ES2252187T3 - Peptidos con actividad antibacteriana. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en aquellos representados por las SEC ID Nos.1-6 y análogos de los mismos que son activos para el tratamiento de la infección bacteriana, el tratamiento de la endotoxemia, disminuir la cantidad de TNF-á, inhibir la proliferación de células endoteliales, inhibir la regulación posterior de la expresión de la molécula de adhesión intercelular mediada por el factor angiogénico, inhibir la angiogénesis y/o inhibir la tumorigénesis, en los que un análogo de los mismos se define como que contiene una supresión de un aminoácido, adiciones de uno o dos aminoácidos, sustituciones conservativas de aminoácidos o modificaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de las cadenas laterales, modificaciones de la cadena principal y modificaciones N- y C-terminales.

Description

Péptidos con actividad antibacteriana.

Se ha publicado que una serie de oligómeros péptídicos diseñados de 33 miembros (péptidos \betapep) es bactericida y es capaz de neutralizar la endotoxina bacteriana lipopolisacárido (LPS) (Mayo et al. Biochim. Biophys. Acta 1425, 81-92 (1998)). Los análisis conformacionales por CD y NMR indican que los péptidos \betapep forman láminas \beta (Mayo et al., Protein Sci. 5, 1301-1315 (1996)), y uno de éstos, el \betapep-4, se pliega de manera compacta como un sandwich de láminas \beta antiparalelas (Ilyina et al., Biochemistry 36, 5245-5250 (1997)). El \betapep-19 es potencialmente bactericida en la escala 10^{-8} M (Mayo et al., Biochim. Biophys. Acta 1425, 81-92 (1998)). Los péptidos \betapep funcionan como el factor anti-LPS de Limulus (LALF, del inglés "Limulus anti-LPS factor") y la proteína bactericida y que aumenta la permeabilidad (B/PI, del inglés "bactericidal/permeability increasing protein") homóloga (Hoess et al., EMBO J. 12, 3351-3356 (1993)), en el sentido de que se ha visto que todos expresan la actividad a través de un motivo estructural de láminas \beta anfipático que tiene una cara de láminas \beta catiónica (Kelly et al., Surgery 114, 140-146 (1993); Siefferman et al., Infect. Immun. 59, 2152-2157 (1991); Beamer et al., Science 276, 1861-1864 (1997); y Gray et al., Biochim. Biophys. Acta 1244, 185-190 (1995)).

Numerosos estudios sobre péptidos bactericidas indican la importancia funcional de una carga neta positiva y una alta hidrofobicidad en el contexto de una estructura anfipática, usualmente helicoidal (Maloy et al., Biopolymers 37, 105-112 (1995)). La carga neta positiva propicia la interacción con la superficie negativamente cargada de las membranas bacterianas (Matsuzaki et al., Biochemistry 36, 2104-2111 (1997)), mientras que las relaciones estructura-actividad demuestran que la conformación anfipática del péptido propicia la lisis de las células bacterianas (Andreu et al., Biochemistry 24, 1683-1688 (1985)). Los péptidos bactericidas tales como las cecropinas (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9159-9162 (1989)), magaininas (Zasloff et al., J. Biol. Chem. 264, 12826-12829 (1987)), péptidos ricos en prolina y arginina (Agerberth et al., Eur. J. Biochem. 202, 849-854 (1991)), y sapecina (Matsuyama et al., J. Biol. Chem. 263, 17112-17116 (1988)), como los péptidos \betapep, tienen todos una carga neta positiva y un carácter considerablemente hidrófobo. Las cecropinas y magaininas son péptidos que forman hélices (Holak et al., Biochemistry 27, 7620-7629 (1988); y Marion et al., FEBs Lett. 227, 21-26 (1988)), mientras que las sapecinas contienen segmentos tanto en hélice \alpha como en lámina \beta (Hanzawa et al., FEBs Lett. 269, 413-420 (1990)). Las estructuras de los péptidos ricos en prolina y arginina no se conocen. La taquiplesina, un péptido bactericida y neutralizante de endotoxinas aislado de hemocitos del cangrejo de herradura (Kawano et al., J. Biol. Chem. 265, 15365-15367 (1990)), así como los péptidos antibacterianos defensinas (Selsted et al., J. Biol. Chem. 264, 4003-4007 (1989); y Lehrer et al., Cell 64, 229-230 (1991)), forman láminas \beta diméricas que están estabilizadas por tres puentes disulfuro intramoleculares (Hill et al., Science 251, 1481-1485 (1991)). Además, se han diseñado varios péptidos pequeños, antibióticos, basados en la estructura del péptido cíclico, anti-LPS, polimixina B (Morrison et al., Immunochem. 13, 813-818 (1976)), como horquillas \beta cortas restringidas por un puente disulfuro (Rustici et al., Science 259, 361-365
(1993)).

La presente invención proporciona un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: ANIKLSVQMKLF (SEC ID No. 1); KLSVQMKLFKRH (SEC ID No. 2); VQMKLFKRHLKW (SEC ID No. 3); KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4); KRHLKWKIIVKL (SEC ID No. 5); LKWKIIVKLNDG (SEC ID No. 6); QMKLFKRHLKWK (SEC ID No. 9); MKLFKRHLKWKI (SEC ID No. 10); MKLFKRHLKWKIIV (SEC ID. No. 11); XLFKRHLKWKII (SEC ID No. 12); KLFXRHLKWKII (SEC ID No. 13); KLFKRHLXWKII (SEC ID No. 14); KLFKRHLKWXII (SEC ID No. 15); KLFKKHLKWKII (SEC ID No. 16); KLFKHLKWKII (SEC ID No. 17);

y análogos de los mismos que son activos para el tratamiento de la infección bacteriana, el tratamiento de endotoxemia, disminuir la cantidad de TNF-\alpha, inhibir la proliferación de células endoteliales, inhibir la regulación posterior de la expresión de la molécula de adhesión intercelular mediada por el factor angiogénico, inhibir la angiogénesis y/o inhibir la tumorigénesis, en los que un análogo de los mismos se define como que contiene una supresión de un aminoácido, adiciones de uno o dos aminoácidos, sustituciones conservativas de aminoácidos o modificaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de las cadenas laterales, modificaciones de la cadena principal y modificaciones N- y C-terminales; y combinaciones de los mismos; en los que X es un aminoácido.

La presente invención proporciona también un uso de un polipéptido (esto es, uno o más polipéptidos) enumerado anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica para tratar la infección bacteriana y/o endotoxemia. De ese modo, la composición farmacéutica que incluye un polipéptido (esto es, uno o más polipéptidos) enumerado anteriormente ha de administrarse a un paciente en una cantidad eficaz para inhibir la infección bacteriana y/o neutralizar la endotoxina. Se proporciona también un método para inhibir la infección bacteriana y/o endotoxemia in vitro. El método incluye poner en contacto las células con una cantidad de una composición eficaz para inhibir la infección bacteriana y/o neutralizar la endotoxina, en el que la composición incluye un polipéptido enumerado anteriormente.

La presente invención proporciona también un uso de un polipéptido (esto es, uno o más polipéptidos) enumerado anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica para disminuir la cantidad de TNF-\alpha en un paciente. De ese modo, la composición farmacéutica que incluye un polipéptido enumerado anteriormente ha de administrarse al paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Se proporciona también un método para disminuir la cantidad de TNF-\alpha in vitro. El método incluye incubar las células con una cantidad eficaz de una composición que comprende un polipéptido seleccionado enumerado anteriormente. Otros polipéptidos adecuados para estos métodos incluyen análogos de aquellos enumerados anteriormente que son activos para disminuir la cantidad de TNF-\alpha.

La presente invención proporciona también un uso de un polipéptido (esto es, uno o más polipéptidos) enumerado anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la proliferación de células endoteliales en un paciente. De ese modo, ha de administrarse al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que incluye un polipéptido enumerado anteriormente. Se proporciona también un método para inhibir la proliferación de células endoteliales in vitro. El método implica poner en contacto las células con una cantidad eficaz de una composición que incluye un polipéptido enumerado anteriormente. Otros polipéptidos adecuados para estos métodos incluyen análogos de aquellos enumerados anteriormente que son activos para inhibir la proliferación de células endoteliales.

La presente invención proporciona también un uso de un polipéptido (esto es, uno o más polipéptidos) enumerado anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la regulación posterior de la expresión de la molécula de adhesión intercelular mediada por el factor angiogénico en un paciente. De ese modo, ha de administrarse al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que incluye un polipéptido enumerado anteriormente. Se proporciona también un método para inhibir la regulación posterior de la expresión de la molécula de adhesión intracelular mediada por el factor angiogénico in vitro. El método incluye poner en contacto las células con una cantidad eficaz de una composición que incluye un polipéptido enumerado anteriormente. Otros polipéptidos adecuados para estos métodos incluyen análogos de aquellos enumerados anteriormente que son activos para inhibir la regulación posterior de la expresión de la molécula de adhesión intercelular mediada por el factor angiogénico.

La presente invención proporciona también un uso de un polipéptido (esto es, uno o más polipéptidos) enumerado anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la angiogénesis en un paciente. De ese modo, ha de administrarse al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que incluye un polipéptido enumerado anteriormente. Se proporciona también un método para inhibir la angiogénesis in vitro. El método incluye poner en contacto las células con una cantidad eficaz de una composición que incluye un polipéptido enumerado anteriormente. Otros polipéptidos adecuados para estos métodos incluyen análogos de aquellos enumerados anteriormente que son activos para inhibir la angiogénesis.

La presente invención proporciona también un uso de un polipéptido (esto es, uno o más polipéptidos) enumerado anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la tumorigénesis en un paciente. De ese modo, ha de administrarse al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que incluye un polipéptido enumerado anteriormente. Otros polipéptidos adecuados para este método incluyen análogos de aquellos enumerados anteriormente que son activos para inhibir la tumorigénesis.

La presente invención proporciona también la estructura tridimensional de algunos de los polipéptidos usando espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR) (p.ej., NMR uni- y bidimensional) y espectroscopía de dicroísmo circular (CD). Esta información es de una utilidad importante en campos tales como el descubrimiento de fármacos. Por tanto, la presente invención proporciona también métodos de uso de tal información estructural.

La presente invención proporciona un polipéptido que tiene una estructura \alpha-helicoidal o 3_{10}-helicoidal anfipática que tiene una superficie compuesta principalmente de restos de aminoácido cargados positivamente y una superficie opuesta compuesta principalmente de restos de aminoácido hidrófobos, en el que éstas definen un dominio activo superficial; en el que el dominio activo superficial comprende los aminoácidos K1, K4, K8, y R5 que se muestran en la Figura 6, en el que el aminoácido K1 es N-terminal, en el que el polipéptido tiene de 12 a 14 restos de aminoácido, preferiblemente 12 restos de aminoácido. Más preferiblemente, los átomos 1-24, 64-109, y 146-167 enumerados en la Tabla 5. Más preferiblemente, el polipéptido tiene las coordenadas estructurales enumeradas en la Tabla 5 y, lo más preferido, tiene la secuencia KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4).

Un método específico de la presente invención implica evaluar un compuesto candidato con respecto a su similitud estructural con la de KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4): suministrando una estructura tridimensional de KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4); suministrando una estructura tridimensional de un compuesto candidato; y comparando la estructura tridimensional del compuesto candidato con la estructura tridimensional de KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4).

Tal como se usa en la presente memoria, "un" o "uno" se refiere a uno o más de los términos modificados. Por tanto, las composiciones de la presente invención incluyen uno o más polipéptidos.

"Aminoácido" se usa en la presente memoria para referirse a un compuesto químico con la fórmula general: NH_{2}-CRH-COOH, donde R, la cadena lateral, es H o un grupo orgánico. Cuando R es un grupo orgánico, R puede variar y es polar, o bien apolar (esto es, hidrófobo). Los aminoácidos de esta invención pueden ser existentes en la naturaleza o sintéticos (a menudo denominados no proteinogénicos). Tal como se usa en la presente memoria un grupo orgánico es un grupo hidrocarbonado que se clasifica como un grupo alifático, un grupo cíclico o una combinación de grupos alifáticos y cíclicos. El término "grupo alifático" significa un grupo hidrocarbonado saturado o insaturado, lineal o ramificado. Este término se usa para abarcar grupos alquilo, alquenilo, y alquinilo, por ejemplo. El término "grupo cíclico" significa un grupo hidrocarbonado que forma un anillo cerrado que se clasifica como un grupo alicíclico, grupo aromático, o grupo heterocíclico. El término "grupo alicíclico" significa un grupo hidrocarbonado cíclico que tiene propiedades parecidas a las de los grupos alifáticos. El término "grupo aromático" se refiere a grupos hidrocarbonados aromáticos mono- o policíclicos. Tal como se usa en la presente memoria, un grupo orgánico puede estar sustituido o no sustituido.

Los términos "polipéptido" y "péptido", tal como se usan en la presente memoria, se usan de manera intercambiable y se refieren a un polímero de aminoácidos. Estos términos no connotan una longitud específica de un polímero de aminoácidos. Por tanto, por ejemplo, los términos oligopéptido, proteína, y enzima se incluyen en la definición de polipéptido o péptido, bien producidos usando técnicas recombinantes, síntesis química o enzimática, o existentes en la naturaleza. Este término incluye también polipéptidos que se han modificado o derivatizado, tal como por glicosilación, acetilación, fosforilación, y similares.

Las siguientes abreviaturas se usan en toda la solicitud:

A = Ala = Alanina	T = Thr = Treonina
V = Val = Valina	C = Cys = Cisteína
L = Leu = Leucina	Y = Tyr = Tirosina
I = Ile = Isoleucina	N = Asn = Asparagina
P = Pro = Prolina	Q = Gln = Glutamina
F = Phe = Fenilalanina	D = Asp = Ácido Aspártico
W = Trp = Triptófano	E = Glu = Ácido Glutámico
M = Met = Metionina	K = Lys = Lisina
G = Gly = Glicina	R = Arg = Arginina
S = Ser = Serina	H = His = Histidina

Otras abreviaturas usadas en todo el documento incluyen: B/PI, proteína bactericida y que aumenta la permeabilidad; LALF, factor anti-lipopolisacárido de Limulus; LPS, lipopolisacárido; PF4 (del inglés "platelet factor-4"), factor plaquetario-4; NMR (del inglés "nuclear magnetic resonance"), espectroscopía de resonancia magnética nuclear; NOE (del inglés, "nuclear Overhauser effect"), efecto Overhauser nuclear; rf, radiofrecuencia; FID (del inglés, "free induction decay"), caída libre de la inducción; CD (del inglés "circular dichroism"), dicroísmo circular; HPLC (del inglés, "high performance liquid chromatography"), cromatografía de líquidos de alta resolución; PBS (del inglés, "phosphate buffered saline"), solución salina tamponada con fosfato; FCS (del inglés, "fetal calf serum"), suero de ternera fetal.

Figura 1. Secuencias peptídicas: se muestran las secuencias peptídicas para el \betapep-19 (SEC ID No. 18) y el \betapep-25 (SEC ID No. 19), junto con las de ocho dodecapéptidos que recorren la secuencia del \betapep-25. Los dodecapéptidos se denominan péptidos SC. El -NH_{2} a la derecha de cada secuencia indica la amidación del grupo carboxilato C-terminal.

Figura 2. Curvas de Respuesta a Dosis Bactericidas para los Péptidos. En esta figura se muestran un número selecto de curvas de respuesta a dosis como el porcentaje de bacterias destruidas frente al logaritmo de la concentración de péptido. Se proporcionan los datos para tres cepas de bacterias: (A) cepa rugosa, E. coli J5; (B) cepa lisa, E. coli IA2; y (C) una cepa de S. aureus Gram-positiva MNHO. Las curvas de respuesta a dosis se adquirieron como se describe en la Sección de Métodos.

Figura 3. Curvas de Respuesta a Dosis para la Neutralización de la Endotoxina. Las curvas de respuesta a dosis, tal como se describen en la Sección de Métodos, se muestran como el porcentaje de neutralización de LPS frente al logaritmo de la concentración de péptido. El panel de arriba ilustra los resultados para los péptidos SC y para el \betapep-25, y el panel de abajo ilustra los resultados para varias variantes del SC-4, tal como se describe en el texto.

Figura 4. Espectros de CD para los Péptidos SC. Se muestran los espectros de dicroísmo circular en el ultravioleta lejano para dos péptidos SC, SC-5 y SC-7, como la elipticidad media de los restos frente a la longitud de onda (nm). La concentración de los péptidos era 40 \muM en fosfato de potasio 20 mM, pH 6,3. La temperatura se fijó a 20ºC. Otras condiciones experimentales se discuten en la Sección de Métodos. Las curvas de CD mostradas se adquirieron como una función de la concentración de TFE desde el 0% al 70% (volumen/volumen). El inserto en el medio muestra el cambio en (\Theta)222 frente a la concentración de trifluoroetanol (TFE).

Figura 5. Espectros de NOESY para el SC-4. Se muestran los espectros de ^{1}H NMR a 600 MHz para el SC-4 en presencia (A) y ausencia (B) de trfluoroetanol al 30%/agua al 70%. La concentración del péptido era 6,3 mM en fosfato de potasio 10 mM, pH 5,5 y 25ºC. Los espectros se acumularon usando 8000 puntos para cubrir una anchura de barrido de 6000 Hz y se procesaron con una anchura de línea de 1 Hz. Sólo se muestran las regiones espectrales en sentido de disminución del campo a partir de la resonancia de HDO y se indican algunas asignaciones de resonancias.

Figura 6. Estructuras Derivadas a partir del NOE del SC-4. Para el dodecapéptido SC-4, 14 estructuras finales derivadas del NOE se han superimpuesto a la izquierda de la figura y los estadísticos estructurales se ofrecen en la Tabla 3. La estructura promedio se muestra a la derecha, y cuatro restos cargados positivamente, K1, K4, R5, y K8, que se encuentran en una superficie de la hélice anfipática, se muestran en el modo de rellenado espacial.

