ES2249786T3 - Uso de un anticuerpo antiinterleuquina 9 para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de asma. - Google Patents

Abstract

UNA VARIACION DE C A T EN DNA EN LA POSICION 3365 EN EL EXON 5 DEL FACTOR ASOCIADO A ASMA 1 HUMANO (AAF1) PRODUCE LA SUSTITUCION AMINOACIDICA PREDICHA DE UNA TREONINA POR UNA METIONINA EN EL CODON 117 DE AAF1. CUANDO ESTA SUSTITUCION SE PRODUCE EN AMBOS ALELOS DE UN INDIVIDUO, SE ASOCIA CON UNA MENOR EVIDENCIA DE ALERGIA ATOPICA INCLUYENDO ASMA, MENORES RESPUESTAS CUTANEAS ANORMALES A TESTS Y UNA MENOR IGE TOTAL EN SUERO. DE ESTE MODO, EL SOLICITANTE HA IDENTIFICADO LA EXISTENCIA DE UN FENOTIPO NO ASMATICO NO ATOPICO CARACTERIZADO POR UNA METIONINA EN EL CODON 117 CUANDO SE PRODUCE EN AMBOS PRODUCTOS DEL GEN AAF1 EN UN INDIVIDUO.

Description

Uso de un anticuerpo antiinterleuquina 9 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de asma.

Remisión a la solicitud referida

Esta solicitud se refiere a la Solicitud Provisional U.S. con Nº de Serie 60/002.765 la cual se presentó el 24 de Agosto de 1995.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al uso de un anticuerpo para la preparación de un medicamento para el tratamiento del asma, basado en la relación entre IL-9 y su receptor.

Antecedentes de la invención

La inflamación es un proceso complejo en el cual el sistema de defensa del cuerpo combate entidades extrañas. Aunque la batalla contra las entidades extrañas pueda ser necesaria para la supervivencia del cuerpo, algunos sistemas de defensa responden indebidamente a entidades extrañas, incluso algunas inocuas, como nocivas y de ese modo dañan el tejido circundante en la consiguiente batalla.

La alergia atópica es un trastorno ecogénico, en el que los antecedentes genéticos dictan la respuesta a estímulos medioambientales. El trastorno generalmente se caracteriza por una capacidad aumentada de los linfocitos para producir anticuerpos IgE en respuesta a antígenos ubicuos. La activación del sistema inmune mediante estos antígenos conduce a la inflamación alérgica y puede ocurrir después de la ingestión, penetración a través de la piel o después de la inhalación. Cuando ocurre esta activación inmune y la inflamación pulmonaria resulta de este trastorno se califica en líneas generales como asma. Ciertas células son críticas para esta reacción inflamatoria e incluyen: las células T y las células que presenta antígeno, las células B que producen IgE, y mastocitos/basófilos y eosinófilos que se unen a IgE. Estas células inflamatorias se acumulan en el sitio de la inflamación alérgica y los productos tóxicos que liberan contribuyen a la destrucción de tejido relacionada con el trastorno.

Aunque generalmente el asma se define como un trastorno inflamatorio de las vías respiratorias, los síntomas clínicos surgen de la obstrucción intermitente del flujo de aire. Es un trastorno de incapacitación crónica que aparece para ir aumentándose en frecuencia y gravedad^{1}. Se estima que el 30-40% de la población padece alergia atópica, y el 15% de los niños y el 5% de los adultos de la población padecen de asma.^{1} Por tanto, se echa una enorme carga sobre nuestros recursos del cuidado de la salud.

El mecanismo de la susceptibilidad a atopía y asma continua desconocido. Curiosamente, aunque la mayoría de los individuos experimentan exposiciones medioambientales similares, solamente ciertos individuos desarrollan alergia atópica y asma. Esta hipersensibilidad a los alergenos medioambientales conocida como "atopía" con frecuencia se indica mediante niveles elevados de IgE en suero o mediante una respuesta a alergenos de la prueba cutánea anormalmente grande en individuos atópicos en comparación con los no atópicos^{10}. La fuerte evidencia para una estrecha relación entre alergia atópica y asma se deriva del hecho de que la mayoría de los asmáticos tienen evidencia clínica y serológica de atopía.^{4-9} En concreto, los asmáticos más jóvenes tienen una alta incidencia de atopía.^{10} Además, los factores inmunológicos asociados con un aumento en los niveles totales de IgE en suero están muy estrechamente relacionados con la función pulmonaria afectada.^{3}

Tanto el diagnóstico como el tratamiento de estos trastornos son problemáticos.^{1} Con frecuencia, la valoración del tejido pulmonar inflamado es difícil, y frecuentemente no se puede determinar la procedencia de la inflamación. Sin el conocimiento de la procedencia de la inflamación de la vía respiratoria y la protección del agente o agentes medioambientales extraños incitadores, no se puede interrumpir el proceso inflamatorio. En la actualidad generalmente se acepta que la falta de control de la inflamación pulmonaria conduce a una pérdida significativa de la función del pulmón a lo largo del tiempo.

Los tratamientos actuales sufren su propio conjunto de desventajas. Los agentes terapéuticos principales, agonistas \beta, reducen los síntomas, es decir, mejoran de manera transitoria las funciones pulmonarias, pero no afectan a la inflamación subyacente de tal manera que el tejido pulmonar continua en peligro. Además, el uso constante de agonistas \beta da como resultado la desensibilización la cual reduce su eficacia y su seguridad.^{2} Los agentes que pueden disminuir la inflamación subyacente, los esteroides antiinflamatorios, tienen su propia lista conocida de desventajas que oscilan entre la inmunosupresión y la pérdida ósea.^{2}

Debido a los problemas asociados con las terapias convencionales, se han evaluado estrategias de tratamiento alternativas.^{65-66} Glicoforina A,^{64} ciclosporina,^{65} y un fragmento nonapéptido de IL-2,^{63} todos inhiben la proliferación de linfocito T dependiente de interleuquina 2 y, por lo tanto, la producción de IL-9,^{51} sin embargo, se sabe que tienen muchos otros efectos.^{3} Por ejemplo, la ciclosporina se usa como inhibidor después del trasplante de órgano. Mientras que estos agentes pueden representar alternativas a los esteroides en el tratamiento de asmáticos,^{63-66} inhiben la proliferación de linfocito T dependiente de interleuquina 2 y las funciones inmunes potencialmente críticas asociadas con la homeostasis. Lo que es necesario en la técnica es la identificación de una ruta crítica para el desarrollo del asma que explique la naturaleza episódica del trastorno y la estrecha asociación con la alergia que está a favor de estas funciones inmunes críticas. La naturaleza demostró que esta ruta es el objetivo apropiado para la terapia ya que la variabilidad biológica normalmente existe en esta ruta y estos individuos por otra parte no están generalmente inmunocomprometidos o enfermos excepto por sus síntomas de atopía.

