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ES2243997T3 - Regulacion del metabolismo por modificacion del nivel de trehalosa-6-fosfato. - Google Patents

Regulacion del metabolismo por modificacion del nivel de trehalosa-6-fosfato.

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Publication number
ES2243997T3
ES2243997T3 ES97923086T ES97923086T ES2243997T3 ES 2243997 T3 ES2243997 T3 ES 2243997T3 ES 97923086 T ES97923086 T ES 97923086T ES 97923086 T ES97923086 T ES 97923086T ES 2243997 T3 ES2243997 T3 ES 2243997T3
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ES
Spain
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trehalose
baselineskip
tps
phosphate
tpp
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Expired - Lifetime
Application number
ES97923086T
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English (en)
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Oscar Johannes Maria Goddijn
Jan Pen
Josephus Christianus Maria Smeekens
Maria Theresia Smits
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Syngenta Mogen BV
Original Assignee
Syngenta Mogen BV
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Publication date
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Abstract

LA INVENCION CORRESPONDE AL CAMPO DE LA REGULACION DEL FLUJO DEL CARBONO EN EL METABOLISMO CELULAR. ESTA COMPROBADO QUE LA INDUCCION DE UN CAMBIO EN LA DISPONIBILIDAD INTRACELULAR DEL SACARIDO TREHALOSA - 6 - FOSFATO (T-6-P) PROVOCA MODIFICACIONES DEL DESARROLLO Y/O COMPOSICION DE CELULAS, TEJIDOS Y ORGANOS IN VIVO. ESTOS CAMBIOS PUEDEN SER INDUCIDOS POR INTRODUCCION O INHIBICION DE LOS ENZIMAS TREHALOSA - FOSFATO - SINTASA (TPS), CAPACES DE FORMAR T-6-P Y TREHALOSA - FOSFATO - FOSFATASA (TPP) QUE DEGRADA LA T-6-P EN TREHALOSA. EL FLUJO DE CARBONO DURANTE LA GLUCOLISIS PUEDE ESTIMULARSE POR UNA DISMINUCION DEL NIVEL INTRACELULAR DE T-6-P.

Description

Regulación del metabolismo por modificación del nivel de trehalosa-6-fosfato.
Campo del invento
La glicólisis ha sido uno de los primeros procesos metabólicos descritos en detalle bioquímicamente en la bibliografía. Aunque el flujo general de los carbohidratos en organismos es conocido y aunque todas las enzimas de las rutas glicolíticas están elucidadas, la señal que determina la inducción del metabolismo mediante la estimulación de la glicólisis aún no ha sido aclarada. Varias hipótesis, basadas especialmente en la situación en levadura han sido propuestas, pero ninguna ha sido probada sin lugar a dudas.
La influencia en la dirección de la división de los carbohidratos no sólo influencia de modo directo los procesos celulares de la glicólisis y el almacenamiento de carbohidratos, sino que también puede ser usada para influir en procesos secundarios o derivados tales como división celular, generación de biomasa y acumulación de compuestos de almacenaje, determinando de ese modo el crecimiento y la productividad.
Especialmente en plantas, frecuentemente las propiedades de un tejido están directamente influenciadas por la presencia de carbohidratos, y la dirección de la división de carbohidratos puede dar diferencias sustanciales.
El crecimiento, desarrollo y rendimiento de plantas depende de la energía que tales plantas puedan derivar de la fijación del CO_{2} durante la fotosíntesis.
La fotosíntesis tiene lugar principalmente en hojas y en menor medida en el tallo, mientras que otros órganos vegetales tales como raíces, semillas o tubérculos no contribuyen de modo esencial al proceso de fotoasimilación. Estos tejidos son completamente dependientes de los órganos fotosintéticamente activos para su crecimiento y nutrición. Esto significa entonces, que hay un flujo de productos derivados de la fotosíntesis (llamados colectivamente "fotosintatos") hacia partes fotosintéticamente inactivas de las plantas.
Las partes fotosintéticamente activas son denominadas "fuentes" y se definen como redes exportadoras de fotosintatos. Las partes fotosintéticamente inactivas son denominadas "sumideros" y se definen como redes importadoras de fotosintatos.
Se asume que tanto la eficacia de la fotosíntesis, así como la partición de carbohidratos en una planta son esenciales. Los tejidos nuevos en desarrollo, como hojas jóvenes u otras partes como las raíces y semillas, son completamente dependientes de la fotosíntesis en las fuentes. La posibilidad de influir la partición de carbohidratos tendría un gran impacto en el fenotipo de una planta, por ejemplo en su altura, la distancia internodal, el tamaño y la forma de una hoja y el tamaño y la estructura del sistema radicular.
Además, la distribución de los productos de fotoasimilación es de gran importancia para el rendimiento de la biomasa y productos vegetales. Un ejemplo es el desarrollo en el trigo a lo largo del último siglo. Su capacidad fotosintética no ha cambiado considerablemente pero el rendimiento del grano de trigo ha aumentado sustancialmente, es decir, el índice de cosecha (relación biomasa cosechada/biomasa total) ha aumentado. La razón subyacente es que la relación sumidero-a-fuente fue cambiada mediante cruce convencional, tal como los sumideros cosechables, es decir, semillas, porción aumentada. Sin embargo, el mecanismo que regula la distribución de los productos de asimilación y consiguientemente la formación de los sumideros y las fuentes es aún desconocido. Se cree que el mecanismo está situado en algún lugar en las rutas metabólicas de carbohidratos y su regulación. En la reciente investigación se ha hecho evidente que las hexoquinasas pueden jugar un papel principal en la señalización por metabolitos y el control del flujo metabólico. Un número de mecanismos para la regulación de la actividad hexoquinasa han sido postulados (Graham y otros (1994), The Plant Cell 6: 761; Jang & Sheen (1994), The Plant Cell 6, 1665; Rose y otros Eur. J. Biochem. 199. 511-518, 1991; Blazquez y otros (1993), FEBS 329, 51; Koch, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. (1996) 47, 509; Jang y otros (1997), The Plant Cell 9, 5. Una de estas teorías de la regulación por hexoquinasas, postulada en levadura, menciona la trehalosa y sus monosacáridos relacionados (Thevelein y Hohmann (1995), TIBS 20, 31. Sin embargo, es difícil ver que éste sería un mecanismo universal, ya que se cree que la síntesis de trehalosa se restringe a ciertas especies. Blazquez y otros (1993) FEBS. Vol 329 Nº 12, pp 51-54 se refiere al papel de la trehalosa-6-fosfato en la glicólisis de levadura. Hohmann y otros (1996) Molecular Microbiology 20 (5) pp 981-991 también se refiere al papel de la trehalosa-6-fosfato en la glicólisis de levadura y describe mutantes de levadura deficientes en actividad TPS y TPP.
Así, queda aún la necesidad para la elucidación de la señal que puede dirigir la modificación del desarrollo y/o composición de células, tejidos y órganos in vivo.
Se ha encontrado ahora que la modificación del desarrollo y/o composición de las células, tejido y órganos in vivo es posible introduciendo la enzima trehalosa-6-fosfato sintasa (TPS) y/o trehalosa-6-fosfato fosfatasa (TPP) induciendo de ese modo un cambio en las rutas metabólicas del sacárido trehalosa-6-fosfato (T-6-P) resultando en una alteración de la disponibilidad intracelular de T-6-P. El invento proporciona un método según las reivindicaciones 1 a 8. La introducción de TPS que induce de ese modo un aumento en la concentración intracelular de T-6-P causa la inhibición del flujo de carbono en la dirección glicolítica, estimulación de la fostosíntesis, inhibición del crecimiento, estimulación de la actividad relacionada con el sumidero y un aumento en el almacenamiento de los recursos. La introducción de TPP que introduce de ese modo una disminución en la concentración intracelular de T-6-P causa la estimulación del flujo de carbono en la dirección glicolítica, aumento en la biomasa y una disminución en la actividad fotosintética. Se proporciona además un método según las reivindicaciones 42 a 54. Los niveles de T-6-P pueden ser influenciados mediante ingeniería genética de un organismo con constructos génicos capaces de influenciar el nivel de T-6-P o suministrando de modo exógeno (oralmente, tópicamente, parenteralmente etc.) compuestos capaces de influir en estos niveles.
Los constructos génicos que pueden ser usados en este invento son constructos que llevan el gen para la trehalosa fosfato sintasa (TPS) enzima que es capaz de catalizar la reacción desde glucosa-6-fosfato y UDP-glucosa a T-6-P. Por otro lado, un constructo que codifica para la enzima trehalosa-fosfato fosfatasa (TPP) que cataliza la reacción desde T-6-P a trehalosa dará, dependiendo de la expresión, una disminución de la cantidad de T-6-P.
Alternativamente, los constructos génicos que albergan el TPS o TPP antisentido pueden ser usados para regular la disponibilidad intracelular de T-6-P.
Además, se documentó recientemente que una fosfo-alfa-(1,1)-glicosidasa, TreA, de Bacillus subtilis era capaz de hidrolizar T-6-P en glucosa y glucosa-6-fosfato (Schöck y otros, Gene, 170, 77-80, 1996). Una enzima similar había sido ya descrita para E. coli (Rimmele y Boos (1996), J. Bact. 176 (18), 5654).
Para una sobreexpresión, se tienen que usar construcciones génicas heterólogas u homólogas. Se cree que las enzimas endógenas que forman y/o degradan T-6-P están bajo la regulación alostérica y regulación a través de modificación covalente. Esta regulación puede ser evitada usando genes heterólogos.
Alternativamente, la mutación de genes heterólogos u homólogos puede ser usada para abolir la regulación.
El invento también proporciona la capacidad para modificar las relaciones fuente-sumidero y la asignación de los recursos en las plantas. El invento proporciona una planta según la reivindicación 28 ó 29. La economía total de carbono de la planta, que incluye asimilar la producción en los tejidos fuente y la utilización en los tejidos fuente puede ser modificada, lo que puede llevar a un rendimiento de la biomasa aumentado de los productos cosechados. Usando esta aproximación, se puede realizar un potencial de rendimiento aumentado, así como un índice de cosecha y calidad del producto mejorados. Estos cambios en los tejidos fuente puede llevar a cambios en los tejidos sumidero mediante por ejemplo una exportación aumentada de la fotosintasa. Por el contrario, cambios en el tejido sumidero puede llevar a cambios en el tejido fuente.
La expresión específica en un orgánulo celular, en un tejido u otra parte de un organismo permite los efectos generales que han sido mencionados anteriormente para ser dirigidos a aplicaciones locales específicas. Esta expresión específica puede ser establecida colocando los genes que codifican TPS, TPP o genes antisentido para TPS o TPP bajo el control de un promotor específico. Consecuentemente, el invento proporciona un vector de clonación según las reivindicaciones 26 ó 27. La expresión específica también permite la expresión simultánea tanto de la enzima TPS como de la enzima TPP en diferentes tejidos aumentando de ese modo el nivel de T-6-P y disminuyendo el nivel de T-6-P localmente.
Usando promotores específicos también es posible construir una diferencia temporal. Para este propósito se pueden usar promotores que son específicamente activos durante un cierto período de la organogénesis de las partes vegetales. De esta manera es posible influir primero en la cantidad de órganos que serán desarrollados y después permitir que estos órganos se rellenen con material de almacenaje como almidón, aceite o proteínas.
Alternativamente, se pueden usar promotores inducibles para encender o apagar de modo selectivo la expresión de los genes del invento. La inducción puede ser lograda mediante por ejemplo, patógenos, estrés, agentes químicos o estímulos de luz/oscuridad.
Definiciones
La actividad hexoquinasa es la actividad enzimática encontrada en las células que catalizan la reacción de la hexosa a hexosa-6-fosfato. Las hexosas incluyen glucosa, fructosa, galactosa o cualquier otro azúcar C_{6}. Se reconoce que hay muchas isoenzimas que todas pueden tomar parte en dicha reacción bioquímica. Al catalizar esta reacción la hexoquinasa forma una enzima clave en la señalización de la hexosa (glucosa).
La señalización de la hexosa es el mecanismo regulador por el que una célula siente la disponibilidad de la hexosa (glucosa).
La glicólisis es la secuencia de reacciones que convierte la glucosa en piruvato con la producción concomitante de ATP.
El endulzamiento en frío es la acumulación de azúcares solubles en tubérculos de patata, después de la cosecha, cuando se almacenan a bajas temperaturas.
El almacenamiento del material fuente de recursos es el proceso en el que la glucosa producto principal es metabolizada en la forma molecular que es adecuada para almacenamiento en la célula o en un tejido especializado. Estas formas pueden ser diversas. En el reino vegetal el almacenamiento tiene lugar la mayoría de las veces en la forma de carbohidratos y policarbohidratos tales como almidón, fructano y celulosa, o como los más simples mono- y di-sacáridos como la fructosa, sacarosa y maltosa; en la forma de aceites tales como aceite aráquico u oleico y en la forma de proteínas tal como la cruciferina, napina y las proteínas de almacenamiento de la semilla en la semilla de colza. En células animales se forman también carbohidratos poliméricos tales como el glucógeno, pero también una gran cantidad de energía rica en compuestos de carbono es transferida a grasas y
lípidos.
La biomasa es la masa total del material biológico.
Descripción de las figuras
Figura 1. Representación esquemática del plásmido pVDH275 que alberga el gen de la neomicina-fosfotransferasa (NPTII) flanqueado por el promotor del virus del mosaico de la coliflor (p35S) y el terminador (T35S) como un marcador seleccionable; un casete de expresión que comprende el promotor de plastocianina del guisante (pPCpea) y el terminador de la nopalina sintasa (Tnos); secuencias bordes derecha (RB) e izquierda (LB) del T-DNA y un gen marcador bacteriano de resistencia a kanamicina (KanR).
Figura 2. Análisis de transferencia Northern de las plantas del tabaco transgénicas. El panel A describe la expresión del mRNA otsA en hojas de plantas de tabaco transgénicas individuales pMOG 799. El carril "C" testigo contiene ARN total de una planta de N.tabacum no transformada.
Figura 3. Alineamiento de secuencias que codifican el TPS derivado de plantas comparado con la secuencia TPS_{levadura} usando el paquete de análisis de secuencias GCG Wisconsin (Devereuwx y otros, (1984) A comprehensive set of sequence analysis programs of the VAX. Nucl. Acids Res.; 12, 387).
TPSatal 3/56 y 142 TPS3 del arroz (SEQ ID NO:53) y TPS del arroz codifican para enzimas de TPS de Arabidopsis y de arroz derivadas de secuencias de datos EST respectivamente.
TPS de girasol 10, TPS de selaginella 43, (SEQ ID NO: 44) y TPS de selaginella 8 (SEQ ID NO:42) codifican para enzimas de TPS de girasol y Selaginella derivadas de secuencias aisladas mediante técnicas de PCR respectivamente (véase el ejemplo 3).
Figura 4. Alineamiento de fragmentos de cADN de TPS de tabaco amplificados por PCR con el gen TPS1 codificado por el TPS de levadura. Las cajas indican identidad entre aminoácidos de todas las cuatro secuencias listadas.
Figura 5. Alineamiento de fragmentos de cADN de TPP de tabaco amplificados por PCR con el gen TPS2 codificado por el TPP de levadura. Las cajas indican identidad entre aminoácidos de todas las cuatro secuencias listadas.
Figura 6. Alineamiento de un fragmento de cADN de TPS/TPP bipartido de girasol amplificado por PCR (SEQ ID NO: 24) con el gen TPS2 codificado por el TPP de levadura. Las cajas indican identidad entre aminoácidos de ambas secuencias.
Figura 7. Alineamiento de un fragmento de los clones de TPS1 de Arabidopsis y de EST de arroz con el gen TPS1 codificado por el TPS de levadura. Las cajas indican identidad entre aminoácidos de las tres secuencias.
Figura 8. Alineamiento de un fragmento del cADN de TPS humano amplificado por PCR (SEQ ID NO: 10) con el gen TPS1 codificado por el TPS de levadura.
Figura 9. Acumulación de trehalosa en tubérculos de plantas de patata transgénicas de pMOG1027 (35S como trehalasa).
Figura 10. Actividad hexoquinasa de extracto de tubérculos de patata silvestre (Solanum tuberosum cv. Kardal) con y sin la adición de trehalosa-6-fosfato.
Figura 11. Actividad hexoquinasa de extracto de tubérculo de patata silvestre (Solanum tuberosum cv. Kardal) con y sin la adición de trehalosa-6-fosfato. Se usa fructosa o glucosa como sustrato para el ensayo.
Figura 12. Actividad hexoquinasa de un extracto de hoja de tabaco silvestre (Nicotiana tabacum cv. SR1) con y sin la adición de trehalosa-6-fosfato. Se usa fructosa o glucosa como sustrato para el ensayo.
Figura 13. Representación de una medida de actividad hexoquinasa de tabaco.
Serie de datos 1: Extracto de planta de tabaco.
Serie de datos 2: Extracto de planta de tabaco + trehalosa-6-fosfato 1 mM.
Serie de datos 3: Extracto hexoquinasa comercial de levadura (1/9 de unidad).
Figura 14. Actividad hexoquinasa de un extracto de hoja de arroz silvestre (Oryza sativa) con y sin la adición de trehalosa-6-fosfato. Los experimentos han sido realizados en duplicado usando diferentes cantidades de extractos. Se usa fructosa o glucosa como sustrato para el ensayo.
Figura 15. Actividad hexoquinasa de un extracto de hoja de maíz silvestre (Zea mais) con y sin la adición de trehalosa-6-fosfato. Se usa fructosa o glucosa como sustrato para el ensayo.
Figura 16. Características de fluorescencia de hojas de tabaco silvestres (triángulo), PC-TPS (cuadrado) y 35S-TPP (cruz). Los dos paneles superiores muestran la eficacia de transporte de electrones (ETE) a las intensidades de luz indicadas (PAR). Las plantas fueron medidas después de un período de oscuridad (panel superior izquierda) y después de un período de luz (panel superior derecha).
