ES2250993T3 - Composiciones del receptor nicotinico neumonal humano de acetilcolina y procedimientos que emplean el mismo. - Google Patents
Composiciones del receptor nicotinico neumonal humano de acetilcolina y procedimientos que emplean el mismo.Info
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Abstract
SE PRESENTAN MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN LAS SUBUNIDADES ALFA Y BETA DEL RECEPTOR DE LA ACETILCOLINA NICOTINICA NEURONAL HUMANA, CELULAS DE MAMIFEROS Y DE ANFIBIOS QUE CONTIENE LAS MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO Y METODOS PARA LA PRODUCCION DE LAS SUBUNIDADES ALFA Y BETA. EN PARTICULAR SE PRESENTAN MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN LAS SUBUNIDADES AL} SUB,6} Y MOLECULAS QUE CODIFICAN LAS SUBUNIDADES BE} SUB,3} DE LOS RECEPTORES DE LA ACETILCOLINA NICOTINICA NEURONAL HUMANA. ADEMAS SE PRESENTAN COMBINACIONES DE UNA PLURALIDAD DE SUBUNIDADES TALES COMO UNA O MAS SUBUNIDADES AL} SUB,1}, AL} SUB,2}, AL} SUB,3}, AL} SUB,4}, AL} SUB,5}, AL} SUB,6} Y/O AL} SUB,7} EN COMBINACION CON UNA O MAS SUBUNIDADES BE} SUB,3} O TALES COMO UNA O MAS SUBUNIDADES BE} SUB,2}, BE} SUB,3} Y/O BE} SUB,4} EN COMBINACION CON UNA SUBUNIDAD AL} SUB,6}.
Description
Composiciones del receptor nicotínico neuronal
humano de acetilcolina y procedimientos que emplean el mismo.
Esta invención se refiere a moléculas de ácido
nucleico que codifican subunidades proteicas del receptor nicotínico
neuronal humano de acetilcolina, así como las proteínas codificadas.
En particular se proporcionan el ADN y ARN que codifican la
subunidad \alpha del receptor nicotínico neuronal humano de
acetilcolina las proteínas de la subunidad \alpha y las
combinaciones de las mismas con el ADN y ARN que codifican la
subunidad \beta.
Los canales iónicos activados por ligando
proporcionan un medio de comunicación entre las células del sistema
nervioso central. Estos canales convierten una señal (por ejemplo,
un agente químico denominado neurotransmisor) que se libera por una
célula en una señal eléctrica que se propaga junto con la membrana
celular diana. Una diversidad de transmisores receptores de
neurotransmisores existen en los sistemas nerviosos central y
periférico. Se han identificado cinco familias de receptores
activados por ligando, que incluyen los receptores nicotínicos de
acetilcolina (nAChRs) de orígenes neuromuscular y neuronal, (Stroud
y col., 1990 Biochemistry 29:
11009-11023). Sin embargo, existe poco entendimiento
de la manera en que la diversidad de receptores genera las
diferentes respuestas a neurotransmisores o a otros ligandos de
modulación en diferentes regiones del sistema nervioso.
Los receptores nicotínicos de acetilcolina
(nAChRs) son múltiples subunidades de proteínas de orígenes
neuromuscular y neuronal. Estos receptores forman canales iónicos
activados por ligando que median la transmisión sináptica entre
nervio y músculo y entre neuronas tras interacción con el
neurotransmisor acetilcolina (ACh). Ya que existen diversas
subunidades del receptor nicotínico de acetilcolina (NAChR, existen
una diversidad de composiciones de nAChR (es decir, combinaciones de
subunidades). Las diferentes composiciones de nAChR muestran
diferentes especificidades para los diversos ligandos y por lo tanto
son farmacológicamente distinguibles. De este modo, los receptores
nicotínicos de acetilcolina expresados en la articulación
neuromuscular de vertebrados, en ganglios simpáticos de vertebrados
y en el sistema nervioso central de vertebrados se han distinguido
en base a los efectos de diversos ligandos que se unen a diferentes
composiciones de nAChR. Por ejemplo, las neurotoxinas á de elapid
que bloquean la activación de los receptores nicotínicos de
acetilcolina en la articulación neuromuscular no bloquean la
activación de alguno de los receptores nicotínicos neuronales de
acetilcolina que se expresan en varias líneas celulares diferentes
derivadas de neuronas.
El nAChR de músculo es una gflicoproteína
compuesta de cinco subunidades con la estereoquímica
(\alpha)_{2}\beta (\gamma o
\varepsilon)\delta. Cada una de las subunidades tiene una
masa de aproximadamente 50-50 kilodaltons (kd) y
esta codificada por un gen diferente. El complejo
(\alpha)_{2}\beta (\gamma o
\varepsilon)\delta forma receptores funcionales que
contienen dos sitios de unión de ligandos y un canal transmembrana
activado por ligando. Tras la interacción con un agonista
colinérgico, los nAChRs nicotínicos musculares conducen iones sodio.
El influjo de los iones sodio rápidamente cortocircuita el gradiente
iónico mantenido a través de la membrana plasmática, por lo tanto
despolarizando la membrana. Al reducir la diferencia de potencial a
través de la membrana, se transduce una señal química en una señal
eléctrica en una señal eléctrica en la articulación neuromuscular
que induce la contracción muscular.
Los receptores nicotínicos musculares funcionales
de acetilcolina se han formado con subunidades
\alpha\beta\delta\gamma, subunidades
\alpha\beta\gamma, subunidades \alpha\beta\delta,
subunidades \alpha\delta\gamma, pero no solamente con una
subunidad (véase, por ejemplo, Kurosaki y col., (1987) FEBS Lett.
214 253–258; Comacho y col., (1993) J. Neuroscience 13:
605-613). Por el contrario, los nAChRs neuronales
funcionales se pueden formar a partir de subunidades \alpha solo o
combinaciones de subunidades \alpha y \beta. La subunidad mayor
\alpha generalmente se cree que sea una unidad a ACh y la
subunidad \beta de menor peso molecular generalmente se cree que
es la subunidad estructural, aunque no se ha demostrado
definitivamente que la subunidad \beta no tiene la capacidad de
unirse a ACh o participar en la formación del sitio de unión a ACh.
Cada una de las subunidades que participa en la formación de un
canal iónico funcional, es hasta el grado que contribuyen a la
estructura del canal resultante, subunidades "estructurales",
independientemente de su capacidad (o incapacidad) de unirse a ACh.
Los nAChRs neuronales, que también son canales iónicos activados por
ligando, se expresan en ganglios del sistema nervioso autonómico en
el sistema nervioso central (donde median la transmisión de señal),
y en localizaciones pre- y extra-sinápticas (donde
modulan la neurotrnasmisión y pueden tener funciones adicionales;
Wonnacott y col., (1990) en: progress in Brain Research, A.
Nordberg y col., Eds. Elsevier, Ámsterdam)
157-163.
El ADN que codifica los nAChRs se han aislado a
partir de arias fuentes. Basándose en la información disponible de
tal trabajo, ha sido evidente durante algún tiempo que los nAChRs
expresados en músculo, en ganglios autonómicos, y en el sistema
nervioso central son funcionalmente diversos. Esta diversidad
funcional se puede deber, al menos en parte, al gran número de
subunidades de nAChRs diferentes que existen. Sin embargo, existe
un entendimiento incompleto de cómo (y qué) unidades de nAChRs se
combinan para generar subtipos únicos de nAChR, particularmente en
células neuronales. De hecho, existe evidencia de que solamente
ciertos subtipos de nAChR pueden estar implicados en una enfermedad
tal como enfermedad de Alzheimer. Además, no está claro de si los
nAChRs de tejidos análogos son similares a través de las
especies.
De acuerdo con lo anterior, existe una necesidad
para la localización y caracterización de los ADN que codifican cada
subunidad de nAChR neuronal humano, células recombinantes que
contienen tales subunidades y receptores preparados a partir de
ellos. Con el fin de estudiar la función de los nAChRs neuronales
humanos y obtener agentes farmacológicamente activos específicos de
la enfermedad, existe también una necesidad de obtener nAChRs
neuronales humanos aislados (preferiblemente purificados, y
subunidades de nAChRs neuronales humanos aislados (preferiblemente
purificados). Además, también existe necesidad de desarrollar
ensayos para identificar tales agentes farmacológicamente
activos.
La disponibilidad de tales ácidos nucleicos,
subunidades de los receptores y composiciones de receptores
eliminarán la incertidumbre de especular la estructura de nAChR
neuronal humano y función basándose en las predicciones diseñadas a
partir de los datos de nAChR no humanos, o los datos de nAChR de
ganglios o músculos no humanos.
Por lo tanto, es un objeto en esta memoria
descriptiva el aislar y caracterizar ADN que codifica subunidades de
los receptores nicotínicos neuronales humanos de acetilcolina.
También es un objeto en esta memoria descriptiva proporcionar
procedimientos para la producción recombinante de subunidades del
receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina . También es un
objeto en esta memoria descriptiva proporcionar subunidades del
receptor y proporcionar procedimientos para seleccionar compuestos
con el fin de identificar compuestos que modulen la actividad de los
nAChRs neuronales humanos.
Éstos y otros objetos serán evidentes para los
expertos en la técnica tras el estudio adicional de la memoria
descriptiva y reivindicaciones.
Se proporcionan moléculas aisladas de ácido
nucleico que codifican subunidades alfa (\alpha) de los nAChRs
neuronales. En particular, se proporcionan moléculas de ADN y ARN
las subunidades \alpha_{6} humanas de los nAChRs neuronales.
También se proporciona el ARN mensajero y los polipéptidos
codificados por el ADN.
También se proporcionan subunidades de nAChR
nicotínicos neuronales humanos, que incluyen las subunidades
\alpha_{6}, así como procedimientos para la producción de los
mismos. Además también se proporcionan receptores nicotínicos
neuronales humanos recombinantes de acetilcolina que contienen al
menos una subunidad de nAChR nicotínico neuronal humano, sí como
procedimientos para la producción de los mismos. También se
proporcionan nAChRs nicotínicos neuronales recombinantes que
contienen una mezcla de uno o más subunidades de nAChR codificadas
por una célula hospedadora, y una o más subunidades de nAChR
codificadas por ADN o ARN heterólogo (es decir, ADN o ARN como se
describe en esta memoria descriptiva que se ha introducido en la
célula hospedadora), así como procedimientos para la producción de
los mismos.
También se proporcionan los plásmidos que
contienen ADN que codifica las subunidades descritas anteriormente.
También se proporcionan células recombinantes que contienen ADN,
ARNm o plásmidos descritos anteriormente. Tales células son útiles,
por ejemplo, para replicar ADN, para producir subunidades de nAChR
humanos y receptores recombinantes, y para producir células que
expresan receptores que contienen una o más subunidades humanas.
Las combinaciones de ADN, ARN, vectores,
subunidades de receptores y células proporcionadas en esta memoria
descriptiva permiten la producción subtipos de receptores
nicotínicos neuronales nAChR seleccionados y las combinaciones
específicas de las mismas, así como anticuerpos para las subunidades
de los receptores. Esto proporciona un medio de preparar receptores
sintéticos y subunidades de receptores que están sustancialmente
libres de combinación de muchas otras proteínas de receptores cuya
presencia puede interferir con análisis de un solo subtipo de nAChR.
La capacidad de los subtipos de receptores deseados le hace posible
observar el efecto de una sustancia fármaco sobre un subtipo de
receptor particular y por lo tanto realizar la selección inicial
in vitro de la sustancia fármaco en un sistema de ensayo que
es específico para seres humanos y específico para un subtipo de
nAChR nicotínico neuronal humano.
También se proporciona en esta memoria
descriptiva sondas de cadena individual que contienen porciones de
las moléculas de ADN descritas en esta memoria descriptiva y
anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas codificadas
por el ADN. También se describen en esta memoria descriptiva una
molécula de ácido nucleico aislado que contiene nucleótidos
98-211 de la SEC ID Nº 15.
También se proporcionan las proteínas codificadas
por el ADN. Las proteínas se pueden preparar expresándole ADN en una
célula hospedadora procariótica o eucariótica adecuada y aislando la
proteína resultante.
También se proporcionan procedimientos para
identificar subunidades de los receptores nicotínicos neuronales de
acetilcolina funcionales y las combinaciones de las mismas.
También se proporcionan ensayos para identificar
compuestos que modulan la actividad de receptores nicotínicos
humanos de acetilcolina. La capacidad de seleccionar sustancias
fármaco in vitro para determinar el efecto del fármaco sobre
composiciones de receptores específicos debe permitir el desarrollo
y selección fármacos específicos de subtipo de receptor o
específicos de la enfermedad. También, el ensayo de subunidades de
receptores individuales o combinaciones de subtipos de receptores
específicos con una diversidad de agonistas o antagonistas
potenciales proporciona información adicional con respecto a la
función y actividad de las subunidades individuales y debe conducir
a la identificación y diseño de compuestos que son capaces de
interacción muy específica con uno o más de las subunidades de los
receptores o subtipos de receptores. Los fármacos resultantes deben
mostrar menos efectos secundarios no deseados que los fármacos
identificados por la selección con células que expresan una
diversidad de subtipos.
En relación adicional al desarrollo de fármacos y
tratamiento terapéutico de diversos estados patológicos, al
capacidad de ADN y ARN que codifica las subunidades de nAChR
neuronal humano proporciona un medio para la identificación de
cualquier alteración en tales genes (por ejemplo, mutaciones) que se
pueden correlacionar con la existencia de ciertos estados
patológicos. Además, llega a ser posible la creación de modelos
animales de tales estados patológicos, introduciendo específicamente
tales mutaciones en secuencias de ADN sintéticas que después se
pueden introducir en animales de laboratorio o en sistemas de ensayo
in vitro para determinar los efectos de los mismos.