Debido a las dificultades relacionadas con el diagnóstico y el tratamiento del asma, la patofisiología compleja de este trastorno está bajo estudio exhaustivo. Aunque este trastorno es heterogéneo y puede ser difícil de definir debido a que puede tomar muchas formas, se encuentran ciertas características en común entre los asmáticos. Ejemplos de tales rasgos incluyen: niveles elevados de IgE en suero, respuesta anormal al desafío con alergeno de la prueba cutánea, hipersensibilidad bronquial (BHR, del Inglés "Bronchial Hyperresponsiveness"), reversibilidad broncodilatadora y obstrucción del flujo de aire.^{3-10} Estas expresiones de estos fenotipos relacionados con el asma se pueden estudiar como medidas cuantitativas o cualitativas.

Los niveles elevados de IgE están también estrechamente correlacionados con BHR, una respuesta aumentada del broncoconstrictor a una diversidad de estímulos.^{4,6,8,9} Se cree que la BHR refleja la presencia de inflamación de vía respiratoria,^{6,8} y se considera un factor de riesgo para el asma.^{11-12} La BHR está acompañada de inflamación bronquial y una diatesis alérgica en individuos asmáticos.^{23-21} Incluso en niños sin síntomas de atopía y asma, la BHR está fuertemente asociada con niveles elevados de IgE.^{29}

Un número de estudios documentan un componente heredable para atopía y asma.^{4,10,21} Sin embargo, los estudios familiares han sido difíciles de interpretar ya que estos trastornos están significativamente influenciados por la edad y el género, así como por muchos factores medioambientales tales como alergenos, infecciones víricas y contaminantes.^{22-24} Además, debido a que no se conoce defecto bioquímico asociado con la susceptibilidad a estos trastornos, los genes mutantes y sus productos génicos anormales solamente se pueden reconocer mediante los fenotipos anómalos que producen. Por tanto, un primer paso importante en el aislamiento y caracterización de un componente heredable es la identificación de las localizaciones cromosómicas de los genes.

Cookson et al. proporcionaron la primera descripción de una localización genética para atopía heredada.^{25} Estos investigadores describieron la evidencia para el ligamiento genético entre atopía y un único marcador en una región cromosómica específica designada 11q13.1. Más adelante, sugirieron la evidencia de la herencia materna para la atopía en este locus.^{26} Aunque la herencia materna [impresión genética] se había observado para la atopía, nunca previamente se había explicado. Sin embargo, los esfuerzos para confirmar este ligamiento generalmente no han sido exitosos.^{27-31}

Recientemente, se hizo un mapa de la subunidad \beta del receptor de IgE de alta afinidad en el cromosoma 11q, y se ha descrito en este gen una supuesta mutación asociada con la atopía.^{32,33} Sin embargo, debido a las dificultades por otros de reproducir exactamente este ligamiento, la significancia de este gen y el polimorfismo no continúa clara. Mientras que los estudios adicionales requerirán confirmar si esta supuesta mutación causa atopía en la población general, los datos recogidos hasta ahora sugieren que este polimorfismo es poco probable que represente una causa frecuente de atopía.

Debido a que los niveles de IgE en suero están tan estrechamente asociados con el comienzo y la gravedad de la alergia y el asma como trastornos clínicos, se ha concentrado la atención sobre los estudios de la regulación genética de los niveles totales de IgE en suero. Mientras que los estudios pasados han proporcionado evidencia para la herencia Mendeliana para los niveles totales de IgE en suero,^{34-38} un indicio de la existencia de un gen regulador, otros han encontrado evidencia para la herencia poligénica de IgE, es decir, la existencia de varios genes responsables.^{39}

Los técnicos han encontrado diversos genes que pueden ser importantes en la regulación de IgE y el desarrollo o progresión de la inflamación bronquial asociada con el asma en el cromosoma 5q. Incluyen genes que codifican diversas interleuquinas, tales como IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, el factor estimulante de colonia de granulocito macrófago [GM CSF, del Inglés "Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor"], un receptor para el factor estimulante de colonia de macrófago [CSF-1R], el factor de crecimiento de fibroblasto ácido [FGFA, del Inglés "Fibroblast Growth Factor Acidic"], así como otros.^{40} La evidencia reciente a partir de los estudios familiares sugiere el ligamiento genético entre los niveles de IgE en suero y los marcadores de ADN en la región de estos genes candidatos en el cromosoma 5q.^{41-42} A la vez, estas investigaciones sugieren que uno o más genes principales en la proximidad del complejo de interleuquina en el cromosoma 5q regula una cantidad significativa de la variabilidad biológica observada en IgE en suero que es probable que sea importante en el desarrollo de la atopía y el asma.

El ligamiento [análisis de pares de hermanos ("sib-pair")] también se usó previamente para identificar una localización genética para BHR.^{79} Debido a que se sabía que la BHR está asociada con un gen principal para atopía, se examinaron regiones cromosómicas que se dice que son importantes en la regulación de los niveles de IgE en suero.^{42} Se han identificado las regiones candidatas para atopía mediante análisis de ligamiento. Estos estudios identificaron la existencia de un gen principal para atopía en el cromosoma humano 5q31-q33.^{42}

Por lo tanto, para determinar la localización cromosómica de un(os) gen(es) que proporciona(n) susceptibilidad a BHR, el(los) cual(es) se heredaría(n) conjuntamente con un gen principal para atopía, se llevaron a cabo experimentos usando análisis de ligamiento entre BHR y marcadores genéticos en el cromosoma 5q.^{42,79,82} Se identificaron los individuos con BHR mediante la sensibilidad a histamina. Los marcadores útiles para hacer los mapas de los genes relacionados con el asma se muestran en la Figura 1.

Específicamente, los candidatos génicos para asma, hipersensibilidad bronquial y atopía se muestran [derecha] en su localización aproximada relativa a los marcadores mostrados. El mapa incluye los genes de interleuquina IL-4, IL-13, IL-9 e IL-3; CDC25, ciclo 25 de la división celular; CSF2, factor estimulante de colonia de granulocito macrófago [GM CSF]; EGR1, gen 1 de respuesta de crecimiento temprano; CD14, antígeno celular 14; ADRB2, el receptor adrenérgico \beta2; GRL1, receptor glucocorticoide específico de linfocito; PDGFR, receptor del factor de crecimiento derivado de plaqueta. Las bandas 5q31-q33 se extienden aproximadamente desde IL-4 a D5S410. Las distancias indicadas son fracciones de recombinación promedio según sexo.

