ES2248816T3 - Moleculas polipeptidicas de fase preeritrocitica del paludismo. - Google Patents
Moleculas polipeptidicas de fase preeritrocitica del paludismo.Info
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Abstract
MOLECULAS POLIPEPTIDICAS QUE CONTIENEN AL MENOS 10 AMINOACIDOS CONSECUTIVOS DE LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS QUE REPRESENTA EL ANTIGENO LSA-3 MOSTRADO EN LA FIGURA 2, A EXCEPCION DE LOS POLIPEPTIDOS (I).
Description
Moléculas polipeptídicas de fase preeritrocítica
del paludismo.
Los parásitos responsables del paludismo en el
hombre presentan en el huésped humano morfologías diferentes y
expresan antígenos diferentes en función de su ubicación en el
organismo. Las diferencias morfológicas y antigénicas de estos
parásitos en el transcurso de sus ciclos de vida en el hombre
permiten definir diferentes fases de desarrollo en el hígado y en la
sangre: el esporozoito, forma infecciosa inyectada por el mosquito
vector, se transforma rápidamente en esquizonte en los hepatocitos
del huésped para infectar después los eritrocitos. La ubicación
intrahepática de P. falciparum se traduce en la expresión de
un grupo de antígenos específicos de esta fase de desarrollo y muy
inmunógenos en las condiciones naturales de exposición a la
enfermedad. Esta fase, clínicamente silenciosa, es actualmente la
única contra la que se puede inducir experimentalmente en el hombre
una gran inmunidad, esterilizante, mediante la inyección de
esporozoitos irradiados, capaces de penetrar en el hepatocito y
desarrollarse en él, pero que no pueden llegar a la fase sanguínea
de la enfermedad. Es por esto que los inventores han enfocado la
mayor parte de sus esfuerzos en estas dos fases preeritrocíticas.
Pero estas fases son también las más delicadas de estudiar, y por
tanto las menos conocidas, ya que la obtención de material biológico
es difícil, incluso imposible, y el único modelo de estudio in
vitro tiene un rendimiento muy bajo y el mejor modelo animal es
aún el chimpancé, de uso limitado y
costoso.
costoso.
Con el fin de acceder a los antígenos de las
fases preeritrocíticas, los inventores han utilizado sueros de
individuos que residen en zonas endémicas desde hace 25 años, pero
bajo profilaxis permanente con cloroquina. Estos individuos recibían
regularmente picaduras de mosquitos infectados, pero no
desarrollaban ninguna infección sanguínea completa. Su suero
contenía por tanto anticuerpos dirigidos fundamentalmente contra las
fases preeritrocíticas, lo que se verificó por inmunofluorescencia
(IF) y Western Blot (inmunotransferencia) sobre las 3 fases del
parásito.
El uso de estos sueros para el cribado de un
banco de ADN genómico del clon parasitario de P. falciparum
construido en vectores de expresión en un fago lambda gt11 (V.
Rosario, Science 212, 1981, p. 1037-1038; y
Thaithong et al., Transactions of the Royal Society of
Tropical Medicine and Hygiene, 1984, 78:242-245) ha
llevado a la observación de polipéptidos de la fase preeritrocítica,
particularmente los polipéptidos SALSA (Sporozoite Liver Stage
Antigen, antígeno de la fase hepática del esporozoito) descritos en
el documento EP A-0407230 y LSA 1 (Liver Stage
Antigen, antígeno de la fase hepática) descrito en el documento WO
92/13884. La presente invención se refiere a nuevas moléculas
polipeptídicas específicas a la fase preeritrocítica y a su uso como
principio activo de una vacuna antipalúdica o en métodos de
diagnóstico de la enfermedad.
La invención ha resultado de la observación por
los inventores de las propiedades particulares de un antígeno en
particular denominado LSA-3 y de sus fragmentos, que
aparecen como candidatos con un fuerte potencial para realizar una
vacuna antipalúdica, y esto por los motivos siguientes:
a) cuando se utilizó una fracción de
LSA-3 en combinación con otro antígeno de la misma
fase de desarrollo del parásito, como LSA-1, para
inmunizar chimpancés, el animal que respondía a las dos moléculas o
sólo a LSA-3 presentaba la característica de no
tener parásitos en la sangre, de tener una disminución importante de
los parásitos en el hígado, y de manifestar un reclutamiento
importante de células mononucleares, lo que indica una respuesta en
inmunidad celular;
b) en zonas endémicas, se observa una correlación
muy clara entre la protección de los individuos contra las
infecciones naturales por esporozoitos y sus respuestas en
anticuerpos contra LSA-3;
c) en ocho voluntarios inmunizados por inyección
de esporozoitos irradiados, se encontraron anticuerpos contra
LSA-3 en cada uno de los cuatro individuos que
resisten a una infección por esporozoitos y en ninguno de los otros
cuatro voluntarios que desarrollaron una infección sanguínea;
d) los anticuerpos obtenidos contra el péptido
DG729 en el documento WO 92/13884 ya descrito producen una reacción
cruzada con las fases de esporozoito y hepática del parásito murino
P. yoelii, lo que permite una explotación significativa del
modelo en ratones. In vitro, los anticuerpos humanos
inmunopurificados sobre DG279 son capaces, incluso a concentraciones
muy débiles, de bloquear la penetración de los esporozoitos de P.
yoelii en los hepatocitos murinos. In vivo, los ratones
inmunizados con DG279 están total o parcialmente protegidos contra
las infecciones por los esporozoitos de P. yoelii;
e) finalmente, ciertos epítopos, particularmente
en las partes no repetidas de la molécula, estimulan la secreción de
interferón \gamma por los monocitos, permitiendo este mediador
inhibir el desarrollo intrahepático del parásito (S. Mellouk et
al., The Jour. of Immun. 139, 4192-4195,
1987).
f) se analizó la secuencia de la región
LSA-3 que corresponde a un (lipo) péptido NR2 en 27
muestras: 4 cepas de laboratorio (NF54, K1, Palo Alto, T9/96), 3
aislados malgaches, 3 aislados birmanos, 5 aislados brasileños, 7
aislados marfileños, y 5 aislados tailandeses. No se observó ninguna
mutación en los 300 pares de bases analizados, es decir un 100% de
conservación en esta región inmunológicamente importante que
contiene uno o más epítopos B, Th y
CTL.
CTL.
g) se obtuvo información sobre la estructura del
antígeno, y particularmente de un péptido RE, y más particularmente
sobre la región central repetida a partir de la que se concibió el
péptido RE y que forma uno o más epítopos B mayores, a partir del
Hydrophobic Cluster Plot (gráfico de agrupaciones hidrófobas) de la
secuencia disponible en el clon T9/96 (630 aminoácidos), (Gaboriot
et al., (1987): Hydrophobic Cluster Analysis: an efficient
new way to compare and analyse amino acid sequences, FEBS Letters,
224:149-155); este método predice una gran
propensión a la organización en hélice \alpha. La región repetida
presenta una extraordinaria regularidad en la distancia de los
residuos de valina y de isoleucina, alternando con residuos ácidos o
de prolina. La disposición de los grupos hidrófobos en la superficie
de esta hélice evoca un borde hidrófobo que se desplaza gradualmente
de una cara de la hélice a la otra, siguiendo una orientación
general constante a lo largo de la molécula, y probablemente en
relación con una estructura o un empaquetamiento
"coiled-coil", como aparece en al figura 4b que
representa el HCP (Hydrophobic Cluster Plot) de la secuencia
peptídica del clon DG729.
h) después de demostrar que existe un gran
intervalo de respuestas inmunitarias al antígeno
LSA-3, se analizó la capacidad de las células que
respondían para ubicarse alrededor de los parásitos en el hígado. En
los ratones inmunizados por los antígenos recombinantes, la
inyección por vía intraportal de cada uno de los péptidos absorbidos
sobre bolas de poliestireno de 10\mum permite visualizar al cabo
de 48 horas un aflujo de linfocitos alrededor del antígeno (que
mimetiza el parásito), y al quinto día, un importante reclutamiento
de células que pertenecen a la línea
macrofágica.
macrofágica.
