ES2252918T3 - Cepa fiv-141 del virus de la inmunodeficiencia felina y sus usos. - Google Patents

Abstract

La presente invención está orientada hacia una nueva cepa del virus de la inmunodeficiencia felina, designada en adelante como FIV-141, y a las formas atenuadas del virus producidas por regiones específicas mutantes del genoma viral. El virus y las formas mutadas del virus se pueden usar para inducir la producción de anticuerpos para el FIV-141, y en vacunas destinadas a la protección de gatos del FIV.

Description

Cepa FIV-141 del virus de la inmunodeficiencia felina y sus usos.

Campo de la invención

La presente invención se dirige a una nueva cepa del virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) y a una variedad de formas mutadas de este virus. Se describen composiciones y procedimientos que pueden usarse en la protección de animales frente a enfermedades asociadas a lentivirus.

Antecedentes de la invención

La infección con el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) en gatos da lugar a un síndrome o enfermedad que es similar al causado en humanos por la infección del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1). La progresión de la enfermedad se inicia con una fase aguda transitoria (8-10 semanas), seguida de una fase asintomática prolongada (que dura de semanas a años) y una fase sintomática terminal (Ishida y col., 1990, Jpn. J. Vet. Sci. 52:645-648). Se ha demostrado que la carga viral en el plasma de gatos infectados está en correlación con la fase de la enfermedad y puede usarse para predecir la progresión de la enfermedad en la infección por VIF acelerada (Diehl y col., 1996, J. Virol. 70:2503-2507).

Estructuralmente, el provirus VIF contiene dos repeticiones terminales largas (LTR), una a cada extremo del genoma (Talbott y col., 1989, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:5743-5747). Hay tres marcos de lectura abierta grandes (Gag (antígenos de grupo); Pol (polimerasa) y ENV (envoltura)) y tres marcos de lectura abierta pequeños (Rev (regulador de la expresión de virión, una proteína que se une a los elementos "RRE" presentes en todos los transcritos virales y promueve su translocación del núcleo al citoplasma de las células hospedadoras infectadas), Vif (factor de infectividad del virión) y ORF(2) (marco de lectura abierta 2)). El polipéptido precursor de Gag del VIF se procesa en tres proteínas estructurales maduras: una proteína de la matriz (MA), una proteína de la cápside (CA) y una proteína de nucleocápside (NC). El gen Pol codifica cuatro proteínas enzimáticas: una proteasa (PR), una transcriptasa inversa (RT), una deoxiuridina trifosfatasa (DU) y una integrasa (IN). Finalmente, el polipéptido precursor ENV se procesa en dos proteínas de la envoltura: una proteína de superficie (SU) y una proteína de transmembrana (TM).

Se han hecho varios intentos para desarrollar una vacuna segura y eficaz frente a VIF. Matteucci encontró que los gatos inoculados con una vacuna convencional de células fijadas estaban protegidos frente a una inoculación con virus homólogo a pesar de una aparente ausencia de anticuerpos neutralizantes tras la vacunación. Se descubrió que la protección tenía corta vida y era difícil de estimular (Matteucci y col., 1996, J. Virol. 70:617-622; Matteucci y col., 1997, J. Virol. 71:8368-8376). Estos resultados pueden contrastar con los de Verschoor, quien no observó protección tras la administración de una vacuna de células fijadas (Verschoor y col., 1995, Vet. Immunol. Immunopathol. 46:139-149).

Otro tipo de vacuna convencional que se ha ensayado comprende el virus VIF inactivado completo. Yamamoto informó que esencialmente más del 90% de los gatos a los que se administraba una vacuna de este tipo mostraban una protección completa frente a la inoculación homóloga y una ligera protección frente a virus heterólogo (Yamamoto y col., 1993, J. Virol. 67:601-605). Se indujo tanto inmunidad humoral como celular frente a VIF y se observaron niveles elevados de anticuerpos anti-ENV, anti-núcleo y neutralizante del virus (VN) en los gatos vacunados. Por el contrario, la vacunación de gatos con VIF completo inactivado, incorporado en complejos de estimulación inmune (ISCOMS) no conseguía proteger a los animales tras la inoculación homóloga (Hosie y col., 1992, Vet. Immunol. Immunopathol. 35:191-197).

Otra aproximación para el desarrollo de vacunas implicaba el uso de vacunas de subunidad que contienen proteína del núcleo recombinante, péptidos V3 sintéticos y proteína ENV recombinante (Elyar y col., 1997, Vaccine 15:1437-1444). Aunque se indujeron niveles significativos de anticuerpos con estas vacunas, no se identificó ninguno que pudiera proteger a los gatos frente a la inoculación de VIF homólogos (Huisman y col., 1998, Vaccine 16:181-187; Flynn y col., 1997, J. Virol. 71:7586-7592; Tijhaar y col., 1997, Vaccine 15:587-596). Los resultados sugieren que probablemente es difícil obtener inmunidad protectiva frente a VIF usando vacunas de tipo de subunidad.

Recientemente, Cuisinier informó de ensayos realizados con una vacuna de ADN frente a VIF (Cuisinier y col., 1997, Vaccine 15:1085-1094). Los gatos se vacunaron con un plásmido que llevaba genes estructurales de VIF, incluyendo ENV y p10. Aunque se observaron respuestas inmunes fuertes, eventualmente, todos los gatos sucumbieron ante inoculaciones homólogas.

Resumen de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el aislamiento y caracterización de una nueva cepa del virus de la inmunodeficiencia felina, denominada en este documento como VIF-141. Se determinó la secuencia genómica completa del virus y es distinta a todas las demás secuencias de VIF conocidas. El plásmido que codifica VIF-141 se depositó como ATCC Nº 203001.

A. Composiciones y procedimientos basados en el virus VIF-141

En este primer aspecto, la presente invención se dirige a un virus VIF-141 sustancialmente purificado que tiene una secuencia genómica que se corresponde con la de la ID SEC Nº 1; a una célula hospedadora infectada con el virus y a la progenie del virus que pueden producirse en las células hospedadoras. La expresión "sustancialmente purificada" significa que VIF-141 se ha separado de todas las demás cepas de virus y, especialmente, de todas las demás cepas de VIF. Las células hospedadoras que pueden usarse para el crecimiento del virus incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC). La progenie del virus puede aislarse usando procedimientos convencionales como se discute a continuación.

El virus VIF-141 de la invención y las células hospedadoras infectadas con el virus puede usarse para infectar animales con el fin de inducir la producción de anticuerpos que reaccionan preferiblemente con una o más cepas de VIF. La "unión preferencial" de anticuerpos, según se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo que tiene una afinidad por VIF al menos 100 veces mayor que por cualquier otro virus o proteína que no sea de VIF. Pueden generarse anticuerpos en cualquiera de los animales normalmente usados para este fin (tales como, por ejemplo, ratones, conejos, cabras u ovejas) pero, preferiblemente, los anticuerpos se obtendrán en gatos domésticos. Cuando se usa el virus para inducir la producción de anticuerpo, si se desea, éste puede inactivarse antes de la infección. Los procedimientos de inactivación pueden implicar el tratamiento del virus con formalina, paraformaldehido, fenol, lactopropionato, luz ultravioleta, calor, psoralenos, complejos de platino, ozono u otros agentes viricidas. Cuando se usan células hospedadoras que expresan VIF-141 para inducir la producción de anticuerpo, las células pueden fijarse antes de la infección. Típicamente, esto implicará el tratamiento de las células con paraformaldehido como se describe en este documento, pero también pueden emplearse otros procedimientos.

En otro aspecto, la invención se dirige a una vacuna con el virus completo que comprende el virus VIF-141 de la invención inactivado. Puede inducirse una respuesta inmune en un gato administrado esta vacuna a una dosis y por una duración suficiente para inducir inmunidad protectora frente a una infección posterior con VIF-141. Típicamente, la vacuna se administrará por vía parenteral dando una o más inoculaciones a intervalos de, por ejemplo dos a ocho semanas. La invención también incluye una vacuna de células fijadas, que comprende una célula hospedadora infectada con el virus VIF-141 de la invención. La administración de esta vacuna seguirá los mismos procedimientos generales usados para la vacuna del virus completo. Pueden usarse procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica para optimizar los protocolos de inmunización.

B. Composiciones y procedimientos basados en el ácido nucleico genómico de VIF-141

En otro aspecto, la presente invención se dirige a una molécula de ácido nucleico (ADN o ARN) sustancialmente purificada que tiene una secuencia que se corresponde con la ID SEC Nº 1. Según se uso en este contexto, "sustancialmente purificada" significa que el producto deseado está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes. Típicamente, un ácido nucleico "sustancialmente puro", comprenderá al menos el 85% de una muestra, prefiriéndose porcentajes mayores. Los contaminantes pueden incluir proteínas, hidratos de carbono o lípidos. Un procedimiento para determinar la pureza de un ácido nucleico es la electroforesis de una preparación en una matriz tal como poliacrilamida o agarosa. La pureza se pone de manifiesto por la aparición tras la tinción de una única banda. Otros procedimientos para valorar la pureza incluyen cromatografía y centrifugación analítica. Puede usarse el ácido nucleico de VIF-141, en lugar del virus completo, para transfectar a las células hospedadoras y, de ese modo, inducir la producción de una progenie de virus o de proteínas virales.

Las células hospedadoras transfectadas con el ADN genómico de VIF-141 de la invención también puede usarse en una vacuna para inmunizar gatos. Si se desea, pueden fijarse estas células para reducir la infectividad viral, por ejemplo, mediante tratamiento con un agente tal como paraformaldehido. Las vacunas hechas de esta manera pueden usarse para inducir una respuesta inmune en un gato. La vacuna puede administrarse usando un protocolo de inmunización convencional optimizado para la inducción de inmunidad protectora frente a la infección posterior con VIF-141 o, si se desea, cualquier otra cepa de VIF.

C. Virus y vacunas de VIF-141 atenuado

Antes de que pueda administrarse un virus completa a un animal como vacuna, ha de convertirse en una forma no patogénica. Como se ha discutido anteriormente, esto puede conseguirse inactivando el virus o fijando las células hospedadoras. Un procedimiento alternativo implica la introducción de mutaciones en el virus para transformarlo en una forma atenuada. La expresión "virus atenuado", según se usa en este contexto, se refiere a un virus que tiene una infectividad sustancialmente reducida en comparación con su equivalente de tipo silvestre. La infectividad puede medirse en PBMC, como se describe a continuación en la sección de Ejemplos de este documento.

De este modo, la invención se dirige a un virus VIF-144 atenuado con una secuencia de ácido nucleico genómico que se corresponde con la ID SEC Nº 1, que muestra una infectividad significativamente reducida para los linfocitos T felinos en relación con el virus de tipo silvestre (es decir, no mutado). El virus atenuado se produce mutando en el genoma de VIF-144 uno o más genes seleccionados entre el grupos compuesto por ENV, SU, TMf, CT, V3/4 y V7/8. En este documento se describen las mutaciones apropiadas para cada uno de estos genes. Los ejemplos de varias mutaciones específicas que puede usarse para hacer virus atenuados incluyen del ENV, del V3/4, del V7/8, del TMF, del CT y del SU. La invención también incluye células hospedadoras infectadas con el virus atenuado y la progenie del virus producido por estas células Una vez producido, el virus atenuado puede purificarse a partir de las
células hospedadoras usando procedimientos convencionales.

Puede inducirse la producción de anticuerpos infectando a un animal con el virus atenuado o, de forma alternativa, pueden usarse células hospedadoras infectadas. Si se desea, puede inactivarse el virus o fijarse las células hospedadoras antes de la administración a un animal y pueden purificarse los anticuerpos a partir de los animales usando procedimientos convencionales.

Además, la invención incluye una vacuna que utiliza el virus completo atenuado discutido a continuación o una célula hospedadora infectada con uno de estos virus. Una vez más, puede inactivarse el virus atenuado y pueden fijarse las células hospedadoras. Estos tratamientos pueden proporcionar la seguridad añadida de que las vacunas no causarán por sí mismas infección. Las vacunas basadas en uno o más virus VIP-141 atenuados de la invención pueden usarse para inducir inmunidad protectora en un gato. En la administración de vacunas pueden seguirse protocolos de inmunización para optimizar de este modo la inducción de inmunidad protectora contra la posterior inoculación de VIF-141.

D. Composiciones y procedimientos basados en el ADN genómico del VIF-141 mutado

En otro aspecto, la presente invención se dirige a un ácido nucleico (ADN o ARN) de VIF-141 sustancialmente purificado que tiene una secuencia que se corresponde con la ID SEC Nº 1, pero que se ha mutado para que codifique un virus atenuado. Las mutaciones pueden ser en uno o más genes seleccionados entre el grupo compuesto por SU, TMf, CT, ENV, V3/4 y V7/8, y puede hacerse de modo tal que tras la introducción en una célula hospedadora, se produzca un virus que tiene la infectividad en linfocitos T de felino (u otros tipos celulares susceptibles) significativamente reducida con respecto al virus de tipo silvestre. En este documento se describen ejemplos de varias mutaciones específicas que producirán un virus atenuado apropiado e incluyen: del ENV, del V3/4, del V7/8, del TMf, del CT y del SU. La invención incluye células hospedadoras transfectadas con el ácido nucleico mutado y la progenie del virus VIF que puede producirse por las células hospedadoras.