Los análisis de pares de hermanos ("sib-pair") afectados demostraron estadísticamente evidencia significativa para el ligamiento entre BHR y D5S436, D5S658 y otros diversos marcadores localizados cerca en el cromosoma 5q31-q33.^{79} Estos datos fuertemente soportaron la hipótesis de que uno o más gen(es) estrechamente espaciado(s) en el cromosoma 5q31-q33 determinan la susceptibilidad a BHR, atopía y asma.^{79,80,81,82}

Recientemente también se ha demostrado el ligamiento entre el fenotipo de asma y los marcadores genéticos en el cromosoma 5q31-q33.^{83} Esta región del genoma humano se evaluó para el ligamiento con el asma debido al gran número de genes que representan candidatos posicionales razonables para proporcionar susceptibilidad genética para atopía y BHR.

Se demostró el ligamiento usando los métodos descritos anteriormente.^{42,83} Específicamente, se analizaron 84 familias de Los Países Bajos tanto con análisis de pares de hermanos ("sib-pair") como los LODs para marcadores de esta misma región del cromosoma 5q previamente mostrado por estar relacionado con BHR y atopía.^{42,83} Se usó un algoritmo para categorizar la enfermedad obstructiva de las vías respiratorias en las probandas asmáticas y sus familias. Este esquema de clasificación se basó, tal como se ha descrito anteriormente, en la presencia o ausencia de BHR a histamina, síntomas respiratorios, historia de fumador significativa [>5 paquetes al año], atopía como la definida mediante la respuesta de la prueba cutánea, obstrucción de vía respiratoria [FEV1 % previsto<95% CI] y reversibilidad a un broncodilatador [>9% previsto].

Se encontró la evidencia para la relación entre asma y los marcadores en el cromosoma 5q mediante análisis de pares de hermanos ("sib-pair") afectados (N=10, P<0,05) y mediante análisis de probabilidad máxima con un modelo dominante para el fenotipo de asma.^{83}

El asma estaba relacionado con D5S658 con un LOD máximo de 3,64 a \theta=0,03, usando un modelo dominante [clase 1 afectado, clase 2-4 incierto, clase 5 no afectado] con una frecuencia génica de 0,015 [frecuencia del 3%]. Se observó un LOD máximo de 2,71 a \theta=0,0 para D5S470 lo cual es aproximadamente telomérico de 5cM, o de IL-9, relativo a D5S436.^{83}

Posterior a la presentación original de esta solicitud, se sugirió la IL-9 o un gen cercano como probable para ser uso importante en atopía y asma.^{43} La sugerencia de IL-9 se basada en una fuerte correlación en una población establecida al azar entre el logaritmo de los niveles totales de IgE en suero y los alelos de un marcador genético en el gen de IL-9.^{43} Este tipo de asociación con uno o más alelos específicos de un marcador se denomina "desequilibrio de ligamiento", y generalmente sugiere que un gen cercano determina la variabilidad biológica bajo estudio.^{44}

Se ha hecho un mapa del gen de IL-9 en la región q31-q33 del cromosoma 5.^{40} Solamente se encuentra una única copia del gen en el genoma humano.^{45,46} Se ha observado una similitud estructural para los genes de IL-9 murina y humano.^{45,46} Cada gen consiste en cinco exones y cuatro intrones que se extiende a través de aproximadamente cuatro Kb de ADN. La expresión del gen parece estar restringida a células T activadas.^{45,46}

En la actualidad, las funciones de IL-9 se extienden muy allá de las originalmente reconocidas. Aunque la IL-9 sirve como factor de crecimiento de célula T, también se sabe que esta citoquina media el crecimiento de progenitores eritroides, células B, mastocitos y timocitos fetales.^{45,46} La IL-9 actúa de manera sinérgica con la IL-3 en causar la proliferación y activación de mastocito.^{47} Esta citoquina también potencia la producción inducida por IL-4 de IgE, IgG e IgM mediante linfocitos B humanos normales.^{48} La IL-9 también potencia la liberación inducida por IL-4 de IgE e IgG1 mediante linfocitos B murina.^{49} También se ha demostrado un papel crítico para la IL-9 en la respuesta inflamatoria mucosa a infección parásita.^{50,51}

Además de la IL-9, el cromosoma 5q porta numerosos otros candidatos génicos que incluyen: IL-3, IRF1, EGR1, ITK, GRL1, ADRB2, CSF1R, FGFA, ITGA2, CD14, PDGFR, CDC25, CSF2, IL-4, IL-5, IL-12B e IL-13. Todos estos pueden ser importantes en la alergia atópica y como objetivos potenciales para el desarrollo terapéutico. Además, la técnica carece de cualquier conocimiento respecto a como la secuencia de IL-9 o la función de IL-9 se correlaciona específicamente con la alergia atópica, el asma o la hipersensibilidad bronquial. Sin tales conocimientos, los técnicos no sabrían como o si usar la IL-9 para o bien diagnosticar o tratar estos trastornos.

La técnica estipula que la IL-9 es una citoquina novedosa que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente entre 20 y 30 kD determinado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio bajo condiciones reductoras. Se produce como una proteína de 144 aminoácidos, que se procesa hasta una glicoproteína de 126 aminoácidos. Yang et al.^{85} revelan que la secuencia de ADN que codifica la IL-9 comprende aproximadamente 630 nucleótidos, con aproximadamente 450 nucleótidos en la pauta de lectura apropiada para la proteína.

En la técnica también se sabe que se pueden generar isoformas de proteína múltiples a partir de un único locus genético mediante maduración por corte y empalme ("splicing") alternativa. La maduración por corte y empalme ("splicing") alternativa es un mecanismo eficaz mediante el cual se pueden generar isoformas de proteína múltiples a partir de un único locus genético. Se usa la maduración por corte y empalme ("splicing") alternativa en células irremediablemente diferenciadas para modificar de manera reversible la expresión de proteína sin cambiar el contenido genético de las células. Estas isoformas de proteína preferiblemente se expresan en tejidos diferentes o durante estados diferentes de la diferenciación o activación celular. Las isoformas de proteína pueden tener funciones diferentes y Alms y White han clonado y expresado una variante por sitio de corte y empalme que ocurre de manera natural de IL-4, formado mediante la omisión del exón 2, por tanto, denominada IL-4\delta2.^{86} Se observó que la IL-4\delta2 inhibe la proliferación de célula T inducida por IL-4.