Todas estas propiedades de entre las cuales
algunas se demostrarán en detalle en los experimentos descritos más
adelante muestran que el antígeno LSA-3 presenta a
la vez una buena antigenicidad y una buena inmunogenici-
dad.
dad.
Los inventores han podido confirmar y precisar la
especificidad de las fases de expresión de la molécula; al nivel de
los esporozoitos, esta expresión se ha confirmado mediante tinción
inmunofluorescente en superficie de varias cepas y aislados. En
análisis por "Western Blot" (o inmunotinción), la molécula
LSA-3 aparece como una proteína de un peso molecular
de 200.000 dalton. Si los ARN mensajeros de los esporozoitos no se
han podido obtener en una cantidad suficiente para un análisis por
"northern blot", experimentos en PCR inverso han confirmado la
expresión de LSA-3 en esta fase. Al nivel de los
hepatocitos infectados, se observa LSA-3 en la
vacuola parasitófora del parásito por inmunofluorescencia con ayuda
de anticuerpos contra las regiones repetidas y no repetidas de la
proteína, así como por microscopía electrónica.
En la solicitud número WO 92/13884 se ha descrito
un fragmento de LSA-3 denominado 729S así como tres
péptidos denominados NRI y NRII incluidos en la parte no repetida, y
729 R incluido en la parte repetida. No obstante, este documento no
evoca las propiedades particulares mencionadas anteriormente ni
otros fragmentos de LSA-3 que podrían ser o bien más
largos o bien más cortos, incluidos o combinados con estos
fragmentos que presentarían propiedades particularmente interesantes
para un uso en vacunas.
La invención tiene por objeto moléculas
polipeptídicas que contienen al menos diez aminoácidos consecutivos
de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 y denominada
SEQ ID nº 2, y que representa LSA-3, excluyéndose
los polipéptidos siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Otras moléculas según la invención contienen al
menos 20 aminoácidos consecutivos o al menos 50.
El conjunto de estos polipéptidos y la molécula
LSA-3 se denominará en lo sucesivo "polipéptidos
de la invención" en el presente documento.
Los resultados experimentales y las comparaciones
de la secuencia no repetida entre los diferentes aislados de P.
falciparum indican la existencia de una homología de al menos un
70% entre antígenos equivalentes de la fase hepática del parásito.
Además, cualquier molécula peptídica que presente al menos un 70% de
homología con una cualquiera de las moléculas definidas
anteriormente forma parte de la invención, así como las que
presenten un 70% de homología con la secuencia siguiente:
comprendida entre los aminoácidos
140-159 de K1 o 23-42 de
T9/96.
Del mismo modo forman parte de la invención las
moléculas polipeptídicas que presenten al menos un 70% de homología
con la secuencia representada en la figura 3 que representa una
parte de LSA-3 en T9/96: el ADN de este aislado de
P. falciparum ha sido digerido por enzimas de restricción y
posteriormente clonado en lambda gt11 y a permitido así constituir
la genoteca de este aislado ya descrito anteriormente.
Forman parte de la invención igualmente los
conjugados constituidos por un polipéptido proveniente de
LSA-3 unido de manera covalente por un puente de
lisina a residuos lipídicos saturados o insaturados, más
particularmente cuando el residuo lipídico es un palmitoilo o un
palmitilo o un oleilo. Se acoplaron así mediante un puente de lisina
residuos en C16 o en C18 a los péptidos NRI, NRII, 729 RE y CT1 ya
representados anteriormente. El método de síntesis utilizado para
estos conjugados se describe en Bourgault, Journal of Immunology,
149, 3416 (1992) y Rouaix, Vaccine, 12, 1209 (1994).
La invención se refiere igualmente a
composiciones inmunógenas que contienen al menos una molécula
polipeptídica o un conjugado descrito anteriormente, así como a
vacunas que contienen estas composiciones inmunógenas. Se han
descrito anteriormente otros epítopos inmunógenos, particularmente
LSA-1, SALSA o STARP en el documento EP
A-0407230 y en el documento WO 92/13884. Las
composiciones de vacunas según la invención pueden contener de
manera ventajosa una mezcla de péptidos inmunógenos provenientes de
LSA-3 y péptidos o antígenos provenientes de
LSA-1, SALSA o STARP; una mezcla más particularmente
interesante podría ser la que está constituida por una parte por
NRI, NRII o LSA-3 enteros, acoplados o no a un
residuo lipídico, y por otra parte por péptidos
SALSA-1 o SALSA-2 o el antígeno
SALSA acoplado o no a un residuo lipídico.
Todas las moléculas polipeptídicas que respondan
a la definición anterior y que presenten un 70% de homología con los
polipéptidos LSA-3, CT1, NRI, NRII o 729RE pueden
combinarse de manera homóloga o heteróloga con otras secuencias
peptídicas o provenientes de otro antígeno de diferentes fases de
P. falciparum.
Por un 70% de homología de las secuencias se
entiende que se trata de una homología de secuencias con respecto a
uno cualquiera de los aislados cuya secuencia se conoce o se puede
conocer, y no globalmente entre el conjunto de aislados. De hecho,
la región central repetida de LSA-3 (bloque 2 de la
figura 4) presenta un número variable de secuencias repetidas
responsables de cierta variabilidad de un aislado a otro como viene
indicado además en la representación de la figura 4 en la que la
diferencia de longitud entre las partes repetidas del bloque 2 de
los aislados T9/96 y K1 es flagrante aunque los tetrapéptidos que
constituyen esta región repetida (VEES, VEEN, VEEI, VAPS, VAPT,
etc.) estén muy bien conservados. Por el contrario, las secuencias
repetidas del bloque 1 se conservan perfectamente entre los dos
aislados. Además, habida cuenta de la variabilidad intrínseca de
este bloque 2 de un aislado al otro, se entiende la definición 70%
de homología para el antígeno LSA-3 de los
diferentes aislados con la exclusión de las secuencias repetidas del
bloque 2.
La invención se refiere igualmente a los
anticuerpos policlonales o monoclonales que reconozcan
específicamente las moléculas polipeptídicas de la invención.
Estas moléculas de la invención pueden utilizarse
para la puesta en práctica de los métodos de diagnóstico y la
fabricación de kits que permiten detectar la existencia de la
infección por P. falciparum; este método puede ser o bien una
dosificación de anticuerpos específicos circulantes por la puesta en
práctica de métodos serológicos clásicos por la puesta en contacto
de uno de los antígenos anteriores con un fluido biológico del
individuo en cuestión, o bien métodos de dosificación de antígenos
que utilizan anticuerpos policlonales o monoclonales obtenidos por
métodos clásicos de obtención de tales anticuerpos por los antígenos
correspondientes. En los paquetes o kits de diagnóstico de la
invención están presentes los reactivos que permiten la detección de
los complejos antígeno-anticuerpo producidos,
pudiendo igualmente llevar un marcador o reconocerse a su vez
mediante un reactivo marcado. Según se desee realizar una prueba de
antígenos o una prueba serológica, el kit comprende o bien los
anticuerpos o bien los antígenos de la invención.
La invención se refiere igualmente a todas las
secuencias de nucleótidos que codifican para un polipéptido de la
invención así como a todo ácido nucleico recombinante que contiene
al menos una secuencia de nucleótidos de la invención, insertado
dentro de un ácido nucleico heterólogo en cuanto a dicha secuencia
de nucleótidos.
