ES2253028A1 - Empleo del gen slug, sus productos de transcripcion o expresion, y/o compuestos inhibidores o estimuladores de la expresion de slug para conferir radiosensibilizacion o radioproteccion celular. - Google Patents

Abstract

La expresión del gen Slug está relacionada con la resistencia celular a la irradiación ya que su ausencia produce un aumento en la radiosensibilidad celular. Por tanto, se puede conferir radiosensibilidad a células tumorales que expresan Slug reprimiendo su expresión o bien se puede conferir radioprotección a células normales activando la expresión del gen Slug, sus productos de transcripción o expresión, produciéndose de este modo un incremento en la eficacia de la radioterapia al reducir, o eliminar, el riesgo de un posible fracaso. De aplicación en el tratamiento del cáncer, por ejemplo, en la elaboración de composiciones farmacéuticas que aumentan la radiosensibilidad de células tumorales que expresan Slug o composiciones farmacéuticas que confieren radioprotección o radioresistencia a células normales.

Description

Empleo del gen Slug, sus productos de transcripción o expresión, y/o compuestos inhibidores o estimuladores de la expresión de Slug para conferir radiosensibilización o radioprotección celular.

Campo de la invención

Esta invención se relaciona, en general, con composiciones y métodos para aumentar la radiosensibilidad de células tumorales o la radioresistencia de células normales basados en la represión o expresión del gen Slug, sus productos de transcripción o expresión, y/o en el empleo de compuestos capaces de interferir con la función Slug a nivel de ácido nucleico o de proteína en células tumorales o de compuestos capaces de aumentar la expresión del producto del gen Slug en células normales.

Antecedentes de la invención

Una de las alternativas terapéuticas para el tratamiento del cáncer consiste en someter al paciente a radioterapia. No obstante, el empleo de radioterapia en el tratamiento de tumores presenta una utilidad limitada debido, entre otras causas, a la existencia de tumores que no responden a radioterapia, y, por otra parte, a la ausencia de dianas específicas. Las bases genéticas relacionadas con la resistencia a la radioterapia en algunas células tumorales todavía no se conoce muy bien. Sin embargo, para mejorar la especificidad se han desarrollado metodologías que emplean radioterapia dirigida en donde los radioisótopos se conjugan a unos agentes selectivos capaces de localizar los tumores. Lamentablemente, el número de dichos agentes selectivos es muy reducido para el elevado número de tipos de tumores existentes.

También se han desarrollado metodologías para el tratamiento de enfermedades neoplásicas que pretenden mejorar la especificidad del tratamiento utilizando un tipo de compuestos conocidos como "radiosensibilizadores", es decir, compuestos que aumentan la sensibilidad de las células tratadas a la irradiación (radiación \gamma). Entre dichos compuestos radiosensibilizadores se encuentra el 5-fluorouracilo que tiene la capacidad de incrementar la sensibilidad celular a la radiación. No obstante, debido a a naturaleza inespecífica de estos y otros compuestos radiosensibilizadores, la radiosensibilidad de las células normales también se ve incrementada. Por tanto, es necesario identificar nuevas dianas que permitan desarrollar compuestos radiosensibilizadores con especificidad mejorada capaces de aumentar de forma preferencial la radiosensibilidad de las células tumorales.

Ahora se ha encontrado que la expresión del gen Slug está relacionada con la resistencia celular a la irradiación ya que su ausencia produce un aumento en la radiosensibilidad celular.

El gen Slug es un gen presente en los vertebrados que codifica para la proteína Slug, un factor de transcripción del tipo "dedos de zinc", implicado en las transiciones epiteliales- mesenquimales [Nieto et al., Science 264:835-849 (1994)]. Además, Slug es el responsable de las funciones del factor de células madre (SCF) y su receptor c-kit.

El SCF es el producto del locus steel (S1) de ratón y es el ligando del receptor de tipo tirosina quinasa c-kit que está codificado por el locus white spotting (W) de ratón. El ligando c-kit parece tener actividades únicas y no redundantes sobre las células progenitoras primitivas. En este sentido, existe una amplia evidencia de que el SCF, en ausencia de otras citoquinas, promueve selectivamente la viabilidad más que la proliferación de las células progenitoras hematopoyéticas murinas primitivas. Sin embargo, se desconocen los mecanismos moleculares que proporcionan especificidad biológica a la vía de transducción de señales de SCF/c-kit en la formación y migración de las células c-kit^{+}. Recientemente, se ha podido demostrar que los ratones Slug mutantes tienen características fenotípicas similares a las de los ratones S1 y W mutantes (consistentes en deficiencia pigmentaria, defectos gonadales y alteración de la hematopoyesis) y se ha identificado al factor de transcripción Slug como una diana molecular que contribuye a la especificidad biológica de la vía de transducción de señales del SCF/c-kit. Los genes Kit y Slug modulan de forma coordinada el desarrollo y supervivencia de líneas de melanocitos y de líneas hematopoyéticas en ratones kit deficientes y Slug deficientes.

Las propiedades biológicas del SCF han demostrado que la acción del SCF se produce en poblaciones celulares muy primitivas. En este sentido, se requiere la producción endógena del SCF para sobrevivir a la irradiación letal [Zsebo KH et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993; 89:9464-9468; Neta R et al., Blood, 1993; 81:324-327]. La supervivencia tras la radiación con una dosis letal (LD_{100/30}, dosis de radiación letal para el 100% de los ratones en 30 días) está basada en la recuperación de la función alterada del sistema hematopoyético, ya que el trasplante de células de médula ósea normales en animales y humanos irradiados con dosis letales tiene como resultado la supervivencia a largo plazo y proporciona una prueba de que el sistema hematopoyético es crucial para la defensa frente a las complicaciones letales inducidas por la radiación. La DL_{100} para los animales mutantes Si es de 200 a 300 rads, mientras que la DLloo de sus homólogos congénicos está comprendida entre 720 y 900 rads [Harrison DE et al., Br. J. Haematol 1972; 22:155-168; Kaczmarek L et al., Int. J. Radiot. Biol. 1988; 53:703-708], lo que demuestra que la ausencia de SCF aumenta la radiosensibilidad.

Por otra parte, se ha descrito el empleo del gen Slug, o de sus productos de transcripción o expresión, en la detección y/o tratamiento de células cancerigenas [WO 02/059361]. También se ha descrito el empleo del gen Slug y de su producto de expresión en la movilización de células madre hematopoyéticas para transplante o terapia génica, en la expansión ex vivo de células madre hematopoyéticas, y/o en el tratamiento de problemas de esterilidad masculina [PCT02/ES02/00520].

Compendio de la invención

La invención se enfrenta, en general, con la búsqueda de medios para mejorar la eficacia terapéutica del tratamiento del cáncer por radioterapia.

La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han descubierto, sorprendentemente, que la expresión del gen Slug está relacionada con la resistencia celular a la irradiación ya que su ausencia produce un aumento en la radiosensibilidad celular. Los resultados de este descubrimiento pueden ser utilizados para conferir radiosensibilidad a células tumorales que expresan Slug o radioprotección a células normales que expresan, o no, Slug, mediante la represión o expresión del gen Slug, sus productos de transcripción o expresión, así como para identificar compuestos capaces de anular o minimizar la expresión de Slug en células tumorales que expresan el gen Slug, lo que aumenta la radiosensibilidad de las mismas, o bien para identificar compuestos que aumenten la expresión de Slug en células normales o sanas, que expresen o no Slug, lo que aumenta la resistencia de dichas células normales a la irradiación (radioresistencia o radioprotección). En cualquiera de los casos se produce un incremento en la eficacia del tratamiento del cáncer mediante radioterapia al reducir, o eliminar, el riesgo de un posible fracaso de la radio-
terapia.