Los paneles inferiores muestran una reducción de la fluorescencia debido a la acumulación del asimilado (apagamiento no fotoquímico). Panel izquierdo y derecho como anteriormente.
Figura 17. Actividad sumidero relativa de partes vegetales de plantas de tabaco transgénicas PC-TPS (Hambre) y 35S-TPP (Saciedad). Se indica la acumulación de nettC como porcentaje de contenido C total para varias partes de las plantas después de un período de luz (D) o luz + oscuridad (D + N).
Figura 18. Distribución real de carbono en partes vegetales de plantas de tabaco transgénicas PC-TPS (Hambre) y 35S-TPP (Saciedad). Se indica la acumulación de nett C expresada como porcentaje de C nuevo acumulado diariamente total para varias partes vegetales después de un período de luz (D) o luz + oscuridad (D + N).
Figura 19. florecimiento reducido y aumentado en líneas de lechuga transgénica que expresa PC-TPS o PC-TPP comparado con plantas silvestres. El panel inferior muestra la morfología y el color de la hoja.
Figura 20. Perfil de azúcares solubles (Fig. 20/1) en extractos de líneas de lechuga transgénica (panel superior) y de remolacha transgénica (panel inferior). En los testigos del panel superior están las líneas transgénicas GUS que se compara con líneas transgénicas para PC-TPS y PC-TPP. En el panel inferior todas las plantas transgénicas son PC-TPS. Los perfiles de almidón están descritos en la Fig. 20/2.
Figura 21. Morfología de planta y hoja de líneas de remolacha azucarera transgénica que expresan PC-TPS (TPS) o PC-TPP (TPP) comparado con plantas silvestres (Testigo). Las de tipo TPS- A tienen hojas que son comparables con las silvestres mientras que las de tipo TPS- D tienen claramente hojas más pequeñas. Las hojas de la línea TPP transgénica tienen un color verde más claro, un pecíolo más largo y un tamaño mayor comparado con el testigo.
Figura 22. Diámetro de la raíz de las líneas de remolacha azucarera transgénica (PC-TPS). En los paneles superiores A, B, C y D se indican tamaños de hojas decrecientes comparadas con el testigo (A). En el panel inferior individual se muestran los clones de el testigo y la línea PC-TPS 286-2.
Figura 23. Rendimiento de tubérculo de líneas de patata transgénica pMOG799 (35S TPS).
Figura 24. Rendimiento de tubérculo de líneas de patata transgénica pMOG1010 (35S TPP) y pMOG1124 (PC-TPP).
Figura 25. Rendimiento de tubérculo de 22 clones independientes de S. tuberosum silvestre.
Figura 26. Rendimiento de tubérculo de líneas de patatas transgénicas pMOG1093 (PC-TPS) en comparación con el silvestre. B, C, D, E, E, F, G indican tamaños de hoja decrecientes comparados con el silvestre (B/C).
Figura 27. Rendimiento de tubérculo de líneas de patata transgénica pMOG845 (Pat-TPS) (Figura 27-1) en comparación con el silvestre (Figura 27-2). B, C, indican tamaño de hojas.
Figura 28. Rendimiento de tubérculo de líneas de patata transgénica pMOG1129 (845-11/22/28).
Figura 29. Sección transversal a través de la hoja de plantas de tabaco transgénicas TPP (panel inferior) y TPS (panel superior). Capas celulares adicionales y tamaños celulares aumentados son visibles en la sección transversal de TPS.
Figura 30. Análisis por HPLC-PED de tubérculos transgénicos para TPS_{E.coli} antes y después del almacenamiento a 4ºC. Kardal C, F, B, G y H son líneas testigo no transgénicas.
Figura 31. Morfología, color y tamaño de la hoja de las líneas de tabaco transgénicas para 35S TPS (hoja superior), silvestre (hoja intermedia) y transgénica para 35S TPP (hoja inferior).
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Figura 32. Perfil metabólico de líneas de tabaco transgénicas 35S TPS (pMOG799), 35S TPP (pMOG1010), silvestre (WT), PC-TPS (pMOG1177) y PC-TPP (pMOG1124). Se muestran los niveles de trehalosa, azúcares solubles (Figura 32-1), almidón y clorofila (Figura 32-2).
Figura 33. Rendimiento de tubérculo de líneas de patata transgénicas pMOG1027 (35S as-trehalasa) y pMOG1027 (845-11/22/28) (35S as-trehalasa pat TPS) en comparación con líneas de patata silvestres.
Figura 34. Contenido de almidón de líneas de patata transgénicas pMOG1027 (35S as-trehalasa) y pMOG1027 (845-11/22/28) (35S as-trehalasa pat TPS) en comparación con líneas de patatas silvestres. La secuencia de todas las líneas descritas es idéntica a la Fig. 33.
Figura 35. Rendimiento de líneas de patatas transgénicas pMOG1028 (pat as-trehalasa) y pMOG1028 (845-11/22/28) (pat as-trehalasa pat TPS) en comparación con las líneas de patatas silvestres.
Figura 36. Rendimiento de líneas de patatas transgénicas pMOG1092 (PC as-trehalasa) en comparación con líneas de patatas silvestres como se describe en la Fig. 35.
Figura 37. Rendimiento de líneas de patatas transgénicas pMOG1130 (PC as-trehalasa PC TPS) en comparación con líneas de patata transgénica como se describe en la Fig. 35.
Descripción detallada del invento
El invento tiene que ver con el hallazgo de que el metabolismo puede ser modificado in vivo por el nivel de T-6-P. Una disminución de la concentración intracelular de T-6-P estimula la actividad glicolítica. Por el contrario, un aumento de la concentración de T-6-P inhibirá la actividad glicolítica y estimulará la fotosíntesis.
Estas modificaciones establecidas por cambios en los niveles de T-6-P son muy probablemente un resultado de la función de señalización de la hexoquinasa, cuya actividad se muestra que está regulada por T-6-P. Un aumento en el flujo a través de hexoquinasa (es decir, un aumento en la cantidad de glucosa) que reacciona a glucosa-6-fosfato se ha demostrado que inhibe la actividad fotosintética en las plantas. Además, un aumento en el flujo a través de la hexoquinasa estimularía no solo la glicólisis, sino también la actividad de división celular.
Teoría de la regulación del metabolismo del carbono por trehalosa-6-fosfato
En una célula vegetal normal la formación de carbohidratos tiene lugar en el proceso de la fotosíntesis en la que el CO_{2} se fija y se reduce a hexosas fosforiladas con sacarosa como producto final. Normalmente esta sacarosa es transportada fuera de la célula a células o tejidos que a través de la ingesta de esta sacarosa pueden usar los carbohidratos como material estructural para su metabolismo o son capaces de almacenar los carbohidratos como por ejemplo el almidón. A este respecto, en plantas, las células que son capaces de fotosintetizar y así producir carbohidratos son denominadas fuentes, mientras que las células que consumen o almacenan los carbohidratos son llamadas sumideros.
En animales y en la mayoría de células microbianas la fotosíntesis no tiene lugar y los carbohidratos tienen que ser obtenidos a partir de fuentes externas, tanto mediante la ingesta directa de sacáridos (por ejemplo levaduras y otros microorganismos) o mediante digestión de carbo-hidratos (animales). El transporte de carbohidratos normalmente tiene lugar en estos organismos en la forma de glucosa, que es transportada de modo activo a través de la membrana celular.
Después de la entrada en la célula, una de las primeras etapas en la ruta metabólica es la fosforilación de glucosa en glucosa-6-fosfato catalizada por la enzima hexoquinasa. Se ha demostrado que en plantas los azúcares que son fosforilados por la hexoquinasa (HXK) están controlando la expresión de genes implicados en la fotosíntesis (Jang & Sheen (1994), The Plant Cell 6, 1665). Por lo tanto, se ha propuesto que la HXK puede tener una función dual y puede actuar como un sensor y transmisor de señal clave de la regulación mediada por carbohidratos de la expresión génica. Se cree que esta regulación señala la célula de modo normal acerca de la disponibilidad del producto de partida, es decir, glucosa. Efectos similares se observan mediante la introducción de TPS o TPP que influye en el nivel de T-6-P. Por otro lado, se muestra que in vitro, los niveles de T-6-P afectan la actividad hexoquinasa. Aumentando el nivel de T-6-P, la célula percibe una señal que es la escasez de la entrada de carbohidratos. Por el contrario, una disminución en los niveles de T-6-P resulta en una señal que hay suficiente glucosa, dando como resultado la disminución de los niveles de fotosíntesis: eso señala que el sustrato para la glicólisis y por consiguiente el suministro de energía para procesos como crecimiento celular y división celular está suficientemente disponible. Esta señalización se cree que es iniciada por el flujo aumentado a través de hexoquinasa (J.J. Van Oosten, discurso público en la Universidad Rijks Universiteit de Utrecht a fecha 19 de abril de 1996).
La teoría que la señalización de hexoquinasa en plantas puede ser regulada a través de la modulación del nivel de trehalosa-6-fosfato implicaría que todas las plantas requieren la presencia de un sistema enzimático capaz de generar y romper la molécula señalizadora trehalosa-6-fosfato. Aunque la trehalosa se encuentra comúnmente en una amplia variedad de hongos, bacterias, levaduras y algas, así como en algunos invertebrados, sólo un intervalo muy limitado de plantas vascularizadas se ha propuesto que sean capaces de sintetizar este azúcar (Elbein (1974), Adv. Carboh. Chem. Bioche. 30, 227). Un fenómeno que no fue entendido hasta ahora es el que pese a la aparente falta de enzimas sintetizadoras de trehalosa, todas las plantas parecen contener trehalasas, enzimas que son capaces de romper la trehalosa en dos moléculas de glucosa.
La evidencia indirecta para la presencia de una ruta metabólica para la trehalosa es obtenida por experimentos presentados aquí con inhibidores de trehalasa tales como Validamicina A o transformación con trehalasa anti-
sentido.
La producción de trehalosa se vería dificultada si su intermediario T-6-P influyera demasiado en la actividad metabólica. Preferiblemente, para acumular altos niveles de trehalosa sin afectar la partición y asignación de metabolitos mediante la acción de trehalosa-6-fosfato, se debería sobreexpresar una enzima TPS/TPP bipartita. Tal enzima se parecería a una constitución genética como se encuentra en levadura, en la que el producto génico TPS2 alberga una región TPS y TPP homóloga cuando se compara con los genes otsA y otsB de E. coli (Kaasen y otros (1994), Gene 145, 9). Usando tal enzima, la trehalosa-6-fosfato no estará libremente disponible a los otros compartimentos celulares. Otro ejemplo de tal enzima bipartita es dado por Zentella e Iturriaga (Plant Physiol. (1996), 111 Resumen 88) que aislaron un cADN de 3,2 kb de Selaginella lepidophylla que codifica una trahalos-6-fosfato sintasa/fosfatasa. También se prevé que la construcción de un producto génico TPS-TPP truncado, mediante el cual sólo se conservaría la actividad TPS, sería tan potente para la síntesis de T-6-P como el gen otsA de E. coli, también cuando se usará en sistemas
homólogos.
A nivel molecular los autores tienen datos que indican que junto con Selaginella también los genes que sintetizan la trehalosa están presentes en Arabidopsis, tabaco, arroz y girasol. Usando cebadores degenerados, basados en secuencias conservadas entre TPS_{E.coli} y TPS_{levadura}, los autores han sido capaces de identificar genes que codifican enzimas que generan trehalosa-6-fosfato putativas en girasol y tabaco. La comparación de secuencias reveló una homología significativa entre estas secuencias, los genes TPS de levadura y E. coli, y secuencias EST (fragmentos de secuencias expresadas) de Arabidopsis y arroz (véase también la Tabla 6b que contiene los números de EST de ESTs homólogos encontrados).
Recientemente un gen de Arabidopsis ha sido elucidado (descrito en GENBANK nº de acc. Y08568, descrito en SEQ ID Nº: 39) que en base a su homología puede ser considerado como una enzima bipartita.
Estos datos indican que, al contrario que la creencia actual, la mayoría de las plantas contienen genes que codifican trehalosa-fosfato-sintasas que les permiten sintetizar T-6-P. Como está probado por la acumulación de trehalosa en plantas que expresan TPS, las plantas también contienen fosfatasas, no específicas o específcas, capaces de desfosforilar el T-6-P en trehalosa. La presencia de trehalasa en todas las plantas puede ser para efectuar un recambio de trehalosa.
Además, los autores también proporcionan datos que la T-6-P está implicada en regular las rutas de carbohidratos en tejido humano. Los autores han elucidado un gen TPS humano (descrito en SEQ ID Nº: 10) que muestra homología con los genes TPS de levadura, E. coli y plantas. Además, muestran datos que también la actividad de la hexoquinasa está influida en tejidos de mamíferos (ratón).
La generación de la señal de "saciedad" mediante la disminución de la concentración intracelular de trehalosa-6-fosfato a través de la expresión de la enzima TPP (o inhibición de la enzima TPS) señalará todos los sistemas celulares para aumentar el flujo de carbono glicolítico e inhibirá la fotosíntesis. Esto está muy bien mostrado en la parte experimental, en la que por ejemplo en el Experimento 2 se describen plantas de tabaco transgénicas en las que la enzima TPP está expresada, tienen tamaño de hoja aumentado, número de ramificaciones aumentado y una reducción en la cantidad de clorofila. Sin embargo, puesto que la señal de "saciedad" se genera en ausencia de suministro suficiente de glucosa, el total de carbohidratos en la célula se vacía rápidamente.
Así, asumiendo que la señal de "saciedad" artificial se mantenga, la reducción en carbohidratos se volverá finalmente limitante para el crecimiento y la división celular, es decir, las células usarán todos sus carbohidratos almacenados y estarán en estado de "hambre". Así, las hojas están formadas con una cantidad baja de carbohidratos almacenados. Por otro lado, las plantas que expresan un constructo con un gen que codifica para TPS, que aumenta la cantidad intracelular de T-6-P, muestran una reducción del tamaño de la hoja, mientras que también las hojas eran de verde más oscuro, y contenían una cantidad aumentada de clorofila.
En levaduras, un papel principal de la señalización inducida por glucosa es cambiar el metabolismo desde un modo neogenético/respiratorio a un modo fermentativo. Varias rutas de señalización están implicadas en este fenómeno (Thevelein y Hohmann, (1995) TIBS 20, 3). Por otro lado el posible papel de la señalización de hexoquinasas, la ruta Ras-AMP-cíclico (cAMP) se ha demostrado que están activadas por glucosa. La activación de la ruta RAS-cAMP por glucosa requiere la fosforilación de glucosa, pero no un metabolismo de la glucosa adicional. Hasta ahora, se ha demostrado que esta ruta activa la trehalasa y la 6-fosfofructo-2-quinasa (estimulando de ese modo la glicólisis), mientras que la fructosa-1,6-bifosfato es inhibida (impidiendo de ese modo la gluconeogénesis), por la fosforilación de proteínas dependiende de cAMP. Esta ruta de transducción de señales y los efectos metabólicos que puede provocar puede así ser vista como una ruta que actúa en paralelo con la ruta de señalización de hexoquinasa, que se muestra que está influida por el nivel de trehalosa-6-fosfato.
Como se describe en este invento, las plantas transgénicas que expresan as-trehalasa revelan fenómenos similares, como hojas verde oscuro, rendimiento potenciado, como se observa cuando se expresa un gen TPS. También parece que la expresión de una as-trehalasa en constructos dobles potencia los efectos que son causados por la expresión de TPS. La actividad trehalasa se ha demostrado que está presente en por ejemplo plantas, insectos, animales, hongos y bacterias mientras que sólo un número limitado de especies, se acumula la trehalosa.
Hasta ahora, el papel de la trehalasas en plantas es desconocido aunque esta enzima está presente en casi todas las especies vegetales. Se ha propuesto que está implicada en las interacciones planta-patógeno y/o en respuestas de defensa vegetal. Los autores han aislado un gen de trehalasas de patata y muestran que la inhibición de la actividad trehalasa en hojas de patata y tejidos tuberosos llevan a un rendimiento en los tubérculos aumentado. La expresión específica de frutas como as-trehalasas en tomate combinada con la expresión de TPS altera dramáticamente el desarrollo de la fruta.
Según una realización del invento, la acumulación de la T-6-P se ocasiona en células en las que la capacidad de producir T-6-P ha sido introducida mediante la introducción de un constructo génico expresable que codifica la trehalosa-fosfato-sintasa (TPS). Cualquier gen de trehalosa fosfato sintasa bajo el control de los elementos reguladores necesarios para la expresión de ADN en células, tanto específicamente como constitutivamente, puede ser usado, siempre que sea capaz de producir una trehalosa fosfato sintasa capaz de producir T-6-P en dichas células. Un ejemplo de un marco de lectura abierta es uno que codifica para una enzima TPS como se representa en la SEQ ID Nº:2. Otros ejemplos son los marcos de lectura abiertos como se representan en las SE ID Nºs: 10, 18-23, 41 y 45-53. Como se ilustra mediante las secuencias anteriormente mencionadas, es bien conocido que mas de una secuencia de ADN puede codificar una enzima idéntica, hecho que está causado por la degeneración del código genético. Si se desea, el marco de lectura abierta que codifica la actividad trehalosa fosfato sintasa puede ser adaptado para usar el codon en el hospedador de elección, pero esto no es un requerimiento.
