ES2252758T3 - Cepas de levaduras geneticamente modificadas. - Google Patents
Cepas de levaduras geneticamente modificadas.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A CEPAS DE LEVADURAS QUE EXPRESAN GENES HUMANOS CODIFICADORES DE ENCIMAS QUE REGULAN LA EXPRESION DEL CITOCROMO P450, SU PROCEDIMIENTO DE FABRICACION Y SUS APLICACIONES.
Description
Cepas de levaduras genéticamente modificadas.
La presente invención se refiere a nuevas cepas
de levaduras que expresan una actividad de citocromo P450 y a su
utilización. Se refiere en particular a las cepas de levaduras
capaces de producir un sistema de enzimas citocromos P450 humanos y
a los plásmidos utilizados para su construcción.
Los citocromos P450 constituyen una superfamilia
de enzimas membranales. Estas son las monooxigenasas que intervienen
más particularmente en el metabolismo de los xenobióticos y de los
medicamentos.
Ellas son especialmente utilizadas en:
- -
- el diagnóstico in vitro de la formación de metabolitos tóxicos o mutágenos por el metabolismo hepático humano de moléculas xenobióticas naturales o artificiales (medicamentos contaminantes o aditivos). Este diagnóstico es primordial para el desarrollo de nuevas moléculas farmacéuticas,
- -
- la identificación y la destrucción de moléculas tóxicas o contaminantes del medio ambiente y
- -
- la producción de metabolitos.
Debido a su implicación, a la vez en estos
procesos de desintoxicación y en estos fenómenos de toxicidad, estas
proteínas han sido ampliamente estudiadas (Guenguerich, 1988).
Sin embargo, estos estudios se han encontrado
rápidamente con dificultades tal como el estudio de formas
individuales de citocromos P450. Para paliar estos problemas, se han
desarrollado entonces los sistemas de expresión heteróloga.
A partir de 1986 (Zuber et al., 1986), se
ha desarrollado la utilización de las células de mamíferos como
hospedantes de expresión heteróloga. Estos sistemas tienen la
ventaja de ser parecidos a las células hepáticas (localización
mayoritaria de los citocromos P450), pero desgraciadamente adolecen
de bajos niveles de expresión.
En lo que concierne a los hospedantes
procariotas, tales como las bacterias, ellos permiten desde luego
tener cantidades importantes de citocromo P450 correctamente
plegadas (Barnes et al., 1991), pero con este tipo de
hospedantes se observan modificaciones insalvables de la parte 5'
terminal expresada del ADN (Doehmer & Greim, 1992).
En cambio la elección de los hospedantes
eucariotas de tipo levadura es muy particularmente ventajosa: este
organismo permite ponerse en condiciones parecidas a las de las
células hepáticas humanas y conduce a un nivel de expresión en
proteínas elevado. Además la levadura posee bajo la forma endógena
toda la maquinaria enzimática necesaria para la expresión de las
proteínas membranales, del tipo citocromo P450, y de sus enzimas
asociadas, de forma que dispone de un citocromo b5 y de una
NADPH-citocromo P450-reductasa, dos
enzimas cuya presencia es necesaria para el funcionamiento del
citocromo P450.
La levadura ofrece pues una solución ventajosa
para los diferentes problemas (Oeda K. et al., 1985; Pompon,
1988), ya que con este organismo:
- -
- las proteínas expresadas no tienen necesidad de ser modificadas al nivel de su secuencia N-terminal (como para la expresión en la bacteria)
- -
- se obtienen cantidades razonables de citocromo P450 heterólogo para diferentes estudios bioquímicos y estructurales,
- -
- ya existe allí un sistema de enzimas asociadas.
Entre las levaduras particularmente estudiadas
para la expresión de proteínas heterólogas, se pueden citar
especialmente Kluyveromyces, Pichia, Hansenula,
Candida y Saccharomyces de las que se conoce bien la
estructura del genoma. En la bibliografía se han descrito diferentes
sistemas de expresión de citocromo P450 en las levaduras.
En las cepas citadas de primera generación los
citocromos P450 han sido expresados a partir de plásmidos y utilizan
como donadores de electrones la NADPH-citocromo
P450-reductasa y el citocromo b_{5} endógenos de
levadura (Pompon, 1988; Cullin & Pompon, 1988).
Una primera mejora de este sistema ha dado lugar
a las cepas citadas de segunda generación donde la citocromo
P450-reductasa de la levadura ha sido sobreexpresada
(bajo el control del promotor GAL10-CYC1) y un
citocromo b_{5} humano coexpresado (patente WO93/02200 y Truan
et al., 1993). Estas cepas han permitido así obtener las
actividades enzimáticas del citocromo P450 recombinante 5 a 60 veces
más importantes, según la isoforma, que en la cepa de partida.
Sin embargo los sistemas existentes no son
totalmente satisfactorios: ya sea porque no permiten tener una
expresión suficiente de las proteínas, o ya sea porque las proteínas
obtenidas no son bastante parecidas al sistema humano.
La presente invención tiene precisamente por
objetivo proponer una tercera generación de cepas que no presentan
los inconvenientes anteriormente citados. De manera inesperada, esta
invención ha puesto en evidencia que era posible reemplazar
simultáneamente la NADPH-citocromo
P450-reductasa y el citocromo b5 de levadura por sus
homólogos humanos. Esto es tanto más sorprendente porque la
disrupción simultánea de estos dos genes era conocida por ser letal
en la levadura y porque hasta ahora no era posible obtener una cepa
viable con los dos genes delecionados.
En las cepas reivindicadas, la citocromo
P450-reductasa y/o el citocromo b5 de levadura han
sido sustituidos por su homólogo humano. Esto permite muy
ventajosamente la creación de un sistema muy parecido a las células
hepáticas, dado que todo el sistema multienzimático es entonces de
la misma naturaleza.
Este nuevo sistema, permite estudiar el efecto de
la naturaleza de los copartícipes redox de los citocromos P450
expresados así como las estequiometrías necesarias para las
actividades de citocromo P450 comparables a las que existen en el
hígado.
El primer objetivo de la invención reside pues en
una cepa de levadura modificada genéticamente, caracterizada
porque:
- 1º
- Los genes que codifican el citocromo b5 endógeno y la NADPH-citocromo P450-reductasa endógena han sido inactivados,
- 2º
- Dicha cepa contiene un ácido nucleico que codifica la NADPH-citocromo P450-reductasa humana,
- 3º
- Dicha cepa contiene un ácido nucleico que codifica el citocromo b5 humano.
Los ácidos nucleicos utilizados para integrar en
la cepa los genes que codifican el citocromo b5 humano y la
reductasa humana son preferiblemente los ADNc. Los ADNc que
contienen la totalidad de la secuencia que codifica estas dos
proteínas han sido aislados y secuenciados (para la reductasa humana
véase S Yamano et al. Mol. Pharmacol. 1989 vol. 36:
83-8, y para el citocromo b5 humano véase M Miyata
et al. Pharmacol. Res. 1989 vol. 21: 513-
20).
20).
También preferiblemente la levadura elegida es
Saccharomyces cerevisiae.
Según la presente invención, se entiende por
genes inactivados, un gen que se ha vuelto incapaz de codificar su
proteína natural. La incapacidad de dichos genes para codificar sus
proteínas naturales se puede manifestar o bien por la producción de
una proteína inactiva en razón de modificaciones estructurales o
conformacionales, o bien por la ausencia de producción, o bien por
la producción de la proteína natural a un nivel atenuado.
La inactivación de los genes nativos se puede
obtener según diferentes métodos:
- -
- una deleción total o parcial del gen. Por deleción se entiende toda supresión del gen considerado. Se puede tratar de una parte de la región que codifica la proteína y/o toda o parte de la región promotora de la transcripción.
- -
- una o varias mutaciones puntuales en el gen. Las mutaciones se pueden obtener por un tratamiento con ayuda de agentes mutágenos, químicos (como los agentes alquilantes, bialquilantes o intercalantes) o de agentes mutágenos físicos (rayos X. g. ultravioleta), o por mutagénesis dirigida.
- -
- una inserción mutacional por acción de enzimas de restricción que van a interrumpir el cuadro de lectura del gen y a inactivarlo y/o,
- -
- una disrupción génica por ejemplo según el protocolo inicialmente descrito por Rothstein [Meth. Enzymol. (1983) 202]. En este caso, la integridad de la secuencia codificante será perturbada para permitir el reemplazamiento por recombinación homóloga de la secuencia original por una secuencia que codifica la proteína humana correspondiente.
Según la presente invención, se utiliza
preferiblemente el método de disrupción génica como se describe más
adelante
Para la transformación de las cepas reivindicadas
con vistas a su capacidad de expresar las enzimas humanas según la
invención, se pueden considerar diferentes soluciones; por una parte
se puede transformar una cepa original, en la que uno de los genes
ha sido inactivado, por un plásmido replicativo que contiene el
ácido nucleico que codifica la proteína humana correspondiente. En
este caso el ácido nucleico no se integra en el genoma de la
levadura.
Por otra parte se puede integrar un ácido
nucleico, bajo la forma de un ADNc que comprende la secuencia que
codifica la proteína humana concerniente, en el genoma de la
levadura. En este caso, la integración se puede hacer ya sea en un
locus conocido sobre el genoma que corresponde a un gen marcador,
sin alterar ni las propiedades de reproducción de la levadura ni la
viabilidad de ésta, o ya sea en el lugar ocupado por el gen nativo
inactivado.
El ácido nucleico que codifica la reductasa lo
mismo que el ácido nucleico que codifica el citocromo b5, pueden por
tanto ser introducidos en la cepa según uno de estos métodos.
Según la presente invención, para mejorar la
estabilidad de la cepa y ponerla en las condiciones más favorables,
se elige con preferencia el modo de realización que consiste en
integrar el ácido nucleico que codifica la
NADPH-citocromo P450-reductasa
humana y/o el ácido nucleico que codifica el citocromo b5 humano en
el genoma de la levadura, siendo un modo preferencial de realización
de la presente invención integrar estos ácidos nucleicos en lugar y
posición de los genes endógenos
Según otro modo preferido de realización de la
presente invención se integra el gen que codifica el citocromo b5
humano en un sitio intergénico para un gen marcador en particular en
el sitio intergénico SPL1/leu2.
Otra característica de la invención reside en una
cepa caracterizada porque el ácido nucleico que codifica el
citocromo b5 humano está integrado en el genoma.
Un modo de realización particular de la invención
consiste en hacer figurar dos copias del citocromo b5 en la cepa
transformada.
Otro problema encontrado por la solicitud es el
de la expresión de los genes humanos en la levadura a una tasa
suficiente.
Es ventajoso para esto que estos genes se pongan
bajo el control de un promotor de la levadura que permite que estos
sean expresados. Estos promotores de levadura pueden, o bien ser
inducibles, o bien ser constitutivos. En la presente solicitud se
entiende por promotor constitutivo un promotor cuya expresión es
constante en las condiciones estándar de cultivo. Según la presente
invención al menos uno de los genes humanos está bajo el control de
un promotor constitutivo de levadura.