La destrucción del sistema hematopoyético inducida por irradiación es la principal causa de muerte según los hallazgos en los que se observa que la transferencia de células de médula ósea normales evita la muerte debida a la irradiación letal. Anteriormente se había relacionado la vía de transducción de señales del SCF/c-kit con la recuperación hematopoyética que evita la muerte debida a la irradiación de una dosis letal, aunque se desconocían los mecanismos moleculares que median este efecto biológico. Dado que mutaciones en los genes SCF, c-Kit y Slug tienen un fenotipo similar en ratones, los inventores han examinado si Slug podría complementar la radiosensibilidad de ratones kit-deficientes. Ahora se ha comprobado (véase el Ejemplo) que Slug actúa como un agente radioprotector ya que su ausencia tiene como consecuencia un aumento de la radiosensibilidad. Este efecto no puede recuperarse activando la vía de señalización de SCF/c-kit en ratones Slug deficientes irradiados con dosis letales, ya que los ratones tratados con SCF no mostraron estimulación de la recuperación hematopoyética que condujese a la supervivencia de los ratones Slug deficientes. Se ha encontrado que se podía complementar el fallo hematopoyético en ratones c-kit deficientes irradiados con dosis letales transduciéndoles con una proteína TAT-Slugh. Estos resultados ponen de manifiesto que el factor de transcripción Slug es absolutamente necesario para la supervivencia a la irradiación a dosis letales y que Slug es la diana molecular que media en la radioprotección celular a través de la vía de transducción de señales SCF/c-kit. Estos resultados indican que Slug es un componente molecular que confiere radiorresistencia a las células cancerígenas.

Por consiguiente, la invención se relaciona, por una parte, con la reducción, inhibición o represión del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, para conferir radiosensibilidad a células tumorales que expresan Slug. La reducción, inhibición o represión del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, puede conseguirse mediante el empleo de "inhibidores de Slug", es decir, compuestos que reducen, inhiben o reprimen la expresión de Slug. Este aumento en la radiosensibilidad de dichas células tumorales permite utilizar dosis de irradiación más bajas. Por consiguiente, el gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, pueden utilizarse en la búsqueda de inhibidores de Slug. Dichos compuestos, al reducir, anular o reprimir la expresión de Slug, aumentan la radiosensibilidad de las células tumorales que expresan Slug, lo que permite utilizar dosis de irradiación más bajas, y, podrían ser utilizados, por tanto, en el tratamiento del cáncer.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con la reducción, inhibición o represión del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, para conferir radiosensibilidad a células tumorales que expresan Slug.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de inhibidores de Slug para conferir radiosensibilidad a células tumorales que expresan Slug.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende un inhibidor de Slug, por ejemplo, un compuesto con capacidad para interferir con la función Slug a nivel de ácido nucleico o proteína. En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dicho inhibidor de Slug en la elaboración de una composición para aumentar la radiosensibilidad de células tumorales que expresan Slug o en la elaboración de una composición para el tratamiento del cáncer, en particular, de células tumorales que expresan Slug. En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación ("screening") de un compuesto capaz de reducir, anular o reprimir la expresión del gen Slug.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de un compuesto potencialmente útil para el tratamiento del cáncer que comprende ensayar dicho compuesto en un sistema celular que expresa el gen Slug, evaluar el efecto de dicho compuesto sobre la transcripción o traducción de dicho gen y/o sobre sus productos de transcripción o expresión, y seleccionar los compuestos que tienen la capacidad de interferir con la función Slug a nivel de ácido nucleico o proteína.

Por otra parte, la invención también se relaciona con la expresión del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, para conferir radioprotección o radioresistencia a células normales o sanas. La expresión del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, puede ser aumentada, lo que incrementaria la radioprotección o redioresistencia celular, mediante el empleo de "estimuladores de Slug", es decir, compuestos que aumentan o activan la expresión del gen Slug, sus productos de transcripción o expresión. Este aumento en la radioresistencia de dichas células normales permite reducir la toxicidad sobre dichas células asociada con la radioterapia. Por consiguiente, el gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, puede utilizarse en la búsqueda de estimuladores de Slug. Dichos compuestos actúan como radioprotectores de las células normales ya que aumentan su radioresistencia, lo que reduce la toxicidad asociada con la radioterapia, y pueden ser utilizados en el tratamiento del cáncer.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, y/o estimuladores de Slug en la elaboración de una composición que confiere radioprotección o radioresistencia a células normales.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende el gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, y/o un estimulador de Slug. En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo del gen Slug, sus productos de transcripción o expresión, o dicho estimulador de Slug en células normales en la elaboración de una composición para proteger dichas células normales frente a la irradiación, o en la elaboración de una composición para aumentar la radioresistencia de células normales o en la elaboración de una composición para el tratamiento del cáncer. En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de un compuesto capaz de aumentar o activar la expresión del gen Slug, en particular, en células normales que expresan dicho gen.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de un compuesto potencialmente útil para el tratamiento del cancer que comprende ensayar dicho compuesto en un sistema celular que expresa el gen Slug, evaluar el efecto de dicho compuesto sobre la expresión de dicho gen y seleccionar los compuestos con capacidad para aumentar la expresión de Slug.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una gráfica que muestra el efecto de irradiación en la supervivencia de ratones Slug -/-. Se irradiaron ratones Slug -/- y +/- con varias dosis para determinar una dosis letal de irradiación. La supervivencia de ratones Slug +/- y tipo salvaje no se ve influenciada por la irradiación a bajas dosis. La dosis de irradiación se administró en forma de dosis divididas de igual intensidad con intervalos de 4 horas. En ordenadas se representa el porcentaje de supervivencia mientras que en abscisas se representan los días post-irradiación.

La Figura 2 muestra los niveles de proteína p53 en células de médula ósea tras la administración de radiación \gamma. La proteína p53 fue detectada mediante un análisis Western blot en células de médula ósea de ratones Slug +/+ y Slug -/-. La actina se utilizó como control de carga. Los números que aparecen en la parte superior (0, 1, 2, 4, 6, y 12) indican los periodos de tiempo (horas).

La Figura 3 es una gráfica que muestra las poblaciones celulares de la médula ósea de ratones irradiados con una DL_{100/30} y tratados con SCF. Se inyectó SCF por vía intravenosa (i.v.) 20 h y 2 h antes de la irradiación y 4 h después de la última dosis de irradiación. Las poblaciones celulares de la médula ósea de ratones tipo salvaje fueron similares a las de los ratones Slug +/- irradiados con una DL_{100/30} y tratados con SCF. Los datos presentados son la media ± EEM para cuatro ratones en cada punto temporal.

La Figura 4 muestra la transducción de TAT-Slugh en ratones. La Figura 4A es un diagrama de la proteína de fusión TAT-Slugh. La Figura 4B muestra los resultados de la inmunofluorescencia de células Ba/F3 no transducidas (panel de la izquierda) y de células Ba/F3 transducidas con la proteína TAT-Slugh. La proteína TAT-Slugh fue detectada con el anticuerpo monoclonal 12CA5 que detecta el epítopo HA. La Figura 4C muestra los resultados de un análisis por inmunoblot de células Ba/F3 a los 60 minutos de ser transducidas con diferentes cantidades de la proteína TAT-Slugh. La Figura 4D muestra los resultados de un análisis por inmunoblot de células Ba/F3 transducidas con 50 µg de la proteína TAT-Slugh a diferentes periodos de tiempo. La Figura 4E muestra los resultados de un análisis por inmunoblot de células de médula ósea aisladas de ratones Slug -/- a los 120 minutos de la inyección por vía intraperitoneal (i.p.) de diferentes cantidades de la proteína de fusión TAT- Slugh. La Figura 4F es una gráfica que muestra el efecto de la irradiación sobre la supervivencia de ratones kit deficientes transducidos con la proteína de fusión TAT-Slugh. Los ratones fueron irradiados con 350 rads administrados en dosis divididas. Se inyectó SCF por vía i.v. 20 h y 2 h antes de la irradiación y 4 h después de la última dosis de irradiación y las proteínas TAT fueron inyectadas por vía i.p. en una dosis única de 250 µg inmediatamente después de la irradiación.