Sin embargo, la técnica carece de cualquier conocimiento sobre las isoformas de proteína de IL-9 las cuales se forman mediante deleciones de los exones 2 y 3 o las funciones reguladoras mostradas mediante estas proteínas truncadas. Específicamente, su papel en la regulación de la actividad biológica, concretamente, la regulación por disminución de la expresión o actividad de IL-9 no está clara. Además, previamente no se ha observado o usado la formación de tales isoformas mediante maduración por corte y empalme ("splicing") alternativa para proporcionar variantes de IL-9 que funcionen como agonistas o antagonistas de la citoquina natural.

La técnica también carece de cualquier conocimiento sobre el papel del receptor de IL-9 con los trastornos relacionados con asma. Se sabe que la IL-9 se une a un receptor específico expresado sobre la superficie de las células diana.^{46,52,53} El receptor actualmente consiste en dos cadenas de proteína: una cadena de proteína, conocida como el receptor de IL-9, se une específicamente con la IL-9 y la otra cadena de proteína es la cadena, la cual se comparte en común con el receptor de IL-2.^{46} Además, se ha clonado el ADNc del receptor de IL-9 humano.^{46,52,53} Este ADNc codifica una proteína de 522 aminoácidos la cual muestra una homología significativa al receptor de IL-9 murina. La región extracelular del receptor está altamente conservada, con una homología al 67% que existe entre las proteínas de murina y las humanas. La región citoplasmática del receptor está menos altamente conservada. El dominio citoplasmático humano es mucho mayor que la región correspondiente al receptor de murina.^{46}

También se ha caracterizado el gen del receptor de IL-9.^{53} Se piensa que existe como copia única en el genoma de ratón y está compuesta de nueve exones y ocho intrones.^{53} El genoma humano contiene al menos cuatro pseudogenes del receptor de IL-9. Se ha hecho un mapa del gen del receptor de IL-9 humano en la región subtelomérica de 320 kb de los cromosomas sexuales X e Y.^{46} Aún así, a pesar de estos estudios, la técnica carece de cualquier conocimiento de una relación entre el receptor de IL-9 y la alergia atópica, el asma, o la hipersensibilidad bronquial.

Por tanto, la técnica carece de cualquier conocimiento de cómo el gen de IL-9, su receptor y sus funciones están relacionadas con el asma. Por lo tanto, hay una necesidad específica en la técnica de información genética sobre el asma y de elucidación del papel de la IL-9 en la etiología de este trastorno. También hay una necesidad de la elucidación del papel del receptor de IL-9 y del gen del receptor de IL-9 en este trastorno. Además, lo más significativamente, basado en este conocimiento, hay una necesidad de la identificación de los agentes, es decir, los anticuerpos, los cuales son capaces de regular la interacción entre IL-9 y su receptor para tratar este trastorno.

Compendio de la invención

El solicitante ha satisfecho la necesidad sentida durante mucho tiempo de un tratamiento del asma al proporcionar información que demuestra el papel de la IL-9 (también conocida como Factor Asociado a Asma 1, o AAFI) en la patogénesis de este trastorno, dicha información ha llevado a los compuestos que son capaces de regular la actividad de IL-9. El solicitante también ha demostrado el ligamiento conservado y las homologías de sinténia entre ratones y humanos para un gen que determina la variabilidad biológica en la hipersensibilidad de vía respiratoria. Estas relaciones identifican específicamente la IL-9 como candidato génico. Además, el solicitante ha determinado que la IL-9 es crítica para un número de respuestas inducidas por antígeno en ratones que incluyen hipersensibilidad bronquial, eosifilia y recuentos celulares elevados en lavado bronquial, e IgE total en suero elevado. Estos descubrimientos tipifican la inflamación alérgica asociada con asma.

En esta invención se reivindican anticuerpos policlonales y monoclonales los cuales bloquean la unión de IL-9 a su receptor y son agentes terapéuticos útiles en el tratamiento del asma.

Las figuras adjuntas, las cuales están incorporadas y constituyen una parte de esta memoria, ilustran varias realizaciones de la invención y, junto con la descripción, sirven para explicar el principio de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Caracterización del papel de la IL-9 en la respuesta de antígeno in vivo.

Figura 2: Examen histológico de pulmones de animales control, sometidos a desafío con OVA y pretratados con IL-9.

Figura 3: Inhibición de la respuesta de antígeno in vivo bloqueando los anticuerpos en el receptor de IL-9 murina.

Descripción detallada de la invención

El solicitante ha resuelto las necesidades en la técnica al elucidar una ruta de IL-9 y composiciones que afectan esa ruta que pueden usarse en el diagnóstico, prevención o tratamiento del asma. El asma abarca los trastornos inflamatorios de las vías respiratorias con obstrucción reversible del flujo de aire.

La hipersensibilidad de la vía respiratoria se encuentra virtualmente en todos los asmáticos y en algunas razas de ratones consanguíneos (DBA/2).^{84} La hipersensibilidad de la vía respiratoria es un factor de riesgo para el desarrollo del asma en seres humanos y se usa en modelos animales de asma como medida fisiológica para valorar la eficacia del tratamiento para el asma. Estos datos junto con los resultados del mapa genético de murina y humano^{79} (véase Ejemplos 1 y 2) sugieren un papel crítico para el producto génico de IL-9 murina en la respuesta de la vía respiratoria del ratón. En concreto, los ratones DBA/2(D2) hipersensibles difieren de los ratones hiposensibles C57BL/6(B6)^{84} en su expresión de los niveles del estado constante de IL-9 (Véase Ejemplo 14, Figura 26). Además, el pretratamiento con anticuerpos bloqueadores para IL-9/receptor de IL-9 opcionalmente puede proporcionar protección completa de la hipersensibilidad e inflamación de la vía respiratoria inducidas por antígeno en ratones demostrando un papel regulador crítico para IL-9 en estas respuestas inmunes. Por tanto, estos datos demuestran que aunque los cambios moleculares diferentes producen variabilidad biológica en la sensibilidad de la vía respiratoria en seres humanos y ratones, estos cambios surgen en el(los) mismo(s) gen(es) (IL-9/IL-9R) que regulan esta ruta. Tomándolas juntas, estas observaciones confirman el papel crítico de la IL-9 y el receptor de IL-9 en la hipersensibilidad de la vía respiratoria, el asma y la alergia atópica. Además, estos datos demuestran que los agentes de la convención, los cuales bloquean la interacción de IL-9 con su receptor, protegen contra una respuesta inducida por antígeno tal como las detalladas anteriormente.