La secuencia de ácidos nucleicos aislada representada por ejemplo por la SEQ ID Nº: 2, puede ser usada para identificar los genes de trehalosa fosfato sintasa en otros organismos y subsiguientemente aislarlos y clonarlos, mediante técnicas de PCR y/o mediante hibridación del ADN de otras fuentes con un fragmento de ADN o ARN obtenido del gen de E. coli. Preferiblemente, tales secuencias de ADN son cribadas hibridando en condiciones mas o menos rigurosas (influidas por factores tales como temperatura y fuerza iónica de la mezcla de hibridación). Si las condiciones son o no rigurosas también depende de la naturaleza de la hibridación, es decir, ADN:ADN, ADN:ARN, ARN:ARN, así como de la longitud del fragmento hibridante más corto: Aquellos con experiencia en la técnica son fácilmente capaces de establecer un régimen de hibridación suficientemente riguroso como para aislar genes TPS, mientras que evitan una hibridación no específica. Según los genes implicados en la síntesis de trehalosa de otras fuentes van estando disponibles, estos pueden ser usado de un modo similar para obtener un gen trehalosa fosfato sintasa expresable según el invento. Se dan más detalles en la sección experimental.
Las fuentes para aislar actividades trehalosa fosfato sintasa incluyen microorganismos (por ejemplo bacterias, levaduras, hongos), plantas, animales, y similares. Las secuencias de ADN aisladas que codifican actividad trehalosa fosfato sintasa de otras fuentes pueden ser usadas igualmente en un método para producir T-6-P según el invento. Como ejemplo, los genes para producir T-6-P de levadura se describen en el documento de patente WO 93/17093.
También están descritas secuencias de ácidos nucleicos que han sido obtenidas modificando la secuencia de ácidos nucleicos representada en la SEQ IN Nº: 1 mutando uno o más codones de modo que resulte en cambios aminoacídicos en la proteína codificada, siempre que la mutación de las secuencias aminoacídicas no paren totalmente la actividad trehalosa fosfato sintasa.
Según otra realización del invento la trehalosa-6-fosfato en una célula vegetal puede convertirse en trehalosa mediante la trehalosa fosfato fosfatasa que codifica genes bajo el control de elementos reguladores necesarios para la expresión de ADN en células vegetales. Un marco de lectura abierto preferido según el invento es uno que codifica para la enzima TPP como se representa en la SEQ ID Nº: 4 (Kaasen y otros (1994) Gene, 145, 9). Es bien conocido que más de una secuencia de ADN puede codificar una enzima idéntica, hecho que es causado por la degeneración del código genético. Si se desea, el marco de lectura abierto que codifica la actividad trehalosa fosfato fosfatasa puede ser adaptado para usar el codon en el hospedador de elección, pero no es un requerimiento.
La secuencia de ácidos nucleicos aislada representada por la SEQ ID Nº:3, puede ser usada para identificar los genes de trehalosa fosfato fosfatasa en otros organismos y subsiguientemente aislarlos y clonarlos, mediante técnicas de PCR y/o por hibridación de ADN de otras fuentes con un fragmento de ADN o ARN obtenible del gen de E. coli. Preferiblemente, tales secuencias de ADN son cribadas hibridando en condiciones más o menos rigurosas (influidas por factores tales como temperatura y fuerza iónica de la mezcla de hibridación). El que las condiciones sean o no rigurosas también depende de la naturaleza de la hibridación, es decir ADN:ADN, ADN:ARN, ARN:ARN, así como de la longitud del fragmento hibridante más corto. Aquellos con experiencia en la técnica son fácilmente capaces de establecer un régimen de hibridación lo suficientemente riguroso como para aislar genes TPP, mientras que evitan hibridación inespecífica. Según van estando disponibles los genes implicados en la síntesis de trehalosa a partir de otras fuentes, estos pueden usarse en un modo similar para obtener un gen de trehalosa fosfato fosfatasa expresable según el invento. Se dan más detalles en la sección experimental.
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Las fuentes para aislar actividades trehalosa fosfato fosfatasa incluyen microorganismo (por ejemplo bacteria, levadura, hongos), plantas, animales y similares. Secuencias de ADN aisladas que codifican la actividad trehalosa fosfato fosfatasa a partir de otras fuentes pueden ser usadas igualmente.
También se describen secuencias de ácidos nucleicos que han sido obtenidas modificando la secuencia de ácidos nucleicos representadas en la SEQ ID Nº:3 mutando uno o más codones de modo que den como resultado cambios en aminoácidos en la proteína codificada, siempre que la mutación de la secuencia aminoacídica no elimine completamente la actividad trehalosa fosfato fosfatasa.
Otras enzimas con actividad TPS o TPP están representadas por las enzimas llamadas bipartitas. Se prevé que la parte de la secuencia que codifica específicamente una de las dos actividades puede ser separada de la parte de la enzima bipartita que codifica la otra actividad. Un modo de separar las actividades es insertar una mutación en la secuencia codificante para la actividad que no se selecciona, mutación por la cual la proteína expresada está dañada o es deficiente en esta actividad y así sólo realiza la otra función. Esto puede ser hecho tanto por la secuencia que codifica para la actividad TPS como para la actividad TPP. Así, las secuencias codificantes obtenidas de tal manera pueden ser usadas para la formación de marcos de lectura abierta quiméricos nuevos capaces de expresar enzimas que tienen actividad tanto TPS como TPP.
Según otra realización del invento, en especial las plantas pueden ser alteradas genéticamente para producir y acumular las enzimas anteriormente mencionadas en partes específicas de la planta. Los sitios preferidos de expresión de la enzima son hojas y partes de almacenamiento de las plantas. En particular los tubérculos de patatas se consideran partes adecuadas de la planta. Un promotor preferido para lograr la expresión selectiva de la enzima TPS en microtubérculos y tubérculos de patata es obtenible de la región aguas arriba del marco de lectura abierta del gen patatin de la patata.
Otro promotor adecuado para la expresión específica es el promotor de la plastocianina, que es específico para partes fotoasimiladoras de la planta. Además, se prevé que la expresión específica en partes vegetales puede dar un efecto favorable para el crecimiento y la reproducción de la planta o para uso económico de dichas plantas. Los promotores que son útiles en este respecto son: el promotor E8 (documento de patente europea EP 0 409 629) y el promotor 2A11 (van Haaren y Houck (1993), Plant Mol. Biol., 221, 625) que son específicos de fruta; el promotor de la cruciferita, el promotor de la napina y el promotor de ACP que son específicos de semilla; el promotor PAL-; el promotor de la chalcona isomerasa que es específico de flor; el promotor SSU, y el promotor ferredoxina, que son específicos de hoja; el promotor TobRb7 que es específico de raíz, el promotor Ro1C que es específico para el floema y el promotor HMG2 (Enjuto y otros (1995), Plan Cell 7, 517) y el promotor de PCNA de arroz (Kosugi y otros (1995), Plant J. 7, 877) que son específicos de tejido meristemático.
Otra opción bajo este invento es usar promotores inducibles. Se conoce que los promotores son inducibles por patógenos, por estrés, por agentes químicos o estímulos de luz/oscuridad. Se prevé que para la inducción específica de fenómeno, por ejemplo brote, formación de semilla, granación, llenado de los tejidos de almacenamiento, es beneficioso inducir la actividad de los genes del invento mediante estímulos externos. Esto permite el desarrollo normal de la planta y las ventajas de la inducibilidad del fenómeno deseado de modo controlado. Los promotores que cumplen los requisitos para ser usados en tales regímenes son los promotores inducibles por patógenos descritos en los documentos de patentes DE 4446342 (PRP-1 inducible por hongo y auxina), el documento de patente 96/28561 (PRP-1 inducible por hongo), el documento de patente europea 0 586 612 (inducible por nemátodo), el documento EP 0 712 273 (inducible por nemátodo), el documento WO 96/34949 (inducible por hongo), el documento PCT/EP96/02437 (inducible por nemátodo), el documento EP 0 330 479 (inducible por estrés), el documento de patente norteamericana US 5.510.474, el documento 96/12814 (inducible por el frío), el documento EP 0494 724 (inducible por tetraciclina), el documento EP 0 619 844 (inducible por etileno), el documento EP 0 337 532 (inducible por ácido salicílico), el documento WO 95/24491 (inducible por tiamina) y el documento WO 92/19724 (inducible por la luz). Otros promotores inducibles químicamente son los descritos en los documentos de patentes europeas EP 0674 608, EP 637 339, EP 455 667 y norteamericana US 5.364.780.
Según otra realización del invento, las células vegetales son transformadas con los constructos que inhiben la función de los TPS o TPP expresados endógenamente. La inhibición de la actividad enzimática endógena no deseada se logra por un número de vías, la elección de la cual no es crítica para el invento. Un método para la inhibición de la expresión génica se logra a través de la denominada "aproximación antisentido". Aquí una secuencia de ADN es expresada, la cual produce un ARN que es al menos parcialmente complementaria al ARN que codifica la actividad enzimática que tiene que ser bloqueada. Se prefiere usar genes antisentido homólogos ya que son más eficaces que los genes heterólogos. Un método alternativo para bloquear la síntesis de actividades enzimáticas no deseadas es la introducción en el genoma de la planta hospedadora de una copia adicional de un gen endógeno presente en la planta hospedadora. Se observa frecuentemente que tal copia adicional de un gen silencia el gen endógeno: este efecto es referido en la bibliografía como el efecto cosupresor, o cosupresión. Los detalles del procedimiento de potenciar la disponibilidad del sustrato se dan en los Ejemplos del documento de patente WO 95/01446, incorporados aquí mediante referencia.
Las células hospedadoras pueden ser cualquier célula en la que la modificación de la señalización de la hexoquinasa puede lograrse a través de alteraciones en el nivel de T-6-P. Así, por consiguiente, se contemplan todas las células eucariotas. Desde un punto de vista económico, las células más adecuadas para la producción de compuestos metabólicos son más adecuadas. Estos organismos son, entre otros, plantas, animales, levaduras, hongos. Sin embargo, también se prevé la expresión en células animales especializadas (como las células beta pancreáticas y células
grasas).
Las plantas hospedadoras preferidas entre las Spermatophytae son las Angiospermae, de modo notable las Dicotyledoneae, que comprenden inter alia las Solanaceae como familia representativa, y las Monocotyledoneae, que comprenden inter alia las Gramineae como familia representativa. Las plantas hospedadoras adecuadas, como se definen en el contexto de presente invento incluyen plantas (así como partes y células de dichas plantas) y su progenie que contiene un nivel modificado de T-6-P, por ejemplo usando técnicas de ADN recombinante para causar o potenciar la producción de TPS o TPP en la planta deseada u órgano vegetal. Los cultivos según el invento incluyen aquellos que tiene flores tales como coliflor (Brassica oleracea), alcachofa (Cynara scolymus), flores de cortar tales como clavel (Dianthus caryophyllus), rosa (Rosa spp), Chrysanthemum, Petunia, Alstromeria, Berbera, Bladiolus, azucenas (Lilium spp), lúpulo (Humulus lupulus), brócoli, plantas de maceta como el Rododendro, Azaleas, Dalias, Begonias, Fucsias, Geranios, etc.; frutas tales como la manzana (Malus, por ejemplo domesticus), platano (Musa, por ejemplo Acuminata), albaricoque (Prunas armeniaca), olivas (Oliva sativa), piña (Ananas comosus), coco (Cocos nucifera), mango (Mangifera indica), kiwi, aguacate (Persea americana), bayas (tales como grosella, cassis, por ejemplo rubrum), cerezas (tales como la picota, Prunas por ejemplo avium), pepino (Cucumis, por ejemplo sativus), uva (vitis, por ejemplo vinifera), limón (Citrus limon), melon (Cucumis melo), mostaza (Sinapis alba y Brassica nigra), frutos secos (tal como la nuez, Juglans, por ejemplo regia; cacahuete, Arachis hypogeae), naranja (Citrus, por ejemplo maxima), melocotón (Prunas, por ejemplo persica), pera (Pyra, por ejemplo Communis), pimiento (Solanum, por ejemplo capsicum), ciruela (Prunas, por ejemplo, domestica), fresa (Fragaria, por ejemplo moschata), tomate (Lycopersicon, por ejemplo esculentum); hojas, tales como alfalfa (Medicago sativa), repollos (tal como Brassica oleracea), endivias (Cichoreum, por ejemplo endivia), puerros (Allium porrum), lechuga (Lactuca sativa), espinaca (Spinacia oleraceae), tabaco (Nicotiana tabacum), hierbas como Festuca, Poe, centeno (tal como Lolium perenne, Lolium multiflorum y Arrenatherum spp.), césped ornamental, césped, alga, achicoria (Cichorium intybus), té (Thea sinensis), apio, perejil (Petroselinum crispum), perifollo y otras hierbas; raíces, tales como arrurruz (Marante arundinacea), remolacha (Beta vulgaris), zanahoria (Daucus carota), cassava (Manihot esculenta), ginseng (Panax ginseng), nabo (Brassica rapa), rábano (Raphanus sativus), ñame (Dioscorea esculenta), batata (Ipomoea batatas), taro; semillas, tales como judías (Phaseolus vulgaris), guisante (Pisum sativum), soja (Glycin max), trigo (Triticum aestivum), cebada (Hordeum vulgare), maíz (Zea mays), arroz (Oryza sativa), judías de arbusto y habas (Vicia faba), algodón (Gossypium spp.), café (Coffea arabica y C. Canephora); tubérculos, tales como col (Brassica oleraceae), patata (Solanum tuberosum); plantas bulbosas como cebollas (Allium cepa), cebolletas, tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), ajo (Allium sativum), tallos tales como alcornoque, caña de azúcar (Saccharum spp.), ágave (Sisal spp.), lino (Linux vulgare), jute; árboles como el árbol de caucho, roble (Quercus spp.), haya (Betuna spp.), aliso (Agnus spp.), fresno (Hacer spp.), olmo (Ulmus spp.), palmeras, helechos, hiedra y
similares.
La transformación de células de levadura y hongos o animales puede ser hecha a través de las técnicas de vanguardia normales de transformación a través de sistemas vectores comúnmente conocidos como pBluescript, pUC y sistemas vectores virales como RSV y SV40.
El método de introducir el gen de trehalosa-fosfato sintasa inducible, el gen trehalosa-fosfato-fosfatasa expresable, o cualquier otro gen homosentido o antisentido en una célula vegetal receptora no es crucial, siempre que el gen se exprese en dicha célula vegetal.
Aunque algunas de las realizaciones del invento puede no ser practicable de momento, por ejemplo porque algunas especies vegetales son aún recalcitrantes a la transformación genética, la práctica del invento en tal especie vegetal es meramente una cuestión de tiempo y no una cuestión de principio. Debido a que la manejabilidad de la transformación genética no es relevante a la realización subyacente del invento.
La transformación de especies vegetales es ahora rutinaria para un número de especies vegetales, incluyendo tanto las Dicotyledoneae así como las Monocotyledoneae. En principio cualquier método de transformación puede ser usado para introducir ADN quimérico según el invento en una célula ancestral adecuada. Los métodos pueden ser seleccionados de modo adecuado a partir del método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens y otros (1982), Nature 296, 72; Negrutiu y otros (1987), Plant Mol. Biol. 8, 363, electroporation of protoplasts (Shillito y otros (1985) Bio/Technol. 3, 1099), microinyección en material vegetal (Crossway y otros (1986), Mol. Gen. Genet. 202), bombardeo de partículas (recubiertas con ADN o ARN) de diversos materiales vegetales (Klein y otros (1987), Nature 327, 70), infección con virus (no integrativos), en transferencia génica mediata por la planta Agrobacterium tumefaciens mediante infiltración de plantas adultas o transformación de polen madura o microsporas (documento de patente europea 0 301 316) y similares. Un método preferido según el invento comprende la transferencia de ADN mediada por Agrobacterium. Especialmente preferido es el uso de la tecnología denominada de vector binario como se describe en el documento de patente europea EP A 120 516 y el documento de patente norteamericana U.S.
4.949.838).
Aunque se considera algo más recalcitrante hacia la transformación genética, las plantas monocotiledóneas son manejables para transformación y las plantas transgénicas fértiles pueden regenerarse a partir de células transformadas o embriones, u otra material vegetal. Ahora mismo, los métodos preferidos para la transformación de monocotiledóneas son el bombardeo de microproyectiles de embriones, explantes de células en suspensión, e ingesta directa de ADN o electroporación (tisular) (Shimamoto y otros (1989), Nature 338, 274-276). Las plantas de maíz transgénico han sido obtenidas introduciendo el gen bar de Streptomyces hygroscopicus, que codifica fosfinotricina acetiltransferasa (una enzima que inactiva el herbicida fosfoinotricina), en células embrionarias de un cultivo de maíz en suspensión mediante bombardeo de microproyectiles (Gordon-Kamm (1990), Plant cell, 2, 603). Se ha documentado la introducción de material genético en protoplastos de aleurona de otros cultivos de monocotiledóneas tales como trigo y cebada (Lee (1989), Plant Mol. Biol. 13, 21). Las plantas de trigo han sido regeneradas a partir de cultivos embrionarios en suspensión seleccionando callos embrio-narios para el establecimiento de cultivos embrionarios en suspensión (Vasi (1990) Bio/Technol. 8, 429). La combinación con sistemas de transformación para estos cultivos permite la aplicación del presente invento a monocotiledóneas.
Las plantas monocotiledóneas, que incluyen cultivos comercialmente importantes como el arroz y el maíz son también susceptibles a la transferencia de ADN mediante cepas de Agrobacterium (vide WO 94/00977; EP 0 159 418 B1; Gould y otros (1991) Plant. Physiol. 95, 426-434).
Para obtener plantas transgénicas capaces de expresar constitutivamente más de un gen quimérico, un número de alternativas están disponibles incluyendo las siguientes:
A. El uso de ADN, por ejemplo T-ADN en un plásmido binario, con un número de genes modificados físicamente acoplados a un segundo gen marcador seleccionable. La ventaja de este método es que los genes quimeras están físicamente acoplados y por lo tanto migran como un locus Mendeliano único.