Este promotor se elige entre los promotores
conocidos. Se pueden utilizar por ejemplo los promotores de los
genes del isocitocromo C1 (CYC1), de la
alcohol-deshidrogenasa (ADH1), del factor de
elongación de la transcripción (TEF), de la
gliceraldehído-fosfodeshidrogenasa de levadura (de
aquí en adelante GAPDH) y de la
fosfoglicerato-quinasa de levadura (de aquí en
adelante PGK).
Preferiblemente el promotor se elige entre el
promotor del gen de la
gliceraldehído-fosfodeshidrogenasa de levadura, el
promotor del gen de la fosfoglicerato-quinasa de
levadura y el promotor endógeno del citocromo b5 de levadura. Es de
señalar que en un modo particular de realización de la invención el
gen que codifica el citocromo b5 humano está bajo el control del
promotor endógeno de Yb5.
En lo que concierne al promotor inducible, éste
se elige preferiblemente entre los promotores GAL10 y
CYC1-GAL10.
Hasta ahora no se podían obtener cepas haploides
que presentan las características que nos interesan, es decir las
inactivaciones de los genes endógenos mencionados y su
reemplazamiento por los ácidos nucleicos que codifican los genes
humanos correspondientes. Era preciso permanecer bajo la forma
diploide. Una de las ventajas de la presente invención es poder
trabajar con levaduras haploides lo que permite tener mejor
estabilidad y evitar las recombinaciones no deseadas.
Según un modo preferencial de realización de la
invención las cepas se caracterizan por tanto, en que son
haploides
Las cepas según la invención poseen al menos un
ácido nucleico que codifica el citocromo P450 humano. Dicho ácido
nucleico estará preferiblemente integrado sobre un plásmido. Las
cepas de levaduras humanizadas según la invención pueden ser
transformadas según las técnicas habituales por un plásmido de
expresión de citocromo P450 cualquiera, siempre que dicho plásmido
sea compatible al nivel de sus marcadores de selección con las cepas
de levadura desarrolladas. En particular tales plásmidos pueden ser
obtenidos clonando según las reglas de la técnica la fase
codificante de un ADNc que codifica un citocromo P450 humano
cualquiera, en el policonector de clonación del plásmido pYeDP60
(véase materiales y métodos).
El citocromo P450 se puede elegir en particular
entre los citocromos P450 humanos 1A1, 1A2, 1B1, 2C8, 2C9, 2C18,
2C19, 2E1, 3A4, 3A5. Las cepas humanizadas según la presente
solicitud presentan ventajas incontestables para la expresión, con
relación a las levaduras originales y con relación a las cepas
recombinantes previamente de-
sarrolladas.
sarrolladas.
Otro objetivo de la invención consiste en una
cepa de levadura según la invención, en la que se hará expresar,
además, la actividad monooxigenasa de un citocromo P450 humano
llevado por un plásmido.
Otro modo de realización de la invención consiste
en hacer figurar la copia suplementaria del ácido nucleico que
codifica el citocromo b5 descrito precedentemente, sobre un plásmido
y especialmente sobre aquel que contiene ya una copia del ácido
nucleico que codifica el citocromo P450. Para la obtención de una
actividad óptima de los P450, es en efecto particularmente ventajoso
poder realizar una estequiometría molar relativa al menos igual a
1/1 entre los niveles de expresión del citocromo b5 humano y del
P450 humano. La integración genómica de una sola copia del gen del
citocromo b5 puede, en ciertas circunstancias, resultar insuficiente
con respecto al nivel elevado de expresión del P450, tal como
resulta de su expresión a partir de un plásmido multicopia según la
invención. La presente invención permite así mejorar todavía más la
eficacia del sistema describiendo la construcción de una serie de
plásmidos que llevan a la vez una casete de expresión para el
citocromo P450 de interés y una casete de expresión para el
citocromo b5. La estructura particular de estos plásmidos permite
una expresión estable, de alto nivel y de estequiometría adecuada
entre los dos citocromos. Estos plásmidos son compatibles con el
conjunto de las cepas descritas en la solicitud. Su uso puede ser
extendido igualmente a otras cepas.
La presente invención tiene por objetivo
preferencial poner a punto una cepa de levadura que responde a todas
las características precedentemente descritas. Varios intermedios
están descritos para alcanzarlo.
En la presente invención se parte preferiblemente
de cepas tales como las descritas en la bibliografía, y
especialmente:
- -
- de la cepa W(AB), descrita por Truant et al., en la que el gen que codifica el citocromo b5 de levadura (de aquí en adelante Yb5) ha sido disrupto. Para hacer esto se construye un vector que tiene el gen marcador HIS3 integrado al nivel de un sitio de restricción del gen del citocromo b5. Este vector se utiliza para transformar una cepa HIS3-diploide. Se seleccionan los recombinantes,
- -
- de la cepa W(R) en la que el gen que codifica la reductasa de levadura no ha sido inactivado.
- -
- y de la cepa W(hR), obtenida a partir de una cepa W(RA), por transformación por el vector pUP81 (fig. 1). En esta cepa el gen que codifica la reductasa de levadura (de aquí en adelante YRED) inactivado ha sido reemplazado, por inserción de una casete que contiene el promotor inducible y la secuencia que codifica la reductasa humana (de aquí en adelante HRED).
Estas cepas se cultivan, después se dejan
esporular y se seleccionan las cepas W(hR,AB) haploides que
se delecionan para Yb5 y YRED y que expresan la reductasa humana
bajo control del promotor GAL10-CYC1.
A este respecto otro objetivo de la invención
consiste en una cepa que comprende un ácido nucleico que codifica la
NADPH-citocromo P450-reductasa
humana bajo control del promotor GAL10-CYC1 y en la
que los genes que codifican el citocromo b5 de levadura y la
NADPH-citocromo P450-reductasa de
levadura han sido inactivados (cepa W(hR, \DeltaB)).
Otra cepa preferida según la invención consiste
en una cepa idéntica a la precedente en la cual el promotor
inducible GAL10-CYC1 ha sido reemplazado por el
promotor GAPDH.
Este reemplazamiento puede ser efectuado, por una
transformación por el plásmido pAB2 (fig. 4), construido a partir
de pUP81 (fig. 9), que contiene un ADNc que codifica la HRED bajo el
control del promotor constitutivo de la GAPDH. Los transformantes se
seleccionan según el método descrito en la patente WO94/01564. La
cepa obtenida se denomina W(GhR, \DeltaB). En esta cepa, la
secuencia que codifica la reductasa humana está bajo el control del
promotor constitutivo de la GAPDH de levadura y el citocromo b5 y la
YRED de levadura son inactivados.
Otro objetivo de la invención consiste en una
cepa caracterizada porque el ácido nucleico que codifica la
NADPH-citocromo P450-reductasa
humana está bajo control del promotor del gen de la
gliceraldehído-fosfodeshidrogenasa de levadura.
Otra cepa preferida según la invención se obtiene
a partir de la cepa W(hR, \DeltaB) por transformación por
el vector pAB3 (fig. 6 y 12) que contiene la secuencia que codifica
el citocromo b5 humano.
Se seleccionan las levaduras que han integrado
ésta. La cepa así obtenida se denomina W(hR, hb5). Esta cepa
posee las dos secuencias que codifican las proteínas humanas.
Para construir una cepa particularmente ventajosa
según la invención se transforma la cepa W(GhR, \DeltaB)
por el plásmido pAB3, de la misma manera que precedentemente. Se
obtiene así una cepa W(GhR,hb5) que tiene las propiedades de
las dos precedentes a saber que expresa el gen que codifica la
reductasa humana bajo control del promotor de la GAPDH de levadura y
que puede expresar también el gen que codifica el citocromo b5
humano bajo control del promotor pYb5 de levadura.
De manera también preferencial en esta invención
se ha construido una cepa a partir de la cepa W(hR, AB). Esta
cepa es transformada por el vector plasmídico pAP1 (fig. 8 y 13)
previamente linealizado por la acción de una enzima de restricción.
Se seleccionan los transformantes que han integrado la secuencia que
codifica el citocromo b5 humano bajo el control del promotor PGK
(fosfoglicerato-quinasa) de levadura, llevados por
pAP1, a nivel del sitio intergénico leu2/SPL1 del cromosoma de la
levadura (fig. 14).
Esta cepa lleva en la nomenclatura de esta
solicitud el nombre W(hR, Lhb5). Ella puede expresar la
secuencia que codifica la reductasa humana bajo control del promotor
pGAL10-CYC1 y la secuencia que codifica el citocromo
b5 bajo el control del promotor PGK de levadura.
Otro objetivo de la invención concierne a una
cepa de levadura caracterizada porque comprende al menos un ácido
nucleico que codifica el citocromo b5 humano bajo control del
promotor del gen de la fosfoglicerato-quinasa de
levadura.
Muy particularmente se prefiere la siguiente
cepa. Es decir se parte de la cepa W(GhR, \DeltaB) que se
transforma por el vector pAP1 linealizado. Se seleccionan los clones
que han integrado en el sitio cromosómico precitado leu2/SPL1 la
secuencia que codifica el citocromo b5 humano bajo el control del
promotor PGK de levadura.
Se obtiene entonces una cepa W(GhR, Lhb5)
que contiene las secuencias codificantes para los dos genes humanos
bajo control de dos promotores constitutivos de levadura.
Otro objetivo de la invención se caracteriza
porque, en una cepa, se tiene a la vez:
- -
- El ácido nucleico que codifica la NADPH-citocromo P450-reductasa humana bajo control del promotor del gen de la gliceraldehído-fosfodeshidrogenasa de levadura.
- -
- Y el ácido nucleico que codifica el citocromo b5 humano bajo control del promotor del gen de la fosfoglicerato-quinasa de levadura.
Otro modo de realización de la invención consiste
en partir de la cepa W(R) y transformarla por el vector pAP1,
después de selección se obtiene una cepa W(R, Lhb5,Yb5)
Preferiblemente se parte de la cepa W(hR)
que se transformará de la misma manera, después de selección se
obtiene una cepa W(hR, Lhb5, Yb5)
Las cepas construidas según la presente invención
permiten realizar procedimientos con vistas a la evaluación de la
toxicidad de los metabolitos que provienen de la degradación por el
sistema enzimático de citocromo P450 de nuevas moléculas
químicas.
Otro objetivo de la invención concierne a un
procedimiento de evaluación de la toxicidad de un compuesto,
caracterizado porque:
- -
- Dicho compuesto se pone en presencia de una levadura según la invención o de una preparación enzimática derivada de tal levadura, y se analizan los metabolitos producidos en cuanto a su toxicidad.
La presente invención permite además tener un
complejo enzimático muy parecido al existente en las células
hepáticas humanas. Esto ofrece la posibilidad de trabajar in
vitro en buenas condiciones de expresión de las enzimas humanas.