El ácido nucleico, preferiblemente ADN, que se ha mutado, puede usarse en una vacuna en la cual está presente a una concentración suficiente para inducir inmunidad protectiva tras la administración a un gato. De forma alternativa, una vacuna puede incluir una célula hospedadora transfectada con este ADN y, si se desea, puede fijarse la célula hospedadora después de que se expresen las proteínas virales. Las vacunas pueden administrarse a un gato a una dosificación y por una duración suficiente para inducir una respuesta inmune en un gato, y pueden optimizarse los protocolos de inmunización para inducir inmunidad protectora contra la infección posterior con VIF-141.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Producción de VIF a partir de células transfectadas. Las células de riñón de gato doméstico de Crandell (CRFK) se transfectaron con un plásmido que comprendía el genoma completo de VIF-141. Empezando 24 horas después de la transfección, se recogieron los sobrenadantes celulares y se evaluó la presencia de la proteína p26 de la cápside de VIF usando un inmunoensayo enzimático.

Figura 2: Infección de linfocitos T FeP2 mediante cultivo conjunto. Las células CRFK se crecieron en placas de seis pocillos y se transfectaron con ADN plasmídico que codifica el genoma completo de VIF-141. Cuarenta y ocho horas tras la transfección, se introdujeron en cada pocillo 2 x 10^{6} células FeP2. Empezando 72 horas después del cultivo conjunto, las células FeP2 se separaron y se analizó por ELISA la presencia de la proteína p26 de la cápside de VIF en los sobrenadantes.

Figura 3: Infección de células FeP2 por adsorción. Se resuspendieron 2 x 10^{6} células FeP2 en 200 \mul de medio acondicionado que contenía el virus VIF-141 derivado de células CRFK transfectadas con el clon completo de VIF-141 infeccioso. Empezando cuatro días tras la infección, se analizó la presencia del virus VIF-141 en los sobrenadantes de las células FeP2 usando un ensayo ELISA para p26.

Figura 4: Expresión de la proteína viral de VIF-141 por clones de deleción. Se fabricó una diversidad de clones mutados para eliminar genes o regiones reguladoras de VIF y se transfectados en células CRFK. Después de 48 horas, se analizó por ELISA la presencia de la proteína p26 de la cápside de VIF en los sobrenadantes celulares. Se muestran los resultados de cada clon de deleción así como del clon molecular de VIF-141 de tipo silvestre.

Figuras 5-10: Infección de linfocitos T FeP2 mediante mutantes VIF-141. Se cultivaron células CRFK en placas de seis pocillos y se infectaron con uno de los tres diferentes clones de deleción de VIF-141: del TMf, del ENV o del NC. Tras 48 horas, se añadieron las células FeP2 a cada pocillo y se mantuvieron los cultivos conjuntos durante 72 horas más. A continuación, se separaron las células FeP2 de las células CRFK y se evaluó la presencia del antígeno p26 usando un ensayo de tipo ELISA. El control de los niveles de p26 se repitió cada 3-4 días y los resultados se muestran en la Figura 5. El experimento se repitió usando: del Vifn, del Vifc y del Vif (Figura 6); del MA y del CA (Figura 7); del V3/4, del V7/8 y del CT (Figura 8); del ORF(2) (Figura 9) y del DU, del SU, del IN y del RRE (Figura 10).

Descripción detallada de la invención A. Producción de VIF-141 y ADN que codifica el virus

La presente invención se dirige a una nueva cepa de virus de la inmunodeficiencia felina (denominado en este documento "VIF-141") que se distingue de todas las cepas similares en base a su secuencia del ácido nucleico genómico y a sus funciones biológicas. Aunque el genoma del VIF-141 está compuesto de ARN, este se transcribe de forma inversa en ADN y se integra en el genoma de un hospedador infectado. Se entenderá que las referencias hechas en este documento a las secuencias de VIF y a formas mutadas de estas secuencias abarcan tanto las secuencias de ARN viral transcritas de forma inversa como el mismo ADN correspondiente.

Es bien conocido que pueden usarse técnicas como la mutagénesis dirigida a sitio para introducir variaciones en la estructura de los ácidos nucleicos. La invención abarca las mutaciones introducidas en la secuencia del ácido nucleico de VIF-141 por este o por algún procedimiento similar, siempre que al menos una de las características biológicas principales del virus resultante, por ejemplo, su antigenicidad, permanezca sustancialmente igual que la del virus del que éste deriva. En una realización preferida que se cree no limitante, las mutaciones que reducen de forma detectable la infectividad de VIF-141 en comparación con la de la cepa de tipo silvestre entran en el alcance de la invención. Por ejemplo, en este documento a continuación se describe una mutación específica en el gen ENV que da lugar a un virus que se replica, pero que muestra una infectividad muy reducida. La presente invención incluye tanto esta como otras mutaciones que dan lugar a una infectividad viral sustancialmente reducida.

Como se describe en la sección de Ejemplos, se ha clonado el genoma completo de VIF-141 y se ha depositado en la ATCC con el número 203001 un plásmido que contiene la secuencia de longitud completa. Puede usarse la metodología convencional para aislarse este plásmido y transfectarlo en células hospedadoras capaces de mantener la producción del virus. Se ha encontrado que las células de riñón de gato doméstico Crandell (CRFK) son adecuadas para este fin, pero también pueden usarse otros tipos de células tales como, por ejemplo, células linfocitos T de gato. En algunos casos, las células hospedadoras que expresan el virus pueden usarse directamente, por ejemplo, pueden recogerse y usarse para generar anticuerpos o en una vacuna. Como alternativa, puede aislarse el virus producido en las células de forma altamente purificada usando técnicas de separación conocidas, tales como centrifugación en gradiente de sacarosa. Estos procedimientos son eficaces tanto para el virus de tipo silvestre como para las formas mutantes del virus.

Un procedimiento alternativo para obtener el genoma de VIF-141 es realizar una amplificación por PCR usando cebadores correspondientes a los elementos de secuencia de la ID SEC Nº 1. En general, los cebadores podrían tener una longitud de aproximadamente 20 a 50 bases. Puede diseñarse una estrategia para amplificar el genoma completo de VIF-141 o, como alternativa, pueden amplificarse porciones del genoma por separado y, a continuación, juntarlos para formar la secuencia de longitud completa. A continuación, en la sección de Ejemplos se describen cebadores y procedimientos específicos que se han mostrado eficaces, pero también pueden desarrollarse y usarse procedimientos alternativos.

Si el virus se ha aislado de una fuente natural, entonces los cebadores para PCR deberían corresponderse con secuencias única de VIF-141. La amplificación con éxito usando estos cebadores indicará que el virus responsable de una infección es, de hecho, VIF-141. De este modo, la PCR puede usarse tanto de forma diagnóstica así como en procedimientos de aislamiento del virus.

B. Producción de virus inactivos y de células hospedadoras fijadas

El virus VIF-141, puede usarse para generar anticuerpos en un hospedador apropiado y en vacunas. En cualquier caso, normalmente será deseable inactivar el virus antes de administrarlo a un animal. La inactivación puede conseguirse por cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, el virus puede purificarse e inactivarse a continuación por incubación durante aproximadamente 24 horas en formalina al 0,8% o en paraformaldehido al 1,25%. Pueden usarse estos procedimientos tanto con virus de tipo silvestre como con mutantes.

También pueden generarse anticuerpos o conseguirse inmunizaciones usando células hospedadoras infectadas con VIF-141 o con formas mutadas del virus. Puede usarse cualquier célula hospedadora capaz de mantener la replicación viral incluyendo células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Generalmente, las células deberían fijarse antes de la administración a un animal. La fijación puede realizarse tratando las células con paraformaldehido (por ejemplo, al 1,25%) durante un periodo de aproximadamente 24 horas a 37ºC. También pueden usarse para fijar las células los otros procedimientos discutidos anteriormente para la inactivación de virus así como cualquier otro procedimiento descrito en la técnica.

C. Producción de virus atenuados

Como se ha descrito anteriormente, las vacunas pueden producirse usando virus inactivados o células hospedadoras fijadas. Un procedimiento alternativo es usar un virus que se ha atenuado mutando uno o más genes del genoma humano. El objetivo es producir un virus que no sea infeccioso cuando se administre a un gato. Pueden determinarse las velocidades de replicación viral in vitro infectando células (por ejemplo, PBMC) con el virus y determinando a continuación como cambian los niveles del virus con el tiempo. La replicación puede seguirse usando un ensayo inmunológico que mide un antígeno específico de VIF, por PCR cuantitativa, o midiendo la actividad de un enzima específico del virus (por ejemplo, la transcriptasa inversa). La infectividad puede determinarse exponiendo los linfocitos T del gato (por ejemplo, células FeP2) al virus y determinando en qué extensión las células incorporan el virus y mantienen la replicación (véase a continuación el Ejemplo 4).

Las mutaciones en el genoma de VIF-141 pueden hacerse por mutagénesis dirigido a sitio. Una manera de realizar esto es amplificar los genes virales con cebadores que introducen alteraciones en la secuencia del gen normal. Por ejemplo, pueden introducirse sitios de restricción únicos en una región seleccionada del genoma y a continuación, puede escindirse la secuencia entre estos sitios por digestión con enzimas de restricción. Tras la escisión, la porción restante del ADN genómico puede ligarse de nuevo y a continuación introducirse en una célula hospedadora para producir virus mutados. A continuación, en los Ejemplos 3 y 4, se proporciona una descripción detallada de la producción y ensayo de los virus mutados. En la Tabla 1 puede encontrarse un resumen de diversas mutaciones que se han introducido.

TABLA 1 Mutaciones en VIF-141

Mutación	Nucleótidos delecionados	Aminoácidos delecionados
del MA	123 bases, nucleótidos 879-1001	\begin{minipage}[t]{75mm}41 aminoácidos, restos 85-125 en el extremo C-terminal de la proteína MA \end{minipage}
del CA	114 bases, nucleótidos 1056-1169	\begin{minipage}[t]{75mm}38 aminoácidos, restos 9-46 en el extremo N-terminal de la proteína CA \end{minipage}
del NC	242 bases, nucleótidos 1635-1876	\begin{minipage}[t]{75mm} 21 aminoácidos en la región CA y 51 aminoácidos en la región NC, acompañado de un desfase de marco de lectura que impide la expresión de la porción terminal de la proteína NC \end{minipage}
del ENV	\begin{minipage}[t]{50mm}2103 bases delecionadas, nucleótidos 6577-8679 \end{minipage}	\begin{minipage}[t]{75mm} 701 aminoácidos en medio de la proteína ENV, resto 106-806 \end{minipage}
del SU	1509 bases, nucleótidos 6577-8085	\begin{minipage}[t]{75mm} 503 aminoácidos de la proteína SU, restos 106-608 \end{minipage}
del V3/4	432 bases, nucleótidos 7339-7770	\begin{minipage}[t]{75mm} 144 aminoácidos de las regiones V3 y V4 de SU, restos 360-503\end{minipage}
del V7/8	216 bases, nucleótidos 8380-8595	\begin{minipage}[t]{75mm} 72 aminoácidos de las regiones variables V7 y V8 de la proteína TM, restos 98-169 \end{minipage}
del TMf	75 bases, nucleótidos 8071-8145	\begin{minipage}[t]{75mm} 25 aminoácidos en la unión de escisión entre SU y TM \end{minipage}
del CT	138 bases, nucleótidos 8686-8823	46 aminoácidos del dominio citoplasmático de TM
del DU	345 bases, nucleótidos 4019-4363	115 aminoácidos de la proteína DU, restos 9-123
del IN	669 bases, nucleótidos 4418-5086	223 aminoácidos de la proteína IN, restos 9-231
del Vifn	150 bases, nucleótidos 5286-5435	\begin{minipage}[t]{75mm} 50 aminoácidos de la porción N-terminal de la proteína Vif, restos 19-68 \end{minipage}
del Vifc	438 bases, nucleótidos 5436-5873	\begin{minipage}[t]{75mm} 146 aminoácidos de la porción C-terminal de Vif, restos 69-214 \end{minipage}
del Vif	588 bases, nucleótidos 5286-5873	196 aminoácidos de la proteína Vif, restos 19-214
del Orf(2)	237 bases, nucleótidos 5988-6224	79 aminoácidos de la proteína ORF(2)
del RRE	84 bases, nucleótidos 8827-8910	- -

Los ejemplos de varias mutaciones específicas que producen virus atenuados adecuados para la administración a animales e inducir la producción de anticuerpos, o para su uso en vacunas son del MA, del ENV, del V3/4, del V7/8, del TMf, del CT, del Vif, del Vifc, del Vifn, del ORF(2), del CA, del NC, del SU, del IN, del DU y del RRE. De este modo, los virus mutados en cualquiera de los genes Vif, MA, ORF(2), ENV, Vifn, Vifc, V3/4, V7/8, TMf, CT, SU, CA, NC, IN, DU o RRE son atenuados y otras deleciones o alteraciones de nucleótidos que inactiven estos genes podrían producir virus alterados con características similares.

D. Generación de anticuerpos frente a VIF-141 y tratamiento de gatos infectados

Los anticuerpos frente a VIF-141 pueden producirse en cualquiera de los animales típicamente usados para la producción de anticuerpos, incluyendo ratones, conejos, etc. Sin embargo, se prefiere que los anticuerpos se produzcan en gatos. Si se usa como antígeno el virus de tipo silvestre, el virus debería inactivarse antes de la administración. Cuando se usan virus atenuados, por ejemplo, virus mutado para reducir o eliminar de este modo su infectividad, no se requiere la inactivación o la fijación de las células hospedadoras, aunque si se desea, pueden realizarse estos procedimientos.