Forman parte de la invención las secuencias de
ácidos nucleicos que codifican para LSA-3 o sus
fragmentos inmunógenos y que responden a una de las definiciones
siguientes:
(a) la cadena de nucleótidos tal como se
representa en la SEQ ID nº 1 de la figura 1, o
(b) la cadena de nucleótidos que se representa en
la SEQ ID nº 2 de la figura 2,
(c) una cadena que presenta al menos un 70% de
homología con la de la figura 1, o de la figura 2 o,
(d) una cadena de nucleótidos complementarios a
los que se describen en (a), (b) o (c).
Se entiende por que codifica para
LSA-3 tanto el gen representado en la SEQ ID nº 1 de
la figura 1 como el ADNc representado en la SEQ ID nº 2 de la figura
2.
La invención se refiere más particularmente a un
ácido nucleico recombinante en el que la secuencia de nucleótidos de
la invención se precede de un promotor (particularmente un promotor
inducible) bajo el control del cual se puede efectuar la
transcripción de dicha secuencia, y llegado el caso, puede seguir
una secuencia que codifica para señales de terminación de la
transcripción.
La invención se refiere igualmente a la secuencia
codificante que proviene del clon T9/96, representada sobre la
figura 3 para la SEQ ID nº 3.
En esta secuencia, el fragmento CT1 está
comprendido entre los nucleótidos 67 y 126, el fragmento 679
comienza en el nucleótido 206 y el fragmento 729 RE está comprendido
entre los nucleótidos 547 y 630.
La invención se refiere, finalmente, a cualquier
vector recombinante, utilizado particularmente para la clonación de
una secuencia nucleotídica de la invención, y/o para la expresión
del polipéptido codificado por esta secuencia, y caracterizado
porque contiene un ácido nucleico recombinante, tal como se define
anteriormente, en uno de los sitios no esenciales para su
replicación.
A modo de ejemplo de vector mencionado
anteriormente, se mencionan los cósmidos, los fagos o los virus.
De este modo, la invención se refiere más
particularmente al plásmido pK1.2 depositado en el CNCM (Centro
Nacional de Cultivos de Microorganismos) con el número
I-1573.
La invención tiene por objeto igualmente un
procedimiento de preparación de un polipéptido de la invención
mediante la transformación de un huésped celular con la ayuda de un
vector recombinante del tipo indicado anteriormente, seguido de la
puesta en cultivo del huésped celular así transformado y de la
recuperación del polipéptido en el medio de cultivo.
Así, la invención se refiere a todo huésped
celular transformado por un vector recombinante tal como se definió
anteriormente, y que comprende los elementos de regulación que
permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifican
para un polipéptido según la invención.
La invención se refiere igualmente a cebadores de
ADN (o de ARN) que se pueden utilizar en el marco de la síntesis de
secuencias nucleotídicas y/o polipeptídicas de la invención,
mediante la técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) o cualquier
otro método conocido actualmente para amplificar los ácidos
nucleicos tales como LCR, CPR, ERA, SPA, NASBA, etc.
La invención se refiere a cualquier cebador de
ADN o de ARN caracterizado porque está constituido por
aproximadamente de 10 a 25 nucleótidos, idénticos o complementarios
a los de 10 a 25 primeros nucleótidos de la secuencia de nucleótidos
que codifica para una secuencia peptídica según la invención o
idénticos a los de 10 a 25 últimos nucleótidos de dicha
secuencia.
Así, la presente invención se refiere igualmente
a un procedimiento de preparación de un polipéptido de la invención
que comprende las etapas siguientes:
- llegado el caso, la amplificación previa
mediante técnicas clásicas de la cantidad de secuencias de
nucleótidos que codifican para dicho polipéptido con la ayuda de dos
cebadores de ADN escogidos de la manera adecuada.
- la puesta en cultivo, en un medio de cultivo
adecuado, de un huésped celular previamente transformado por un
vector que contiene un ácido nucleico según la invención que
comprende la secuencia nucleotídica que codifica para dicho
polipéptido, y
- la recuperación, a partir del medio de cultivo
mencionado anteriormente, del polipéptido producido por dicho
huésped celular transformado.
A modo de ejemplo de cebadores de ADN o de ARN
según la invención, se mencionan los pares de secuencias
siguientes:
\newpage
- S1: GTGATGAACTTTTTAATGAATTATTAAA (SEQ ID nº:4)
- S2: TGTTGTTCTTGTTGAACACTTTTTACTAA (SEQ ID nº 5)
en los que las posiciones
respectivas sobre el gen LSA-3/K1 representado en la
figura 1 son de 695 a 722 y de 829 a 799 (en lectura inversa), o el
par:
- 6.1: GGTATCGAAACTGAGGAAATAAAGG (SEQ ID nº 6)
- 6.2: CATAGCAGGAACATCAACATCCAC (SEQ ID nº 7)
en los que las posiciones
respectivas son de 2668 a 2692 para 6.1 y de 3456 a 3433 para 6.2
(lectura
inversa).
La información sobre las secuencias ID nº 4, ID
nº 5, ID nº 6 e ID nº 7 se detallan al final de la descripción.
Los péptidos de la invención pueden prepararse
igualmente mediante las técnicas clásicas de la síntesis de
péptidos. Esta síntesis puede realizarse en disolución homogénea o
en fase sólida. Por ejemplo, se podrá recurrir a la técnica de
síntesis en disolución homogénea descrita por HOUBENWEYL en la obra
titulada "Meuthode der Organischen Chemie" (Método de Química
Orgánica, editado por E. Wunsch, vol. 15-I y II.
THIEME, Stuttgart 1974), o aquella descrita por R.D. MERRIFIELD en
el artículo titulado "Solid phase peptide synthesis" (J. Am.
Chem. Soc. 45, 2149-2154).
La invención se refiere igualmente a los
oligómeros solubles en agua de los péptidos monoméricos indicados
anteriormente.
La oligomerización puede provocar un aumento de
la inmunogenicidad de los péptidos monoméricos según la invención.
Sin que pueda considerarse limitativa tal indicación cifrada, no
obstante se menciona que los oligómeros pueden contener, por
ejemplo, de 2 a 10 unidades monoméricas.
Se puede tener recurso, para realizar la
oligomerización, a cualquier técnica de polimerización utilizada
actualmente en el dominio de los péptidos, conduciéndose esta
polimerización hasta la obtención de un oligómero o un polímero que
contiene el número de patrones monoméricos requeridos para adquirir
la inmunogenicidad deseada.
Un método de oligomerización o de polimerización
de un monómero consiste en hacerlo reaccionar con un agente
reticulante tal como el glutaraldehído.
Se puede recurrir igualmente a otros métodos de
oligomerización o de acoplamiento, por ejemplo al que pone en juego
acoplamientos sucesivos de unidades monoméricas mediante sus
funciones terminales carboxilo y amino en presencia de agentes de
acoplamiento homo o heterobifuncionales.
La invención se refiere además a los conjugados
obtenidos por acoplamiento covalente de los péptidos según la
invención (o de los oligómeros mencionados anteriormente) a
moléculas portadoras que permiten particularmente aumentar la
inmunogenicidad (naturales o sintéticas), fisiológicamente
aceptables y no tóxicas, mediante grupos reactivos complementarios
portados respectivamente por la molécula portadora y el péptido. A
modo de ejemplo de moléculas portadoras o soportes macromoleculares
que constituyen los conjugados según la invención, se mencionarán
proteínas naturales tales como la anatoxina tetánica, la ovalbúmina,
sueros de albúmina, hemociaminas, el PPD de la tuberculina (PPD:
"Purified Protein Derivative", derivado proteico purificado),
etc.