Así se puede determinar cuáles serán los metabolitos que resultan,
en el hombre, de la degradación por el complejo de citocromo P450,
de nuevos compuestos químicos.
Otro objetivo de la invención concierne a un
método de determinación in vitro de los metabolitos humanos
de un compuesto químico, caracterizado porque:
- -
- Dicho compuesto se pone en presencia de una levadura según la invención o de una preparación enzimática derivada de tal levadura, y se identifican los metabolitos producidos.
La presente invención se describe en más detalle
con ayuda de los ejemplos que siguen, que deben ser considerados
como ilustrativos y no limitativos.
Figura 1: plásmido pUP81.
Figura 2: plásmido pPL100.
Figura 3: plásmido pAB1.
Figura 4: plásmido pAB2.
Figura 5: plásmido pLIP1.
Figura 6: plásmido pAB3.
Figura 7: plásmido pCD26.
Figura 8: plásmido pAP1.
Figura 9: construcción de pAB2 a partir de
pUP81.
Figura 10: construcción de la cepa W(GhR,
\DeltaB) con pAB2.
Figura 11: construcción de la casete hb5.
Figura 12: construcción de pAB3.
Figura 13: construcción de pAP1.
Figura 14: construcción de la cepa W (GhR,
Lhb5).
Figura 15: representación de los plásmidos
pYeDP60, pYeDP1/10/hb5 y pYeDP110.
Figura 16: representación de los plásmidos pAP2,
pAP3, pVD1, pVD2, pVD3, pVD4.
Figura 17: construcción y estructura de pAP4.
Figura 18: construcción de pVD1.
Figura 19: construcción de pVD2.
Figura 20: construcción de pVD3.
Véase la tabla I siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
| W0ADIF | W0ABIF | W0A1F | W0A1 | YPGA | YPGa1A | N3 | Esporulación | |
| YNB (1) | 1,43 g/l | 1,43 g/l | 1,43 g/l | 1,43 g/l | ||||
| YE | 10 g/l | 10 g/l | 10 g/l | 2,5 g/l | ||||
| B. peptona | 10 g/l | 10 g/l | 10 g/l | |||||
| Sulfato de amonio | 5 g/l | 5 g/l | 5 g/l | 5 g/l | ||||
| Acetato de potasio | 20 g/l | |||||||
| Agar alemán | 17 g/l | 17 g/l | 17 g/l | 17 g/l | 17 g/l | 17 g/l | 17 g/l | 17 g/l |
| D-Glucosa | 20 g/l | 20 g/l | 20 g/l | 20 g/l | 20 g/l | |||
| D-Galactosa | 20 g/l | |||||||
| Glicerol | 20 ml/l | |||||||
| Adenina | 20 mg/l | 20 mg/l | 20 mg/l | 20 mg/l | 15 mg/l | 30 mg/l | ||
| L-Histidina | 10 mg/l | |||||||
| L-Leucina | 60 mg/l | 60 mg/l | 60 mg/l | |||||
| Triptófano | 20 mg/l | 20 mg/l | 20 mg/l | 20 mg/l | ||||
| Uracilo | 20 mg/l |
El medio de esporulación se completa de manera
que complementa las diferentes auxotrofias que siguen a las
cepas.
(1) La base de nitrógeno de las levaduras (YNB)
sin aminoácidos y sin amonio procede de GIBCO BRL. El sulfato de
amonio de MERCK. El agar alemán de ROHSTOFF Gmbh. La adenina, la
L-histidina y el L-triptófano de
SIGMA. La L-leucina y el uracilo de CALBIOCHEM. La
D-glucosa, la D-galactosa, el
glicerol y el acetato de potasio anhidro de PROLABO. La bactopeptona
(B. peptona) y el extracto de levadura (YE) de DIFCO.
El N3 está tamponado con un tampón de fosfato a
pH=6,2 obtenido disolviendo 89 g de Na_{2}HPO_{4}, 272 g de
KH_{2}PO_{4} y 1 g de specilline en 5 litros de agua.
Los medios líquidos tienen la misma composición
que los medios sólidos salvo que no contienen agar. Ringer: NaCl al
0,9% en agua.
- Levadura: S. cerevisiae:
- W(N): MATa y a, leu2-3,112, his3-11, ade2-1, trp1-1, ura3-1. W(N)a designa a W(N) Mat a y W(N)a designa a W(N) Mat a.
- W(\DeltaB): MATa y a, leu2-3,112, ade2-1, trp1-1, ura3-1, Yb5: HIS3. W(\DeltaB)a designa a W(\DeltaB) Mat a y W(\DeltaB)a designa a W(\DeltaB) Mat a.
- W(hR): MATa y a, leu2-3,112, his.3-11, ade2-1, trp1-1, YRED: [GAL10-CYC1::HRED]. W(hR)a designa a W (hR) Mat a y W(hR)a designa a W(hR) Mat a
- Bacterias
- E. coli DH5-1: supE44, hddR17, recA1, gyrA96, thi-1, relA1.
- Plásmido pUP81: la fase codificante del
gen de la citocromo P450-reductasa humana obtenida
por PCR con los cebadores N1 y N2, se corta por BamHI y
BglII, después es clonada en el vector de integración DP110
al nivel de su sitio BamHI, el ATG del lado del promotor
GAL10-CYC1 (Urban et al., 1993).
Cebador N1:
5'-GCggatccATGGGAGACAGTCACGTGG-3'
(SEQ ID nº 1), las bases 1 a 2 forman una pinza GC, las bases 3 a 8
(letras minúsculas) corresponden al sitio BamHI añadido, las bases 9
a 17 y 21 a 27 son respectivamente homólogas con los nucleótidos 1 a
9 y 13 a 19 de la secuencia de la fase de lectura abierta del gen de
la reductasa humana, las bases 18 a 20 (en caracteres en negrita)
permiten mutar a los nucleótidos TCC en posición 10 a 12 a partir
del ATG de la secuencia codificante de la reductasa humana. Esta
mutación permite destruir la estructura en horquilla del ARN
transcrito en los 20 primeros pares de bases, responsable de la
inhibición de la traducción en la levadura (Baim et al.,
1988).
Cebador N2:
5'-CGgaattcAGATCTAGCTCCACACGTCCAGG-3'
(SEQ ID nº 2), las bases 1 a 2 forman una pinza GC, las bases 3 a 8
(letras minúsculas) corresponden al sitio EcoRI, las bases 9
a 14 (letras subrayadas) corresponden al sitio BglII, las
bases 14 a 16 (caracteres en negrita) corresponden al codón de
terminación (cadena complementaria) y las bases 13 a 31 son
complementarias de los nucleótidos 2018 a 2034 de la fase de lectura
abierta del gen de la reductasa humana.
- Plásmido pFL26 (Bonneaud et al.,
1991).
- Plásmido pPL100: ADE2/pFL (Stotz &
Linder). El gen ADE2 de levadura ha sido modificado a fin de
construir el vector pPL100. El sitio BglII interno del gen se
destruye al mutar la adenosina en posición 593, a partir del ATG, en
guanina. Esta mutación no cambia ni la secuencia de aminoácidos ni
la actividad proteica. Un sitio BglII se introduce en la
región 5'- del gen ADE2 en posición -373 a partir del codón de
iniciación. El gen posee un sitio BglII en posición 1862 a
partir del ATG. El fragmento BglII de 2241 pb está clonado en
el vector pFL36 en el sitio BglII(Bonneaud et
al., 1991).
- El plásmido
"Blue-Script" está descrito en el kit "kit de
clonación pCR-Script^{TM} SK(+)"
(Stratagène).
Las cepas haploides de signos opuestos (a o a),
se cultivan por separado en medio completo YPGA. Las células se
diluyen a continuación en Ringer a 10^{5} células/ml
aproximadamente. Se prepara una mezcla de 500 ml de cada una de las
dos suspensiones de células haploides. A partir de la mezcla, se
extienden 50 ml de suspensión sobre medio sólido YPGA. Después de 8
h de crecimiento, las células son sub-clonadas sobre
un medio selectivo que no complementa las auxotrofias presentes
simultáneamente en los dos padres. Esto permite el crecimiento del
diploide que resulta del crecimiento, pero no de los haploides de
origen. Después de dos días de crecimiento, los clones diploides que
aparecen son replicados sobre el mismo medio selectivo.
Las células diploides son replicadas sobre un
medio de esporulación sólido complementado por los marcadores de
auxotrofia del diploide Al cabo de 3 días de esporulación, se
disecan las esporas.
Se diluyen las esporas en tubos Eppendorff de 1,5
ml, a 5.10^{8} células/ml, en agua que contiene zimoliasa 10.000
(Seikagaku Kogyo Co., Tokyo, Japan) a 100 mg/ml, y después se
incuban durante 30 min a 28ºC. Se centrifuga una alícuota de 500 ml
a 10.000 rpm durante 1 min. El residuo celular se recoge en 1 ml de
agua, se centrifuga y se recoge en 100 ml de agua. Las células se
agitan en vórtex durante 2 min. Se enjuaga el tubo con agua
repitiendo 2 a 3 veces. Después de 5 enjuagues, las esporas que son
hidrófobas, se adhieren a las paredes del tubo, mientras que las
células vegetativas diploides permanecen en suspensión y se eliminan
por lavado. Las esporas se vuelven a suspender a continuación en una
solución de Nonidet P-40 al 0,01% (v/v) (Sigma). Se
elimina el detergente después de centrifugación. Las esporas
purificadas se recogen en Ringer y se extienden sobre medio
selectivo sólido.
Las esporas se incuban en una solución (con
glicerol al 55%) de citohelicasa (Biosepra) a 0,5 g/l durante 15 min
a 22ºC, después se extienden sobre un trozo de agar previamente
cortado y depositado sobre una lámina. La lámina se deposita a
continuación sobre el reverso de una cámara de microdisección. Las
cuatro esporas, contenidas en una tétrada, se separan bajo un
microscopio con la ayuda del micromanipulador. El agar, que soporta
las tétradas así disecadas, se deposita sobre una placa de medio
completo YPGalA.
El ADN del promotor del gen de la
gliceraldehído-fosfodeshidrogenasa de levadura ha
sido clonado por la técnica de la PCR a partir de 100 ng de ADN
genómico de S. cerevisiae W(N) preparados siguiendo el
método descrito (Bellamine et al., 1994), utilizando como
iniciadores 50 ng de los cebadores N3 (SEQ ID nº 3) y N4 (SEQ ID nº
4) (Fig. 9). La amplificación se hace con 2,5 U de Pfu
ADN-polimerasa nativa (Stratagène). La reacción de
polimerización tiene lugar en 50 ml de una solución de
Tris-HCl 20 mM, KCl 10 mM,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 6 mM, MgCl_{2} 2 mM Triton
X-100 al 0,1%, 10 mg/ml de "seroalbúmina" sin
nucleasa y 200 mM de cada uno de los cuatro
desoxinucleótidotrifosfatos (dNTP). Las condiciones de PCR son las
siguientes:
| 2 preciclos | 95ºC | 10 s |
| 40ºC | 50 s | |
| 60ºC | 5 s | |
| 74ºC | 2 min | |
| 25 ciclos | 95ºC | 5 s |
| 48ºC | 50 s | |
| 65ºC | 5 s | |
| 74ºC | 2 min |
Las secuencias de los cebadores son:
- Cebador N3:
5'-CCaagcttGAGTTTATCATTATCAATACTCG-3'
(SEQ ID nº 3), las dos primeras bases forman una pinza GC, las
letras en minúsculas corresponden al sitio HindIII, las bases
que van de 9 a 31 son homólogas con los nucleótidos -673 a -650 de
la secuencia del promotor del gen GAPDH.