La Figura 5 muestra el rescate de la aplasia inducida por irradiación letal en ratones kit mutantes por la proteína de fusión TAT-Slugh. La Figura 5A muestra el efecto de la supervivencia de células de médula ósea W/W^{v} tras la irradiación. La muerte celular está acompañada de pérdida de nucleosoma tras la irradiación. El ADN de bajo peso molecular se aisló 6 horas después de la irradiación con 350 rads de ratones control. Calle 1: ratones control; Calle 2: ratones W/W^{v} tratados con SCF mediante inyección por vía i.v. 20 h y 2 h antes de la irradiación y 4 h después de la última dosis de irradiación; Calle 3: ratones W/W^{v} a los que se les inyectó por vía i.p. una dosis única de 250 µg de la proteína TAT-Slugh inmediatamente después de la irradiación; Calle 4: ratones W/W^{v} a los que se les inyectó por vía i.p. una dosis única de 250 µg de la proteína TAT control inmediatamente después de la irradiación. El ADN se marcó en los extremos, se resolvió por electroforesis en gel de agarosa al 2% y se visualizó por autorradiografia. La Figura 5B muestra los resultados de un análisis hematológico de sangre periférica de ratones irradiados con 350 rads y tratados con la proteína de fusión TAT-Slugh o con la proteína TAT. Se obtuvieron resultados similares después de estudiar 5 ratones por grupo. En ordenadas se representa el número de leucocitos, plaquetas y eritrocitos o la concentración de hemoglobina, y en abscisas el tiempo post-irradiación (días).

Descripción detallada de la invención

La invención se relaciona, en general, con el descubrimiento de que la expresión del gen Slug está relacionada con la resistencia celular a la irradiación ya que su ausencia produce un aumento en la radiosensibilidad celular. Por tanto, la represión o expresión del gen Slug, sus productos de transcripción o expresión, puede ser utilizada para conferir radiosensibilidad o radioprotección celular, por lo que dicho gen, sus productos de transcripción y/o expresión, constituyen una diana muy atractiva para el tratamiento del cáncer.

1. Aumento de la radiosensibilidad de células tumorales

Ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que el factor Slug actúa como agente radioprotector de células tumorales que lo expresan (véase el Ejemplo que acompaña a esta descripción) por lo que dicho factor podría ser una de las causas del fracaso, total o parcial, de una terapia antitumoral basada en la irradiación de células tumorales que expresan el producto del gen Slug. Consecuentemente, un aumento en la sensibilidad de dichas células tumorales que expresan el factor Slug a la irradiación (radiosensibilidad) permitiria reducir el fracaso en la terapia antitumoral por irradiación.

Por consiguiente, la invención se relaciona, por una parte, con la reducción, inhibición o represión del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, para conferir radiosensibilidad a células tumorales que expresan Slug. La reducción, inhibición o represión del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, puede conseguirse mediante el empleo de inhibidores de Slug. El gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, pueden utilizarse en la búsqueda de inhibidores de Slug, los cuales pueden ser utilizados en el tratamiento del cáncer.

De forma más concreta, en un aspecto, la invención se relaciona con la reducción, inhibición o represión del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, para conferir radiosensibilidad a células tumorales que expresan Slug.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de inhibidores de Slug para conferir radiosensibilidad a células tumorales que expresan Slug. Tal como se utiliza en esta descripción, el término "inhibidor de Slug" incluye a cualquier compuesto que reduce, anula o reprime la expresión del gen Slug, por ejemplo, un compuesto con capacidad para interferir con la función Slug a nivel de ácido nucleico (ADNg, ADNc, ARN) o proteína (Slug). En general, la interferencia con la función del gen Slug se puede hacer a nivel del ADN impidiendo su expresión, inactivando el ARNm que se genera mediante oligonucléotidos antisentido o ribozimas, inactivando la proteína mediante el empleo de anticuerpos o compitiendo el efecto de dicha proteína con dominantes negativos [Choo Y et al. J. Mol. Biol., 1997, 273:525-532; Cobaleda C and Sánchez-García I. Blood, 2000, 95:731-737] y/o, en general, mediante el empleo de cualquier compuesto que reprima la expresión del gen Slug. A modo ilustrativo, dicho inhibidor de Slug puede ser una proteína, un péptido, un oligonucleótido antisentido, una ribozima, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

En una realización particular, dicho inhibidor de Slug es un oligonucleótido antisentido, es decir, un compuesto que, cuando se administra a una célula que expresa el gen Slug, por ejemplo, una célula tumoral que expresa la proteína Slug, es capaz de, por ejemplo, reducir, anular, o reprimir la expresión del gen Slug, reduciendo de este modo los niveles de factor Slug o anulándolos completamente. Dicho oligonucleótido antisentido podría unirse específicamente, por ejemplo, al ARNm del gen Slug evitando de ese modo su traducción en la proteína Slug. Información sobre ADNg, ADNc o ARNm de Slug, en particular, de Slugh (humano) puede encontrarse en WO 02/059361 así como en las referencias bibliográficas contenidas en dicho documento. Dicho oligonucleótido antisentido comprende una secuencia de nucleótidos y una longitud adecuados para su hibridación con la secuencia de nucleótidos del gen Slug o de su producto de transcripción, bajo condiciones de alta astringencia. A modo ilustrativo, dicho oligonucleótido antisentido comprende, al menos 8, nucleótidos consecutivos, preferentemente, al menos, 12, 16 ó 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos del gen Slug o capaces de hibridar con la secuencia de nucleótidos del gen Slug bajo condiciones de alta astringencia, tales como, por ejemplo, SSPE 5x y SDS al 0,5%, a 65ºC o condiciones equivalentes. Ejemplos de oligonucleótidos antisentido que pueden utilizarse para evitar la expresión de Slug pueden encontrarse en WO 02/059361.

En otra realización particular dicho inhibidor de Slug es un anticuerpo anti-Slug, tal como un anticuerpo que reconoce a la proteína Slug intacta o un fragmento antigénico de la misma, opcionalmente conjugado a un portador. Los anticuerpos anti-Slug pueden ser policlonales o, preferentemente, monoclonales, los cuales pueden obtenerse mediante la tecnología del hibridoma [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]. Alternativamente se pueden utilizar fragmentos de anticuerpos, por ejemplo Fab, F(ab')2, etc., los cuales pueden obtenerse por métodos convencionales, que reconocen a la proteína Slug o un fragmento antigénico de la misma.

En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica que comprende, al menos, un inhibidor de Slug, en una cantidad terapéuticamente eficaz, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha composición farmacéutica puede contener uno o más inhibidores de Slug, es decir, uno o más compuestos capaces de reducir, anular o reprimir la expresión del gen Slug por lo que es útil para sensibilizar células tumorales que expresan Slug frente a la irradiación, por ejemplo, frente a la radiación ionizante, tal como la radiación \gamma, de manera que, al no expresar dicha proteína Slug, o expresarla a niveles muy bajos, se aumenta la radiosensibilidad de dichas células tumorales que expresan Slug, con lo que se pueden utilizar dosis letales de irradiación más bajas, lo que contribuye a reducir la toxicidad asociada con la radioterapia sobre las células normales o sanas.