Figura 7. Proyecciones de ruedas helicoidales para los péptidos SC. Las secuencias de los péptidos SC se muestran en las proyecciones de ruedas helicoidales tal como se discute en el texto.

Esta invención contribuye al desarrollo de agentes en la lucha contra el problema siempre recurrente de los microorganismos resistentes a fármacos. Implica el descubrimiento de polipéptidos eficaces en el tratamiento de infección bacteriana y/o endotoxemia bacteriana, así como otros trastornos.

Las composiciones que comprenden los polipéptidos de esta invención pueden añadirse a las células en cultivo o usarse para tratar pacientes, tales como mamíferos. Cuando los polipéptidos se usan para tratar un paciente, el polipéptido se combina preferiblemente en una composición farmacéutica con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como una molécula más grande para propiciar la estabilidad del polipéptido o un tampón farmacéuticamente aceptable que sirve como vehículo para el polipéptido.

El tratamiento puede ser profiláctico o terapéutico. Por tanto, el tratamiento puede iniciarse antes, durante, o después del desarrollo de la afección (p.ej., infección bacteriana o endotoxemia). Como tales, las frases "inhibición de" o "eficaz para inhibir" una afección tal como una infección bacteriana y/o endotoxemia, por ejemplo, incluyen el tratamiento tanto profiláctico como terapéutico (esto es, prevención y/o inversión de la afección).

La presente invención proporciona un uso de un polipéptido (esto es, uno o más polipéptidos) enumerado anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica para tratar la infección bacteriana y/o endotoxemia en un paciente (p.ej., un mamífero tal como un humano). De ese modo, ha de administrarse a un paciente una cantidad de una composición farmacéutica eficaz para inhibir la infección bacteriana y/o neutralizar la endotoxina, en la que la composición farmacéutica incluye uno o más polipéptidos descritos en la presente memoria. Análogamente, la presente invención proporciona un método para inhibir la infección bacteriana y/o endotoxemia in vitro (por ejemplo, en un cultivo celular). Este método implica poner en contacto las células con una cantidad de una composición eficaz para inhibir la infección bacteriana y/o neutralizar la endotoxina, en el que la composición incluye uno o más polipéptidos descritos en la presente memoria.

Hace más de 100 años, se determinó que los extractos estables al calor de bacterias entéricas Gram-negativas eran muy tóxicos. Asumiendo que estas toxinas se liberaban del interior de la bacteria tras su muerte, los investigadores denominaron a estas toxinas "endotoxinas". Estudios químicos subsiguientes mostraron que estas endotoxinas son realmente componentes de lipopolisacárido (LPS) de la membrana externa de las bacterias entéricas. El LPS tóxico se compone de tres unidades estructurales - un componente de polisacárido externo, una región central de oligosacárido, y la porción interna, el lípido A, que aporta a la molécula sus actividades proinflamatorias. El LPS tóxico se libera de la bacteria cuando muere o durante periodos de rápido crecimiento bacteriano.

En muchas especies, por ejemplo en humanos, vacas, conejos, ratones, y ratas, el LPS tóxico en el suero se une rápidamente a un polipéptido del plasma llamado proteína de unión a lipopolisacárido (LBP, del inglés "lipopolysaccharide binding protein"). La LBP, que es sintetizada por los hepatocitos como parte de la respuesta a la fase aguda de la inflamación, tiene una fuerte afinidad por la porción de lípido A de la endotoxina.

La activación de una célula por un complejo tóxico que contiene LPS da como resultado la síntesis, liberación, o activación de mediadores proinflamatorios derivados de la célula, que pueden incluir citoquinas (por ejemplo, interleuquina-1, interleuquina-6, interleuquina-8, y factor de necrosis tumoral-\alpha), factor activador de plaquetas, óxido nítrico, complemento (p.ej., C5a y C3a), prostaglandinas, leucotrienos, el sistema de quininas, metabolitos del oxígeno, catecolaminas y endorfinas. Los mediadores pueden chocar contra sistemas de órganos incluyendo el corazón, sistema vascular, sistema de coagulación, pulmones, hígado, riñón y el sistema nervioso central. Estos factores pueden conducir a endotoxemia, también denominada choque endotóxico, choque séptico, choque circulatorio, y septicemia, una enfermedad progresiva que puede conducir a la muerte.

La endotoxemia está típicamente causada por LPS tóxico de bacterias Gram-negativas, pero puede estar causado también por bacterias Gram-positivas, y ocasionalmente, por hongos. Los componentes liberados por las bacterias Gram-positivas que pueden causar endotoxemia incluyen peptidoglicano y ácido lipoteicoico, y lipoarabinomanano de la pared celular de Mycobacterium spp.

Los estudios han mostrado que las concentraciones en suero de la citoquina factor de necrosis tumoral (TNF, del inglés "tumor necrosis factor") aumentan tras el establecimiento de la endotoxemia, y la actividad del TNF en suero está directamente asociada con el establecimiento de los signos de dolor abdominal y fiebre, por ejemplo. Por tanto, la actividad de la endotoxina puede medirse también determinando la cantidad de liberación del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-\alpha) de una línea celular de macrófagos o evaluando los síntomas del choque en animales. La producción de TNF-\alpha puede ensayarse como se describe en Mossman et al. (Immunological Methods 65:55,
1983).

En ambos usos in vivo y métodos in vitro, "inhibir" una infección bacteriana incluye prevenir así como invertir o reducir el crecimiento de las bacterias en un paciente o una muestra celular, y "neutralizar" la endotoxina incluye unir el LPS y de ese modo eliminarlo del sistema de un paciente o muestra celular. El nivel de infección bacteriana puede determinarse según el ensayo bactericida descrito en la Sección de los Ejemplos. El nivel de endotoxemia puede determinarse según el ensayo de neutralización de LPS descrito en la Sección de los Ejemplos. Estos ensayos pueden usarse para determinar la eficacia de un polipéptido, usado bien in vivo o in vitro. Para determinar la eficacia del tratamiento de un paciente que tiene una infección bacteriana, puede tomarse una muestra de sangre, desarrollar un cultivo, y determinarse la cantidad de bacterias vivas según el ensayo bactericida descrito en la Sección de los Ejemplos. Para determinar la eficacia del tratamiento de un paciente que tiene endotoxemia, puede tomarse una muestra de sangre, desarrollar un cultivo, y la cantidad de citoquinas (p.ej., TNF-\alpha, IL-1) puede determinarse usando métodos conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, puede usarse el ensayo WEHI para la detección de TNF-\alpha (Battafarano et al., Surgery 118, 318-324 (1995)).

La cantidad eficaz de un péptido para tratar una infección bacteriana dependerá de la infección bacteriana, la localización de la infección y el péptido. Una cantidad eficaz del péptido para tratar una infección bacteriana es esa cantidad que disminuye el número de bacterias en el animal y disminuye los síntomas asociados con la infección bacteriana tales como fiebre, dolor y otros síntomas asociados de la infección bacteriana. La cantidad eficaz de un péptido puede determinarse por métodos de respuesta a dosis estándar in vitro, y se consideraría una cantidad eficaz una cantidad de péptido que es eficaz para destruir al menos aproximadamente del 50% a aproximadamente el 100% de las bacterias (LD_{50}) y más preferiblemente aproximadamente del 60% a aproximadamente el 100% de las bacterias. Preferiblemente, el péptido tiene una dosis eficaz a una concentración de aproximadamente 1 x 10^{-4} M a aproximadamente 1 x 10^{-10} M, y más preferiblemente a una concentración de aproximadamente 1 x 10^{-7} M a aproximadamente 1 x 10^{-9} M. Los péptidos que se consideran como bactericidas destruyen al menos un organismo seleccionado del grupo de P. aeruginosa, P. cepacia, E. coli B, Salmonella, Proteus mirabilis, y Staphylococcus aureus a concentraciones de aproximadamente 10^{-10} M o mayores en condiciones fisiológicas (p.ej., a un pH de 5,6).

Alternativamente, una cantidad eficaz del péptido para tratar una infección bacteriana puede determinarse en un sistema animal tal como un ratón. Puede inducirse una peritonitis aguda en ratones tales como ratones "webster" suizos cruzados por inyección intraperitoneal con bacterias tales como P. aeruginosa como se describe en Dunn et al. (Surgery, 98:283, 1985); Cody et al. (Int. Surg. Res., 52:315, 1992). Pueden inyectarse cantidades diferentes de péptido por vía intravenosa una hora antes de la inyección de las bacterias. El porcentaje de bacterias viables en sangre, bazo, e hígado puede determinarse en presencia y ausencia del péptido u otros antibióticos. Aunque no se pretende que limite la invención, se cree que el péptido bactericida podría también potenciar la eficacia de otros antibióticos tales como eritromicina, y similares.

La actividad bactericida puede evaluarse frente a una variedad de bacterias, preferiblemente bacterias Gram-negativas, pero los tipos de bacterias pueden incluir Pseudomonas spp. incluyendo P. aeruginosa y P. cepacia, cepas de E. coli, incluyendo E. coli B, Salmonella, Proteus mirabilis y cepas de Staphylococcus tales como Staphylococcus aureus. Un organismo preferido es Pseudomonas aeruginosa.

Los péptidos con actividad neutralizante de endotoxinas pueden usarse para tratar mamíferos infectados con bacterias Gram-negativas sistémicamente y que presentan síntomas de choque endotóxico tales como fiebre, choque, o liberación de TNF-\alpha. Los animales se infectan típicamente con una o más bacterias Gram-negativas tales como Pseudomonas spp., cepas rugosas de E. coli, E. coli encapsulado y cepas lisas de E. coli. El péptido neutralizante de la endotoxina puede combinarse con otros agentes que son conocidos y usados para tratar el choque endotóxico.

La actividad neutralizante de endotoxinas puede medirse determinando la concentración en moles a la que el péptido inhibe completamente la acción del lipopolisacárido en un ensayo tal como el ensayo de productos de lisis de amebocitos de Limulus (LAL, Sigma Chemicals, St. Louis, MO) o el ensayo cromógeno LAL 1000 (Biowittacker, Walkersville, MD). La actividad neutralizante de endotoxinas puede medirse también calculando una dosis inhibidora 50 (LD50) usando métodos de respuesta a dosis estándar. Una dosis inhibidora 50 es esa cantidad de péptido que puede inhibir el 50% de la actividad de la endotoxina. Los péptidos neutralizaron preferiblemente la endotoxina a una concentración en moles de aproximadamente 1 x 10^{-4} M a aproximadamente 10^{-8} M, más preferiblemente de aproximadamente 10^{-5} M a aproximadamente 10^{-6} M. Los péptidos que se considera que no tienen actividad neutralizante de endotoxinas no neutralizan la endotoxina a una concentración en moles de aproximadamente 10^{-4} M o
inferior.

La presente invención proporciona también un uso de un polipéptido (esto es, uno o más polipéptidos) enumerado anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica para disminuir la cantidad de TNF-\alpha en un paciente (p.ej., un mamífero tal como un humano). De ese modo, ha de administrarse a un paciente una cantidad de una composición farmacéutica eficaz para disminuir la cantidad de TNF-\alpha en el sistema de un paciente tal como se determina evaluando los niveles en suero de TNF-\alpha, en la que la composición farmacéutica incluye uno o más polipéptidos descritos en la presente memoria. Análogamente, la presente invención proporciona un método para disminuir la cantidad de TNF-\alpha in vitro (p.ej., en un cultivo celular). Este método implica incubar las células con una cantidad de una composición eficaz para disminuir las cantidades de TNF-\alpha en el cultivo celular, en la que la composición incluye uno o más polipéptidos descritos en la presente memoria. Para ambos usos in vivo y métodos in vitro, puede usarse el ensayo WEHI para la detección de TNF-\alpha (Battafarano et al., Surgery 118, 318-324 (1995)) en el cultivo celular o en el suero de un paciente. Alternativamente, la cantidad de TNF-\alpha en una muestra puede ensayarse usando un anticuerpo anti-TNF-\alpha. Un polipéptido "activo" para disminuir el TNF-\alpha puede evaluarse usando un ensayo in vitro, y muestra preferiblemente una disminución de al menos el 10% en la cantidad de TNF-\alpha.

La angiogénesis es crucial para numerosas funciones biológicas en el cuerpo, desde procesos normales como la embriogénesis y la curación de heridas hasta procesos anormales como el crecimiento tumoral, artritis, restenosis y retinopatía diabética. El uso de agentes que puedan inhibir la angiogénesis in vitro e in vivo, particularmente en la investigación antitumoral, ha indicado que la terapia antiangiogénica será una modalidad terapéutica prometedora en el futuro. La búsqueda de inhibidores angiogénicos se ha centrado en controlar dos de los procesos que propician la angiogénesis: el crecimiento y adhesión de las células endoteliales (EC, del inglés "endothelial cells"), principalmente porque las EC son más accesibles de lo que son otras células a los agentes farmacológicos suministrados a través de la sangre y las EC son genéticamente estables y no mutan fácilmente hacia variantes resistentes a fármacos. La mayoría de los agentes antiangiogénicos se han descubierto identificando moléculas endógenas, principalmente proteínas que inhiben el crecimiento de las EC. Este enfoque tradicional ha producido varios productos antiangiogénicos, tales como el factor plaquetario-4 (PF4), la trombospondina, el factor de necrosis tumoral (TNF), la proteína-10 inducible por interferón-\gamma, la angiostatina, la endostatina, la vasostatina, y la proteína bactericida y que aumenta la permeabilidad (B/PI). En total se conocen actualmente aproximadamente cuarenta agentes antiangiogénicos, identificados usando varios enfoques.

Se ha postulado también que el crecimiento tumoral puede controlarse por privación de la vascularización (Folkman, J. Natl. Cancer Inst. 82, 4-6 (1990); Folkman et al., J. Biol. Chem. 267, 10931-10934 (1992)). Se ha descrito un número creciente de inhibidores endógenos de la angiogénesis tales como el factor plaquetario-4 (PF4), la proteína-10 inducible por interferón-\gamma (IP-10), la trompospondina-1 (TSP-1), la angiostatina, así como agentes sintéticos, p.ej., talidomida, TNP-470, e inhibidores de metaloproteinasas. Algunos de estos ensayos se están probando actualmente en pruebas clínicas en fase I/II. La investigación previa descrita en Griffioen et al., Blood 88, 667-673 (1996), y Griffioen et al., Cancer Res. 56, 1111-1117 (1996) ha demostrado que los factores pro-angiogénicos en tumores inducen la regulación posterior de las moléculas de adhesión sobre células endoteliales en la vascularización tumoral e inducen la anergia frente a señales inflamatorias tales como el factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha), la interleuquina-1, y el interferón-\gamma. Las EC expuestas al factor de crecimiento de células endoteliales vascular (VEGF, del inglés "vascular endothelial cell growth factor") (Griffioen et al., Blood 88, 667-673 (1996)) y el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, del inglés "basic fibroblast growth factor") (Griffioen et al., Blood 88, 667-673 (1996); y Melder et al., Nature Med. 2, 992-997 (1996)) tienen una regulación anterior gravemente dificultada de la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1, del inglés "intercellular adhesion molecule-1") y una inducción de la molécula de adhesión celular vascular-1 (VCAM-1, del inglés "vascular cell adhesion molecule-1") y la E-selectina. Este fenómeno, que se denominó anergia de EC inducida por tumor, es una manera en la que los tumores con un fenotipo angiogénico pueden escapar a la infiltración por leucocitos citotóxicos.

Debido a que la regulación posterior mediada por la angiogénesis de las moléculas de adhesión endoteliales (EAM, del inglés "endothelial adhesion molecules") puede propiciar el autocrecimiento del tumor evitando la respuesta inmune (Griffioen et al., Blood 88, 667-673 (1996); Kitayama et al., Cancer Res. 54, 4729-4733 (1994); y Piali et al., J. Exp. Med. 181, 811-816 (1995)), se cree que la inhibición de la angiogénesis reduciría la regulación posterior de las moléculas de adhesión y la falta de respuesta a las señales inflamatorias. Como apoyo a esta hipótesis, se ha publicado una relación entre la regulación anterior de la E-selectina y el agente angiostático AGM-1470 (Budson et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 225, 141-145 (1996)). Se ha demostrado también que la inhibición de la angiogénesis por PF4 regula anteriormente la ICAM-1 en EC estimuladas por bFGF. Además, la inhibición de la angiogénesis por PF4 reduce la anergia de las EC asociada con la angiogénesis frente a señales inflamatorias. Por tanto, la presente invención proporciona un uso de un polipéptido (esto es, uno o más polipéptidos) enumerado anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la proliferación de células endoteliales en un paciente (p.ej., un mamífero, tal como un humano). De ese modo, ha de administrarse a un paciente una cantidad de una composición farmacéutica eficaz para inhibir el crecimiento de células endoteliales, en la que la composición farmacéutica incluye uno o más polipéptidos descritos en la presente memoria. Análogamente, la presente invención proporciona un método para inhibir la proliferación de células endoteliales in vitro (p.ej., en un cultivo celular). Este método implica poner en contacto las células con una cantidad de una composición eficaz para prevenir y/o reducir el crecimiento de células endoteliales, en el que la composición incluye uno o más polipéptidos descritos en la presente
memoria.

Para determinar la cantidad de proliferación de células endoteliales in vivo, podrían usarse varios métodos conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, para la evaluación del crecimiento de células endoteliales en tumores, pueden teñirse apropiadamente secciones de tejidos para cuantificar la densidad de los vasos. Para determinar la cantidad de proliferación de células endoteliales in vitro, puede usarse el Ensayo de Proliferación de EC descrito en la Sección de los Ejemplos, que implica la absorción de timidina tritiada por células en cultivo celular. Un polipéptido que es "activo" para inhibir la proliferación de células endoteliales es preferiblemente uno que causa una reducción de al menos un 10% en la proliferación de células endoteliales a una concentración inferior a 10^{-4} M.