B. Polinización cruzada de plantas transgénicas cada una capaz ya de expresar uno o más genes quimeras, preferiblemente acoplados a un gen marcador seleccionable, con polen de una planta transgénica que contiene uno o más genes quimera acoplados a otro marcador seleccionable. Después la semilla, que se obtiene mediante este cruce, puede ser seleccionada en base a la presencia de dos marcadores seleccionables, o en base a la presencia de los genes quimera mismos. Las plantas obtenidas a partir de las semillas seleccionadas pueden ser usadas después para cruces adicionales. En principio los genes quimera no están en un locus único y los genes pueden por lo tanto segregarse como loci independientes.
C. El uso de un número de una pluralidad de moléculas de ADN quimeras, por ejemplo plásmidos, teniendo cada uno uno o más genes quimera y un marcador seleccionable. Si la frecuencia de cotransformación es alta, entonces la selección en base a un solo marcador es suficiente. En otros casos, se prefiere la selección en base a más de un marcador.
D. La transformación consecutiva de plantas transgénicas que contienen ya un primer, segundo, (etc), gen quimera con nuevo ADN quimérico, que comprende opcionalmente un gen marcador seleccionable. Como en el método B, los genes quimera no están en principio en un locus único y los genes quimera pueden por lo tanto segregarse como loci independientes.
E. Combinaciones de las estrategias anteriomente mencionadas.
La estrategia actual puede depender de varias consideraciones como puede determinarse fácilmente tal como el propósito de las líneas parentales (crecimiento directo, uso en un programa de cruces, uso para producir híbridos) pero no es crítico con respecto al invento descrito.
Se sabe que prácticamente todas las plantas pueden ser regeneradas a partir de células o tejidos en cultivo. Los medios para la regeneración varía de especie a especie vegetal, pero generalmente primero se proporciona una suspensión de protoplastos transformados o una placa de petri que contiene explantes. Los brotes pueden ser inducidos directamente, o indirectamente a partir del callo vía organogénesis o embriogénesis y subsiguientemente arraigar. Junto al marcador seleccionable, el medio de cultivo contendrá generalmente diversos aminoácidos y hormonas, tales como auxina y citoquininas. Es también ventajoso añadir ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para especies tales como maíz y alfalfa. La regeneración eficaz dependerá del medio, del genotipo y de la historia del cultivo. Si estas tres variables están controladas, la regeneración es normalmente reproducible y repetible. Después de la incorporación estable de las secuencias génicas transformadas en las plantas transgénicas, los rasgos otorgados por ellas pueden ser transferidos a otras plantas mediante cruce sexual. Cualquiera número de técnicas de cruce estándar puede ser usado, dependiendo de las especies a cruzar.
Secuencias de ADN adecuadas para el control de la expresión de los genes expresables en plantas (incluyendo genes marcadores), tal como regiones de inicio de la transcripción, potenciadores, secuencias líder no transcritas y similares, pueden derivarse de cualquier gen que esté expresado en una célula vegetal. También se pretende que los promotores híbridos combinen las porciones funcionales de varios promotores, o equivalentes sintéticos de los mismos. Aparte de los promotores constitutivos, los promotores inducibles, o promotores regulados de otro modo en su patrón de expresión, por ejemplo específico de desarrollo o de tipo celular, pueden ser usados para controlar la expresión de los genes expresables según el invento.
Para seleccionar o cribar células transformadas, se prefiere incluir genes marcadores unidos al gen expresable en planta según el invento para ser transferido a una célula vegetal. La elección de un gen marcador adecuado en transformación vegetal está dentro del alcance del profesional con experiencia común; algunos ejemplos de genes marcadores usados de modo rutinario son los genes neomicina fosfotransferasa que otorgan resistencia a kanamicina (documento de patente europea EP-B 131 623), el gen de la glutatión-S-transferasa de hígado de rata que otorga resistencia al herbicidas derivados de glutatión (documento de patente EP-A 256 223), glutamina sintetasa que otorga tras sobre expresión resistencia a inhibidores de glutamina sintetasa tales como fosfoinotricina (documento de patente WO 87/05327), el gen de acetil tranferasa de Streptomyces viridochromogenes que otorga resistencia al agente selectivo fosfoinotricina (documento EP-A 275 957), el gen que codifica una 5-enolshikimate-3-fosfato sintasa (EPSPS) que otorga tolerancia a N-fosfonometilglicina, el gen bar que confiera resistencia contra Bialofos (por ejemplo el documento de patente WO 91/02071) y similares. La elección actual del marcador no es crucial siempre que sea funcional (es decir selectivo) en combinación con las células vegetales de elección.
Los genes marcadores y el gen de interés no tienen que estar unidos, puesto que la cotransformación de genes no unidos (documento de patente norteamericana US 4.399.216) es también un proceso eficaz en transformación vegetal.
El material vegetal preferido para la transformación, especialmente para los cultivos de dicotiledóneas son los discos de hojas que pueden ser fácilmente transformados y tienen una buena capacidad regenerativa (Horsch y otros (1985), Science 227, 1229).
El uso específico del invento se prevé en los siguientes modos: como se puede ver a partir de los Ejemplos, los efectos de la expresión de TPP (que causa una disminución de la concentración de T-6-P intracelular) son un tamaño de hoja aumentado, un número de ramificaciones aumentado que lleva a un aumento en el número de hojas, aumento de la biomasa de hojas, decoloración de las hojas maduras, formación de flores más pequeñas y esterilidad. Estos efectos son especialmente útiles en los siguientes casos: tamaño de hoja aumentado (y aumento en el número de hojas) es importante económicamente para vegetales de hoja tales como espinacas, lechuga, puerros, alfalfa, maíz de silo, para cubrir la tierra y control de malas hierbas mediante césped y plantas de jardín; para cultivos en los que las hojas se usan como producto, tal como tabaco, té, cáñamo y rosas (perfumes); para alfombrar cultivos de tipo repollo tales como coliflor.
Una ventaja adicional del hecho de que estas hojas son estimuladas en su actividad metabólica es que tienden a quemar todos sus recursos intracelulares, lo que significa que son bajas en contenido de almidón. Para plantas que se usan para consumo, una reducción en el contenido de almidón es ventajoso a la luz de la actual tendencia para alimentos bajos en calorías. Tal reducción en el contenido de almidón también tiene sus efectos en el gusto y la textura de las hojas. Un aumento en el balance proteína/carbohidratos como se pueden producir mediante la expresión de TPP es especialmente importante para cultivos de hojas como el maíz de silo.
Una ramificación aumentada, que va acompañada por una tendencia a tener tallos con un diámetro mayor, puede ser ventajosa en cultivos en los que el tallo es responsable para la generación de un producto atractivo económicamente. Los ejemplos en esta categoría son todos los árboles para la producción aumentada de madera, que es también un material de partida para la producción de papel; cultivos como el cañamo, el ágave, el lino que se usan para la producción de cuerdas y lino, cultivos como el bambú y el azúcar de caña, árbol del caucho, alcornoque; para la prevención de la devastación de cultivos o partes de cultivos, como granos, maíz, legumbres y fresas.
Un tercer fenómeno es la decoloración aumentada de las hojas (causado por una disminución de la actividad fotosintética). Las hojas menos coloridas son preferidas para los cultivos tales como la achicoria y el espárrago. También para flores de cortar la decoloración en los pétalos puede ser deseable, por ejemplo en Alstromeria.
Un efecto global es el aumento en la biomasa que resulta de un aumento en la actividad metabólica. Esto significa que la biomasa consiste en compuestos metabolizados tales como proteínas y grasas. Por consiguiente, hay un aumento del balance proteína /carbohidratos en hojas maduras que es una ventaja para cultivos como el maíz de silo, y todo el forraje que puede ser almacenado en silos. Un balance proteína/carbohidratos aumentado de modo similar puede ser establecido en frutas, tubérculos y otras partes vegetales comestibles.
Fuera del reino vegetal un metabolismo aumentado sería beneficioso para la producción proteica en microorganismos o cultivos celulares eucarióticos. Tanto la producción de proteínas endógenas como también proteínas heterólogas será potenciado lo que significa que la producción de proteínas heterólogas en cultivos de levadura u otros organismos unicelulares puede ser potenciada de esta manera. Para las levaduras esto daría una fermentación más eficaz que daría como resultado un rendimiento de alcohol aumentado, lo cual es por supuesto favorable en los procesos de fabricación de la cerveza, producción de alcohol y similares.
En animales o seres humanos se prevé que las enfermedades causadas por un defecto en el metabolismo puede ser superado por la expresión estable de TPP o TPS en las células afectadas. En las células humanas, el consumo de glucosa aumentado de muchas células tumorales depende en gran medida de la sobreexpresión de hexoquinasas (Remple y otros (1996) FEBS Lett. 385, 233). Se prevé que el flujo de glucosa en el metabolismo de células cancerígenas pueden estar influenciado por la expresión de enzimas que sintetizan trehalosa-6-fosfato. También se ha demostrado que la activación de hexoquinasa es potenciada por el cAMP/PKA (ruta de la proteina quinasa A). Por lo tanto, la inactivación de esta ruta de transducción de señales pueden afectar la ingesta de glucosa y la proliferación de las neoplasias. Las actividades enzimáticas en células de mamíferos capaces de sintetizar trehalosa-6-fosfato y trehalosa y degradar trehalosa han sido mostradas por ejemplo en células del córtex de riñón de conejo (Sacktor (1968) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60, 1007).
Otro ejemplo puede encontrarse en los defectos en la secreción de insulina en las células beta pancreáticas en las que la producción de glucosa-6-fosfato catalizada por la hexoquinasa es la reacción predominantes que acopla el aumento en los niveles de glucosa extracelular a la secreción de insulina (Efrat y otros (1994), TIBS 19, 535). Un aumento en la actividad hexoquinasa causada por una disminución de T-6-P intracelular estimulará después la producción de insulina en células que son deficiente en la secreción de insulina.
También en animales transgénicos un balance proteína/carbohidratos aumentado puede ser ventajoso. Ambas propiedades de un metabolismo aumentado y una producción potenciada de proteínas son de gran importancia en granjas en las que los animales deberían ganar en carne lo más rápido posible. La transformación de la enzima TPP en animales productores de carne como pollos, ganado vacuno, ovejas, pavos, cabras, pescado, langostas, cangrejos, gambas, caracoles etc, darán animales que crecen más rápido y tiene mas carne proteinácea.
Del mismo modo este metabolismo aumentado significa un aumento en la velocidad de quemar carbohidratos y así impedir la obesidad.
Más efectos específicos de plantas a partir de la disminución de la concentración de T-6-P intracelular son un aumento en el número de flores (aunque no parece que lleven a la formación de la semilla). Sin embargo, un aumento en el número de flores es ventajoso para plantas de flores de cortar y plantas de flores de maceta y también para todas las plantas adecuadas para la horticultura.
Un efecto adicional de este fenómeno de floración es la esterilidad, debido a que las plantas no producen semillas. Las plantas estériles son ventajosas en cruces híbridos.
Otro aspecto importante económicamente es la prohibición de floración temprana de cosechas de cultivos tales como la lechuga, endivias y tanto hierbas de forraje como de ornamentación. Esta es una propiedad beneficiosa debido a que permite que el cultivo crezca sin tener que gasta en esfuerzos metabólicos para la floración y la producción de semillas. Por otro lado, en cultivos como la lechuga, endivias y hierbas el producto/aplicación comercial no está cerrado.
La expresión específica de TPP en ciertas partes (sumideros) de la planta puede dar efectos beneficiosos adicionales. Se prevé que la expresión de TPP por otro promotor que es activo de modo temprano en por ejemplo formación de semillas permita un crecimiento aumentado del desarrollo de la semilla. Un efecto similar sería obtenido mediante la expresión de TPP por un promotor específico de semilla. Para exponerlo brevemente: un crecimiento excesivo de una cierta parte vegetal es posible si el TPP se expresa mediante un promotor específico. La expresión específica de fruta puede llevar a un aumento aumentado de la piel en relación con la carne. Esto permite la mejora del pelado de la fruta, que puede ser ventajoso para industrias de pelado automático.
La expresión de TPP durante el proceso de germinación de semillas que almacenan aceite impide la degradación del aceite. En el proceso de germinación, el ciclo glioxilato es muy activo. Esta ruta metabólica convierte el acetil-CoA via malato en sacarosa, que puede ser transportada y usada como fuente de energía durante el crecimiento de la plántula. Las enzimas claves en este proceso son la malato sintasa y la isocitrato liasa. La expresión de ambas enzimas se supone que está regulada por la señalización de la hexoquinasa. Una de las indicaciones para esta regulación es que tanto la 2-desoxiglucosa como la manosa está fosforiladas por la hexoquinasa y son capaces de transducir sus señales, dándose la reducción de la malato sintasa y la expresión de la isocitrato liasa, sin estar metabolizadas adicionalmente.
La expresión de TPP en la semilla, disminuyendo de ese modo la inhibición de la hexoquinasa, inhibiendo de ese modo la malato sintasa y la isocitrato liasa mantiene el almacenamiento de aceite en las semillas e impide la germinación.
Al contrario de los efectos del TPP el aumento en T-6-P causado por la expresión de TPS causa otros efectos como se ilustra en los Ejemplos. A partir de estos se puede aprender que un aumento en la cantidad de T-6-P causa enanismo o un crecimiento atrofiado (especialmente con expresión elevada de TPS), la formación de hojas con forma mas puntiaguda, color más oscuro debido a un aumento en la clorofila y un aumento en el contenido de almidón. Como ya se reconoció anteriormente, la introducción de un constructo de trehalasa antisentido estimulará efectos similares como la introducción de TPS. Por lo tanto, las aplicaciones que se muestran o indican para el TPS serán establecidas igualmente usando as-trehalasa. Por otro lado, el uso de constructo doble de TPS y as-trehalasa potencia los efectos de un constructo único.
El enanismo es un fenómeno que es deseado en plantas de horticultura, de las cuales los árboles bonsái japoneses son ejemplos proverbiales. Sin embargo, también la creación de miniflores en plantas como plantas semilleras, rosas, Amaryllis, hortensias, abedules y palmeras tendrán oportunidades económicas. Junto con el reino de las plantas el enanismo también se desea en animales. También es posible inducir floración temprana en cultivos tales como la lechuga. Esto es beneficioso debido a que permite la rápida producción de semilla. Idealmente la expresión de TPS para este efecto debería estar bajo control de un promotor inducible.
La pérdida de la dominancia apical también causa la formación de múltiples brotes que es de importancia económica por ejemplo en alfalfa.
Una reducción en el crecimiento es deseado además para la industria de "aperitivos vegetarianos", en los que los vegetales se consideran para ser consumidos en las formas de aperitivos. Los tomates cherry es un ejemplo de vegetales de tamaño reducido que tiene éxito en el mercado. Se puede prever que también otros vegetales como los repollos, coliflor, zanahorias, remolacha y batatas y frutas como la manzana, pera, melocotón, melón, y varias frutas tropicales como el mango y el plátano tendrían mercado en tamaño en miniatura.
El crecimiento reducido se desea para todas las células que son perjudiciales para un organismo, tales como las células de patógenos y células cancerosas. En este último aspecto se puede ver un papel en la regulación del crecimiento cambiando el nivel de T-6-P. Un aumento en los niveles de T-6-P reduciría el crecimiento y el metabolismo de los tejidos cancerosos. Una manera de aumentar el nivel intracelular de T-6-P es eliminar el gen TPP de tales células introduciendo un evento de recombinación específica que causa la introducción de una mutación en los genes TPP endógenos. Una manera en la que esto podría hacerse es la introducción de una secuencia de ADN capaz de introducir una mutación en el gen endógeno vía un anticuerpo internalizante específico de célula cancerígena. Otra manera es el bombardeo de micropartículas dirigido con dicho ADN. Tercero, se pueden usar vectores virales específicos de células cancerígenas que tienen dicho ADN.
El fenómeno de un color verde más oscuro visto con una concentración aumentada de T-6-P, es una propiedad que es deseable para plantas de flores de macetas y, en general, para especies en horticultura y para hierbas ornamentales.
Un aumento en el nivel de T-6-P también causa un aumento en el almacenamiento de carbohidratos tal como almidón y sacarosa. Esto entonces significaría que los tejidos en los que los carbohidratos se almacenan serían capaces de almacenar más material. Esto se puede ilustrar mediante los Ejemplos en los que se muestra que en plantas se forma una biomasa aumentada de órganos de almacenamiento tales como tubérculos y raíces mas gruesas como en las remolachas (almacenamiento de azúcar). El invento también proporciona el uso de trehalosa-6-fosfato según las reivindicaciones 30 a 34.
Los cultivos en los que esto sería ventajoso son patata, remolacha azucarera, zanahorias, achicoria y azúcar de caña.
Un efecto adicional económicamente importante en las patatas es que tras la transformación con ADN que codifica para el gen TPS (que genera un aumento en T-6-P) se ha encontrado que la cantidad de azúcares solubles disminuye, incluso después de la recogida y el almacenamiento de los tubérculos en condiciones frías (4ºC). Normalmente, aún se necesitaría un almacenamiento más frío para evitar los brotes tempranos, pero esto resulta en una excesiva edulcoración de las patatas. La reducción de la cantidad de azúcares reductores es de principal importancia para la industria alimenticia puesto que el material de tubérculo de las patatas dulces no es adecuado para el procesamiento debido a que la reacción Maillard tendría lugar entre los azúcares reductores y los aminoácidos que daría como resultado un oscurecimiento.
De la misma manera también la inhibición de la actividad de la invertasa puede obtenerse transformando remolachas azucareras con un polinucleótido que codifica para la enzima TPS. La inhibición de la actividad invertasa en las remolachas azucareras después de la cosecha es económicamente muy importante. Más adelante se proporciona un método según las reivindicaciones 35 ó 36.