Además la evidencia que define el papel crítico de la IL-9 en la patogénesis del asma deriva directamente de la observación de los solicitantes de que la IL-9 es crítica para un número de respuestas inducidas por antígeno en ratones. Cuando las funciones de IL-9 están reguladas por disminución mediante pretratamiento con anticuerpo antes del desafío con aerosol con antígeno, los animales se pueden proteger completamente de las respuestas inducidas por antígeno. Estas respuestas incluyen: hipersensibilidad bronquial, eosinofilia y recuentos celulares elevados en lavado bronquial, cambios histológicos en pulmón asociados con la inflamación, e IgE total elevado en suero. Por tanto, el tratamiento de tales respuestas, las cuales caracterizan la inflamación alérgica asociada con el asma, mediante la regulación por disminución de las funciones de IL-9, están dentro del alcance de esta invención.

El técnico experto reconocerá fácilmente que todas las moléculas que contienen la conformación estructural tridimensional requerida y las cuales contienen los residuos esenciales o críticos para la unión al receptor están dentro del alcance de esta invención.

La demostración de una secuencia de IL-9 asociada con un fenotipo similar al asma, y una asociada con la falta de un fenotipo similar al asma, indica que la respuesta inflamatoria de los pulmones a antígeno es dependiente de IL-9 y, por lo tanto, que la regulación por disminución de la función de IL-9 debería proteger contra la respuesta inducida por antígeno.

Un receptor es un componente unido a membrana o soluble que reconoce y se une a moléculas, y el receptor de IL-9 (también conocido como Factor Asociado a Asma 2 o AAF2) de la invención es el componente que reconoce y se une a IL-9. Las funciones del receptor de IL-9 consisten en unir una molécula similar a IL-9 y propagar su señal reguladora en células específicas.^{57-60} Una interrupción de esa función llevará a una regulación por disminución, es decir, reducción, de o bien la expresión de IL-9 o de las funciones controladas por IL-9. Por consiguiente, por la ventaja de esta interacción entre IL-9 y el receptor de IL-9, se modulan o controlan ciertas funciones del organismo. Para una discusión general de los receptores, véase Goodman y Gilman's The Pharmacologic Basis of Therapeutics (Séptima Edición, McMillan Publishing Commpany, N.Y. USA, 1995).

La invención implica el tratamiento del asma.

Además, esta invención también proporciona compuestos que previenen la síntesis o reduce la estabilidad biológica de IL-9 o del receptor de IL-9.

En otra realización, los agonistas y antagonistas de la invención son anticuerpos para IL-9 y el receptor de IL-9. Los anticuerpos para IL-9 y su receptor pueden ser o bien monoclonales o policlonales producidos usando técnicas estándar bien conocidas en la técnica (Véase Harlow y Lane's Antibodies-A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Se pueden usar para bloquear la IL-9 de la unión al receptor. En una realización los anticuerpos interactúan con IL-9. En otra realización los anticuerpos interactúan con el receptor de IL-9. La IL-9 usada para obtener estos anticuerpos puede ser cualquiera de las variantes de IL-9 analizadas anteriormente.

Los anticuerpos también se producen a partir de las secuencias peptídicas de IL-9 o del receptor de IL-9 usando técnicas estándar en la técnica (véase Protocols in Immunology, Capítulo 9, Wiley). Las secuencias peptídicas del receptor de IL-9 murina que se pueden usar para producir antisueros bloqueadores se han identificado como: GGQ
KAGAFTC (residuos 1-10)(SEC. I.D. Nº:19); LSNSIYRIDCHWSAPELGQESR (residuos 11-32)(SEC. I.D. Nº:20); y CESYEDKTEGEYYKSHWSEWS (residuos 184-203 con un residuo Cys añadido al terminal N para acoplar el péptido a la proteína vehículo)(SEC. I.D. Nº:21). Además, se ha identificado un epítopo que se une a un anticuerpo bloqueador dirigido al receptor de IL-9 humano como residuos 8-14 del receptor de IL-9 humano adulto. También se han identificado (TCLTNNI)(SEC. I.D. Nº:22) y dos epítopos que se unen a los anticuerpos bloqueadores dirigidos a IL-9 humana como residuos 50-67 (CFSERLSQMTNTTMQTRY)(SEC. I.D. Nº:23) y residuos 99-116 (TAGNALT
FLKSLLEIFQK)(SEC. I.D. Nº:16). Los epítopos humanos así como los péptidos humanos que corresponden a los péptidos que producen anticuerpos bloqueadores en las secuencias de murina son los más probables de ser útiles para la producción de los anticuerpos terapéuticos.

Además, la invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra de manera intravenosa. También se pueden emplear disoluciones salinas y disoluciones de glicerol y dextrosa acuosa como vehículos líquidos, particularmente para disoluciones inyectables. Los vehículos farmacéuticamente aceptables están descritos en Martin, E.W., Remington's Pharmaceutical Sciences.

Los anticuerpos usados en esta invención se pueden administrar de manera sistémica o local, dependiendo de tales consideraciones como la enfermedad a tratar, la necesidad de tratamiento específico de sitio, la cantidad de fármaco a administrar y consideraciones similares.

Se puede usar la administración local. Se puede emplear cualquier formación local común tal como una disolución, suspensión, gel, pomada, o bálsamo y similares. La preparación de tales fórmulas locales está bien descrita en la técnica de fórmulas farmacéuticas tal como se ilustran, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Science, Edición 17, Mack Publising Company, Easton, Pa. Para la aplicación local, estos compuestos también se podrían administrar como polvos o pulverizados, particularmente en forma de aerosol. El ingrediente activo se puede administrar en composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración sistémica. Tal como se conoce, si un fármaco es para ser administrado de manera sistémica, se puede producir como polvo, píldora, comprimidos o similares, o como jarabe o elixir para la administración oral. Para la administración intravenosa, intraperitoneal o intralesional, el compuesto se preparará como una disolución o suspensión capaz de ser administrada mediante inyección. En ciertos casos, puede ser útil formular estos compuestos en forma de supositorio o como una fórmula de liberación prolongada para depositar bajo la piel o inyección intermuscular. En una realización preferida, los compuestos de esta invención se administran mediante inhalación. Para la terapia de inhalación el compuesto puede estar en una disolución útil para la administración mediante inhaladores de dosis medidas, o en una forma adecuada para un inhalador de
polvo seco.

Una cantidad eficaz es esa cantidad que regulará por disminución o bien la expresión de IL-9 o las funciones controladas por IL-9. Una cantidad eficaz dada variará de enfermedad a enfermedad y en ciertos casos puede variar con la gravedad de la enfermedad a tratar y la susceptibilidad del paciente al tratamiento. Por lo tanto, una cantidad eficaz dada será mejor determinada en el tiempo y lugar a través de la experimentación rutinaria. Sin embargo, se anticipa que en el tratamiento de los trastornos relacionados con el asma de acuerdo con la presente invención, una fórmula que contiene entre 0,001 y 5 por ciento en peso, preferiblemente aproximadamente de 0,01 a 1%, normalmente constituirá una cantidad terapéuticamente eficaz. Cuando se administra de manera sistémica, una cantidad entre 0,01 y 100 mg por kg de peso corporal por día, pero preferiblemente aproximadamente de 0,1 a 10 mg/kg, efectuará un resultado terapéutico en la mayoría de los casos.