La presente invención proporciona también un uso de un polipéptido (esto es, uno o más polipéptidos) enumerado anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la regulación posterior de la expresión de la molécula de adhesión intercelular mediada por el factor angiogénico en un paciente (p.ej., un mamífero tal como un humano). De ese modo, ha de administrarse a un paciente una cantidad de una composición farmacéutica eficaz para prevenir y/o reducir la cantidad de regulación posterior de la expresión de ICAM, en la que la composición farmacéutica incluye uno o más polipéptidos descritos en la presente memoria. Análogamente, la presente invención proporciona un método para inhibir la regulación posterior de la expresión de la molécula de adhesión intracelular mediada por el factor angiogénico in vitro (p.ej., en un cultivo celular). Este método implica poner en contacto las células con una cantidad de una composición eficaz para prevenir y/o reducir la cantidad de regulación posterior de la expresión de ICAM, en el que la composición incluye uno o más polipéptidos descritos en la presente memoria.

La presente invención proporciona un uso de un polipéptido (esto es, uno o más polipéptidos) enumerado anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la angiogénesis (esto es, la formación de nuevos vasos sanguíneos) en un paciente (p.ej., un mamífero tal como un humano). De ese modo, ha de administrarse a un paciente una cantidad de una composición farmacéutica eficaz para prevenir y/o reducir la angiogénesis, en la que la composición farmacéutica incluye uno o más polipéptidos descritos en la presente memoria. Análogamente, la presente invención proporciona un método para inhibir la angiogénesis in vitro (p.ej., en un cultivo celular). Este método implica poner en contacto las células con una cantidad de una composición eficaz para prevenir y/o reducir la angiogénesis, en el que la composición incluye uno o más polipéptidos descritos en la presente memoria.

Para determinar la cantidad de angiogénesis in vivo, podrían usarse varios métodos conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, para la evaluación de la angiogénesis en tumores, pueden teñirse apropiadamente secciones de tejidos para cuantificar la densidad de los vasos. Para determinar la cantidad de angiogénesis in vitro, puede usarse el Ensayo de Angiogénesis in vitro (esto es, Ensayo de Formación de Tubos de EC) descrito en la Sección de los Ejemplos, que implica la desaparición del surgimiento de EC en cultivo celular. Un polipéptido que es "activo" para inhibir la angiogénesis es preferiblemente uno que causa una reducción de al menos un 10% en el surgimiento de células endoteliales a una concentración inferior a 10^{-4} M.

La presente invención proporciona un uso de un polipéptido (esto es, uno o más polipéptidos) enumerado anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la tumorigénesis en un paciente (p.ej., un mamífero tal como un humano). De ese modo, ha de administrarse a un paciente una cantidad de una composición farmacéutica eficaz para prevenir y/o reducir el crecimiento tumoral, en la que la composición farmacéutica incluye uno o más polipéptidos descritos en la presente memoria. Los métodos para determinar la inhibición de la tumorigénesis son bien conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo la evaluación del encogimiento de los tumores, la supervivencia, etc.

Un polipéptido preferido se selecciona del grupo que consiste en: ANIKLSVQMKLF (SEC ID No. 1); KLSVQMK
LFKRH (SEC ID No. 2); VQMKLFKRHLKW (SEC ID No. 3); KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4); KRHLKW
KIIVKL (SEC ID No. 5); LKWKIIVKLNDG (SEC ID No. 6); y análogos de los mismos.

Un polipéptido alternativo se selecciona del grupo que consiste en: QMKLFKRHLKWK (SEC ID No. 9); MKLFK
RHLKWKI (SEC ID No. 10); MKLFKRHLKWKIIV (SEC ID. No. 11); XLFKRHLKWKII (SEC ID No. 12); KLFXRHLKWKII (SEC ID No. 13); KLFKRHLXWKII (SEC ID No. 14); KLFKRHLKWXII (SEC ID No. 15); KLFKKHLKWKII (SEC ID No. 16); KLFKHLKWKII (SEC ID No. 17); y análogos de los mismos, en los que X es un aminoácido, natural o sintético. Preferiblemente, X es norleucina.

Un polipéptido más preferido se selecciona del grupo que consiste en: ANIKLSVQMKLF (SEC ID No. 1); KLSVQMKLFKRH (SEC ID No. 2); VQMKLFKRHLKW (SEC ID No. 3); KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4); KRHLKWKIIVKL (SEC ID No. 5); LKWKIIVKLNDG (SEC ID No. 6).

Los polipéptidos de las SEC ID Nos. 1 a 6 y 9 a 17 pueden estar en su forma de ácido libre o pueden estar amidados en el grupo carboxilato C-terminal. La presente invención incluye también análogos del polipéptido de las SEC ID Nos. 1 a 6 y 9 a 17 que tienen típicamente una similitud estructural con las SEC ID Nos. 1 a 6 y 9 a 17. Un "análogo" de un polipéptido incluye al menos una porción del polipéptido, en la que la porción contiene supresiones o adiciones de uno o dos aminoácidos contiguos o no contiguos, o que contiene una o más sustituciones de aminoácidos. Los sustitutos para un aminoácido en los polipéptidos de la invención son sustituciones conservativas, que se seleccionan entre otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica de la bioquímica de proteínas que un aminoácido que pertenece a una agrupación de aminoácidos que tienen un particular tamaño o característica (tal como la carga, hidrofobicidad e hidrofilia) pueden sustituirse generalmente por otro aminoácido sin alterar sustancialmente la estructura del polipéptido.

Para los propósitos de esta invención, las sustituciones conservativas de aminoácidos se definen como las que resultan del intercambio de restos de aminoácido de entre una de las siguientes clases de restos: Clase I: Ala, Gly, Ser, Thr, y Pro (que representan casdenas laterales alifáticas pequeñas y cadenas laterales con un grupo hidroxilo); Clase II: Cys, Ser, Thr, y Tyr (que representan cadenas laterales que incluyen un grupo -OH ó -SH); Clase III: Glu, Asp, Asm, y Gln (cadenas laterales que contienen un grupo carboxilo); Clase IV: His, Arg, y Lys (que representan cadenas laterales básicas); Clase V: Ile, Val, Leu, Phe, y Met (que representan cadenas laterales hidrófobas); y Clase VI: Phe, Trp, Tyr, e His (que representan cadenas laterales aromáticas). Las clases incluyen también aminoácidos relacionados tales como 3Hyp o 4Hyp en la Clase I; homocisteína en la Clase II; ácido 2-aminoadípico, ácido 2-aminopimélico, ácido \gamma-carboxiglutámico, ácido \beta-carboxiaspártico, y las amidas de los aminoácidos correspondientes en la Clase III; ornitina, homoarginina, N-metil-lisina, dimetil-lisina, trimetil-lisina, ácido 2,3-diaminopropiónico, ácido 2,4-diaminobutírico, homoarginina, sarcosina e hidroxilisina en la Clase IV; fenilalaninas sustituidas, norleucina, norvalina, ácido 2-aminooctanoico, ácido 2-aminoheptanoico, estatina y \beta-valina en la Clase V; y naftilalaninas, fenilalaninas sustituidas, ácido tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico, y tirosinas halogenadas en la Clase
VI.

Los análogos de polipéptidos, tal como se usa ese término en la presente memoria, incluyen también polipéptidos modificados. Las modificaciones de los polipéptidos de la invención incluyen derivatizaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de las cadenas laterales, modificaciones de la cadena principal, y modificaciones N- y C-terminales incluyendo acetilación, hidroxilación, metilación, amidación, y la unión de componentes de carbohidratos o lípidos, cofactores, y similares.

Un análogo de polipéptido preferido se caracteriza por tener al menos una de las actividades biológicas descritas en la presente memoria. Tal análogo se denomina en la presente un "análogo biológicamente activo" o simplemente un "análogo activo". La actividad biológica de un polipéptido puede determinarse, por ejemplo, como se describe en la Sección de los Ejemplos.

Los polipéptidos de la invención pueden sintetizarse por el método en fase sólida usando métodos estándar basados en los grupos protectores t-butiloxicarbonilo (BOC) o bien 9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC). Esta metodología se describe en G.B. Fields et al. en Synthetic Peptides: A User's Guide, W.M. Freeman & Company, New York, NY, pp. 77-183 (1992). Los presentes péptidos pueden sintetizarse también por medio de técnicas recombinantes bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la Patente de los EE.UU. No. 5.595.887 describe métodos de formación de una variedad de péptidos relativamente pequeños a través de la expresión de una construcción génica recombinante que codifica una proteína de fusión que incluye una proteína de unión y una o más copias del péptido diana deseado. Tras la expresión, la proteína de fusión se aísla y se escinde usando métodos químicos y/o enzimáticos para producir el péptido diana deseado.

Los polipéptidos de esta invención pueden administrarse solos en un vehículo farmacéuticamente aceptable, como un antígeno en asociación con otra proteína, tal como una proteína inmunoestimuladora o con un vehículo proteico tal como, pero sin limitarse a ellos, homocianina de lapa (KLH, del inglés "keyhole limpet homocyanin"), albúmina de suero bovino (BSA, del inglés "bovine serum albumin"), ovoalbúmina, o similares. Pueden emplearse en estado monovalente (esto es, péptido libre o un único fragmento de péptido acoplado a una molécula de vehículo). Pueden emplearse también como conjugados que tienen más de un péptido (iguales o diferentes) unidos a una única molécula de vehículo. El vehículo puede ser una molécula de vehículo biológica (p.ej., un glicosaminoglicano, un proteoglicano, albúmina, o similares) o un polímero sintético (p.ej., un polialquilenglicol o un soporte cromatográfico sintético). Típicamente, se emplea como vehículo ovoalbúmina, albúmina de suero humano, otras proteínas, polietilenglicol, o similares. Tales modificaciones pueden aumentar la afinidad aparente y/o cambiar la estabilidad de un péptido. El número de péptidos asociados o unidos a cada vehículo puede variar, pero típicamente se obtienen de aproximadamente 4 a 8 péptidos por molécula de vehículo en condiciones de acoplamiento estándar.

Los polipéptidos pueden conjugarse a otros polipéptidos usando métodos estándar tales como la activación de la molécula de vehículo con un reactivo de 4-(n-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo heterobifuncional. El entrecruzamiento de un vehículo activado con un péptido puede tener lugar por reacción del grupo maleimida del vehículo con el grupo sulfhidrilo de un péptido que contenga un resto de cisteína. Los conjugados pueden separarse del péptido libre a través del uso de cromatografía en columna de penetrabilidad en gel u otros métodos conocidos en la técnica.

Por ejemplo, los conjugados de péptido y molécula de vehículo pueden prepararse tratando una mezcla de péptidos y moléculas de vehículo con un agente de acoplamiento, tal como una carbodiimida. El agente de acoplamiento puede activar un grupo carboxilo en el péptido o bien en la molécula de vehículo, de manera que el grupo carboxilo pueda reaccionar con un nucleófilo (p.ej., un grupo amino o hidroxilo) del otro miembro del conjugado de péptido y molécula de vehículo, dando como resultado la unión covalente del péptido y la molécula de vehículo.

Por ejemplo, los conjugados de un péptido unido a ovoalbúmina pueden prepararse disolviendo cantidades iguales de péptido liofilizado y ovoalbúmina en un pequeño volumen de agua. En un segundo tubo, se disuelve hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC; diez veces la cantidad de péptido) en una pequeña cantidad de agua. La solución de EDC se añade a la mezcla de péptido y ovoalbúmina y se deja reaccionar durante varias horas. La mezcla puede entonces dializarse (p.ej., en solución salina tamponada con fosfato) para obtener una solución purificada del conjugado de péptido y ovoalbúmina.

La presente invención proporciona también una composición que incluye uno o más agentes activos (esto es, polipéptidos) de la invención y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Pueden administrarse a un paciente uno o más polipéptidos con actividad biológica demostrada en una cantidad sola o junto con otros agentes activos y con un tampón farmacéuticamente aceptable. Los polipéptidos pueden combinarse con una variedad de vehículos fisiológicamente aceptables para el suministro a un paciente, incluyendo una variedad de diluyentes o excipientes conocidos por los que poseen una experiencia normal en la técnica. Por ejemplo, para administración parenteral, se prefiere un solución salina isotónica. Para administración tópica, puede usarse una crema, incluyendo un vehículo tal como dimetilsulfóxido (DMSO), u otros agentes encontrados típicamente en cremas tópicas que no bloqueen o inhiban la actividad del péptido. Otros vehículos adecuados incluyen, pero sin limitarse a ellos, alcohol, solución salina tamponada con fosfato, y otras soluciones salinas equilibradas.

Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacología. Preferiblemente, tales métodos incluyen el paso de poner el agente activo en asociación con un vehículo que constituye uno o más ingredientes auxiliares. En general, las formulaciones se preparan poniendo uniformemente e íntimamente el agente activo en asociación con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y seguidamente, si es necesario, dando forma al producto en las formulaciones deseadas.

La invención incluye que la composición de la invención ha de administrarse a un paciente, preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente un humano, en una cantidad eficaz para producir el efecto deseado. Los péptidos pueden administrarse como una dosis única o en múltiples dosis. Las dosificaciones útiles de los agentes activos pueden determinarse comparando su actividad in vitro y la actividad in vivo en modelos animales. Los métodos para la extrapolación de dosificaciones eficaces en ratones, y otros animales, a humanos son conocidos en la técnica; por ejemplo, véase la Patente de los EE.UU. No. 4.938.949.

Los agentes de la presente invención se formulan preferiblemente en composiciones farmacéuticas y seguidamente, conforme a los métodos de la invención, se administran a un paciente, tal como un paciente humano, en una variedad de formas adaptadas a la vía elegida de administración. Las formulaciones incluyen, pero sin limitarse a ellas, las adecuadas para administración oral, rectal, vaginal, tópica, nasal, oftálmica, o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intratumoral, e intravenosa).

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen convenientemente una preparación acuosa estéril del agente activo, o dispersiones de polvos estériles del agente activo, que son preferiblemente isotónicas con la sangre del receptor. Los agentes isotónicos que pueden incluirse en la preparación líquida incluyen azúcares, tampones, y cloruro sódico. Las soluciones del agente activo pueden prepararse en agua, mezclada opcionalmente con un tensioactivo no tóxico. Las dispersiones del agente activo pueden prepararse en agua, etanol, un poliol (tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicoles líquidos, y similares), aceites vegetales, ésteres de glicerol, y mezclas de los mismos. La forma de dosificación final es estéril, fluida, y estable en la condiciones de fabricación y almacenamiento. La fluidez necesaria puede conseguirse, por ejemplo, usando liposomas, empleando el tamaño de partícula apropiado en el caso de las dispersiones, o usando tensioactivos. La esterilización de una preparación líquida puede conseguirse por cualquier método conveniente que preserve la bioactividad del agente activo, preferiblemente mediante esterilización por filtración. Los métodos preferidos para preparar polvos incluyen el secado a vacío y la liofilización de las soluciones inyectables estériles. La contaminación microbiana subsiguiente puede prevenirse usando varios agentes antimicrobianos, por ejemplo, agentes antibacterianos, antivirales y antifúngicos incluyendo parabenes, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. La absorción de los agentes activos durante un periodo prolongado puede conseguirse incluyendo agentes para retrasar, por ejemplo, monoestearato de aluminio y
gelatina.

Las formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral pueden presentarse como unidades discretas tales como comprimidos, pastillas, cápsulas, tabletas, láminas, u obleas, cada una conteniendo una cantidad predeterminada del agente activo como un polvo o gránulos, como liposomas que contienen el agente quimiopreventivo, o como una solución o suspensión en un líquido acuoso o un líquido no acuoso tal como un jarabe, un elixir, una emulsión, o una pócima. Tales composiciones y preparaciones contienen típicamente al menos aproximadamente un 0,1% en peso del agente activo. La cantidad de polipéptido (esto es, agente activo) es tal que el nivel de dosificación será eficaz para producir el resultado deseado en el paciente.

Las formulaciones de pulverizadores nasales incluyen soluciones acuosas purificadas del agente activo con agentes conservantes y agentes isotónicos. Tales formulaciones se ajustan preferiblemente a un pH y estado isotónico compatible con las membranas mucosas nasales. Las formulaciones para administración rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio con un vehículo adecuado tal como manteca de cacao, o grasas hidrogenadas o ácidos carboxílicos grasos hidrogenados. Las formulaciones oftálmicas se preparan por un método similar al del pulverizador nasal, excepto que los factores de pH e isotónicos se ajustan preferiblemente para ajustarse a los del ojo. Las formulaciones tópicas incluyen el agente activo disuelto o resuspendido en uno o más medios tales como aceite mineral, petróleo, polihidroxialcoholes, u otras bases usadas para formulaciones farmacéuticas tópicas.

Los comprimidos, pastillas, píldoras, cápsulas, y similares pueden contener también uno o más de los siguientes: un aglutinante tal como goma tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; un excipiente tal como fosfato dicálcico; un agente desintegrante tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico, y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; un agente edulcorante tal como sacarosa, fructosa, lactosa, o aspartamo; y un agente de sabor natural o artificial. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, puede contener adicionalmente un vehículo líquido, tal como un aceite vegetal o un polietilenglicol. Otros materiales varios pueden estar presentes como revestimientos o para modificar de otra forma la forma física de la forma de dosificación unitaria sólida. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras, o cápsulas pueden revestirse con gelatina, cera, goma laca, azúcar, y similares. Un jarabe o elixir puede contener uno o más de un agente edulcorante, un conservante tal como metil- o propilparabene, un agente para retardar la cristalización del azúcar, un agente para aumentar la solubilidad de cualquier otro ingrediente, tal como un alcohol polihídrico, por ejemplo, glicerol o sorbitol, un colorante, y un agente de sabor. El material usado en la preparación de cualquier forma de dosificación unitaria es sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. El agente activo pueden incorporarse en preparaciones y dispositivos de liberación prolongada.