Pueden administrarse a los animales composiciones que contienen virus por cualquier vía, pero típicamente, se inyectará a los animales por vía intramuscular, subcutánea o intravenosa. Generalmente, la preparación del virus incluirá un adyuvante, por ejemplo, adyuvante completo o incompleto de Freund. Las preparaciones apropiadas para la inyección, los programas de inyección y similares, son bien conocidos en la técnica y puede emplearse para VIF-141 y sus mutantes (véase, por ejemplo, Harlow, y col., 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.; Klein, 1982, Immunology The Science of Self-Nonself Discrimination). También pueden usarse anticuerpos monoclonales y pueden producirse usando procedimientos convencionales (Kennett, y col, 1980, Monoclonal Antibodies and Hybridomas A New Dimension in Biological Analyses; Campbell, 1984, "Monoclonal Antibody Technology," en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology).

También pueden usarse anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que reaccionan con especificidad con VIF-141 (es decir, que tiene al menos una afinidad 100 veces mayor por VIF-141 que por cualquier otro virus) en cualquiera de una diversidad de inmunoensayos. Por ejemplo, pueden usarse los anticuerpos para detectar el VIF-141 en radioinmunoensayos o en ensayos inmunométricos, también conocidos como ensayos de "2 sitios" o de tipo "sándwich" (véase Chard, 1978, "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques," en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Publicaciones North Holland Co. N.Y.). En un ensayo inmunométrico típico, se une una cantidad de anticuerpo no marcado a un soporte sólido que es insoluble en el fluido que esta siendo ensayado, por ejemplo, sangre, linfa, extractos celulares, etc. Tras la unión inicial del antígeno al anticuerpo inmovilizado, se añade una cantidad de anticuerpo secundario marcado de forma detectable (que puede o no ser el mismo que el primero) para permitir la detección y/o cuantificación del antígeno (véase, por ejemplo, Kirkham y col. (ed.), 1970, Radioimmune Assay Methods, págs. 199-206, E y S Livingstone, Edinburgo). En la técnica se conocen muchas variaciones de estos tipos de ensayos que pueden emplearse para la detección del VIF.

E. Vacunas convencionales y procedimientos de vacunación

Varios autores han descrito vacunas y procedimientos de vacunación que emplean diferentes cepas de VIF o virus muy cercanos (Elyar y col., 1997, Vaccine 15:1437-1444; Yamamoto y col., 1993, J. Virol. 67:601-605; Murphey-Corb y col., 1989, Science 240:1293-1297; Jarrett y col., 1990, AIDS 4:S163-S165 y Desrosiers y col., 1989, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:6353-6357). En el caso de VIF-141, pueden usarse tres tipos de vacunas: vacunas con virus completo inactivo, vacunas con células fijadas y vacunas con virus atenuados.

Típicamente, una vacuna contendrá entre aproximadamente 1 x 10^{6} y aproximadamente 1 x 10^{8} partículas de virus en un volumen de entre aproximadamente 0,5 y 5 ml. La formulación puede efectuarse usando procedimientos convencionales tales como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences, 1982, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 16ª Edición. Las preparaciones pueden contener virus inactivado, células hospedadoras fijadas o virus atenuados, junto con un vehículo y uno o más adyuvantes. Las vacunas más preferidas contendrán virus atenuado que será completamente, o esencialmente por completo, no infeccioso cuando se administre a los gatos.

Los procedimientos de inmunización típicamente comportarán varias inoculaciones con vacunas (por ejemplo, 3 inoculaciones) separadas por intervalos de 3 a 10 semanas. Los procedimientos para optimizar los programas de inoculación y los demás parámetros asociados con la inmunización son bien conocidos en la técnica.

F. Vacunas de ADN

Las referencias que describen vacunas y procedimientos de vacunación que utilizan ácidos nucleicos (ADN o ARNm) incluyen la Patente de EE.UU. Nº 5.703.055, la Patente de EE.UU. Nº 5.580.859 y la Patente de EE.UU. Nº 5.589.466. Los inmunogénicos suministrados de esta forma típicamente evocan tanto una respuesta inmune humoral como citotóxica.

Estos procedimientos pueden utilizarse para producir una vacuna frente a VIF en la que se administra a un gato un ácido nucleido correspondiente con VIF-141 atenuado.

Puede usarse en las vacunas tanto ADN como ARN que codifican el genoma de VIF-141 atenuado, pero generalmente se preferirá el ADN. El ADN puede presentarse en forma "desnuda" o puede administrarse junto con un agente que facilita la captación celular (por ejemplo, liposomas o lípidos catiónicos). La vía de administración típica será por inyección intramuscular de entre aproximadamente 0,1 y 5 ml de vacuna. El polinucleótido total de la vacuna generalmente debería estar entre aproximadamente 0,1 \mug/ml y aproximadamente 5,0 mg/ml. Los polinucleótidos pueden estar presentes como parte de una suspensión, solución o emulsión pero, generalmente, se prefieren vehículos acuosos.

La inmunización de los gatos usando vacunas de ADN puede realizarse como una única inoculación o como múltiples inoculaciones de dosis separadas divididas, por ejemplo, en intervalos de 3 a 10 semanas. Si se desea, puede recogerse el suero de los animales inoculados y ensayarse la presencia de anticuerpos frente a VIF-141 o frente a otras cepas de VIF:

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de un clon de ADN provírico de VIF infeccioso A. Aislamiento y clonación de VIF-141 Aislamiento del virus

VIF-141 se aisló a partir del plasma de un gato infectado por VIF. El virus se amplificó administrando plasma del animal infectado a un gato sin un patógeno específico (SPE). La infección del gato inoculado se confirmó por aislamiento del virus y la seroconversión. El gato se sacrificó a las 12 semanas tras la inoculación, se recogieron los tejidos y se usó el bazo como fuente del virus para la clonación molecular del genoma de VIF-141. El ADN genómico se aisló a partir del bazo infectado usando un kit de extracción de ADN (Stratagene, La Jolla, CA) según el protocolo proporcionado por el fabricante. El ADN genómico purificado se disolvió en tampón TE a una concentración de 1 mg/ml y se conservó a -70ºC.

Amplificación por PCR y clonación de tres segmentos del genoma de VIF-141

Se diseñaron tres grupos de oligonucleótidos en base a las secuencias publicadas de otros VIF aislados (Talbott y col., 1989, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86:5743-5747; Miyazawa y col., 1991, J. Virol. 65:1572-1577; Talbott y col., 1990, J. Virol. 64:4605-4613). Estos oligonucleótidos se usaron para amplificar tres segmentos del genoma VIF-141, uno en el extremo 5', otro en el extremo 3' y otro en el medio del genoma. Debido a un número bajo de copias del genoma proviral de VIF en el tejido infectado, se realizaron dos rondas de amplificación por PCR usando un conjunto de cebadores semianidados para cada fragmento.

Se usaron tres cebadores para clonar un segmento a partir del extremo 5' del genoma proviral de VIF-141, que se extendía de los nucleótidos 118 al 648. Esta región cubre la mayoría de la repetición terminal larga 5', la secuencia intermedia entre la repetición terminal larga 5' y el marco de lectura abierta de Gag, y la porción N-terminal del gen Gag. Las secuencias de los cebadores eran las siguientes: el cebador sentido pr-1 (117-CCGCAAAACCA
CATCCTATGTAAAGCTTGC-146, ID SEC Nº 2) y los dos cebadores complementarios, pr-2 (646-CGCCCCTGTC
CATTCCCCATGTTGCTGTAG-617, ID SEC Nº 3) y pr-8 (1047-TTACTGTTTGAATAGGATATGCCTGTGG
AG-1018, ID SEC Nº 4). La primera ronda de amplificación por PCR se realizó usando 200 ng de pr-1 y pr-8 como cebadores y 1 \mug de ADN genómico como molde, con una mezcla de 0,5 unidades de la ADN polimerasa Taq (Gibco, BRL, Gaithersburg, MD) y 1 unidad de ADN polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA). La amplificación se desarrolló a 94ºC durante un minuto, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 45 segundos; hibridación a 52ºC durante 45 segundos y extensión a 72ºC durante dos minutos. La segunda ronda de amplificación se realizó usando los cebadores pr-1 y pr-2 conjuntamente con 2 \mul de los productos de la primera ronda de PCR como molde. En la segunda ronda se aplicaron las mismas condiciones usadas en la primera ronda de amplificación, excepto porque la hibridación tuvo lugar a una temperatura de 55ºC.

También se usaron tres oligonucleótidos para clonar un segmento del extremo 3' del genoma proviral de VIF-141. Este segmento incluye los nucleótidos de 8874 a 9367, estando compuesto de la mayoría de la repetición terminal larga 3' y la secuencia intermedia entre la repetición terminal larga 3' y el gen ENV. Las secuencias de los tres cebadores eran las siguientes: los dos cebadores sentido, pr-5 (8793-GCAATGTGGCATGTCTGAAAAAGAGGAGGA-8822, ID SEC Nº 5) y pr-7 (8874-TCTTCCCTTTGAGGAAGATATGTCATATGAATCC-8907, ID SEC Nº 6), y el cebador complementario, pr-6 (9367-TCTGTGGGAGCCTCAAGGGAGAACTC-9342, ID SEC Nº 7). Los cebadores pr-5 y pr-6 se usaron para realizar la primera ronda de amplificación y pr-6 y pr-7 se usaron para realizar la segunda ronda de amplificación. A la presente amplificación se aplicaron las mismas condiciones que las usadas en la amplificación del segmento de extremo 5' de VIF-141 descrita anteriormente.

Para clonar un segmento de la parte central del genoma VIF-141, que se extiende de los nucleótidos 5147 a 5631 y cubre la porción C-terminal del gen IN y la porción N-terminal del gen Vif, se realizó una primera ronda de amplificación usando el cebador sentido, pr-3 (4738-ACAAACAGATAATGGACCAAATTTTAAAAA-4767, ID SEC Nº 8) y el cebador complementario pr-10 (5631-TTTCAATATCATCCCACATAAATCCTGT-5604, ID SEC Nº 9). Se realizó una segunda ronda de amplificación usando el cebador sentido pr-9 (5147-TTAAAGGATGAAGAGAAGG
GATATTTTCTT-5176, ID SEC Nº 10) y el cebador complementario pr-10.

Tras la finalización de la segunda ronda de amplificación por PCR, se aplicaron los productos en un gel de agarosa al 1% y se purificaron las bandas esperadas de las tres regiones mediante un kit Wizard PCR Preps (Promega, Madison, WI). Los fragmentos de PCR purificados se clonaron en vectores PCR-Script Amp SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA) según el procedimiento recomendado por el fabricante. Las inserciones se confirmaron por digestión con enzimas de restricción seguido de la secuenciación de las dos cadenas del ADN plasmídico (Advanced Genetic Analysis Center, St. Paul, MN). Para eliminar los "errores" generados por las ADN polimerasas en las secuencias de VIF durante la amplificación, se secuenciaron tres clones para cada región a partir de amplificaciones por PCR independientes. La secuencia consenso a partir de tres clones independientes se consideró como la auténtica secuencias de VIF-141.

La combinación de las secuencias de los segmentos terminales 5' y 3' sugiere que la repetición terminal larga de VIF-141 está compuesta de 354 bases, incluyendo 208 bases de la región de U3, 79 bases en la región R y 67 bases en la región U5. Las repeticiones terminales invertidas de 2 bases, la caja TATA, la señal de poliadenilación y varios elementos probables potenciadores-promotores que actúan en cis se conservaban perfectamente con respecto a otros VIF aislados.

Amplificación por PCR y clonación del genoma proviral completo de VIF-141

La información de secuencia obtenida usando los tres segmentos clonados descritos anteriormente se usó para diseñar cebadores específicos de VIF-141 que pudieran usarse para amplificar y clonar el genoma proviral completo en dos trozos, la mitad 5' y la mitad 3'. Cada mitad se amplificó por dos rondas de amplificación con un conjunto semianidado de cebadores.

Para amplificar la mitad 5' del genoma de VIF-141 (del nucleótido 1 al 5460); se realizó la primera ronda de amplificación usando el cebador sentido, pr-11 (1-TGGGAAGATTATTGGGATCCTGAAGAAATA-30, ID SEC Nº 11) y el cebador complementario pr-10. El protocolo de amplificación seguía el proporcionado con el kit Advantage Genomic PCR de Clonetech (Palo Alto, CA). Brevemente, la reacción de PCR se estableció en un volumen total de 50 \mul, conteniendo 1 \mul del molde de ADN genómico (1 \mug/\mul), 1 \mul de cada cebador (100 ng/\mul), 5 \mul del tampón de reacción de PCR, Tth x10, 2,2 \mul de Mg (OAc)_{2} 25 mM, 1 \mul de mezcla de dNTP x50 (10 mM de cada),
1 \mul de mezcla de Polimerasa Advantage Tth x10, 1 \mul de polimerasa Pfu (2,5 U/\mul) y 36,8 \mul de agua estéril. La mezcla de reacción se calentó a 94ºC durante 2 minutos, seguido de 30 ciclos de amplificación: 94ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 6 minutos. La segunda ronda de amplificación se realizó usando como molde 2 \mul del producto de la primera ronda de PCR, el mismo cebador sentido, pr-11 y el cebador complementario, pr-12 (5460-CATATCCTATATAATAATCACGCGTATGAAAGCTCCACCT-5421, ID SEC Nº 12). Para facilitar la construcción de un genoma de VIF-141 de longitud completa a partir de estas dos mitades, se incorporó el sitio para la enzima de restricción Mlu I (subrayado) en el cebador pr-12. En la segunda ronda, se aplicaron las mismas condiciones de PCR que las usadas en la primera ronda de amplificación dando lugar a la producción de un fragmento de amplificación con el tamaño de 5460 pares de bases.