Los excipientes que pueden utilizarse en la elaboración de la composición farmacéutica proporcionada por esta invención dependerán, entre otras cosas, de la forma de administración de dicha composición farmacéutica. Una revisión de las distintas formas de administración de principios activos, de los excipientes a utilizar y de sus procedimientos de fabricación puede encontrarse en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993.

En una realización particular, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención es una composición destinada a su administración por vía intravenosa (i.v.) o intraperitoneal (i.p.). En otra realización particular, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención es una composición destinada para su empleo en terapia génica que comprende un vector, viral o no viral, y un inhibidor de Slug. A modo ilustrativo, dichos vectores pueden ser vectores virales, por ejemplo, basados en retrovirus, adenovirus, etc., o no virales tales como los complejos ADN-liposoma, ADN-polímero, ADN-polímero-liposoma, etc. [véase "Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y Wagner, Academic Press (1999)].

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un inhibidor de Slug en células tumorales en la elaboración de una composición para aumentar la radiosensibilidad de células tumorales que expresan Slug o en la elaboración de una composición para el tratamiento del cáncer, en particular, de células tumorales que expresan Slug. En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica. Ejemplos ilustrativos de células tumorales que expresan Slug incluyen, entre otras, células de leucemias y de tumores sólidos, por ejemplo, leucemias mieloides agudas, células leucémicas con la translocación t(17;19), sarcomas, por ejemplo, células de rabdomiosarcoma que expresan la traslocación PAX3-FKHR, células que expresan BCR-ABL, cáncer de pulmón de células pequeñas, tumores ginecológicos, carcinomas de mama, tumores colónicos derivados de células intersticiales de Cajal (un tipo de células dependiente del SCF), etc. Por tanto, dicho inhibidor de Slug podría ser utilizado en el tratamiento de dichos tumores y cánceres, por ejemplo, como coadyuvante en el tratamiento de dichos tumores y cánceres por radioterapia.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación ("screening") de un compuesto capaz de reducir la transcripción y/o traducción del gen Slug que comprende ensayar dicho compuesto en un sistema celular que expresa el gen Slug y evaluar el efecto de dicho compuesto sobre la transcripción y/o traducción de dicho gen.

La invención se relaciona, en otro aspecto, con un método para la identificación de un compuesto potencialmente útil para el tratamiento del cáncer, en particular de células tumorales que expresan Slug, que comprende ensayar dicho compuesto en un sistema celular que expresa el gen Slug, evaluar el efecto de dicho compuesto sobre la transcripción o traducción de dicho gen y/o sobre sus productos de transcripción o expresión, y seleccionar los compuestos con capacidad para interferir con la función Slug a nivel de ácido nucleico o de proteína.

Dicho sistema celular que expresa el gen Slug utilizado bien para identificar un compuesto capaz de reducir la transcripción y/o traducción del gen Slug o bien para identificar un compuesto potencialmente útil para el tratamiento del cáncer, puede ser una célula, normal o tumoral, que expresa dicho gen Slug de forma nativa o bien una célula que no expresa dicho gen Slug de forma nativa pero que ha sido transformada con una construcción de ADN o con un vector que contiene la secuencia del gen Slug y lo expresa. En una realización particular, dicho sistema celular que expresa el gen Slug se selecciona entre una célula normal de mamífero y una célula tumoral de mamífero que expresan dicho gen Slug.

La evaluación del efecto del compuesto a ensayar sobre la transcripción o traducción del gen Slug y/o sobre sus productos de transcripción o expresión para, por ejemplo, seleccionar los compuestos con capacidad para interferir con la función Slug a nivel de ácido nucleico o de proteína puede realizarse por métodos convencionales.

En general, la expresión del gen Slug puede ser evaluada por cualquier método convencional apropiado, por ejemplo, determinando el nivel de ARNm correspondiente al gen Slug (ARNm), o bien determinando el número de copias de gen Slug producidas. En el sentido utilizado en esta descripción, "determinar el nivel de ARNm" incluye cualquier método que permite medir o estimar cualitativa o cuantitativamente el nivel de ARNm que se puede traducir en la proteína Slug en las células de una muestra de ensayo bien directamente o bien relativamente comparándolo con el nivel de ARNm de Slug en las células de una muestra de control. Asimismo, "determinar el número de copias de gen Slug producidas" incluye cualquier método que permite medir o estimar cualitativa o cuantitativamente el número de copias producidas del gen Slug en células de una muestra de ensayo bien directamente o bien relativamente comparándolo con el número de copias del gen Slug producidas en células de una muestra de control. La determinación del número de copias del gen Slug puede realizarse por cualquier método convencional apropiado, por ejemplo, visualizando fragmentos dobles extracromosómicos [extrachromosomal double minutes (dmin)] o regiones de tinción homogéneamente integradas [integrated homogeneously staining regions (hsrs)] (Gebhart et al., Breast Cancer Res. Treat. 8:125 (1986); Dutrillaux et al., Cancer Genet. Cytogenet. 49:203 (1990)), mediante técnicas de hibridación utilizando sondas apropiadas obtenidas por métodos convencionales a la vista de la secuencia de nucleótidos del gen Slug, etc. Asimismo, el nivel de ARNm de Slug puede determinarse por cualquier método convencional apropiado, por ejemplo, mediante análisis Northern blot (Harada et al., Cell 63:303-312 (1990)), mapeo con la nucleasa Si (Fujita et al., Cell 49:357-367 (1987)), reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (patentes norteamericanas US 4.683.195, US 4.683.202, US 4.965.188), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) (Makino et al., Technique 2:295-301 (1990)), técnicas de hibridación, microarrays (Wooster R., Trends in Genetics 16:327-329 (2000)), etc.

Por otra parte, la expresión de la proteína Slug puede ser evaluada por cualquier método convencional apropiado, por ejemplo, mediante técnicas basadas en el empleo de anticuerpos, técnicas basadas en el diagnóstico por imagen in vivo, citometria de flujo, proteómica, etc. A modo ilustrativo, la expresión de la proteína Slug puede ser estudiada mediante un ensayo Western blot o dot/slot (Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)), mediante inmunoensayos, tales como ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima) o RIA (radioinmunoensayo). Adicionalmente, la expresión de la proteína Slug puede ser detectada in vivo mediante técnicas de diagnóstico por imagen mediante el empleo de anticuerpos anti-Slug unidos a marcadores apropiados, por ejemplo, marcadores detectables por rayos X, resonancia magnética nuclear (RMN), etc. Una revisión del diagnóstico por imagen de tumores puede encontrarse en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer (S.W. Burchiel & B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)). Otros métodos para determinar la expresión de Slug incluyen la citometria de flujo (Ward M.S., Pathology 31:382-392 (1999), proteómica (Pandey M. & Mann M., Nature 405:837-846 (2000); Chambers et al., J. Pathol. 192:280-288 (2000), etc.