En los ejemplos presentados en la presente memoria, una serie de dodecapéptidos (SC-1 a SC-8) que "recorren" la secuencia de aminoácidos del \betapep-25 (SEC ID No. 19) se investigó con relación a su capacidad para destruir bacterias y neutralizar el LPS, específicamente para destruir bacterias Gram-negativas y positivas y neutralizar la endotoxina. Uno de estos péptidos SC, SC-4 (KLFKRHLKWKII, SEC ID No. 4), se identificó por ser excepcionalmente potente con una LD50 de 3 nanomolar frente a bacterias Gram-negativas, incluso más potente que el péptido parental \betapep-25. Frente a bacterias Gram-positivas, el SC-4 mostró también una buena actividad con LD50s en la escala submicromolar.

Para demostrar la actividad bactericida de amplio espectro, se investigaron varias cepas: una cepa rugosa de bacterias Gram-negativas, J5; cuatro cepas lisas Gram-negativas clínicamente relevantes (Pseudomonas aeruginosa, J96, H5 e IA2), y dos cepas Gram-positivas (MN-8 y MNHO). Además, puesto que los péptidos que forman ambas conformaciones en láminas \beta y helicoidales pueden ser bactericidas y estos dodecapéptidos se derivaron de un péptido \betapep que forma láminas \beta, se adquirieron datos de CD y NMR en solución acuosa y en solución de trifluoroetanol (TFE) al 30% para investigar en qué tipo conformacional se clasifican estos oligómeros de 12 miembros.

Los estudios de pérdida de fluido realizados usando microscopía de fluorescencia, indicaron una rápida permeabilidad de la membrana bacteriana con valores de t1/2 de aproximadamente 10 minutos con dosis de 100% de destrucción de péptido. El SC-4 también neutralizó eficazmente la endotoxina en la escala micromolar y es no hemolítico por debajo de 10^{-4} M. Para todos los péptidos SC, los datos de dicroísmo circular sugirieron fuertemente la presencia de ambas hélices \alpha o hélices 3_{10}. Los datos de NOESY adquiridos de los péptidos SC en presencia de trifluoroetanol al 30%, muestran también NOEs característicos de ambas hélices \alpha o hélices 3_{10}. Las diferencias en las actividades entre estos dodecapéptidos helicoidales permitieron inferir algunas relaciones estructura-función. Para el SC-4, que es mayormente de tipo hélice 3_{10}, el modelado computacional basado en el NOE proporciona una estructura en hélice 3_{10} anfipática con K1, K4, R5, K8 y K10 ordenándose de manera pentagonal en una superficie de la hélice.

Se investigaron también varias variantes de SC-4 con un único resto sustituido. Las actividades bactericidas en las variantes de SC-4 con sustituciones de lisina/arginina por norleucina varían, sin que sea sorprendente, de cepa a cepa bacteriana. Frente a la cepa J5, cualquier sustitución muestra no más que una disminución en 2 veces la actividad, mientras que frente a P.a., la sustitución en las posiciones N-terminales K1, K4 ó R5 hace caer la actividad significativamente en aproximadamente 20 veces. Para la neutralización de la endotoxina, la sustitución de grupos cargados tiene poco efecto, mientras que la eliminación de las isoleucinas C-terminales hace caer la actividad en aproximadamente 500 veces. Con relación a otros péptidos bactericidas conocidos en la categoría de péptidos lineales que forman hélices, SC-4 resulta ser el agente bactericida más potente de amplio espectro identificado hasta la
fecha.

La presente invención proporciona también la estructura tridimensional de algunos de los polipéptidos derivados usando espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR) (p.ej., uni- y bidimensional) y opcionalmente espectroscopía de dicroísmo circular (CD). Esta información es de una utilidad importante en campos tales como el descubrimiento de fármacos. La comprensión de la estructura de, por ejemplo, el SC-4, permite el diseño de fármacos que tienen una estructura similar y, por tanto, una actividad similar. Tales fármacos pueden ser péptidos, peptidomiméticos (p.ej., compuestos peptídicos en los que la cadena principal peptídica se sustituye por una o más moléculas de benzodiazepina, péptidos en los que todos los L-aminoácidos se sustituyen por los D-aminoácidos correspondientes, y péptidos "retro-inversos"), y miméticos no peptídicos. Tales fármacos son preferiblemente miméticos no peptídi-
cos.

Los datos estructurales presentados en la presente memoria pueden usarse (preferiblemente en combinación con la información sobre Relaciones entre Estructura y Actividad (SAR, del inglés "Structure Activity Relationships") y sitios farmacóforos potenciales) para seleccionar un compuesto candidato (fármaco potencial) a partir de una base de datos de estructuras tridimensionales de compuestos conocidos. Las estructuras tridimensionales en la base de datos pueden determinarse experimentalmente, o bien generarse por ordenador. Alternativamente, un compuesto candidato puede diseñarse también de novo. El compuesto candidato tendrá una estructura tridimensional que es al menos en parte (y preferiblemente, sustancialmente) similar a la estructura tridimensional de uno de los polipéptidos presentados en la presente memoria, preferiblemente el SC-4. Pueden usarse varias técnicas de búsqueda en bases de datos de compuestos y/o de modelado molecular conocidas por un experto en la técnica para seleccionar compuestos candidatos. Tales compuestos pueden evaluarse en relación con su actividad biológica usando los ensayos descritos en la presente memoria.

Específicamente, la presente invención proporciona información detallada sobre la forma y estructura del dominio activo superficial de varios de los polipéptidos descritos en la presente memoria. Cada uno de los aminoácidos constituyentes que forma el "dominio activo superficial" se define por los mostrados en la Fig. 6. El término "dominio activo superficial" se refiere a una región de una molécula o complejo molecular que, como resultado de su forma, es activa para el tratamiento de una o más afecciones, tales como las descritas en la presente memoria. Tal dominio activo superficial es la parte del polipéptido que se cree es importante para impartir la función deseada. Por tanto, la información estructural de justo este dominio puede usarse para identificar compuestos candidatos como se describe anteriormente.

El término "coordenadas estructurales " se refiere a las coordenadas Cartesianas (véase la Tabla 5) derivadas del modelado por ordenador usando las distancias internucleares obtenidas de experimentos espectroscópicos de NMR, esto es, NOEs (véase la Tabla 6), como se describe en la Sección de los Ejemplos. Las coordenadas estructurales generan una configuración única de puntos en el espacio. Debe observarse que estas coordenadas representan una representación del mejor ajuste estadístico de numerosas estructuras para cualquier polipéptido, y que cabría esperar ligeras variaciones en coordenadas estructurales individuales. También, pueden definirse configuraciones similares o idénticas mediante un juego de coordenadas totalmente diferente, siempre que las distancias y ángulos entre las coordenadas se mantengan esencialmente iguales.

\newpage

Generalmente, la estructura en la presente memoria es una estructura anfipática, tal como una hélice (que puede verse como un cilindro), en la que una superficie incluye restos de aminoácido cargados positivamente (preferiblemente, una superficie esta compuesta principalmente de restos de aminoácido cargados positivamente (esto es, restos de aminoácido hidrófilos)) y la superficie opuesta incluye restos de aminoácido hidrófobos (preferiblemente, la superficie opuesta está compuesta principalmente de restos de aminoácido hidrófobos). El dominio activo superficial se identifica por los restos de aminoácido cargados positivamente y la superficie opuesta hidrófoba. En el caso del SC-4, que tiene una estructura helicoidal, una superficie incluye cuatro restos de aminoácido cargados positivamente, aunque puede haber más o menos para otras estructuras, y la superficie opuesta incluye restos de aminoácido hidrófobos. Más específicamente, para el SC-4, el dominio activo superficial incluye las coordenadas estructurales de los átomos de los restos de aminoácido K1 (átomos 1-24), K4 (átomos 64-85), R5 (86-109), y K8 ofrecidas en la Tabla 5, como se muestra en la Fig. 6. Una manera alternativa de visualizar el dominio activo superficial es en términos de las relaciones espaciales entre restos clave funcionalmente derivados de las SAR (véase, por ejemplo, la
Fig. 6).

Pueden usarse varios análisis por ordenador para determinar si un compuesto es suficientemente similar a la estructura tridimensional deseada. Tales análisis pueden llevarse a cabo en aplicaciones de software actuales, como se conoce en la técnica. Esto puede implicar una comparación de la estructura tridimensional, hidrofobicidad, volumen estérico, propiedades electrostáticas, ángulos de enlaces, tamaño o composición molecular, etc. Por ejemplo, el paquete Quanta's Molecular Similarity (Molecular Simulations, Inc., Waltham, MA) permite la comparación entre estructuras diferentes, conformaciones diferentes de la misma estructura, y partes diferentes de la misma estructura. Típicamente, la estructura del compuesto que se está analizando se traduce y se rota para obtener un ajuste óptimo con la estructura del polipéptido activo.

Las estructuras candidatas preferidas son las que tienen un juego de coordenadas estructurales con una desviación de la raíz de los cuadrados de la media (esto es, la raíz cuadrada de la media aritmética de los cuadrados de las desviaciones de la media) de los átomos de los restos conservados inferior a 2,0 Angstroms, cuando se superponen sobre las coordenadas estructurales relevantes. Más preferiblemente, la desviación de la raíz de los cuadrados de la media es inferior a 1,0 Angstrom.

Una vez que se identifica un compuesto candidato usando las técnicas de modelado molecular o de comparación de bases de datos, puede sintetizarse por una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica.

Un método específico de la presente invención implica evaluar un compuesto candidato en relación con su similitud estructural con la de KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4): suministrando una estructura tridimensional de KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4); suministrando una estructura tridimensional de un compuesto candidato; y comparando la estructura tridimensional del compuesto candidato con la estructura tridimensional de KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4).

Los objetos y ventajas de esta invención se ilustran adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, pero los materiales particulares y cantidades de los mismos enumerados en estos ejemplos, así como otras afecciones y detalles, no deberían interpretarse como que limiten excesivamente esta invención.

Métodos y materiales Preparación de los péptidos

Los péptidos se sintetizaron usando un sintetizador de péptidos en fase sólida Milligen/Biosearch 9600, usando la química del fluorenilmetoxicarbonilo. Los péptidos brutos liofilizados se purificaron por HPLC preparativa de fase inversa en una columna C18 con un gradiente de elución de acetonitrilo al 0-60% con ácido trifluoroacético al 0,1% en agua. La pureza y composición de los péptidos se verificaron por HPLC (Beckman Model 6300), análisis de aminoácidos, y espectrometría de masas.

Cepas bacterianas

Pseudomonas aeruginosa de tipo 1 es un aislado clínico de cepa lisa serotipado usando el esquema de Homma et al., Japan J. Exp. Med. 46, 329-336 (1976) y mantenido en el laboratorio mediante transferencia mensual sobre placas de sangre en agar. E. coli J96, IA2, y H5 son aislados clínicos uropatogénicos de cepa lisa amablemente mantenidos y proporcionados por J.R. Johnson y descritos en Jonhson et al., J. Infect. Disease 173, 920-926 (1996) para J96 e IA2 y en Jonhson et al., J. Infect. Disease 173, 746-749 (1996) para H5. J5 es una cepa rugosa de E. coli inicialmente referenciada por G.R. Siber y discutida en Warren et al., Infect. Immunity 55, 1668-1673 (1987) y es análoga a la cepa lisa E. coli 0111:B4 usada en el estuche ("kit") de detección y cuantificación de endotoxina LAL de Bio Whittaker descrito más abajo. MN8 y MNHO Gram-positivos son dos aislados de pacientes de Staphylococcus aureus, que fueron amablemente proporcionados por P.M. Schlievert y descritos en Bohach et al., Rev. Infect. Diseases 11, 75-82 (1989) para MNHO y en Schlievert et al.,J. Infect. Diseases 147, 236-242 (1983) para MN8. Todos los cultivos se mantienen en placas de nutriente en agar.

Ensayo bactericida

Se usaron soluciones libres de pirógeno en todo el ensayo. Las bacterias en fase logarítmica se obtuvieron transfiriendo un cultivo crecido durante una noche o sacando trocitos de cristales de reservas en glicerol a -85ºC de cultivos crecidos durante una noche. Las bacterias se lavaron y resuspendieron en cloruro sódico al 0,9% con ajuste a una densidad óptica a 650 nm que proporciona 3 x 10^{8} CFU/ml. Las bacterias se diluyeron seguidamente 1:10 en tampón citrato fosfato 0,08 M, pH 7,0 (preparado mezclando ácido cítrico 0,08 M con fosfato de sodio dibásico 0,08 M). Las bacterias (0,15 ml) se incubaron con el péptido en un volumen final de 1,0 ml de tampón. El ensayo se hizo en tubos de polipropileno de 17x100 en un agitador recíproco con baño de agua a 37ºC durante 30 minutos. Después de esta incubación de 30 minutos (min), se realizaron diluciones por un factor de 10 en cloruro sódico al 0,9%. Las diluciones se hicieron hasta 10^{-4} y 20 \mul de cada dilución se inocularon como una raya a lo largo de una placa de agar. Los organismos Gram-positivos se dispusieron en placas de nutriente en agar que contenían agar al 2% y los organismos Gram-negativos se dispusieron en placas de agar MacConkey (2%). Las placas se incubaron durante una noche a 37ºC y se cuantificaron a la mañana siguiente. La dilución que contenía 10-100 bacterias se cuantificó y el número se multiplicó por 50 para ajustar todas las cuentas al número de bacterias destruidas por milímetro. Las concentraciones de péptido se convirtieron a logaritmos decimales y se representaron en una gráfica. La actividad bactericida se determinó por la respuesta a dosis donde los valores de LD50 se determinaron mediante los mejores ajustes de una curva sigmoide a los datos de respuesta a dosis.

Ensayo de productos de lisis de amebocitos de Limulus para la neutralización de LPS

La capacidad de los péptidos sintéticos para neutralizar la endotoxina se detectó usando el "kit" cromógeno QCL-1000 de Bio Whittaker, Inc. (Walkersville, MD) como se describe en su protocolo. Este método es cuantitativo para la endotoxina de bacterias Gram-negativas (lipopolisacárido, LPS). En el ensayo de productos de lisis de amebocitos de Limulus (LAL), los péptidos que son activos inhiben la activación mediada por LPS de una proenzima (Young et al., J. Clin. Invest. 51, 1790-1798 (1972)) cuya forma activa liberaría p-nitroanilina (pNA) de un sustrato sintético sin color (Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA), produciendo un color amarillo (pNA) cuya absorción se monitoriza espectrofotométricamente a 405-410 nm. La tasa inicial de activación de la enzima es proporcional a la concentración de endotoxina presente. La concentración de péptido requerida para unirse al LPS y, por tanto, inhibir los productos de lisis de amebocitos de Limulus impulsados por 0,04 unidades (ó 0,01 ng) de LPS de E. coli 055:B5 (de SIGMA) se determinó por la respuesta a dosis.

Cinética de la pérdida de fluido

La integridad de la membrana de las células bacterianas se midió usando el "kit" de viabilidad bacteriana
LIVE/DEAD BacLight (L-7007) de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR) que usa mezclas de colorantes fluorescentes rojos y verdes para diferenciar las bacterias dañadas e intactas, respectivamente. Se investigaron dos cepas de E. coli (H5 y J5) y una cepa de Staphylococcus aureus (MN8), y se usaron los péptidos SC en una dosis que inicia una destrucción del 100%. Se tomaron puntos a tiempos entre 0 y 60 min. La emisión de fluorescencia (excitación a 470 nm y emisión de 490 nm a 700 nm) de cada suspensión de células se midió en un espectrofotómetro de fluorescencia. Se colocaron 5 \mul de cada muestra en una platina de microscopio con un cubre cuadrado y sellado para prevenir el movimiento.

Actividad Hemolítica

Los glóbulos rojos humanos se lavaron tres veces usando solución salina tamponada con fosfato (PBS: tampón fosfato 35 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,0) antes de realizar el ensayo. 100 \mul de glóbulos rojos humanos resuspendidos en PBS al 0,4% (v/v) se colocaron en tubos eppendorf, y se añadieron 100 \mul de péptidos diluidos de manera seriada en PBS (la concentración de péptido estaba en el intervalo de 1 \muM a 100 \muM). Los tubos se incubaron durante 1 h a 37ºC y se centrifugaron a 1000 g durante 5 min. A continuación se transfirieron alícuotas de 100 \mul del sobrenadante a tubos eppendorf, y la hemólisis se midió por la absorbancia a 414 nm. El 0% de hemólisis y 100% de hemólisis se determinaron en PBS y en Triton-X 100 al 1%, respectivamente. El porcentaje de hemólisis se calculó usando la siguiente fórmula: % hemólisis = [(A_{414} en la solución de péptido - A_{414} en PBS)/(A_{414} en Triton-X 100 al 1% - A_{414} en PBS)] x 100.

Dicroísmo Circular

Los espectros de dicroísmo circular (CD) se midieron en un espectropolarímetro de registro automático JASCO JA-710 acoplado con un procesador de datos. Las curvas se registraron digitalmente y se introdujeron en el procesador de datos para calcular el promedio de las señales y sustraer la línea base. Los péptidos se disolvieron (0,6 mg/ml) en tampón fosfato de potasio 10 mM, pH 5,5, y los espectros de CD se registraron a 20ºC sobre un intervalo de 190 nm a 250 nm usando una cubeta de cuarzo de 0,5 mm de paso óptico con cubierta térmica. La temperatura se controló usando un baño de agua NesLab. La velocidad de los barridos fue 20 nm/min. Se calculó el promedio de la señal de los espectros 8 veces, y se sustrajo una línea base del disolvente cuya señal se había promediado de igual manera. Los espectros de CD para cada péptido se adquirieron como una función de la concentración de trifluoroetanol (TFE) del 0% al 80% (volumen/volumen, v/v). Los espectros de CD se desconvolucionaron como se describe en Sreerama et al., Anal. Biochem. 209, 32-44 (1993).