- Cebador N4:
5'-CggatccTATTTATGTGTGTTTATTCGAAACTAAGTTCTTGG-3'
(SEQ ID nº 4), las letras en minúsculas corresponden al sitio BamHI,
las bases que van de 8 a 42 son complementarias de los nucleótidos
-6 a -48.
El tamaño del ADN amplificado es de 691 pb.
Se añaden 26 ml de acetato de amonio 7,5 M y 4 ml
de agua a 50 ml del producto de la PCR. Le mezcla se precipita con
80 ml de etanol durante 10 min a 22ºC. Se centrifuga el ADN
precipitado a 10.000 rpm durante 10 min. El residuo se lava con
etanol al 70% (v/v), se seca, y se recoge en 20 ml de agua.
Una alícuota de 10 ng de este ADN es clonada en
el sitio SrfI del vector Blue Script del kit "kit de clonación
pCR-Script^{TM} SK(+)" siguiendo las
recomendaciones del vendedor (Stratagène). Los clones se seleccionan
por restricción con PvuII. Los que dan los fragmentos PvuII a 2513 y
1139 pb, son secuenciados sobre 100 pb a nivel de la unión entre el
ADN clonado y el vector Blue-Script con el kit:
Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit U. S. B. (Amersham). Estas
construcciones se llaman pAB1.
El clon pAB1 se corta por HindIII. Este
corte genera un sitio de extremo adhesivo que es rellenado gracias
al fragmento Klenow de la DNA-polimerasa
(Biolabs). El vector pAB1 así linealizado (fragmento de 3652 pb) es
cortado a continuación, en su extremidad 5' por BamHI,
después es clonado en el vector pUP81 entre los sitios EcoRV
et BamHI. Durante la ligación el sitio HindIII que se ha
vuelto de extremo romo, se adapta al sitio EcoRV que es de
extremo romo, mientras que los dos semi-sitios
BamHI del fragmento pGAPDH y del vector de integración pUP81,
se ligan entre ellos. El sitio EcoRV ha sido elegido para
romper al mismo tiempo el gen URA3 (Fig. 9). Los clones son
seleccionados por restricción enzimática con las enzimas PstI y
BamHI. Aquellos que dan los fragmentos de ADN de 600 y 800 pb
además de los fragmentos de 60, 104, 197, 385, 440 y 2564 pb
(fragmentos que existen en el vector pUB81), representan los
vectores pUP81 que contienen el ADN del promotor GAPDH. Esta
construcción se llama pAB2. Tres clones que contienen el plásmido
pAB2 son verificados por secuenciación sobre 100 pb con el cebador
N3 (SEQ ID nº 3) a partir del extremo 5' del ADN del promotor del
gen GAPDH.
Esta construcción ha sido hecha en tres PCR
diferentes.
En la primera PCR (PCR 1), los 353 pb del extremo
3' del promotor del gen del citocromo b5 de levadura (Yb5), han sido
amplificados utilizando los cebadores N5 (SEQ ID nº 5) y N6 (SEQ ID
nº 6) y el ADN genómico de levadura W(N):
- -
- Cebador N5: 5'-ggatccGAGCGGGTAATAGCCTGGAGTTTCC-3'(SEQ ID nº 5), consta de un sitio BamHI a partir de su extremo 5' (en letras minúsculas). Este cebador es homólogo, en las bases 7 a 31, con los nucleótidos -331 a -306 de la fase abierta del promotor del gen del citocromo b5 de levadura.
- -
- Cebador N6: 5'-ccgactgctctgccatGATTGTTTGATATTTTATGTTGTAGTTGATTG-3'(SEQ ID nº 6), a partir de su extremo 5' consta de: bases 1 a 16, la secuencia complementaria de los 16 primeros nucleótidos del extremo 5' de la fase de lectura abierta del gen del citocromo b5 humano (letras minúsculas), bases 17 a 49, la secuencia complementaria de los nucleótidos -1 a -32 del promotor del gen del citocromo b5 de levadura.
El fragmento amplificado tiene 375 pb.
En la segunda PCR (PCR 2), los 147 últimos pb de
la parte 5' del terminador del gen del citocromo b5 de levadura han
sido amplificados por los cebadores N7 (SEQ ID nº 7) y N8 (SEQ ID nº
8):
- -
- Cebador N7: 5'-cctatacatggcagaggactgaATTCTITITCTTCCAGAATAGCCCACAC-3'(SEQ ID nº 7), a partir de su extremo 5' consta de: bases 1 a 22: secuencia homóloga con los nucleótidos 383 a 405 de la fase abierta del gen del citocromo b5 humano (letras minúsculas), bases 23 a 50, la secuencia homóloga con los nucleótidos 1 a 28 del terminador a partir del codón de terminación.
- -
- Cebador N8: 5'-GGagatctGTGACATACTTCTATGCGATATAG-3'(SEQ ID nº 8), consta de una pinza GC en las bases 1 a 2 y un sitio BglII en las bases 3 a 8 (en letras minúsculas). Este cebador es complementario, en las bases 9 a 32, de los nucleótidos 1 a 147 de la fase abierta del terminador del gen YCYB5 de levadura a partir del codón de terminación.
El fragmento amplificado tiene 180 pb.
En las PCR 1 y 2, el ADN genómico de la levadura
W(N) se utiliza como matriz.
En una tercera PCR (PCR 3), se utilizan 4
cebadores:
- -
- Doscientos nanogramos de los productos de las dos primeras PCR (375 y 180 pb) se utilizan como cebadores y 100 ng del ADN de la fase codificante del citocromo b5 humano como matriz (Fig. 11). Esto permite tener la casete de integración del b5 humano (CIH) pero en menor cantidad.
\newpage
- -
- El producto de esta PCR se amplifica a continuación por los cebadores N5 (SEQ ID nº 5) y N8 (SEQ ID nº 8), esto ha permitido tener la casete de integración en mayor cantidad. El producto de fusión se trata después de la amplificación con la Pfu-polimerasa en presencia de dNTP 0,2 mM durante 30 min a 76ºC. El fragmento obtenido tiene 917 pb. Las amplificaciones se realizan con la Taq-polimerasa (Appligène).
Los programas de PCR utilizados son los
siguientes:
PCR 1 y PCR 2:
| 2 preciclos | 88ºC | 3 s |
| 95ºC | 10 s | |
| 42ºC | 2 min | |
| 60ºC | 3 s | |
| 74ºC | min 30 s | |
| 30 ciclos | 88ºC | 3 s |
| 95ºC | 5 s | |
| 50ºC | 1 min | |
| 65ºC | 3 s | |
| 74ºC | 2 min. |
\vskip1.000000\baselineskip
PCR 3:
| 3 preciclos | 88ºC | 3 s |
| 95ºC | 10 s | |
| 40ºC | 5 min | |
| 60ºC | 3 s | |
| 74ºC | 3 min | |
| 15 ciclos | 88ºC | 3 s |
| 95ºC | 5 s | |
| 45ºC | 2 min | |
| 65ºC | 3 s | |
| 74ºC | 2 min. |
La casete de integración así construida (CIH), es
clonada en el vector pCRScript a nivel del sitio SfrI. El clon
obtenido pLIP1 se controla por secuenciación sobre 200 pb a nivel de
las dos uniones: del promotor y del terminador del gen YCYB5 de
levadura y de la fase codificante del gen del citocromo b5 humano. A
fin de prolongar los pies de recombinación para que la integración
de la casete de integración del b5 humano se haga correctamente, se
ha construido una nueva casete de integración que consta de la fase
codificante del gen del citocromo b5 humano y de la totalidad del
promotor y del terminador del gen YCYB5 de levadura, a partir del
fragmento BamHI/BglII de 917 pb del vector pLIP1. El
vector YCYB5/YEP352 que contiene la totalidad del gen YCYB5 de
levadura (Truan et al., 1994), se corta en un sitio único
ClaI. Este fragmento linealizado se cotransforma en la cepa
W(N)a con el fragmento BamHI/BglII de 917 pb
del vector pLIP1. En la linealización del vector YCYBS/YEP352, que
está a nivel de la fase codificante del gen YCYB5, el citocromo b5
de levadura será sustituido por el citocromo b5 humano a
continuación de una recombinación homóloga en la levadura (Fig.
12). La selección de los recombinantes se hace gracias a la
recircularización del vector de expresión (Bellamine et al.,
1994). El nuevo vector pAB3 se recupera a partir de la levadura y
después se amplifica en la bacteria E. coli según el método
descrito (Bellamine et al., 1994).
Se ha construido una casete que permite integrar
el gen del citocromo b5 humano en la proximidad inmediata del gen
LEU2 en la región intergénica con 500 pb del gen SPL1, en dos
etapas:
- -
- Construcción del vector pCD26: a partir del vector pFL26 (Bonneaud et al., 1991) que lleva a la vez el gen LEU2 y 500 pb del gen SPL1, se ha introducido un sitio NotI en tres PCR (Fig. 13).
En la primera PCR, los 704 pb de la parte 3'- del
gen LEU2 se amplifican utilizando los cebadores N9 (SEQ ID nº 9) y
N10 (SEQ ID nº 10):
- -
- Cebador N9: 5'-TTGAAGGTTCAACATCAATTGATTG-3 (SEQ ID nº 9)' es homólogo de los nucleótidos 2190 a 2214 del vector pFL26 que corresponden al fin de la fase abierta del gen LEU2 (la numeración, a nivel del vector pFL26, se hace a partir del nucleótido 1 situado a 417 pb hacia arriba del sitio BamHI).
- -
- Cebador N10: 5'-GTGTGgcggccgcCTCCTTGTCAATATTAATGTTAAAG-3' (SEQ ID nº 10), consta, en su extremo 5'- de, cinco bases complementarias de los nucleótidos 2890 a 2894 del vector pFL26, un sitio NotI de las bases 6 a 13 y una secuencia complementaria de los nucleótidos 2857 a 2881 de las bases 14 a 38.