Para clonar la mitad 3' del genoma proviral de VIF-141, inicialmente se usaron tres cebadores para realizar las amplificaciones, pr-9, pr-13 y pr-14. La primera ronda de amplificación por PCR se realizó usando el cebador sentido, pr-9 y el cebador complementario, pr-14 (9464-TGCGAGGTCCCTGGCCCGGACTCC-9441, ID SEC Nº 13). La segunda ronda de amplificación se realizó usando el cebador sentido, pr-13 (5421-AGGTGGAGCTTTCATACGCGTGATTATT
ATATAGGATATG-5460, ID SEC Nº 14) y el mismo cebador complementario pr-14. El cebador pr-13 se diseñó para que solapara con el cebador pr-12 usado en la amplificación de la mitad 5' del genoma. Al igual que en el cebador pr-12; en pr-13 se incorporó un sitio para la enzima de restricción Mlu I (subrayado) para facilitar la construcción del clon VIF de longitud completo. Desgraciadamente, después de dos rondas de amplificación por PCR, no se observó una banda específica de ADN. Se concluyó que el fracaso para amplificar la mitad 3' del genoma VIF-141 probablemente era debido al alto contenido en GC y a una estructura secundaria muy estable en el cebador pr-14. Por tanto, se diseñó un nuevo cebador, pr-16 (9444-CTCCAGGGATTCGCAGGTAAGAGAAATTA-9416, ID SEC Nº 15). Esta secuencia finalizar 20 bases antes del extremo 5' de la última base en el genoma de VIF-141. La primera ronda de amplificación por PCR se realizó usando en cebador sentido pr-9 y el cebador complementario pr-16. Esta fue seguida de una amplificación usando el cebador sentido pr-13 y, una vez más, el cebador complementario pr-16. Tras la segunda ronda de amplificación, se obtuvo un fragmento de ADN del tamaño esperado.

Los fragmentos de ADN de la mitad 5' y de la mitad 3' del genoma de VIF-141 se purificaron usando el kit de purificación de ADN Wizard PCR Prep. (Promega, Madison, WI) y se clonó en los vectores de clonación pCR-Script Amp SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA). Para cada clon de la mitad 5' y de la mitad 3' se secuenciaron tres clones de tres reacciones de PCR independientes. Se secuenciaron ambas cadenas del ADN plasmídico y se obtuvo la auténtica secuencia consenso para el genoma completo comparando los resultados obtenidos de los tres clones independientes. Se usó el programa DNAStar (DNAStar Inc., Madison, WI) para realizar el ensamblaje, comparación y análisis de la secuencia.

B. Caracterización molecular del virus VIF-141 clonado Resultados de la secuencia y análisis del genoma del VIF-141 completo

Se encontró que el genoma proviral completo de VIF-141 contenía 9464 bases. El genoma está organizado de una forma típica de lentivirus y está compuesto de: repeticiones terminales largas 5' y 3'; tres marcos de lectura abierta (ORF) grandes que contienen los genes Gag, Pol y ENV, y tres marcos de lectura abierta pequeños que contienen las proteínas reguladores Vif, Rev y ORF(2). La repetición terminal larga comparte respectivamente el 78,6% y el 93,9% de homología de secuencia con VIF-Petaluma (Olmsted y col., 1989, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:2448-2452) y con VIF-USIL (Sodora y col., 1995, AIDS Res. Hum. Retroviruses 11:531-533) aislados. La poliproteína Gag comparte respectivamente el 88,4% y el 94,4% de homología de aminoácidos con VIF-Petaluma y VIF-USIL aislados.

El gen Gag codifica la proteína de matriz (MA) (bases 627 a 1031), la proteína de la cápside (CA) (bases 1032 a 1724) y la proteína de nucleocápside (NC) (bases 1725 a 1979). Las poliproteínas Gag y Pol se superponen en 97 bases con la ORF Pol, empezando en el nucleótido 1880 y terminando en el nucleótido 5239. Una señal de desfase de marco de un heptanucleótido (5'-GGGAAAC-3') se localiza 100 bases secuencia arriba del extremo 3' del solapamiento. Como resultado de un desfase de marco -1 durante la traducción, se produce una poliproteína de fusión Gag/Pol.

La poliproteína Pol de VIF-141 muestra un 85,7% y un 92,2% de identidad de aminoácidos en comparación con VIF-Petaluma y VIF-USIL aislados, respectivamente. El gen Pol codifica: una secuencia líder del nucleótido 1880 al 1978; una proteína (PR) del nucleótido 1979 a 2326; una transcriptasa inversa (RT) del nucleótido 2327 al 3994; una deoxiuridina trifosfatasa (DU) del nucleótido 3995 al 4393 y una integrasa (IN) del nucleótido 4394 al 5239.

El ORF Vif se superpone en ocho bases con el gen Pol y comparte el 80,25 y el 91,3% de homología de aminoácido con VIF-Petalumna y VIF-USIL aislados, respectivamente. Inmediatamente después del gen Vif está el gen ORF(2), empezando en el nucleótido 5988 y terminando en el 6224, que presenta un 62% y un 92,4% de homología de secuencia con VIF-Petaluma y VIF-USIL aislados, respectivamente.

La poliproteína ENV comparte un 79,3% y un 88,6% de identidad de aminoácidos con VIF-Petaluma y VIF-USIL aislados, respectivamente. El gen ENV codifica: una proteína de superficie (SU), del nucleótido 6262 al 8088 y una proteína de transmembrana (TM), del nucleótido 8089 al 8826.

La proteína Rev es el resultado de la traducción de un ARNm de ayuste múltiple. El primer exón del probable gen Rev aparentemente comparte un codon de iniciación con el gen ENV, empezando en el nucleótido 6262 y terminando en el 6505. El segundo exón de Rev empieza en el nucleótido 8947, se extiende en la región U3 de la repetición terminal larga 3' y termina en el nucleótido 9161. La proteína Rev de VIF-141 tiene un 67,3% y un 83,9% de homología de aminoácidos con VIF-Petaluma y VIF-USIL aislados, respectivamente. Las 151 bases del elemento de respuesta a Rev (RRE) solapa en 52 bases con el gen ENV, empezando en el nucleótido 8775 y termina en el 8925.

En base a las comparaciones de secuencia en la región V3 de la glicoproteína SU, VIF-141 es un aislado de tipo B. Aparentemente, VIF-141 está relacionado más de cerca con VIF-USIl, otro VIF aislado de tipo B.

C. Construcción de un clon molecular de longitud completa de VIF-141

Para construir un clon VIF-141 de longitud completa, se tuvieron que añadir 20 bases en el extremo 3' terminal del genoma en el clon de la mitad 3'. Además, se identificó una secuencia consenso comparando las secuencias de tres clones independientes. A continuación, se usó la mutagénesis dirigida a sitio (MDS) para ajustar las secuencias de los clones de las mitades 5' y 3' y hacer coincidir con la secuencia consenso antes de la construcción del clon viral de longitud completa.

Adición de las 20 bases perdidas en el extremo 3' final de VIF-141

Para añadir las 20 bases en el clon de la mitad 3' de VIF-141, en primer lugar se amplificó por PCR la repetición terminal larga y se clonó en un vector de clonación PCR-Script Amp SK(+) usando como molde el clon de la mitad 5', el cebador sentido, PR-21 (5'-TTACAAGAATTCAACTGCAG TGGGAAGATTATTGGGATCCTGAAGAAAT-3', ID SEC Nº 16) y el cebador complementario, pr-20 (5'-TTCAAGGAGCTCTTTTGTCGACAACTGCGAGGTCCCTGG CCC-3', ID SEC Nº 17). Para facilitar la clonación del fragmento PCR, se incorporaron en el cebador sentido PR-21 dos sitios de enzimas de restricción para EcoRI y Pst I (subrayados) y se incorporaron en el cebador complementario PR-20 dos sitios para Sac I y Sal I (subrayados). En los cebadores se muestran en cursiva las secuencias específicas de VIF-141. El clon resultante se secuenció y se denominó pCR-LTR. Un fragmento de restricción de pFIV-LTR generado por digestión con Sac I y Nhe I se clonó en uno de los clones de la mitad 3' de VIF-141. El clon resultante se denominó pVIF3'-2A-1^{+} y se confirmó la presencia de las 20 bases en el extremo 3' de VIF-141 por secuenciación de nucleótidos.

Construcción de una secuencia consenso en los clones de las mitades 5' y 3'

Para establecer la secuencia consenso en los clones de las mitades 5' y 3' existentes del genoma de VIF-141, se realizó una SDM. Para introducir cambios en la secuencia de la primera mitad del genoma, se usó como molde uno de los clones de la mitad 5' (denominado como "pVIF5'-D-11"). Había un total de 15 cambios de nucleótido en pVIF5'-D-11 en comparación con la secuencia consenso. Se localizaron dos cambios en la región no codificadora 5', A602G y A612G y siete cambios de nucleótido en la región codificadora eran mutaciones silentes. Los otros seis cambios en la región codificadora daban lugar a una sustitución de aminoácidos por cada cambio, tres en la región RT (un cambio de nucleótido A2890G, que daba lugar a una sustitución de I por M; un cambio G3461A que daba lugar a una sustitución de E por K y un cambio G3737A que daba lugar a una sustitución de E por K), uno en la proteína DU (un cambio C4383T, que daba lugar a una sustitución de T por I) y dos en la proteína IN (un cambio A4579G, que daba lugar a una sustitución de I por M y un cambio A 5007T, que daba lugar a una sustitución de Q por L). Se diseñaron siete oligonucleótidos para hacer los dos cambios en la región no codificadora y seis cambios en la región codificadora que conducían a sustituciones de aminoácidos. Los oligonucleótidos son los siguientes, con las faltas de coincidencia subrayadas:

Oligo pF-1, diseñado para reparar los errores A602G y A612G: 5'-GATTCGTCGGGGGACAGCCAACAAGG
TAGGAGAGATTCTACAGCAACATGGGG-3' (ID SEC Nº 18);

Oligo pF-2, diseñado para fijar el error A2890G: 5'-TCAATATATGGATGATATCTATATAGGATCAAATTTAAG
TAA-3' (ID SEC Nº 19);

Oligo pF-3, diseñado para reparar el error G3461A: 5'- GTGATATAGCTCTAAGGGCATGTTACAAAATAAGA
GAAGAATCCATTATAAGAATAGG-3' (ID SEC Nº 20);

Oligo pF-4 se diseñó para reparar el error G3737A: 5'-CGGGCAGATGGCAGGTAATGGAAATAGAAGGAAG
TAATCAAAAAGC-3';(ID SEC Nº 21);

Oligo pF-5, diseñado para reparar el error C4383T: 5'-AGAAAGGGATTTGGGTCAACTGGAGTCTTTTCTTC
ATGGGTGGA-3' (ID SEC Nº 22);

Oligo pF-6, diseñado para reparar el error A4579G: 5'-GGGGGACAATTAAAGATTGGACCTGGCATATGGCA
AATGGACTGTACACAC-3' (ID SEC Nº 23) y

Oligo pF-7, diseñado para reparar el error A5007T: 5'-GGCTCCTTATGAATTATACATACAACAGGAATCATTA
AGAATACAAGAC-3' (ID SEC Nº 24).

Para hacer cambios en la secuencia de la mitad 3' del genoma, se usó como molde el clon "pVIF3'-2A-1^{+}" de la mitad 3' para realizar una MDS. Había nueve cambios en el clon pVIF3'-2A-1^{+} en comparación con la secuencia consenso. Dos de los cambios de nucleótido en la región codificadora eran silentes. Los otros siete cambios todos daban lugar a una sustitución de aminoácido: uno en la proteína Vif (T5508C, H por Y), otro en la región ORF(2) (A6041T, D por E), tres en la proteína SU (A6922G, V por I; G7007T, T por R y A7814G, S por N), uno en la región TM (A8405T, I por N) y uno de la región Rev (A8976G, E por K). Se diseñaron siete oligonucleótidos de mutagénesis para reparar estas siete sustituciones de aminoácidos.

Oligo pF-8, diseñado para reparar el error T5508C: 5'-CAAAATAGTTTAAGATTGTATGTTTATATAAGCAAT-3' (ID SEC Nº 25);

Oligo pF-9, diseñado para reparar el error A6041T: 5'-CAGAAAAGTTAGATAGAGAAGCAGCTATTAGATTGT
TTAT-3' (ID SEC Nº 26);

Oligo pF-10, diseñado para reparar el error A6922G: 5'-TAAAAGCAAATGTTATATAAGTATACAAGAAGGAC
CCTAC-3' (ID SEC Nº 27);

Oligo pF-11, diseñado para reparar el error G7007T: 5'-AAAAGCTACAAGGCAATGCAGAAGGGGAAGGATA
TGGAAG-3' (ID SEC Nº 28);

Oligo pF-12, diseñado para reparar el error A7814G: 5'-AGAGGACCTTATTGTACAATTTAATATGACAAAA
GCAGTGGAAA-3' (ID SEC Nº 29);

Oligo pF-13, diseñado para reparar el error A8405T: 5'-CCCTCAATCTGTGGACAATGTATAACATGACTAT
AAATCA-3' (ID SEC Nº 30);

Oligo pF-14, diseñado para reparar el error A8976G: 5'-GACAACGCAGAAGAAGAAAGAAGAAGGCCTTCA
AAAAATT-3' (ID SEC Nº 31).