2. Aumento de la radioresistencia de células normales

La invención también se relaciona, por otra parte, con el empleo del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, y compuestos que estimulan o activan la expresión de Slug para conferir radioprotección o radioresistencia a células normales o sanas, las cuales pueden, o no, expresar Slug. Asimismo, la invención también se relaciona con el empleo del gen Slug, sus productos de transcripción o traducción, en la búsqueda de compuestos que aumentan o activan la expresión del gen Slug, los cuales actúan como radioprotectores de las células normales y pueden ser utilizados en el tratamiento del cáncer.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un compuesto seleccionado entre un ácido nucleico que codifica para la proteína Slug, una proteína Slug, un estimulador de Slug y sus mezclas, en la elaboración de una composición farmacéutica que confiere radioprotección o radioresistencia a células normales. Tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "ácido nucleico que codifica para la proteína Slug" incluye al ADN genómico (ADNg), ADN copia o complementario (ADNc) o ARN mensajero (ARNm) que contienen la secuencia codificante de la proteína Slug. El término "proteína Slug" incluye a cualquier proteína Slug independientemente de su origen; preferentemente, dicha proteína Slug es una proteína Slug de origen murino o humano. Asimismo, el término "estimulador de Slug", tal como aquí se utiliza, se refiere a un compuesto que aumenta o activa la expresión del gen Slug, por ejemplo, en células normales que expresan dicho gen, así como a compuestos, composiciones o construcciones que contienen la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína Slug para su expresión en células que no lo expresan de forma nativa. Dicho estimulador de Slug puede actuar estimulando bien la transcripción de dicho gen o bien la traducción de su mensajero. El término "célula normal o sana", se utilizan indistintamente en esta descripción para referirse a una célula que no tiene alterado su ciclo de vida por ninguna alteración patológica. Dichas células normales o sanas pueden expresar, o no, Slug. Ejemplos de células normales que expresan Slug incluyen entre otras, células madre hematopoyéticas, células precursoras neuronales, etc. [WO 02/059361].

En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica para la proteína Slug, una proteína Slug, un estimulador de Slug, o sus mezclas, en una cantidad terapéuticamente eficaz, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En una realización concreta, dicha composición farmacéutica comprende un ácido nucleico que codifica para la proteína Slug, una proteína Slug o sus mezclas. Dicho ácido nucleico que codifica para la proteína Slug así como dicha proteína Slug pueden obtenerse por técnicas convencionales de ingenieria genética [PCT/ES02/00520].

En otra realización concreta, dicha composición farmacéutica comprende uno o más estimuladores de Slug, es decir, uno o más compuestos capaces de estimular la expresión del gen Slug en células normales por lo que es útil para proteger dichas células, por ejemplo, células hematopoyéticas normales, frente a la irradiación, por ejemplo, frente a la radiación ionizante, de manera que, al sobreexpresar dicha proteína Slug aumenta la resistencia de dichas células normales a la irradiación. Como consecuencia de ello, el fracaso de la radioterapia se reduce ya que disminuye la toxicidad asociada con la radioterapia sobre las células normales o bien se pueden administrar dosis mayores de radioterapia. Los compuestos que estimulan o activan la expresión de Slug (estimuladores de Slug) pueden obtenerse por técnicas convencionales que comprenden, por ejemplo, la preparación de construcciones de ADN que comprenden el gen Slug o ADNc de dicho gen Slug, y un gen delator que cuando se pone en contacto con el compuesto a ensayar permite determinar si dicho compuesto activa la expresión del gen Slug. A modo ilustrativo, dicho gen delator puede ser el gen que codifica para una proteína para la que se dispone de anticuerpos específicos, o una proteína con actividad enzimática, por ejemplo, fosfatasa alcalina, [i-glucoronidasa, GFP, etc., detectándose dicha actividad mediante la adición del sustrato o sistema de revelado correspondiente [PCT/ES02/00520].

Los excipientes que pueden estar presentes en la composición farmacéutica de la invención dependerán, entre otras cosas, de la forma de administración de dicha composición farmacéutica. Una revisión de las distintas formas de administración de principios activos, de los excipientes a utilizar y de sus procedimientos de fabricación puede encontrarse en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, SA. de Ediciones, 1993.

La composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede prepararse en prácticamente cualquier forma de administración; no obstante, en una realización particular, dicha composición farmacéutica es una composición destinada a su administración por vía intravenosa (i.v.) o intraperitoneal (i.p.). En otra realización particular, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención es una composición destinada para su empleo en terapia génica que comprende un vector, viral o no viral, y un inhibidor de Slug.

En general, cuando la composición farmacéutica comprende el gen Slug o sus productos de transcripción o expresión, dicha composición farmacéutica comprenderá unos vectores o sistemas que ayudan al proceso de transferencia de un gen exógeno a una célula, facilitando la entrega y biodisponibilidad intracelular del mismo de tal modo que éste pueda funcionar correctamente. A modo ilustrativo, dichos vectores pueden ser vectores virales, por ejemplo, basados en retrovirus, adenovirus, etc., o no virales tales como los complejos ADN-liposoma, ADN-polímero, ADN-polímero-liposoma, etc. [véase "Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y Wagner, Academic Press (1999)].

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un compuesto seleccionado entre un ácido nucleico que codifica para la proteína Slug, una proteína Slug, un estimulador de Slug y sus mezclas, en la elaboración de una composición para proteger células normales frente a la irradiación, o en la elaboración de una composición para aumentar la radioresistencia de células normales o en la elaboración de una composición para el tratamiento del cáncer. En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica. En general, dicha irradiación es una radiación ionizante, tal como una radiación \gamma, del tipo utilizado habitualmente en radioterapia. Por tanto, el ácido nucleico que codifica para la proteína Slug, la proteína Slug y dicho estimulador de Slug pueden ser utilizados en el tratamiento de tumores y cánceres, por ejemplo, como coadyuvante en el tratamiento de dichos tumores y cánceres por radioterapia; ventajosamente, dicho ácido nucleico que codifica para la proteína Slug, la proteína Slug y dicho estimulador de Slug pueden ser utilizados en el tratamiento de tumores y cánceres de tejidos cuyas células normales expresan Slug.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de un compuesto capaz de aumentar o activar la expresión del gen Slug en un sistema celular que comprende ensayar dicho compuesto en un sistema celular que expresa el gen Slug y evaluar el efecto de dicho compuesto sobre la transcripción y/o traducción de dicho gen.

La invención se relaciona, en otro aspecto, con un método para la identificación de un compuesto potencialmente útil para el tratamiento del cáncer que comprende ensayar dicho compuesto en un sistema celular que expresa el gen Slug, evaluar el efecto de dicho compuesto sobre la expresión de dicho gen, y seleccionar los compuestos con capacidad para aumentar la expresión del producto del gen Slug.

Dicho sistema celular que expresa el gen Slug utilizado bien para identificar un compuesto capaz de aumentar la expresión del gen Slug o bien para identificar un compuesto potencialmente útil para el tratamiento del cáncer, puede ser una célula, normal o tumoral, que expresa dicho gen Slug de forma nativa o bien una célula que no expresa dicho gen Slug de forma nativa pero que ha sido transformada con una construcción de ADN o con un vector que contiene la secuencia del gen Slug y lo expresa. En una realización particular, dicho sistema celular que expresa el gen Slug es una célula normal de mamífero que expresa Slug [WO 02/059361].

El aumento en la expresión de Slug puede ser debido bien a un incremento en la transcripción del gen Slug, bien a un aumento en la traducción de su mensajero o bien a una combinación de ambos efectos, e incluye, por tanto, la amplificación del gen Slug como su sobreexpresión así como la expresión en sistemas celulares que no lo expresan de forma nativa. La expresión del gen Slug y de la proteína Slug puede ser evaluada por cualquier método convencional apropiado tal como se ha mencionado previamente [véase lo relativo a la evaluación del efecto de los compuestos a ensayar sobre la transcripción o traducción del gen Slug y/o sobre sus productos de transcripción o expresión para seleccionar los compuestos con capacidad para interferir con la función Slug a nivel de ácido nucleico o de proteína].