En la segunda PCR, los 347 últimos pb de la parte
3' del gen SPL1 se amplifican utilizando los cebadores N11 (SEQ ID
nº 11) y N12 (SEQ ID nº 12):
- -
- Cebador N11: 5'-CAAGGAGgcggccgcCACACAAAAAGTTAGGTGT-3'(SEQ ID nº 11), consta en su extremo 5' de, siete bases complementarias de los nucleótidos 2875 a 2881 de la secuencia del vector pFL26, un sitio NotI de las bases 8 a 15 y una secuencia homóloga de los nucleótidos 2889 a 2908 del pFL26, de las bases 16 a 34.
- -
- Cebador N12: 5'-TCTGCTTCCCTAGAACCTTCTTATG-3'(SEQ ID nº 12) es complementaria de los nucleótidos 3198 a 3222 del extremo 3' de la cadena que codifica la fase abierta del gen SPL1 en el vector pFL26.
En la tercera PCR, 100 ng de los dos fragmentos
obtenidos de las dos primeras PCR (que tienen 20 pb de solapamiento
que contienen el sitio NotI), son utilizados como matriz y
los cebadores N9 y N12 como iniciadores. Los 1031 pb amplificados
son clonados en el vector pFL26 en los sitios NsiI y BstXI
para dar el vector pCD26.
Las amplificaciones se hacen con la
Taq-polimerasa Appligène. Las dos primeras PCR
utilizan el mismo programa que las PCR 1 y 2 del párrafo 8, la PCR 3
utiliza el programa siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
| 30 ciclos. | ||
| 95ºC | 10 s | |
| 60ºC | 5 s | |
| 45ºC | 1 min | |
| 65ºC | 5 s | |
| 74ºC | 2 min |
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Construcción del vector de integración pAP1: A partir del plásmido pUP12 previamente construido (Urban et al., 1990), se recupera la casete de expresión del citocromo b5 humano bajo el control del promotor y del terminador del gen PGK (fosfoglicerato-quinasa) de levadura, gracias a un corte BamHI/HindIII. Este fragmento de 2400 pb se vuelve de extremos romos gracias a la Mung Bean nucleasa (Biolaps), después se clona en el vector pCD26 cortado en el sitio NotI vuelto de extremos romos gracias al fragmento Klenow de la DNA-polimerasa (Fig. 13). Los clones que dan fragmentos de restricción PstI de 5154 y 2904 pb denominados pAP1 son utilizados para la integración.
El plásmido pYeDP60 es un vector vehículo
(bacteria, levadura) de 9265 pb que posee los orígenes de
replicación ori E. coli y ori 2 \mu, el gen
bla que codifica la resistencia a la ampicilina, los genes
URA3 et ADE 2 que son marcadores de complementaciones
de auxotrofia, un promotor híbrido GAL10-CYC1
inducible en presencia de galactosa y el terminador de transcripción
del gen PGK. Un policonector que comprende entre otros los sitios
de restricción BamHI, KpnI, EcoRI se inserta entre el
promotor y el terminador de transcripción a fin de clonar un ADNc a
expresar. Los plásmidos 1A1/V60 y 3A4/V60 corresponden al vector V60
en el cual las fase codificantes de los ADNc que codifican
respectivamente los citocromos P450 1A1 y 3A4 humanos han sido
insertadas bajo control del promotor
GAL10-CYC1 y del terminador de transcripción PGK.
GAL10-CYC1 y del terminador de transcripción PGK.
\newpage
- -
- extracto de levadura
\hskip0.9cm
10 g/l
- -
- bactopeptona
\hskip0.7cm
10 g/l
- -
- glucosa
\hskip0.4cm
5 g/l
- -
- etanol
\hskip0.53cm
30 ml/l
- -
- base
nitrogenada de levadura (Difco)
\hskip0.2cm
7 g/l
- -
- Glucosa
\hskip0.2cm
20 g/l
- -
- Casaminoácido (Difco)
\hskip0.2cm
1 g/l
- -
- Triptófano
\hskip0.2cm
20 mg/l
- -
- Agar
\hskip0.2cm
15 g/l (para los medios sólidos únicamente).
Para el medio galactosado correspondiente (SW5)
la glucosa es reemplazada por la galactosa a la misma
concentración.
Las levaduras son transformadas por los plásmidos
1A1/V60 o 3A4/V60 según el método estándar denominado al "cloruro
de litio". Los transformantes se seleccionan sobre un medio de
cultivo de levadura glucosado sintético desprovisto de adenina y de
uracilo (SW6) al que se han adicionado los nutrientes necesarios
para complementar las auxotrofias residuales según la cepa utilizada
(véase el genotipo de las cepas). Una fuerte proporción de los
transformantes primarios seleccionados sobre el medio glucosado no
crecen sobre un medio mínimo de cultivo galactosado. Sólo se
conservan los clones que se desarrollan correctamente sobre el medio
de galactosa.
Los clones seleccionados se replican sobre un
medio mínimo no inductor glucosado selectivo para el plásmido
(generalmente medio SW6), después se incuban una noche a 28ºC, en 20
ml del mismo medio líquido.
Se siembran 250 ml de medio YPGE con el
precultivo y se incuban bajo agitación a 28ºC hasta obtener una
densidad celular comprendida entre 8 y 9,6.10^{7} células/ml.
Seguidamente se vuelve a añadir galactosa a una concentración de 20
g/l, y se incuba el cultivo a 28ºC durante la noche, de forma que se
obtenga una densidad celular de 2.10^{8} células/ml. La presencia
de galactosa permite la inducción del citocromo P450 y de otros
genes dependientes del promotor GAL10-CYC1.
Las células son centrifugadas y lavadas en tampón
TE pH 7,4 (Tris-HCl, 50 mM; EDTA 1 mM); KCl 0,1 M, y
puestas en suspensión en tampón TE pH 7,4; Sorbitol 0,6 M. A fin de
romper las células, se añaden cuentas de vidrio y se agitan
vigorosamente los tubos de abajo a arriba durante 5 min a 4ºC. Las
etapas siguientes se llevan a cabo a 4ºC. La suspensión de células
rotas se recupera y las cuentas de vidrio se lavan varias veces con
el mismo tampón. A fin de eliminar los desechos celulares y los
núcleos así como la fracción mitocondrial, se efectúan dos
centrifugaciones de 3 min a 3500 rpm y de 10 min a 15000 rpm
respectivamente. Para precipitar los microsomas, se incuba el
sobrenadante en presencia de NaCl (0,15 M final) y de PEG 4000 (10%
final) durante 15 min en hielo. Después de una centrifugación de 10
min a 10000 rpm, se recupera el residuo de microsomas en el tampón
TE pH 7,4; glicerol al 20%. La preparación de microsomas se divide
en alícuotas y se almacena a -80ºC.
La concentración de citocromo P450 en las
fracciones microsomales se determina espectralmente. El citocromo
P450 a dosificar se diluye en el tampón TE pH 7,4 (aproximadamente 1
mg de proteínas microsomales por ml) y se reduce por algunos granos
de ditionito de sodio. Después de registrar la línea base (citocromo
P450 reducido frente a citocromo P450 reducido), se añaden algunas
burbujas de CO a la cubeta de medida y se mide el espectro
diferencial entre 400 y 500 nm. El CO forma un complejo estable con
el hierro reducido del citocromo P450, este complejo presenta un
máximo de absorción característico a 450 nm. El coeficiente de
absorción _{-}\varepsilonM (450-490 nm) es de 91
mM^{-1}. cm^{-1}.
La dosificación de las proteínas totales se
realiza con el kit de dosificación PIERCE-BCA en las
condiciones dadas por el fabricante. La seroalbúmina bovina se
utiliza como estándar.
El citocromo P450 1A1 cataliza la
O-desetilación de la
7-etoxi-resorufina. El producto de
la reacción, la resorufina (7-hidroxifenoxazina),
después de excitación a 530 nm, produce fluorescencia a 586 nm. La
cantidad de resorufina formada por unidad de tiempo corresponde a la
velocidad de acumulación de la resorufina.
La mezcla de incubación comprende:
- -
- 2 \mul de una suspensión microsomal (entre 20 y 50 µg de proteínas microsomales) en 1 ml de tampón TE pH 7,4, que contiene NADPH 50 \muM y 2,5 \muM de 7-etoxi-resorufina. Para determinar el efecto del citocromo b5 de conejo sobre la eficacia catalítica, las fracciones microsomales son incubadas previamente en frío en presencia de un exceso de citocromo purificado.
La testosterona es una hormona esteroidea
hidroxilada en posición 6\beta por el citocromo 3A4. El medio de
incubación comprende 100 \mug de proteínas microsomales en 0,25 ml
de tampón Tris 50 mM, EDTA 1 mM pH 7,4 o fosfato de sodio 50 mM pH
7,4, que contiene NADPH 50 \muM, testosterona 80 \muM (a partir
de una solución madre 5 mM en etanol), en ausencia o en presencia de
un exceso de citocromo b5.
Las incubaciones tienen lugar durante 10 min a
28ºC o 37ºC. La reacción se para por adición de 10 \mul de TFA al
50% en agua. El procedimiento de extracción es el siguiente:
- -
- adición de 500 \mul de diclorometano
- -
- agitación en vórtex a la velocidad máxima durante 1 min
- -
- centrifugación durante 5 min a 10.000 rpm
- -
- eliminación de la fase acuosa superior
- -
- evaporación de la fase orgánica bajo flujo de nitrógeno.
El residuo seco se recoge con 20 \mul de
metanol, después se añaden 20 µl de agua. La mitad se inyecta en una
columna de HPLC de fase inversa
SPHERI-5RP-18,5 \mum (100 x 2,1
mm) utilizando como eluyente acetonitrilo a 1 ml/min. La composición
en acetonitrilo del gradiente de elución varía de 10% (vol/vol) a
los 0 min hasta 60% a los 8 min. La detección se realiza a 254 nm.
Los tiempos de elución son 6 min 20 s para la
\beta-hidroxitestosterona y 8 min para la
testosterona.
La cepa W(\DeltaB)a (que crece
sobre el medio W0ABIF) y la cepa W(hR)a (que crece
sobre el medio W0ADIF) se cruzan entre ellas y se selecciona el
diploide sobre el medio de glucosa WOAIF. Este medio es letal para
cada uno de los haploides y no para el diploide W(hR/YR,
Yb5/DYb5). Los clones diploides son sub-clonados
sobre el mismo medio selectivo. Después de esporulación, se disecan
las tétradas o bien por microdisección o bien por disección a
granel. Las esporas cultivadas sobre el medio YPGalA se replican a
continuación sobre diferentes medios selectivos que contienen
galactosa como fuente de carbono, a fin de analizar las auxotrofias
de las diferentes esporas. Los clones de levadura que crecen sobre
el medio de galactosa y que son prototrofos para el uracilo y la
histidina corresponden a la cepa W(hR, \DeltaB). Estas
levaduras no siguen creciendo cuando se reemplaza sobre el mismo
medio la galactosa por la glucosa, pues en estas condiciones, la
reductasa humana no se expresa. Siendo entonces estas cepas
deficientes a la vez en reductasa y en b5 de levadura (cuyo gen está
disrupto), no crecen pues la doble deficiencia es letal (Truan et
al., 1994). Se retienen cuatro clones para lo siguiente: Sp1 y
Sp2 obtenidos por microdisección, y C1 y C2 obtenidos por disección
a granel.