Las preparaciones del molde de ADN de cadena sencilla para ambos clones, pVIF5'-D-11 y pVIF3'-2A-1^{+}, se hicieron esencialmente según el protocolo proporcionado por el fabricante (Promega, Madison, WI). Brevemente, los plásmidos de ADN de los dos clones se transfectaron en la cepa CJ236 de E. coli. El ADN de cadena sencilla (CS) se recuperó usando el fago colaborador R408 y se purificó mediante extracción con fenol/cloroformo. El ADN de CS purificado se disolvió en tampón TE, estimándose su concentración por desarrollo de muestras de 2 \mul de las preparaciones de molde en un gel de agarosa al 1%. Los oligonucleótidos se fosforilaron según el protocolo proporcionado por el fabricante (Gibco BRL, Gaithersburg, MD).

Los oligonucleótidos se hibridaron con el molde en un volumen total de reacción de 30 \mul. Esta contenía 0,2 pmol de molde de ADN de cadena sencilla (pVIF5'-D-11 o pVIF3'-2-A-1^{+}), 4 pmol de cada oligonucleótido (es decir, pF-1 a pF-7 para el molde pVIF5'-D-11 y pF-8 a pF-14 para el molde pVIF3'-2-A-1^{+}), 3 \mul de tampón de hibridación (Tris-HCl 0,2 M, pH 7,4, MgCl_{2} 20 mM y NaCl 0,5 M). La mezcla se incubó a 85ºC durante 5 minutos y, a continuación, se enfrió gradualmente hasta temperatura ambiente a una velocidad de aproximadamente 1ºC por minuto.

Para sintetizar la cadena de ADN complementaria, se añadieron a la mezcla de hibridación los siguientes componentes: 3 \mul de tampón de síntesis (4 mM de cada dNTP, ATP 7,5 mM, Tris-HCl 175 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 37,5 mM, DTT 215 mM), 3 \mul de ADN ligasa de T4 (3 U/\mul) y 3 \mul de la ADN polimerasa de T7 diluida (0,5 unidades por \mul). La reacción se incubó a 37ºC durante 3 horas, seguido de la inactivación a 68ºC durante 10 minutos. Se usaron 2 \mul de la mezcla de reacción de MDS para transfectar células DH\alpha-5 de E. coli competentes.

Para el clon de la mitad 5', pVIF5'-D-11, la incorporación de uno de los oligonucleótidos de mutagénesis, el PF-5, dio lugar a la adición de un sitio Hinc II. Una selección preliminar con Hinc II dio lugar a la identificación de cuatro mutantes positivos que se denominaron como pVIF5'-D-11/M-4, pVIF5'-D-11/M-22, pVIF5'-D11/M-28 y pVIF5'-D-11/M52. Estos cuatro mutantes se secuenciaron completamente para verificar la incorporación de las otras siete mutaciones deseadas. Los resultados de la secuenciación revelaron que tres de los cuatro clones contenían las ocho mutaciones. Un clon, el pVIF5'-D-11/M28, sólo tenía siete posiciones mutadas.

Se seleccionó el clon pVIF5'-D-11/M-52 como el clon de la mitad 5' para ser usado en la construcción del clon VIF-141 de longitud completa. Para el clon de la mitad 3', pVIF3'-2-a-1^{+}, la selección preliminar de digestión con BspH I identificó 10 mutantes en los que se había eliminado un sitio de restricción para BspH I debido a la incorporación del oligonucleótido de mutagénesis pF13. La secuenciación completa reveló que 8 de los 10 clones contenían mutaciones en las siete posiciones deseadas. Uno de los mutantes, el "pVIF3'-2-A-1^{+}/M-21", contenía los 8 cambios y se seleccionó para ser usado como el clon de la mitad 3' en la construcción del clon VIF-141 de longitud completa.

Construcción del clon VIF-141 de longitud completa

Para la construcción del clon VIF-141 de longitud completa, se ligó un fragmento MluI/XhoI de 5,5 kb derivado del clon de la mitad 5', pVIF 5'-D-11/M-52, con el clon de la mitad 3' pVIF3'-2-A-1^{+}/M-21, que se había digerido con las mismas dos enzimas de restricción. El producto de ligamiento de longitud completa se seleccionó mediante amplificación por PCR usando un cebador sentido dirigido al clon de la mitad 5' y un cebador complementario dirigido al clon de la mitad 3'. El cebador sentido, pr-9, tenía la secuencia: 5'-(5147)-TTAAAGGATGAAGAGAAGGGATATTTTCTT-(5176)-3' (ID SEC Nº 10). El cebador complementario, pr-10, tenía la secuencia: 5'-(5631)-TTTCAATATCATCCC
ACATAAATCCTGT-(5604)3', (ID SEC NO:9). Los clones positivos se confirmaron mediante digestión de restricción y secuenciación. Uno de los clones de longitud completa resultantes se denominó "pVIF-141-B1" y se seleccionó para su caracterización tanto in vitro como in vivo.

Ejemplo 2 Demostración de que el clon molecular de longitud completa es infeccioso Transfección

Las células de riñón de gato doméstico Crandell (CRFK) se crecieron en placas de seis pocillos hasta una confluencia del 40 al 60%. La transfección se logró introduciendo 2 \mug de ADN plasmídico y siguiendo el protocolo básico recomendado para los Reactivos de Transfección de Poliamina IT Trans (Mirus, Madison, WI). Brevemente, se mezclaron 10 \mul de TransIT Lt-1 (Panvera) con 1 ml de medio RPMI 1640 y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadieron 2 \mug de ADN plasmídico a la solución RPMI/Lt-1 y se incubaron durante otros 15 minutos a temperatura ambiente. Se retiró el medio de los pocillos, las células se lavaron una vez con PBS y se añadieron las combinaciones de ADN a las monocapas de células. Tras la incubación a 37ºC en un incubador de CO_{2} durante cuatro horas, se retiró la combinación de ADN de los pocillos y se añadieron a cada pocillo 2 ml de medio RPMI 1650 suplementado con suero fetal (SF) al 3%. Veinticuatro horas después de la transfección, se ensayó la producción de VIF en los sobrenadantes celulares, la actividad transcriptasa inversa (TI) y la infectividad viral.

Producción de VIF a partir de células CRFK transfectadas

Los sobrenadantes de las células CRFK transfectadas se recogieron diariamente tras la transfección, y se ensayó la producción de proteínas de la cápside de VIF usando el kit de ensayo del antígeno de VIF (IDEXX, Portland, ME), según el protocolo recomendado por el fabricante. Este inmunoensayo enzimático se diseñó para detectar el antígeno asociado al grupo predominante de la proteína p26 de la cápside del VIF. El antígeno p26 de VIF se detectó a las 24 horas tras la transfección (PT), alcanzó un pico a las 72 horas PT y a continuación descendió hasta niveles basales 11 días PT (véase la Figura 1).

Para confirmar la producción del virus a partir de las células transfectadas (CRFK), se realizó un ensayo de actividad transcriptasa inversa (TI) (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) para detectar la actividad TI asociada a virión en los sobrenadantes de las células transfectadas. Brevemente, se recogieron 200 \mul de sobrenadante celular y se centrifugaron durante 5 minutos en una microfuga para sedimentar las células y los restos celulares. Los sobrenadantes se centrifugaron a 20.000 g durante 20 minutos a 4ºC en un rotor de adaptadores oscilantes para sedimentar las partículas del virus VIF. Los sedimentos de partículas virales se resuspendieron en 40 \mul del tampón de lisis del kit y, a continuación, se realizaron los ensayos recomendados por el fabricante. Cuarenta y ocho horas tras la transfección (PT) se demostró la producción de virus por medio de las células transfectadas en los sobrenadantes
celulares.

Infección de células CRFK

Los virus VIF-141 de tipo silvestre no infectan las células CRFK. Para determinar si el clon molecular del virus mostraba un comportamiento similar, se cultivaron células CRFK en placas de 6 pocillos y se inocularon con 200 \mul de medio condicionado p26+ de células CRFK transfectadas. Tras la incubación durante 2 horas a 37ºC, las células se lavaron con PBS y se añadieron 2 ml de medio RPMI 1640 suplementado con FS al 3% a cada pocillo. A continuación, se controló la producción de virus en los sobrenadantes por un ELISA para p26 de VIF cada 3 ó 4 días tras la transfección. Se encontró que, de forma similar al virus de tipo silvestre, el clon VIF- 141 no infectaba las células CRFK.

Infección de células FeP2 por cultivo conjunto con células CRFK transfectadas

Las células CRFK se cultivaron en placas de 6 pocillos y se transfectaron como se ha descrito anteriormente. A las 48 horas tras la transfección, se añadieron 2 x 10^{6} células FeP2 a cada pocillo transfectado p26+. Tras el cultivo conjunto de las células durante 72 horas, se separaron las células FeP2 (no adherentes) de las células CRFK (adherentes). Se recogieron los sobrenadantes de las células FeP2 y se controló la producción del virus por ELISA para p26 de VIF cada 3 ó 4 días. Se demostró que los niveles mayores de producción de virus en los sobrenadantes de las células FeP2 se daban tras cuatro días de cultivo conjunto. El valor del virus alcanzaba una meseta 6 días tras la transfección, lo que indicaba que el clon molecular del virus VIF-144 es infeccioso en las células FeP2. Los resultados también sugieren que la infección de las células CRFK está bloqueada en una etapa temprana de infección del virus, es decir, en el momento de la entrada del virus en las células.

En términos generales, se concluyó que, tras la transfección en células CRFK, el clon molecular de VIF-141 puede replicarse en la célula y las partículas del virus liberadas a partir de las células son infecciosas para los linfocitos FeP2.

Infección de células FeP2 por adsorción

Las células FeP2 (2 x 10^{6}) se suspendieron en 200 \mul de medio condicionado p26+ obtenido a partir de células CRFK transfectadas y se incubaron a 37ºC durante dos horas. Las células se lavaron con PBS, se resuspendieron en 2 ml de medio Opti-MEM suplementado con FCS inactivado por calor al 10% y se incubaron a 37ºC. Se recogieron los sobrenadantes y se controló la producción de virus por ELISA para p26 de VIF cada tres o cuatro días. Cuatro días después de la infección, se detectaba en los sobrenadantes la liberación del virus a partir de las células FeP2 infectados y se alcanzaba un pico tres semanas después de la infección (Figura 3). Los resultados indican que puede conseguirse la infección productiva de las células FeP2 por VIF-141 a través de la adsorción o cultivo conjunto con células CRFK transfectadas. Comparando con la infección por cultivo conjunto, la producción de virus alcanzada una meseta mucha más despacio cuando la infección tenía lugar por adsorción (Figuras 2 y 3).

Ejemplo 3 Clones de VIF-141 mutante y su uso en vacunas

Sólo los clones mutantes que tienen deleciones en la región ENV (parte B) entran dentro del alcance de las reivindicaciones, el resto se incluyen con fines ilustrativos. Para desarrollar vacunas candidatas de VIF-141, se usó el clon de tipo silvestre infeccioso de VIF-141 para construir varios clones con genes delecionados. Los criterios generales para hacer los clones mutantes son:

1. Las deleciones o mutaciones introducidas en el genoma de VIF-141 han de ser suficientemente serias como para que la infectividad del virus se reduzca sustancialmente (atenuado) después de que los clones se transfieran a células en cultivo in vitro o se administren a gatos in vivo.

2. Las deleciones o mutaciones introducidas en el genoma de VIF-141 no han de abolir la competencia de replicación del genoma viral o la capacidad para expresar las proteínas virales a niveles elevados.

Otros factores que se tendrán en cuenta son si el genoma delecionado en un gen se integrará en los cromosomas del hospedador, si se formarán partículas víricas defectivas y el nivel de proteínas estructurales virales que se expresará. En base a estas consideraciones, se usaron como dianas para la deleción varios genes y elementos. Debido a que tenía que mantenerse la replicación del genoma viral, no se mutaron ni el gen RT ni el PR del VIF-141.

A. Deleciones en la región Gag

La poliproteína Gag contiene tres proteína estructurales del virión: MA, CA y NC. Se construyeron tres clones con un gen delecionado con una deleción en cada una de estas proteínas.

Mutación del MA

Se realizó la mutagénesis dirigida a sitio para crear dos sitios de restricción Spe I en la porción C- terminal de la proteína MA usando como molde el clon de la mitad 5' pVIF5'-D-11/M-52 y los cebadores de mutagénesis: Mpma-1 (5'-AGTAAAGAAATTGACATGGCGATTACTAGTTTAAAAGTTTTTGCAGTGGC-3', (ID SEC Nº 32) y Mpma-2 (5'-CCATCTATAAAAGAAAGTGGGACTAGTGAAGAAGGACCTCCACAGGC-3', ID SEC Nº 33).