Mediciones de NMR

Para las mediciones de NMR, el péptido liofilizado se disolvió en H_{2}O. La concentración de péptido era usualmente aproximadamente de 5 a 6 mM. El pH se ajustó a pH 5,5 añadiendo cantidades en \mul de NAOD o DCl a la muestra de péptido. Los espectros de NMR se adquirieron en un espectrómetro de NMR Varian UNITY Plus-600. La resonancia del agua se suprimió por irradiación directa (0,8 s) a la frecuencia del agua durante el tiempo de retardo de relajación entre los barridos.

Los espectros de transferencia de magnetización homonuclear en 2D (HOHAHA), obtenidos por confinamiento de espines con una secuencia MLEV-17 (Bax et al., J. Magn. Reson. 65, 355-360 (1985)) con un tiempo de mezcla de 60 ms, se usaron para identificar los sistemas de espín. Los experimentos de NOESY (Wider et al., J. Magn. Reson. 56, 207-234 (1984)) se realizaron para el análisis conformacional. Todos los espectros de 2D-NMR se adquirieron en el modo sensible a la fase States-TPPI (States et al., J. Magn. Reson. 48, 286-293 (1982); y Bodenhausen et al., J. Magn. Res. 37, 93-99 (1980)). La resonancia del agua se suprimió por irradiación directa (0,8 s) a la frecuencia del agua durante el tiempo de retardo de relajación entre los barridos, así como durante el tiempo de mezcla en los experimentos de NOESY. Los espectros de 2D-NMR se acumularon usando de 256 a 512 experimentos en t1, cada uno con 2000 puntos complejos para cubrir una anchura espectral de 6 kHz en ambas dimensiones con el trasmisor situado en la resonancia del agua. Para los espectros de NOESY y HOHAHA, se promediaron 16 acumulaciones por cada experimento en t1. Los datos se procesaron directamente en el espectrómetro o fuera de él usando VNMR (Varian, Inc., Palo Alto, CA) o NMRPipe (Delagio et al., J. Biomol. NMR 6, 277-293 (1995)) en una estación de trabajo SGI. Los juegos de datos se multiplicaron en ambas dimensiones con una función sinusoidal desplazada 30-60 grados y se llenaron de ceros hasta 1000 puntos en la dimensión t1 antes de la transformada de
Fourier.

Puesto que los péptidos SC son bastante hidrófobos y más tarde se encontró que son anfipáticos, se realizaron mediciones de auto-difusión de NMR usando gradientes de campo pulsado (PFG, del inglés "pulsed field gradient") como una comprobación de la agregación de los péptidos. Los experimentos de PFG-NMR se hicieron como se describe en Mayo et al., Protein Sci. 5, 1301-1315 (1996) usando un espectrómetro de NMR Varian Unity-Plus 500. La magnitud máxima del gradiente fue 6- G/cm, y se usó una secuencia de pulsos que contiene un tiempo para eliminar las corrientes de Foucault en los PFG longitudinales para todas las mediciones de auto-difusión, que se realizaron en temperaturas D20 de 5ºC y 40ºC. Las concentraciones de péptido estaban en el intervalo de 0,1 mM a 15 mM. Los datos de PFG-NMR se analizaron también como se describe en Mayo et al., Protein Sci. 5, 1301-1315
(1996).

Modelado estructural

El análisis de las curvas de crecimiento de NOE indicó que los NOEs interprotón de cadena principal a cadena principal eran normalmente máximos de 300 ms a 400 ms. Las restricciones de las distancias interprotón se derivaron de los NOEs asignados en los espectros de ^{1}H NOESY adquiridos con tiempos de mezcla de 200 ms y 400 ms. Los NOEs se clasificaron como fuerte, medio, débil o muy débil correspondiendo con límites superiores de restricciones de las distancias de 2,8, 3,3, 4,0, y 4,5 \ring{A}, respectivamente. El límite inferior de restricción entre protones no enlazados se fijó en 1,8 \ring{A}. Las correcciones pseudos-atómicas se añadieron a los límites superiores de restricciones de las distancias cuando fue apropiado, y se añadió una corrección de 0,5 \ring{A} al límite superior para los NOEs que implicaban a los protones metílicos. Las restricciones de los enlaces de hidrógeno se identificaron a partir del patrón de NOEs secuenciales y entre cadenas que implicaban protones NH y C\alphaH, junto con la evidencia de un intercambio lento de protones entre amida y disolvente. Cada enlace de hidrógeno identificado se definió usando dos restricciones de distancias; r_{NH-O} = 1,8 a 2,5 \ring{A}, y r_{N-O} = 1,8 a 2,5 \ring{A}.

Las restricciones de las distancias internucleares derivadas se usaron en el cálculo de las estructuras para el dodecapéptido SC-4 usando X-PLOR (Brunger et al., X-plor Manual, Yale University Press, New Haven (1992)). El SC-4 se creó usando campos de fuerza parallhdg.pro. Se generó un juego de coordenadas molde usando la rutina Template. Seguidamente se usó el protocolo de reasociación simulada (SA, del inglés "simulated annealing") ab initio. El procedimiento SA aplicó una dinámica a alta temperatura (3000 K durante 120 ps) y seguidamente enfrió a 100 K en pasos de 50 K con una dinámica molecular de 1,5 ps en cada paso. La minimización de Powell se realizó a 100 K para 1000 pasos. El refinamiento de la estructura se hizo basándose en la reasociación simulada comenzando a 1000 K y terminando a 100 K. Las estructuras finales se sometieron a la rutina X-PLOR Accept con un umbral de violación para los NOEs de 0,5 \ring{A} y ángulos dihedros de 5º. No se permitió que los ángulos, longitudes de enlace o ángulos impropios se desviaran de la geometría ideal más de 5º, 0,05 \ring{A} y 5º, respectivamente. Las estructuras se superpusieron usando el visualizador BIOSYM INSIGHT (Molecular Simulations, Inc.) y se analizaron usando las rutinas de análisis X-PLOR.

Células, Cultivos, y Reactivos

Las EC derivadas de la vena umbilical humana (HUVEC, del inglés "human umbilical vein derived EC") pueden recogerse de cordones umbilicales humanos normales por perfusión con tripsina/EDTA al 0,125% como se describe en Groenewegen et al., J. Exp. Med. 164, 131-143 (1986). Para la determinación del fenotipo estático de EC aislado, las EC se fijan inmediatamente en paraformaldehído al 1%. Se aíslan EC microvasculares (MVECs, del inglés "microvascular ECs") humanas. Las EC se cultivan en matraces de cultivo de tejido recubierto con fibronectina en medio de cultivo (RPMI-1640 con suero humano (HS, del inglés "human serum") al 20%, suplementado con glutamina 2 mM y 100 U/ml de penicilina y 0,1 mg/ml de estreptomicina). Para el aislamiento de PF4 recombinante, el gen sintético del PF4 nativo humano se expresa como un proteína no de fusión en células de E. coli (BL21) (Repligen Corp., Cambridge, MA). La proteína se purifica, se escinde, y se repliega esencialmente como se describe en Yang et al., J. Biol. Chem. 269, 20110-20118 (1994). La pureza se evaluó por tinción con Coomassie de SDS PAGE, HPLC de fase inversa en C4 analítica, y análisis de aminoácidos. Típicamente, se aíslan varios cientos de miligramos de material puro en más de un 95% a partir de 100 gramos (g) de material de partida.

Ensayo de Proliferación de EC

La proliferación de EC se mide usando un ensayo de incorporación de [^{3}H]timidina. Las EC se siembran a 5000 células/pocillo en placas de cultivo de tejido de fondo plano y se dejan crecer durante 3 días, en ausencia o presencia de reguladores, en medio de cultivo. Durante las últimas 6 horas del ensayo, el cultivo se somete a una dosis de 0,5 \muCi de [^{3}H]metil-timidina/pocillo.

Ensayo de Angiogénesis in vitro

Se prepara una matriz seminatural de colágeno de tipo I mezclando 8 volúmenes de vitrogen 100 (Collagen Corporation, Fermont, CA, USA) con 1 volumen de MEM (Life Technologies) concentrado 10x y 1 volumen de bicarbonato de sodio (11,76 mg/ml). La matriz se dispensa en placas de cultivo y se deja convertir en gel a 37ºC. BMEC confluentes (amablemente proporcionadas por el Dr. M. Furie, State University of New York, Stony Brook, USA) se tratan con tripsina y se siembran encima de esta matriz de colágeno. Cuando las células han crecido hasta formar una monocapa confluente, el medio se reemplaza por medio fresco, medio que contiene 25 ng/ml de bFGF o medio que contiene 25 ng/ml de bFGF y los péptidos. En contraste con la adición del inductor de la angiogénesis encima de la matriz, los esferoides de la línea celular de colon (LS174T) se incrustan en la matriz de colágeno antes de la formación del gel. Los péptidos se añaden al cultivo simultáneamente con las EC. En ambos experimentos, después de 48 horas de incubación, las monocapas endoteliales (que brotan) se fotografían con un foto-microscopio de contraste de fases invertidas Zeiss. La cantidad de brote en cada pocillo (esto es, la longitud total de los brotes) se cuantifica mediante el programa de ordenador NIH Image (Barendsz-Janson et al., J. Vasc. Res. 35, 109-114
(1998)).

Ensayo de la CAM

Se incuban huevos Leghorn blancos seleccionados de la línea Lohman fértil durante tres días a 37ºC y un 55% de humedad relativa y se rotan una vez cada hora. En el día 3, se hace una ventana rectangular (1x2 cm) en la cáscara del huevo. La ventana se cubre con cinta adhesiva para prevenir la deshidratación. La ventana permite la observación tranquila de la vascularización en desarrollo de la membrana corio-alantoidea (CAM, del inglés "chorio-allantoic membrane"). En el día 7, se coloca un anillo silástico (10 mm de diámetro) en la CAM para permitir la administración local de los fármacos dentro del anillo. Los péptidos disueltos en solución salina estéril (NaCl al 0,9%) se aplican diariamente en alícuotas de 65 \mul desde el día 10 al día 13. En el día 14, las CAMs se fotografían.

Inmunofluorescencia

El análisis mediante un separador de células activadas por fluorescencia (FACS, del inglés "fluorescence activated cell sorter") usando reactivos conjugados con ficoeritrina (PE) indirectos requiere 3 incubaciones separadas. Las EC (1 x 10^{5}) se fijan durante 1 h en paraformaldehído al 1%, se resuspenden en 20 \mul de MAb diluido apropiadamente y se incuban durante 1 h en hielo. Subsiguientemente, las células se lavan 2 veces en solución salina tamponada con fosfato/albúmina de suero bovino (PBS/BSA) (0,1%) y se incuban durante otros 30 min con Ig de conejo anti-ratón biotinilada (Dako, Glostrup, Dinamarca). Después de otros 2 lavados, las células se incuban con conjugado de estreptavidina-ficoeritrina (Dako). Las células teñidas se analizan en un citómetro de flujo FACScan. El análisis de los datos se realiza usando el software PCLysys (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

La inhibición de la angiogénesis previene la regulación posterior de ICAM-1 inducida por bFGF

Para probar la hipótesis de que los factores angiostáticos pueden prevenir la regulación posterior mediada por la angiogénesis de EAM, puede ensayarse un polipéptido con respecto a sus efectos sobre la expresión de EAM. Estos estudios se concentran en la expresión de ICAM-1 porque investigaciones previas usando anticuerpos anti-ICAM-1 y anti-LFA-1 demostraron que la interacción ICAM-1/LFA-1 es crucial, esto es, tanto esencial como suficiente, en la adhesión y extravasación leucocito/EC (Bevilacqua, Ann. Rev. Immunol. 11, 767-804 (1993); y Springer, Cell 76, 301-314 (1994)). Una incubación de 3 días de EC con 10 ng/ml de bFGF para evaluar la atenuación de la expresión de ICAM-1 se compara con células control.

Resultados

La Figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos para el \betapep-19 (SEC ID No. 18), el \betapep-25 (SEC ID No. 19), y los dodecámeros peptídicos (péptidos SC) que "recorren" la secuencia del \betapep-25. Se observó que la actividad bactericida del \betapep-25 era igual o mejor que la del \betapep-19, y estos "recorredores" se diseñaron para identificar los segmentos de esa secuencia de aminoácidos que más contribuían a esta actividad. Se anticipó que la actividad bactericida en estos péptidos SC más cortos sería necesariamente inferior a la del péptido parental \betapep-25. Como se informa más abajo, éste no fue el caso y es la base de este trabajo.

Actividades Bactericidas

Se eligieron para la investigación siete cepas bacterianas, que representan bacterias Gram-negativas y positivas. Para los péptidos \betapep y dodecapéptidos derivados de los \betapep, las actividades bactericidas frente a estas cepas se ofrecen en la Tabla 1 como la concentración que es eficaz para destruir el 50% de las bacterias, esto es, la LD50. Los valores de LD50 se determinaron a partir de curvas de respuesta a dosis como las que se muestran en la Figura 2, que representa el porcentaje de bacterias destruidas frente al logaritmo de la concentración de péptido. Los puntos de datos reales se muestran con símbolos como se identifica en la leyenda, y cada curva representa el mejor ajuste usando una función sigmoide. Los valores de LD50 se leen en la curva ajustada a una mortalidad del 50%. Globalmente, el SC-4 funciona mejor destruyendo bacterias Gram-negativas de cepas tanto rugosas como lisas. Las LD50s están en el intervalo de 3 nanomolar frente a J5 a 250 nanomolar frente a J96. Frente a las cepas de S. aureus, el SC-4 (80 a 400 nanomolar) y el SC-5 (180 a 350 nanomolar) son comparables en actividad al \betapep-19 y el \betapep-25. El BG-22, un oligómero peptídico de 28 miembros que tiene la secuencia de aminoácidos del dominio de láminas \beta de la proteína bactericida y que aumenta la permeabilidad (B/PI) (restos 82-108) (Gray et al., Biochim. Biophys. Acta 1244, 185-190 (1995)), propuesto como ese sitio que propicia la actividad bactericida, es menos bactericida que el \betapep-19 o el \betapep-25, y considerablemente menos activo que el SC-4. En general, el SC-4 demuestra tener la mejor actividad bactericida de amplio espectro.

Cinética de Pérdida de Fluido

Los péptidos bactericidas se piensa que funcionan generalmente integrándose en la membrana bacteriana y creando canales de tal manera que las bacterias se vuelven "permeables" y mueren. Para evaluar si este mecanismo de acción tiene lugar con los péptidos SC, así como con los péptidos \betapep, se investigaron las cinéticas de pérdida de fluido de la membrana frente a dos cepas de E. coli (H5 y J5) y una cepa de S. aureus (MN8). En cada caso, las bacterias se vuelven "permeables" en pocos minutos tras la adición del péptido. Para cualquiera de estas cepas, los valores de t_{1/2} se estima que están en el entorno de los 10 min.

Actividad Hemolítica

Considerando el uso potencial de estos péptidos como agentes antibióticos en mamíferos, es importante conocer su potencial para lisar células eucariotas. Para esta información, se usaron glóbulos rojos como modelo para todas las células eucariotas. La lisis de glóbulos rojos (hemólisis) se comprobó a unas concentraciones de péptido de 1 x 10^{-4} M, 1 x 10^{-5} M, y 1 x 10^{-6} M. Con 10^{-6} M, el SC-1, el SC-5 y el BG-22 demostraron una hemólisis del 15% al 30% que aumentó hasta alrededor del 70% con 10^{-4} M. Todos los otros péptidos mostraron menos del 5% al 10% de efecto con 10^{-6} M. Incluso con 10^{-4} M, el \betapep-25 indujo sólo aproximadamente un 5% de hemólisis, mientras que el SC-3, el SC-4 y el SC-8 proporcionaron aproximadamente un 10% de efecto, y el SC-2, el SC-6 y el SC-7 proporcionaron aproximadamente un 15% de efecto. Para la mayoría de los péptidos SC, la concentración 10^{-4} M es considerablemente mayor que su valor de LD50 bactericida. Por ejemplo, para el SC-4, las LD50s frente a P. aeruginosa y MN8 son 50.000 veces y 500 veces, respectivamente, inferiores a esta concentra-
ción.

Neutralización de LPS

La lisis de las bacterias Gram-negativas produce la endotoxina lipopolisacárido (LPS) que desencadena el trastorno patológico conocido como sepsis. A este respecto, los péptidos que no sólo son bactericidas, sino que neutralizan eficazmente el LPS, son de una importancia considerable para combatir la endotoxemia y la sepsis. Por lo tanto, estos péptidos se probaron en el ensayo de amebocitos de Limulus con respecto a su capacidad para unir y neutralizar el LPS. Los valores de IC50 se determinaron a partir de las curvas de respuesta a dosis mostradas en la Figura 3 y se enumeran en unidades de micromolar en la columna más a la derecha de la Tabla 1. El \betapep-19, el \betapep-25 y el SC-5 son esencialmente igual de potentes (valores de IC50 de aproximadamente 2 micromolar), estando el SC-4 detrás no muy lejos. El SC-1 y el SC-6 son ligeramente menos eficaces, con IC50s de 3,5 micromolar. El SC-3 es aproximadamente 10 veces menos potente (IC50 = 25 x 10^{-6} M) que el SC-4 o el SC-5. El SC-2, el SC-7 y el SC-8 no muestran actividad de unión a LPS a o por debajo de 1 x 10^{-4} M. Esto no fue sorprendente para el SC-7 y el SC-8 que son esencialmente inactivos como bactericidas, pero el SC-2 demostró una actividad bactericida
razonable.