El vector de integración del promotor GAPDH pAB2
cortado por NotI, se utiliza para transformar la cepa W(hR,
\DeltaB)a. El vector pPL100 se utiliza como marcador de
cotransformación (10 a 15 ng de ADN del vector pPL100 para 2 mg de
ADN del vector pAB2). Los transformantes se seleccionan sobre el
medio WOBDIF. Los clones pasan por 3 series de cribas:
- -
- Una selección de la auxotrofia para el uracilo: los transformantes son replicados sobre el medio W0ABDIF, después sobre el medio W0ADIF para señalar los clones que no crecen en ausencia de uracilo. La pérdida del gen URA3 sugiere que el promotor GAPDH ha reemplazado al promotor GAL10-CYC1, pues la integración del promotor GAPDH en el lugar del promotor GAL10-CYC1 inactiva al mismo tiempo el gen URA3 que está hacia arriba del promotor. El 25% de los transformantes no crecen en ausencia de uracilo (Fig. 10).
- -
- La segunda selección: para verificar la actividad de la reductasa humana expresada bajo el control del promotor GAPDH, ha sido evaluada la resistencia al quetoconazol de los clones W(GhR, AB) (Patente nº WO94/01564). Tres clones diferentes tienen una resistencia al quetoconazol de 20 mg/ml mientras que la cepa W(hR), en la que la reductasa humana está expresada bajo el control del promotor GAL10-CYC1, tiene una resistencia de 1 a 5 mg/ml en las mismas condiciones.
- -
- Tercera selección: A fin de estimar el nivel de expresión de la reductasa humana en la cepa W(GhR, AB), se mide la reducción del citocromo c por la reductasa contenida en las fracciones microsomales de los tres clones estudiados (Truan et al., 1993). Siguiendo las condiciones de cultivo, la reducción del citocromo c es de 1,5 a 3 veces más importante que en la cepa W(hR).
- -
- Ensayo de respiración: los clones obtenidos se replican sobre el medio sólido N3 a fin de ensayar su fenotipo respiratorio. Los tres clones no crecen sobre N3. Ellos son por tanto de fenotipo de respiración negativa. Para hacerlos de [respiración positiva], estos clones se cruzan con una cepa con fenotipo de respiración positiva W(hR)a. El diploide obtenido W(GhR/hR, \DeltaB/Yb5) se selecciona sobre el medio WOAIF. Después de la esporulación y disección a granel, el ADN genómico de los haploides se prepara una vez que se efectúa una PCR sobre este ADN, utilizando los cebadores N13 (SEQ ID nº 13) y N14 (SEQ ID nº 14).
- -
- Cebador N13: 5'-CAGATCTGCATGCCTAAAGTTTACAGTTACC-3'(SEQ ID nº 13), las bases 1 a 30 son homólogas de los 30 nucleótidos del extremo 5'- de la fase de lectura del gen YCYB5 de levadura.
- -
- Cebador N14: 5'-CGGATTCTGCAGTTATTCGTTCAACAAATAATAAGCAACACC-3'(SEQ ID nº 14), las bases 1 a 42 son complementarias de los nucleótidos 321 a 363 de la cadena que codifica el b5 de levadura.
Entre los seis clones analizados, tres clones
tienen una banda amplificada a 363 pb (la fase codificante del gen
del citocromo b5 de levadura), los otros tres clones tienen una
banda de 2063 pb que corresponde a la suma del tamaño del gen HIS3
(1700 pb) y el tamaño de la fase abierta del b5 de levadura (363
pb). Estos clones son sub-clonados sobre el medio
sólido W0ABIF para ensayar su auxotrofia frente a la histidina.
Todos los clones crecen en ausencia de histidina mientras que el 50%
de ellos (los que tienen la banda de PCR amplificada a 363 pb)
parecen ser auxotrofos para la histidina. En la cepa de origen
W(N), el gen his3-11 está mutado. En la
construcción de la cepa W(\DeltaB) (Truan et al.,
1993), la disrupción del gen YCYB5 de levadura por integración del
gen HIS3 en la fase codificante del YCYB5 va probablemente
acompañada por una segunda integración del gen HIS3 en otro locus.
Esto habría llevado a la construcción de una cepa
(W(\DeltaB)) que contiene dos copias funcionales del gen
HIS3. La segregación del gen HIS3 no será ya del tipo 2/2. Esto
podría explicar el resultado obtenido. Dos de estos clones se
retienen para lo que sigue (B1 y B2).
Los 4 clones SP1, SP2, C1 y C2 se cultivan en
medio completo líquido YPGalA y se transforman por el fragmento
PvuII de 2022 pb del vector pAB3 (Fig. 12). Los transformantes se
extienden sobre el medio YPGA. La selección de los integrantes se
hace sobre la capacidad del citocromo b5 humano para salvar de la
letalidad a la cepa W(hR, \DeltaB) sobre el medio
glucosado. Los clones que han crecido se reagrupan por lotes. Se
prepara el ADN genómico de cada lote. Se efectúa una PCR utilizando
los cebadores N5 (SEQ ID nº 5) y N15 (SEQ ID nº 15) (las mismas
condiciones que las PCR 1 y 2 del párrafo 8). Los lotes que dan una
banda amplificada de 758 pb, se analizan individualmente por PCR. A
partir del clon inicial W(hR, \DeltaB) Sp1, se obtiene un
clon que tiene integrada la casete de expresión del citocromo b5
humano en el locus YCYB5, W(hR, hb5).
- -
- Cebador N15: 5'-CCgaattcTGATCAGTCCTCTGCCATGTATAGG-3'(SEQ ID nº 15), bases 1 a 2: pinza GC, las bases 3 a 8 corresponden al sitio EcoRI (letras minúsculas), las bases 9 a 14 corresponden al sitio BclI, las bases 12 a 14 corresponden al codón de terminación y las bases 15 a 33 son complementarias de los nucleótidos 386 a 405 de la fase de lectura abierta del gen del citocromo b5 humano.
Los clones B1 y B2 se cultivan en medio completo
YPGA líquido y se transforman por el fragmento de 2022 pb PvuII del
vector pAB3, así como por el vector pPL100 como marcador de
cotransformación. Los transformantes se seleccionan sobre el medio
W0BDIF sólido. Los clones que crecen se reagrupan a continuación por
lotes y se analizan por PCR utilizando los cebadores N3 (SEQ ID nº
3) y N13 (SEQ ID nº 13). De la misma forma que en el párrafo
precedente, se verifican los clones individuales por la PCR.
El vector de integración pAP1 es cortado por
XbaI. Los 4 clones SP1, SP2, C1 y C2 se transforman por este
fragmento linealizado. Los transformantes se extienden sobre el
medio YPGA. Por recombinación homóloga en la levadura, la casete de
expresión del citocromo b5 humano bajo la dependencia del promotor y
del terminador del gen PGK, se integra en el sitio intergénico
leu2/SPL1 (Fig. 14). Esta recombinación permite al mismo tiempo
reemplazar el gen leu2-3 inactivo en el
genoma por el LEU2 original llevado por el vector pAP1. Una primera
selección de los transformantes se hace sobre la restitución del gen
LEU2, es decir la prototrofia de los transformantes frente a la
leucina (medio de selección W0AI). Una segunda selección se hace por
PCR sobre el ADN genómico de los transformantes utilizando los
cebadores N9 (SEQ ID nº 9) y N16 (SEQ ID nº 16), y las condiciones
de PCR descritas en el párrafo 9. Los clones que presentan una banda
de PCR a 1495 pb tienen integrada la casete de expresión del
hb5.
- -
- Cebador N16: 5'-GCCCAGATCTATGGCAGAGCAGTCGGACG-3'(SEQ ID nº 16), de las bases 1 a 4 lleva una secuencia pinza GC, de las bases 5 a 10 un sitio BglII y de las bases 11 a 29 una secuencia homóloga de los nucleótidos 1 a 19 (a partir del ATG) de la fase abierta del gen del citocromo b5 humano.
La construcción de esta cepa se hace de la misma
forma que la cepa W(hR, Lhb5) pero a partir de W (GhR, AB).
La selección de los transformantes se hace directamente sobre medio
W0ABI después por análisis PCR sobre el ADN genómico.
La cepa W(R) se cultiva en medio completo
YGPA líquido y se transforma por el vector pAP1 linealizado por
Xba1. Una primera selección de los transformantes se hace
sobre la restitución del gen LEU2, es decir la prototrofia de los
transformantes frente a la leucina (medio de selección W0AI). Una
segunda selección se hace por PCR sobre el ADN genómico de los
transformantes utilizando los cebadores N9 (SEQ ID nº 9) y N16 (SEQ
ID nº 16), y las condiciones de PCR descritas en el párrafo 9
(material y métodos). Los clones que presentan una banda de PCR a
1495 pb tienen integrada la casete de expresión del hb5. Esta cepa
sobreexpresa la reductasa de levadura en presencia de galactosa y
expresa el citocromo b5 humano bajo el control del promotor PGK. La
expresión del b5 endógeno no cambia con relación a la cepa
normal.
La construcción es idéntica a la de la cepa
W(R, Lhb5, Yb5) pero se reemplaza la cepa W(R) por la
cepa W(hR).
Los niveles de expresión de dos citocromos P450
en las diferentes cepas se indican en las tablas II y III. De manera
sorprendente, el nivel de expresión de los citocromos P450 en
condiciones de cultivo equivalentes se ve significativamente
aumentado en las cepas humanizadas. Se nota que la actividad por mg
de proteína crece proporcionalmente, a la vez, al nivel de expresión
y al valor de la renovación.
| Expresión del citocromo P450 1A1 humano en los microsomas de levadura humanizada. | |||
| Cepas | P450 (\muM) | proteína (mg/ml)^{a} | P450 (pmol/mg)^{b} |
| W(N) | 1,6 | 20 | 80 |
| W(R) | 4,5 | 30 | 150 |
| W(R, Lhb5,Yb5) | 4,1 | 31 | 130 |
| W(hR) | 4,4 | 28 | 155 |
| W(hR, Lhb5) | 5,6 | 22 | 260 |
| W(GhR,\DeltaB) | 6,6 | 26 | 250 |
| W(GhR, Lhb5) | 10,1 | 29,5 | 342 |
| ^{a} concentración en citocromo P450 (determinación espectral) de la suspensión de microsomas. | |||
| ^{b} concentración en proteínas totales de la solución de microsomas. |
| Expresión del citocromo P450 3A4 humano en los microsomas de levadura humanizada | |||
| Cepas | P450 (µM)^{a} | Proteína (mg/ml)^{b} | P450 (pmol/mg) |
| W(N) | 80 | ||
| W(R) | 10,4 | 32 | 320 |
| W(R, Lhb5,Yb5) | 9,1 | 30 | 300 |
| W(hR) | 10,5 | 34 | 310 |
| W(hR, Lhb5) | 4 | 23 | 180 |
| W(GhR,\DeltaB) | 7,4 | 29 | 250 |
| W(GhR, Lhb5) | 9 | 22 | 410 |
| ^{a} concentración en citocromo P450 (determinación espectral) de la suspensión de microsomas. | |||
| ^{b} concentración en proteínas totales de la solución de microsomas. |
Los resultados obtenidos indican que la eficacia
catalítica del citocromo P450 1A1 es óptima en la cepa haploide
W(R, LHb5) que sobreproduce la reductasa de levadura y
produce el citocromo b5 humano. La adición de citocromo b5 de conejo
produce sin embargo un ligero aumento suplementario de la actividad
que alcanza una renovación de 27 pmol de metabolito/pmol de
citocromo P450 por min.