En las secuencias se han subrayados los sitios Spe I introducidos por los cebadores. La MDS se realizó como se ha descrito previamente para reparar los errores probables en los clones de las mitades 5' y 3'. Los mutantes se seleccionaron por digestión de restricción con Spe I y se usaron los clones positivos para construir los clones de deleción. La digestión con Spe I se realizó para liberar el fragmento Spe I y la parte restante del clon se autoligó para crear los clones de deleción. Estos se seleccionaron por amplificación por PCR usando grupos de cebadores que flanquean la región delecionada y se obtuvo la confirmación por secuenciación de nucleótidos. El clon de la mitad 5' con la deleción se ligó con el clon de la mitad 3' pVIF3'-2A-1^{+}/M-21 para generar el clon de longitud completa con la deleción. Este clon se denominó clon de deleción VIF-141 MA y contenía una deleción de 123 bases del nucleótido 879 al nucleótido 1001, que se corresponden con 41 aminoácidos de los restos 85 a 125 del extremo C-terminal de MA.

Mutación del CA

La MDS se realizó para crear dos sitios Spe I en la región CA del VIF-141 usando como molde el clon de la mitad 5', pVIF5'-D-11/M-52, y como cebadores, Mpca-1 (5'-ATTCAAACAGTAAAT GGAGCAACTAGTTATGTAGCCC
TTGATCCAAAAATG-3', ID SEC Nº 34) y Mpca-2 (5'-ACAGCCTTTTCAGCTAATTTAACTAGTACTGATATGG
CTACATTAATTATG-3', ID SEC Nº 35). Tras la deleción del fragmento de restricción de Spe I, se ligó el clon de la mitad 5' con pVIF3'-2A-1+/M-21 para generar el clon de longitud completa con el gen delecionado. Este clon tenía una deleción de 114 pares de base de los nucleótidos 1056 al 1169, que se corresponden con los 38 aminoácidos de las posiciones 9 a 46 en el extremo N-terminal de la proteína CA.

Mutación del NC

El clon de la mitad 5' tiene sitios únicos para Sca I y Sma I en los nucleótidos 1635 y 1876, respectivamente. El clon se digirió con Sca I y como Sma I para liberar un fragmento de 242 pares de bases. La porción restante del clon de la mitad 5' se autoligó y después se unión con el clon de la mitad 3' para generar el clon de longitud completa con el gen delecionado. La deleción consistía en 63 bases (21 restos de aminoácidos) en la región CA, 27 bases (9 restos de aminoácidos) entre las proteínas CA y NC y 152 bases (51 restos de aminoácidos) en la porción N-terminal de la proteína NC. La deleción también causaba un desfase de marco de lectura de -1 y, por tanto, éste clon no podía expresar la porción C-terminal de la proteína NC.

B. Deleciones en la región ENV

La glicoproteína precursora de ENV se procesa en dos proteínas maduras: SU y TM. Se construyeron seis clones de deleción en la región ENV.

Mutación del ENV

La MDS se realizó para crear dos sitios para BstE II en la región ENV usando como molde el clon de la mitad 3', pVIF3'-2A-1^{+}/M-21 y como cebadores de mutagénesis, Mpenv-1 (5'-ACTATAGTCTATTTACTAACTGGT
TACCTGAGATATTTAATAAGCCATAG-3', ID SEC Nº 36) y Mpenv-2 (5'-TACTTATATGCTTGCCTACATTGGGT
TACCGTATAAGAAACTGTACTAATAAAA-3', ID SEC Nº 37). En los cebadores se subrayan los sitios para BstE II. Tras la deleción del fragmento BstE II, el clon autoligado se unión a pVIF5'-D-11/M-52. El clon resultante tiene una deleción de 2103 bases desde los nucleótidos 6577 al 8679, que se corresponde con la mitad de los 701 aminoácidos de la proteína ENV (restos 106 a 806). Los 105 restos del extremo N-terminal, la mayoría de los cuales solapan con el primer exón de la proteína Rev, y los 45 restos del extremo C-terminal que solapan con el elemento de respuesta a Rev (RRE), se mantenían en el clon de deleción.

Mutación del Su

Se crearon dos sitios para Spe I en la región SU del VIF-141 mediante MDS usando como molde el clon pVIF3'-2A-1^{+}/M-21 y como cebadores de mutagénesis, Mpsu-1 (5'-GAGGTATAAAGG TAAACAAAAACTAGTGCCATT
CATATTATGTTAGCCCTTGC-3', ID SEC Nº 38) y Mpsu-2 (5'-ACTAACTATAGTCTATTTACTAACAACTAGTTT
GAGATATTTAATAAGCCATAGAAAC-3', ID SEC Nº 39). El fragmento Spe I se delecionó por digestión con Spe I seguida de autoligado del fragmento mayor restante. El clon resultante se ligó a pVIF5'-D-11/M-52. Este clon tiene una deleción de 1509 bases de los nucleótidos 6577 a 8085, correspondiente con una deleción de 503 aminoácidos (restos 106 a 608) de la proteína SU. El clon mantenía los 105 aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína SU:

Mutación del V3/4

Se realizó la MDS para crear dos sitios Sph I que flanqueaban las regiones V3 y V4 de la proteína SU. El clon pVIF3'-2A-1^{+}/M-21 se usó como molde junto con los cebadores de mutagénesis: Mpenv-5 (5'-ATACCGAAATGTGG
ATGGTGGAATCAGGCATGCTATTATAATAATTGTAAATGGGAAGAAGC-3', ID SEC Nº 40) y Mpenv-6 (5'-GCACTATGTACAATTGTTCCTTACAGGCATGCTTCACTATGAAAATAGAGGACCTTAT-3', ID SEC Nº 41). Se han subrayado los sitios Sph I. Después de la digestión para retirar el fragmento Sph I, el clon se autoligó y a continuación se unión con pVIF5'-D-11/M-52. Este clon contiene una deleción de 432 bases de la posición 7339 a la 7770, que se corresponde con una deleción de 144 aminoácidos (del residuo 360 al 503) de la proteína SU, que cubren las regiones V3 y V4.

Mutación del V7/8

Se usó la MDS para crear dos sitios Sph I que flanqueaban las regiones V7 y V8 de la proteína TM. Esta se logró usando como molde el clon pVIF3'-2A-1^{+}/M-21 y los cebadores de mutagénesis Mpenv-7 (5'-GAATCAATTCTT
TTGTAAGATCGCATGCAATCTGTGGACAATGTATAACATGACTA-3', ID SEC Nº 42) y Mpenv-8 (5'-GGGAAA
ATTGGGTGGGATGGATAGGTAAGATCGCATGCTATTTAAAAGGACTTCTTGGTAG-3', ID SEC Nº 43). Se han subrayado los sitios Sph I. La digestión con Sph I dio lugar a la eliminación de 216 bases de los nucleótidos 8380 a 8505 y se siguió del ligamiento del fragmento mayor. A continuación, el clon resultante se unión con el clon de la mitad 5' pVIF5'-D-11/M-52 para generar "del V7/8". Este contiene la deleción de 72 aminoácidos (del resto 98 al 169) de la proteína TM cubriendo diversas regiones V7 y V8.

Mutación del TMf

El clon de la mitad 3' del VIF-141 tiene un único sitio Age I en el nucleótido 8145. Se realizó la MDS para crear un segundo sitio Age I en la posición 8071. Se usó como molde el clon de la mitad 3' junto con el cebador de mutagénesis, Mpenv-3 (5'-GGAAGAAGTTATGAGGTATACCGGTAAACAAAAAAGGGCC-3', ID SEC Nº 44). Se delecionó un fragmento de 75 bases entre los dos sitios Age I por digestión con la enzima de restricción seguida del autoligado del fragmento de restricción mayor. El clon resultante se ligó con el clon de la mitad 5' para generar "del TMf". Este contiene una deleción de 25 aminoácidos en la unión de escisión entre las proteínas SU y TM. Los aminoácidos delecionados incluyen 6 restos del extremo C-terminal de la proteína SU (4 de los cuales son básicos (K o R) y se requieren para el procesamiento del sitio de escisión de SU/TM) y 19 restos del extremo N-terminal del péptido de fusión de la proteína TM (requeridos para la fusión de membrana entre el envoltorio del virión y la membrana celular).

Mutación del CT

Se realizó la MDS para truncar la cola citoplásmica de la proteína TM usando el clon de la mitad 3' pVIF3'-2A-1^{+}/M-21 como molde y el cebador de mutagénesis, Mpenv-4 (5'-CTACTTATATGCTTGCCTACATTGGTCGAC
TGATAGTGAAACTGTACTAATAAAATATTGGG-3', ID SEC Nº 45). Se incorporó un sitio de restricción Sal I (subrayado) en los oligonucleótidos por mutación silente para facilitar la selección de los mutantes. En el cebador, se incorporaron tres codones de terminación de traducción repetidos en tándem (en cursiva) justo después del dominio transmembrana de la proteína TM. El clon resultante se ligó en el clon de la mitad 5' para general "del. CT". Este tenía un truncamiento de 138 bases de los nucleótidos 8686 a 8823 (que se corresponden con un truncamiento de 46 aminoácidos del dominio citoplásmico de la proteína TM).

C. Deleciones en la región Pol

La poliproteína Pol consta de cuatro proteínas enzimáticas: PR, RT, DU e IN. Se construyeron dos clones de deleción de la región Pol.

Mutación del Du

Se realizó la MDS para crear dos sitios Spe I en la región DU usando como molde el clon de la mitad 5' pVIF5'-D-11/M-52 y, como cebadores de mutagénesis, Mpdu-1 (5'-GATGGTTATAGAAGGTGAAGGAATTACTAGTAAAA
GATCAGAAGATGCAGGATATG-3', ID SEC Nº 46) y Mpdu-2 (5'-GAAATAATAATGGATTCAGAAAGAGGAAC TAGTGGATTTGGGTCAACTGGA GTCTTTTC-3', ID SEC Nº 47). En los cebadores se subrayan los sitios Spe I. Mediante la digestión con Spe I se logró una deleción de 345 bases del nucleótido 4019 al 4363, seguida del autoligado del fragmento de restricción mayor. El clon resultante se unión con el clon pVIF3'-2A-1^{+}/M-21 para generar "del DU". El clon contiene una deleción de 115 aminoácidos que se corresponde prácticamente con la proteína DU
completa.

Mutación del IN

Se crearon mediante MDS dos sitios Spe I en la región IN de VIF-144 usando como molde pVIF5'-D11/M-52 y los oligonucleótidos de mutagénesis, Mpin-1 (5'-CTTCATGGGTGGACAGAATTGAAACTAGTGTATTAAATCATGA
AAAATTTCACTCAG-3', ID SEC Nº 48) y Mpin-2 (5'-GCAATGGGTGTATTATAAAGATCAGACTAGTAAAAAG
TGGAAGGGACCAATGAGAGTAG-3', ID SEC Nº 49). En los cebadores se subrayan los sitios Spe I. Tras la deleción del fragmento Spe I y del autoligado, el clon resultante se unión con pVIF3'-2A-1^{+}/M-21 para generar "del IN". Este contiene una deleción de 669 bases del nucleótido 4481 al 5036, que prácticamente se corresponde con la proteína IN completa (223 aminoácidos, del resto 9 al 231 de IN).

D. Deleciones en los genes o elementos reguladores

Las tres proteínas reguladores identificadas en VIF son Rev, Vif y ORF2. Se informó de un elemento de respuesta a Rev en el extremo 3' del genoma del VIF. Se construyeron cinco clones de deleción en estas regiones.

Mutación del Vifn

Se introdujo un único sitio Mlu I en medio del gen Vif en el clon de la mitad 5' pVIF 5'-D-11/M-52. Se realizó la MDS para crear un segundo sitio Mlu I en el extremo N-terminal del gen Vif usando como molde pVIF3'-D-11/M-52 y el cebador de mutagénesis, Mpvif-1 (5'-AG AAGACTCTTTGCAGTTCTCCAATGAACGCGTTAGAGTGCCATGT
TATACATATCG-3', ID SEC Nº 50). En el cebador se subraya el sitio Mlu I. Mediante la digestión con Mlu I se delecionó un fragmento de restricción de 150 bases del nucleótido 5286 al 5435, seguida del autoligado del fragmento de restricción mayor. El clon de deleción resultante se unión con pVIF3'-2A-1^{+}/M-21 para generar "del Vifn". Este contiene una deleción de 50 aminoácidos (del resto 19 al 68) en la porción N-terminal de la proteína Vif.

Mutación del Vifc

El clon de la mitad 3' pVIF3'-2A-1^{+}/M-21 tiene un único sitio Mlu I en la región Vif. Se creó un segundo sitio Mlu I por MDS en el extremo C-terminal de la proteína Vif usando como molde pVIF3'-2A-1^{+}/M-21y el cebador de mutagénesis Mpvif-2 (5'-CGTGTGGCAAAGAGGCTAAAACGCGTAGAGGCTGTTGTAATCAG-3', ID SEC Nº 51). En el cebador se subraya el sitio Mlu I. Tras la deleción del fragmento Mlu I, el clon resultante se ligó con el clon de la mitad 5' pVIF5'-D-11/M-52 para generar "del Vifc". Este contiene una deleción de 438 bases del nucleótido 5436 al 5873, que se corresponde con una deleción de 146 aminoácidos (del resto 69 al 214) en la porción C-terminal de la proteína Vif.