El solicitante también prevé un método para investigar los compuestos que regulan por disminución la expresión de IL-9 o las funciones controladas por IL-9. Uno puede determinar si las funciones expresadas por IL-9 se regulan por disminución usando técnicas estándar en la técnica.^{57-60} En una realización específica, el solicitante prevé un método de identificación de compuestos con funciones comparables a IL-9 de Met. Por tanto, en una realización, se puede medir el IgE total en suero usando técnicas muy conocidas en la técnica^{42} para valorar la eficacia de un compuesto en la regulación por disminución de las funciones de IL-9 in vivo. En otra realización, se puede medir la hipersensibilidad bronquial, el lavado broncoalveolar y la eosinofilia usando técnicas muy conocidas en la técnica^{42} para valorar la eficacia de un compuesto en la regulación por disminución de las funciones de IL-9 in vivo. En aún otra realización, se pueden valorar las funciones de IL-9 in vitro. Tal como se conoce por los expertos en la técnica, la IL-9 humana induce específicamente la rápida y transitoria fosforilación de tirosina de proteínas múltiples en células MO7e. La fosforilación de tirosina del factor transcripcional Stat3 parece estar específicamente relacionado con las acciones de IL-9. Otro método para caracterizar la función de IL-9 y las moléculas similares a IL-9 que dependen de la "expresión estable" del receptor de IL-9 usa los clones TS1 murina bien conocidos para valorar la función de la IL-9 humana con un ensayo de proliferación celular.^{59}

La invención también incluye un ensayo de exploración simple para la unión de ligando específica y saturable en líneas celulares que expresan el receptor de IL-9.^{46,50} El receptor de IL-9 se expresa en una amplia variedad de tipos celulares, que incluyen: K562, C8166-45, células B, células T, mastocitos, neutrófilos, megacariocitos (células UT-7),^{53} las líneas celulares MO7e de leucemia megacarioblástica humana^{57}, TF1,^{59} macrófagos, timocitos fetales, la línea celular 293 de riñón humano,^{53} y las líneas celulares de progenitor hipocampal embrionario de murina.^{46,52,53} En otra realización, se puede usar el receptor de IL-9 soluble para evaluar la unión de ligando y los antagonistas potenciales del receptor.

La práctica de la presente invención empleará los términos y técnicas convencionales de la biología molecular, farmacología, inmunología y bioquímica que están dentro de las técnicas normales de los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1985), o Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Ejemplo 1 El papel de IL-9 en modelos de murina de asma: La respuesta de la vía respiratoria de animales insensibilizados Animales

Se obtuvieron ratones machos libres de virus certificados que oscilaban en edad entre 5 y 6 semanas del "Jackson Laboratory" (Bar Harbor, ME). Los animales se alojaron en campanas de flujo laminar de aire filtrado particulado de alta eficacia (HEPA, del Inglés "High Efficiency Particulate Air") en una condición libre de antígeno y virus y se permitió el libre acceso a comida de roedor en bolitas y agua durante 3 a 7 días antes de la manipulación experimental. Las condiciones de los animales se mantuvieron a 22ºC y el ciclo luz:oscuridad se controlaba automáticamente (luz:oscuridad 10:14 h). Se adquirieron ratones DBA/2 (D2), C57BL/6 (B6) y (B6D2)F1 (F1) hembras y machos de 5 a 6 semanas de edad del "Jackson Laboratory", Bar Harbor, ME o del "National Cancer Institute", Frederick, MD. Se adquirieron ratones BXD del "Jackson Laboratory", Bar Harbor, ME. La comida y el agua estaban presentes ad libitum.

Realización de fenotipo y eficacia del pretratamiento

Para determinar la respuesta broncoconstrictora, se midió la presión del sistema respiratorio en la tráquea y se anotó antes y durante la exposición al fármaco. Se anestesiaron los ratones y se sometió a instrumentación tal como se ha descrito previamente. (Levitt, R.C. y Mitzner, W., FASEB J., 2:2.605-2.608 (1988); Levitt, R.C. y Mitzner, W., J. Appl. Physiol., 67(3):1.125-1.132 (1989); Kleeberger, S., Bassett, D., Jakab, G.J. y Levitt, R.C., Am J. Physiol., 258(2)L313-320 (1990); Levitt, R.C., Pharmacogenetics, 1:94-97 (1991); Levitt, R.C. y Ewart, S.L., Am J. of Respir. Crit. Care Med., 151:1.537-1.542(1995); Ewart, S., Levitt, R.C. y Mitzner, W., In press, J. Appl. Phys. (1995). Se midió la sensibilidad de la vía respiratoria a uno o más de lo siguiente: 5-hidroxitriptamina (5HT) (sigma). Una construcción de cadena adicional que se puede usar es la acetilcolina (sigma), el atracurium (Glaxo welcome). Se usó una medida simple y repetible del cambio en Ppi que sigue al desafío broncoconstrictor y el cual se ha calificado como el Índice Presión Tiempo de la Vía Respiratoria (APTI, del Inglés "Airway Pressure Time Index") (Levitt, R.C. y Mitzner, W., FASEB J., 2:2.605-2.608 (1988); Levitt, R.C., y Mitzner, W., J. Appl. Physiol., 67(3):1.125-1.132 (1989). Se valoró el ATPI mediante el cambio en la presión máxima de inspiración (Ppi) integrada desde el tiempo de inyección hasta la presión máxima vuelta al punto de referencia o estancada. El ATPI era comparable a la resistencia de la vía respiratoria (Rrs), sin embargo, el ATPI incluye un componente adicional relacionado con la recuperación de la broncoconstricción.

Se identificó la distribución por raza de la sensibilidad bronquial en múltiples razas de ratón consanguíneo en estudios previos (Levitt, R.C. y Mitzner, W., FASEB J., 2:2.605-2.608 (1988); Levitt, R.C. y Mitzner, W., J. Appl. Physiol., 67(3):1.125-1.132 (1989). Se determinó el Rrs y/o ATPI en ratones A/J, C3H/HeJ, DBA/2J, C57BL/6J.