3. Ejemplos

La invención se ilustra a continuación mediante un ejemplo que pone de manifiesto que la función biológica de radioresistencia de la vía de transducción de señales del SFC/c-kit es mediada por el factor de transcripción Slug. Dado que las mutaciones en los genes SCF, c-kit y Slug tienen un fenotipo similar que afecta a la hematopoyesis y como la radiosensibilidad es una anomalía fenotípica característica observada en los mutantes S1 y W in vivo [Harrison DE et al., Br. J. Haematol 1972; 22:155-168; Kaczmarek L et al., Int. J. Radiot. Biol. 1988; 53:703- 708], se ha examinado si Slug podría complementar la radiosensibilidad de ratones kit deficientes. Se ha encontrado que la ausencia de Slug aumenta la radiosensibilidad y que este efecto no se puede recuperar tratando ratones Slug mutantes sometidos a dosis de radiación letales con estimulación SCF de la recuperación hematopoyética. Por el contrario, se puede complementar el fallo hematopoyético que sigue al daño en el ADN tras radiación \gamma en ratones c-kit deficientes transduciéndoles con una proteína TAT-Slugh. Por tanto, dicho ejemplo ilustra, entre otras cosas, que la adición de Slug a células radiosensibles aumenta la radioresistencia de dichas células.

I. Materiales y métodos Cultivos celulares

Las células Ba/F3 [Palacios y Steinmetz, Cell 41:727 (1985)] se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de suero de ternera fetal (FCS). Cuando fue necesario, se añadió un 10% de medio acondicionado con WEHI-3B como fuente de EL-3 (interleucina-3). Alternativamente, dichas células Ba/F3 pueden obtenerse tal como se describe en PCT/ES02/00520.

Ratones

Se han descrito ratones heterocigóticos y homocigóticos para la mutación Slugh^{\Delta 1} obtenidos por eliminación de las secuencias genómicas de la región codificante de la proteína Slugh completa (ratones mutantes Slugh^{\Delta 1}) (18). Los ratones kit mutantes (W/W^{v}) y sus parejas para la reproducción se obtuvieron de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, Estados Unidos). Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidados Animales. Los ratones fueron irradiados con varias dosis, usando una fuente de cesio, siendo el intervalo entre dosis de igual intensidad de 4 horas. A los ratones se les inyectó SCF (SIGMA) por vía intravenosa (i.v.) en la vena de la cola en una dosis de 100 \mug/kg o solución salina que contenía suero bovino fetal al 0,1% (excipiente para las diluciones de SCF) en diferentes intervalos de tiempo. Todos los animales tratados se mantuvieron en jaulas de microaislamiento recibiendo alimento esterilizado y agua estéril acidificada. Diariamente durante 30 días se registró el número de ratones supervivientes.

Análisis de la médula ósea

Se sembraron células de médula ósea (0,25-1,0 x 10^{5} células/placa) aisladas de ratones Slug normales y Slug mutantes en placas de cultivo semisólido sin FBS (Stem Cell Technologies). El crecimiento de las colonias se estimuló con las siguientes combinaciones de factores de crecimiento recombinantes:

-

factor de células madre de rata (100 ng/ml; SIGMA), interleuquina-3 de ratón (10 ng/ml; SIGMA) y EPO humana (2 U/ml; ROCHE) para el crecimiento de la unidad formadora de brotes eritroides (BFU-E);

-

el crecimiento de las colonias derivadas de la unidad formadora de colonias eritrocitarias (CFU-E) se estimuló sólo con EPO humana (2 U/ml); y

-

el crecimiento de las colonias mieloides (CFU-GM) se estimuló con GM-CSF murino recombinante (10 ng/mg; SIGMA) en presencia o en ausencia de SCF (100 ng/ml; SIGMA).

Los cultivos se incubaron a 37ºC en un incubador humidificado que contenía CO_{2} al 5% en aire y se hizo el recuento durante 3 días (para las colonias derivadas de la CFU-E) o durante 7 días (para GM-CSF y las colonias derivadas de la BFU-E) tras la iniciación del cultivo. La frecuencia de las colonias se determinó en cultivos por triplicado.

Análisis de sangre periférica

Se extrajeron muestras de sangre periférica en tubos que contenían EDTA por sangrado retro-orbital y se sometieron a un recuento completo de células sanguíneas para determinar la cifra de eritrocitos, leucocitos, el hematocrito y el número de plaquetas. Para los hemocultivos, la sangre se recogió en jeringas estériles de insulina de 1 ml recubiertas con 70 µl de una solución de citrato trisódico al 3,8% (usada como anticoagulante que no inhibe el crecimiento aeróbico). Se inoculó una alícuota (0,1 ml) de sangre en los tubos que contenían (i) caldo de soja tripticasa o (ii) medio de tioglicolato fluido y se incubaron a 35ºC durante 7 días, tiempo tras el cual se determinó la presencia de bacterias utilizando técnicas convencionales.

Parámetros bioquímicos séricos

Se recogió el suero total sin añadir anticoagulantes y se calcularon los parámetros bioquímicos usando un analizador de parámetros bioquímicos automático (Beckman). Se analizaron en 10 animales por grupo y por día los valores del nitrógeno ureico en sangre, potasio, glucosa, albúmina, proteínas totales y creatinina.

Transducción de TAT-Slugh en ratones

A ratones mutantes Slug -/- y kit (W/W^{v}) (de 8 semanas de edad) se les inyectó por vía i.p. 250 µg de la proteína de fusión TAT-Slugh o de la proteína TAT en 500 Al de tampón fosfato salino (PBS). Los ratones tratados fueron irradiados y analizados tal como se ha descrito previamente.

La fusión genética TAT-Slugh se generó insertando ADN que contenía el marco de lectura abierto (ORF) de Slug en el plásmido pTAT-HA (Nagahara et al., 1998) y posterior transferencia a bacterias BL21(DE3)LysS. Tanto la proteína TAT como la proteína de fusión TAT-Slugh fueron purificadas mediante un procedimiento ya descrito (Nagahara et al., 1998) por sonicación en urea 8 M seguido de pases a través de una columna Ni-NTA (Qiagen) y de una columna PD-10 (Amersham Pharmacia) en PBS para eliminar las sales, procediéndose seguidamente a congelar las proteínas purificadas en presencia de glicerol y almacenarlas a -80ºC.

Marcaje de células

Las células Ba/F3 transducidas con la proteína de fusión TAT-Slugh fueron analizadas mediante marcaje por inmunofluorescencia tal como se describe a continuación. Las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% (pip) durante 15 minutos, lavadas con PBS y permeabilizadas con metanol durante 2 minutos. Después de bloquear con FCS al 5% en PBVS durante 30 minutos se utilizó el anticuerpo monoclonal anti-HA (12CA5) para detectar las células transducidas. Las células fluorescentes fueron visualizadas mediante microscopía epifluorescente. Las imágenes se registraron mediante el empleo de un microscopio de barrido confocal.

Inmunoblot

Se recogieron células de médula ósea a partir de la cavidad medular de los fémures de los ratones. Los ensayos Western blot se realizaron utilizando extractos de 1x10^{7} células de méduloa ósea o de células Ba/F3 por calle. La proteína p53 de ratón fue detectada utilizando el anticuerpo FL-393 (Santa Cruz), la proteína de fusión TAT-Slugh fue detectada utilizando el anticuerpo monoclonal anti-HA (12CA5). El anticuerpo policlonal C-11 (Santa Cruz) fue utilizado para detectar actina.

Análisis del ADN

Se aisló ADN de bajo peso molecular tal como se indica a continuación. Las células se recogieron en 1,5 ml de medio de cultivo, se microcentrifugaron durante 1 minuto a 1.500 rpm (400 x g) y los sedimentos se suspendieron en 300 \mul de tampón de proteinasa K. Después de un periodo de incubación de una noche a 55ºC, el ADN se precipitó con etanol, se suspendió en 200 \mul de tampón TE que contenía 50 µg/ml de RNasa A y se incubó a 37ºC durante 2 h. El ADN se extrajo con fenol y cloroformo y se precipitó con etanol. Alícuotas de ADN (2 µg) fueron marcadas en sus extremos con \alpha32-dCTP y se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 2%. Después de la electroforesis, el gel se transfirió a Hybond-N (Amersham) y se autorradiografió durante 2 h a -70ºC.