También en las frutas y semillas, el almacenamiento puede estar alterado. Esto no tiene como resultado sólo un aumento de la capacidad de almacenamiento sino un cambio en la composición de los compuestos almacenados. Los cultivos en los que las mejoras en el rendimiento en las semilla son especialmente importantes son el maíz, el arroz, los cereales, los guisantes, semilla de colza, girasoles, soja y legumbres. Además, todas las plantas que llevan frutas son importantes para la aplicación de desarrollar un cambio en la cantidad y composición de los carbohidratos almacenados. Especialmente para la fruta, la composición de productos almacenados da cambios en la solidez y firmeza que es especialmente importante en frutas blandas como el tomate, el plátano, la fresa, el melocotón, las bayas y las uvas.
Al contrario de los efectos vistos con la expresión de TPP, la expresión de TPS reduce la relación de proteína/carbohidratos en hojas. Este efecto es de importancia en cultivos de hojas tomo las hierbas de forraje y alfalfa. Además, las hojas tienen una biomasa reducida, lo cual puede ser de importancia en hierbas de ornamentación pero, lo que es más importante, tienen un contenido energético relativamente aumentado. Esta propiedad es especialmente beneficiosa para los cultivos como la cebolla, el puerro y el maíz de silo.
Además, también la viabilidad de las semillas puede estar influida por el nivel de T-6-P disponible intracelularmente.
Las combinaciones de expresión de TPP en una parte de una planta y TPS en otra parte de la planta puede sinergizar para aumentar los efectos descritos anteriormente. Es posible también expresar los genes de modo secuencial durante el desarrollo usando los promotores específicos. Por último, es también posible inducir la expresión tanto de los genes implicados colocando la secuencia codificante bajo el control de un promotor inducible. Se prevé que las combinaciones de los métodos de aplicación como se describen será evidentes para una persona con experiencia en la técnica.
El invento está ilustrado adicionalmente mediante los ejemplos siguientes. Se resalta que los Ejemplos muestran realizaciones específicas de los inventos, pero que será claro que las variaciones en estos ejemplos y el uso de otras plantas o sistemas de expresión están cubiertos por el invento.
Experimental Manipulaciones de ADN
Todos los procedimientos de ADN (aislamiento de ADN a partir de E. coli, restricción, ligación, transformación, etc.) se realizan según los protocolos estándar (Sambrook y otros, (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York.)
Cepas
En todos los ejemplos la cepa DH5\alpha de E. coli K-12 es usada para clonación. Las cepas de Agrobacterium tumefaciens usadas para experimentos de transformación vegetal son EHA 105 y MOG 101 (Hood y otros (1993) Trans. Research 2, 208).
Construcción de la cepa Agrobacterium MOG101
La construcción de la cepa Agrobacterium MOG101 está descrita en el documento de patente WO 96/21030.
Clonación del gen otsA de E. coli y la construcción de pMOG799.
En E. coli la trehalosa fosfato sintasa (TPS) está codificada por el gen otsA situado en el operón otsBA. La clonación y determinación de secuencia del gen otsA está descrito en detalle en el Ejemplo I del documento WO95/01446, incorporado aquí mediante referencia. Para efectuar su expresión en células vegetales, el marco de lectura abierto ha sido unido a elementos de regulación transcripcional del promotor CaMV 35S ARN, el potenciador transcripcional de la secuencia líder ALMV, y el terminador transcripcional del gen nos, como se describe en mayor detalle en el Ejemplo I del documento de patente WO95/01446, dando como resultado el pMOG799. Una muestra de una cepa de E. coli que alberga el pMOG799 ha sido depositada bajo el Tratado de Budapest en el central Bureau loor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, P.O.Box 273, 3740 AG Baarn, The Netherlands, el Lunes 23 de Agosto de 1993: el número de acceso dado por la institución depositaria internacional es CBS 430.93.
Aislamiento de un promotor/construcción patatin de pMOG546
Un fragmento del promotor patatin es aislado de ADN cromosómico de Solanum_tuberosum cv. Bintje usando la reacción polimerasa en cadena. Un equipo de oligonucleótidos, complementario a la secuencia de la región aguas arriba del gen patatin \lambdapat21 (Bevan y otros (1986) Nucl. Acids Res. 14. 5564), es sintetizado consistiendo en las siguientes secuencias:
5' AAG CTT ATG TTG CCA TAT AGA GTA G 3' PatB33.2 (SEQ ID NO:5)
5' GTA GTT GCC ATG GTG CAA ATG TTC 3' PatATG.2 (SEQ ID NO:6)
Estos cebadores son usados para amplificar por PCR un fragmento de ADN de 1123 pb, usando ADN cromosómico aislado de patata cv. Bintje como molde. El fragmento amplificado muestra un alto grado de similitud con la secuencia de patatin \lambdapat21 y se clona usando los adaptadores EcoR1 en el vector pUC18 dando como resultado el plásmido pMOG546.
Construcción del pMOG845
La construcción del pMOG845 está descrita en el documento de patente WO 96/21030.
Construcción de pVDH318, plastocianina-TPS
El plásmido pMOG798 (descrito en el documento WO95/01446) se digiere con HindIII y se liga con el dúplex oligonucleotídico TCV11 y TCV12 (véase la construcción de pMOG845). El vector resultante se digiere con PstI y HindIII seguido por la inserción del terminador PotPiII dando como resultado PTCV118. El plásmido pTCV118 es digerido con SmaI y HindIII dando un fragmento de ADN que comprende la región codificante TPS y el terminador PotPiII. Los sitios de unión BglII fueron añadidos y el fragmento resultante fue insertado en el vector de expresión binaria vegetal pVDH275 (Fig. 1) digerida con Bam HI, dando pVDH318. El pVDH275 es un derivado de pMOG23 (Sigmons y otros (1990), Bio/Technol. 8. 217) que alberga el marcador de selección NPTII bajo el control del promotor 35S CaMV y un cassette de expresión que comprende el promotor de plastocianina (PC) de guisante y las secuencias nos terminadoras. El promotor de plastocianina presente en el pVDH275 ha sido descrito por Pwee y Gray (1993) Plant J. 3, 437. Este promotor ha sido transferido al vector binario usando la amplificación de PCR y los cebadores que contienen sitios de clonación adecuados.
Clonaje del gen otsB de E.coli y construcción de pMOG1010 (35S CaMV TPP)
Un grupo de oligonucleótidos, TPP I (5' CTCAGATCTGGCCACAAA 3') (SEQ ID NO: 56) y TPP II (5' GTGCTC
GTCTGCAGGTGC 3') (SEQ ID NO: 57), fue sintetizado complementario a la secuencia del gen de E. coli TPP (SEQ ID NO: 3). Estos cebadores fueron usados para amplificar por PCR un fragmento de ADN de 375 pb que albergaban la parte 3' de la región codificante del gen TPP de E. coli, introduciendo un sitio PSTI 10 pb aguas abajo del codon de terminación, usando pMOG748 (documento de patente WO 95/01446) como molde. Este fragmento de PCR fue digerido con BglII y PstI y clonado en pMOG446 (documento de patente europea EP 0449 376 A2 ejemplo 7A) y linealizado con BglII y PstI. El vector resultante fue digerido con PstI y Hind III y un terminador PotPiII fue insertado (véase la construcción pMOG845). El vector anteriormente descrito fue digerido con BglII y HindIII, el fragmento de 1325 pb resultante fue aislado y clonado junto con el fragmento de PCR 5' TPP digerido con SmaI y BglII en pUC18 linealizado con SmaI y Hind III. El vector resultante fue llamado pTCV124. Este vector fue linealizado con EcoRI y SmaI y usado para insertar el promotor 35S CaMV (un fragmento EcoRI- "NcoI" de 850 pb (el sitio NcoI fue hecho romo mediante tratamiento con nucleasa de alubia) aislado a partir de pMOG18 que contiene el promotor potenciador doble 35S CaMV). Este vector fue llamado pTCV127. A partir de este vector un fragmento EcoRI-HindIII de 2,8 kb fue aislado conteniendo el casete de expresión 35S TPP completo y fue clonado en el vector pMOG800 binario resultando en el vector pMOG1010.
Construcción de pVDH321, TPP de plastocianina (PC)
El sitio BamHI del plásmido pTCV124 fue eliminado mediante digestión BamHI, rellenado y subsiguientemente religado. La subsiguiente digestión con HindIII y EcoRI dio un fragmento de ADN que comprende la región TPP y el terminador PotPiII. Los sitios de unión BamHI fueron añadidos y el fragmento resultante fue insertado en el vector de expresión binario vegetal pVDH (digerido con BamHI) dando pVDH321.
Construcción de un vector de expresión TPP patatín
De modo similar a la construcción del vector de expresión TPS patatín (véase la construcción de pMOG845), un vector de expresión TPP patatin fue construido dando un vector binario (pMOG1128) que, después de la transformación, puede efectuar la expresión de TPP en una manera específica de tubérculo.
Construcción de otros vectores de expresión
De modo similar a la construcción de los vectores anteriormente mencionados, los constructos génicos pueden hacerse en los que se usan diferentes promotores, en combinación con TPS, TPP o trehalasa usando vectores binarios con el gen NPTII o el gen de resistencia a higromicina como un gen marcador seleccionable. Una descripción de un vector binario pMOG22 que alberga un marcador de selección HPT es dado en Goddijn y otros (1993) Plant J. 4,
863.
Cruces triparentales
Los vectores binarios son movilizados en cruces triparentales con la cepa HB101 de E. coli que contiene el plásmido pRK2013 (Ditta y otros (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7347) en las cepas MOG101 o EHA105 de Agrobacterium tumefaciens y usadas para transformación.
Transformación de tabaco (Nicotiana tabacum cv. SR1 o cv Samsun NN)
El tabaco fue transformado mediante cocultivo de tejidos vegetales con la cepa de Agrobacterium tumefaciens MOG101 que contiene el vector binario de interés como está descrito. La transformación fue llevada a cabo usando un cocultivo de discos de hoja de tabaco como está descrito por Horsch y otros (1985) Science 227, 1229. Las plantas transgénicas son regeneradas a partir de brotes que crecen en medio de selección que contiene kanamicina, arraigado y transplantado a tierra.
Transformación de patata
La patata (Solanum tuberosum cv. Kardal) fue transformada con la cepa EHA 105 de Agrobacterium que contenía el vector binario de interés. El medio de cultivo básico fue MS30R3 que consiste en sales MS (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 14, 473), vitaminas R3 (Ooms y otros (1987) Theor. Appl. Genet. 73, 744), 30 g/l de sacarosa, 0,5 g/l de MES con un pH final de 5.8 (ajustado con KOH) solidificado cuando es necesario con 8 g/l de agar Daichin. Los tubérculos de Solanum tuberosum cv. Pardal fueron pelados y la superficie esterilizada quemándola en 96% de etanol durante 5 segundos. Las llamas fueron extinguidas en agua estéril y las rodajas cortadas con aproximadamente 2 mm de grosor. Los discos fueron cortados con una perforadora a partir del tejido vascular e incubados durante 20 minutos en medio MS30R3 que contiene 1-5 x 10^{8} bacterias/ml de Agrobacterium EHA 105 que contiene el vector binario. Los discos de tubérculos fueron lavados con medio MS30R3 y transferidos a medio postcultivo solidificado (PM). PM consistía en medio M30R3 suplementado con 3,5 mg/l de zeatina ribósido y ácido acético indol 0,03 mg/l (IAA). Después de dos días, los discos fueron transferidos a medio PM fresco con cefotaxim 200 mg/l y vacomicina 100 mg/l. Tres días después los discos de tubérculos fueron transferidos a medio de inducción de brotes (SIM) que consistía en medio PM con carbenicilina 250 mg/l y kanamicina 100 mg/l. Después de 4-8 semanas, los brotes que emergieron de los discos fueron cortados y colocados en medio de arraigo (medio MS30R3 con cefotaxim 100 mg/l, vancomicina 50 mg/l y kanamicina 50 mg/l). Los brotes fueron propagados limpiamente mediante cortes del meristemo.
Transformación de la lechuga
La transformación de la lechuga, Lattuca sativa cv. Evola fue realizada según Curtis y otros (1994) J. Exp. Bot. 45, 1441.
Transformación de la remolacha azucarera
La transformación de la remolacha azucarera, beta vulgaris (población de mantenimiento) fue realizada según Fry y otros (1991) Tercer congreso internacional de ISPMB, Tucson USA Resumen No. 384, o según Krens y otros (1996), Plant Sci. 116, 97.
Transformación de Lycopersicon esculentum
La transformación del tomate fue realizada según Van Roekel y otros (1993) Plant Cell Rep. 12, 644.
Transformación de Arabidopsis
La transformación de Arabidopsis thaliana fue llevada a cabo bien mediante el método descrito por Clarke y otros (1992) Plant. Mol. Biol. Rep. 10, 178 o bien mediante el método descrito por Valvekens y otros (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5536.
Inducción de microtubérculos
Los segmentos del tallo de plantas de patata in vitro que albergan un meristemo auxiliar fueron transferidas a medio de inducción de microtubérculos. El medio de inducción de microbutérculos contiene 1 X sales MS suplementadas con vitaminas R3, MES 0,5 g/l (pH final= 5,8, ajustado con KOH) y solidificado con agar Daichin 8 g/l, sacarosa 60 g/l y kinetin 2,5 mg/l. Después de 3 a 5 semanas de crecimiento en la oscuridad a 24ºC, se formaron microtubérculos.
Aislamiento de Validamicina A
La Validamicina A se ha encontrado que es un inhibidor altamente específico de las trehalasas de varias fuentes que oscilan desde (IC_{50}) 10^{-6} M a 10^{-10} M (Asano y otros (1987) J. Antibiot. 40, 526; Kameda y otros (1987) J. Antibiot. 40, 563). Excepto para la trehalasa, no inhibe significativamente ninguna actividad \alpha- o \beta-glicohidrolasa. La Validamicina A fue aislada a partir de Solacol, una formulación agricultural comercial (Takeda chem. Industr., Tokio) como se describe por Kendall y otros (1990) Phytochemistry 29, 2525. El procedimiento implica cromatografía de intercambio iónico (QAE-Sephadex A-25 (Pharmacia), vol. de lecho 10 ml, tampón de equilibrado Na-Pi 0,2 mM pH7) de una formulación agricultural al 3%. Cargando 1 mg de Solacol en la columna y eluyendo con agua en 7 fracciones, prácticamente toda la Validamicina fue recuperada en la fracción 4. En base a una recuperación del 100%, usando este procedimiento, la concentración de la Validamicina A fue ajustada a 1.10^{-3} M en medio MS, para usar en ensayos de acumulación de trehalosa. Alternativamente, la Validamicina A y B puede ser purificada directamente desde Streptomyces hygroscopicus var. Limoneus, como está descrito por Iwasa y otros (1971) J. Antibiot. 24, 119, el contenido del cual se incorpora aquí mediante referencia.
Análisis de carbohidratos
Los carbohidratos fueron determinados cuantitativa-mente mediante cromatografía de intercambio aniónico con detección de pulso electroquímico. Los extractos fueron preparados extrayendo material congelado homogeneizado con EtOH 80%. Después de la extracción durante 15 minutos a temperatura ambiente, la fracción soluble es evaporada y disuelta en agua destilada. Las muestras (25 \mul) fueron analizadas en una cromatografía líquida Dionex DX-300 equipada con una columna 4 x 250 mm Dionex 35391 carbopac PA-1 y una precolumna 4 x 50 mm Dionex 43096 carbopac PA-1. La elusión fue hecha con NaOH 100 mM a 1 ml/min segundo de un gradiente NaAc. Los azúcares fueron detectados con un detector electroquímico de pulso (Dionex, PED). Se usaron carbohidratos comercialmente disponibles (Sigma) como estándar.
Análisis de almidón
El análisis de almidón fue realizado como se describe en: Aman y otros, (1994) Methods in Carbohydrate Chemistry, Volume x (eds. BeMiller y otros), pp 111-115.
Análisis de expresión
La expresión de los genes introducidos en diversas especies vegetales fue monitorizada usando análisis de transferencia Northern.
Ensayo de trehalosa-6-fosfato fosfatasa
El TPP fue ensayado a 37ºC midiendo la producción de [^{14}C]trehalosa a partir de [^{14}C]trehalosa-6-fosfato (Londesborough y Vuorio (1991) J. of Gen. Microbiol. 137, 323). Extractos en bruto fueron preparados en Tris 25 mM, HCl pH 7,4, que contenía MgCl_{2} 5,5 mM, Las muestras fueron diluídas a una concentración proteica de alrededor de 1 mg/ml en tampón de extracción que contenía BSA 1 mg/ml. Las mezclas de ensayo estándar (50 \mul volumen final) contenía Tris 27,5 mM, HCl pH 7,4, MgCl_{2} 5,5 mM, BSA 1 mg/ml y T-6-P 0,55 M (actividad específica 854 cpm/nmol). Las reacciones fueron iniciadas mediante la adición de 5 \mul de enzima y terminada después de 1 hora calentándola 5 minutos en agua hirviendo. La resina de intercambio aniónico AG1-X8 (formiato) (BioRad) fue añadida y las mezclas de reacción fueron centrifugadas después de 20 minutos de equilibrado a temperatura ambiente. La radioactividad en el sobrenadante de las muestras (400 \mul) fue medida mediante contaje de centelleo
líquido.
Preparación de extractos vegetales para ensayos hexoquinasa
El material vegetal congelado fue triturado en nitrógeno líquido y homogeneizado durante 30 segundos con tampón de extracción (EB: HEPES 100 mM pH 7.0 (KOH), PVP 1% (p/v), MgCl_{2} 5 mM, EDTA 1,5 Mm, \beta-MeOH 0,1% v/v) incluyendo un cóctel completo de inhibidores de proteinasas (Boeringher Mannheim). Tras centrifugación, las proteínas en el sobrenadante fueron precipitadas usando sulfato amónico 80% y disueltas en Tris-HCl pH 7,4 y el extracto fue dializado durante toda la noche frente a Tris-HCl 100 mM pH 7,4. Parte de la muestra fue usada en el ensayo hexoquinasa.