Antes de sacrificarlos se recogió toda la sangre para las mediciones de IgE en suero mediante perforación con aguja de la vena cava inferior en animales completamente anestesiados. Se centrifugaron las muestras para separar las células y se recogió el suero y se usó para medir los niveles de IgE totales. Las muestras no medidas inmediatamente se congelaron a -20ºC.

Se formó previamente el lavado broncoalveolar y los análisis celulares tal como se ha descrito en otra parte de la memoria (Kleeberger et al., 1990).

Se midieron todos las muestras de suero de IgE usando un ensayo tipo "sándwich" de anticuerpo ELISA. Se recubrieron placas Microtiter (Corning Nº2585096, Corning, NY), 50 \mul por pocillo, con anticuerpo anti IgE de ratón de rata (Southern Biotechnology Nº1130-01, Birmingham, AL) a una concentración de 2,5 \mug/ml en tampón de recubrimiento de carbonato de sodio-bicarbonato de sodio con azida de sodio (Sigma NºS-7795, NºS-6014 y NºS-8032, St. Louis, MO). Se recubrieron placas con un envoltorio plástico y se incubaron a 4ºC durante 16 horas. Las placas se lavaron tres veces con un tampón de lavado de Tween-20 al 0,05% (Sigma NºP-7949) en disolución salina tamponada con fosfato (BioFluids Nº313, Rockville, MD), incubando durante cinco minutos para cada lavado. El bloqueo de los sitios de unión no específicos se efectuó añadiendo 200 \mul por pocillo de albúmina de suero bovina al 5% (Sigma NºA-7888) en PBS, recubriendo con envoltorio plástico e incubando durante 2 horas a 37ºC. Después de lavar tres veces con tampón de lavado, se añadieron a los pocillos muestras del ensayo de 50 \mul duplicadas. Las muestras del ensayo se sometieron a ensayo después de ser diluidas 1:10, 1:50 y 1:100 con BSA al 5% en tampón de lavado. Además de las muestras de ensayo se sometieron a ensayo un conjunto de patrones de IgE (PharMingen Nº03121D, San Diego, CA) a concentraciones de 0,8 ng/ml a 200 ng/ml en BSA al 5% en tampón de lavado para generar una curva patrón. Se usó un blanco de no muestra o patrón para poner a cero el lector de placa (fondo). Después de añadir las muestras y los patrones, se recubrió la placa con envoltorio plástico y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con tampón de lavado, se añadió 50 \mul del segundo conjugado de peroxidasa de rábano con anticuerpo anti IgE de ratón de rata (PharMingen Nº02137E) a una concentración de 250 ng/ml en BSA al 5% en tampón de lavado. Se recubrió la placa con envoltorio plástico y se incubó 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con tampón de lavado, se añadió 100 \mul de la O-fenilaminadiamina 0,5 mg/ml sustrato (Sigma NºP-1526) en tampón de citrato 0,1 M (Sigma NºC-8532) a cada pocillo. Después de 5-10 minutos se paró la reacción con 50 \mul de H_{2}SO_{4} al 12,5% (VWR Nº3370-4, Bridgeport, NJ) y se midió la absorbancia a 490 nm en un lector de placa MR-5000 Dynatech (Chantilly, VA). Se construyó una curva patrón a partir de las concentraciones de IgE estándar con la concentración de antígeno en el eje "x" (escala de logaritmo) y la absorbancia en el eje "y" (escala lineal). Se interpoló la concentración de IgE en las muestras a partir de la curva patrón.

Ejemplo 2 El papel de IL-9 en modelos de murina de asma: La respuesta de la vía respiratoria de animales sensibilizados Animales, realización de fenotipo y optimización de la sensibilización de antígeno

Los animales y el manejo fueron esencialmente tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. La sensibilización con albúmina de huevo de pavo (OVA) y el desafío con aerosol se llevó a cabo para valorar el efecto sobre BHR, BAL e IgE en suero. Se inyectó OVA I.P. (25 \mug) el día 0 antes del tratamiento con aerosol con disolución salina o con OVA. Los ratones se sometieron a un desafío con tratamiento con aerosol con disolución salina o con OVA la cual se administraba una vez al día durante 5 a 7 días comenzando o bien el día 13 o el 14. Las mediciones fenotípicas de IgE en suero, BAL y BHR se llevaron a cabo el día 21. Se evaluó el efecto de una exposición a aerosol con OVA de 7 días en el desafío broncoconstrictor con 5-HT y acetilcolina junto con el IgE total en suero, los recuentos celulares totales de BAL y los recuentos celulares diferenciales, y la sensibilidad bronquial. Se examinó el efecto del anticuerpo (Ab) o del pretratamiento con disolución salina sobre la inflamación de pulmón inducida por aerosol con disolución salina o aerosol con OVA midiendo BHR, BAL e IgE en suero. Se administraron Ab I.P. 2-3 días antes del tratamiento con aerosol de disolución salina o OVA.

La histología del pulmón se llevó a cabo después de extraer los pulmones durante anestesia profunda. Ya que la instrumentación anterior puede introducir artefactos, se usaron animales separados para estos estudios. Por tanto, se trató un pequeño grupo de animales en paralelo exactamente igual que el cohorte que recibían diversos pretratamientos excepto que estos animales no se usaron para otros ensayos a parte del ensayo de sensibilidad bronquial. Después de ensayar la sensibilidad bronquial, se extrajeron los pulmones y se sumergieron en nitrógeno líquido. El examen histológico y de criosección se llevó a cabo de un modo rutinario.

Los anticuerpos neutralizadores policlonales para IL-9 murina se adquirieron de "R & D systems", Minneapolis, MN y los anticuerpos bloqueadores para el receptor de IL-9 murina estaban producidos por "Magainin Pharmaceuticals Inc." por "Lampine Biological Labatories", Otsville, PA usando conjugados peptídicos producidos en Magainin. Los antisueros policlonales se prepararon en conejos contra secuencias peptídicas del receptor de IL-9 murina. Los péptidos usados para producir los antisueros fueron: GGQKAGAFTC (residuos 1-10)(SEC. I.D. Nº:19); LSNSIY
RIDCHWSAPELGQESR (residuos 11-32)(SEC. I.D. Nº:20); y CESYEDKTEGEYYKSHWSEWS (residuos 184-203 con un residuo de Cys añadido al terminal N para acoplar el péptido a la proteína vehículo)(SEC. I.D. Nº:21). Los antisueros se generaron usando técnicas descritas en Protocols in Immunology, Capítulo 9, Wiley. Brevemente se acoplaron los péptidos a la proteína vehículo, hemocianina de Lapa californiana "Keyhole Limpet" (Sigma), a través de la cadena lateral del residuo Cys usando el agente MBS de enlace cruzado bifuncional (Pierce). Se usaron los conjugados peptídicos para inmunizar conejos con adyuvantes apropiados y se obtuvieron antisueros útiles después de varias inyecciones de recuerdo del conjugado peptídico. Se usaron los anticuerpos de manera terapéutica para regular por disminución las funciones de IL-9 y valorar la importancia de esta ruta para la sensibilidad pulmonar de referencia, IgE en suero y BAL en el ratón insensibilizado. Después del pretratamiento con Ab sobre el punto de referencia se determinó los niveles de IgE en suero, BHR y BAL relativos a los controles. En experimentos adicionales, se administraron I.P. IL-9 murina y humana recombinante 1 día antes y diariamente durante la sensibilización de antígeno (días 13-18). A continuación, se realizó el fenotipo de los animales tal como se ha descrito.