A modo de soportes sintéticos macromoleculares se
mencionarán por ejemplo polilisinas o
poli(D-L-alanina)-poli(L-lisina).
A modo de soportes hidrocarbonados o lipídicos,
se mencionarán los ácidos grasos, saturados o insaturados, y
preferiblemente aquellos en C16 o C18 del tipo oleilo o
palmitoleilo.
Finalmente, y sin ser limitativos, los antígenos
o péptidos según la invención pueden acoplarse a soportes clásicos o
adsorberse sobre tales soportes, particularmente microesferas o
bolas de látex o de poliestireno, o incorporados en partículas
Ty1.
Para sintetizar los conjugados según la
invención, se puede recurrir a procedimientos conocidos en sí, tales
como el descrito por Frantz y Robertson en Infect. and Immunity, 33,
193-198 (1981), o el descrito en Applied and
Environmental Microbiology, (octubre 1981), vol. 42, nº 4,
611-614 por P.E. Kauffman utilizando el péptido y la
molécula portadora apropiada.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden
prepararse o bien mediante un procedimiento químico o bien mediante
otros procedimiento.
Un modo de preparación adecuado de los ácidos
nucleicos de la invención que contienen como máximo 200 nucleótidos
(o 200 pb, cuando se trata de ácidos nucleicos bicatenarios)
comprende las etapas siguientes:
- la síntesis de ADN utilizando el método
automatizado de \beta-cianetilfosforamidita
descrito en Bioorganic Chemistry 4; 274-325
(1986),
- la clonación de los ácidos nucleicos así
obtenidos en un vector adecuado y la recuperación del ácido nucleico
mediante hibridación con una sonda adecuada.
En el documento WO 92/13884 se ha descrito ya un
método de preparación por vía química de ácidos nucleicos de
longitud superior a 200 nucleótidos.
La invención se refiere igualmente a paquetes de
diagnóstico que contienen uno o más cebadores de amplificación
específicos del gen LSA-3 y que permiten detectar la
presencia del gen o del RNAm en un individuo propenso a ser
infectado por P. falciparum.
La invención se refiere también a composiciones
farmacéuticas o vacunales en las que uno al menos de los productos
según la invención se encuentra asociado a excipientes
farmacéuticamente aceptables, sólidos o líquidos, adaptados a la
construcción de formas orales, oculares o nasales, o a excipientes
adaptados a la construcción de formas de administración rectal, o
adicionalmente con excipientes gelatinosos para la administración
vaginal. Se refiere también a composiciones líquidas isotónicas que
contienen al menos uno de los conjugados según la invención,
adaptados a la administración sobre las mucosas, particularmente
oculares o nasales o pulmonares.
Ventajosamente, las composiciones vacunales según
la invención contienen además un vehículo, tal como la
polivinilpirrolidona, que facilita la administración de la vacuna.
En lugar de la polivinilpirrolidona, se puede utilizar cualquier
otro tipo de adyuvante en el sentido clásico que se daba antes a
esta expresión, es decir, de una sustancia que permite la absorción
más fácil de un medicamento o que facilita su acción en el
organismo. A modo de ejemplos de otros adyuvantes de este último
tipo, se mencionarán además la carboximetilcelulosa, los hidróxidos
y fosfatos de aluminio, la saponina o cualquier otro adyuvante de
este tipo, bien conocidos del experto en la técnica. Finalmente,
contienen, de ser necesario, un adyuvante inmunológico,
particularmente del tipo muramilpéptido.
La invención se refiere además a composiciones
farmacéuticas que contienen como principio activo al menos uno de
los anticuerpos policlonales o monoclonales definidos anteriormente
en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención se refiere, finalmente, a un método
de inmunización de un individuo propenso a infecciones por P.
falciparum mediante la inyección de una molécula peptídica o de
un oligómero tal como los que se han descrito anteriormente, sólo o
en asociación con otros tipos de moléculas que pueden proteger a
dicho individuo contra una infección posterior, utilizándose la
molécula polipeptídica o antigénica o los lipopéptidos naturales o
recombinantes, o bien solos, o bien adsorbidos o acoplados a
microesferas o bolas de látex o de poliestireno.
Características adicionales de la invención se
harán evidentes en los ejemplos ilustrados por las figuras a
continuación y que muestran las características particulares de las
moléculas de la invención con respecto a otros antígenos de la fase
preeritrocítica del parásito.
La figura 1 representa la secuencia ID nº 1 del
ADN genómico de 6152 pares de bases del gen LSA-3,
proveniente del clon K1.2, que en sí proviene de un aislado
tailandés.
La figura 2 representa la secuencia ID nº 2 del
ADNc y la secuencia polipeptídica del antígeno
LSA-3. La secuencia de ADN representa 5361 pares de
bases.
La figura 3 representa la secuencia ID nº 3 de la
parte secuenciada en el clon parasitario T9/96 (1890 pares de
bases), siendo la línea superior la secuencia nucleotídica y la
línea inferior la secuencia peptídica. En este clon, la secuencia
CT1 está comprendida entre los nucleótidos 67 y 126, comenzando el
fragmento DG 679 propiamente dicho en el nucleótido 207. El
fragmento 729 RE está comprendido entre los nucleótidos 547 y
629.
La figura 4a representa esquemáticamente las
posiciones relativas de las secuencias repetidas y no repetidas, de
los intrones y de los exones en las cepas K1 y T9/96, los clones 679
y 729 proviniendo de éste último.
La figura 4b representa el HCP (Hydrophobic
Cluster Plot) de la secuencia peptídica del clon DG729.
La figura 5 representa las cantidades de
inmunoglobulinas producidas en el suero del chimpancé Nuria antes y
después de la inmunización con diferentes péptidos de
LSA-3.
La figura 6 indica el título de anticuerpos
específico de diferentes especies de ratones inmunizados o bien con
un péptido o bien con un lipopéptido correspondiente.
La figura 7 muestra la inhibición de la invasión
de las células hepáticas por los esporozoitos por sueros
hiperinmunes obtenidos tras la inmunización con diferentes péptidos
inmunopurificados contra el LSA-3 entero.
\newpage
La figura 8 representa la comparación de un
antígeno proveniente de LSA-3 con dos antígenos
adicionales sobre la inmunidad de tipo T.
La figura 9 representa la inducción del
interferón-\gamma en los chimpancés Gerda y Dirk
con los péptidos provenientes de la molécula
LSA-3.
La figura 10 representa los resultados de
linfoproliferación de las PMBC de un individuo protegido por
inyección de esporozoitos irradiados contra péptidos provenientes de
los antígenos LSA-1 y LSA-3.
La criba inicial de la genoteca que proviene del
clon parasitario T9/96 con el suero de un misionario cuidado de
forma continua en profilaxis permitió aislar 120 clones
correspondientes a moléculas expresadas en el estado esporozoico y/o
hepático del ciclo de P. falciparum. El clon 729S se ha
utilizado como sonda para cribar un banco genómico de la cepa K1
tailandesa mencionada anteriormente que contiene grandes fragmentos
de Eco R1 clonados en el fago lambda gt10. Se ha purificado de esta
genoteca un inserto de 6,85 kilobases que contenía el gen entero y
se ha clonado de nuevo en un plásmido pUC18 para su secuenciación y
caracterización. En P. falciparum cuyo genoma es muy rico en
bases A:T (80%), este enfoque se ha vuelto a menudo difícil por la
rareza de sitios de restricción utilizables y por la inestabilidad o
incluso la imposibilidad de clonar ciertos fragmentos cuando están
insertados en vectores plasmídicos.