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TABLA 1 Serie de péptidos SC - Valores de LD50 para la actividad bactericida y valores de IC50 para la neutralización del lipopolisacárido (LPS) bacteriano. Todos los valores se dan como cantidades micromolares

	Gram-neg. rugosa	Gram-neg. lisa	Gram-positiva	Efecto sobre LPS
	[10^{-6} M]	[10^{-6} M]	[10^{-6} M]	[10^{-6} M]
	J5	P.a.	J96	H5	IA2	MN8	MNHO
\betapep-19	0,01	0,03	0,1	0,71	0,06	0,25	0,16	2
\betapep-25	0,02	0,06	0,13	0,2	0,3	0,16	0,1	1,6
BG-22	0,09	0,05	0,52	0,71	0,32	0,5	0,63	5
SC-1	0,24	0,86	0,12	0,7	0,48	0,65	0,48	3,5
SC-2	0,13	0,05	1,3	0,63	0,8	0,8	0,28	XXX
SC-3	0,01	0,01	0,63	1,3	0,8	1,2	1	25
SC-4	0,003	0,01	0,25	0,08	0,08	0,35	0,4	1,9
SC-5	0,02	0,13	0,20	0,63	0,33	0,35	0,18	1,6
SC-6	0,4	0,09	1,1	1,3	0,4	0,48	0,35	3,5
SC-7	XXX	XXX	XXX	XXX	XXX	XXX	XXX	XXX
SC-8	XXX	XXX	XXX	XXX	XXX	XXX	XXX	XXX

	Las bacterias J5, J96, H5 e IA2 son cepas de E. coli; las bacterias MN8 y MNHO son cepas de S. aureus.
	Los valores de LD50 e IC50 están en unidades de 10^{-6} M.
	Las desviaciones estándar son de aproximadamente \pm 30% de los valores dados.
	\begin{minipage}[t]{145mm} XXX significa que no es activo a concentraciones por debajo de 1 x 10^{-5} M en el ensayo bactericida y por debajo de 1 x 10^{-4} M en el ensayo de neutralización de LPS. \end{minipage}

Dicroísmo Circular

La espectroscopía de CD, usada para evaluar las poblaciones conformacionales de los péptidos SC, indica la presencia de estructura helicoidal. Esto se demuestra en la Figura 4 que muestra trazos de CD seleccionados del SC-5 y el SC-7, adquiridos a varias concentraciones de TFE. En todos los casos, los trazos de CD muestran una banda de elipticidad negativa a 222 nm que es característica de la conformación helicoidal (Greenfield et al., Biochemistry 8, 4108-4116 (1969); Johnson et al., Proteins 7, 205-214 (1990); y Waterhous et al., Biochemistry 33, 2121-2128 (1994)). A concentraciones inferiores de TFE, están presentes mayormente poblaciones de arrollamiento al azar, como queda evidenciado por el mínimo de elipticidad negativa a aproximadamente 200 nm (más que a 207/208 nm para la hélice) y una baja proporción [\Theta]_{222}/[\Theta]_{200}. A medida que se aumenta la concentración de TFE, aumenta la población de hélices, puesto que la banda de elipticidad negativa a 200 nm se desplaza más cerca de los 207 nm y la banda a 222 nm se vuelve más negativa. Con aproximadamente del 20% al 30% de TFE, estas dos características observables han alcanzado una meseta, como se indica en el recuadro insertado en la Figura 4 que representa [\Theta]_{222} frente al% (v/v) deTFE. Estas características de los espectros de CD, sin embargo, resultarían de la presencia bien de hélice \alpha o de hélice 3_{10}, o de una mezcla de ambas. La hélice 3_{10} hacia la derecha muestra una banda de CD negativa a 207 nm (\lambda_{min}) y un hombro centrado cerca de los 222 nm, siendo la proporción [\Theta]_{222}/[\Theta]_{207} aproximadamente 0,4 (Millhauser, Biochemistry 34, 3873-3877 (1995); y Toniolo et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 2744-2745 (1996)). Para una hélice \alpha, las bandas a 207 nm y 222 nm también están presentes; sin embargo, la proporción [\Theta]_{222}/[\Theta]_{207} está más cerca de la unidad. Cuando \lambda_{min} es 207 nm y la proporción [\Theta]_{222}/[\Theta]_{207} está entre 0,4 y 1,0, probablemente están presentes poblaciones interconvertibles de hélice 3_{10} y hélice \alpha.

Para los péptidos SC, la Tabla 2 enumera la longitud de onda para el mínimo n el UV lejano, \lambda_{min}, y la proporción [\Theta]_{222}/[\Theta]_{207} con TFE al 70%. En los casos en los que la proporción [\Theta]_{222}/[\Theta]_{207} está más cerca de 0,4 que de 1,0 y la \lambda_{min} es 207 nm, la conformación de ese péptido SC debería tener un carácter más de hélice 3_{10} que de hélice \alpha (Millhauser, Biochemistry 34, 3873-3877 (1995); y Toniolo et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 2744-2745 (1996)). Para el péptido más activo, SC-4, \lambda_{min} es 207 nm y [\Theta]_{222}/[\Theta]_{207} es 0,49, indicando la presencia de hélice 3_{10} mayormente. A pesar de que los péptidos SC-1,-2, -3, -5 y -6 tienen valores de \lambda_{min} de 207 nm, las mayores proporciones [\Theta]_{222}/[\Theta]_{207} de 0,6 a 0,7 indican menos carácter de hélice 3_{10}. Puesto que el SC-7 y el SC-8 muestran valores de \lambda_{min} de 203 nm y 204 nm, respectivamente, deberían estar presentes poblaciones importantes de arrollamiento al azar en sus conjuntos conformacionales.

TABLA 2 Resumen de los Datos de Dicroísmo Circular para los péptidos en presencia de trifluoroetanol al 70%

	\lambda del mínimo (nm)	proporción [\Theta]_{222}/[\Theta]_{207}
SC-1	208	0,83
SC-2	207	0,65
SC-3	207	0,59
SC-4	207	0,46
SC-5	207	0,64
SC-6	207	0,73
SC-7	202	0,5
SC-8	204	0,48
Variantes de SC-4:
SC-401	207	0,63
SC-402	204	0,52
SC-403	208	0,79
SC-404	207	0,54
SC-405	207	0,71
SC-406	208	0,67
SC-407	207	0,58
SC-408	207	0,53
SC-409	208	0,65

Análisis Conformacional por NMR

La Figura 5 muestra las regiones \alphaH-NH y NH-NH de los datos de NOESY para el SC-4 en ausencia (paneles A) y presencia (paneles B) de TFE al 30% (v/v). En cada caso, la serie de NOEs NH-NH que va desde F3 a I12 solo indica la presencia de al menos una conformación helicoidal incipiente (Dyson et al., J. Mol. Biol. 201, 201-217 (1998)). Además, incluso en ausencia de TFE, los cuatro NOEs \alphaH-NH i,i+2 son fácilmente distinguibles, apoyando la presencia de giro múltiple o hélice 3_{10} (Wüthrich et al., NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wiley-Interscience, New York (1986); y Wishart et al., Biochemistry 31, 1647-1651 (1992)). En presencia de TFE, estos NOEs permanecen y aparecen otros NOEs de más alto alcance. Por ejemplo, dos NOEs \alphaH-NH i,i+3 (8/5, 10/7), tres NH-NH i,i+2 (8/6, 9/7, 10/8) y dos NH-NH i,i+3 (10/7, 11/8) se han marcado en la Figura 5. Para una hélice 3_{10} pura, sólo deberían observarse NOEs i,i+2 e i,i+3, mientras que para una hélice \alpha pura, sólo deberían estar presentes NOEs i,i+3 e i,i+4 (Wüthrich et al., NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wiley-Interscience, New York (1986)). La presencia de NOEs \alphaH-NH i,i+2 característicos de la hélice 3_{10} es consistente con los resultados de CD como se discute anteriormente. La conformación en hélice \alpha, sin embargo, debe contribuir también al conjunto conformacional como indican los datos de CD. Puesto que todos los péptidos SC, en varias medidas, muestran tendencias de NOE y CD similares, estos péptidos existen en solución acuosa en un equilibrio principalmente entre hélice 3_{10}, hélice \alpha y arrollamiento al azar.

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Puesto que algunos péptidos SC son relativamente hidrófobos y podrían tender a auto-asociarse, afectando de este modo a la presencia y/o magnitud de los NOEs, se hicieron mediciones de difusión de NMR usando PFG (datos no mostrados). Para todos los péptidos SC, los coeficientes de difusión derivados de estos datos permanecen invariables en el intervalo de concentraciones de péptido de 0,1 mM a 15 mM, indicando la ausencia de agregación.

Para el péptido SC-4, que forma la estructura helicoidal 3_{10} más estable y es en general el más bactericida, se realizó un modelado conformacional usando los datos de NOEs adquiridos para el péptido en presencia de TFE al 30%/agua al 70%. Debe enfatizarse que la mayoría de los mismos NOEs se pudieron observar en ausencia de TFE; sin embargo, TFE al 30% al parecer estabilizaba la conformación helicoidal y aumentaba el tiempo de correlación del movimiento global, aumentando en general de ese modo la magnitud de los NOEs. Se derivaron un total de 140 restricciones de NOEs para distancias a partir del análisis de los espectros de NOESY. Éstas incluyen 68 restricciones intrarresto, 24 secuenciales, 20 de medio alcance ( |i-j| < 5), y 27 de largo alcance ( |i-j| \geq 5). Además, pudieron identificarse un total de 8 enlaces de hidrógeno de la inspección de las estructuras de SC-4 iniciales y de los NHs de larga vida de la cadena principal, dando lugar a 16 restricciones para distancias de enlaces de hidrógeno. El número total de restricciones derivadas experimentalmente fue por lo tanto 156, lo que da una media de 13 restricciones por
resto.

Inicialmente, se calcularon 100 estructuras para el SC-4 como se describe en la Sección de Métodos. Las superposiciones mejor ajustadas de los átomos C\alpha de la cadena principal para las 14 estructuras finales se muestran en la Figura 6 (izquierda). Estas estructuras muestran unas violaciones de los NOEs no mayores que 0,5 \ring{A}. Los estadísticos estructurales se resumen en la Tabla 3. El extremo N-terminal de alguna forma menos definido estructuralmente es evidente. Las estructuras satisfacen las restricciones experimentales bastante bien. Para los restos 3 a 12, las diferencias de RMS atómicas con respecto a las posiciones medias de las coordenadas son 0,71 \pm 0,08 \ring{A} para los átomos de la cadena principal (N, C^{\alpha}, C) y 1,4 \pm 0,4 \ring{A} para todos los átomos pesados. Además, los parámetros de orden angular \phi; y \psi; son todos > 0,8. Juntos, los datos anteriores indican que estas estructuras usadas para representar la conformación en solución del SC-4 convergen bien. La estructura helicoidal del SC-4 está, sin ser sorprendente, entre la de una hélice \alpha y una hélice 3_{10}, siendo el promedio de restos por giro de 3,3. Desde el extremo N-terminal hasta W9, la hélice es anfipática con K1, K4, R5 y K8 alineados en una cara como se ilustra en la Figura 6, con estos restos subrayados.

TABLA 3

Estadísticos Estructurales para las estructuras calculadas del SC-4 a partir de datos de NMR

Desviaciones RMS de las restricciones experimentales para distancias (\ring{A})ª

	NOE (140)	0,04 \pm 0,0042
	Enlace de H (16)

Desviaciones de la geometría ideal

	Enlaces (\ring{A})	0,038
	Ángulos (º)	0,65 \pm 0,03
	Ángulos Impropios (º)	0,25 \pm 0,03

Energías (kcal.mol^{-1})

	ENOE^{b}	9 \pm 1
	ECDIH	1,3 \pm 0,6
	ENCS	11,6 \pm 1
	EENLACES	3,7 \pm 0,4
	EÁNGULOS	30 \pm 5
	EÁNGULOS IMPROPIOS	16 \pm 2
	ETOTAL	72 \pm 7
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm} Ninguna de las 14 estructuras finales mostraba violaciones de las restricciones para distancias mayores que 0,5 \ring{A} o violaciones de ángulos dihedros mayores que 5^{o}. Los valores de RMSD representan la media y desviaciones estándar para las 14 estructuras.\end{minipage}
^{b} \begin{minipage}[t]{155mm} Los valores finales de los potenciales NOE (ENOE), ángulo de torsión (ECDIH) y NCS (ENCS) se han calculado con constantes de fuerza de 50 kcal.mol^{-1}.\ring{A}^{-2}, 200 kcal.mol^{-1}.rad^{-2}, y 300 kcal.mol^{-1}.\ring{A}^{-2}, respectivamente.\end{minipage}

Efectos de Modificar la Secuencia del SC-4

Puesto que el SC-3 y el SC-4 fueron los más bactericidas, menos hemolíticos y el SC-4 fue uno de los mejores en la neutralización de la endotoxina, se prepararon "recorredores" dodecapeptídicos adicionales para completar los desplazamientos de restos individuales entre el SC-3 y el SC-4:

\vskip1.000000\baselineskip

SC-401	Q M K L F K R H L K W K-_{NH2}
SC-402	M K L F K R H L K W K I-_{NH2}

\vskip1.000000\baselineskip

Además, se investigó una variante más larga que aumenta el SC-4 en un resto por cada lado de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

SC-403

M K L F K R H L K W K I I V-_{NH2}

\vskip1.000000\baselineskip

Puesto que se sabe que la presencia de restos cargados positivamente es crucial para las actividades bactericida y de neutralización del LPS, se investigó una serie de variantes del SC-4 con sustituciones lisina/arginina:

\vskip1.000000\baselineskip

SC-404	X L F K R H L K W K I I-_{NH2}
SC-405	K L F X R H L K W K I I-_{NH2}
SC-406	K L F K R H L X W K I I-_{NH2}
SC-407	K L F K R H L K W X I I-_{NH2}
SC-408	K L F K K H L K W K I I-_{NH2}
SC-409	K L F K X H L K W K I I-_{NH2}

\vskip1.000000\baselineskip

Del SC-404 al SC-407 se cambian cada una de las cuatro lisinas por norleucinas (lisina sin el grupo amino de la cadena lateral). En las variantes SC-408 y SC-409 se cambia la arginina, R5, por lisina y norleucina, respectiva-
mente.

Los datos de CD indican que estas variantes se pliegan también helicoidalmente, fluctuando entre la estructura de hélice 3_{10} y \alpha como los péptidos parentales SC-3 y SC-4 (datos no mostrados). La Tabla 2 enumera los valores de \lambda_{min} y la proporción [\Theta]_{222}/[\Theta]_{207} con TFE al 70%. Mientras que ambos SC-401 y SC-403 muestran valores de \lambda_{min} de aproximadamente 207 nm, sus proporciones [\Theta]_{222}/[\Theta]_{207} son mayores que las del SC-3 o el SC-4, indicando que estas dos variantes del SC-4 tienen un carácter más de hélice \alpha y menos de hélice 3_{10} que el péptido parental SC-4. El SC-402, sin embargo, tiene una mayor población de arrollamiento al azar en su conjunto conformacional, puesto que su valor de \lambda_{min} es 204 nm. Las variantes de lisina/arginina, SC-404 a SC-409, se comportan conformacionalmente como el SC-4 parental, con un carácter de hélice 3_{10} considerable. Los datos de NMR, adquiridos en presencia de TFE al 30% (datos no mostrados), apoyan la presencia de poblaciones significativas de conformación helicoidal como se observa para el SC-3 y el SC-4.

Las actividades bactericidas de estos péptidos se adquirieron frente a tres de las cepas usadas anteriormente, E. coli J5, P. aeruginosa y S. aureus MNHO. Los resultados se ofrecen en la Tabla 4. Frente a J5, el SC-401 y el SC-402 son más activos que el SC-3 y ligeramente menos activos que el SC-4. El desplazamiento de la unidad dodecapeptídica desde el SC-3 hacia el SC-4, por lo tanto, aumenta la actividad. Por otro lado, la adición de restos hidrófobos a ambas posiciones terminales en el SC-4, esto es, el SC-403, aumenta ligeramente la actividad. Usando P. aeruginosa, las curvas de respuesta a dosis bactericida indican que cualquiera de los dos dodecapéptidos, SC-401 o SC-402, disminuye la actividad. Esto es de alguna manera sorprendente, ya que ambos SC-3 y SC-4 tienen la misma actividad frente a P. aeruginosa (véase la Tabla 1). Esto puede tener algo que ver con la forma en que estos péptidos interactúan con la pared/membrana celular bacteriana. Frente a la cepa de S. aureus MNHO, el desplazamiento de la ventana dodecapeptídica desde el SC-3 hacia el SC-4 en un sólo resto, esto es, el SC-401, esencialmente suprime la actividad. El desplazamiento de otro resto (SC-402) devuelve algo de actividad, y el alargamiento de ambos extremos del SC-4 no tiene efecto.

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TABLA 4 Variantes del péptido SC-4 SC-401 a SC-409 - Valores de LD50 para la actividad bactericida y valores de IC50 para la neutralización del lipopolisacárido (LPS) bacteriano. Todos los valores se dan como cantidades micromolares

	Gram-neg. rugosa	Gram-neg. lisa	Gram-positiva )	Neutralización de
	(10^{-6} M)	(10^{-6} M)	(10^{-6} M	LPS (10^{-6} M)
	J5	P.a.	MNHO
SC-3 (parental)	0,01	0,01	1	25
SC-4 (parental)	0,003*	0,01	0,4	2
SC-401	0,004	0,06	XXX	126
SC-402	0,005	0,07	6	25
SC-403	0,002	0,05	0,4	6
Variantes de lisina/arginina:
SC-404 (K1X)	0,004	0,22	1	7
SC-405 (K4X)	0,006	0,17	0,4	7
SC-406 (K8X)	0,005	0,05	2	3
SC-407 (K10X)	0,007	0,05	1	3
SC-408 (R5K)	0,003	0,07	2	1000
SC-409 (R5X)	0,001	0,22	0,3	3
* Los valores de LD50 e IC50 están en unidades de 10^{-6} M.
\; Las desviaciones estándar son aproximadamente \pm 30% de los valores dados.
\; XXX significa inactivo a concentraciones por debajo de 1 x 10^{-5} M.