Mutación del Vif

Para construir "del Vif", se sustituyó el fragmento de restricción Xho I/Mlu I de Vifc por un fragmento Xho I/Mlu I de Vifn de 5,3 kb. El clon resultante contiene una deleción de 588 bases del nucleótido 5286 al 5873, que se corresponde con una deleción de 196 aminoácidos (del resto 19 al 214), prácticamente la proteína Vif completa.

Mutación del ORF(2)

Se crearon por MDS dos sitios Mlu I en los nucleótidos 5988 y 6224 (en los extremos N y C terminales de ORF(2)). Esto se logró usando como molde el clon pVIF3'-2A-1^{+}/M-21 y como cebadores de mutagénesis Mporf-1 (5'-GTGGACGGGAGAATTATGAACGCGTGAACTAATCCCACTGTTTAATAAGGTTACAG-3', ID SEC Nº 52) y Mporf-2 (5'-CTACATTATC CATAAATACTGCCTAGACGCGTTTCTTTTAATATTTCATCTGCAG-3', ID SEC Nº 53). En los cebadores se subrayan los sitios Mlu I. Además de los dos sitios Mlu I creados por MDS, hay un sitio Mlu I en el nucleótido 5436 del clon. Para construir "del ORF(2)", se ligó un fragmento Mlu I/Xho I de 5,4 kb del clon de la mitad 5' pVIF5'-D-11/M-52 con el fragmento mayor Mlu I/Xho I del clon de la mitad pVIF3'-2A-1^{+}/M-21. A continuación, se insertó en el clon resultante un fragmento MluI de 552 bases de la posición 5436 a 5988. La ORF(2) del contiene una deleción de 237 bases, que cubre el gen ORF(2) completo.

Mutación del RRE

Se realizó una MDS para crear dos sitios para Spe I en la región RRE usando como molde el clon de la mitad 3', pVIF3'-2A-1^{+}/M-21, y como cebadores de mutagénesis, Mprre-1 (5'-GGCATATCTGAA AAAGAGGAGGAATGA
ACTAGTATATCAGACCTGTAGAATACA-3', ID SEC Nº 54) y Mprre-2 (5'-GAGGAGGATGTGTCATATGAATC
AAATACTAGTCAAAAATAACAGTAAAATCT ATATTG-3', ID SEC Nº 55). En los cebadores se subrayan los sitios Spe I. La deleción del fragmento Spe I se logró mediante digestión con Spe I seguida de autoligado de fragmento mayor restante. El clon de deleción resultante se ligó a pVIF5'-D-11/M-52 para generar "del RRE". Este contiene una deleción de 84 bases del nucleótido 8827 al 8910.

Ejemplo 4 Caracterización de los clones de deleción del gen VIF-141 A. Expresión de proteína viral y/o producción de virus defectivos

Cada plásmido de los clones de deleción se transfectó en células CRFK como se describe previamente. Se realizaron ensayos de tipo ELISA para la proteína p26 del VIF para detectar la expresión de proteína viral y/o la producción de partículas virales en los sobrenadantes de células transfectadas. A las 48 horas después de la transfección, se encontró que las muestras de 13 de las construcciones producían una fuerte señal positiva comparable a la observada para el clon molecular del VIF-141 de tipo silvestre (véase la Figura 4). Los niveles más elevados de producción de partículas virales se observaron para los seis clones en la región ENV, incluyendo del ENV, del TMf, del SU, del CT, del V3/4 y del V7/8.

Se obtuvieron niveles comparables de producción de partículas virales para otros siete clones de deleción, incluyendo tres clones de deleción en la región Vif (del Vifn, del Vifc y del Vif), del MA, del DU, del IN y del ORF(2). Los resultados indican que las deleciones portadas por estos 13 clones no interfieren con la formación y liberación de partículas virales desde las células transfectadas. Se detectó una señal positiva relativamente débil para el del NC, que indica que la deleción en esta región afecta al ensamblaje o a la liberación de partículas virales.

No se detectó producción de partículas virales en los sobrenadantes de células transfectadas con del CA o con del RRE. La deleción en el extremo C-terminal de la proteína CA puede suprimir la formación de partículas virales o tener como resultado la pérdida del epítope reconocido por el anticuerpo monoclonal (AcM) usado en el kit de ELISA para p26. Como se esperaba, la deleción en la región RRE daba lugar al bloqueo de la exportación de ARN viral sin ayustar desde el núcleo al citoplasma, que conducía a una falta total, o a un descenso espectacular en la expresión de proteínas estructurales virales.

B. RT-PCR intracelular para detectar la expresión de ARN viral

Se realizó una RT-PCR intracelular para detectar la expresión de ARN viral en los dos clones de deleción, del CA y del RRE. Se transfectó el ADN plasmídico de cada clon en células CRFK diferentes. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se aisló el ARN total de las células transfectadas usando un kit de RNeasy ((Qiagen, Chatsworth, CA). Se eluyó el ARN en 50 \mul de agua con DEPC y se usaron 2 \mul de cada muestra de ARN para sintetizar la primera hebra de ADNc usando Superscript II (Gibco BRL, Gaithersburg, MD).

Se amplificó un fragmento de 585 pares de bases desde el nucleótido 2958 al 3542 usando un cebador sentido Sp-8 (5'-TATTATGGTGGGGATTTGAAAC-3', ID SEC Nº 56) y, como cebador complementario, Sp-20 (5'-TAATT
AGATTTGATTCCCAGGC-3', ID SEC Nº 57). En las reacciones de PCR se usaron como molde 2 \mul de ADNc de cada reacción y, como control, 2 \mul de ARN total de cada preparación. Cada reacción se realizó en un volumen de 100 \mul usando un kit de amplificación de PCR (Gibco BRL, Gaithersburg). La reacción se llevó a cabo como sigue: 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante otros 30 segundos. Se cargaron 10 \mul de cada reacción en un gel de agarosa al 1%. Se observó una banda específica con el tamaño esperado tanto para el clon del CA como para el clon del RRE, que indicaba que se producía la expresión de ARN viral en las células transfectadas con estos clones. Los resultados sugieren que el fallo para detectar la expresión de la proteína p26 mediante ELISA para del CA, se debe probablemente a un fallo en la formación de partículas virales o a una falta del epítope reconocido por el anticuerpo usado en el ensayo de tipo ELISA para p26. Para el clon de deleción de RRE, se demostró la expresión génica viral mediante RT-PCR intracelular, pero no se detectó expresión de la proteína p26 usando el ensayo de tipo ELISA. Esta discrepancia puede reflejar una sensibilidad mucho mayor del ensayo de RT-PCR cuando se compara con el ELISA.

C. Encapsulación del genoma viral y enzima RT en las partículas virales defectivas

La transfección de células CRFK con la mayoría de los clones de deleción del VIF-141 dio como resultado la producción y liberación de partículas virales defectivas. Para determinar si los genomas virales con un gen delecionado y la proteína RT eran encapsulados dentro de partículas virales, se realizaron ensayos de RT-PCR y de actividad RT asociados a virión. Brevemente, 48 horas después de la transfección, se recogieron 200 \mul del sobrenadante de cada cultivo de células CRFK transfectadas y se centrifugaron 5 minutos en una microfuga para sedimentar las células y los restos celulares. Se sedimentaron las partículas virales en los sobrenadantes mediante ultracentrifugación a 20.000 g durante 20 minutos a 4ºC en un rotor de adaptadores oscilantes. Para analizar la encapsulación, se resuspendieron los sedimentos virales en 350 \mul de tampón RLT del kit RNeasy y se purificó el ARN viral por elución en 50 \mul de agua con DEPC según las recomendaciones del fabricante. La primera hebra de ADNc se hizo usando Superscript II y la amplificación por PCR se realizó como se describe previamente usando el conjunto de cebadores Sp-8 y Sp-20.

Catorce de los 16 clones de deleción mostraron una banda específica después de la amplificación por RT-PCR, que indicaba que la transfección de las células CRFK con estos clones producía partículas virales defectivas y que los genomas virales con deleción de gen se encapsulaban. Los 14 clones consistían en 6 clones de la región ENV (incluyendo del ENV, del TMf, del SU, del CT, del V3/4 y del V7/8), 3 clones de la región Vif (del Vifn, del Vifc y del Vif); 2 clones de la región Pol (del DU y del IN), 2 clones de la región del gen/elemento regulador (del ORF(2) y del RRE) y 1 clon de la región Gag (del MA). De acuerdo con los datos del ELISA para p26, del CA mostraba una señal negativa en el ensayo de RT-PCR asociado a virión. La proteína NC es necesaria para el empaquetamiento del genoma viral dentro del virión y, como se esperaba, no se detectó genoma ARN viral con un gen delecionado asociado a virión mediante RT-PCR para del NC. Para del RRE, se demostró que el ARN viral con deleción de gen asociado a virión estaba presente, pero no se detectó la producción de partículas virales usando el ensayo de tipo ELISA para p26. La discrepancia en estos resultados puede reflejar de nuevo una sensibilidad mucho mayor del ensayo de RT-PCR con respecto al ELISA.

Para analizar la encapsulación de la enzima RT (es decir, transcriptasa inversa) en las partículas virales defectivas, se resuspendieron sedimentos virales en 40 \mul del tampón de lisis del kit de ELISA RT y se permitió que el ensayo procediera como recomienda el fabricante. De acuerdo con los datos obtenidos usando ensayos de tipo ELISA para p26 y ensayos de RT-PCR asociados a virión, se pudo detectar actividad RT asociada a virión en 14 clones de deleción, que incluían del ENV; del SU; del TMf; del V3/4; del V7/8; del CT; del MA; del DU; del IN; del Vifn; del Vifc; del Vif; del ORF(2) y del NC. No se detectó actividad RT asociada a virión en los clones de deleción CA o RRE.

D. Infectividad in vitro de los clones del VIF-141 con deleción de gen

Se crecieron células CRFK en placas de seis pocillos y se transfectaron como se describe previamente. Cuarenta y ocho horas tras la transfección, se añadieron a cada pocillo 2 x 10^{6} células FeP2. Tras el cultivo conjunto de las células durante 72 horas, las células FeP2 se separaron de las células CRFK, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos de células FeP2 y se controló la producción de virus usando un ensayo de tipo ELISA para p26 de VIF cada 3 a 4 días durante un total de 4 a 6 semanas.

Se encontraron 12 clones de deleción que no tenían niveles significativos de expresión de la proteína de la cápside p26 durante el periodo controlado. Estos incluían: del ENV, del TMf y del NC (Figura 5); 3 clones de deleción de la región Vif (del Vifn, del Vifc y del Vif) (Figura 6); los clones de deleción de MA y CA (Figura 7), los clones de deleción de V3/4, V7/8 y CT (Figura 8) y el clon de deleción de ORF(2) (Figura 9). Los resultados indican que las deleciones introducidas en estos clones suprimen totalmente la infectividad del virus en las células FeP2. Se detectaron niveles moderados de replicación viral en cuatro clones de deleción que incluían del DU, del SU, del IN y del RRE (Figura 10).

E. Conclusiones Del ENV

El clon de deleción ENV, que tiene una deleción de 701 aminoácidos en mitad de la proteína ENV (restos 106 a 806), perdía totalmente la capacidad para infectar células FeP2. No obstante, mantenía la capacidad para ensamblar y liberar partículas virales defectivas, para encapsular el genoma viral y para transcribir inversamente ARN. La función principal de la proteína ENV es mediar en la entrada del virus en la célula diana durante la fase temprana de infección. La deleción de la mayoría de la proteína ENV puede bloquear la entrada del virus y, por lo tanto, la infectividad del virus.

Del TMf

El clon de deleción TMf, que contiene una deleción de 25 aminoácidos en la unión de escisión entre las proteínas SU y TM, no es infeccioso en las células FeP2. La deleción puede bloquear el procesamiento de escisión de la proteína precursora ENV y esto puede tener como resultado un fallo de las partículas virales para unirse a las células diana y entrar en ellas. Se ha informado que la eliminación del sitio de escisión de la glicoproteína ENV del VIF tiene como resultado la expresión de una proteína precursora ENV sin escindir. Sin embargo, la proteína recombinante expresada mantiene sus propiedades antigénicas, como evidencia su interacción con los anticuerpos monoclonales determinada mediante el uso de ensayos de transferencia de tipo Western y de radioinmunoprecipitación (Rimmelzwaan y col., 1994, J. Gen. Virol. 75:2097-2012). Tras la transfección en células CRFK, el clon de deleción produce partículas virales defectivas a un nivel comparable a un clon del VIF-141 de tipo silvestre. El genoma viral defectivo y las enzimas RT se encapsulaban en los viriones defectivos.

Del SU

Del SU tiene una deleción de 503 aminoácidos desde el resto 106 al 608 de la proteína SU. Se ha encontrado que mantiene niveles de producción de partículas virales aproximadamente igual a los del clon de tipo silvestre. Se encapsulaban tanto el genoma viral con la deleción de gen como la enzima RT. Sin embargo, a diferencia de del ENV, las células transfectadas con del SU producían partículas virales que eran infecciosas en las células FeP2, aunque en una extensión mucho menor que el virus de tipo silvestre. De este modo, parece que la deleción de la proteína SU del genoma del VIF-141 atenuaba el virus. Se cree que la unión del VIF a los receptores celulares, que es la primera etapa en la infección del virus, está mediada por la proteína SU cuando se asocia con la proteína TM. No se conoce el mecanismo por el cual el virus mutante se une a las células diana y entran en ellas. Una ruta alternativa para que el virus mutante entre en las células hospedadoras puede ser responsable de la infectividad más baja asociada con el clon de deleción.