La figura 1 presenta un mapa de restricción de un
vector pcDNA3-KEalpha6.3 basado en promotor de
citomegalovirus (CMV) que contiene un fragmento que codifica
\alpha_{6} como una inserción de EcoRI.
La figura 2 presenta un mapa de restricción de un
vector pcDNA3-KEbeta3.2 basado en promotor de
citomegalovirus que contiene un fragmento que codifica \beta_{3}
como una inserción de EcoRI.
Salvo que se defina otra cosa, todos los técnicos
y científicos usados en esta memoria descriptiva tienen los mismos
significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica a
los que esta invención pertenece. Todas las patentes y publicaciones
mencionadas en esta memoria descriptiva, salvo que se indique otra
cosa, se incorporan en esta memoria descriptiva como referencia en
su totalidad.
Como se usa en esta memoria descriptiva, aislado
(o sustancialmente purificado o puro) como un modificador de
molécula de ácido nucleico, ADN, ARN, polipéptidos o proteínas
significa que el ADN, ARN, polipéptidos o proteínas así designadas
se han separado de sus ambientes celulares in vivo mediante
de la mano del hombre. De este modo, por ejemplo, como se usa en
esta memoria descriptiva, ADN aislado (o sustancialmente puro) se
refiere a fragmentos de ADN purificados de acuerdo con técnicas
convencionales empleados por los expertos en la técnica (véase, por
ejemplo, Maniatis y col., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY).
De manera similar, como se usa en esta memoria
descriptiva, "recombinante" como un modificador de ADN, ARN,
polipéptidos o proteínas significa que el ADN, ARN, polipéptidos o
proteínas así designados se han preparado mediante los esfuerzos de
seres humanos, por ejemplo, mediante clonación, expresión
recombinante, o tal procedimiento. De esta manera, como se usa en
esta memoria descriptiva, proteínas recombinantes, por ejemplo, se
refiere a proteínas producidas mediante un huésped recombinante que
expresa los ADN que se han añadido a ese huésped a través de los
esfuerzos de seres humanos.
Como se usa en esta memoria descriptiva, vector
(o plásmido) se refiere a elementos discretos que se usan para
introducir ADN heterólogo en células para o bien expresión o
replicación del mismo. La selección y uso de tales vehículos se
conocen bien dentro de la experiencia en la técnica. Un vector de
expresión incluye vectores de expresión incluye capaz de expresar
ADN que está unido de manera operativa con secuencias reguladoras,
tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la
expresión de tales fragmentos de ADN. De este modo, un vector de
expresión se refiere a una construcción de ADN o ARN recombinante,
tal como plásmido, un fago, virus recombinante u otro vector que,
tras la introducción a una célula hospedadora, permite la expresión
de ADN clonado en el sitio apropiado sobre el vector. Los vectores
de expresión apropiados los conocen bien los expertos en la técnica
e incluyen los que son replicables en células eucarióticas y/o
células procarióticas y aquellos que permanecen episomales o
aquellos que se integran en el genoma de al célula hospedadora. Los
plásmidos preferidos actualmente para la expresión de las
subunidades de nAChR en células hospeadoras ecucarióticas,
particularmente células de mamíferos, incluyen, pero no se limitan
a, vectores que contienen promotores de citomegalovirus (CMV), virus
de simio 40 (SV40) virus de tumor mamario de ratón (MMTV) tales como
pCMV, pcADN1, pcDNA3, pZeoSV, pCEP4, pMAMneo y pMAMhyg.
Como se usa en esta memoria descriptiva, una
región promotora se refiere a un segmento de ADN que controla la
transcripción de ADN al que se une operativamente. La región
promotora incluye secuencias específicas que son suficientes el
reconocimiento de ARN polimerasa, unión e iniciación de la
transcripción. Esta porción de la región promotora se denomina el
promotor. Además, la región promotora incluye secuencias que modulan
este reconocimiento, unión y actividad de inicio de la transcripción
de la ARN polimerasa. Estas secuencias pueden ser factores de
actuación cis o pueden ser responsables de actuación
trans. Los promotores, dependiendo de la naturaleza de la
regulación, pueden ser constitutivos o regulados. Los promotores
ejemplares contemplados para uso en esta memoria descriptiva
incluyen el promotor temprano de SV40, el promotor de
citomegalovirus (CMV), el promotor inducible de esteroide de virus
de tumor mamario de ratón, y promotor de virus de leucemia murino de
Molones (MMLV), y otros promotores adecuados.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término "unido de manera operativa" se refiere a la relación
funcional de ADN con secuencias reguladoras y efectoras de
nucleótidos, tales como promotores, potenciadores, sitios de
comienzo y detención transcripcionales y traduccionales, y otras
secuencias de señal. Por ejemplo, la unión operativa de ADN a un
promotor se refiere a la relación física y funcional entre en ADN y
el promotor de manera que la transcripción de tal ADN se inicie
desde el promotor mediante un ARN polimerasa que reconoce
específicamente, se une a y transcribe el ADN. Con el fin de
optimizar la expresión y/o transcripción in vivo, puede ser
necesario para retirar o alterar las porciones no traducidas en 5'
de los clones para retirar los codones alternativos potenciales de
inicio (es decir, comienzo) de traducción, o bien al nivel de
transcripción o traducción. Como alternativa, sitios de unión de
ribosomas de consenso (véase, por ejemplo, Kozak (1991) J. Biol.
Chem. 266: 19867-19870) se puede insertar
inmediatamente en 5' del codón de inicio para potenciarla expresión.
La deseabilidad (o necesidad de tal modificación se puede determinar
empíricamente.
Como se usa en esta memoria descriptiva,
expresión se refiere al procedimiento mediante el que los ácidos
polinucleótios se transcriben en ARNm y se traducen en péptidos,
polipéptidos, o proteínas. Si el ácido polinucleótido se deriva de
ADN genómico, la expresión puede, si se selecciona una célula u
organismo hospedador eucariótico apropiado, incluyen ayuste del
ARNm.
Los vectores particularmente preferidos para
transfección de células de mamífero son los vectores de expresión
basados en promotores de SV40, tales como pZeoSV (Invitrogen, San
Diego, CA), vectores basados en promotores de CMV tal como pcADN1,
pcDNA3, pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA), y vectores basados en
promotores de MMTV tal como pMAMneo (Clontech, Inc.).
Como se usa en esta memoria descriptiva, un gen
de la subunidad alfa (\alpha) humana que codifica una subunidad
alfa de un receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina. Las
subunidades alfa de los nAChRs típicamente muestran una conservación
de residuos de cisteína adyacentes en el dominio extracelular
presumido de la subunidad que son homólogos de cisteínas 192 y 193
de al subunidad alfa Torpedo (véase Noda y col., (1982)
Nature 299: 793-797).
Como se usa en esta memoria descriptiva, un
subtipo de subunidad alfa se refiere a una subunidad de nAChR
neuronal humano que está codificada por ADN que se hibridiza en
condiciones de alta rigurosidad a al menos uno de los clones de ADN
que codifican las subunidades alfa de nAChR neuronal descritos en
esta memoria descriptiva. Una subunidad alfa generalmente se une a
ACh en condiciones fisiológicas y a concentraciones fisiológicas y,
en la presencia opcional de una subunidad beta (es decir, algunas
subunidades alfa son funcionales solos, mientras que otros requieren
la presencia de una subunidad beta), generalmente forma un nAChR
funcional como se ensaya mediante los procedimientos descritos en
esta memoria descriptiva conocidos por los expertos en esta
técnica.
También se contemplan subunidades alfa
codificadas por moléculas de ADN que codifican subunidades alfa como
se definen en esta memoria descriptiva, pero que en virtud de la
degeneración del código genético no necesariamente se hibridan al
ADN descrito en condiciones de hibridación específicas. Tales
subunidades también forman un receptor funcional, como se ensaya
mediante los procedimientos descritos en esta memoria descriptiva o
conocidos por los expertos en la técnica, generalmente con uno o más
subtipos de subunidad beta. Típicamente, salvo que una subunidad
alfa esté codificada por ARN que surge de ayuste alternativo (es
decir, una variante de ayuste), el ADN que codifica alfa y la
subunidad alfa codificada comparten por lo tanto compartes la
homología de secuencia sustancial con al menos uno de los ADN de la
subunidad alfa (y proteínas codificadas por él) descritas en esta
memoria descripti-
va.
va.
Como se usa en esta memoria, un gen de la
subunidad beta (\beta) humano es un gen que codifica una subuniadd
beta de un receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina. La
asignación del nombre "beta" a una subunidad de nAChR neuronal
putativo se ha basado en la carencia de residuos de cisteína
adyacentes (dichos residuos son característicos de las subunidades
alfa). La subunidad beta se refiere frecuentemente a la subunidad
estructural de nAChR (aunque es posible que las subunidades beta
también tengan propiedades de unión a ACh). La combinación de
la(s) subunidad(es) beta apropiada(s) con
subunidad(es) alfa apropiada(s) conduce a la formación
de un receptor funcio-
nal.
nal.
Como se usa en esta memoria descriptiva, un
subtipo de subunidad beta se refiere a una subunidad de nAChR
neuronal que está codificada por ADN que se hibridiza en condiciones
de alta rigurosidad a al menos uno de los ADN que codifican nAChR
descritos en esta memoria descriptiva. Una subunidad beta puede
formar un nAChR funcional, como se establece mediante procedimientos
descritos en esta memoria descriptiva o conocidos por los expertos
en esta técnica, con subtipo(s) de subunidad alfa
apropiada(s).
También se describen subunidades beta codificadas
por ADN que codifica subunidades beta como se han definido
anteriormente, pero que en virtud de la degeneración del código
genético no se híbrida necesariamente al ADN descrito en las
condiciones de hibridación especificadas. Tales subunidades también
pueden formar receptores funcionales, como se determina mediante los
procedimientos descritos en esta memoria descriptiva o son conocidos
por los expertos en la técnica, en combinación con subtipo(s)
de la subunidad alfa apropiados(s). Típicamente, salvo que
una subunidad beta esté codificada por ARN que surge como una
variante de ayuste, ADN que codifica beta y la subunidad beta
codificada por lo tanto comparten la homología de secuencia
sustancial con el ADN que codifica beta y la proteína de la
subunidad beta descrita en esta memoria descriptiva.
Como se usa en esta memoria descriptiva, un
subtipo de nAChR se refiere a un receptor nicotínico de acetilcolina
que contiene una combinación particular de subtipos \alpha y/o
\beta, un receptor que contiene subunidades \alpha_{6} y
\beta_{3} de nAChR humano.
Como se usa en esta memoria descriptiva, una
variante de ayuste se refiere a ácido(s) nucleico(s)
que codifica(n)
subunidades de nAChR variantes producidos mediante procesamiento diferencial de transcripción(es) primaria(s) de ADN genómico, que dan como resultado la producción de más de un tipo de ARNm. ADNc derivado de ADN genómico procesado diferencialmente codificará las subunidades de nAChR que tienen regiones de identificación de aminoácidos completa y regiones que tienen diferentes secuencias de aminoácidos. De este modo, la misma secuencia genómica pueden conducir a la producción de ARNm y proteínas múltiples, relacionadas. El ARNm y proteínas resultantes se denominan "variantes de ayuste".
subunidades de nAChR variantes producidos mediante procesamiento diferencial de transcripción(es) primaria(s) de ADN genómico, que dan como resultado la producción de más de un tipo de ARNm. ADNc derivado de ADN genómico procesado diferencialmente codificará las subunidades de nAChR que tienen regiones de identificación de aminoácidos completa y regiones que tienen diferentes secuencias de aminoácidos. De este modo, la misma secuencia genómica pueden conducir a la producción de ARNm y proteínas múltiples, relacionadas. El ARNm y proteínas resultantes se denominan "variantes de ayuste".
Como se usa en esta memoria descriptiva, se usan
ADN y ARN heterólogo o extraño indistintamente y se refieren a ADN o
ARN que no se producen naturalmente como parte del genoma en el que
está presente o que se encuentre en una localización o
localizaciones en el genoma que difiere del que se produce en la
naturaleza. Es típicamente ADN o ARN que no es endógeno a la célula
y se ah introducido artificialmente en al célula. Los ejemplos de
ADN heterólogo incluyen, pero no se limitan a, ADN que codifica una
subunidad de nAChR y ADN que codifica ARN o proteínas que median o
alteran la expresión de ADN endógeno afectando la transcripción,
traducción, u otros procedimientos bioquímicos regulables. La célula
que expresa el ADN heterólogo, tal como ADN que codifica una
subunidad de nAChR humano, puede contener ADN que codifica las
mismas o diferentes subunidades de receptores nicotínicos de
acetilcolina. El ADN heterólogo no necesita expresarse y se puede
introducir de una manera que se integre en el genoma de la célula
hospedadora o se mantiene de manera episomal.
La rigurosidad de la hibridación se usa en esta
memoria descriptiva para referirse a condiciones bajo las que los
híbridos de ácidos polinucleicos son estables. Como conocen los
expertos en la técnica, la estabilidad de los híbridos se refleja en
al temperatura de fusión de (T_{m}) de los híbridos. Tm se puede
aproximar por la fórmula:
81,5ºC - 16,6
(log10 [Na^{+}]) + 0,41 (%G + C) -
600/l,
en la que I es la longitud de los
híbridos en los nucleósidos. T_{m} disminuye aproximadamente
1-1,5ºC con cada 1% de disminución en homología de
secuencia. En general, la estabilidad de un híbrido es función de la
concentración de ion sodio y temperatura. Típicamente, la eracción
de hibridación se realiza en condiciones de baja rigurosidad,
seguido de lavados de rigurosidad variante, pero superior. La
referencia a la rigurosidad de hibridación se refiere a tales
condiciones de
lavado.