Ensayo hexoquinasa
La actividad hexoquinasa fue medida en un ensayo que contenía Hepes-KOH 0,1 M pH 7,0, MgCl_{2} 4 mM, ATP 5 mM, NADP^{+} 0,2 mM, Creatina fosfato quinasa 10 U/ml (disuelta en glicerol 50%, BSA 0,1%, Hepes 50 mM pH 7,0), Creatina fosfato 3,5 mM, glucosa-6-fosfato deshidrogenada 7 U/ml y Glucosa 2 mM midiendo el aumento en la D.O. a 340 nm a 25ºC.
Cuando se usó la fructosa 2 mM en lugar de glucosa como sustrato para la reacción hexoquinasa, se incluyó fosfoglucosa isomerasa 3,8 U/ml. Alternativamente, se usó un ensayo hexoquinasa como el descrito por Gancedo y otros. (1977) J. Biol. Chem. 252, 4443.
Ejemplo 1 Expresión del gen otsA (TPS) de E. coli en tabaco y patata
Las plantas de tabaco transgénicas fueron generadas albergando el gen otsA dirigido por el promotor de35SCaMV (pMOG799) o el promotor de plastocianina (pVDH318).
Las plantas de patata transgénicas fueron generadas albergando el gen otsA dirigido por el promotor patatín específico de tubérculo de patata (pMOG845).
Los discos de hoja de tabaco fueron transformados con el vector binario pMOG799 usando Agrobacterium tumefaciens. Los brotes transgénicos fueron seleccionados en kanamicina.
Las hojas de algunas plantas hechas crecer en suelo no se expandieron totalmente en dirección lateral, llevando a una morfología en forma de lanza (Fig. 31).
Además, la dominancia apical fue reducida dando como resultado un crecimiento atrofiado y la formación de varios brotes axiales. Siete de cada treinta y dos plantas mostraron una fuerte reducción en el crecimiento, alcanzando alturas vegetales de 4-30 cm en el momento de la floración (Tabla 1).
TABLA 1 Acumulación de trehalosa en muestras de hojas de plantas de tabaco transgénicas otsA y su longitud de planta en el momento de la floración
Línea vegetal Trehalosa Altura cm
mg. g-1 peso fresco
Testigos 0,00 60-70
799-1 0,04 ND
799-3 0,02 10
799-5 0,08 4
799-15 0,055 30
799-24 0,02 12
799-26 0,05 25
799-32 0,055 30
799-40 0,11 25
ND: no determinada
Las plantas testigo alcanzaron longitudes de 60-70 cm en el momento de la floración. Las líneas transgénicas produjeron menos semillas con el fenotipo de crecimiento atrofiado. Los análisis de transferencia Northern confirmaron que las plantas que tenían el fenotipo de crecimiento atrofiado expresaron el gen otsA de E. coli (Fig. 2). En las plantas testigo no se pudo detectar tránscritos. La funcionalidad del gen introducido se demostró mediante análisis de carbohidratos de material de hoja a partir de 32 plantas de tabaco transgénicas hechas crecer en invernadero, revelando la presencia de 0,02 a 0,12 mg. g^{-1} de peso fresco de trehalosa en plantas reducidas en longitud (tabla 1) indicando que el producto de la reacción catalizada por TPS está desfosforilado mediante fosfatasas vegetales. Una prueba adicional de la acumulación de trehalosa en tabaco fue obtenida tratando extractos en bruto con trehalasa porcina. Una incubación prolongada de un extracto de hoja de tabaco con trehalasa tuvo como resultado una degradación completa de la trehalosa (datos no mostrados). La trehalosa no fue detectada en plantas testigo o en plantas de tabaco transgénicas sin un fenotipo aberrante.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1a Transformantes de tabaco PC-TPS primarios
1
2
Las plantas de tabaco transgénicas pVDH318 desarrollaron un crecimiento atrofiado y un desarrollo de hojas pequeñas que fueron de verde más oscuro y ligeramente más gruesas que las hojas testigo, un fenotipo similar a las plantas transgénicas pMOG799 (tabla 1a). Un análisis adicional de estas hojas mostró un peso fresco y seco aumentado por área de hoja comparada con los testigos (tabla 1a y 2). Las hojas verde más oscuro indican la presencia de más clorofila en las hojas transgénicas (tabla 1b). Las plantas transgénicas para pMOG799 (35STPS) y pMOG1177 (PCTPS) fueron analizadas en lo que respecta a carbohidratos solubles, clorofila, trehalosa y almidón (Fig. 32). El pMOG1177 es funcionalmente idéntico a pVDH318.
TABLA 1b Contenido en clorofila de hojas de N. tabacum (To) transgénicas para PC-TPS
Muestra Clorofila (mg/g de hoja)
testigo 1 0,59
PC TPS 10-1 0,75
PC TPS 10-2 0,80
PC TPS 11 0,60
PC TPS 13 0,81
PC TPS 16 0,90
PC TPS 19 0,64
PC TPS 37 0,96
\begin{minipage}[t]{133mm} Nota: las condiciones de luz durante el crecimiento influirán en los niveles determinados de clorofila de modo significativo. Las cantidades calculadas de clorofila pueden así solamente ser comparadas entre plantas cultivadas y analizadas dentro de un experimento.\end{minipage}
TABLA 2 Datos de peso fresco y peso seco de material de hoja transgénica para plastocianina-TPS_{E.coli}
N. tabacum cv. Samsun NN transgénica para PC-TPS
Transgén Testigo
peso fresco (g) 0,83 0,78
peso seco (g) 0,072 0,079
% materia seca 8,70% 10,10%
PF / área 39 (139%) 28 (100%)
PS / área 3,46 (121%) 2,87 (100%)
área (unidades) 208 275
El cálculo de la relación entre la longitud y la anchura de las hojas en desarrollo indica claramente que las hojas de las plantas transgénicas para PC-TPS tienen más forma de lanza (tabla 3).
Los discos de tubérculos de patata Solanum tuberosum cv. Kardal fueron transformados con Agrobacterium tumefaciens EHA 105 que alberga el vector binario pMOG845. los transgénicos fueron obtenidos con frecuencias de transformación comparables a los testigos de vector vacío. Todas las plantas obtenidas fueron fenotípicamente indistinguibles de las plantas silvestres indicando que el uso de un promotor específico de tejido impide el fenotipo observado en plantas en las que un promotor constitutivo dirige el gen TPS. Los microtubérculos fueron inducidos en segmentos de tallo de transgénicos y las plantas silvestres fueron cultivadas en medio inductor de microtubérculos suplementado con Validamicina A 10^{-3} M. Como testigo, los microtubérculos fueron inducidos en medio sin Validamicina A. Los microtubérculos inducidos en medio con Validamicina A mostraron niveles elevados de trehalosa en comparación con microtubérculos crecidos en medio sin Validamicina A (tabla 4). La presencia de pequeñas cantidades de trehalosa en plantas silvestres indica la presencia de una ruta biosintética de trehalosa funcional.
TABLA 3 Plantas de tabaco transgénicas para pVDH318 (cv. Samsun NN)
4
TABLA 4 Trehalosa (% de peso fresco)
+ Validamicina A - Validamicina A
845-2 0,016 -
845-4 - -
845-8 0,051 -
845-11 0,015 -
845-13 0,011 -
845-22 0,112 -
845-25 0,002 -
845-28 0,109 -
Kardal silvestre 0,001 -
Ejemplo 2 Expresión del gen otsB de E. coli (TPP) en tabaco
Las plantas de tabaco transgénicas fueron generadas albergando el gen otsB dirigido por el promotor doble potenciado 35SCaMV (pMOG1010) y el promotor de plastocianina (pVDH321).
Las plantas de tabaco (cv. Samsun NN) transformadas con pMOG1010 revelaron en el invernadero el desarrollo de hojas muy grandes (área de hoja aumentada en promedio hasta aproximadamente 140%) que empezaron a desarrollar clorosis cuando estaban completamente desarrolladas (Fig. 31). Adicionalmente, los tallos más gruesos fueron formados comparados con los testigos, en algunos ejemplos llegando a arrancarse de los tallos. En algunos casos, se formaron múltiples tallos (ramificación) a partir de la base de la planta (tabla 5). Las muestras de hoja de plantas que desarrollaron grandes hojas revelaron de 5 a 10 veces actividades trehalosa-6-fosfato potenciadas comparadas con las plantas testigo proporcionando funcionalidad del gen introducido. El peso seco y fresco/cm^{2} de las hojas grandes anormales fue comparable a las hojas testigo, indicando que el aumento en tamaño es debido a un aumento en materia seca y no a un contenido en agua aumentado. La inflorescencia fue también afectada por la expresión de TPP. Las plantas que tenían un fenotipo atrofiado, causado probablemente por la expresión constitutiva del gen TPP en todas las partes vegetales, desarrollaron muchas flores pequeñas que no maduraron completamente y se cayeron o se necrotizaron. El de-
sarrollo de flores y establecimiento de semillas parece estar menos afectado en plantas que estaban menos atrofiadas.
TABLA 5 Plantas de tabaco transgénicas para pMOG1010, dp35S CaMV TPP
6
7 
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TABLA 6 Transformantes de tabaco PC-TPP primarios
8
9
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Las plantas de tabaco (cv. Samsun NN) transformadas con pVDH321 revelaron en el invernadero un patrón de desarrollo comparable a las plantas transgénicas pMOG1010 (tabla 6).
Las plantas transgénicas para pMOG1010 (35S-TPP) y pMOG1124 (PC-TPP) fuerona analizadas en lo que se refiere a carbohidratos, clorofila, trehalosa y almidón (Fig. 32). Para los datos de clorofila véase también la Tabla 6a.
TABLA 6a Contenido en clorofila de hojas N. tabacum (To) transgénicas para PC-TPP
Muestra Clorofila (mg/ g de hoja) Fenotipo de hoja
Testigo 1 1,56 Silvestre
Testigo 2 1,40 Silvestre
Testigo 3 1,46 Silvestre
Testigo 4 1,56 Silvestre
Testigo 5 1,96 Silvestre
PC TPP 12 0,79 despigmentada
PC TPP 22 0,76 despigmentada
PC TPP 25 1,30 Silvestre
PC TPP 37 0,86 Silvestre
PC TPP 38 0,74 despigmentada
\begin{minipage}[t]{130mm}Nota: las condiciones de luz durante el crecimiento influirán significativamente en los niveles determinados de clorofila. Las cantidades calculadas de clorofila pueden así ser sólo comparadas entre plantas cultivadas y analizadas dentro de un experimento.\end{minipage}
Ejemplo 3 Aislamiento de fragmentos génicos que codifican la trehalosa-6-fosfato sintasa de Selaginella lepidophylla y Helianthus annuus
Comparación de las secuencias proteicas TPS de E. coli y S. cerevisiae revelaron la presencia de varias regiones conservadas. Estas regiones fueron usadas para diseñar cebadores degenerados que fueron ensayados en reacciones de amplificación de PCR usando ADN genómico de E. coli y levadura como molde. Se usó un programa de PCR con un desnivel de temperaturas entre la temperatura de hibridación y la etapa de elongación para facilitar la hibridación de los cebadores degenerados.
La amplificación por PCR fue realizada usando los equipos de cebadores TPSdeg 1/5 y TPSdeg 2/5 usando cADN de Selaginella lepidophylla como molde.
Los cebadores degenerados usados (código IUB):
TPSdeg1: GAY ITI ATI TGG RTI CAY GAY TAY CA (SEQ ID Nº: 7)
TPSdeg2: TIG GIT KIT TYY TIC AYA YIC CIT TYC C (SEQ ID N:8)
TPSdeg5: GYI ACI ARR TTC ATI CCR TCI C (SEQ ID Nº: 9)
Los fragmentos de PCR del tamaño esperado fueron clonados y secuenciados. Puesto que se aislaron un gran número de secuencias homólogas, se usaron análisis mediante transferencia Southern para determinar qué clones hibridaban con el ADN genómico de Selaginella. Dos clones fueron aislados, el clón 8 cuya secuencia está dada en la SEQ ID Nº:42 (combinación de cebadores de PCR 1/5) y el clon 43 cuya secuencia está dada en la SEQ ID Nº: 44 (combinación de cebadores de PCR 2/5) el cual a nivel de aminoácidos reveló regiones con un alto porcentaje de identidad con los genes TPS de E. coli y levadura.
Un fragmento génico de TPS fue aislado de Helianthus annuus (girasol) usando la combinación de cebadores TPSdeg 2/5 en una amplificación de PCR con el ADN genómico de H. Annuus como molde. Los análisis de secuencia y de transferencia Southern confirmaron la homología con el gen TPS de E. coli, levadura y Selaginella. La comparación de estas secuencias con las secuencias EST (fragmentos de secuencia expresados) de varios organismos, véase la Tabla 6b y SEQ ID Nºs 45-53 y 41, indicaron la presencia de genes altamente homólogos en arroz y Arabidopsis, que apoyan este invento de que la mayoría de las plantas contienen génes TPS homólogos (Fig. 3).
TABLA 6b
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Ejemplo 4 Aislamiento de los genes TPS y TPP vegetales a partir de Nicotiana tabacum
Los fragmentos del cADN que codifica para TPS- y TPP fueron aislados usando PCR en cADN derivado de preparaciones de ARN total de hojas de tabaco. La columna "anidada" en la tabla 7 indica si una segunda ronda de amplificación por PCR fue necesaria con los grupo 3 y 4 de cebadores para obtener el correspondiente fragmento de ADN. Los cebadores han sido incluidos en el listado de secuencias (tabla 7). El subclonaje y el subsiguiente análisis de secuencias de los fragmentos de ADN obtenidos con los grupos de cebadores mencionados reveló una homología sustancial con los genes TPS conocidos (Fig. 4 y 5).
TABLA 7 Amplificación de cADN de TPS y TPP derivados de plantas
TPS-cADN Cebador 1 Cebador 2 Anidado Cebador 3 Cebador 4
"825" pb Tre-TPS-14 Deg 1 No
SEQ ID. NO 22 y 23 SEQ ID NO 30 SEQ ID NO 7
"840" pb Tre-TPS 14 Tre-TPS-12 si Tre-TPS-13 Deg 5
SEQ ID. NO 18 y 19 SEQ ID NO 30 SEQ ID siNO 31 SEQ ID NO 32 SEQ ID NO 9
"630" pb Tre-TPS 14 Tre-TPS-12 si Deg 2 Deg 5
SEQ ID. NO 20 y 21 SEQ ID NO 30 SEQ ID NO 31 SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 9
TABLA 7 (continuación)
TPP-cADN Cebador 1 Cebador 2 Anidado
"723" pb Tre-TPP-5 Tre-TPP-16 No
SEQ ID. NO 16 y 17 SEQ ID NO 35 SEQ ID NO 38
"543" pb Tre-TPP-7 Tre-TPP-16 No
SEQ ID. NO 14 SEQ ID NO 36 SEQ ID NO 38
"447" pb Tre-TPP-11 Tre-TPP-16 No
SEQ ID. NO 12 SEQ ID NO 37 SEQ ID NO 38
Ejemplo 5 Aislamiento de un gen bipartito TPS /TPP de Helianthus annuus y Nicotiana tabacum
Usando la información de la secuencia del fragmento del gen TPS de girasol (Helianthus annuus), se obtuvo un clon TPS completo de girasol usando la tecnología RACE-PCR. El análisis de la secuencia de este clon completo y alineado con TPS2 de la levadura (Fig. 6) y secuencias codificadas TPS y TPP indicaron que el clon aislado codifica una enzima bipartita TPS/TPP (SEQ ID NO 24, 26 y 28). El clon bipartito aislado (pMOG1192) se depositó en la Oficina Central para la colección de cepas bajo las reglas del tratado de Budapest con número de acceso CBS692.97 el 21 de abril de 1997.
Posteriormente, investigamos si otras especies de plantas contenían también clones bipartitos TPS/TPP. Un cADN bipartito TPS/TPP fue amplificado a partir del tabaco. Un producto de ADN del tamaño deseado (es decir 1,5 Kb) se detectó después del PCR con los cebadores TPS degl/TRE-TPP-16 y se anidó con TPS deg2/TRE-TPP-15 (SEQ ID NO: 33). Una banda idéntica apareció con el PCR con TPS deg1/TRE-TPP-6 (SEQ ID NO:34) y se anidó con TPS deg2/TRE-TPP-15. El ultimo fragmento se mostró para hibridar con el cADN bipartito del girasol en un experimento de transferencia Southern. Además, usando búsquedas en la base de datos del ordenador, se identificó un clon bipartito de Arabidopsis (SEQ ID NO:39).
Ejemplo 6 Expresión de planta derivada de genes TPS en plantas
Una prueba adicional para la función de genes TPS del girasol y Selaginella lepidophylla se obtuvo al aislar sus correspondientes clones cADN de tamaño completo y la subsiguiente expresión de estos clones en las plantas bajo el control del promotor 35S CaMV. La acumulación de trehalosa mediante la expresión de la enzima de Seliganella ha sido publicada por Zentella e Iturriaga (1996) (Plant Physiol. 111, Abstract 88).
Ejemplo 7 Genes que codifican TPS y TPP de las especies monocotiledóneas
Una búsqueda de las secuencias en el ordenador del Genbank reveló la presencia de varias secuencias EST de arroz homologas al TPS1 y TPS2 de la levadura (Fig. 7) que se incluyen en el listado de secuencias (SEQ ID NO: 41, 51, 52 y 53).
Ejemplo 8 Aislamiento del gen humano TPS
Se aisló un gen TPS del cADN humano. Se realizó una reacción PCR en el cADN humano usando los cebadores degenerados TPS deg2 y deg5. Esto condujo al fragmento TPS deseado de 0,6 kb. El análisis de la secuencia (SEQ ID NO. 10) y la comparación con la secuencia de la levadura TPS indicaron que la secuencia aislada codifica una proteína TPS homologa (Fig. 8).