II. Resultados Potencial radioprotector de células Slug deficientes en respuesta a la radiación \gamma

Células de médula ósea Slug deficientes fueron analizadas funcionalmente in vivo tras haber inducido daño en el ADN por radiación \gamma. Inicialmente, se irradiaron ratones Slug +/+, +/- y -/- con varias dosis que oscilaban entre 100 y 1.200 rads (1 rad = 0,01 Gy) para determinar una dosis letal (DL) de irradiación para los ratones Slug usados en estos estudios. El 50% de los ratones Slug -/- sobrevivió durante 30 días tras recibir una dosis de irradiación de 275 rads (DL_{50/30}). De manera similar, la DL_{90/30} se obtuvo con 300 rads y la DL_{100/30} se obtuvo con 350 rads (Figura 1). Sin embargo, la DL100130 de sus homólogos congénicos (ratones Slug +/+) estaba comprendida entre 1.100 y 1.150 rads. Por tanto, los estudios posteriores se llevaron a cabo aplicando 350 rads para obtener una dosis letal de irradiación para los ratones Slug deficientes.

Como la pérdida de función heterocigótica de Slug produce anomalías fenotípicas, se ha determinado la dosis letal de irradiación para ratones Slug +/-. La DL_{100/30} de los ratones Slug +/- se obtuvo con 1.100 rads (Figura 1), siendo similar a la DL_{100/30} de sus homólogos congénicos Slug +/+. Estos resultados indican que una mutación con resultado de pérdida de función de Slug en un alelo no produce un aumento en la radiosensibilidad.

Para determinar si la recuperación hematopoyética era crucial para recuperar las dosis de irradiación, se trasplantaron células de médula ósea procedentes de donantes singénicos normales a los ratones Slug -/- y a los ratones Slug +/- irradiados con 350 y 1.100 rads, respectivamente. A las 4 horas posteriores a la irradiación, la inyección por vía i.v. de células de médula ósea supuso la supervivencia del 100% de los ratones sometidos a ambas dosis de irradiación, en comparación con el 0% de supervivencia de los animales control que no recibieron el trasplante de médula ósea. Los datos de los parámetros bioquímicos séricos no mostraron diferencias significativas, lo que sugiere que no había insuficiencias orgánicas principales que pudieran ser las responsables de las diferencias en las supervivencias de ambos grupos. Los hemocultivos de sangre periférica detectaron la presencia de bacterias intestinales en 10 de los 10 ratones que no habían recibido el transplante de médula ósea, en comparación con ninguno de los 9 ratones a los que se les había efectuado un transplante de médula ósea.

Activación normal de p53 en células de médula ósea Slug deficientes en respuesta a daño en el ADN

Se ha encontrado que las células de médula ósea Slug deficientes son radiosensibles a danos en el ADN inducidos por radiación \gamma. La proteína p53 está implicada en la respuesta celular a la irradiación [Lee et al., Oncogene, 1994, 9:3731-3736]. La exposición a una radiación ionizante provoca un incremento en los niveles intracelulares de p53 [Kastan et al., Cancer Res., 1991, 51:6304-6312]. Por tanto, se estudió si el potencial radioprotector de Slug se basaba en una interferencia con la activación de p53. Tal como se muestra en la Figura 2, se midieron los niveles de p53 a diferentes tiempos en células de médula ósea procedentes de ratones Slug -/- y Slug +/+ después de haber inducido daño en el ADN por radiación \gamma. La activación de p53 en células control y en células Slug deficientes fue similar (Figura 2), lo que indica que la regulación de p53 en respuesta al daño causado en el ADN no se ve afectada en células Slug deficientes. Estos resultados están de acuerdo con datos previos [Inoue et al., Cancer Cell, 2002, 2:279-285] y sugieren que Slug no necesita p53 para su función radioprotectora.

Papel de SCF en la recuperación hematopoyética de ratones Slug deficientes irradiados con dosis letales

Se ha encontrado potencial radioprotector únicamente en células de médula ósea tipo salvaje mientras que células de médula ósea Slug deficientes no protegían de la irradiación letal. El potencial radioprotector en ratones está sujeto a la modulación por interacciones SCF/c-kit. El tratamiento de ratones irradiados con SCF tiene como consecuencia un aumento de la supervivencia, en comparación con los controles irradiados [Zsebo KH et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993; 89:9464-9468; Neta R et al., Blood, 1993; 81:324-327]. Como la radioprotección por parte del SCF se hace evidente tras inyección por ambas vías de administración, tanto por vía i.p como por vía i.v., del rSCF en ratones (14), se utilizó la vía i.v. en estos experimentos. La combinación del pre y post-tratamiento con SCF (-20, -2, y + 4 h) dio como resultado un 100% de supervivencia de ratones Slug +/+ y +/- irradiados con 1.100 rads (Tabla 1). La Tabla 1 muestra el efecto del SCF sobre la supervivencia de los ratones irradiados con LD_{100/30}.

TABLA 1 Efecto del SCF sobre la supervivencia de ratones irradiados con LD_{100/30}

Genotipo	Tratamiento	Muertos/Total	Supervivencia (%)
Slug -/-	Excipiente	40/40	0
Slug -/-	SCF	40/40	0
Slug +/-	Excipiente	40/40	0
Slug +/-	SCF	0/40	100
Slug +/+	Excipiente	40/40	0
Slug +/+	SCF	0/40	100
\begin{minipage}[t]{153mm}El excipiente o el SCF fue inyectado por vía i.v. a las 20 h y 2 h antes de la irradiación y 4 h después de la última dosis de irradiación. Los ratones Slug -/- fueron irradiados con 350 rads y los ratones Slug +/+ y +1- con 1.100 rads. Los resultados presentados corresponden a 40 ratones de cada grupo.\end{minipage}

Para determinar hasta qué punto el SCF podría proteger a los ratones Slug -/- frente a una irradiación que en otras circunstancias seria letal, los ratones Slug -/- se irradiaron con 350 rads y se les inyectó SCF o un excipiente. El día 30, ninguno de los animales Slug -/- había sobrevivido (supervivencia 0%). Por el contrario, ninguno de los animales Slug +/+ y +/- murieron después de la irradiación y los animales seguían vivos después de los 30 días del periodo de estudio. Las poblaciones celulares de la médula ósea, incluyendo CFU-GM, CFU-E y BFU-E, nunca experimentaron una recuperación en ratones Slug -/- tratados con SCF (Figura 3). El día 3 después de la irradiación, las poblaciones celulares de la médula ósea disminuyeron hasta aproximadamente un 4% de los niveles previos a la irradiación (Figura 3), mientras que los ratones Slug +1- tratados con SCF presentaban un drástico aumento de las poblaciones celulares hacia el día 8 y habían recuperado los niveles anteriores a la irradiación hacia el día 21 (Figura 3). Estos resultados eran concordantes con la hematología de la sangre periférica, que no mostraba diferencias significativas entre los ratones Slug -/- tratados con SCF y no tratados [Pérez-Losada et al., Blood, 2002, 100:1274-1286], no observándose el aumento esperado en la cifra de eritrocitos, leucocitos y plaquetas durante las 2-3 semanas post-irradiación.