Como se usa en esta memoria descriptiva:
- (1)
- Condiciones de ALTA RIGUROSIDAD, con respecto a la hibridación de fragmentos, se refiere a condiciones que permiten la hibridación de solamente aquellas secuencias de ácidos nucleicos que forman híbridos estables en NaCl 0,018 M a 65ºC (es decir, si un híbrido no es estable en NaCl 0,018 M a 65ºC, no será estable en condiciones de alta rigurosidad, como se contempla en esta memoria descriptiva). Se pueden proporcionar condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, mediante hibridación en formamida al 50%, 5 X solución de Denhardt, 5 X SSPE, SDS al 0,2%, 200 \mug/ml de ADN de esperma de arenque sonicado desnaturalizado, a 42ºC, seguido de lavado en 0,1 X SSPE, y SDS al 0,1% a 65ºC;
- (2)
- Condiciones de MODERADA RIGUROSIDAD, con respecto a la hibridación de fragmentos, se refiere a condiciones equivalentes a la hibridación en formamida al 50%, 5 X solución de Denhardt, 5 X SSPE, SDS al 0,2%, 200 \mug/ml de ADN de esperma de arenque sonicado desnaturalizado, a 42ºC, seguido de lavado en 0,2 X SSPE, SDS al 0,2% a 60ºC;
- (3)
- Condiciones de BAJA RIGUROSIDAD, con respecto a la hibridación de fragmentos, se refiere a condiciones equivalentes a la hibridación en formamida al 10%, 5 X solución de Denhardt, 6 X SSPE, SDS al 0,2%, 200 \mug/ml de ADN de esperma de arenque sonicado desnaturalizado, a 42ºC, seguido de lavado en 1 X SSPE, SDS al 0,1% a 50ºC; y
- (4)
- Condiciones de RIGUROSIDAD ALTA, con respecto a hibridación de oligonucleótidos (es decir, ADN sintético \leq aproximadamente 30 nucleótidos de longitud), se refiere a condiciones equivalentes a la hibridación en formamida al 10%, 5 X solución de Denhardt, 6 X SSPE, SDS al 0,2%, 200 \mug/ml de ADN de es-perma de arenque sonicado desnaturalizado, a 42ºC, seguido de lavado en 1 X SSPE y SDS al 0,2% a 50ºC.
Se entiende que estas condiciones se pueden
duplicar usando una diversidad de tampones y temperaturas y que no
son necesariamente precisas.
La solución de Denhardt y SSPE (véase, por
ejemplo, Sambrook y col., (1989) Molecualr Cloning: A Laboratory
Manual, edición 2ª, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY) son bien conocidos por los expertos en la técnica
como son otros tampones de hibridación adecuados. Por ejemplo, SSPE
es NaCl 0.18 M tamponado con fosfato de pH 7,4. SSPE se puede
preparar por ejemplo, como una solución madre 20 X disolviendo 175,3
g de NaCl, 27,6 g de NaH_{2}PO_{4} y 7,4 g de EDTA en 800 ml de
agua, ajustando el pH hasta 7,4 y después añadiendo agua hasta 1
litro. La solución de Denhardt (véase, Denhardt (1966) Biochem,
Biophys, Res. Commun. 23: 641) se puede preparar, por ejemplo,
como una solución madre 50 X mezclando 5 g de Ficoll (Tipo 400,
Pharamcia LKB Biotechnology, INC., Piscataway NJ), 5 g de
polivinilpirrolidona, 5 g de albúmina sérica bovina (Fracción V;
Sigma, San Luis MO) agua hasta 500 ml y filtrando para retirar la
materia particulada.
Como se usa en esta memoria descriptiva, la frase
"homología de secuencia sustancial" se refiere a dos secuencias
de nucleótidos que comparten al menos aproximadamente 90% de
identidad, y las secuencias de aminoácidos que típicamente comparten
más de un 95% de identidad de aminoácidos. Sin embargo, se reconoce
que las proteínas (y ADN o ARNm que codifica tales proteínas) que
contienen menos del nivel descrito anteriormente de homología que
surge de variantes de ayuste o que están modificadas por
sustituciones de aminoácidos conservadoras (o sustituciones o
codones degenerados) se contemplan en esta memoria descriptiva.
La frase "sustancialmente la misma" se usa
en esta memoria descriptiva en referencia a la secuencia de
nucleótidos, la secuencia de ribonucleótidos de ARN, o la secuencia
de aminoácidos o proteína, que tienen variaciones de secuencias
ligeras y no consecuentes de las secuencias reales descritas en esta
memoria descriptiva. Las especies que son sustancialmente las mismas
se consideran que son funcionalmente equivalentes a las secuencias
descritas. De este modo, como se usan en esta memoria descriptiva,
las moléculas de ácido nucleico o proteínas funcionalmente
equivalentes son aquellas que son suficientemente equivalentes para
funcionar sustancialmente de la misma manera para lograr
sustancialmente los mismos resultados.
Como se usa en esta memoria descriptiva,
"variaciones ligeras y no consecuentes de la secuencia"
significa que las secuencias que son sustancialmente la misma que el
ADN, ARN, o proteínas descritas y reivindicadas en esta memoria
descriptiva son funcionalmente equivalentes a las secuencias
derivadas de seres humanos descritas y reivindicadas en esta memoria
descriptiva. Las secuencias funcionalmente equivalentes funcionarán
sustancialmente de la misma manera que producen sustancialmente las
mismas composiciones que las composiciones de ácidos nucleicos y
aminoácidos derivados de seres humanos descritas y reivindicadas en
esta memoria descriptiva. En particular, moléculas de ADN
funcionalmente equivalentes codifican proteínas derivadas de seres
humanos que son las mismas que las descritas en esta memoria
descriptiva o que tienen variaciones conservadoras de aminoácidos,
tales como sustitución de un residuo no polar por otro residuo polar
o un residuo cargado por un residuo cargado de manera similar
(véase, por ejemplo, la tabla 1. Estos cambios incluyen los
reconocidos por los expertos en la técnica como aquellos que no
alteran sustancialmente la estructura terciaria de la proteína.
Las sustituciones conservadoras adecuadas de
aminoácidos son conocidas por lo expertos en la técnica y se pueden
realizar generalmente sin alterar la actividad biológica de la
molécula resultante. Los expertos en la técnica reconocen que, en
general, las sustituciones individuales de aminoácidos en regiones
no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la
actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson y col., Molecular
Biology of the Gen, edición 4ª, 1987, The Benjamín/Cumings Pub. co.,
p. 224). Tales sustituciones se realizan preferiblemente de acuerdo
con las expuestas en la tabla 1 como sigue:
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Residuo original \+ \hskip5cm \+ Sustitución
conservadora\cr \+\+\cr Ala (A) \+ \+ Gly; Ser\cr Arg (R) \+ \+
Lys\cr Asn (N) \+ \+ Gln; His\cr Cys (C) \+ \+ Ser; aminoácidos
neutros\cr Gln (Q) \+ \+ Asn\cr Glu (E) \+ \+ Asp\cr Gly (G) \+
\+ Ala; Pro\cr His (H) \+ \+ Asn; Gln\cr Ile (I) \+ \+ Leu: Val\cr
Leu (L) \+ \+ Ile: Val\cr Lys (K) \+ \+ Arg: Glny: Glu\cr Met (M)
\+ \+ Leu; Tyr: Ile\cr Phe (F) \+ \+ Met; Leu; Tyr\cr Ser (S) \+
\+ Thr\cr Thr (T) \+ \+ Ser\cr Trp (W) \+ \+ Tyr\cr Tyr (Y) \+ \+
Trp; Phe\cr Val (V) \+ \+ Ile;
Leu\cr}
También son permisibles otras sustituciones y se
pueden determinar empíricamente o de acuerdo con sustituciones
conservadoras conocidas. Cualquier de tales modificaciones del
polipéptido se puede efectuar mediante cualquier medio conocido por
los expertos en esta técnica.
Como se usa en esta memoria descriptiva, la
actividad de un nAChR neuronal humano se refiere a cualquier
actividad característica de un nAChR. Tal actividad se puede
típicamente medir mediante uno o más procedimientos in vitro,
y frecuentemente corresponde a una actividad in vitro de un
nAChR neuronal. Tal actividad se puede medir mediante cualquier
procedimiento conocido por los expertos en la técnica, tal como, por
ejemplo, midiendo la cantidad de corriente que fluye a través del
canal correspondiente en respuesta a un estímulo.
Los procedimientos para determinar la presencia
y/o actividad de los nAChR neuronales humanos incluyen, pero no se
limitan a, ensayos que miden la unión a nicotina, flujo de iones
^{86}Rb, influjo de Ca^{2+}, respuesta electrofisiológica de
células, la respuesta electrofisiológica de oocitos inyectados con
ARN. En particular, se proporcionan procedimientos en esta memoria
descriptiva para la medición o detección de una respuesta mediada
por nAChR tras contacto de células que contienen el ADN o ARNm con
un compuesto de ensayo.
Como se usa en esta memoria descriptiva, un nAChR
neuronal humano se refiere a un receptor que contiene una o más
subunidades codificadas por ADN heterólogo que se ha introducido en
y expresado en células capaces de expresar proteína receptora. Un
nAChR neuronal humano, recombinante también puede incluir
subunidades que se producen mediante ADN endógeno para la célula
hospedadora. En ciertas realizaciones, nAChR neuronal humano
recombinante o heterólogo puede contener solamente subunidades que
están codificadas por ADN heterólogo.
Como se usa en esta memoria descriptiva, un nAChR
neuronal funcional es un receptor que muestra una actividad de los
nAChR nicotínicos neuronales como de determina por cualquier ensayo
in vitro o in vivo descrito en esta memoria
descriptiva o conocidos por los expertos en la técnica y
proporcionado en esta memoria descriptiva es suficiente para
designar un receptor como funcional. Los procedimientos para
detectar la proteína nAChR y/o actividad incluyen, pero no se
limitan a, por ejemplo, ensayos que miden la unión a nicotina, flujo
de iones ^{86}Rb, influjo de Ca^{2+} y la respuesta
electrofisiológica de células que contienen ADN heterólogo o ARNm
que codifica uno o más de los subtipos de subunidades receptoras. Ya
que todas las combinaciones de subunidades alfa y beta no forman
receptores funcionales, numerosas combinaciones de subunidades alfa
y beta se pueden ensayar con el fin de caracterizar completamente
una subunidad particular y células que producen lo mismo. De esta
manera, como se usa en esta memoria descriptiva, "funcional"
con respecto a un nAChR neuronal humano significa que el canal
receptor es capaz de proporcionar y regular la entrada de iones
permeables a nAChR neuronales humanos, tales como, por ejemplo,
Na^{+}, K^{+}, Ca^{2+}, o Ba^{2+}, en respuesta a un
estímulo y/o ligandos de unión con afinidad para el receptor.
Preferiblemente tal actividad de nAChR neuronal humano es
distinguible, tal como mediante medios electrofisiológicos,
farmacológicos y otros conocidos por los expertos en la técnica, a
partir de cualquier actividad de nAChR endógeno que se puede
producir por la célula hospedadora.
Como se usa en esta memoria descriptiva, un tipo
de una célula "control" o cultivo "control" es una célula
o cultivo que trata sustancialmente la misma como la célula o
cultivo expuesto al compuesto de ensayo excepto que el cultivo
control no se expone al cultivo de ensayo. Otro tipo de célula
"control" o cultivo "control" puede ser una célula o
cultivo de células que son idénticas a las células transfectadas
empleadas para el cultivo control no exprese los receptores
nicotínicos funcionales de acetilcolina. En esta situación, la
respuesta de la célula de ensayo al compuesto de ensayo se compara
con la respuesta (o carencia de respuesta) de al célula negativa al
receptor nicotínico de acetilcolina al compuesto de ensayo, cuando
las células o cultivos de cada tipo se exponen a sustancialmente la
mismas condiciones de reacción en presencia del compuesto que se
está ensayando.
Como se usa en esta memoria descriptiva, un
compuesto o señal que "modula la actividad de un nAChR" se
refiere a un compuesto a señal que altera la actividad de nAChR de
manera que la actividad del nAChR es diferente en presencia del
compuesto o señal que en ausencia del compuesto o señal. En
particular, tales compuestos o señales incluyen agonistas y
antagonistas. El término agonista se refiere a una sustancia o
señal, tal como ACh, que activa la función del receptor; y el
término antagonista se refiere a una sustancia que interfiere con la
función del receptor. Típicamente, el efecto de un antagonista se
observa por un bloqueo de activación por un agonista. Los
antagonistas incluyen antagonistas competitivos y no competitivos.
Un antagonista competitivo (o bloqueador competitivo) interactúa con
o cerca del sitio específico para el agonista (por ejemplo, ligando
o neurotransmisor) para el mismo sitio o situado cerca. Un
antagonista no competitivo o bloqueador inactiva el funcionamiento
del receptor interactuando con un sitio diferente del sitio que
interactúa con el agonista.
Se proporcionan las moléculas de ADN que
codifican subunidades alfa y beta humanas de nAChR neuronal.
Específicamente, los ADN aislados que codifican las subunidades
\alpha_{6} y \beta_{6} de los nAChR neuronales humanos se
describen en esta memoria descriptiva. También se proporcionan ARN
mensajero recombinante (ARNm) y polipéptidos recombinantes
codificados por el ADN descrito anteriormente.
Para los propósitos en esta memoria descriptiva
"el ácido nucleico que codifica la subunidad \alpha_{6}" se
refiere a ADN o ARN que codifica una subunidad del receptor
nicotínico neuronal de acetilcolina del mismo nombre. Tales
moléculas de ácido nucleico se pueden caracterizar de numerosas
formas, por ejemplo los nucleótidos del ADN (o ribonucleótidos del
ARN) pueden codificar la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC
ID Nº 10 o SEC ID Nº 20.