La estructura del gen está representada en la
figura 4 y presenta las siguientes características:
a) un mini exón 1 que codifica en su extremo 3'
para un péptido señal hidrófobo;
b) un intrón corto (168 pares de bases) incluido
entre sitios consenso de donadores y aceptores de empalme;
c) un segundo exón de 5 kilobases que codifica
para una región organizada de 1,8 kilobases y compuesto de una
disposición de 7 bloques de 4 aminoácidos, y de una región hidrófoba
en 3' que podría corresponder a un anclaje del tipo
glicosil-fosfatidil-inositol
(GPI).
Se ha realizado una investigación detallada del
polimorfismo de LSA-3 secuenciando el clon 679 que
contiene lo esencial de las secuencias repetidas del gen
LSA-3 y una porción de 1 kilobase de la fracción no
repetida en 3', representándose la secuencia de este fragmento en la
figura 3 entre los nucleótidos 207 y 1890.
Las repeticiones de la cepa K1 son las
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las repeticiones en el clon T9/96 tal como se
determinaron en la solicitud de patente número FR 9101286 del 5 de
febrero de 1991, son las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El exón 2 del gen LSA3 lleva 2 regiones repetidas
que pueden descomponerse en 3 bloques como se indica en la figura
4:
- el bloque 1, que codifica para una cadena de 14
tetrapéptidos. Este bloque está conservado al 100% en ácidos
aminoácidos y en ácidos nucleicos entre T9/96 y K1. Sólo los
tetrapéptidos VEES y VEEN se encuentran en el bloque 2.
- el bloque 2 codifica, en K1, para 127
tetrapéptidos que corresponden a una cadena de diferentes
octapéptidos, ellos mismos formados por la combinación de 2 de los 7
tetrapéptidos o patrones de base (VEES, VVES, VEEN, VEEI, VAEN,
VAPS, VAPT). El número de repeticiones y la disposición de estos
octapéptidos varían según los patrones y parecen ser específicos del
clon K1.2. De hecho, en el clon T9/96, el bloque 2 (53
tetrapéptidos) corresponde igualmente a la cadena de octapéptidos
formados a partir de 7 tetrapéptidos de base iguales (y de un octavo
patrón VVPS que no existe en K1), pero con un número y una
disposición diferente de estas repeticiones.
- el bloque 3 se constituye de la cadena de 10
tetrapéptidos degenerados y diferentes de los de los bloques 1 y 2.
Sin embargo, resultados preliminares obtenidos por PCR con el clon
T9/96 y otras varias cepas de laboratorio indican que no existe un
polimorfismo de tamaño en esta región.
Las regiones no repetidas del exón 2 se conservan
particularmente bien. De hecho, la comparación de secuencias entre
T9/96 y K1 ha podido realizarse sobre 315 pb en 5' del bloque 1 y en
763 pb en 3' del bloque 2. La homología es del 99,4% en ácidos
nucleicos y del 98,6% en aminoácidos.
La comparación de secuencias del clon 679
proveniente del clon de P. falciparum T9/96, y de la
secuencia correspondiente de LSA-3 proveniente del
aislado K1 muestra que el gen se conserva bien, observándose las
diferencias más notables en la región repetida en la que los bloques
de 4 aminoácidos están bien conservados pero varían en su número y
en su organización.
Por el contrario las partes 5' y 3' no repetidas
aparecen como particularmente bien conservadas mostrando hasta el
100% de homología en la región 5' dónde los epítopos B y T ya se han
identificado.
Amplificaciones de ADN, especialmente por PCR de
diferentes cepas de P. falciparum con 8 pares de cebadores
repartidos por el conjunto del gen LSA-3 han
mostrado que, exceptuando las que rodean las regiones repetidas,
todo el genoma produce productos de PCR de tamaño similar, lo que
sugiere que el antígeno LSA-3 se conser-
va bien.
va bien.
Se han hibridado diversas sondas
LSA-3, elegidas entre las regiones repetidas y no
repetidas, a baja restricción con los ADN de diferentes especies de
Plasmodium y no han permitido identificar ningún gen homólogo
a LSA-3, salvo en el parásito de chimpancé
P.reichenowi, lo que confirma el parentesco próximo de esta
especie con
P. falciparum.
P. falciparum.
Sorprendentemente, el antígeno análogo a
LSA-3 encontrado en P. yoelii, que produce
claramente reacciones inmunológicas cruzadas en la superficie del
esporozoito con los anticuerpos contra el fragmento 729S, no parece
estar conservado a nivel de la secuencia nucleotídica. Finalmente la
comparación de secuencias LSA-3 con las bases de
datos no ha relevado ninguna homología con moléculas conocidas, con
excepción de la región repetida de la que ciertos patrones presentan
una fuerte analogía con las repeticiones de un gen de
Staphilococus xylosis, pero también con dos antígenos de
P. falciparum, RESA y Pf11.1, ambos expresados en el
transcurso de la fase sanguínea del parásito. Esta homología se debe
esencialmente a la riqueza en secuencias
"glu-glu" de estos antígenos y las
repeticiones
de LSA-3.
de LSA-3.
Se clonaron el inserto DG729 y otras regiones del
exón 2 de la cepa K1 en un vector de expresión procariótico pGEX,
vector comercializado por la sociedad In Vitrogene Corp (San Diego
EE.UU.). Este vector produce una proteína de fusión con la
glutation-S-transferasa (GST) de
Schistosoma mansoni y permite una purificación fácil de las
proteínas recombinantes por afinidad de las bolas de
glutation-agarosa. Los péptidos de expresión a
partir de estos vectores se denominan:
- para la proteína LSA-3 entera:
proteína REC.
- o para el fragmento 729S: 729PGEX.
Los intentos de clonación de otros fragmentos,
especialmente el fragmento 1-5 3NSREP, 3NFREP, 5NR,
y 5SNREP han planteado dificultades concernientes o bien a la
clonación, o bien a la producción y la purificación de proteínas en
cantidad suficiente para experimentos de inmunización.
Sólo los fragmentos 729, NN y 3PC han permitido
producir y purificar los polipéptidos recombinantes correspondientes
en cantidad suficiente para el análisis de antigenicidad de la
molécula.
2.1 Un chimpancé Dirk inmunizado previamente por
una fracción de LSA-3 en combinación con otro
antígeno de la misma fase de desarrollo del parásito, y que presenta
los efectos descritos anteriormente en el punto a), ha sido
reinmunizado algunos años más tarde por péptidos y proteínas
recombinantes correspondientes a la misma combinación de antígenos.
De nuevo, este chimpancé se muestra protegido contra una infección
de prueba a dosis baja (2*10^{4} esporozoitos) seguido de una
infección de prueba a dosis alta (5*10^{6} esporozoitos). Al igual
que en el transcurso de primera exposición, se observó una reducción
importante del número de esquizontes detectados en el hígado después
de la exposición a dosis altas así como un infiltrado
linfomonocitario alrededor de los raros esquizontes detectables (que
demuestran una defensa local).
2.2. Protección parcial del chimpancé
Gerda: se inmunizó otro chimpancé únicamente con el antígeno
LSA-3 (animal descrito en los ejemplos 7 y 8
siguientes), a saber el polipéptido NR2 seguido de las proteínas
recombinantes (GST-729, GST-NN,
GST-3PC) que cubren las tres el 95% de la molécula
de LSA-3 y adsorbidas sobre microesferas de látex.
Este animal se muestra parcialmente protegido contra una infección
de prueba a dosis altas (8*10^{6} esporozoitos) ya que presenta
una muy baja parasitemia sanguínea y una reducción del 90% en el
número de esquizontes hepáticos con respecto al control seguido a la
infección de prueba.
