cabo la reacción de hibridación.
Se empapó la oligoplaca con un tampón que contiene SDS 0,5 \sim 5 mM, NaCl 50 mM y fosfato 10 mM
(pH 7,0) durante 10 min. Tras lavar con NaCl 50 mM y fosfato 10 mM (pH 7,0), se empapó la oligoplaca con 3,6-diaminoacridina 1 mg/ml, NaCl 50 mM y fosfato 10 mM (pH 7,0) durante 10 min., y cuando estuvo limpia, se midió la voltametría cíclica.
La figura 7 es un voltamograma cíclico de un electrodo de trabajo tras su intercalación con un compuesto de acridina. En el caso de un electrodo de trabajo fijado con una sonda de captación que genera un híbrido de ADN, se midió un voltamograma cíclico tal como se describe en \ding{192}, y con un electrodo de trabajo fijado solamente con un ADN de cadena única, se midió un voltamograma cíclico tal como se describe en \ding{193}.
<110> POHANG IRON STEEL CO., LTD
\hskip1cm
Universidad de Pohang de Ciencia y Tecnología 
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<120> MÉTODO DE DETECCIÓN DE LA HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
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<130> DPP021550
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<150> KR 10-2001-44971
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<151> 25-07-2001
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<150> KR 10-2002-43389
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<151> 23-07-2002
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<160> 3
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<170> KopatentIn 1.71
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<210> 1
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> secuencia de la sonda de captación
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> secuencia de la sonda diana
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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ctcgccatgt ctgtgaccac 
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Claims (12)

1. Método electroquímico para detectar la hibridación entre un ácido nucleico fijado sobre una superficie de electrodo (sonda de captación) y un ácido nucleico complementario a éste que se deriva de una muestra mediante una neutralización eléctrica de un ácido nucleico de doble cadena o un ácido nucleico de cadena única con un material de unión a ácidos nucleicos,
en el que el método de detección comprende:
(a)
fijar la sonda de captación sobre una superficie de electrodo para obtener una capa de ácido nucleico;
(b)
poner en contacto la sonda de captación fijada sobre la superficie de electrodo con el ácido nucleico derivado de una muestra para inducir la hibridación;
(c)
hacer reaccionar simultanea o secuencialmente una sonda de captación hibridada o no hibridada con un tensioactivo y un material de unión a ácidos nucleicos, en el que el material de unión a ácidos nucleicos tiene carga positiva, para cambiar una cantidad de carga o estado de carga de la sonda de captación hibridada o no hibridada mediante la unión a éste; y
(d)
monitorizar una corriente eléctrica o cantidad de carga de la superficie de electrodo en una disolución de electrolito electroactivo para determinar si la sonda de captación se hibrida o no.
2. Método según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico es ADN o ARN.
3. Método según la reivindicación 1, en el que la sonda de captación se fija sobre la superficie de electrodo utilizando un grupo tiol localizado en el extremo terminal de la sonda de captación.
4. Método según la reivindicación 1, en el que la sonda de captación se fija sobre la superficie de electrodo utilizando un grupo amina localizado en el extremo terminal de la sonda de captación.
5. Método según la reivindicación 1, en el que el electrodo está fabricado con un material seleccionado del grupo que consiste en oro, platino, plata, carbono, cobre, níquel, cromo y paladio.
6. Método según la reivindicación 1, en el que el material de unión a ácidos nucleicos se selecciona del grupo que consiste en un intercalante, un colorante fluorescente de intercalación, un compuesto de acridina, cloroquina, quinina, novanatrona, doxorrubicina, una proteína de unión a ADN de cadena única y una proteína Rec A.
7. Método según la reivindicación 6, en el que el colorante fluorescente de intercalación se selecciona del grupo que consiste en
tetrayoduro de 1,1'-[1,3-propanodiilbis[(dimetiliminio)-3,1-propanodiil]]bis[4-[(3-metil-2(3H)benzoxa-zoliliden)metilo]],
tetrayoduro de 1,1'-[1,3-propanodiilbis[(dimetiliminio)-3,1-propanodiil]]bis[4-[(3-metil-2(3H)benzoxazoliliden)-1-propenilo]],
diyoduro de 4-[(3-metil-2(3H)benzoxazoliliden)metil]-1-[3-(trimetilamonio)propilo],
diyoduro de 4-[3-(3-metil-2(3H)-benzoxazoliliden)-1-propenil]-1-[3-(trimetilamonio)propilo],
tetrayoduro de 2,2'-[1,3-propanodiilbis[(dimetiliminio)-3,1-propanodiil-1(4H)-piridinil-4-ilidenmetilidin]]bis[3-metilo],
tetrayoduro de 2,2'-[1,3-propanodiilbis[(dimetiliminio)-3,1-propanodiil-1(4H)-piridinil-4-iliden-1-propen-1-il-3-iliden]]bis[3-metilo],
EtBr (bromuro de 3,8-diamino-5-etil-6-fenilo),
diyoduro de 3-metil-2-[[1-[3-(trimetilamonio)propil]-4(1H)-piridiniliden]metilo],
diyoduro de 3-metil-2-[3-[1-[3-(trimetilamonio)propil]-4(1H)-piridiniliden]-1-propenilo], y
SYBR green.
8. Método según la reivindicación 6, en el que el compuesto de acridina se selecciona del grupo que consiste en 3,6-diaminoacridina, cloruro de 3,6-diamino-10-metilacridinio, naranja de acridina y amarillo de acridina.
9. Método según la reivindicación 1, en el que el tensioactivo es dodecilsulfato de sodio o Triton-X.
10. Método según la reivindicación 1, en el que el método de detección comprende además la etapa de aplicar calor, tensión, u ondas sónicas sobre la capa de ácido nucleico después de la etapa (c).
11. Método según la reivindicación 1, en el que el método electroquímico es voltametría cíclica, amperimetría o cronoculombimetría.
12. Método según la reivindicación 1, en el que la sonda de captación se fija sobre la superficie de electrodo mediante unión química.
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