Actualmente el ácido nucleico preferido que
codifica \alpha_{6} incluye ADN oARN que se hibridiza a las
secuencias codificadoras expuestas en al SEC ID Nº 9
(preferiblemente a sustancialmente la secuencia codificadora entera
de la misma, es decir, los nucleótidos 143-1624) o
la SEC ID Nº 19 (preferiblemente a sustancialmente la secuencia
codificadora entera de la misma, es decir, los nucleótidos
143-1579) en condiciones de alta rigurosidad.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican
\alpha_{6} especialmente preferidas son aquellas que codifican
una proteína que tiene sustancialmente la misma secuencia de
aminoácidos (es decir, con solamente sustituciones conservadoras de
aminoácidos) como se expone en la SEC ID Nº 10 o SEC ID Nº 20. Las
moléculas más preferidas incluyen una secuencia de nucleótidos (o
ribonucleótidos con U sustituido por T) que tienen sustancialmente
la misma secuencia de nucleótidos que la expuesta en la SEC ID Nº 9
(es decir, particularmente los nucleótidos 143-1624
de la misma) o la SEC ID Nº 19 (es decir, particularmente los
nucleótidos 143-1579 de la misma).
El ADN que codifica \alpha_{6} compartirá la
homología de la secuencia sustancial (es decir, mayor que
aproximadamente 90%), con una molécula de ácido nucleico que
codifica \alpha_{6} descrita en esta memoria descriptiva.
También descritos en esta memoria descriptiva
están "los ácidos nucleicos que codifican la subunidad
\beta_{3}", que incluye moléculas de ADN o ARN que codifican
una subunidad del receptor nicotínico neuronal de acetilcolina del
mismo nombre. Tales moléculas de ácido nucleico se pueden
caracterizar de numerosas formas, por ejemplo, los nucleótidos del
ADN (o ribonucleótidos del ARN) pueden codificar la secuencia de
aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 16.
El ácido nucleico actualmente preferido que
codifica \beta_{3} incluye ADN o ARN que se hibridiza en
condiciones de alta rigurosidad a la secuencia codificadora expuesta
en la SEC ID Nº 15 (preferiblemente a sustancialmente la secuencia
codificadora entera de la misma, es decir, los nucleótidos
98-1471). Más preferidos son aquello aminoácidos que
codifican una proteína que incluye la secuencia de aminoácidos (o
sustancialmente la secuencia de aminoácidos con sustituciones de
aminoácidos conservadoras solamente) expuesta en la SEC ID Nº 16.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican \beta_{3}
especialmente preferidas descritas en esta memoria descriptiva
tienen sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos que la
expuesta en la SEC ID Nº 15 (es decir, particularmente los
nucleótidos 98-1471 de la misma).
El ácido nucleico que codifica \beta_{3}
compartirá la homología de la secuencia sustancial (mayor que
aproximadamente 90%), con las moléculas de ácido nucleico que
codifica \beta_{3} descritas en esta memoria descriptiva.
El ADN que codifica las subunidades alfa y beta
de nAChR nicotínico neuronal humano se pueden aislar seleccionando
ADNc humano o librerías genómicas adecuadas en condiciones adecuas
de hibridación con el ADN descrito en esta memoria descriptiva
(incluyendo los nucleótidos derivados de la SEC ID Números 9 ó 15).
Las librerías adecuadas se pueden preparar a partir de tejidos tales
como muestras de tejido neuronal, ganglios basales, tálamo, y tejido
de hipotálamo. La librería preferiblemente se selecciona con una
porción de ADN que incluye la secuencia que codifica la subunidad
entera de la misma, o la librería se puede seleccionar con una sonda
adecuada. Típicamente las sondas se marcan con una etiqueta
identificable, tal como una radioetiqueta, enzima o otra de tales
tarjetas conocidas por los expertos en la técnica.
También se proporcionan las sondas para uso en
los procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos que codifican
\alpha_{6}. Así pues, por ejemplo, con referencia a las
subunidades \alpha_{6}, una sonda es una molécula de ADN o ARN
de cadena sencilla que tiene una secuencia de nucleótidos que
incluye al menos 27 bases contiguas que son las mismas que (o el
complemento de) cualquiera de las 27 bases expuestas en la SEC ID Nº
9 ó SEC ID Nº 19.
Con referencia a las subunidades \beta_{3},
una sonda es un ADN o ARN de cadena sencilla que tiene una secuencia
de nucleótidos que incluye al menos 28 bases contiguas que son las
mismas que (o el complemento de) cualquiera de las 28 bases
derivadas de los primeros 105 nucleótidos de la secuencia
señal/secuencia codificadora expuesta en la SEC ID Nº 15.
Entre las regiones preferidas a partir de las que
se construyen sondas incluyen, pero no se limitan a, secuencias
codificadoras en 5' y/o 3', regiones que contienen secuencias
predichas para codificar dominios transmembrana, regiones que
contienen secuencias predichas para codificar dominio citoplásmico,
secuencias señal, y acetilcolina (ACh) y sitios de unión a
\alpha-bungarotoxina
(\alpha-bgtx). Los aminoácidos que corresponden a
los residuos 190-198 de la subunidad \alpha de
nAChR Torpedo (véase, por ejemplo, Karlin (1993) Curr.
Opin. Neurobiol. 3, 299-309) están típicamente
implicadas en ACh y sitio de unión a \alpha-bgtx.
Los residuos de aminoácidos aproximados que incluyen tales regiones
para otras sondas se exponen en la siguiente tabla 2:
\newpage
| Subunidad | Secuencia señal | TMD1 | TMD2 | TMD3 | TMD4 | Bucle citoplásmico |
| \alpha_{6}^{#} | 1-30 | 240-265 | 272-294 | 301-326 | 4584-483 | 327-457 |
| \beta_{3} | 1-20 | 231-258 | 265-287 | 293-318 | 421-446 | 319-420 |
| ^{\text{*}} TMD = dominio transmembrana | ||||||
| ^{#} Con referencia a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SECID Nº 10. |
Como alternativa, se pueden usar porciones del
ADN como cebadores para amplificar fragmentos seleccionados en una
librería particular.
Las sondas se usan para seleccionar una librería
adecuada. Las librerías adecuadas para obtener ADN que codifica cada
subunidad incluye, pero no se limita a: sustancia nigra, tálamo o
hipotálamo para aislar ADN que codifica \alpha_{6} humana y
sustancia nigra o hipotálamo para aislar ADN que codifica
\beta_{3} humana.
Después de seleccionar la librería, los clones
positivos se identifican mediante la detección de una señal de
hibridación; los clones identificados se caracterizan mediante mapeo
de enzima de restricción y/o análisis de secuencia de ADN, y después
examinada, por comparación con as secuencias expuestas en esta
memoria descriptiva. para averiguar si incluyen ADN que codifica una
subunidad alfa o beta completa. Si los clones seleccionados son
incompletos, se pueden usar para volver a seleccionar la misma
librería o diferente con el fin de obtener clones de solapamiento.
Si se desea, la librería se puede volver a seleccionar con clones
positivos hasta que se obtengan los clones de solapamiento que
codifican la subunidad alfa o beta completa. Si la librería es una
librería de ADNc, entonces los clones de solapamiento incluirán una
fase de lectura abierta. Si la librería es genómica, entonces los
clones de solapamiento pueden incluir exones e intrones. Los clones
completos se pueden identificar mediante comparación con el ADN y
proteínas codificadas proporcionadas en esta memoria
descriptiva.
Se han aislado los clones de ADN complementarios
que codifican diversos subtipos de subunidades alfa y beta de nAChR,
neuronal humano. Cada subtipo de subunidad parece que esté
codificada por un gen diferente. Los clones de ADN proporcionados en
esta memoria descriptiva se pueden usar para aislar clones genómicos
que codifican cada subtipo y para aislar cualquier variante de
ayuste seleccionando las librerías preparadas a partir de tejidos
neurales diferentes. Las técnicas de amplificación de ácidos
nucleico, que se conocen bien en la técnica, se pueden usar para
localizar variantes de ayuste de subunidades de nAChR neuronal
humano. Esto se lleva a cabo empleando oligonucleótidos basándose en
secuencias de ADN que corean la(s) secuencia(s)
divergente como cebadores para amplificar ARN humano o ADN genómico.
Las determinaciones de tamaño y secuencia de los productos de
amplificación pueden revelar la existencia de variantes de ayuste.
Además, el aislamiento de secuencias de ADN genómico humano mediante
hibridación puede producir ADN que contiene múltiples exones,
separados por intrones, que corresponden a diferentes variantes de
ayuste de transcripciones que codifican subunidades de nAChR
neuronal humano.
Se ha encontrado que no todos los subtipos de
subunidades se expresan en todos los tejidos neurales o en todas las
partes del cerebro. De este modo, con el fin de aislar ADNc que
codifica subtipos de subunidades o variantes de ayuste particulares
de tales subtipos, es preferible seleccionar librerías preparadas a
partir de diferentes tejidos neuronales o neurales.
Las moléculas de ácido nucleico descritas
anteriormente que codifican las subunidades de nAChR humano se
pueden incorporar en vectores para manipulación adicional. La
incorporación de ADN clonado en un vector de expresión adecuado,
transfección de células eucarióticas con una o una combinación de
construcciones de expresión que codifican uno o más genes distintos
o con ADN lineal, y selección de células transfectadas se conoce
bien en la técnica (véase, por ejemplo Sambrook y col., (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, NY). El ADN heterólogo se puede
introducir en células hospedadoras mediante cualquier procedimiento
conocido por los expertos en la técnica, tal como transfección con
un vector de expresión que codifica el ADN heterólogo mediante
precipitación con CaPO_{4} (véase, por ejemplo, Wigler y col.,
(1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:
1373-1376). Después se pueden cultivar células
recombinantes en condiciones en las que la(s)
subuni-
dad(es) codificada(s) por el ADN se expresa(n). Las células preferidas incluye, pero no se limitan a, células de mamífero (por ejemplo, células HEK 293, CHO y Ltk), células de levadura (por ejemplo, células de levaduras metilotróficas, tales como Pichia pastoris) y células bacterianas (por ejemplo, Escherichia coli).
dad(es) codificada(s) por el ADN se expresa(n). Las células preferidas incluye, pero no se limitan a, células de mamífero (por ejemplo, células HEK 293, CHO y Ltk), células de levadura (por ejemplo, células de levaduras metilotróficas, tales como Pichia pastoris) y células bacterianas (por ejemplo, Escherichia coli).
Los ácidos nucleicos que codifican las
subunidades \alpha_{6} o \beta_{3} se pueden incorporar en
vectores individualmente o en combinación con ácidos nucleicos que
codifican otras subunidades del receptor nicotínico de acetilcolina
para posterior manipulación. Los clones de ADN de longitud completa
que codifican las subunidades de nAChR neuronal humano se han
insertado en el vector pcDNA3, un vector de expresión de células de
mamífero basado en pUC19 que contiene el promotor/potenciador de
CMV, un poliengarce cadena abajo del promotor/potenciador de CMV,
seguido de la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento
bovina (BGH). La colocación del ADN que codifica la subunidad de
nAChR entre el promotor de CMV y la señal de poliadenilación de la
BGH proporciona la expresión constitutiva del ADN en la célula
hospedadora de mamífero transfectada con la construcción. Para la
expresión inducible del ADN que codifica la subunidad de nAChR
humana en una célula de mamífero, el ADN
se puede insertar en un plásmido tal como pMAMneo. Este plásmido contiene el promotor de virus de tumor de mamífero de ratón (MMTV) para la expresión inducible de esteroides de ADN foráneo asociado operativamente. Si la célula hospedadora no expresa los receptores de glucocorticoides endógenos requeridos para la captación de glucocorticoides (es decir, inductores del promotor de MMTV) en la célula, es necesario transfectar adicionalmente la célula con ADN que codifica el receptor de glucocorticoide (Nº de acceso de ATCC 67200).
se puede insertar en un plásmido tal como pMAMneo. Este plásmido contiene el promotor de virus de tumor de mamífero de ratón (MMTV) para la expresión inducible de esteroides de ADN foráneo asociado operativamente. Si la célula hospedadora no expresa los receptores de glucocorticoides endógenos requeridos para la captación de glucocorticoides (es decir, inductores del promotor de MMTV) en la célula, es necesario transfectar adicionalmente la célula con ADN que codifica el receptor de glucocorticoide (Nº de acceso de ATCC 67200).
De acuerdo con otra realización, se proporcionan
células que contienen los ácidos polinucleótidos descritos
anteriormente (es decir, ADN o ARNm). Las células hospedadoras tales
como células bacterianas, de levaduras y de mamíferos se pueden usar
para replicar ADN y producir subunidad(es) de nAChR). Los
procedimientos para construir vectores de expresión, preparar
transcripciones in vitro, transfectar ADN en células de
mamífero, inyectar oocitos, y realizar análisis electrofisiológicos
y otros para determinar la expresión y función de receptores como se
describe en esta memoria descriptiva también se describen en la
solicitud PCT números PCT/US91/02311, PCT/US94/02447,
PCT/US91/05625, y PCT/US92/11090, en la patente de Estados Unidos Nº
5.369.028, y en la solicitud de Estados Unidos pendiente de
aplicación Nº de serie 07/563.751 y 07/812.254.
Aunque el ADN proporcionado en esta memoria
descriptiva se puede expresar en cualquier célula eucariótica,
incluyendo células de levaduras (tales como, por ejemplo,
Pichia, particularmente Pichia pastoris (véanse las
patentes de Estados Unidos números 4.882.279, 4.837.148, 4.929.555 y
4.855.231), Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis,
Hansenula polymorpha, y otras células de levaduras), se
prefieren actualmente sistemas de expresión de mamíferos, incluyendo
sistemas comercialmente disponibles y otros de tales sistemas
conocidos por los expertos en la técnica, para la expresión de ADN
que codifica las subunidades de nAChR nicotínico neuronal humano
proporcionados en esta memoria descriptiva. Se prefieren oocitos de
Xenopus para la expresión de transcripciones de ARN del
ADN.