2.3. Protección parcial del chimpancé
Nuria: un chimpancé inmunizado por una fracción del antígeno
LSA-3 solo, a saber una combinación de péptidos, de
lipopéptidos, seguida de proteínas recombinantes correspondientes al
95% de la molécula LSA-3 y emulsionados en el
Montanide ISA-51 (SEPPIC, 75 Quai d'Orsay, Francia),
se muestra parcialmente protegido contra una infección de prueba a
dosis media (1*10^{5} esporozoitos). De hecho, este animal
presenta un retraso significativo en la aparición de parásitos en la
sangre con respecto a 4 controles (chimpancés inmunizados por los
antígenos pre-eritrocitarios LSA-1,
SALSA o STARP, y 1 animal control no inmunizado), una parasitemia
sanguínea máxima más baja y una caída de la parasitemia más rápida
(24 horas en lugar de 3 días), resultados que se traducen en una
fuerte reducción del número de formas hepáticas inducidas en este
animal por la infección de prueba y de acuerdo con los resultados
obtenidos en Gerda. En este caso, no se ha realizado el examen de
formas hepáticas.
2.4. Inmunogenicidad B T en los chimpancés
Demi, Karlien y Iris: Tres chimpancés inmunizados por los
péptidos LSA-3-NR1 y -RE y los
lipopéptidos -NR2 y -CT1, así como por los péptidos
correspondientes, para cada animal, a otro antígeno
pre-eritrocitario (LSA-1, SALSA o
STARP) presentan los 3:
- respuestas humorales elevadas contra los
epítopos B presentes sobre los péptidos NR1, NR2 y RE. Los
anticuerpos reconocen no solamente los péptidos y los recombinantes
sino que son también fuertemente positivos sobre las moléculas
nativas del parásito, lo que se observa mediante inmunofluorescencia
sobre los esporozoitos y las fases hepáticas de Plasmodium
falciparum (pero negativos frente a las fases
eritrocitarias);
- respuestas linfoproliferativas elevadas y
específicas contra los 4 péptidos LSA-3 como contra
los epítopos T nativos presentes en la superficie de los
esporozoitos de Plasmodium. falciparum y de Plasmodium
yoelii, en el que LSA-3 posee un homólogo
(todavía no caracterizado).
Las respuestas B y T frente a antígenos nativos
son un punto importante porque:
a) prueban la buena representatividad de las
moléculas sintéticas;
b) significan que en el momento de la infección,
hay grande posibilidades de obtener una respuesta secundaria
anamnésica; es de hecho lo que se ha observado en el chimpancé Nuria
en el momento de la exposición. La importancia de esta observación
está confirmada por el hecho de que no se ha obtenido la misma
respuesta secundaria frente a otros antígenos tales como
LSA-1 y STARP.
2.5 Inmunogenicidad en el Aotus: un mono
búho (Aotus trivirgatus) inmunizado por los péptidos
LSA-3-NR1 y -RE y los 2 lipopéptidos
-NR2 y -CT1, seguidamente re-estimulado por las
proteínas recombinantes correspondientes al 95% de la molécula de
LSA-3 y adsorbidos sobre microesferas como se
describió anteriormente, presenta respuestas linfoproliferativas
elevadas y específicas contra los epítopos T presentes en estos
mismos péptidos.
En lo que respecta a la respuesta in vivo
de los diferentes chimpancés preinmunizados de este modo, los
resultados subrayan la excelente inmunogenicidad (B y T) de
LSA-3, bajo formas de péptido, lipopéptido y
recombinantes, y en todos los modelos de animales probados hasta la
fecha, es decir 6/6 chimpancés (sin parentesco), 1/1 Aotus, y
en todos los ratones inmunizados (>20). Obsérvese que los
resultados de formulaciones lipopeptídicas (que se pueden utilizar
en el hombre) se han obtenido mediante inyecciones subcutáneas en la
ausencia de cualquier adyuvante.
El método utilizado para identificar los CTL es
el que se describe en Fidock et al, (1994), J. Inmunol.
153:190 o en Bottius et al, (1996), J.Inmunol.
156:2874-2884.
Se han identificado epítopos CTL (para linfocitos
T citotóxicos) en los péptidos NR2, RE y CT1 gracias a pruebas de
citotoxicidad efectuadas a partir de PBMC (células mononucleares
sanguíneas periféricas) de los chimpancés Dirk, Gerda, Nuria, Demi,
Karlien e Iris descritos anteriormente.
En el hombre, se han podido poner en práctica 8
epítopos CTL adicionales, de los cuales 7 situados en la región 3'
no repetida, a partir de las PBMC de individuos pertenecientes a 3
haplotipos diferentes (MHC clase 1-A2, -B8 y -B53) y
que viven en una región endémica (Gambia) (resultados no
publicados). Además, la secuenciación de 2 epítopos CTL restringidos
por B53 ha demostrado una perfecta conservación de sus secuencias
nucleotídicas y peptídicas en varias cepas de Kenia y Gambia.
En total, se han identificado 11 epítopos CTL en
la molécula LSA-3, que es considerable. Además, 5
chimpancés/6 han desarrollado respuestas CTL contra el péptido NR2
después de la inmunización por el lipopéptido NR2 sin adyuvante, que
es un resultado notable para animales no consanguíneos. Por otra
parte, en la medida en que los anticuerpos desarrollados por Nuria
no presentaban ninguna actividad inhibidora de la invasión de
esporozoitos de Plasmodium falciparum, se puede suponer que
la protección observada dependía de las respuestas celulares, en
particular de los CTL.
El método utilizado es el descrito en Behr et
al. (1992), J. Inmunol. 149:3321.
La reactividad está expresada en razón ELISA, es
decir, la densidad óptica medida a 496 nanómetros de suero después
de la inmunización con respecto a la densidad óptica del mismo suero
antes de la inmunización. La primera columna indica el animal
inmunizado, la segunda al inmunógeno recibido por el animal, la
tercera columna indica el número de inyecciones realizadas así como
el soporte que acompaña al péptido inyectado: RP significa proteína
recombinante, RP/B significa proteína recombinante adsorbida sobre
bolas de látex, P significa péptido y LP lipopéptido. Además hay que
precisar que los lipopéptidos se inyectan en un suero fisiológico,
los péptidos y las proteínas recombinantes se adsorben sobre bolas
de látex o en una emulsión con un adyuvante Montanide
ISA-51.
ISA-51.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La tabla 2 representa los títulos de los
anticuerpos de los sueros obtenidos en los chimpancés por
inmunofluorescencia sobre los antígenos nativos presentes en la
superficie de diferentes fases (esporozoicas, hepáticas y
sanguíneas) de P. falciparum, P. yoelii y P.
berghei.
\newpage
4.3. Respuesta linfoproliferativa de las PBMC
de los diferentes chimpancés después de la estimulación in
vitro o bien por los diferentes péptidos, o bien por los
antígenos nativos presentes en la superficie de los esporozoitos.
Esta respuesta se ha medido mediante la incorporación de timidina
tritiada en las PBMC (células de sangre periféricas) o bien tras la
estimulación por los péptidos LSA-3 (tabla III) o
bien después de la estimulación in vitro con los esporozoitos
(tabla IV).
Las respuestas linfoproliferativas se indican en
diferencia de contaje en pulsos por minuto (\Delta CPM) entre el
número de pulsos obtenidos en presencia de antígenos dividido por el
número de pulsos en ausencia de antígeno. Las cifras entre
paréntesis indican los índices de estimulación, es decir la relación
entre el número de pulsos obtenidos en presencia de antígenos y el
número de pulsos obtenidos en ausencia de antígeno.
Los resultados se consideran positivos cuando el
\Delta CPM es superior a 1000 y cuando el índice de estimulación
es superior a 3.
La figura 5 representa las cantidades de
inmunoglobulinas presentes en el suero del chimpancé Nuria antes y
después de la inmunización por los péptidos 729NR1 Y 729RE, y los
lipopéptidos 729NR2 y CT1.