Con la variantes de lisina, la sustitución de K1 o K4 por norleucina reduce la actividad bactericida frente a J5 sólo ligeramente, mientras que la sustitución de K8 y K10 por norleucina muestra una caída de alguna manera más significativa en la actividad. Esto es especialmente verdad para el SC-407 (K10X). No obstante, las actividades bactericidas se mantienen considerables, indicando que la eliminación de una única carga positiva sola no suprime la actividad. La sustitución de R5 por lisina, sin embargo, no muestra ningún cambio en la actividad, mientras que la sustitución de R5 por norleucina causa un aumento significativo de la actividad. La estructura en solución por NMR del SC-4 muestra que K1, K4, R5 y K8 se encuentran en una cara de una hélice anfipática con K10 más hacia el lado (Figura 5). Esta conformación del péptido encierra como un sándwich a K4 y R5 entre K1 y K8. La eliminación del grupo cargado en la posición 5 puede ayudar a reducir la repulsión carga-carga y a estabilizar, a través de interacciones hidrófobas, el resto del núcleo de lisinas.

Una vez más, cualquier cambio en la secuencia de aminoácidos del SC-4 reduce los efectos bactericidas frente a P. aeruginosa (Tabla 4). En la serie lisina/arginina, la sustitución de K1, K4 y R5 por norleucina tiene los efectos más perjudiciales. Frente a la cepa de S. aureus MNHO, la sustitución de cualquiera de estos restos cargados es más tolerada (Tabla 4).

Estos datos indican también que aunque el mecanismo de acción de estos péptidos frente a varias cepas bacterianas puede ser similar, hay diferencias discretas y significativas relacionadas con la orientación espacial de los grupos cargados e hidrófobos de los péptidos. Además, aunque los datos de CD y NMR indican una conformación helicoidal de estos péptidos, la interacción con la pared/membrana celular bacteriana puede ciertamente modificar esta conformación, haciendo imposible la derivación de relaciones estructura-actividad precisas.

Se investigó también la capacidad de estas variantes del SC-4 para neutralizar el LPS. Las curvas de respuesta a dosis se muestran en la Figura 3 y los valores de IC50 se enumeran en la Tabla 4. Como se muestra anteriormente, el SC-401 y el SC-402 son dodecapéptidos que desplazan un resto cada uno del SC-3 hacia el SC-4, respectivamente. El SC-4 tiene un IC50 de 2 x 10^{-6} M, mientras que el SC-3 tiene un IC50 más de diez veces mayor (25 x 10^{-6} M). Con el desplazamiento de un único resto desde el SC-3 al SC-4, la actividad del SC-401 (valor de IC50 de 126 x 10^{-6} M) ha caído 5 veces con relación a la del SC-3. El desplazamiento de un resto más para dar el SC-402 devuelve la actividad de neutralización del LPS al nivel observado para el SC-3 (IC50 de 25 x 10^{-6} M). La comparación de estas secuencias indica que es por lo visto crucial tener al menos un resto hidrófobo en la posición C-terminal. El SC-3 tiene Trp y el SC-402 tiene Ile. El SC-401 menos activo termina en un resto de Lys. El péptido más activo SC-4 tiene el dipéptido hidrófobo Ile-Ile en su extremo C-terminal. La importancia funcional exacta no está clara puesto que el equipotente SC-5 tiene sólo un resto hidrófobo, Leu, en su extremo C-terminal, mientras que el SC-1 tiene Phe, el SC-2 tiene His, el SC-6 tiene Gly, y el inactivo SC-7 también tiene una Leu.

En las variantes que cambian lisina por norleucina, la sustitución de los dos primeros restos de Lys (K1X y K4X) reduce la actividad en sólo 3 veces aproximadamente. La sustitución de los dos últimos restos de Lys (K8X y K10X) esencialmente no tiene efecto sobre la capacidad del péptido para neutralizar el LPS. A este respecto, ninguna de estas lisinas es crucial para esta actividad. Un descubrimiento sorprendente, sin embargo, se observó con el SC-408 y el SC-409. El SC-408 es la variante R5K. Aquí, la actividad cae espectacularmente en aproximadamente 500 veces. Por sí solo, esto sugeriría que el resto de Arg es crucial para la actividad y la conservación de la carga es insuficiente para mantener la actividad. Esta conclusión, sin embargo, es cuestionada por los resultados del SC-409 que tiene la Arg reemplazada por norleucina, eliminando completamente la carga positiva, pero manteniendo el carácter hidrófobo de los metilenos de la cadena lateral. En el SC-409, se ha conservado prácticamente toda la actividad con relación a la del SC-4. Por lo tanto, un grupo amina pequeño cargado positivamente en esa posición es perjudicial para la actividad, pero la carga por sí misma no juega un papel evidente en la actividad.

Discusión

Frente a las bacterias investigadas en este estudio, el SC-4, con valores de LD50 que quedan en el intervalo de nanomolar con un único dígito a 100 nanomolar, es, globalmente, el más eficaz antibacteriano de cualquiera de estos péptidos. Aparte del SC-7 y el SC-8 que son inactivos a concentraciones por debajo de 10 micromolar, los otros péptidos SC, particularmente SC-3 y SC-5, son asimismo razonablemente bactericidas. En realidad, frente a las cepas de S. aureus MN8 y MNHO, las actividades de los péptidos SC-1 a SC-6 están dentro de aproximadamente un factor de dos unas de las otras, pero frente a la cepa de E. coli IA2, el SC-4 destaca otra vez, siendo aproximadamente de 4 a 10 veces más activo que cualquier otro péptido SC. La observación de que los péptidos bactericidas como el SC-4 son más eficaces frente a cepas Gram-negativas en contraposición a las Gram-positivas, se observa generalmente con otros péptidos bactericidas conocidos. Las diferencias en las actividades bactericidas frente a varias cepas se deben, lo más probablemente, a la variabilidad en los componentes de las membranas bacterianas y en cómo estos péptidos interactúan con esas membranas. Por ejemplo, la superficie de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas incluye lipopolisacáridos, mientras que en las bacterias Gram-positivas no hay membrana externa y la pared celular incluye polisacáridos ácidos, ácidos teicoicos. El SC-4 debe acaparar las características de composición y estructurales apropiadas necesarias para las interacciones con estas superficies celulares mayormente cargadas negativamente para mostrar tal actividad bactericida de amplio espectro.

Con relación a las membranas bacterianas, las membranas celulares de mamíferos normales que están compuestas predominantemente de fosfatidilcolina zwitteriónica y fosfolípidos de esfingomielina, tienen más carácter de carga positiva. Dada la importante caída en la carga neta negativa de las superficies de las membranas celulares eucariotas, los péptidos bactericidas generalmente interactúan menos con las células de mamíferos. No obstante, los péptidos bactericidas pueden lisar células de mamíferos a concentraciones cercanas a sus concentraciones de LD50 bactericidas (Maloy et al., Biopolymers 37, 105-112 (1995)). A este respecto, debe comprobarse que estos umbrales de concentración no estén cerca unos de otros, para tener el agente bactericida terapéutico más eficaz y menos citotóxico. Usualmente se eligen los glóbulos rojos como modelos de células eucariotas y la hemólisis se usa a menudo como un índice de la actividad citolítica de un péptido frente a células de mamífero. Para la mayoría de los péptidos SC, una hemólisis importante tiene lugar sólo a concentraciones por encima de 1 x 10^{-4} M, mientras que los valores de LD50 están todos en los intervalos submicromolar a nanomolar. Esta baja citotoxicidad frente a las células de mamíferos es una ventaja añadida para usar los péptidos SC como antibióticos.

Los péptidos antibacterianos se han clasificado de varias maneras. Una clasificación se basa en criterios químico-estructurales y se divide en dos amplios grupos: péptidos lineales y péptidos cíclicos. Dentro del grupo lineal, pueden distinguirse dos subgrupos: (1) péptidos lineales que tienden a adoptar una estructura helicoidal y (2) péptidos lineales de composición inusual, ricos en aminoácidos tales como Pro, Arg o incluso Trp. Dada la observación de que los péptidos SC son helicoidales, se clasifican en el primer subgrupo. Andreu & Rivas (Andreu et al., Biopolymers (Pep. Sci.) 47, 415-433 (1998)) han tabulado una lista de otros péptidos antibacterianos lineales con conformación helicoidal (véase la Tabla I en Andreu et al., Biopolymers (Pep. Sci.) 47, 415-433 (1998)) e incluyen: andropina, BLP-1, bombinina, bombolitina, las cecropinas, ceratotoxina, clavanina, CRAMP, dermaseptina, enbocina, FALL-39, licotoxina I, magainina, melitina, misgurina, PGLa, pleurocidina, seminalplasmina, y estielina. Las conformaciones de los péptidos dentro de este grupo se señala más frecuentemente que son \alpha-helicoidales, que es un tipo específico de hélice que tiene 13 átomos o 3,6 restos por giro helicoidal. Sin embargo, se ha observado que muchos péptidos lineales cortos forman una mezcla de hélice \alpha y hélice 3_{10} en solución acuosa (Toniolo et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 2744-2745 (1996); y Millhauser et al., Biochemistry 34, 3873- 3877 (1995)). Revisando los datos estructurales (mediciones de CD en su mayoría) de otros péptidos antibacterianos que forman hélices conocidos enumerados anteriormente, resulta evidente que algunos de estos péptidos tienen también un carácter de hélice 3_{10}. A este respecto, el término "\alpha-helicoidal" tal como se usa actualmente en la bibliografía puede referirse realmente a ambos tipos de hélice, esto es, la hélice 3_{10} no debería excluirse.

Ambos análisis conformacionales por CD y por NMR de los péptidos SC, especialmente del SC-4, demuestran que existen en solución acuosa como una mezcla de hélice \alpha, hélice 3_{10}, y arrollamiento al azar. El grado de formación de una hélice específica depende de la secuencia en particular y de la presencia o ausencia de TFE. Con los péptidos SC, el TFE por lo que se ve no induce las conformaciones que, hasta cierto punto, están ya presentes en agua. Los perfiles de NOE, por ejemplo, son esencialmente los mismos en agua y en TFE. Sin embargo, en TFE, los NOEs son generalmente mayores, indicando que el TFE actúa para estabilizar las conformaciones existentes. Además, el TFE proporciona también un entorno de dielectricidad inferior, que, en algunos casos, puede mimetizar la baja dielectricidad dentro de la membrana. En términos del plegamiento peptídico, la presencia de uno u otro tipo de hélice es intersante porque los péptidos SC se derivaron del \betapep-25, que forma una estructura de lámina \beta en solución acuosa (Mayo et al., Protein Sci. 5, 1301-1315 (1996)). Resulta, por lo tanto, que cuando se eliminan del contexto del oligómero \betapep de 33 miembros entero, los péptidos SC son libres para formar una estructura helicoidal. Se ha observado también que la actividad bactericida en los péptidos \betapep está correlacionada negativamente con la estabilidad de la lámina \beta (Mayo et al., Biochim. Biophys. Acta 1425, 81-92 (1998)), esto es, una lámina \beta más estable conduce a una disminución de la actividad bactericida. En la membrana bacteriana, ésta puede hacer reajustes conformacionales para algunos péptidos \betapep, más fáciles, propiciando de ese modo una mayor actividad bactericida.

Basándose en los datos de NOE, el modelado estructural muestra que el SC-4 tiene una conformación de hélice anfipática. Durante algún tiempo, la estructura helicoidal anfipática se ha señalado como importante para la actividad bactericida. Aunque el mecanismo de acción de los péptidos bactericidas no está claro en su mayor parte, se ha demostrado que el péptido-lípido, más que los procedimientos de reconocimiento mediados por receptor, juega el papel más importante en su función (Oren et al., Biopolymers (Pep. Sci.) 47, 451-463 (1998)). Al menos un péptido antibacteriano: KLKLLLLLKLK-_{NH2} (SEC ID No. 20), eficaz sólo a una concentración mucho mayor (1 x 10^{-4} M) que el SC-4, se ha demostrado que funciona formando canales en las membranas bacterianas, aumentando de ese modo la permeabilidad de la membrana e interfiriendo con su función, dando como resultado en último término la muerte celular (Álvarez-Bravo et al., J. Biochem. 117, 1312-1316 (1995)). Los péptidos SC funcionan probablemente de manera similar, puesto que la cinética de pérdida de fluido tiene lugar en la misma escala de tiempo con un tiempo de semidestrucción de aproximadamente 10 min. Se han propuesto dos mecanismos de acción para explicar la permeabilización por péptidos helicoidales anfipáticos: (1) formación de un poro transmembrana a través de un mecanismo de "barril-duela" (Ehrenstain et al., Quart. Rev. Biophys. 10, 1-34 (1977)) ó (2) destrucción/solubilización de la membrana a través de un mecanismo "tipo alfombra" (Gazit et al., Biochemistry 34, 11479-11488 (1995); y Pouny et al., Biochemistry 31, 12416-12423 (1992)). En el mecanismo "tipo alfombra" generalmente favorecido, los péptidos helicoidales anfipáticos interaccionan con la superficie de la membrana celular de tal forma que sus superficies hidrófobas quedan enfrentadas con la membrana y sus superficies hidrófilas quedan enfrentadas con el disolvente. Cuando se alcanza una concentración umbral de péptido, la membrana se rompe y se forma un poro transitorio. A partir de los presentes datos, es imposible concluir definitivamente que los péptidos SC interactúan con las membranas celulares sólo cuando están en una conformación helicoidal. No obstante, cuando estos péptidos tienen una conformación de hélices anfipáticas, su mecanismo de acción puede explicarse más fácilmente.

La superficie de la membrana de ambas bacterias Gram-positivas y negativas tiene una carga neta negativa, que la convierte en un entorno favorable para la interacción con péptidos policatiónicos como el SC-4. En realidad, Gray et al. (Gray et al., Biochim. Biophys.Acta 1244, 185-190 (1995)) demostraron que mucha de la actividad bactericida de la proteína B/PI (proteína bactericida y que aumenta la permeabilidad) puede estar causada por la secuencia tripeptídica cargada positivamente KWK. Los péptidos SC, así como el péptido antibacteriano cecropina (Hanzawa et al., FEBs Lett. 269, 413-420 (1990)), contienen también el motivo tripeptídico KWK. Con relación al SC-4, sin embargo, sus actividades bactericidas frente a P. aeruginosa son mucho más inferiores con concentraciones letales, por ejemplo, de 6 micromolar para la cecropina P1 (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9159-9162 (1989)), comparada con 10 nanomolar para el SC-4. Es importante enfatizar que una elevada carga neta positiva sola no garantiza una actividad bactericida óptima. Por ejemplo, el SC-4 y el SC-5 tienen ambos una carga neta de +6, aunque el SC-4 es el más potente de los dos frente a bacterias Gram-negativas. Además, mientras que el SC-6 y el SC-1 tienen cargas netas únicamente de +3, el SC-6 muestra aproximadamente la misma actividad bactericida general que el SC-5, y el SC-1 es al menos tan activo como el SC-4 frente a la cepa de E. coli J96. La presencia de restos hidrófobos modula también la actividad bactericida; sin embargo la hidrofobicidad sola tampoco puede ser la causa de estas diferencias de actividad, puesto que el contenido de restos hidrófobos en cada péptido SC es aproximadamente del 50% al 60%. Otro péptido bactericida mayormente cargado positivamente e hidrófobo, derivado de la hélice \alpha anfipática C-terminal del factor plaquetario-4 (Darveau et al., J. Clin. Invest. 90, 447-454 (1992)), por ejemplo, tiene cuatro restos de lisina ordenadas en tándem en una cara de su hélice; sin embargo su actividad es aproximadamente 100 veces inferior a la del SC-4.

Claramente, tanto la composición como la secuencia contribuyen a la función. La secuencia de aminoácidos, a su vez, determina la conformación que en último término es la clave para entender los efectos bactericidas de los péptidos SC y de otros péptidos bactericidas en general. En el caso del SC-4, K1, K4, R5 y K8 están alineados en la misma cara de la molécula helicoidal (véase la Figura 6). Puesto que los datos de CD y NMR indican que los otros péptidos SC tienen también propensión a formar una estructura helicoidal en solución acuosa y que pueden asimismo propiciar su actividad antibacteriana cuado están en una conformación helicoidal, la Figura 7 muestra las proyecciones de ruedas helicoidales para el SC-1 al SC-8. Obsérvese que los péptidos SC más activos, SC-3 y SC-4, tienen cuatro restos cargados positivamente alineados en tándem en una cara de la hélice. Además, en ambos casos, un resto de lisina se encuentra encima de una ordenación en forma de diamante con un par R-K en el medio y otra K en la parte de abajo de esta ordenación. Para el SC-4, la ordenación en forma de diamante es K1, R5-K4, K8, y para el SC-3, la ordenación es K4, R8-K7, K11. En el SC-4, esta ordenación comienza en el primer giro de la hélice desde el extremo N-terminal, mientras que en el SC-3 comienza desde el segundo giro de la hélice. Ésta puede ser la razón por la que el SC-4 es globalmente más activo que el SC-3. En el siguiente péptido más activo, SC-5, los restos K1-R2 y K5 en la superficie de la hélice forman una forma triangular que es parte de una forma de diamante. En los péptidos menos activos SC-1, -2 y -6, los restos cargados positivamente están situados a lo largo de la hélice, y en los péptidos menos activos, o inactivos, SC-7 y -8, los restos de lisina son pocos e intercalados con restos cargados negativamente. Esta ordenación en forma de diamante no debe hacer demasiado en términos de potencia antibacteriana de los péptidos SC, puesto que la eliminación de cualquiera de esos restos cargados positivamente del SC-4 no reduce su actividad en gran medida alguna. No obstante, al menos parte de esta distribución de carga puede requerirse para una actividad óptima.