Del V3/4 y del V7/8

Se delecionaron 144 aminoácidos desde el resto 360 al 503 de la proteína SU (que cubren las regiones variables V3 y V4) y 72 aminoácidos desde el resto 98 al 169 de la proteína TM (que incluyen las regiones V7 y V8) en del V3/4 y del V7/8, respectivamente. Tras la transfección a células CRFK, cada clon produce virus defectivos a niveles similares a los observados para el clon de tipo silvestre. Como con otros clones de deleción relacionadas con ENV, del V3/4 y del V7/8 encapsulaban sus genomas virales con deleción de gen y las enzimas RT dentro de viriones. El ensayo de infectividad indicaba que la deleción de la región V3 y V4 de SU y la deleción de la región V7 y V8 de la proteína TM, suprimía totalmente la infectividad del virus en las células FeP2. La región variable V3 es el dominio inmunodominante y se ha informado que está implicado en múltiples funciones, incluyendo tropismo viral, patogénesis viral y epítopes neutralizantes. Actualmente no está claro en qué etapa de la infección viral se bloqueaba en estos dos clones de deleción.

Del CT

La proteína TM de VIF tiene una cola citoplásmica relativamente larga (46 aminoácidos de longitud). El truncamiento de esta cola en el clon CT tenía como resultado la pérdida de infectividad del virus en células FeP2. Sin embargo, el truncamiento no tiene efecto sobre la formación de partículas virales y la encapsulación del genoma viral y de la proteína RT. Se ha informado de una interacción funcional específica entre MA y la cola citoplásmica de TM del VIF, así como de VIH-1. Se ha propuesto que esta interacción es importante para la incorporación de la proteína ENV en los viriones. El truncamiento del dominio citoplásmico en del CT puede eliminar la interacción funcional entre las proteínas MA y TM, bloqueando, de este modo, la incorporación de ENV.

Del MA

Del MA contiene una deleción de 41 aminoácidos desde el resto 85 al 125 en el extremo C-terminal de la proteína MA. Tras la transfección en células CRFK, el clon producía virus defectivos a un nivel comparable al producido usando el clon VIF-141 de tipo silvestre. Esto indica que la deleción del dominio C-terminal no tiene efecto significativo sobre el ensamblaje y liberación de partículas virales. El genoma viral con deleción de gen y la proteína RT se encapsulaban en las partículas virales defectivas. Cuando estas partículas virales se liberaban desde las células CRFK transfectadas, no eran infecciosas con respecto a las células FeP2.

Del CA

Una deleción de 38 aminoácidos desde el resto 9 al 46 en el extremo N-terminal de la proteína CA, suprimía la formación de partículas virales, como evidencia la señal negativa en el ensayo de tipo ELISA para p26, el ensayo RT PCR intravirión y el ensayo de actividad de RT. Sin embargo, la RT-PCR intracelular a partir de las células CRFK transfectadas demostraron que la deleción no bloqueaba la expresión del ARN viral. Por tanto, el fallo para detectar la proteína p26 o la producción de virus defectivos en los sobrenadantes de las células transfectadas se debe al bloqueo del ensamblaje de partículas virales, no a la expresión de la proteína viral.

Del NC

Se delecionó la proteína NC completa en el clon del NC. Las células transfectadas con este clon producían virus defectivos a un nivel significativamente reducido comparado con el clon de tipo silvestre, indicando que la deleción perjudicaba el ensamblaje o la liberación de partículas virales. Se ha informado que la proteína NC del VIH-1 no es necesaria para el ensamblaje de partículas similares a virus. La deleción en el clon NC no afectaba al empaquetamiento de la enzima RT dentro de los viriones defectivos. Como se esperaba, no se encapsulaba genoma viral en las partículas virales.

Del Vif, del Vifc y del Vifn

Se construyeron tres clones de deleción en el gen Vif, es decir, del Vifn, del Vifc y del Vif. Vifn tenía una deleción de 50 aminoácidos en la porción N-terminal de la proteína Vif. Vifc tenía una deleción de 146 aminoácidos en la región C-terminal de la proteína y del Vif tenía una deleción de casi la proteína Vif completa. Los tres clones mostraban propiedades similares. Las células transfectadas con cualquiera de los tres clones producían partículas virales a una velocidad comparable al clon VIF-141 de tipo silvestre. Tanto los genomas virales como la enzima RT se encapsulaban en viriones en los tres clones. Los viriones liberados desde las células CRFK transfectadas por los tres clones no eran infecciosos con respecto a las células FeP2, lo que indicaba que Vif es necesaria para la replicación viral en los linfocitos T.

Del ORF(2)

Se delecionó el marco de lectura abierta completo de ORF(2) en el clon de deleción ORF(2). Las células transfectadas con el clon ensamblaban y liberaban partículas virales a una velocidad comparable con el clon de tipo silvestre. Aunque tanto el genoma viral como la enzima RT se empaquetaban en las partículas virales, el clon fallaba a la hora de replicarse en células FeP2, lo que sugería que el producto génico de ORF(2) es necesario para la producción viral de estas células.

Del RRE

En del RRE se delecionaron 84 de las 150 bases totales que comprende la secuencia RRE del VIF. Esta deleción perjudicaba gravemente la expresión de proteínas estructurales y la producción de partículas virales en células transfectadas. No se detectó la producción de p26 en los sobrenadantes de células CRFK transfectadas. De forma similar, no se detectó actividad RT empaquetada. Estos resultados están en consonancia con la propuesta de que la secuencia RRE es necesaria para la exportación del ARN viral sin ayustar y con ayuste único desde el núcleo al citoplasma de las células. Sin embargo, se demostró mediante RT PCR que el ARN genómico viral asociado a virión estaba presente y las partículas virales eran infecciosas en células FeP2, aunque a un nivel marcadamente reducido comparado con el clon VIF-141 de tipo silvestre. Considerados en conjunto, estos resultados indican que la deleción de la secuencia RRE disminuye espectacularmente la expresión de las proteínas estructurales virales. Sin embargo, parece que la deleción no suprimía totalmente la expresión y las células transfectadas producían una cantidad traza de partículas de virión infecciosas.

Del IN

En el clon del IN se delecionó la proteína IN casi completa. Tras la transfección en células CRFK, el clon mostraba un nivel de expresión de proteína viral y producción de partículas virales comparables a las del clon de tipo silvestre. Los ensayos de RT PCR y actividad RT asociados a virión indicaban que tanto el ARN genómico viral como la enzima RT se empaquetaban en partículas virales. Sorprendentemente, los viriones recuperados a partir de las células transfectadas con el clon eran infecciosos y podrían replicarse en células FeP2, aunque a un nivel reducido comparado con el virus de tipo silvestre. La integración es una etapa obligada requerida para la infección productiva de varios retrovirus, incluyendo VIH-1. Los datos sugieren que la proteína IN de VIF, en contraste con VIH, puede no ser un requerimiento obligatorio para la expresión de proteínas virales y para la expresión viral en células FeP2.

Del DU

En el clon del DU se delecionó el gen DU casi completo. El producto de este gen convierte dUTP en dUMP. La deleción del gen DU en el clon no afectaba a la expresión de proteínas virales o a la producción de partículas virales en las células CRFK transfectadas. Tanto el genoma viral como la enzima RT se encapsulaban y los viriones producidos desde las células transfectadas eran infecciosos para las células FeP2. Sin embargo, el clon de deleción se replicaba en FeP2 a una velocidad más lenta que el virus VIF-141 de tipo silvestre. Esto indica que el gen DU es necesario para la replicación máxima del virus. Los datos estaban de acuerdo con informes que sostienen que el VIF con deleción de DU mantiene su capacidad para propagarse en linfocitos T.

Depósito de materiales biológicos

Los siguientes materiales biológicos se depositaron en la American Type Culture Collection (ATCC) en el 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, EE.UU., el 1 de julio de 1998 y se asignaron los siguientes números de acceso:

	N^{o} de acceso de la ATCC
Cepa viral VIF-141	VR-2619
Plásmido pVIF-141-B1	203001

Claims (34)

1. Un virus VIF-141 sustancialmente purificado, en el que dicho virus tiene una secuencia de ácido nucleico genómico que se corresponde con la ID SEC Nº 1.

2. Una célula hospedadora infectada con el virus de la reivindicación 1.

3. Una progenie del virus VIF-141 que puede producirse en la célula hospedadora de la reivindicación 2.

4. Una vacuna de virus completo que comprende el virus VIF-141 de la reivindicación 1, en la que dicho virus se ha inactivado, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. Una molécula de ácido nucleico sustancialmente purificada que tiene una secuencia que se corresponde con la ID SEC Nº 1.

6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5, en la que dicho ácido nucleico es ADN.

7. Una célula hospedadora transfectada con el ácido nucleico de la reivindicación 5.

8. Una progenie del virus VIF que puede producirse por la célula hospedadora de la reivindicación 7.

9. Una vacuna de células fijadas que comprende una célula hospedadora infectada con el virus de la reivindicación 1 o transfectada con el ácido nucleico de la reivindicación 5, en la que dicha célula hospedadora se ha fijado, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Un virus VIF-141 atenuado que tiene una secuencia de ácido nucleico genómico que se corresponde con la ID SEC Nº 1, pero en el que el gen ENV de dicho virus está mutado por deleción y que se replica tras la entrada en una célula hospedadora pero muestra una infectividad significativamente reducida en linfocitos T felinos cuando se compara con el virus VIF-141 de tipo silvestre.

11. Una célula hospedadora infectada con el virus atenuado de la reivindicación 10.

12. Un virus VIF-141 atenuado que puede producirse en la célula hospedadora de la reivindicación 11.

13. Una vacuna de virus completo atenuado, que comprende el virus de la reivindicación 10, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Una vacuna de célula hospedadora atenuada que comprende la célula hospedadora de la reivindicación 11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Una molécula de ácido nucleico de VIF-141 sustancialmente purificada que tiene una secuencia que se corresponde con la ID SEC Nº 1, pero en la que el gen ENV de dicha molécula de ácido nucleico está mutado por deleción, de forma que cuando la molécula de ácido nucleico mutada se ha introducido en una célula hospedadora, la célula hospedadora produce un virus VIF-141 atenuado que se replica pero tiene una infectividad significativamente reducida en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con respecto al virus VIF-141 de tipo silvestre.

16. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 15, en la que dicho ácido nucleico es ADN.

17. Una célula hospedadora transfectada con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 15 ó 16.

18. Una progenie del virus VIF que puede producirse por la célula hospedadora de la reivindicación 17.

19. Una vacuna que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 15 ó 16 a una concentración suficiente para inducir inmunidad cuando se administra a un gato, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. La vacuna de la reivindicación 19, en la que dicho ácido nucleico es ADN.

21. Una vacuna que comprende una célula hospedadora transfectada con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 15 ó 16 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. La vacuna de la reivindicación 21, en la que dicha célula hospedadora ha sido fijada.

23. Un procedimiento para producir un virus VIF-141 atenuado que tiene una secuencia de ácido nucleico genómico que se corresponde con la ID SEC Nº 1, pero en el que el gen ENV de dicho virus está mutado por deleción y que se replica en células hospedadoras pero tiene una infectividad significativamente reducida en linfocitos T felinos con respecto al virus VIF-141 de tipo silvestre, mediante deleción en un gen ENV del virus de tipo silvestre.

24. Un lentivirus atenuado que puede producirse por el procedimiento de la reivindicación 23.

25. Una célula hospedadora infectada con el virus atenuado de la reivindicación 24.

26. Una vacuna de virus completo atenuado, que comprende el virus de la reivindicación 24, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

27. Una vacuna de célula hospedadora atenuada, que comprende la célula hospedadora de la reivindicación 25, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

28. Un procedimiento de producción de una molécula de ácido nucleico mutada adecuada para su uso en una vacuna por infección por VIF-141, que comprende:

(a) transcribir de forma inversa el ARN genómico de un virus VIF-141, que tiene una secuencia de ácido nucleico genómico que se corresponde con la ID SEC Nº 1;

(b) clonar el transcrito inverso de la etapa (a) para formar un ácido nucleico clonado;

(c) mutar por deleción en el gen ENV de dicho ácido nucleico clonado de la etapa (b) para formar una molécula de ácido nucleico mutada; y

(d) clonar dicho ácido nucleico mutado de la etapa (c) en el que el ácido nucleico mutado, tras la introducción en una célula hospedadora, produce un virus VIF-141 atenuado que se replica, pero que tiene una infectividad significativamente reducida con respecto al virus VIF-141 de tipo silvestre codificado por el ácido nucleico sin mutar.

29. Una célula hospedadora transfectada con una molécula de ácido nucleico que puede producirse por el procedimiento de la reivindicación 28.

30. Una progenie de lentivirus que puede producirse por la célula hospedadora de la reivindicación 29.

31. Una vacuna que comprende una molécula de ácido nucleico que puede producirse por el procedimiento de la reivindicación 28, cuya molécula de ácido nucleico está a una concentración suficiente para inducir inmunidad cuando se administra a un gato, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

32. Una vacuna que comprende la célula hospedadora de la reivindicación 29 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

33. Una cepa del virus de inmunodeficiencia felina que tiene el Nº de acceso de la ATCC VR-2619 y la progenie de virus que puede producirse a partir de la misma.

34. Un plásmido denominado como pVIF-141-B1 y que tiene el Nº de acceso de la ATCC 203001.