Ejemplo 9 Inhibición de la expresión TPS endógena mediante inhibición antisentido
La expresión de genes TPS endógenos se pueden inhibir mediante la expresión antisentido de un gen TPS homólogo bajo control de secuencias de promotores que dirigen la expresión de dicho gen TPS antisentido en células o tejidos en los que se desea la inhibición. Mediante esta aproximación, es preferible usar una secuencia completamente idéntica al gen TPS que ha sido suprimido aunque no es necesario expresar la región de codificación completa en un vector de expresión antisentido. Los fragmentos de dicha región de codificación han mostrado también ser funcionales en la inhibición antisentido de la expresión del gen. Alternativamente, los genes heterólogos se pueden usar para la aproximación antisentido cuando estos son suficientemente homólogos al gen endógeno.
Vectores binarios similares al pMOG845 y pMOG1010 se pueden usar para asegurar que las regiones de codificación de los genes introducidos que tienen que ser suprimidos se introduzcan en orientación inversa. Todos los promotores adecuados para dirigir la expresión de genes en tejidos diana son también adecuados para la expresión de genes antisentido.
Ejemplo 10 Inhibición de expresión endógena TPP mediante inhibición antisentido
Similar a la construcción de vectores que se pueden usar para dirigir la expresión antisentido de TPS en células y tejidos (Ejemplo 9), se pueden construir vectores que dirigen la expresión antisentido de genes TPP.
Ejemplo 11 Acumulación de trehalosa en tabaco de tipo silvestre y plantas de patata cultivadas en Validamicina A
La evidencia de la presencia de una ruta biosintética de trehalosa en el tabaco fue obtenida cultivando plantas de tipo silvestre en presencia de una concentración 10^{-3} del inhibidor de trehalasa Validamicina A. Las plantas tratadas acumularon muy pocas cantidades de trehalosa, hasta 0,0021% (pf).
La acumulación de trehalosa no fue nunca detectada en las plantas testigo cultivadas sin inhibidor. Datos similares se obtuvieron con microtubérculos de tipo silvestre cultivados en presencia de Validamicina A. Diez de un grupo de diecisiete líneas acumularon trehalosa (pf) en un promedio de 0,001% (Tabla 4). No se observó trehalosa en microtubérculos que fueron inducidos en un medio sin Validamicina A.
Ejemplo 12 Acumulación de trehalosa en plantas de patata transgénicas para as-trehalase
Otra prueba para la presencia de genes biosintéticos de trehalosa endógena se obtuvo por transformación de plantas de patata de tipo silvestre con una construcción de trehalasa antisentido 35S CaMV (SEQ ID NO: 54 y 55, pMOG1027; descrita en el documento de patente WO 96/21030). Un golpe de patata transgénica para pMOG1027 mostró acumular trehalosa hasta 0,008% en base al peso fresco.
La identidad del pico de trehalosa observado se confirmó al descomponer específicamente la trehalosa acumulada con la enzima trehalase. Los tubérculos de algunas líneas transgénicas pMOG1027 mostraron la acumulación de pequeñas cantidades de trehalosa (Fig. 9).
Ejemplo 13 Inhibición de la actividad de la planta hexoquinasa por trehalosa-6 fosfato
Para demostrar el efecto regulador de la trehalosa-6-fosfato en la actividad hexoquinasa, se prepararon extractos vegetales y se ensayaron en lo que respecta a la actividad hexoquinasa en ausencia y presencia de trehalosa-6-fosfato.
\bullet
Los extractos de tubérculo de patata se ensayaron usando fructosa (Fig. 10, Fig. 11) y glucosa (Fig. 11) como sustrato. El ensayo del tubérculo de patata usando T-6-P 1 mM y fructosa como sustrato se realizó según Gancedo y otros (1997) J. Biol. Chem. 252, 4443. Los siguientes ensayos en tabaco, arroz y maíz se realizaron según el ensayo descrito en la sección experimental.
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Los extractos de hoja de tabaco fueron ensayados usando fructosa (Fig. 12) y glucosa (Fig. 12, Fig. 13) como sustrato.
\bullet
Los extractos de hoja de arroz fueron ensayados usando fructosa y glucosa (Fig. 14) como sustrato.
\bullet
Los extractos de hoja de maíz fueron ensayados usando fructosa y glucosa (Fig. 15) como sustrato.
Ejemplo 14 Inhibición de la actividad hexoquinasa en cultivos de células animales por trehalosa-6-fosfato
Para demostrar la regulación de la actividad hexoquinasa en células animales, se prepararon extractos de célula completa a partir de cultivos de células de hibridoma de ratón. Se realizó un ensayo hexoquinasa usando glucosa o fructosa como sustrato en condiciones como las descritas por Gancedo y otros (véase anteriormente). Las células de hibridoma de ratón fueron sometidas a choque osmótico exponiendo el precipitado celular a 20% de sacarosa, seguido de agua destilada. Este extracto de proteína en bruto fue usado en el ensayo de hexoquinasa (50 \mul de extracto correspondiente a alrededor de 200 \mug de proteína).
TABLA 8 Inhibición de la actividad hexoquinasa animal por T-6-P
Sustrato Concentración T6P V_{0} V_{1} Inhibición
(mM) (mM) (U.D.O/min) (U.D.O/min) (%)
Glucosa 2 0,83 0,0204 0,0133 35
Glucosa 20 0,83 0,0214 0,0141 35
Glucosa 100 0,83 0,0188 0,0125 34
Fructosa 20 0,23 0,0207 0,0205 1
Fructosa 20 0,43 0,0267 0,0197 26
Fructosa 20 0,83 0,0234 0,0151 35
Fructosa 20 1,67 0,0246 0,0133 46
Los datos obtenidos mostraron claramente que la actividad hexoquinasa en extractos de células de ratón se inhibe por trehalosa-6-fosfato. El intervalo de concentración T-6-P en el que se observa este efecto es comparable al que se ha observado en extractos de planta en bruto. Ninguna diferencia se observa en la eficacia de la inhibición hexoquinasa por trehalosa-6-fosfato usando glucosa o fructosa como sustrato para la enzima.
Ejemplo 15 Fotosíntesis y respiración de plantas de tabaco que expresan TPS y TPP
Usando plantas de tabaco transgénicas para 35S-TPP (1010-5), PC-TPS (1318-10 y 1318-37) y plantas NN Samsun de tipo silvestre, los efectos de la expresión de estos genes en la fotosíntesis y respiración fueron determinados en las hojas.
Se realizaron medidas en condiciones experimentales de intercambio de gases. Las velocidades de intercambio de gases fueron calculadas en base a la diferencia en la concentración entre el aire entrante y el aire saliente usando un equipo de análisis de gases por infrarrojos. La fotosíntesis y respiración se midieron en hojas idénticas. De cada planta transgénica, se usó la hoja más joven, completamente madura (hoja superior) y una hoja que estaba 3-4 "niveles" de hoja más abajo (hoja inferior).
La fotosíntesis fue medida como una función de la intensidad de luz fotosintéticamente activa (PAR) de 0-975 \mumol.m^{-2}.s^{-1} (200 Watt m^{-2}) a concentraciones de CO_{2} cuatro veces superiores, de 350 vpm y 950 vpm.
La respiración fue medida usando dos intervalos de tiempo diferentes. Las medidas realizadas durante un período corto de oscuridad después de los experimentos de fotosíntesis se codificaron como RD en la tabla 9. Estos valores reflejan la actividad instantánea puesto que la respiración varía sustancialmente durante el período oscuro. Por tanto, los valores para el período de la noche entera también se sumaron como se muestran en la tabla 10 (sólo medidas a 350 vpm de CO_{2}).
TABLA 9 Intervalo de fotosíntesis y respiración, DE es desviación estándar
13
TABLA 10 Respiración durante 12 horas de período de oscuridad (mmol CO_{2}), DE es desviación estándar
Hoja superior DE Hoja inferior DE
Tipo silvestre 25,17 0,82 13,19 1,98
1010-5 30,29 5,09 13,08 1,52
1318-10 28,37 4,50 20,47 0,87
1318-37 32,53 2,01 17,7 1,03
En contraste con la respiración en las hojas superiores, en las hojas inferiores la respiración de plantas TPS transgénicas es significativamente más alta que el tipo silvestre y que las plantas TPP (Tabla 10) que indican una actividad metabólica más alta. La disminución en la respiración durante la maduración de las hojas es significativamente menor para plantas TPS transgénicas.
También, las características fotosintéticas defirieron significativamente entre, por un lado plantas TPS transgénicas y por otro lado plantas TPP transgénica y plantas de tipo silvestre. Los valores AMAX (máximo de fotosíntesis a saturación de luz), eficacia de fotosíntesis (EFF) y la velocidad de respiración durante un corto período de oscuridad después de las medidas fotosintéticas (RD) se muestran en la tabla 9. En promedio, las hojas TPS superiores tenían un valor AMAX 35% más alto comparado con hojas TPP y las de tipo silvestre. Las hojas inferiores muestran incluso un velocidad mayor aumentada de fotosíntesis (88%).
Para excluir que diferencias en la absorción de la luz estuvieran causando la diferencia en las velocidades de fotosíntesis, se midieron los valores de absorción con una SPAD-502 (Minolta). No se midieron diferencias significativas en la absorción (Tabla 11).
TABLA 11 Valores de absorción de líneas transgénicas
Absorción (%) Hoja superior Hoja inferior
Samsun NN tipo silvestre 84 83
1010-5 84 82
1318-10 85 86
1318-37 86 86
Ejemplo 16 Fluorescencia de la clorofila de TPS y TPP expresada en plantas de tabaco
Usando plantas de tabaco transgénicas para 35S-TPP (1010-5), PC-TPS (1318-10 y 1318-37) y plantas NN Samsun de tipo silvestre, se determinaron los efectos en la expresión de estos genes en la fluorescencia de la clorofila del material de la hoja. Se midieron dos características de fluorescencia:
1) ETE (eficacia en el transporte de electrones), como una medida para la velocidad de transporte de electrones y la generación de poder reductor y
2) Apagamiento no fotoquímico, una medida para la disipación de energía producida por la acumulación de productos asimilados.
Las plantas fueron cultivadas en un invernadero con luz adicional de 100 \mumol. m^{-2}.s^{-1} (04:00 - 20:00 horas). Día/noche T=21ºC/18ºC; H.amb \pm75%. Durante un período nocturno previo a las medidas (16 horas de duración), dos plantas de cada genotipo fueron transferidas a la oscuridad y dos plantas a la luz (\pm430 \mumol, m^{-2}.s^{-1}, 20ºC, H.amb 70%). Se midió la hoja más joven completamente madura. La eficacia fotoquímica de PSII (fotosistema II) y los parámetros de "apagamiento no fotoquímico" se determinaron como una función de incremento de la intensidad de la luz. A cada intensidad de luz, se tomó un tiempo de estabilización de 300 seg. Las medidas fueron realizadas a 5, 38, 236, 422 y 784 \mumol m^{-2}.s^{-1} PAR con una frecuencia de 3 ráfagas de luz min^{-1}, 350 ppm CO_{2} y 20% de O_{2}. Los experimentos se repitieron usando plantas idénticas, invirtiendo el pre-tratamiento de la oscuridad a la luz y viceversa. Las características fluorescentes se describen en la Fig. 16.
La disminución en la eficacia del transporte de electrones (ETE) fue comparable entre plantas TPP y de tipo silvestre. Las plantas TPS respondieron claramente menos al incremento de la intensidad de la luz. Esta diferencia fue más clara en el pre-tratamiento de la luz. Estas observaciones están de acuerdo con los datos de apagamiento "no fotoquímicos". Las plantas TPS respondieron claramente menos al suministro adicional de productos asimilados por la luz en comparación con las plantas TPP y de tipo silvestre. En el caso de las plantas TPS, la regulación negativa de acumulación de productos asimilados en la fotosíntesis se redujo significativamente.
Ejemplo 17 Exportación y colocación de productos asimilados en plantas de tabaco que expresan TPS y TPP
Usando plantas de tabaco transgénicas para 35S-TPP (1010-5) y PC-TPS (1318-37), se determinó
1) la exportación de productos asimilados de carbono de una hoja completamente madura (que indica "actividad de fuente relativa", Koch (1996) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 47, 509 y
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2) la acumulación neta de productos fotoasimilados en disminución ("actividad de sumidero relativa"), durante un período de luz y uno de oscuridad.
El estadío de desarrollo de las plantas: capullos de flores apenas visibles. La técnica de marcaje usada: elevada abundancia en estado estacionario de productos fotosinteticos marcados con 13C (De Visser y otros (1997) Plant Cell Environ 20, 37). De ambos genotipos, 6 plantas, usando una hoja completamente madura, se marcaron con 5,1 átomos % de ^{13}CO_{2} durante un período de luz (10 horas), seguido cuando era apropiado de un período de oscuridad (14 horas). Después del marcaje, la plantas se dividieron en: 1) brote-punta, 2) hoja joven creciendo, 3) hoja joven completamente desarrollada (por encima de la hoja que ha sido marcada), 4) tallo joven (por encima de la hoja que ha sido marcada), 5) hoja marcada, 6) pecíolo y base de la hoja marcada, 7) hoja vieja, senescente, 8) otras hojas y hojas viejas por debajo de la hoja marcada, 9) tallo por debajo de la hoja marcada, 10) raíz-puntas. Se determinó el número, el peso fresco y seco y el porcentaje de carbono ^{13}C (átomo% de ^{13}C). Junto a los parámetros generales como biomasa, materia seca y número de hojas, se calculó: 1) exportación de C fuera de la hoja marcada; 2) la contribución relativa de C importado en partes de la planta; 3) la cantidad absoluta de C importado en partes de la planta; 4) la distribución relativa de C importado durante un período de luz y un período completo de luz y de oscuridad.
La biomasa por encima del suelo de las plantas TPP transgénicas fue un 27% mayor comparado con las plantas TPS transgénicas (P< 0,001); también el sistema radicular de las TPP transgénicas se desarrolló mejor. Las plantas TPP revelaron una distribución de materia seca significativamente alterada, 39% + de hoja y 10% + de biomasa radicular comparada con las plantas TPS. Las plantas TPS tuvieron un número mayor de hojas, pero un área de hoja más pequeña por hoja. El área total de hoja por planta TPS fue comparable con la silvestre (0,4 m^{2} planta^{-1}).
- Actividad fuente relativa de una hoja completamente desarrollada
La tasa de exportación neta de fotosintatos fuera de la hoja marcada es determinada por la disminución relativa del % de "C nueva" durante la noche (para TPP 39% y para TPS 56%) y por la cantidad total fijada presente en la planta usando la cantidad de "C nueva" en la planta (sin la hoja marcada) como una medida. Después del período de luz, las hojas TPP exportaron un 37% comparado con un 51% para las hojas TPS (tabla 11). En un siguiente período de oscuridad, este porcentaje aumentó hasta 52% y 81% respectivamente. Ambos métodos apoyan la conclusión de que las plantas TPS transgénicas tienen una tasa de exportación significativamente potenciada de productos fotosintéticos comparados con las plantas TPP transgénicas.
- Cantidad absoluta de "C nueva" en partes vegetales
La exportación por las TPS transgénicas fue significativamente mayor comparada con las TPP transgénicas. Las hojas TPS en crecimiento importan C mas fuertemente comparado con las hojas TPP jóvenes en crecimiento.
- Aumento relativo de "C nueva" en partes vegetales: fuerza sumidero
La contribución relativa de "C nueva" a la parte vegetal concerniente se describe en la Fig. 17. Este porcentaje es una medida de la fuerza sumidero. Una fuerza sumidero significativamente mayor estuvo presente en las TPS transgénicas, especialmente en la parte superior de los brotes, el tallo por encima y por debajo de la hoja marcada y el pecíolo de la hoja marcada.
TABLA 11 Actividad fuente de un hoja marcada completamente desarrollada: acumulación y exportación de asimilados de C en la hoja marcada y la planta entera (por encima del suelo) después del estado estacionario de marcaje con 13^{C} durante un período de luz (día). N=4: los valores LSD indicaron las diferencias significativamente más pequeñas para P< 0,05
1000
- Distribución relativa, dentro de la planta, de "C nueva" entre las partes vegetales: fuerza sumidero relativa
La distribución de carbono fijado entre los órganos vegetales (Fig. 18) confirmó las conclusiones anteriormente mencionadas. Las plantas TPS transgénicas revelaron una exportación relativamente grande de asimilados al extremos superior de los brotes, a la hoja joven en crecimiento (día) e incluso a la hoja más vieja (sin meristemos axilares), y al tallo joven y viejo.
Ejemplo 18 Lechuga Rendimiento de las plantas de lechuga transgénicas para PC-TPS y PC-TPP
Construcciones usadas en experimentos de transformación de lechuga: PC-TPS y PC-TPP. Las PC-TPS transgénicas fueron rescatadas durante la regeneración cultivando explantes en sacarosa 60 g/l. Los fenotipos de ambas plantas TPS y TPP transgénicas se distinguen claramente a partir de testigos silvestres; las plantas TPS transgénicas tienen hojas gruesas, verde oscuro y las plantas transgénicas TPP tienen hojas verde claro con un borde de hoja más suave cuando se comparan con las plantas silvestres.
La morfología de las hojas, y modo más prominente los bordes de la hoja, se vieron afectados claramente por la expresión de TPS y TPP. Las hojas transgénicas para PC-TPS tuvieron muchos más "recortes" que las hojas transgénicas PC-TPP que tenían una morfología más suave y más redonda (Fig. 19). Los extractos de hoja de líneas de lechuga transgénica fueron analizados en lo que se refiere a los azúcares y el almidón (Fig. 20).