El ADN de longitud completa clonado que codifica
cualquiera de las subunidades del nAChR nicotínico neuronal humano
se puede introducir en un vector de plásmido para la expresión en
una célula eucariótica. Tal ADN puede ser ADN genómico o ADNc. Las
células hospedadoras se pueden transfectar con uno o combinación de
plásmidos, cada uno de los cuales codifica al menos una subunidad de
nAChR nicotínico neuronal humano. El ADN heterólogo se puede
mantener en la célula en forma de un elemento episomal o se puede
integrar en ADN cromosómico de la célula.
Las células eucarióticas en las que ADN o ARN se
pueden introducir incluyen cualesquiera células que son
transfectables mediante tal ADN o ARN o en el que tal ADN o ARN se
puede inyectar. Las células preferidas son aquellas que se pueden
trasnfectar de manera transitoria o de manera estable y también
expresa el ADN o ARN. Las células más preferidas actualmente son
aquellas que pueden formar los nAChR nicotínico neuronal humano
recombinantes o heterólogos que contienen una o más subunidades
codificadas por el ADN ehterólogo. Tales células se pueden
identificar empíricamente o seleccionarse entre aquellas que se sabe
que se transfectan o inyectan fácilmente.
Las células ejemplares para introducir ADN
incluyen, pero no se limitan a, células de origen mamífero (por
ejemplo, células COS, células L de ratón, células de ovario de
hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano (HEK),
células GH3 y otras de tales células conocidas por los expertos en
la técnica, células de anfibio (por ejemplo, oocitos de Xenopus
laevis) y células de levaduras (por ejemplo, Saccharomyces
cerevisiae, Pichia pastoris). Las células ejemplares para
expresar transcripciones de ARN inyectado incluyen oocitos de
Xenopus laevis. Las células que se prefieren para la
transfección de ADN son conocidas por los expertos en la técnica o
se pueden identificar empíricamente, e incluyen células HEK 293 (que
están disponibles de ATCC bajo número de acceso CRL 1573); células
Ltk (que están disponibles de ATCC número de acceso CCL 1.3);
células COS-7 (que están disponibles de ATCC número
de acceso CRL 1651); y células GH3 (que están disponibles de ATCC
número de acceso CCL 82.1). Actualmente las células preferidas
incluyen células GH3 y células HEK 293 que se han adaptado para
crecer en suspensión y que se pueden congelar en nitrógeno líquido y
después descongelarse y volver a desarrollarse. Las células HEK 293
se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Nº
5.024.939 de Gorman (véase, también, Stillman y col., (1985) Mol.
Cell Biol. 5: 2051-2060).
El ADN se puede incorporar de manera estable en
las células o se puede introducir de manera transitoria usando
procedimientos conocidos en al técnica. Las células de mamífero
transfectadas de manera estable se pueden preparar transfectando
células o bien con una o más construcciones de expresión que llevan
ADN que codifica subunidades de nAChR y un vector de expresión
separado que lleva un gen marcador seleccionable (por ejemplo, pero
sin limitación, el gen para resistencia a neomicina, resistencia a
zeomicina, o resistencia a higromicina) o con una o más
construcciones de expresión que llevan el ADN que codifica la
subunidad de nAChR y el marcador seleccionable, y desarrollar las
células transfectadas en condiciones selectivas para las células que
expresan el gen(es) marcador(es). Para producir tales
células, la células se deben transfectar con una concentración
suficiente de ácidos nucleicos que codifican subunidades para formar
los nAChRs neuronales humanos que contienen las subunidades humanas
codificadas por ADN heterólogo. Las cantidades precisas de
relaciones de ADN que codifica las subunidades se pueden determinar
y optimizar empíricamente para una combinación particular de
subunidades, células y condiciones de ensayo. Las células
recombinantes que expresan nAChR neuronal que contienen subunidades
codificadas solamente por el ADN o ARN heterólogo se prefieren de
manera especial.
\newpage
En esta memoria descriptiva se proporcionan
proteínas sustancialmente puras de subunidades de nAChR
\alpha_{6} humano. También se proporcionan en esta memoria
descriptiva nAChR recombinante que contiene al menos proteínas de
subunidades de nAChR \alpha_{6} humano. De esta manera, una
realización adicional proporcionada en esta memoria descriptiva
contiene procedimientos de producción de subunidades de nAChR humano
recombinante y receptores que contienen las subunidades.
En las realizaciones preferidas, ADN que codifica
subunidad(es) de nAChR humano, particularmente subunidades
\alpha_{6} de nAChR humano y opcionalmente \beta_{3}, se
liga en un vector, y al construcción resultante se introduce en
células hospedadoras adecuadas para producir líneas celulares
transformadas que expresan un subtipo de receptor de nAChR neuronal
humano específico, o combinaciones específicas de subtipos. Las
líneas celulares resultantes se pueden después producir en cantidad
para análisis cuantitativo reproducible de los efectos sobre al
función receptora. En otras realizaciones, el ARNm se puede producir
mediante transcripción in vitro de ADN que codifica cada
subunidad. Este ARNm, o bien a partir de un único clon de subunidad
o a partir de una combinación de clones, se puede después inyectar
en oocitos de Xenopus en los que el ARNm dirige la síntesis
de las subunidades de los receptores humanos, que después forman
receptores funcionales. Como alternativa, el ADN que codifica
subunidades se puede inyectar directamente en oocitos para la
expresión de receptores funcionales. Las células de mamífero
transfectadas u oocitos inyectados
se pueden usar después en los procedimientos de selección de fármacos proporcionados en esta memoria descriptiva.
se pueden usar después en los procedimientos de selección de fármacos proporcionados en esta memoria descriptiva.
Las células recombinantes resultantes se pueden
cultivar o subcultivar para subcultivar, en el caso de células de
mamíferos) a partir de tal cultivo o un subcultivo del mismo. Los
procedimientos para transfección, inyección y cultivo de células
recombinantes los conocen los expertos en la técnica. De manera
similar, las subunidades de nAChR nicotínico neuronal humano se
pueden purificar usando procedimientos de purificación de proteína
conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, anticuerpos u
otros ligandos que específicamente se unen a uno o más de las
subunidades se pueden usar para la purificación por afinidad de la
subunidad o los nAChR neuronales que contienen las subunidades.
De acuerdo con una realización, también se
proporcionan procedimientos para producir células que expresan
subunidades de nAChR neuronal humano y receptores funcionales. En
uno de tales procedimientos, las células hospedadoras se transfectan
con ADN que codifica al menos una subunidad alfa de un nAChR
neuronal y al menos una subunidad beta de v neuronal. Usando
procedimientos tales como análisis de transferencia Northern o
transferencia en ranura, se pueden seleccionar las células
transfectadas que contienen ADN o ARN que codifican las subunidades
alfa y/o beta. Las células transfectadas también se analizan para
identificar las que expresan proteína de nAChR. Los análisis de
pueden llevar a cabo, por ejemplo, midiendo la capacidad de als
células para unirse a acetilcolina, nicotina, o un agonista de
nAChR, comparado con la capacidad de unión a nicotina de células
hospedadoras no transfectadas u otras células de control adecuadas,
o mediante control electrofisiológico de las corrientes a través de
la membrana celular en respuesta a un agonista de nAChR.
En aspectos particularmente preferidos, se
proporcionan células eucarióticas que contienen ADN heterólogo,
expresan tal ADN y forman nAChR(s) neuronal(es)
funcional (es) recombinante(s). En aspectos más preferidos,
la actividad de nAChR neuronal recombinante se determina fácilmente
debido a que es un tipo que está ausente de al célula hospedadora
transfectada o es de una magnitud no mostrada en la célula no
transfectada. Tales células que contienen receptores recombinantes
se pueden preparar, por ejemplo, causando células transformadas con
ADN que codifica las subunidades \alpha_{6} y \beta_{3} de
nAChR nicotínico neuronal humano que expresan las correspondientes
proteínas en presencia o ausencia de una o más subunidades de nAChR
alfa y/o beta. El receptor recombínate sintético o recombinante
contendría las subunidades \alpha_{6} y \beta_{3} de nAChR.
Tal receptor debe útil para una diversidad de aplicaciones, por
ejemplo,como parte de un sistema de ensayo libre de interferencias
presentes frecuentemente en sistemas de ensayo de la técnica
anterior que emplean receptores no humanos o preparaciones de tejido
humanos. Además, el ensayo de subunidades receptoras individuales
con una diversidad de agonistas o antagonistas potenciales
proporcionaría información adicional con respecto a la función y
actividad de las subunidades individuales. Tal información puede
conducir a la identificación de compuestos que son capaces de
interacción muy específica con una o más de las subunidades
receptoras. Tal especificidad puede resultar de gran valor en
aplicación médica.
De este modo, el ADN que codifica una o más
subunidades de nAChR neuronal humana se puede introducir en células
hospedadoras adecuadas (por ejemplo, células eucarióticas o
procarióticas) para la expresión de subunidades individuales y los
nAChR funcionales. Preferiblemente las combinaciones de subunidades
alfa y beta se pueden introducir en las células: tales combinaciones
incluyen combinaciones de una cualquiera o más de \alpha_{2},
\alpha_{3}, \alpha_{4}, \alpha_{5}, \alpha_{6} y
\alpha_{7} con \beta_{2}, \beta_{3} y/o \beta_{4}.
La información de secuencias para cada una de estas subunidades se
presenta en el listado de secuencias proporcionado con el presente
documento. La información de secuencias para \alpha_{5} también
se presenta en Proc. natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:
1572-1576; la información de secuencias para
\alpha_{2}, \alpha_{3}, \alpha_{4}, \alpha_{7},
\beta_{2} y \beta_{4} también se presenta en la publicación
PCT WO 94/20617. Las combinaciones preferidas actualmente de las
subunidades incluyen \alpha_{6} y opcionalmente \beta_{3}
con uno o más de \alpha_{2}, \alpha_{3}, \alpha_{4},
\alpha_{5}, \beta_{2} o \beta_{4}. Se reconoce que
alguna de las subunidades pueden tener función de transporte de
iones en ausencia de subunidades adicionales, mientras otras
requieren una combinación de de dos o más subunidades con el fin de
mostrar la función de transporte de iones. Por ejemplo, la subunidad
\alpha_{7} es funcional en ausencia de cualquier subunidad beta
añadida. Además, alguna de las subunidades puede no formar nAChR
funcionales solos o en combinación, pero en su lugar puede modular
las propiedades de otras combinaciones de subunidades de nAChR.
En ciertas realizaciones, las células
eucarióticas con nAChR neuronales humanos heterólogos se producen
introduciendo en las células una primera composición, que contiene
al menos una transcripción de ARN que se traduce en la célula en una
subunidad de un v neuronal humano. En realizaciones preferidas, las
subunidades que se traducen incluyen una subunidad alfa de nAChR
neuronal humano. Más preferiblemente, la composición que se
introduce contiene una transcripción de ARN que codifica una
subunidad alfa y también contiene una transcripción de ARN que
codifica una subunidad beta de un nAChR neuronal humano. Las
transcripciones de ARN se pueden obtener a partir de las células
transfectadas con ADN que codifican subunidades de nAChR neuronal
humano o mediante transcripción in vitro de ADN que codifican
subunidades. Los procedimientos para la transcripción in
vitro de ADN clonado e inyección del ARNm resultante en células
eucarióticas se conocen bien en la técnica. Los oocitos de anfibio
se prefieren particularmente para la expresión de transcripciones
in vitro de clones del ADN de nAChR neuronal humano. Véase,
por ejemplo, Dascal (1989) CRC Crit. Rev. Biochem. 22:
317-387, para una revisión del uso de oocitos de
Xenopus para estudiar canales iónicos.
De este modo, es posible una introducción por
etapas en las células de ADN o ARN que codifica uno o más subtipos
alfa, y uno o más subtipos beta. Las células resultantes se pueden
ensayar mediante los procedimientos proporcionados en esta memoria
descriptiva o son conocidos por los expertos en la técnica para
detectar la actividad de nAChR funcional. Tal ensayo permitirá la
identificación de combinaciones de subtipos de subunidades alfa y
beta que producen nAChR funcionales, así como subunidades
individuales que producen nAChR funcionales.
Los receptores recombinantes sobre superficies de
células eucarióticas pueden contener una o más subunidades
codificadas por el ADN o ARNm que codifica subunidades de nAChR
neuronal humano, o pueden contener una mezcal de subunidades
codificadas por la célula hospedadora y subunidades codificadas por
ADN o ARN heterólogo. Los receptores recombinantes pueden ser
homogéneos o pueden ser una mezcla de subtipos. Las mezclas de ADN o
ARNm que codifican receptores de diversas especies, tales como ratas
y seres humanos, también se pueden introducir en las células. De
este modo, una célula se puede preparar que exprese los receptores
recombinantes que contienen solamente subunidades \alpha_{6} y
\beta_{3}, o en combinación con cualquier subunidad alfa y beta
proporcionadas en esta memoria descriptiva. Por ejemplo, cualquiera
o ambas de las subunidades \alpha_{6} y \beta_{3}
proporcionadas en esta memoria descriptiva se pueden coexpresar con
las subunidades de los receptores \alpha_{2}, \alpha_{3},
\alpha_{4}, \alpha_{5}, \alpha_{7}, \beta_{2}, y/o
\beta_{4}. Como se ha indicado anteriormente, alguno a de las
subunidades de nAChR neuronal puede ser capaz de formar receptores
funcionales en ausencia de otras subunidades, de este modo la
coexpresión no se requiere siempre para producir receptores
funcionales. Además, algunas de las subunidades de nAChR pueden
requerir la coexpresión con dos o más subunidades de nAChR que
participan en receptores funcionales.