Este experimento muestra la superioridad en
cuanto a la inmunidad B del antígeno R, sobre todo cuando está
conjugado con un residuo lipídico.
La figura 6 muestra que el nivel de anticuerpos
específicos medido mediante ELISA contra el péptido 729NR2 en
ratones inmunizados con o bien el péptido 729 NRII o bien el
lipopéptido 729NRII es netamente superior cuando se utiliza el
lipopéptido, independientemente de la especie de ratón.
En ocho voluntarios humanos inmunizados por
inyección de esporozoitos irradiados, se encuentran anticuerpos
anti-LSA-3 en cada uno de los cuatro
individuos resistentes a una infección por esporozoitos; ninguno de
los otros cuatro voluntarios ha desarrollado una infección
sanguínea.
Además, el único de estos cuatro individuos
protegidos cuyas células eran accesibles, las PBMC han sido
extraídas seis meses después de la infección de prueba e incubadas
en presencia de péptidos provenientes de los antígenos
LSA-1 y LSA-3.
La figura 10 representa los resultados de las
linfoproliferaciones de las PBMC de un individuo protegido por
inyección de los esporozoitos irradiados contra los péptidos
provenientes de los antígenos LSA-1 y
LSA-3.
Se han observado linfoproliferaciones importantes
con cada uno de los tres péptidos LSA-3 (NR1, NR2 y
RE) pero no para ninguno de los péptidos LSA-1. Hubo
un nivel particularmente elevado de secreción de
IFN-\gamma (100 UI/ml) tras estimulación por el
péptido NR1 y, en menor grado, por el péptido NR2
(IFN-\gamma: la citoquina con el mayor efecto de
bloqueo sobre la esquizogonia hepática).
Las técnicas utilizadas para preparar los
cultivos primarios de hepatocitos, los esporozoitos, los anticuerpos
y la prueba de fluorescencia indirecta se describen en detalle por
S. MELLOUK et al. Bulletin of the World Health Organization,
68: 52-59, 1990. La tabla V a continuación compara
los resultados obtenidos en inmunofluorescencia o bien por
anticuerpos contra el fragmento 679 o bien por los anticuerpos
obtenidos contra fragmentos provenientes de otros péptidos. La
columna de la izquierda indica el número de esquizontes detectados
tras 48 horas de cultivo en hepatocitos de ratones Balb c infectados
por P. yoelii y la columna de la derecha indica los mimos
parámetros tras infección por P. berghei.
| Clones de | P. Yoelli | P. berghei | ||||
| anticuerpos | IFA | Nº de LS a las 48 h | IFA | Nº de LS a las 48 h | ||
| a) | b) | |||||
| Control | 88 | 110 | 119 | 108 | ||
| 679 | ++ | 0 | - | 47 | ||
| ++ | 0 | - | ND | |||
| 679 | ++ | 1 | - | 105 |
| Clones de | P. Yoelli | P. berghei | ||||
| anticuerpos | IFA | Nº de LS a las 48 h | IFA | Nº de LS a las 48 h | ||
| a) | b) | |||||
| 679b | ++ | 1 | - | 133 | ||
| 679c | ++ | 1 | - | 30 | ||
| 32 | ++ | 8 | \pm | 103 | ||
| 222 | + | 5 | \pm | 23 | ||
| 667 | ++ | 276 | 143 | ND | 502 | |
| 362 | + | 3 | ||||
| 493 | ++ | 55 | ND | 508 | ||
| \alphaP.b. CSP Mab | 82 | +++ | 30 | |||
| \alphaP.y. CSP Mab | +++ | 171 | 138 |
Se observa claramente que el anticuerpo contra el
péptido 679 tiene un efecto de inhibición casi total de entre las
que se han observado a las 48 horas en las células hepáticas. De la
misma forma, la figura 7 muestra la inhibición de la invasión de las
células hepáticas por los esporozoitos por sueros hiperinmunes
obtenidos después de la inmunización por diferentes péptidos e
inmunopurificados contra el LSA-3 entero.
En lo que concierne a las protecciones de los
ratones, los mejores resultados se han obtenido por inmunización con
los recombinantes, o antígenos preparados según la invención,
absorbidos sobre microesferas de látex o de poliestireno de 0,5
\mum de diámetro:
- 3/3 ratones están protegidos contra una
administración de 10 veces la dosis mínima infecciosa
- 3/3 ratones están protegidos contra la segunda
exposición
- 2/3 ratones están protegidos contra la tercera
exposición.
Las microesferas utilizadas son las microesferas
de poliestireno Polybead® (Polysciences, Inc.) de 0,50 \mum de
diámetro (ref. 07307) sobre las cuales se adsorben pasivamente los
recombinantes o los péptidos. En la práctica, en el ratón, para 1
inyección, se ponen en contacto 50 \mug de antígenos con 50 \mul
de microbolas; no se determinó la cantidad exacta de antígenos
adsorbidos. En el chimpancé se realizó el mismo proceso con 200
\mug de antígenos y 200 \mul de bolas.
Además, recientemente, la inmunización de ratones
por el recombinante GST-3PC (que corresponde con la
región 3' no repetida del aminoácido nº 869 en el codón de parada en
3') ha permitido obtener sueros que reaccionan muy fuertemente en
inmunofluorescencia sobre los esporozoitos de Plasmodium
falciparum. Este resultado es la primera demostración de la
presencia de uno o más epítopos B en esta región de la molécula.
Se inmunizó al chimpancé Gerda por vía IV con el
lipopéptido 729NRII proveniente del antígeno LSA-3.
Se extrajo la sangre 9 días después de la 4ª inyección. Loas PBMC se
incubaron in vitro con 5 \mug/ml del péptido 729NRII (con
la adición de IL2 recombinante, 10 U/ml al día 3). Al día 15 se
estudió la actividad citotóxica contra los blastos autólogos
generados por la PHA a 0,5 \mug/ml. Los blastos se preincubaron
durante la noche con 5 \mug/ml del péptido 729NRII y con un
péptido de control: el RESA, o sin péptido. No se añadieron péptidos
durante la prueba (8 horas). El número de dianas por pocillo fue de
5000.
Las PMBC de Gerda que se incubaron durante el
mismo periodo con 5\mug/ml de un péptido de control o del péptido
729NRI (proveniente del mismo antígeno), no engendran la lisis de
los blastos autólogos preincubados o no con los péptidos
anteriores.
La figura 8 indica los resultados obtenidos para
una razón E/D (efector sobre diana) que varía desde 12 hasta 0,03.
Se observa que las células diana presensibilizadas por el péptido
729NRII sufren lisis en presencia de células efectoras, lo que
indica una respuesta inmunitaria del tipo T citotóxico específico de
este antígeno.
El lipopéptido NRII, inyectado por vía IV es
capaz, sin adyuvante, de inducir una respuesta citotóxica
específica.
Se ha demostrado que los interferones tienen una
actividad inhibidora en el desarrollo del P. falciparum en
los hepatocitos humanos en cultivo (Sylvie Mellouk et al.,
The Journal of Immunology, vol. 139 nº 12: 41-92,
41-95, 1987). Los resultados obtenidos con los
péptidos de la invención son los siguientes:
El chimpancé Gerda, inmunizado con el polipéptido
NR 2 y reforzado con el recombinante DG729, lleva PBMCs capaces de
secretar tasas elevadas de IFN-\gamma en presencia
de los péptidos LSA-3, en particular el péptido 729
NR1. Se ha confirmado el resultado en el chimpancé Dirk, inmunizado
con la misma proteína. El chimpancé BRAM, control no inmunizado, no
muestra ningún interferón contra los péptidos LSA-3
en la sangre.