Rescate de la aplasia inducida por irradiación letal en ratones kit mutantes por TAT-Slugh

Slug es una diana molecular aguas abajo de la vía de señalización SCF/c-kit, por lo que se exploró si el factor Slug podría estar implicado en la defensa frente al fallo hematopoyético inducido por irradiación en ratones kit mutantes. Como no se disponía de mecanismos farmacológicos para activar Slug, se procedió a la transducción de Slug: TAT-Slugh (Figura 4A). Se generó una proteína de fusión TAT-Slugh en el extremo amino terminal (Nagahara et al., 1998). El análisis por inmunoblot y el análisis microscópico reveló que la proteína de fusión TAT-Slugh era transducida rápidamente en células cultivadas alcanzando concentraciones intracelulares máximas en menos de 20 minutos (Figuras 4B-4D).

A continuación, se inyectó por vía i.p. la proteína TAT-Slugh en ratones Slug -/- (Schwarze et al., Science, 1999, 285:1569-1572]. El análisis por inmunoblot de células de médula ósea aisladas 120 minutos después de la inyección i.p. puso de manifiesto la presencia de la proteína TAT-Slugh alcanzando concentraciones máximas tras la inyección de 250 µg de la proteína TAT-Slugh (Figura 4E). Para ensayar el efecto de la proteína TAT-Slugh en ratones Slug deficientes irradiados con una dosis letal, se administró una única dosis de 250 µg de proteína TAT-Slugh inmediatamente después de la irradiación letal. Los 10 ratones Slug deficientes sobrevivieron tras el tratamiento con la proteína TAT-Slugh mientras que no sobrevivió ninguno de los 10 ratones Slug deficientes tratados con la proteína TAT-control (Figura 4F). Estos resultados ponen de manifiesto que la administración de TAT-Slugh puede complementar completamente la recuperación de la aplasia inducida por irradiación de una dosis letal en ratones Slug deficientes.

Seguidamente, se ensayó el efecto de TAT-Slugh en ratones kit deficientes irradiados mediante la administración de una dosis única de 250 µg de la proteína TAT-Slugh inmediatamente después de la administración de la dosis letal de irradiación. Los 10 ratones kit deficientes sobrevivieron tras el tratamiento con la proteína TAT-Slugh mientras que no sobrevivió ninguno de los 10 ratones kit deficientes tratados con la proteína TAT-control (Figura 4F). La proteína TAT-Slugh protegió a las células de médula ósea kit deficientes de la apoptosis tras irradiación con la dosis letal (Figura 5A). Las poblaciones celulares de la médula ósea de ratones kit deficientes tratados con TAT-Slugh se recuperaron y casi volvieron a los niveles anteriores a los de la irradiación. Estos resultados fueron concordantes con la hematología de la sangre periférica (Figura 5B). Por tanto, TAT-Slugh parece proteger ratones kit mutantes de la irradiación a dosis letales, lo que indica que Slug media el potencial radioprotector de la vía de señalización SCF/c-kit.

III. Discusión La función radioprotectora de la vía de señalización de SCF/c-kit es mediada por el factor Slug

Los acontecimientos biológicos controlados por la vía de transducción de señales de SCF/c-kit están involucrados en la generación y migración de las células madre hematopoyéticas. Ahora se ha investigado si la supervivencia a la irradiación letal gobernada por la vía de señalización de SCF/c-kit está mediada por el factor de transcripción Slug. Según esto, como la ausencia de Slug altera el desarrollo de las células madre hematopoyéticas, al igual que las mutaciones en los locus W o S1, y como los genes Kit y Slug modulan de forma coordinada el desarrollo y supervivencia de melanocitos y líneas hematopoyéticas en ratones kit deficientes y Slug deficientes [Pérez-Losada et al., Blood, 2002, 100:1274-1286; Sánchez- Martín et al., Hum. Mol. Genet., 2002, 11:3231-3236], se procedió a analizar, en primer lugar, si la ausencia de Slug producía un aumento en la radiosensibilidad. Los datos aquí presentados demuestran claramente que los ratones mutados en el locus Slug son radiosensibles. Estos resultados confirman que Slug es absolutamente necesario para la supervivencia a la irradiación letal de los ratones no manipulados. Como los ratones Slug mutantes tienen una vía de transducción de las señales de SCF/c-kit normal, se ha demostrado también que la activación del c-kit por el SCF no puede recuperar específicamente este efecto en los ratones Slug mutantes. Por el contrario, se pudo complementar el fallo hematopoyético tras dañar el ADN por radiación -y en ratones c-kit deficientes transduciéndoles con la proteína TAT-Slugh, lo que demuestra que la estimulación por parte del SCF de la recuperación hematopoyética tras la irradiación letal está mediada por el factor Slug.

Estos hallazgos son congruentes con el modelo propuesto por los inventores y según el cual las células madre que llevan el receptor c-kit expresarian el factor Slug, promoviendo así la supervivencia de la célula, dependiendo de la señal externa requerida (SCF) y permitiendo a las células migrar fuera de su entorno normal. Si esto no se consigue en un periodo específico de tiempo, experimentarian apoptosis, ya que se verian privadas de las señales externas requeridas para mantener la expresión del factor Slug.

Importancia de la radiorresistencia dependiente de Slug en el tratamiento del cáncer

Los resultados obtenidos muestran que la radiorresistencia conferida a las células HSC por la vía de señalización de SCF/c-kit está mediada por el factor Slug. El receptor c-kit está involucrado tanto en leucemias como en tumores sólidos. Se han descrito mutaciones que tienen como consecuencia la activación constitutiva del c-kit en las leucemias mieloides agudas, en el cáncer de pulmón de células pequeñas, en tumores ginecológicos, en carcinomas de mama y en tumores colónicos derivados de células intersticiales de Cajal (un tipo de células dependiente del SCF). Por tanto, la activación constitutiva de c-kit podría conferir propiedades de radiorresistencia a las células tumorales. Además, los hallazgos más recientes han mostrado que el factor Slug también se expresa en células leucémicas con la translocación t(17;19), en células de rabdomiosarcoma que expresan la traslocación PAX3-FKHR y en células que expresan BCR- ABL. Por lo tanto, el factor Slug podría ser un componente común que proporciona radiorresistencia a las células tumorales y, como tal, podría, por lo tanto, constituir una diana atractiva en el tratamiento del cáncer humano.

Claims (9)

1. Empleo de un inhibidor de Slug en la elaboración de una composición farmacéutica para aumentar la radiosensibilidad de células tumorales que expresan Slug o en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.

2. Empleo según la reivindicación 1, en donde dicho inhibidor de Slug es un compuesto con capacidad para interferir con la función Slug a nivel de ácido nucleico o proteína.

3. Empleo según la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho inhibidor de Slug se selecciona entre una proteína, un péptido, un oligonucleótido antisentido, una ribozima, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

4. Empleo según la reivindicación 1, en donde dicho cáncer comprende células tumorales que expresan Slug.

5. Empleo según la reivindicación 4, en donde dichas células tumorales que expresan Slug comprenden células de leucemias o de tumores sólidos.

6. Empleo según la reivindicación 1 ó 5, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de leucemias mieloides agudas, células leucémicas con la translocación t(17;19), sarcomas, células de rabdomiosarcoma que expresan la traslocación PAX3-FKHR, células que expresan BCR-ABL, cáncer de pulmón de células pequeñas, tumores ginecológicos, carcinomas de mama o tumores colónicos derivados de células intersticiales de Cajal.

7. Empleo de un compuesto seleccionado entre un ácido nucleico que codifica para la proteína Slug, una proteína Slug, un estimulador de Slug y sus mezclas, en la elaboración de una composición farmacéutica que confiere radioprotección o radioresistencia a células normales o en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.

8. Empleo según la reivindicación 7, en donde dicho ácido nucleico que codifica para la proteína Slug comprende ADNg, ADNc o ARNm que contienen la secuencia codificante de la proteína Slug.

9. Empleo según la reivindicación 7, en donde dicho estimulador de Slug comprende un compuesto con capacidad para estimular la expresión del producto del gen Slug en células normales.