De acuerdo con una realización proporcionada en
esta memoria descriptiva, las células de mamífero que expresan nAChR
neuronal humano u oocitos se pueden poner en contacto con un
compuesto de ensayo, y el (los) efectos modulador(es) del
mismo se pueden después evaluar comparando la respuesta mediada por
nAChR en presencia y ausencia del compuesto de ensayo, o comparando
la respuesta mediada por nAChR de células de ensayo, o células
control para la presencia del compuesto.
Como entienden los expertos en la técnica,
procedimientos de ensayo para identificar compuestos que modulan la
actividad de nAChR neuronal humano (por ejemplo, agonistas y
antagonistas) generalmente requieren comparación con un control.
Como se ha indicado anteriormente, un tipo de una célula
"control" o cultivo "control" es una célula o cultivo que
trata sustancialmente la misma que la célula o cultivo control
expuesto al compuesto de ensayo, excepto que el cultivo control no
se expone al cultivo de ensayo. Por ejemplo, en procedimientos que
usan procedimientos electrofisiológicos de corrección de tensión, la
misma célula se puede ensayar en presencia y ausencia del compuesto
de ensayo, solamente cambiando la solución externa que baña la
célula. Otro tipo de célula de "control" o cultivo de
"control" puede ser una célula o un cultivo de células que son
idénticas a las células transfectadas, excepto que las células
empleadas para el cultivo de control no expresan los nAChR
neuronales humanos. En esta situación, la respuesta de la célula de
ensayo al compuesto de ensayo se compara con la respuesta (o
carencia de respuesta) de la célula receptor - negativa (control) al
compuesto de ensayo, cuando las células o cultivos de cada tipo de
célula se exponen a sustancialmente las mismas condiciones de
reacción en presencia del compuesto que se está ensayando.
Los nAChR neuronales humanos recombinantes
incluyen al menos una subunidad alfa, o al menos una subunidad alfa
y una subunidad beta de un nAChR neuronal humano. Las células
eucarióticas que expresan estas subunidades se han preparado
mediante inyección de transcripciones de ARN y mediante transfección
de ADN. Tales células han mostrado actividad de nAChR atribuible a
los nAChR neuronales humanos que contienen una o más de las
subunidades de nAChR neuronal humano heterólogo.
Con respecto a la medición de la actividad de los
nAChR neuronales humanos heterólogos, la actividad de nAChR endógeno
y, si se desea, actividad de los nAChRs que contienen una mezcla de
subunidades de células hospedadoras endógenas y subunidades
heterólogas, si es posible, deben inhibirse hasta un grado
significativo mediante medios químicos, farmacológicos y
electrofisiológicos.
\newpage
También se proporcionan en esta memoria
descriptiva anticuerpos generados contra las subunidades de nAChR
descritas anteriormente. Tales anticuerpos se pueden emplear para
determinar la localización del tejido receptor, composición del
subtipo, estructura de los dominios funcionales, purificación de
receptores, así como en aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas.
Preferiblemente para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos
empleados serán anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos descritos anteriormente se pueden
preparar empleando técnicas convencionales, como conocen los
expertos en la técnica, usando las proteínas de subunidades de
nAChR, o porciones de las mismas, descritas en esta memoria
descriptiva como antígenos para la producción de anticuerpos. Se
pueden usar tanto anticuerpos de proteínas anti péptico y anti
fusión [véase, por ejemplo, Bahouth y col., (1991) Trends
Pharmacol. Sci. 12: 338-343; Current
Protocols in Molecular Biolgy (Ausubel y col., eds.), John Wiley and
Sons, Nueva York (1989)]. Los factores a considerar en la
selección de porciones de las subunidades de nAChR para uso como
inmunógeno (como o bien un péptido sintético o una proteína de
fusión bacteriana producida de manera recombinante) incluyen
antigenicidad, accesibilidad (es decir, dominios extracelulares y
citoplásmico), unicidad para el subtipo particular, y otros factores
conocidos por los expertos en esta técnica.
La disponibilidad de los anticuerpos específicos
de subtipos hace posible la aplicación de la técnica de
inmunoquímica para controlar la distribución y densidad de expresión
de diversos subtipos (por ejemplo, en tejido cerebral normal frente
a enfermo). Los anticuerpos producidos usando las subunidades de
nAChR humano como inmunógenos tienen, entre otras propiedades, la
capacidad de unirse específicamente y preferentemente a y/o provocar
la inmunoprecipitación de nAChR humano o una subunidad del mismo que
puede estar presente en una muestra biológica o una solución
derivada de tal muestra. Tales anticuerpos también se pueden usar
para aislar selectivamente células que expresan nAChR humano que
contienen la subunidad para la que los anticuerpos son específicos.
Tales anticuerpos también se podrían emplear para aplicaciones de
diagnóstico y terapéuticas. En una realización adicional, se
proporcionan procedimientos para modular la actividad de los canales
iónicos de los nAChR poniendo en contacto los receptores con una
cantidad eficaz de los anticuerpos descritos anteriormente.
Los anticuerpos en esta memoria descriptiva se
pueden administrar a un sujeto que emplea procedimientos
convencionales, tales, como por ejemplo, mediante inyección
intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, o subcutánea, implante
o modos transdérmicos de administración. Los expertos en la técnica
pueden fácilmente determinar las formas de dosis, regímenes de
tratamiento, etc., dependiendo del modo de administración
empleado.
Los siguientes ejemplos se incluyen pata
propósitos ilustrativos solamente.
Ejemplo
1
Una librería de ADNc de sustancia nigra humana
(Clontech Laboratories, Inc) se seleccionó para hibridación a un
fragmento del ADN de la subunidad \alpha_{6} de nAChR de rata.
Las placas aisladas se transfirieron a filtros de nitrocelulosa y la
hibridación se realizó en 5 X de Denhardt, 5 X de SSPE, formamida al
50%, 200 21% a 42ºC. Los lavados se realizaron en 0,2 X de SSPE,
SDS al 0,2%, a 60ºC.
Se purificaron en placa cinco clones de
hibridación y se caracterizaron mediante mapeo de endonucleasa de
restricción y análisis e secuencia de ADN. La secuencia de ADN de
los extremos 5' y 3' de las inserciones de ADNc se determinó usando
cebadores de oligonucleótidos directos e inverso \lambdagt10
disponibles. El análisis de la secuencia de ADN de cinco inserciones
de ADNc reveló que tres clones contenían el codón de inicio de
traducción, una fase abierta de lectura de \alpha_{6} de
longitud completa (nucleótidos 143-1624 de la SEC ID
Nº 9), el codón de parada traduccional y 142 nucleótidos adicionales
de 5' y 116 nucleótidos de las secuencias flanqueantes en 3'. La
secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos del
clon de longitud completa tiene aproximadamente 82% de identidad con
la secuencia de aminoácidos deducida a partir del ADN de la
subunidad \alpha_{6} de nAChR. Varias regiones de las secuencias
de aminoácidos de \alpha_{6} humana y de rata son notablemente
disimilares:
los aminoácidos 1-30 (la
secuencia señal humana tiene solamente aproximadamente 56% de
identidad con respecto a la secuencia de rata),
los aminoácidos 31-50 (la
secuencia señal humana tiene solamente aproximadamente 70% de
identidad con respecto a la secuencia de rata),
los aminoácidos 344-391 (la
secuencia señal humana tiene solamente aproximadamente 40% de
identidad con respecto a la secuencia de rata),
los aminoácidos 401-428 (la
secuencia señal humana tiene solamente aproximadamente 64% de
identidad con respecto a la secuencia de rata).
Además, el ADN de inserción de un único clon.
KE\alpha6,5, se determinó que era perdiendo 45 nucleótidos de la
secuencia que codifica \alpha_{6}, dando como resultado una
supresión de la fase de 25 residuos de aminoácidos de la secuencia
de aminoácidos deducida (residuos 74 a 88 de la SEC ID Nº 10). La
secuencia de nucleótidos de una variante de la subunidad
\alpha_{6} que carece de esta secuencia se muestra en la SEC ID
Nº 19, y la secuencia de aminoácidos deducida de la misma se muestra
en la SEC ID Nº 20. De manera interesante, la secuencia de
aminoácidos deducida inmediatamente cadena abajo del sitio de la
supresión comparte solamente aproximadamente 58% de la identidad de
aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de \alpha_{6} de
rata (aminoácidos 89-100 de la SEC ID Nº 10).
Ejemplo
2
Una librería de ADNc de sustancia nigra humana
(Clontech Laboratories, Inc) se seleccionó para hibridación a
oligonucleótidos sintéticos complementarios al ADNc de la subunidad
\beta_{3} de nAChR de rata. Las placas aisladas se transfirieron
a filtros de nitrocelulosa y la hibridación se hibridaron en
condiciones de alta rigurosidad con respecto a oligonucleótidos
(condiciones de lavado 1 X de SSPE, SDS al 0,2% a 50ºC) con
oligonucleótidos sintéticos complementarios a las secuencias del
ADNc de al subunidad de nAChR \beta_{3} que incluía los
nucleótidos 212-230 y 1442-1469 de
la SEC ID Nº 15.
Dos clones de hibridación se purificaron por
placa y se caracterizaron mediante mapeo por endonucleasa de
restricción. La secuencia de ADN de los extremos 5' y 3' de la
inserción de ADN se determinó usando cebadores de oligonucleótidos
T7 y SP6 disponibles. Se determinó la secuencia completa del clon
KB\beta3.2. El clon KB\beta3.2. contiene una inserción de ADNc
de 1927 pares de bases que contiene una fase abierta de lectura de
1.377 nucleótidos que codifica una subunidad de nAChR \beta_{3}
de longitud completa (nucleótidos 98-1471 de la SEC
ID Nº 15) así como 97 nucleótidos de 5' y 454 nucleótidos de la
secuencia no traducida en 3'. La secuencia de aminoácidos en 3'. La
secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos del
clon de longitud completa tiene aproximadamente 81% de identidad con
la secuencia de aminoácidos deducida del SADN de la subunidad
\beta_{3} de nAChR nicotínico de rata. Varias regiones de las
secuencias de aminoácidos \beta_{3} de rata y humana son
notablemente disimilares:
los aminoácidos 1-28 (la
secuencia señal humana tiene solamente aproximadamente 25% de
identidad con respecto a la secuencia de rata),
los aminoácidos 347-393 (la
secuencia señal humana tiene solamente aproximadamente 55% de
identidad con respecto a la secuencia de rata),
los aminoácidos 440-464 (la
secuencia señal humana tiene solamente aproximadamente 68% de
identidad con respecto a la secuencia de rata),
Ejemplo
3
Los ADNc que codifican subunidades de nAChR
neuronal humano se incorporaron en vectores para uso en la expresión
de las subunidades en células hospedadoras de mamíferos y para uso
en la generación in vitro de transcripciones de los ADN que
se expresan en oocitos de Xenopus. Los siguientes vectores se
utilizaron en la preparación de construcciones.
Un fragmento EcoRI de 1743 pares de bases,
que codifica la subunidad \alpha_{6} de nAChR humano, se aisló a
partir de KE\alpha6.3 mediante procedimientos convencionales y se
ligaron en el sitio de poliengarce EcoRI del vector pcDNA3 para
generar pcDNA3-KE\alpha6.3 (véase la figura 1). El
plásmido pcDNA3 (véase al figura 1) es un vector basado en pUC19 que
contiene un promotor/potenciador de CMV, un promotor de la ARN
polimerasa del ARN del bacteriófago T7 posicionado cadena debajo del
promotor/potenciador de CMV, una señal de poliadenilación de la
hormona de crecimiento bovina (BGH) cadena abajo del promotor de T7,
y un poliengarce entre el promotor de T7 y al señal de
poliadenilación de la BGH. Este vector de esta manera contiene todos
los elementos reguladores requeridos para la expresión en una célula
hospedadora de mamífero de ADN heterólogo que se ha incorporado en
el vector al poliengarce. Además, debido a que el promotor de T7 se
localiza justo cadena arriba del poliengarce, este plásmido se puede
usar para al síntesis de las transcripciones in vitro de ADn
heterólogo que se ha subclonado en el vector del poliengarce.
Además, este plásmido contiene un gen que codifica la resistencia a
neomicina usado como un marcador seleccionable durante la
transfección.
La figura 1 también muestra un mapa de
restricción parcial de pcDNA3-KE\alpha6.3.
La expresión de la subunidad \alpha_{6} de
nAChR se optimizó mediante la introducción de un sitio de unión a
ribosoma de consenso [RBS; véase, por ejemplo, Kozak (1991) J.
Biol. Chem. 266: 19867-19870] antes del
del codón de partida traduccional. La región no traducida en 5'
existente se modificó mediante mutagénesis de PCR usando el plásmido
pcDNA3-KE\alpha6.3 como molde de ADN y un
oligonucleótido cadena arriba complementario que contiene las
sustituciones de RBS de nucleótidos apropiados así como los sitios
flanqueantes 5' HindIII y EcoRI, y un oligonucleótido
complementario a las secuencias que codifican \alpha_{6} de
aproximadamente 450 nucleótidos cadena abajo del codón de partida
traduccional. El producto de amplificación resultante contenía los
sitios HindIII y EcoRI seguido de RBS de consenso y
los nucleótidos 1-459 de la secuencia que codifica
\alpha_{6} de nAChR (nucleótidos 143-602 de la
SEC ID Nº 9). El ADN amplificado se digirió con HindIII y
BamHI; el fragmento HindIII y BAMRI de 308
pares de bases se aisló y se ligó con el fragmento
BamHI-PvuI de 6,3 miles de bases de
pcDNA3-KE\alpha6.3 y PvuI de 1,4 miles de
pases al fragmento HindIII de pcDNA3 para generar el plasmido
pcDNA3-KE\alpha6RBS de aproximadamente 7,0 miles
de bases.