La desintegración de la membrana externa celular de bacterias Gram-negativas libera la endotoxina lipopolisacárido (LPS), que en los glóbulos blancos de mamíferos desencadena la sobre-liberación de varias citoquinas como el TNF-\alpha y la interleuquina-1. Esto a su vez puede conducir al trastorno patológico de la sepsis y posiblemente la muerte eventual. El SC-4 es uno de tales péptidos bactericidas que tiene la ventaja añadida de ser capaz de neutralizar el LPS. Aunque la actividad de unión del LPS (IC50) del SC-4 (2 x 10^{-6} M) no es tan alta como la de la proteína de 55 kD B/PI (2 x 10^{-8} M) (Marion et al., FEBs Lett. 227, 21-26 (1988)), el SC-4 es, después de todo, sólo un dodecapéptido. Con respecto al mecanismo, la neutralización del LPS se piensa que está mediada principalmente por interacciones entre la proteína/péptido y la porción del lípido A de cualquier LPS dado. La naturaleza del LPS varía de cepa a cepa bacteriana; sin embargo, todas las moléculas de LPS contienen una unidad lipídica A en un núcleo conservado que está compuesta por un desglicosaminoglicano desfosforilado con varios oligosacáridos polifosforilados unidos y varias cadenas acilo. La neutralización del LPS se ha propuesto que tiene lugar a través de la unión de la proteína/péptido al lípido A, a través de interacciones de aminoácidos catiónicos con los fosfatos aniónicos y a través de interacciones hidrófobas con las cadenas acilo. En la serie SC, la dosis de carga positiva juega un papel en la neutralización del LPS. El SC-4 y el SC-5, que tienen la mayor carga neta positiva de +6, también son los mejores neutralizando el LPS. Sin embargo, como con la actividad bactericida, una carga neta positiva alta sola no puede ser la causa de la neutralización de LPS. Considérense por ejemplo el SC-2 y el SC-3, que tienen ambos una carga neta de +5; sin embargo el SC-3 es considerablemente más activo que el SC-2. Además, en la serie de péptidos con sustituciones de Arg/Lys por norleucina (Tabla 4), la eliminación de cualquier resto cargado positivamente hace caer la actividad de unión del LPS sólo ligeramente, indicando probablemente que el campo de carga positiva por sí mismo, más que cualquier resto cargado individual, media la actividad. Por otro lado, los restos hidrófobos en el extremo C-terminal han resultado ser más cruciales para le unión del LPS. La eliminación de las dos isoleucinas del extremo C-terminal del SC-4 (péptido SC-401), hace caer la actividad en 60 veces, mientras que la eliminación de sólo una de estas isoleucinas (péptido SC-402) hace caer la actividad en sólo 12 veces. Un descubrimiento curioso es que aunque la eliminación de R5 (SC-408) no afecta a la unión del LPS, el reemplazamiento de R5 con lisina reduce la unión del LPS en unas 500 veces.

Conclusión

La identificación de un dodecapéptido con una potente actividad bactericida frente a bacterias tanto Gram-positivas como negativas puede conducir al desarrollo de un agente antibiótico y neutralizante de endotoxinas bacterianas terapéutico altamente eficaz. La producción y purificación de proteínas o péptidos bactericidas con secuencias más largas presenta problemas que pueden evitarse en parte mediante la identificación de un péptido pequeño como el SC-4. Dado que continuamente surgen nuevas cepas de bacterias resistentes a antibióticos, tales agentes bactericidas novedosos serán particularmente útiles.

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TABLA 5

1

2

3

4

5

6

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TABLA 6

7

8

9

10

Texto libre de secuencias

Los siguientes son polipéptidos sintéticos:

ANIKLSVQMKLF (SEC ID No. 1)

KLSVQMKLFKRH (SEC ID No. 2)

VQMKLFKRHLKW (SEC ID No. 3)

KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4)

KRHLKWKIIVKL (SEC ID No. 5)

LKWKIIVKLNDG (SEC ID No. 6)

KIIVKLNDGREL (SEQ ID No: 7)

VKLNDGRELSLD (SEQ ID No: 8)

QMKLFKRHLKWK (SEC ID No. 9)

MKLFKRHLKWKI (SEC ID No. 10)

MKLFKRHLKWKIIV (SEC ID. No. 11)

XLFKRHLKWKII (SEC ID No. 12)

KLFXRHLKWKII (SEC ID No. 13)

KLFKRHLXWKII (SEC ID No. 14)

KLFKRHLKWXII (SEC ID No. 15)

KLFKKHLKWKII (SEC ID No. 16)

KLFKHLKWKII (SEC ID No. 17)

<110> Miembros del Consejo Rector de la Universidad de Minnesota

\hskip10mm Mayo, Kevin H.

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<120> POLIPÉPTIDOS CON ACTIVIDAD TERAPÉUTICA Y MÉTODOS DE USO

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<130> 110.01120201

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<140> PCT/US01/01916

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<141> 2001-01-19

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/177,255

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<151> 2000-01-20

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<150> 60/210,297

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<151> 2000-06-08

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<160> 20

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<170> PatentIn Ve. 2.1

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<210> 1

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 1

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\sa{Ala Asn Ile Lys leu Ser Val Gln Met Lys Leu Phe}

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<210> 2

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 2

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\sa{Lys Leu Ser Val Gln Met Lys Leu Phe Lys Arg His}

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<210> 3

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 3

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\sa{Val Gln Met Lys Leu Phe Lys Arg His Leu Lys Trp}

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<210> 4

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 4

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\sa{Lys Leu Phe Lys Arg His Leu Lys Trp Lys Ile Ile}

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<210> 5

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 5

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\sa{Lys Arg His Leu Lys Trp Lys Ile Ile Val Lys Leu}

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<210> 6

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 6

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\sa{Leu Lys Trp Lys Ile Ile Val Lys Leu Asn Asp Gly}

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<210> 7

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 7

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\sa{Lys Ile Ile Val Lys Leu Asn Asp Gly Arg Glu Leu}

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 8

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\sa{Val Lys Leu Asn Asp Gly Arg Glu Leu Ser Leu Asp}

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<210> 9

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 9

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\sa{Gln Met Lys Leu Phe Lys Arg His Leu Lys Trp Lys}

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<210> 10

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 10

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\sa{Met Lys Leu Phe Lys Arg His Leu Lys Trp Lys Ile}

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 11

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\sa{Met Lys Leu Phe Lys Arg His Leu Lys Trp Lys Ile Ile Val}

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<210> 12

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (1)

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<223> Aminoácido, natural o sintético; preferiblemente Nle

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<400> 12

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\sa{Xaa Leu Phe Lys Arg His Leu Lys Trp Lys Ile Ile}

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<210> 13

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (4)

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<223> Aminoácido, natural o sintético; preferiblemente Nle

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<400> 13

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\sa{Lys Leu Phe Xaa Arg His Leu Lys Trp Lys Ile Ile}

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<210> 14

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (8)

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<223> Aminoácido, natural o sintético; preferiblemente Nle

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<400> 14

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\sa{Lys Leu Phe Lys Arg His Leu Xaa Trp Lys Ile Ile}

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<210> 15

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (10)

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<223> Aminoácido, natural o sintético; preferiblemente Nle

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<400> 15

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\sa{Lys Leu Phe Lys Arg His Leu Lys Trp Xaa Ile Ile}

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<210> 16

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 16

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\sa{Lys Leu Phe Lys Lys His Leu Lys Trp Lys Ile Ile}

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<210> 17

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 17

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\sa{Lys Leu Phe Lys His Leu Lys Trp Lys Ile Ile}

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<210> 18

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<211> 33

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 18

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\sa{Ser Ile Gln Lys Leu Asn Val Ser Met Lys Leu Phe Arg Lys Gln Ala}

\sac{Lys Trp Lys Ile Ile Val Lys Leu Asn Asp Gly Arg Glu Leu Ser Leu}

\sac{Asp}

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<210> 19

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<211> 33

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 19

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\sa{Ala Asn Ile Lys Leu Ser Val Gln Met Lys Leu Phe Lys Arg His Leu}

\sac{Lys Trp Lys Ile Ile Val Lys Leu Asn Asp Gly Arg Glu Leu Ser leu}

\sac{Asp}

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<210> 20

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 20

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\sa{Lys Leu Lys Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Lys}

Claims (29)

1. Un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en aquellos representados por las SEC ID Nos. 1-6 y análogos de los mismos que son activos para el tratamiento de la infección bacteriana, el tratamiento de la endotoxemia, disminuir la cantidad de TNF-\alpha, inhibir la proliferación de células endoteliales, inhibir la regulación posterior de la expresión de la molécula de adhesión intercelular mediada por el factor angiogénico, inhibir la angiogénesis y/o inhibir la tumorigénesis, en los que un análogo de los mismos se define como que contiene una supresión de un aminoácido, adiciones de uno o dos aminoácidos, sustituciones conservativas de aminoácidos o modificaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de las cadenas laterales, modificaciones de la cadena principal y modificaciones N- y C-terminales.

2. Un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en aquellos representados por las SEC ID Nos. 9-17 en los que X es un aminoácido, y análogos de los mismos que son activos para el tratamiento de la infección bacteriana, el tratamiento de la endotoxemia, disminuir la cantidad de TNF-\alpha, inhibir la proliferación de células endoteliales, inhibir la regulación posterior de la expresión de la molécula de adhesión intercelular mediada por el factor angiogénico, inhibir la angiogénesis y/o inhibir la tumorigénesis, en los que un análogo de los mismos se define como que contiene una supresión de un aminoácido, adiciones de uno o dos aminoácidos, sustituciones conservativas de aminoácidos o modificaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de las cadenas laterales, modificaciones de la cadena principal y modificaciones N- y C-terminales.

3. El polipéptido de la reivindicación 2 en el que X es norleucina.

4. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. El uso de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en aquellos representados por las SEC ID Nos. 1-6 y 9-17 en los que X es un aminoácido; análogos activos de los mismos; y combinaciones de los mismos; para la preparación de una composición farmacéutica para tratar la infección bacteriana y/o endotoxemia, en los que un análogo de los mismos se define como que contiene una supresión de un aminoácido, adiciones de uno o dos aminoácidos, sustituciones conservativas de aminoácidos o modificaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de las cadenas laterales, modificaciones de la cadena principal y modificaciones N- y C-terminales.

6. El uso de la reivindicación 5 en el que el polipéptido neutraliza la endotoxina.

7. El uso de la reivindicación 5 en el que el polipéptido es bactericida.

8. El uso de la reivindicación 5 en el que el polipéptido es bactericida, así como capaz de neutralizar la endotoxi-
na.

9. Un método para inhibir la infección bacteriana y/o endotoxemia in vitro, comprendiendo el método poner en contacto las células con una cantidad de una composición eficaz para inhibir la infección bacteriana y/o neutralizar la endotoxina, en el que la composición comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en aquellos representados por las SEC ID Nos. 1-6 y 9-17 en los que X es un aminoácido; análogos activos de los mismos; y combinaciones de los mismos; en los que un análogo de los mismos se define como que contiene una supresión de un aminoácido, adiciones de uno o dos aminoácidos, sustituciones conservativas de aminoácidos o modificaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de las cadenas laterales, modificaciones de la cadena principal y modificaciones N- y C-terminales.

10. El uso de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en aquellos representados por las SEC ID Nos. 1-6 y 9-17 en los que X es un aminoácido; análogos activos de los mismos; y combinaciones de los mismos; para la preparación de una composición farmacéutica para disminuir la cantidad de TNF-\alpha en un paciente, en los que un análogo de los mismos se define como que contiene una supresión de un aminoácido, adiciones de uno o dos aminoácidos, sustituciones conservativas de aminoácidos o modificaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de las cadenas laterales, modificaciones de la cadena principal y modificaciones N- y C-terminales.

11. Un método para disminuir la cantidad de TNF-\alpha in vitro, comprendiendo el método incubar las células con una cantidad eficaz de una composición que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en aquellos representados por las SEC ID Nos. 1-6 y 9-17 en los que X es un aminoácido; análogos activos de los mismos; y combinaciones de los mismos; en los que un análogo de los mismos se define como que contiene una supresión de un aminoácido, adiciones de uno o dos aminoácidos, sustituciones conservativas de aminoácidos o modificaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de las cadenas laterales, modificaciones de la cadena principal y modificaciones N- y C-terminales.

12. El uso de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en aquellos representados por las SEC ID Nos. 1-6 y 9-17 en los que X es un aminoácido; análogos activos de los mismos; y combinaciones de los mismos; para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la proliferación de células endoteliales en un paciente, en los que un análogo de los mismos se define como que contiene una supresión de un aminoácido, adiciones de uno o dos aminoácidos, sustituciones conservativas de aminoácidos o modificaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de las cadenas laterales, modificaciones de la cadena principal y modificaciones N- y C-terminales.

13. Un método para inhibir la proliferación de células endoteliales in vitro, comprendiendo el método poner en contacto las células con una cantidad eficaz de una composición que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en aquellos representados por las SEC ID Nos. 1-6 y 9-17 en los que X es un aminoácido; análogos activos de los mismos; y combinaciones de los mismos; en los que un análogo de los mismos se define como que contiene una supresión de un aminoácido, adiciones de uno o dos aminoácidos, sustituciones conservativas de aminoácidos o modificaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de las cadenas laterales, modificaciones de la cadena principal y modificaciones N- y C-terminales.

14. El uso de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en aquellos representados por las SEC ID Nos. 1-6 y 9-17 en los que X es un aminoácido; análogos activos de los mismos; y combinaciones de los mismos; para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la regulación posterior de la expresión de la molécula de adhesión intercelular mediada por el factor angiogénico en un paciente, en los que un análogo de los mismos se define como que contiene una supresión de un aminoácido, adiciones de uno o dos aminoácidos, sustituciones conservativas de aminoácidos o modificaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de las cadenas laterales, modificaciones de la cadena principal y modificaciones N- y
C-terminales.

15. Un método para inhibir la regulación posterior de la expresión de la molécula de adhesión intercelular mediada por el factor angiogénico in vitro, comprendiendo el método poner en contacto las células con una cantidad eficaz de una composición que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en aquellos representados por las SEC ID Nos. 1-6 y 9-17 en los que X es un aminoácido; análogos activos de los mismos; y combinaciones de los mismos; en los que un análogo de los mismos se define como que contiene una supresión de un aminoácido, adiciones de uno o dos aminoácidos, sustituciones conservativas de aminoácidos o modificaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de las cadenas laterales, modificaciones de la cadena principal y modificaciones N- y C-terminales.

16. El uso de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en aquellos representados por las SEC ID Nos. 1-6 y 9-17 en los que X es un aminoácido; análogos activos de los mismos; y combinaciones de los mismos; para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la angiogénesis en un paciente, en los que un análogo de los mismos se define como que contiene una supresión de un aminoácido, adiciones de uno o dos aminoácidos, sustituciones conservativas de aminoácidos o modificaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de las cadenas laterales, modificaciones de la cadena principal y modificaciones N- y C-terminales.

17. Un método para inhibir la angiogénesis in vitro, comprendiendo el método poner en contacto las células con una cantidad eficaz de una composición que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en aquellos representados por las SEC ID Nos. 1-6 y 9-17 en los que X es un aminoácido; análogos activos de los mismos; y combinaciones de los mismos; en los que un análogo de los mismos se define como que contiene una supresión de un aminoácido, adiciones de uno o dos aminoácidos, sustituciones conservativas de aminoácidos o modificaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de las cadenas laterales, modificaciones de la cadena principal y modificaciones N- y C-terminales.

18. El uso de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en aquellos representados por las SEC ID Nos. 1-6 y 9-17 en los que X es un aminoácido; análogos activos de los mismos; y combinaciones de los mismos; para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la tumorigénesis en un paciente, en los que un análogo de los mismos se define como que contiene una supresión de un aminoácido, adiciones de uno o dos aminoácidos, sustituciones conservativas de aminoácidos o modificaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de las cadenas laterales, modificaciones de la cadena principal y modificaciones N- y C-terminales.

19. El polipéptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en el que las modificaciones incluyen la acetilación, hidroxilación, metilación, amidación, y la unión de componentes de carbohidratos o lípidos o cofactores.

20. El polipéptido de la reivindicación 19 en el que el polipéptido está amidado en el grupo carboxilato C-termi-
nal.

21. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, 10, 12, 14, 16 ó 18, en el que la composición comprende KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4).

22. Un polipéptido que tiene una estructura \alpha-helicoidal o 3_{10}-helicoidal anfipática que tiene una superficie compuesta principalmente de restos de aminoácido cargados positivamente y una superficie opuesta compuesta principalmente de restos de aminoácido hidrófobos, en el que éstas definen un dominio activo superficial; en el que el dominio activo superficial comprende los aminoácidos K1, K4, K8, y R5 que se muestran en la Figura 6, en el que el aminoácido K1 es N-terminal, en el que el polipéptido tiene de 12 a 14 restos de aminoácido.

23. El polipéptido de la reivindicación 22 en el que el polipéptido tiene 12 restos de aminoácido.

24. El polipéptido de la reivindicación 22 en el que el dominio activo superficial comprende los átomos 1 a 24, 64 a 109, y 146 a 167 enumerados en la Tabla 5.

25. El polipéptido de la reivindicación 22 que tiene las siguientes coordenadas estructurales:

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11

12

13

14

15

16

26. Un polipéptido que tiene una estructura anfipática que tiene una superficie que comprende restos de aminoácido cargados positivamente y una superficie opuesta que comprende restos de aminoácido hidrófobos, en el que éstas definen un dominio activo superficial que tiene la secuencia KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4) en el que el polipéptido tiene de 12 a 14 restos de aminoácido.

27. Un método para evaluar un compuesto candidato con respecto a su similitud estructural con la del polipéptido KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4), comprendiendo el método: suministrar una estructura tridimensional de KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4); suministrar una estructura tridimensional de un compuesto candidato; y comparar la estructura tridimensional del compuesto candidato con la estructura tridimensional de KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4).

28. El método de la reivindicación 27 en el que suministrar una estructura tridimensional de KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4) comprende suministrar las coordenadas de los átomos 1-24, 64-109, y 146-167 enumeradas en la reivindicación 25.

29. El método de la reivindicación 27 en el que suministrar una estructura tridimensional de KLFKRHLKWKII (SEC ID No. 4) comprende suministrar las coordenadas estructurales enumeradas en la reivindicación 25.