\vskip1.000000\baselineskip
- (2)
- INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 4
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
- (B)
- TIPO: nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencilla
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip1.000000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N°: 4
GTGATGAACT TTTTAATGAA TTATTAAA
\vskip1.000000\baselineskip
- (2)
- INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 5
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
- (B)
- TIPO: nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencilla
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip1.000000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N°: 5
TGTTGTTCTT GTTGAACACT TTTTACTAA
\vskip1.000000\baselineskip
- (2)
- INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 6
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
- (B)
- TIPO: nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencilla
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip1.000000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N°: 6
GGTATCGAAA CTGAGGAAAT AAACG
\vskip1.000000\baselineskip
- (2)
- INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 7
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
- (B)
- TIPO: nucleótido
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencilla
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip1.000000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N°: 7
CATAGCAGGA ACATCAACAT CCAC
Claims (28)
1. Moléculas polipeptídicas que contienen al
menos 10 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos
mostrada en la figura 2, excluyéndose los polipéptidos
siguientes:
2. Moléculas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque contienen al menos 20 aminoácidos
consecutivos de dicha secuencia.
3. Moléculas según la reivindicación 2,
caracterizadas porque contienen al menos 50 aminoácidos
consecutivos de dicha secuencia.
4. Molécula polipeptídica que presenta al menos
un 70% de homología con una de las moléculas según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3.
5. Molécula polipeptídica caracterizada
porque presenta al menos un 70% de homología con la secuencia
siguiente:
- Leu Leu Ser Asn Ile Glu Glu Pro Lys Glu Asn Ile Ile Asp Asn Leu Leu Asn Asn Ile (CT1).
6. Molécula polipeptídica según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque presenta al
menos un 70% de homología con la secuencia representada en la figura
3.
7. Composición inmunógena caracterizada
porque contiene al menos una molécula polipeptídica según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y al menos un vehículo
farmacéutico.
8. Composición de vacuna antipalúdica que
contiene entre otros principios inmunógenos, una molécula
polipeptídica según una de las reivindicaciones 1 a 6.
9. Composición de vacuna según la reivindicación
8, caracterizada porque contiene, además, una molécula que
contiene al menos un epítopo y que proviene del grupo formado por
las moléculas LSA-1, SALSA o STARP.
10. Composición según la reivindicación 9,
caracterizada porque contiene al menos dos inmunógenos,
escogiéndose el primero entre los polipéptidos siguientes:
- el de la figura 2,
- NRI,
- NRII,
y escogiéndose el segundo del grupo constituido
por SALSA, SALSA 1 y SALSA 2.
11. Composición de vacuna antipalúdica
caracterizada porque contiene al menos dos inmunógenos,
escogiéndose el primero entre los polipéptidos siguientes:
- el de la figura 2,
- NRI,
- NRII,
y escogiéndose el segundo del grupo constituido
por SALSA, SALSA 1 y SALSA 2.
12. Composición según la reivindicación 11,
caracterizada porque contiene el polipéptido de la figura
2.
13. Anticuerpos policlonales o monoclonales, que
reconocen específicamente las moléculas polipeptídicas según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
14. Método de diagnóstico in vitro del
paludismo en un individuo propenso a ser infectado por P.
falciparum que comprende poner en contacto un tejido o un fluido
biológico extraído del individuo, con una molécula según una de las
reivindicaciones 1 a 8, en condiciones que permiten una reacción
inmunológica entre dicha molécula polipeptídica y los anticuerpos
que puedan estar presentes en el tejido o el fluido biológico, y la
detección in vitro de los complejos
antígeno-anticuerpo que puedan formarse.
15. Método según la reivindicación 14,
caracterizado porque el tejido o el fluido biológico se pone
en contacto con una mezcla de moléculas polipeptídicas que responden
a una de las reivindicaciones 1 a 6 y otras moléculas provenientes
de antígenos de la fase de esporozoito que son
LSA-1, SALSA o STARP.
16. Método de diagnóstico in vitro del
paludismo en un individuo propenso a ser infectado por P.
falciparum, caracterizado porque comprende poner en
contacto un tejido o un fluido biológico extraído del individuo, con
anticuerpos según la reivindicación 13, en condiciones que permiten
una reacción inmunológica in vitro entre dichos anticuerpos y
las proteínas específicas de P. falciparum que puedan estar
presentes en el tejido biológico, y la detección in vitro de
los complejos antígeno-anticuerpo que puedan
formarse.
17. Kit para el diagnóstico in vitro del
paludismo según la reivindicación 14 ó 15, caracterizado
porque comprende al menos una o varias moléculas según una de las
reivindicaciones 1 a 6,
los reactivos para constituir el medio propicio
para la reacción,
los reactivos que permiten la detección de los
complejos antígeno-anticuerpo producidos por la
reacción inmunológica, reactivos que pueden llevar igualmente un
marcador o ser susceptibles de reconocerse a su vez por un reactivo
marcado, más particularmente en el caso de que la molécula
polipeptídica mencionada anteriormente no esté marcada.
18. Kit para el diagnóstico in vitro del
paludismo, caracterizado porque comprende:
- anticuerpos según la reivindicación 13,
- reactivos para constituir el medio propicio
para que se lleve a cabo la reacción inmunológica,
- reactivos que permiten la detección de los
complejos antígeno-anticuerpo producidos por la
reacción inmunológica, reactivos que pueden llevar igualmente un
marcador o ser susceptibles de reconocerse a su vez por un reactivo
marcado, más particularmente en el caso de que los anticuerpos
mencionados anteriormente no estén marcados.
19. Uso de una molécula polipeptídica según una
de las reivindicaciones 1 a 6, en la preparación de una vacuna
antipalúdica.
20. Uso de uno o varios anticuerpos policlonales
o monoclonales según la reivindicación 13, para la preparación de un
medicamento destinado al tratamiento del paludismo.
21. Composición farmacéutica que lleva a título
de principio activo uno o varios anticuerpos policlonales o
monoclonales según la reivindicación 13, en asociación con un
vehículo farmacéutico aceptable.
22. Secuencia de ácidos nucleicos
caracterizada por una de las secuencias siguientes:
(a) la cadena de nucleótidos tal como la
representada en SEQ ID nº 1 de la figura 1, o
(b) la cadena de nucleótidos representada en SEQ
ID nº 2 de la figura 2,
(c) una cadena que presenta al menos un 70% de
homología con la de la figura 1 o de la figura 2 o,
(d) una cadena de nucleótidos complementarios a
los presentados en (a), (b) o (c).
23. Ácido nucleico según la reivindicación 22,
que contiene una secuencia que codifica para una molécula
polipeptídica según una de las reivindicaciones 1 a 6.
24. Vector recombinante para la clonación de una
secuencia nucleotídica según la reivindicación 22 o 23, y/o la
expresión de un polipéptido codificado por la secuencia mencionada
anteriormente que contiene dicha secuencia en uno
de los sitios no esenciales para su replicación, siendo dicho vector particularmente de tipo plásmido, cósmido o fago.
de los sitios no esenciales para su replicación, siendo dicho vector particularmente de tipo plásmido, cósmido o fago.
25. Vector según la reivindicación 24,
caracterizado porque es un plásmido que está depositado en el
CNCM bajo el número I-1573 y la referencia
pK1.2.
26. Conjugados constituidos por moléculas
polipeptídicas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y
por un soporte sobre el que se adsorben dichas moléculas.
27. Conjugados según la reivindicación 26,
caracterizados porque el soporte está constituido por
microesferas o bolas de látex o de poliestireno.
28. Uso de un conjugado según una de las
reivindicaciones 26 ó 27, para la preparación de una composición
destinada a la inmunización de individuos infectados o propensos a
ser infectados por el paludismo.
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