Un fragmento EcoRI de aproximadamente 2,0
miles de bases, que codifica una subunidad \beta_{3} de AChR, se
aisló a partir de KB\beta3.2 mediante procedimientos
convencionales y se ligó en el sitio de poliengarce EcoRI del vector
pcDNA3 para generar pcDNA3-KB\beta3.2 (véase al
figura 2). La figura 2 también muestra un mapa de restricción
parcial de pcDNA3.KB\beta3.2.
La expresión de la subunidad \beta_{3} de
nAChR nicotínico humano se optimizo mediante la introducción de un
sitio de unión de ribosoma de consenso (RBS) antes del codón de
partido traduccional. La región no traducida en 5' se modifica
mediante mutagénesis de PCR usando un procedimiento similar la
descrita anteriormente para la subunidad de nAChR \alpha6 para
generar pcDNA3-KB\beta3BS.
Ejemplo
4
Oocitos de Xenopus se inyectaron con
transcripciones in vitro preparados a partir de
construcciones que contienen ADN que codifica las subunidades
\alpha_{6} y \beta_{3}. Las mediciones electrofisiológicas
de las corrientes de transmembrana de oocitos se realizaron usando
la técnica de corrección de tensión de dos electrodos (véase, por
ejemplo, Stuhmer (1992) Meth. Enzymol. 207:
310-339).
Las transcripciones rematadas recombinantes de
pcDNA3-KE\alphaRBS y
pcDNA3-KB\betaRBS se sintetizan a partir de
plásmidos linealizados usando el kit de transcripción in vitro
mMessage y mMachine de acuerdo con el protocolo de transcripción
rematada proporcionado por el fabricante (nº de catálogo 1344 de
AMBION, Inc., Austin, TX). La masa de las transcripciones
sintetizadas se determina mediante la absorbancia de UV y la
integridad de las transcripciones se determina por electroforesis a
través de un gel de agarosa.
Oocitos de Xenopus se inyectan con o bien
12,5, 50 ó 125 ng de una o más transcripciones de las subunidades
\alpha y \beta por oocito. La preparación e inyección de oocitos
se lleva a cabo como describe Dascal (1987) en Crit. Rev.
Biochem. 22: 317-387. Dos a seis días después de
la inyección de ARNm, los oocitos se examinan usando la técnica de
corrección de tensión de dos electrodos. Las células de bañan en
solución Ringer (NaCl 115 mM, KCl 2,5 mM, CaCl_{2} 1,8 mM, HEPES
10 mM, pH 7,3) que contiene atropina 1 \muM con o sin
d-tubocurarina 100 \muM. Las células son
corregidas de tensión a -60 a -80 mV. Los datos se adquieren con el
software Axotape a 2-5 Hz. Los agonistas
acetilcolina (ACh) nicotina, y citisina se añaden a concentraciones
que varían entre 0,1 \muM y 100 \muM.
Ejemplo
5
Células 293 de riñón embrionario humano (HEK) se
transfectar de manera transitoria y estable con ADN que codifica
subunidades \alpha_{6} y \beta_{3}. Los transfectantes
transitorios se analizan para evaluar la expresión de nAChR
nicotínico usando diversos ensayos, por ejemplo, procedimientos
electrofisiológicos, ensayos basados en indicador fluorescente
sensible a Ca^{2+}.
Las células HEK son transitoriamente
cotransfectadas con ADN que codifica una o mas subunidades \alpha
y/o una o más subunidades \beta. Aproximadamente 2 x 10^{6}
células HEK se transfectan de manera transitoria con 10 \mug del
(de los) plásmido(s) indicado de acuerdo con los
procedimientos de transfección de CaPO_{4} convencioanles (Wigler
y col., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76:
1373-1376) o usando lipofectamina de acuerdo con las
instrucciones del fabricante (Bethesda Research Laboratory (BRL),
Gaithersburg, MD). Además, se contransfectan 2 \mug del plásmido
pCMV\betagal (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA), que contiene
el gen de la \beta-galactosidasa de Escherichia
coli condensado a al promotor de CMV, como un gen indicador para
controlar la eficacia de la transfección. Los transfectantes se
analizan para evaluar la expresión de
\beta-galactosidasa [Miller (1972) Experiments
in Molecular Genetics, p. 352-355, Cold Spring
Harbor Press]. Los transfectantes también se pueden analizar para
evaluar la expresión de la \beta-galactosidasa
mediante tinción directa del producto de una reacción que implica la
\beta-galactosidasa y el sustrato
X-gal [Jones (1986) EMBO 5:
3133-3142].
Se transfectan células HEK usando el
procedimiento de transfección de fosfato de calcio (Current
Protocols in Molecular Biology, Vol 1, Wiley Inter Science,
Supplement 14, Unit 9.1.1-9.1.9 (1990)). Las células
HEK se transfectan con 1 ml de ADN/precipitado con fosfato de calcio
que contiene el ADN que codifica las subunidades alfa y beta
deseadas y pSV2neo (como marcador seleccionable). Después de 14 días
de crecimiento en medio que contiene 1 \mug/ml de G418, se forman
colonias y se aislan individualmente usando cilindros de clonación.
Los aislados se someten a dilución limitante y se seleccionan para
identificar la que expresan el nivel más alto de nAChR, como se
describe más adelante.
Ejemplo
6
Las líneas celulares recombinantes generadas
mediante transfección con ADN que codifica subunidades de nAChR
neuronal humano, tales como las descritas en el ejemplo 5, se pueden
caracterizar adicionalmente usando uno o más de los procedimientos
siguientes.
El ARN total se aisla a partir de aproximadamente
1 x 10 7 células y 10-15 \mu g de ARN de cada tipo
de célula se usa para análisis de hibridación de transferencia de
Northern o de ranura. Las inserciones de plásmidos que codifican
nAChR neuronal humano se pueden marcar por desplazamiento de mella
y usar como sonda. Además, un fragmento de secuencia génica de la
glicerilaldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPD) (Tso y col., (1985) Nucleic Acids Res.
13: 2485) se puede marcar por desplazamiento de mella y usar
como una sonda control sobre filtros duplicados para confirmar la
presencia o ausencia de ARN sobre cada transferencia y proporcionar
un estándar bruto para uso en la cuantificación de diferencias en
niveles de ARNm específicos de \alpha- o \beta- entre líneas
celulares. La hibridación por transferencia Northern o de ranura
típica y condiciones de lavado son como siguen:
hibridación en 5 X de SSPE, 5 X de solución
Denhardt, SSDS al 0,2%, 200 \mug/ml de ADN de arenque
desnaturalizado, sonicado, formamida al 50>%, a 42ºC seguido de
lavado en 0,1 X de SSPE, SDS al 0,1%, a 65ºC.
Líneas celulares generadas mediante transfección
con ADN que codifica las subunidades \alpha- o \beta- de nAChR
neuronal humano se pueden analizar para evaluar su capacidad de
unirse a nicotina u otro agonista, por ejemplo, cuando se compara
con líneas celulares control: por ejemplo, líneas celulares PC12
derivadas neuronalmente (Boulter y col., Nature 319:
368-374; ATCC nº CRL 1721) e IMR32 (Clementi, y
col., (1986) Int. J. Neurochem. 47: 291-297;
ATCC nº CCL 127), y la línea celular BC3H1 derivada de músculo
(Patrick y col., (1977) J. Biol. Chem. 252:
2143-2153). Células control negativas (es decir,
células hospedadoras a partir de la que se prepararon
transfectantes) se incluyen también en el ensayo. El ensayo se lleva
a cabo como sigue:
Justo antes de ensayarse, las células
transfectadas se retiran de las placas mediante raspado. Las células
de control positivo son PC12, BC3H1, e IMR32 (a las que se habían
desprovisto de nutriente se medio reciente durante siete días). Las
líneas celulares de control se retiraron enjuagando en tampón de
ensayo a 37ºC (Tris/HCl 50 mM, Mg Cl_{2} 1 mM, CaCl_{2} 2 mM,
NaCl 120 mM, EDTA 3 mM, 2 mg/ml de BSA y aprotinina al 0,1% a pH
7,4). Las células se lavan y se vuelven a suspender hasta una
concentración de 1 x 10^{6}/250 \mul. A cada tubo de ensayo de
plástico se añaden 250 \mul de la solución de células,
^{3}H-nicotina 15 nM, con o sin nicotina no
marcada 1 mM, y tampón de ensayo para completar un volumen final de
500 \mul. Los ensayos para las líneas celulares transfectadas se
incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente; los ensayos se
las células de control positivo se incuban durante 2 minutos a 1ºC.
Después del tiempo de incubación apropiado, se filtran alícuotas de
450 \mul de volumen de ensayo a través de filtros de Whatman
GF/fibra de vidrio que se había pretratado mediante incubación en
polietilenimina al 0,05% durante 24 horas a 4ºC. Los filtros después
de lavan dos veces, con 4 ml cada lavado, con tampón de ensayo
enfriado en hielo. Después de lavar, se secan los filtros, se añaden
a viales que contienen 5 ml de fluido de centelleo y se mide
la
radiactividad.
radiactividad.
La capacidad de agonistas y antagonistas de
nicotina o de nAChR para mediar el influjo de ^{86}Rb en células
de control y transfectadas se ha encontrado que proporcionan una
indicación de la presencia de nAChR funcionales sobre al superficie
celular. El ensayo de flujo de innoves ^{86}Rb se lleva a cabo
como sigue:
1. La noche antes del experimento, se siembran
células a 2 x 106 por pocillo (es decir, 2 ml por pocillo) en una
placa recubierta con polilisina de 6 pocillos.
2. Se decanta el medio de cultivo y se lava la
placa con 2 ml de tampón de ensayo (HEPES 50 mM, sacarosa 260 mM,
KCl 5,4 mM, CaCl_{2}1,8 mM, MgSO_{4} 0,8 mM, glucosa 5,5 mM) a
temperatura ambiente.
3. Se decanta el tampón de ensayo y 1 ml de
tampón de ensayo, que contiene 3 \muCi/ml de ^{86}Rb, con
ouabaína 5 mM y se añade agonista o antagonista en una concentración
para efectuar una respuesta máxima respuesta.
4. La placa se incuba sobre hielo a 1ºC durante 4
minutos.
5. El tampón se decanta en un recipiente y cada
pocillo se lavó con 3 ml de tampón de ensayo, seguido de dos lavados
de 2 ml cada uno.
6. Las células se lisan con 2 x 0,5 ml de SDS al
0,2% por pocillo y se transfieren a un vial de centelleo que
contiene 5 ml de fluido de centelleo.
7. La radiactividad contenida en cada vial de 5
ml se mide y los datos se calculan. En este ensayo las células de
control positivo proporcionaron los datos siguientes:
| PC12 | IMR32 | |||
| CE_{50} | Respuesta máxima | CE_{50} | Respuesta máxima | |
| Agonista | ||||
| Nicotina | 52 \muM | 2,1X^{a} | 18 \muM | 7,7X^{a} |
| CCh * | 35 \muM | 3,3X^{b} | 230 \muM | 7,6X^{c} |
| Citisina | 57 \muM | 3,6X^{d} | 14 \muM | 10X^{e} |
| Antagonista | ||||
| d-tubocurarina | 0,81 \muM | 2,5 \muM | ||
| mecamilamina | 0,42 \muM | 0,11 \muM | ||
| hexametonio | nd f | 2 \muM | ||
| atropina | 12,5 \muM | 43 \muM | ||
| * CCh = carbamicolina | ||||
| ^{a} nicotina 200 \muM | ||||
| ^{b} CCh 300 \muM | ||||
| ^{c} CCh 3 mM | ||||
| ^{d} citisina 1 mM | ||||
| ^{e} citisina 100 \muM | ||||
| ^{+}nd = no determinada |
Las mediciones electrofisiológicas se pueden usar
para determinar la actividad de receptores recombinantes o para
determinar la capacidad de un compuesto de ensayo a potenciar,
antagonizar o de otra manera modular la magnitud y duración del
flujo de cationes a través de nAChR recombinante activado por
ligando. La función de nAChR neuronal expresado se puede determinar
mediante una diversidad de técnicas electrofisiológicas, incluyendo
procedimientos de corrección de tensión y de patch clamp de dos
electrodos. El canal que conduce cationes intrínsecos al AChR se
abre en respuesta a acetilcoilina (ACh) u otros agonistas
colinérgicos nicotínicos, permitiendo que el flujo de corriente
transmembrana se lleve predominantemente mediante iones de sodio y
potasio en condiciones fisiológicas. Esta corriente se puede
modificar directamente mediante técnicas de corrección de tensión.
En las realizaciones preferidas, células de mamífero transfectadas u
oocitos inyectados se analizan electrofisiológicamente para evaluar
la presencia de corrientes dependientes de agonistas de nAChR.
La activación de nAChR activado por ligando
mediante agonistas conduce a un influjo de cationes, incluyendo
Ca^{++}, a través del canal receptor. Ca^{++} entra en la célula
a través del canal puede inducir la liberación de calcio contenido
en almacenes intracelulares. La entrada del catión monovalente en la
célula a través del canal puede dar como resultado un incremento en
los niveles de Ca^{++} citoplásmico a través de la despolarización
de la membrana y posterior activación de los canales de calcio
dependientes de la tensión. Por lo tanto, los procedimientos de
detección de incrementos transitorios en la concentración de calcio
intracelular se pueden aplicar al análisis de expresión de nAChR
nicotínico funcional. Un procedimiento para medir los niveles de
calcio intracelular se basa en indicadores fluorescentes sensibles a
calcio.