A la inversa de los resultados obtenidos con el
citocromo P450 1A1, la eficacia catalítica del citocromo P450 3A4
está preferiblemente aumentada en las cepas de levaduras que
expresan la reductasa humana. La cepa W(GhR, hb5) muestra una
eficacia catalítica óptima. Cualquiera que sea la naturaleza y el
nivel de la reductasa, la presencia del ADNc que codifica el
citocromo b5 en el genoma de las cepas se traduce por un aumento de
la eficacia catalítica (con un factor 2 a 20). La deleción del gen
endógeno del citocromo b5 aparece como un factor fuertemente
favorable particularmente en presencia de b5 humano expresado. La
expresión de la reductasa humana, la disrupción del citocromo b5
endógeno y la expresión del b5 humano en una misma cepa de levadura
haploide constituye un conjunto particularmente favorable a la
expresión de ciertos citocromos P450 humanos, en particular el
citocromo P450 3A4.
Este ejemplo describe la construcción de
plásmidos utilizables para optimizar la actividad P450 de las cepas
de levadura según la invención. Estos plásmidos permiten la
expresión simultánea de un citocromo P450 y del citocromo b5
microsomal humano. Todos los plásmidos de la serie incluyen el
conjunto original de los caracteres comunes siguientes:
- (i)
- La casete de expresión del P450 está preferiblemente bajo el control transcripcional del promotor inducible GAL10-CYC1.
- (ii)
- La casete de expresión del citocromo b5 está preferiblemente bajo el control transcripcional de uno de los tres promotores siguientes: GAL10-CYC1, GAPDH o PGK.
- (iii)
- Dos marcadores de selección están presentes de los que uno es preferiblemente el gen ADE2 de levadura.
- (iv)
- Las dos casetes de expresión están separadas sobre el plásmido, de un lado por el origen de replicación de levadura, del otro lado por el marcador ADE2. En el caso en que se utilizan dos promotores idénticos de tipo GAL10-CYC1 para la expresión del b5 y del P450, estos promotores tienen orientaciones invertidas sobre el plásmido (con respecto a una rotación del plásmido). Se utilizan dos terminadores de transcripción diferentes, preferiblemente los de los genes PGK y de la P450 reductasa de levadura. El conjunto de estas propiedades tiene por objetivo la obtención de plásmidos estables en particular con relación a los fenómenos de recombinación homóloga.
Los plásmidos de la serie difieren por la
naturaleza del promotor utilizado para la expresión del citocromo
b5. Esta propiedad permite modular los niveles relativos de
expresión y optimizarlos para diferentes condiciones de cultivo o
aplicaciones.
Ejemplo
11.1
El vector, descrito en la figura 15,
pYeDP1/10/Hb5, contiene la POL (fase de lectura abierta) del
citocromo b5 humano dirigida inmediatamente hacia arriba del codón
de iniciación por un sitio BglII e inmediatamente hacia abajo del
codón de terminación por un sitio EcoRI. La casete
BglII-EcoRI está incluida en el vector de expresión
pYeDP1/10 (Cullin et Pompon, Gene. 65 (1988)
203-217). Este vector es digerido por BamHI y
HindIII. El fragmento de 2310 pb que contiene los secuencias del
promotor y del terminador del gen PGK y la secuencia que codifica el
citocromo b5 humano se recupera después de tratado por el fragmento
Klenow de la ADN-polimerasa a fin de hacer que los
extremos sean puntas romas. El vector pYeDP60 se digiere por la
enzima de restricción EcoRV y se recupera el fragmento de 5819 pb.
Este contiene los orígenes de replicación para la levadura y E.
Coli. Este fragmento se recirculariza sobre sí mismo y da el
vector pAP2. Este vector se digiere por PvuII y el fragmento de 2310
pb salido del vector pYeDP1/10/Hb5 se inserta allí en la orientación
que da el vector pAP3 en el que la casete de expresión es conforme a
la figura 17. Este vector se digiere por BgII. Se recupera el
fragmento de 7012 pb. El vector pYeDP60 se linealiza por PvuII y se
purifica la banda que corresponde al plásmido linealizado. Un
cultivo de levadura procedente de un clon de la cepa W(N) es
cotransformado por el plásmido lineal y se seleccionan el fragmento
de 7012 pb y los clones prototrofos para el uracilo y la adenina.
Por recombinación homóloga en la levadura, la casete de expresión
del citocromo b5 bajo el control del promotor y del terminador del
gen PGK se sustituye en el sitio PvuII del vector pYeDP60 y da el
vector final pAP4 (figuras 16 y 17). El ADN plasmídico
correspondiente al vector pAP4 se recupera de la levadura y se
utiliza para transformar E. coli (Ampr). Después de
selección, amplificación y control de la estructura del plásmido por
restricción, la POL del citocromo P450 de interés se inserta en el
vector pAP4 en la zona de clonación múltiple situada entre el
promotor GAL10-CYC1 y el terminador del gen PGK. El
plásmido resultante se utiliza para transformar, por selección de
clones prototrofos para la adenina y el uracilo, la cepa de levadura
receptora elegida preferiblemente entre las descritas en la presente
patente.
Ejemplo
11.2
El vector pYeDP1/10/Hb5 se digiere por BglII y
EcoRI para que aparezca la banda que codifica el citocromo b5
humano. La banda de 417 pb correspondiente a la POL del b5 se
purifica, después se clona en pAB2 y se digiere por BamHI y EcoRI.
En el vector obtenido, el sitio EcoRI se destruye entonces por
digestión con EcoRI, después relleno del sitio con la ayuda del
fragmento klenow de la DNA polimerasa después recircularización por
la ligasa. Este plásmido de 4993 pb, se llama pVD1 (figuras 16 y
18).
La casete de expresión de pVD1 se amplifica a
continuación por PCR utilizando los cebadores N17 (SEQ ID nº 17) y
N18 (SEQ ID nº 18) como iniciadores. La banda amplificada tiene 1753
pb. Los cebadores se eligen para añadir en los dos extremos de la
casete de expresión los pies de recombinaciones homólogas en la
región situada alrededor del sitio único PvuII de pYeDP60. Por
recombinación homóloga (véase ejemplo 11.1. y figura 17) entre
pYeDP60 linealizado en el sitio PvuII y desfosforilado por la
fosfatasa alcalina, y la casete de expresión amplificada por PCR,
se obtiene entonces el vector pVD2 conforme a las figuras 16 y 19.
La estructura del vector se verifica en el vehículo de la levadura
(cotransformación) después en E. coli (selección y
amplificación) por digestión con PstI y HindIII. El plásmido deseado
que presenta una banda de digestión a 10994 pb se llama pVD2 (figura
19). Las diferentes uniones de la casete de expresión se verifican
por secuenciación con ayuda de los cebadores N19 (SEQ ID nº 19) y
N20 (SEQ ID nº 20).
Ejemplo
11.3
Lo mismo que en la construcción precedente, la
POL del citocromo b5 humano se obtiene a partir de pYeDP1/10/
hb5 bajo la forma de fragmento BglII-EcoRI. Esta POL se introduce por ligación entre los sitios BamHI y EcoRI del plásmido pYeDP110, descrito en la figura 15, que contiene un bloc de secuencia constituido (i) de secuencias situadas inmediatamente hacia arriba de la región promotora del gen de la P450 reductasa de levadura, (ii) del gen URA3, (iii) del promotor GAL10-CYC1, (iv) del terminador de transcripción del gen de la P450 reductasa de levadura. Como precedentemente el sitio EcoRI del plásmido que resulta de la ligación es destruido por corte-relleno-ligación para dar un plásmido de 5551 pb llamado pVD3 (figura 20). La casete de expresión del citocromo b5 humano bajo el promotor GAL10-CYC1 se amplifica entonces por la PCR gracias a los cebadores N17 y N18 de manera similar al ejemplo 12. La banda amplificada de 2365 pb se purifica, después se introduce como precedentemente por recombinación homóloga en el lugar del sitio PvuII de pYeDP60 (igual que la figura 19 sustituyendo el promotor GAPDH por GAL10-CYC1). La naturaleza de los secuencias de los pies de recombinación introducidos por la PCR impone una orientación inversa a la que las dos casetes GAL10-CYC1 presentan sobre el plásmido recombinado como se indica en la descripción de la estructura general de los plásmidos de la invención. El plásmido de 11595 pb, llamado pVD4 y conforme a la figura 16 se selecciona entonces en el vehículo de la levadura-E. coli La unión entre el promotor GAL10-CYC1 y el gen del citocromo b5 se verifica por secuenciación gracias al cebador N21 (SEQ ID nº 21).
hb5 bajo la forma de fragmento BglII-EcoRI. Esta POL se introduce por ligación entre los sitios BamHI y EcoRI del plásmido pYeDP110, descrito en la figura 15, que contiene un bloc de secuencia constituido (i) de secuencias situadas inmediatamente hacia arriba de la región promotora del gen de la P450 reductasa de levadura, (ii) del gen URA3, (iii) del promotor GAL10-CYC1, (iv) del terminador de transcripción del gen de la P450 reductasa de levadura. Como precedentemente el sitio EcoRI del plásmido que resulta de la ligación es destruido por corte-relleno-ligación para dar un plásmido de 5551 pb llamado pVD3 (figura 20). La casete de expresión del citocromo b5 humano bajo el promotor GAL10-CYC1 se amplifica entonces por la PCR gracias a los cebadores N17 y N18 de manera similar al ejemplo 12. La banda amplificada de 2365 pb se purifica, después se introduce como precedentemente por recombinación homóloga en el lugar del sitio PvuII de pYeDP60 (igual que la figura 19 sustituyendo el promotor GAPDH por GAL10-CYC1). La naturaleza de los secuencias de los pies de recombinación introducidos por la PCR impone una orientación inversa a la que las dos casetes GAL10-CYC1 presentan sobre el plásmido recombinado como se indica en la descripción de la estructura general de los plásmidos de la invención. El plásmido de 11595 pb, llamado pVD4 y conforme a la figura 16 se selecciona entonces en el vehículo de la levadura-E. coli La unión entre el promotor GAL10-CYC1 y el gen del citocromo b5 se verifica por secuenciación gracias al cebador N21 (SEQ ID nº 21).