En la Figura 1 tabla 1 (superior) se muestra la respuesta fenotípica de un animal representativo tratado con disolución salina I.P. el día cero y sometido a desafío los días 14-20 con disolución salina (tal como se ha descrito en el Ejemplo 1). El IgE total en suero de referencia (control) era de 9,2 ng/ml. Los recuentos celulares totales del lavado broncoalveolar (BAL, del Inglés "Bronchoalveolar Lavage") mostraban 182.500 células por mililitro de BAL. Estos animales no demostraron hipersensibilidad bronquial si se comparaban con los controles históricos (Levitt, R.C. y Mitzner, W., J. Appl. Physiol., 67(3):1.125-1.132; 1989).

La Figura 1 tabla 2 (mitad superior) muestra un animal representativo de un grupo sensibilizado con anterioridad con OVA I.P. el día cero y sometido a desafío con disolución salina los días 14-20. Estos animales no diferían en su respuesta a broncoconstrictor, IgE en suero o recuentos celulares de BAL de los ratones insensibilizados (Figura 7 tabla superior).

La Figura 1 tabla 3 (mitad inferior) muestra un animal representativo de aquellos sensibilizados con anterioridad con OVA I.P. el día cero y sometidos a desafío con antígeno (OVA) los días 14-20. Estos animales desarrollaron hipersensibilidad bronquial (aproximadamente de dos a tres veces sobre los controles), IgE en suero elevado (aproximadamente mil veces sobre los controles) y números aumentados de células inflamatorias en la vía respiratoria tal como se demuestra por los recuentos celulares elevados de BAL (aproximadamente treinta veces) en comparación con los controles (Figura 1 las 2 tablas superiores). La mayoría de las células reclutadas de la vía respiratoria como resultado de este desafío con antígeno eran eosinófilos.

La Figura 1 tabla 4 (inferior) muestra un animal representativo de los sensibilizados con anterioridad con OVA I.P. el día cero, pretratado con anticuerpos neutralizadores policlonales para IL-9 murina (aproximadamente 200 \mug/ratón I.P. en 0,5 ml de PBS) y sometido a desafío con antígeno (OVA) los días 14-20. Estos animales se protegieron de la respuesta a antígeno. No diferían significativamente en su sensibilidad bronquial, IgE en suero o recuentos celulares de BAL de los controles (Figura 1 las 2 tablas superiores).

La Figura 2 ilustra el efecto del desafío con antígeno a OVA (tal como se ha descrito anteriormente) con y sin pretratamiento con anticuerpos neutralizadores policlonales a IL-9 murina I.P. tres días antes en animales representativos. La figura izquierda (A1-2-1B) es una sección histológica de los pulmones de los animales controles (sensibilizados a OVA pero expuestos solamente a un desafío con aerosol de disolución salina). La Figura del medio (A1-3-5) es una sección histológica de los pulmones de animales sensibilizados a OVA y expuestos a un desafío con aerosol de OVA. La figura derecha (A1-4-5) es una sección histológica de los pulmones de animales sensibilizados a OVA y expuestos a un desafío con aerosol de OVA los cuales se pretrataron tres días antes con anticuerpos neutralizadores policlonales a IL-9 murina. El pretratamiento con el anticuerpo neutralizador produjo la confirmación histológica de la protección completa del desafío con antígeno.

La Figura 3 tabla 1 (superior) muestra un animal representativo de ratones sensibilizados con anterioridad con OVA I.P. el día cero y sometidos a desafío con antígeno (OVA) los días 13-18. Estos animales desarrollaron hipersensibilidad bronquial (aproximadamente de dos a tres veces sobre los controles) y números aumentados de células inflamatorias que incluyen eosinófilos en las vías respiratorias tal como se demuestra mediante los recuentos celulares elevados de BAL en comparación con los controles (Figura 1 las 2 tablas superiores). Muchas de las células reclutadas de las vías respiratorias como resultado de este desafío con antígeno fueron eosinófilos.

La Figura 3 tabla 2 (inferior) muestra un animal representativo de los sensibilizados con anterioridad con OVA I.P el día cero, pretratados con anticuerpos neutralizadores policlonales al receptor de IL-9 murina (aproximadamente 1 mg/ratón I.P. en 0,5 ml de PBS) y sometidos a desafío con antígeno (OVA) los días 13-18. Este animal representativo se protegió de la respuesta a antígeno. Esta respuesta no difería significativamente la hipersensibilidad bronquial, los recuentos celulares de BAL de los controles (Figura 1 las 2 tablas superiores). Estos datos demuestran la eficacia potencial del tratamiento de la alergia atópica con anticuerpos al receptor de IL-9.

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Otras realizaciones de la invención descrita anteriormente serán aparentes para los expertos en la técnica a partir de la consideración de la memoria y la práctica de la invención descrita en la presente memoria. Se intenta que la memoria y los ejemplos considerados solamente como ilustrativos, estén indicados mediante las siguientes reivindicaciones con el verdadero alcance y espíritu de la invención.

Claims (12)

1. Uso de un anticuerpo, el cual es un anticuerpo antiinterleuquina 9 o un anticuerpo de receptor de antiinterleuquina 9, que bloquea la unión de interleuquina 9 al receptor de interleuquina 9, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del asma.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo está en una cantidad suficiente para regular por disminución la actividad de interleuquina 9.

3. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho anticuerpo reduce la eosinofilia en el lavado bronquial en un paciente.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

5. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo es un fragmento de unión de antígeno.

6. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho medicamento se administra mediante inyección.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho medicamento se administra mediante inyección intravenosa.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho medicamento se administra mediante inyección subcutánea.

9. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho medicamento se administra mediante inhalación.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho medicamento se administra mediante un dispositivo de inhalación.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho medicamento se administra mediante un inhalador de dosis medida.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho medicamento se administra mediante un inhalador de polvo seco.