Los indicadores sensibles a calcio, tales como
fluo-3 (nº de catálogo FO1241, Molecular Probes,
Inc., Inc., Eugene, OR), están disponibles como ésteres de
acetoximetilo que son permeables a la membrana. Cuando al forma de
éster de acetoximetilo del indicador entra en una célula, el grupo
éster se retira mediante estearasas citosólicas, por lo tanto
atrapando el indicador libre en el citosol. La interacción del
indicador libre con calcio da como resultado da como resultado un
incremento de fluorescencia del indicador; por lo tanto, un
incremento en la concentración de Ca^{2+} intracelular de las
células que contienen el indicador se puede expresar directamente
como un incremento de fluorescencia. Se ha descrito un sistema de
detección de fluorescencia automático para ensayar nAChR nicotínico
(véase, la solicitud de patente de Estados unidos números de serie
08/229.150, 08/244.985, 08/434.511, y 08/434.968 y la solicitud de
patente PCT internacional publicada correspondiente Nº US92/11090;
véase, también la solicitud PCT internacional publicada Nº
96/05488).
Las células HEK que se cotransfectan de manera
transitoria o estable con ADN que codifica las subunidades \alpha
y \beta y las subunidades \alpha_{6} y \beta_{3} se
analizan para evaluar la expresión de nAChR recombinante funcional
usando el ensayo basado en indicador fluorescente automático. El
procedimiento de ensayo es como sigue. Células no transfectadas y
células HEK cotransfectadas con ADN que codifica las subunidades
\alpha y \beta apropiadas se sitúan en los pocillos de un disco
de microtitulación de 96 pocillos y se cargan con
fluo-3 mediante incubación durante dos horas a 20ºC
en un medio que contiene fluo-3 20 \muM, Pluronic
F-127 al 0,2% en HBS (NaCl 125 mM, KCl 5 mM,
CaCl_{2} 1,8 mM, MgSO_{4} 0,62 mM, glucosa 6 mM, HEPES 20 mM, pH
7,4). Después las células se lavan con tampón de ensayo (es decir,
HBS). Se añade el antagonista d-tubocurarina a
alguno de los pocillos a una concentración final de 10 \muM. El
disco de microvaloración se coloca después en un lector de placas
por fluorescencia y se mide la fluorescencia basal de cada pocillo y
se registra antes de la adición de agonista, por ejemplo, nicotina
200 \muM, a los pocillos. La fluorescencia de los pocillos se
controla de manera repetida durante un período de aproximadamente 60
segundos después de a adición de nicotina.
La fluorescencia de las células HEK no
transfectadas no cambia con después de la adición de nicotina. Por
el contrario, al fluorescencia de las células cotransfectadas, en
ausencia de d-tubo curarina, incrementa notablemente
después de la adición de nicotina a los pocillos. Este incremento
estimulado por nicotina en fluorescencia no se observó en células
cotransfectadas que se habían expuesto al antagonista
d-tubocurarina. Tales resultados demuestran que las
células cotransfectadas expresan nAChR recombinante funcional que se
activan por nicotina y se bloquearon por
d-tubocurarina.
Aunque la invención se ha descrito en detalle con
referencia a ciertas realizaciones preferidas de las mismas, se
entiende que las modificaciones y variaciones están dentro del
espíritu y alcance de la que se describe y reivindica.
Ya que las modificaciones serán evidentes para
los expertos en esta técnica, se entiende que esta invención está
solamente limitada solamente por el alcance de las reivindicaciones
anexas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: SIBIA NEUROSCIENCES, INC.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 505 S. COAST Blvd.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: La Jolla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92037
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- INVENTOR/SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Kathryn J. Elliot.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 3854 Baker Street.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Diego
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92117
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- INVENTOR/SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Michael M. Harpold.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 15360 Creek Hills Road.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: El Cajón
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92021
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES DE RECEPTORES NICOTÍNICOS NEURONALES HUMANOS DE ACETILCOLINA Y
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipPROCEDIMEINTOS QUE EMPLEAN LOS MISMOS
\hfill
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 20
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: Brown, Martín, Haller y McClain.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1660 Unión Street.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Diego
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- ZIP: 92101-2926
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEAM OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ versión nº 1.5
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 de junio de 1996
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/484.722
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 07/06/95
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Seidman, Stephanie L
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33.779
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 6362-9370PC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN TELEFÓNICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 619-238-0999
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 619-238-0062
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2664 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de codificación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 555 . . . 2141
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: subunidad alfa 2 de receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LOCALIZACIÓN: 1 . . . 554
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2142 . . . 2666
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 529 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1908 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de codificación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 190 . . . 1704
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: subunidad alfa 3 de receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 . . . 189
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1705 . . . 1908
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 505 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3496 pares de basas
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de codificación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 232 . . . 2115
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: subunidad alfa 4 de receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 . . . 231
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2116 . . . 3496
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 628 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1828 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de codificación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 155 . . . 1561
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: subunidad alfa 5 de receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 . . . 154
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1562 . . . 1828
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 469 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1743 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de codificación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 143 . . . 1627
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: subunidad alfa 6 de receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 . . . 142
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1628 . . . 1743
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 495 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1876 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de codificación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 73 . . . 1561
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: subunidad alfa 7 de receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 . . . 72
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1582 . . . 1876
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 446 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 12:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2448 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de codificación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 265 . . . 1773
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: subunidad beta 2 de receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 . . . 264
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1774 . . . 2448
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 503 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1925 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de codificación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 98 . . . 1474
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: subunidad beta 3 de receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 . . . 97
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1475 . . . 1927
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 459 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1915 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de codificación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 87 . . . 1583
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: subunidad alfa 4 de receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 . . . 86
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1584 . . . 1915
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 499 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 18:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1698 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia de codificación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 143 . . . 1582
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: subunidad alfa 4 de receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 5' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1 . . . 143
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3' UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1583 . . . 1698
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 480 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGíA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SENTIDO OPUESTO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 1 es una secuencia
de nucleótidos que codifica una subunidad \alpha_{2} de un
receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina, y la secuencia
deducida de aminoácidos de la
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 2 es la secuencia
de la subunidad \alpha_{2} de un receptor nicotínico neuronal
humano de acetilcolina expuesta en la secuencia Nº
1.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 3 es una secuencia
de nucleótidos que codifica una subunidad \alpha_{3} de un
receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina, y la secuencia
de aminoácidos deducida de la
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 4 es la secuencia
de nucleótidos de la subunidad \alpha_{3} de un receptor
nicotínico neuronal humano de acetilcolina expuesta en la secuencia
Nº
3.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 5 es una secuencia
de nucleótidos que codifica una subunidad \alpha_{4} de un
receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina, y la secuencia
de aminoácidos deducida de la
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 6 es la secuencia
de nucleótidos de la subunidad \alpha_{4} de un receptor
nicotínico neuronal humano de acetilcolina expuesta en la secuencia
Nº
5.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 7 es una secuencia
de nucleótidos que codifica una subunidad \alpha_{5} de un
receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina, y la secuencia
de aminoácidos deducida de la
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 8 es la secuencia
de nucleótidos de la subunidad \alpha_{5} de un receptor
nicotínico neuronal humano de acetilcolina expuesta en la secuencia
Nº
7.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 9 es una secuencia
de nucleótidos que codifica una subunidad \alpha_{6} de un
receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina, y la secuencia
de aminoácidos deducida de la
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 10 es la secuencia
de nucleótidos de la subunidad \alpha_{6} de un receptor
nicotínico neuronal humano de acetilcolina expuesta en la secuencia
Nº
9.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 11 es una secuencia
de nucleótidos que codifica una subunidad \alpha_{7} de un
receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina, y la secuencia
de aminoácidos deducida de la
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 12 es la secuencia
de nucleótidos de la subunidad \alpha_{7} de un receptor
nicotínico neuronal humano de acetilcolina expuesta en la secuencia
Nº
11.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 13 es una secuencia
de nucleótidos que codifica una subunidad \beta_{2} de un
receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina, y la secuencia
de aminoácidos deducida de la
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 14 es la secuencia
de nucleótidos de la subunidad \beta_{2} de un receptor
nicotínico neuronal humano de acetilcolina expuesta en la secuencia
Nº
13.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 15 es una secuencia
de nucleótidos que codifica una subunidad \beta_{3} de un
receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina, y la secuencia
de aminoácidos deducida de la
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 16 es la secuencia
de nucleótidos de la subunidad \beta_{3} de un receptor
nicotínico neuronal humano de acetilcolina expuesta en la secuencia
Nº
15.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 17 es una secuencia
de nucleótidos que codifica una subunidad \beta_{4} de un
receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina, y la secuencia
de aminoácidos deducida de la
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 18 es la secuencia
de nucleótidos de la subunidad \beta_{4} de un receptor
nicotínico neuronal humano de acetilcolina expuesta en la secuencia
Nº
17.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 19 es una secuencia
de nucleótidos que codifica una subunidad \alpha_{6} variante de
un receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina, y la
secuencia de aminoácidos deducida de la
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia ID Nº 20 es la secuencia
de nucleótidos de la subunidad \alpha_{6} de un receptor
nicotínico neuronal humano de acetilcolina expuesta en la secuencia
Nº
19.
Claims (33)
1. Una molécula aislada de ácido nucleico, que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una subunidad
\alpha_{6} de un receptor nicotínico neuronal humano de
acetilcolina, y la secuencia de aminoácidos deducida de la misma que
tiene al menos 90% de identidad.
2. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que la subunidad \alpha_{6} comprende
la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 10.
3. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que la subunidad \alpha_{6} comprende
la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 20.
4. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos se hibridiza
a los nucleótidos 143-1624 expuestos en la SEC ID Nº
9 en condiciones de alta rigurosidad, o
la secuencia de nucleótidos se hibridiza en
condiciones de alta rigurosidad a los nucleótidos
143-1579 expuestos en la SEC ID Nº 19.
5. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos que
codifica una subunidad \alpha_{6} tiene al menos 90% de
identidad con los nucleótidos 143-1624 expuestos en
la SEC ID Nº 9.
6. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 5, que comprende los nucleótidos
143-1624 expuestos en la SEC ID Nº 9.
7. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos que
codifica una subunidad \alpha_{6} tiene al menos 90% de
identidad con los nucleótidos 143-1579 expuestos en
la SEC ID Nº 19.
8. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 7, que comprende los nucleótidos
143-1579 expuestos en la SEC ID Nº 19.
9. Una molécula de ácido nucleico de cadena
sencilla de al menos 27 bases de longitud, que comprende
cualesquiera 27 bases contiguas expuestas en la SEC ID Nº 9 o SEC ID
Nº 19 o el complemento de las mismas.
10. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 9 que está marcada.
11. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 10 que está marcada con ^{32}P.
12. Un procedimiento para aislar ADN que codifica
una subunidad del receptor nicotínico humano de acetilcolina, que
comprende la selección de una librería con la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 11, y aislar clones que se hibridizan
en condiciones de al menos baja rigurosidad al ácido nucleico de la
reivindicación 11.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que los clones aislados se hibridizan en condiciones de alta
rigurosidad.
14. El procedimiento de la reivindicación 12 o
reivindicación 13, que comprende adicionalmente identificar los
clones que codifican una subunidad \alpha_{6}.
15. Las células que comprenden una molécula de
ácido nucleico o una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en
las que las células son células procarióticas o células eucarióticas
y el ácido nucleico es heterólogo a las células.
16. Las células de la reivindicación 15 que son
células de mamífero u oocitos de anfibio.
17. Las células de la reivindicación 15, que
comprende adicionalmente ácido nucleico heterólogo que codifica una
subunidad \beta del receptor nicotínico neuronal humano de
acetilcolina.
18. Las células de la reivindicación 17, en las
que la subunidad \beta se selecciona entre \beta_{2},
\beta_{3} o \beta_{4}.
19. Las células de la reivindicación 18, en las
que la subunidad \beta es \beta_{3}.
20. Las células de la reivindicación 15, en las
que las células expresan receptores nicotínicos neuronales
funcionales de acetilcolina que contienen una o más subunidades
codificadas por el ácido nucleico heterólogo.
21. La molécula de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 que es ADN.
22. La molécula de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 que es ARN.
23. Un procedimiento de selección de compuestos
para identificar compuestos que modulan la actividad de receptores
nicotínicos neuronales humanos de acetilcolina, comprendiendo el
procedimiento la determinación del efecto de un compuesto de ensayo
sobre la actividad del receptor nicotínico neuronal de acetilcolina
en células de la reivindicación 15 comparado con el efecto sobre las
células de control o con la actividad del receptor nicotínico
neuronal de acetilcolina de las células en ausencia del
compuesto.
24. Una subunidad \alpha_{6} del receptor
nicotínico neuronal de acetilcolina sustancialmente pura que tiene
al menos un 90% de homología con las SEC ID números 10 ó 20.
25. Un receptor nicotínico neuronal recombinante
sustancialmente puro de acetilcolina, que comprende una subunidad
\alpha_{6} del receptor nicotínico neuronal humano de
acetilcolina como se ha definido en la reivindicación 24.
26. El receptor nicotínico de acetilcolina de la
reivindicación 25, que comprende adicionalmente una subunidad
\beta del receptor nicotínico neuronal humano de acetilcolina.
27. Un procedimiento para identificar subunidades
del receptor nicotínico neuronal funcional de acetilcolina y las
combinaciones de las mismas, que comprende:
- (a)
- introducir una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en células eucarióticas; y
- (b)
- detectar la actividad del receptor nicotínico neuronal de acetilcolina en las células de la etapa (a), en la que la actividad está mediada por un receptor que contiene una subunidad codificada por la molécula introducida.
28. El procedimiento de la reivindicación 27, que
comprende adicionalmente introducir ácido nucleico que codifica una
o más subunidades á de un receptor nicotínico neuronal humano de
acetilcolina.
29. El ácido nucleico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 que es ARN.
30. El procedimiento de la reivindicación 27, que
comprende adicionalmente introducir una molécula de ácido nucleico
que codifica una o más subunidades \beta de un receptor nicotínico
neuronal humano de acetilcolina.
31. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta
en la SEC ID Nº 9.
32. Las células de la reivindicación 15 que
expresa los receptores nicotínicos neuronales de acetilcolina.
33. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1 obtenida a partir de una librería de ADNc.
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