- W(GhR, \DeltaB): MATa, leu2-3,112, ade2-1, trp1-1, ura3-1.
- W(hR, \DeltaB): MATa, leu2-3,112, ade2-1, trp1-1.
- W(hR, hb5): MATa, leu2-3,112, ade2-1, trp1-1.
- W(GhR, hb5): MATa, leu2-3,112, ade2-1, trp1-1, ura3-1.
- W(hR, Lhb5): MATa, ade2-1, trp1-1.
- W(GhR, Lhb5): MATa, ade2-1, trp1-1, ura3-1.
- W(R, Lhb5,Yb5)
- W(hR, Lhb5, Yb5)
Las 42 primeras bases son homólogas a la región
comprendida entre las bases 4069 y 4113 de pYeDP60. En mayúsculas,
bases 43-69, los nucleótidos del cebador son
homólogos a la región de pUB81 comprendida entre las bases 5772 y
5799 que corresponden a una región del gen de URA3.
- (SEQ ID nº18) N18: 5'-gggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctGG CCGATTCATTAATGCAGCTGGGCGG
Las 43 primeras bases son homólogas a la cadena
complementaria de la región de pYeDP60 comprendida entre las bases
4114 y 4157. Las bases 44 a 71 son homólogas a la región de pUB81
comprendida entre las bases 2507 y 2538.
- (SEQ ID nº 19) N19: 5'-cccccctttcgccagggaacgtgc
Este cebador es homólogo de la región entre 4102
a 4125 de pVD2 correspondiente al fin de la fase de lectura abierta
del gen URA3 vecino de la casete de integración del citocromo b5
humano bajo el promotor GAPDH.
- (SEQ ID nº 20) N20: 5'-cggtaggtattgattgtaattctg
Este cebador para la secuenciación es homólogo de
la parte de pVD2 comprendía entre las bases 4835 y 4860
correspondiente al fin del promotor GAPDH.
- (SEQ ID nº 21) N21: 5'-ggcatgcatgtgctctgtatg
Esta cebador para la secuenciación es homólogo a
la región del promotor GAL10-CYC1 situada a -120 pb
de la unión entre el promotor GAL10-CYC1 y la POL
del citocromo b5 humano.
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1258-1261.
- Brevet nº WO 93/02200: Souches de levure
avec intégration stable de gênes hétérologues.
- Brevet nº WO 94/01564: Souche de levure
permettant la co-expression d'une activité
mono-oxygénase de cytochrome P450 de plante et d'une
NADPH-cytochrome
P450-reductaseendogéne o hétérologue et son
utilization à des fins de bioconversion.
(1) INFORMACIONES GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: RHONE POULENC RORER S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 20, AVENUE RAYMOND ARON
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ANTONY
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 92165
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (1) 40.91.69.22
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: (1) 40.91.72.91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: C.N.R.S
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 3, Rue Michel Ange
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: PARÍS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 75016
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (1) 44 96 40 00
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: (1) 44 96 50 00
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: CEPAS DE LEVADURAS QUE EXPRESAN LOS GENES HUMANOS, SU MODO DE PREPARACIÓN ASÍ COMO LAS CEPAS INTERMEDIAS.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 21
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Cinta
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA DE ORDENADOR: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGATCCAT GGGAGACAGT CACGTGG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGAATTCAG ATCTAGCTCC ACACGTCCAG G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAAGCTTGA GTTTATCATT ATCAATACTC G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGATCCTAT TTATGTGTGT TTATTCGAAA CTAAGTTCTT GG
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATCCGAGC GGGTAATAGC CTGGAGTTTC C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGACTGCTC TGCCATGATT GTTTGATATT TTATGTTGTA GTTGATTG
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTATACATG GCAGAGGACT GAATTCTTTT TCTTCCAGAA TAGCCCACAC
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGATCTGT GACATACTTCT ATGCGATATA G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGATCTGCA TGCCTAAAGT TTACAGTTAC C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGATTCTGC AGTTATTCGT TCAACAAATA ATAAGCAACA CC
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGAATTCTG ATCAGTCCTC TGCCATGTAT AGG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCCAGATCT ATGGCAGAGC AGTCGGACG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 70 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCCCTTTC GCCAGGGAAC GTGC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGTAGGTAT TGATTGTAAT TCTG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCATGCATG TGCTCTGTAT G
\hfill21
Claims (29)
1. Una cepa de levadura modificada genéticamente,
caracterizada porque
1º Los genes que codifican el citocromo b5
endógeno y la citocromo P450-reductasa endógena han
sido inactivados,
2º La cepa contiene un ácido nucleico que
codifica la NADPH-citocromo
P450-reductasa humana,
3º La cepa contiene un ácido nucleico que
codifica el citocromo b5 humano.
2. La cepa según la reivindicación 1,
caracterizada porque el ácido nucleico es un ADNc.
3. La cepa según la reivindicación 2,
caracterizada porque al menos uno de los ADNc humanos está
bajo control de un promotor de levadura constitutivo o
inducible.
4. La cepa según la reivindicación 3,
caracterizada porque se trata de un promotor constitutivo,
elegido entre el promotor del gen de la
gliceraldehído-fosfodeshidrogenasa, el promotor del
gen de la fosfoglicerato-quinasa y el promotor
endógeno del citocromo b5.
5. La cepa según la reivindicación 3,
caracterizada porque el promotor inducible se elige entre los
promotores GAL10 y CYC1-GAL10
6. La cepa según una de las reivindicaciones 1
a 5, caracterizada porque el ácido nucleico que codifica la
NADPH-citocromo P450-reductasa
humana está integrado en el genoma de la levadura.
7. La cepa según una de las reivindicaciones 1
a 6, caracterizada porque el ácido nucleico que codifica el
citocromo b5 humano está integrado en el genoma de la levadura.
8. La cepa según una de las reivindicaciones 1
a 7, caracterizada porque comprende además al menos un ácido
nucleico que codifica un citocromo P450 humano.
9. La cepa según la reivindication 8,
caracterizada porque el ácido nucleico que codifica el
citocromo P450 humano está integrado sobre un plásmido.
10. La cepa según la reivindicación 9,
caracterizada porque comprende además una copia suplementaria
del ácido nucleico que codifica el citocromo b5 humano, sobre dicho
plásmido o integrada en el genoma.
11. La cepa según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizada porque es haploide.
12. La cepa según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque la levadura es
una cepa de Saccharomyces cerevisiae.
13. La cepa según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, 11 y 12, caracterizada porque se
trata de una cepa que comprende un ácido nucleico que codifica el
citocromo b5 humano y un ácido nucleico que codifica la
NADPH-citocromo P450-reductasa
humana.
14. La cepa según la reivindicación 13,
caracterizada porque el ácido nucleico que codifica la
NADPH-citocromo P450-reductasa
humana está bajo control del promotor del gen de la
gliceraldehído-fosfodeshidrogenasa de levadura.
15. La cepa según la reivindicación 13,
caracterizada porque el ácido nucleico que codifica el
citocromo b5 humano está bajo control del promotor del gen de la
fosfoglicerato-quinasa de levadura.
16. La cepa según una de las reivindicaciones
13, 14 o 15, caracterizada porque el ácido nucleico que
codifica el citocromo b5 humano está bajo control del promotor del
gen de la fosfoglicerato-quinasa de levadura y el
ácido nucleico que codifica la NADPH-citocromo
P450-reductasa humana está bajo control del promotor
del gen de la gliceraldehído-fosfodeshidrogenasa de
levadura.
17. La cepa según las reivindicaciones 13 a 16,
caracterizada porque comprende además al menos un ácido
nucleico que codifica un citocromo P450 humano.
18. La cepa según la reivindicación 17,
caracterizada porque el ácido nucleico que codifica el
citocromo P450 humano está integrado sobre un plásmido.
19. Una cepa de levadura modificada
genéticamente que comprende un ácido nucleico que codifica la
NADPH-citocromo P450-reductasa
humana y en la que los genes que codifican el citocromo b5 de
levadura y la NADPH-citocromo
P450-reductasa de levadura han sido inactivados.
20. La cepa según la reivindicación 19,
caracterizada porque el ácido nucleico que codifica la
NADPH-citocromo P450-reductasa
humana está bajo control del promotor del gen de la
gliceraldehído-fosfodeshidrogenasa de levadura.
21. Un procedimiento de obtención de cepas
según la reivindicación 13 o la reivindicación 15,
caracterizado porque utiliza una cepa de levadura que
comprende un ácido nucleico que codifica la
NADPH-citocromo P450-reductasa
humana bajo control del promotor GAL10-CYC1 y en la
que los genes que codifican el citocromo b5 de levadura y la
NADPH-citocromo P450-reductasa de
levadura han sido inactivados.
22. El procedimiento de obtención de cepas
según la reivindicación 14 o 16, caracterizado porque utiliza
una cepa de levadura que comprende un ácido nucleico que codifica la
NADPH-citocromo P450-reductasa
humana bajo control del promotor de la
gliceraldehído-fosfodeshidrogenasa y en la que los
genes que codifican el citocromo b5 de levadura y la
NADPH-citocromo P450-reductasa de
levadura han sido inactivados.
23. Un procedimiento de evaluación de la
toxicidad de un compuesto, caracterizado porque:
- -
- dicho compuesto se pone en presencia de una levadura según una de las reivindicaciones 1 a 18 o de una preparación enzimática derivada de una levadura de este tipo y
- -
- se analizan los metabolitos producidos en cuanto a su toxicidad.
24. Un método de determinación in vitro
de los metabolitos humanos de un compuesto químico,
caracterizado porque
- -
- dicho compuesto se pone en presencia de una levadura según una de las reivindicaciones 1 a 18 o de una preparación enzimática derivada de una levadura de este tipo y
- -
- se analizan los metabolitos producidos.
25. Un plásmido caracterizado porque
permite la expresión simultánea en la levadura de un citocromo P450,
con preferencia humano, y del citocromo b5 microsomal humano.
26. El plásmido según la reivindicación 25,
caracterizado porque:
(i) la casete de expresión del P450 comprende
preferiblemente el promotor GAL10-CYC1,
(ii) la casete de expresión del b5 comprende
preferiblemente uno de los promotores GAL10-CYC1,
PGK o GAPDH, y,
(iii) cuando el mismo promotor se utiliza dos
veces, las dos copias están presentes en orientaciones inversas
sobre el plásmido.
27. El plásmido según la reivindicación 26,
caracterizado porque las dos casetes de expresión están
separadas sobre el plásmido, de un lado por el origen de replicación
de la levadura, del otro lado por al menos un marcador de selección
de levadura.
28. La cepa de levadura transformada por un
plásmido según una de las reivindicaciones 25 a 27.
29. La cepa de levadura según la reivindicación
28, desprovista del gen endógeno del citocromo b5 microsomal.
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