Ejemplo 19 Remolacha azucarera Rendimiento de plantas de remolacha transgénica para PC-TPS y PC-TPP
Las construcciones usadas en los experimentos de transformación de remolacha azucarera fueron: PC-TPS y PC-TPP. Las frecuencias de transformación obtenidas con ambas construcciones de TPS y TPP fueron comparables a los testigos. Los fenotipos de ambas plantas transgénicas TPS y TPP se distinguieron claramente de los testigos de tipo silvestre; las plantas transgénicas TPS tenían hojas gruesas, verde oscuras y las plantas transgénicas TPP tenían hojas de color verde claro con pecíolos ligeramente más grandes cuando se compararon con plantas de tipo silvestre (Fig. 21). El diámetro de la raíz se determinó para todas las plantas después de alrededor de 8 semanas de crecimiento en el invernadero. Algunas líneas transgénicas PC-TPS que tenían un tamaño de hoja similar al de las plantas testigo mostraron un diámetro significativamente mayor de la raíz (Fig. 22). Las líneas transgénicas PC-TPP formaron una raíz más pequeña comparada con los testigos no transgénicos. Los extractos de hojas de líneas transgénicas de remolacha azucarera fueron analizados en lo que respecta a los azúcares y almidón (Fig. 20).
Ejemplo 20 Arabidopsis Rendimiento de plantas Arabidopsis transgénicas para PC-TPS y PC-TPP
Las construcciones usadas en experimentos de transformación de Arabidopsis: PC-TPS y PC-TPP. Los fenotipos de ambas plantas transgénicas TPS y TPP se distinguieron claramente de los testigos de tipo silvestre; las plantas transgénicas TPS tenían hojas gruesas, verde oscuras y las plantas transgénicas TPP tenían hojas más grandes, despigmentadas cuando se compararon con plantas de tipo silvestre. Las plantas con niveles altos de expresión TPP no generaron semillas.
Ejemplo 21 Patata Rendimiento de plantas Solanum tuberosum transgénicas para las construcciones TPS y TPP
Construcción: 35S-TPS 
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pMOG799
Las plantas transgénicas para pMOG799 se hicieron crecer en el invernadero y se determinó el rendimiento del tubérculo (Fig. 23). La mayoría de las plantas transgénicas mostraron tamaños de hojas menores cuando se compararon con los testigos de tipo silvestre. Las plantas con tamaños de hoja más pequeños dieron una masa de tubérculo menor comparado con las líneas testigo (Fig. 25).
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Construcción: 35S-TPP 
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pMOG1010 y PC-TPP pMOG1124
Las plantas transgénicas para pMOG1010 y pMOG1124 se hicieron crecer en el invernadero y se determinó el rendimiento del tubérculo. El rendimiento del tubérculo (Fig. 24) fue comparable o menor que el de las líneas testigo de tipo silvestre (Fig. 25).
Construcción: PC-TPS 
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pMOG1093
Las plantas transgénicas para pMOG1093 se hicieron crecer en el invernadero y se determinó el rendimiento del tubérculo. Un número de líneas transgénicas que tenían hojas con un tamaño comprable al del tipo silvestre (B-C) y que eran de color verde ligeramente más oscuro dieron más masa de tubérculo comparado con las plantas testigo (Fig. 26). Las plantas con hojas de tamaño menor (D-G) que las de las plantas testigo dieron menor masa de tubérculo.
Construcción: Pat-TPP 
\hskip0,5cm
pMOG1128
Se indujeron microtubérculos in vitro en explantes de plantas transgénicas pat-TPP. La biomasa de peso fresco promedio de los microtubérculos formados fue sustancialmente menor comparada con la de las líneas testigo.
Construcción: Pat-TPS 
\hskip0,5cm
pMOG845
Las plantas transgénicas para pMOG845 se hicieron crecer en el invernadero y se determinó el rendimiento del tubérculo. Tres líneas Pat-TPS produjeron más masa de tubérculo comparado con las líneas testigo (Fig. 27).
Construcción: PC TPS Pat TPS; 
\hskip0,5cm
pMOG1129 (845-11/22/28)
Las plantas que expresan PC TPS y Pat-TPS de modo simultáneo fueron generadas mediante retransformación de líneas Pat-TPS (resistentes contra kanamicina) con la construcción pMOG1129, albergando una construcción PC TPS y un gen marcador resistente a la higromicina, dando como resultado los genotipos pMOG1129 (845-11), pMOG1129 (845-28). El rendimiento de la masa de tubérculo varió entre casi ningún rendimiento hasta un rendimiento comparable o mayor que el de las plantas testigo (Fig. 28).
Ejemplo 22 Tabaco Rendimiento de plantas de N. tabacum transgénicas para las construcciones TPS y TPP Sistema radicular
Las plantas de tabaco transgénicas para 35S TPP (pMOG1010) o 35S TPS (pMOG799) se hicieron crecer en invernadero. El tamaño de la raíz se determinó justo antes de la floración. Las líneas transgénicas para pMOG1010 revelaron un tamaño de raíz significativamente menor/mayor comparado con el de pMOG799 y de las plantas de tabaco no transgénicas de tipo silvestre.
Influencia de la expresión de TPS y/o TPP en la floración
Las plantas de tabaco transgénicas para 35S-TPS, PC-TPS, 35S-TPP o PC-TPP fueron cultivadas en el invernadero. Las plantas que expresaban niveles altos del gen TPS revelaron significativamente valores menores de crecimiento comparado con el de las plantas de tipo silvestre. La floración y la senescencia de las hojas inferiores se retrasaron en estas plantas dando como resultado un fenotipo verde permanente de las hojas senescentes de modo normal. Las plantas que expresan niveles altos del gen TPP no dieron ninguna flor o dieron capullos de flores aberrantes, que no desarrollaron completamente dando como resultado esterilidad.
Influencia de la expresión de TPS y/o TPP en la colocación de la semilla
Las plantas de tabaco transgénicas para 35S-TPS, PC-TPS, 35S-TPP o PC-TPP fueron cultivadas en el invernadero. Las plantas que expresaban niveles altos del gen TPP revelaron un escaso o nulo desarrollo de flores y ausencia de formación de semillas.
Influencia de la expresión de TPS y/o TPP en la germinación de la semilla
Las plantas de tabaco transgénicas para 35S TPP (pMOG1010) o PC TPP se hicieron crecer en el invernadero. Algunas de las líneas transgénicas, que tenían unos niveles de expresión bajos del transgén, florecieron y dieron semilla. Tras la germinación de la semilla S1, se observó una frecuencia de germinación significativamente reducida (o la germinación estaba ausente) comparada con la semilla S1 derivada de las plantas de tipo silvestre (tabla 12).
TABLA 12 Germinación de semillas transgénicas 35S-TPP
14 
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Influencia de la expresión TPS y/o TPP en el rendimiento de la semilla
El rendimiento de la semilla se determinó para las plantas S1transgénicas para pMOG1010-5. En promedio, las plantas pMOG1010-5 dieron 4,9 g de semilla/planta (n=8) comparado con 7,8 g semilla/planta (n=8) para plantas de tipo silvestre. El peso de "1000 granos" es 0,06 g para la línea pMOG1010-5 comparado con 0,08 g para Samsun NN de tipo silvestre. Estos datos se pueden explicar por una exportación reducida de carbohidratos de las hojas fuente, llevando a un escaso desarrollo del tejido "sumidero" de la semilla.
Influencia de la expresión TPS y TPP en la morfología de la hoja
Los segmentos de hojas de tabaco testigo PC-TPS transgénicas, de PC-TPP transgénicas y no transgénicas crecidas en invernadero fueron fijados, embebidos en plástico y se prepararon cortes para estudiar las estructuras de las células usando microscopio de luz. Las estructuras de la célula y la morfología de secciones transversales de las plantas transgénicas PC-TPP fueron comparables a las observadas en las plantas testigo. Las secciones transversales de PC-TPS transgénicas revelaron que la capa celular del parénquima esponjoso estaba constituido de 7 capas de células comparado con 3 capas en las plantas de tipo silvestre y TPP transgénicas (Fig. 29). Este descubrimiento está de acuerdo con la observación por parte de los autores de que las líneas de plantas transgénicas TPS forman hojas más gruesas y más rígidas comparadas con las plantas TPP y testigo.
Ejemplo 23 Inhibición del endulzamiento en frío por la expresión de la trehalosa fosfato sintasa
Las plantas de patata transgénicas (Solanum tuberosum cv. Pardal) se generaron albergando el gen TPS bajo el control del promotor patatin de la patata específico de tubérculo (pMOG845; Ejemplo 1). Las plantas transgénicas y las plantas testigo de tipo silvestre se hicieron crecer en el invernadero y los tubérculos fueron cosechados. Se tomaron muestras de material de tubérculo para analizar el azúcar directamente después de cosechadas y después de 6 meses de almacenamiento a 4ºC. Los datos resultantes del análisis HPLC-PED están descritos en la Fig. 30.
Lo que se muestra claramente es que las plantas de patata transgénicas para TPS_{E.coli} tienen una cantidad menor de azúcar total (glucosa, fructosa y sacarosa) acumulada en los tubérculos directamente después de cosechados. Después de un período de almacenamiento de 6 meses a 4ºC, el incremento en los azúcares solubles es significativamente menor en las líneas transgénicas comparado con las líneas testigo de tipo silvestre.
Ejemplo 24 Rendimiento mejorado de plantas de tabaco transgénicas para 35S TPS 35S TPP (pMOG851) en condiciones de estrés por sequía
Las plantas de tabaco transgénico fueron manipuladas mediante ingeniería albergando tanto el gen TPS como el gen TPP de E. coli bajo el control del promotor 35S CaMV. La expresión de los genes TPS y TPP se verificó en las líneas obtenidas usando una transferencia Northern y medidas de actividad enzimática. pMOG851-2 se mostró que acumulaba 0,008 mg de trehalosa.g^{-1} pf y pMOG851-5 acumuló 0,09 mg de trehalosa.g^{-1} pf. La expresión de ambos genes tenía un efecto pronunciado en la morfología de la planta y en el rendimiento del crecimiento en condiciones de estrés por sequía. Cuando crecían en condiciones de estrés por sequía impuesto por un suministro de agua limitante, las dos líneas de tabaco transgénicas ensayados, pMOG851-2 y pMOG851-5, dieron pesos secos totales que eran 28% (P<0,01) y 39% (P<0,001) mayores que los del tabaco de tipo silvestre. Estos incrementos en el peso seco se debieron principalmente al incremento de la producción de la hoja: los pesos de hoja seca eran mayores del 85% para las plantas transgénicas pMOG851-5. No se observaron diferencias significativas en condiciones de buen riego.
Experimentos de estrés por sequía
Las semillas F1 obtenidas de los transformantes primarios de auto fertilización pMOG851-2 y pMOG851-5 (Goddijn y otros (1997) Plant Physiol. 113, 181) fueron usadas en este estudio. Las semillas fueron esterilizadas durante 10 minutos en lejía casera al 20%, aclaradas cinco veces en agua estéril, y sembradas en un medio Murashige y Skoog de fuerza media que contenía 10 g.L^{-1} de sacarosa y 100 mg.L^{-1} de kanamicina. Las semillas de tipo silvestre SR1 fueron sembradas en placas sin kanamicina. Después de dos semanas las plántulas de todas las líneas fueron transferidas al suelo (arcilla arenosa), y hechas crecer en una cámara de crecimiento a 22ºC a una intensidad de luz de aproximadamente 100 \muE.m^{-2}, 14 h.d^{-1}. Todas las plantas crecieron en cantidad iguales de suelo, en macetas de 3,8 litros. Las plantas se regaron diariamente con una solución nutriente Hoagland de fuerza media. Las semillas de pMOG851-2 y pMOG851-5 crecieron algo más lentamente que las plántulas de tipo silvestre. Puesto que los autores consideraron más importante empezar los experimentos en el mismo estadío de desarrollo, iniciaron los tratamientos de estrés por sequía de cada línea cuando las plántulas estaban a una misma altura (10 cm), en un estadío de desarrollo igual (4 hojas), y un peso seco igual (medido a partir de dos plantas adicionales de cada línea). Esto significó que el inicio del tratamiento de pMOG851-2 fue dos días más tarde que el de tipo silvestre, y que el de pMOG851-5 empezó siete días más tarde que el de tipo silvestre. De cada línea, seis plantas fueron sujeto de estrés por sequía, mientras cuatro se mantuvieron en condiciones de buen riego como testigos. Las plantas de tabaco de tipo silvestre fueron puestas en sequía manteniéndolas alrededor del punto de marchitación: cuando la mitad inferior de las hojas se marchitó, se le dio a las plantas tanta solución nutriente que las plantas ganaron temporalmente turgencia. En la práctica, esto supuso suministrar 50 ml de solución nutriente cada tres días; las plantas testigo fueron regadas diariamente para mantenerlas a la capacidad del campo. Las plantas pMOG851-2 y pMOG851-5 fueron regadas después de la misma forma que las plantas silvestres, es decir, que se les suministró igual cantidad de solución nutriente y tras intervalos de tiempo iguales a los de tipo silvestre. La altura del tallo fue medida regularmente durante todo el período de estudio. Todas las plantas se cosecharon el mismo día (32 d después del comienzo del tratamiento para las plantas de tipo silvestre), ya que cosechar las plantas transgénicas en un estadío más tardío complicaría la comparación de las líneas de las plantas. En el tiempo de cosecha, el área total de la hoja se midió usando un medidor de área de hoja Delta-T Devices (Santa Clara, CA). Además, se determinó el peso fresco y el peso seco de las hojas, tallos y raíces.
Un segundo experimento fue hecho esencialmente de la misma manera, para analizar el potencial osmótico de las plantas. Después de 35 días de estrés por sequía, se cogieron muestras de las hojas maduras más jóvenes en el comienzo del período de luz (n=3).
Secado al aire de las hojas desprendidas
La pérdida de agua de las hojas secadas al aire desprendidas se midió en las plantas bien regadas, de cuatro semanas pMOG851-2, pMOG851-5 y plantas de tipo silvestre. Por línea vegetal, se usaron cinco plantas, y de cada planta las dos hojas maduras más jóvenes fueron arrancadas y secadas al aire a una humedad relativa del 25%. El peso fresco de cada hoja fue medido después de 32 horas. En el momento del experimento se cogieron muestras de hojas comparables, bien regadas, para las medidas de potencial osmótico y la determinación del contenido en azúcar soluble.
Medidas de potencial osmótico
Las muestras de hojas para el análisis del potencial osmótico fueron almacenadas inmediatamente en jeringas de 1 ml con tapa y congeladas en hielo seco. Justo antes del análisis la savia de la hoja fue exprimida en un vial pequeño, mezclada, y usada para saturar un disco de papel. El potencial osmótico se determinó luego en cámaras Wescor C52, usando un medidor de microvoltio de punto de rocío Wescor HR-33T.
Fluorescencia de la clorofila
La fluorescencia de la clorofila de las plantas tipo silvestre, pMOG851-2 y pMOG851-5 fue medida para cada línea de planta después de 20 días de tratamiento de sequía, usando un fluorímetro de modulación de pulso (PAM) (Walz, Effeltrich, Alemania). Antes de los tratamientos, las plantas fueron mantenidas en la oscuridad durante dos horas, seguidas de un período de luz de una hora. Subsiguientemente, la hoja madura más joven se dejó que se adaptara a la oscuridad durante 20 minutos. Al comienzo de cada medida, se encendió un pequeño rayo de luz de medida (0,05 \mumol m^{-2} s^{-1} modulado a 1,6 KHz), y se midió el nivel de fluorescencia mínimo (F_{0}). El nivel de fluorescencia máximo (F_{m}) se midió después aplicando de un pulso de luz de saturación 4000 \mumol m^{-2} s^{-1} de 800 ms de duración. Después de otros 20 s, cuando la señal se relajó hasta cerca de F_{0}, se dieron repetidamente breves pulsos de saturación de luz actínica (800 ms en longitud, 4000 \mumol m^{-2} s^{-1}) durante 30 s con intervalos de oscuridad
de 2 s. Los componentes de apagamiento fotoquímico (q_{Q}) y no fotoquímico (q_{E}) fueron determinados a partir de la curva fluorescencia/tiempo según Bolhar-Nordenkampf y Oquist (1993). En el momento de la medida, las hojas en cuestión no estaban visiblemente marchitas. Los datos estadísticos fueron obtenidos mediante análisis unidireccional de la varianza usando el programa Number Cruncher Statistical System (Dr. J.L. Hintze, 865 East 400 North, Kaysville, UT 84037, USA).
Los análisis de fluorescencia de la clorofila de plantas con estrés por sequía mostraron un apagamiento fotoquímico más alto (qQ) y una relación mayor de la fluorescencia variable por encima de una fluorescencia máxima (F_{v}/F_{m}) en pMOG851-5, lo que indica una maquinaria fotosintética que trabaja con mayor eficacia (tabla 13).
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(Tabla pasa a página siguiente)
\newpage
TABLA 13
Parámetros de fluorescencia de la clorofila de tipo silvestre (silv.) y acumulación de trehalosa (pMOG851-2, pMOG851-5) de plantas de tabaco transgénicas. Los valores P (probabilidad) fueron obtenidos de ensayos ANOVA analizando las diferencias por línea vegetal entre las plantas que crecieron en condiciones de buen riego (testigo) o condiciones secas, así como las diferencias entre las líneas transgénicas y silv., crecidas en condiciones de buen riego o secas. F_{m}: fluorescencia máxima; F_{v}: fluorescencia variable (F_{m} - F_{0}); q_{Q}: apagamiento fotoquímico: q_{E}: apagamiento no fotoquímica. F_{m}, F_{v} se expresan en unidades arbitrarias (cuadro mm).
16
Análisis de carbohidratos
En el momento de la cosecha, las plantas pMOG851-5 contenían 0,2 mg.g^{-1} de peso seco de trehalosa, mientras que en las plantas pMOG851-2 y de tipo silvestre los niveles de trehalosa estaban por debajo del límite de detección, tanto en condiciones de estrés como de no estrés. La trehalosa contenida en las plantas pMOG851-5 era comparable en las plantas con estrés y sin estrés (0,19 y 0,20 mg. g^{-1} de peso seco, respectivamente). En condiciones de buen riego, los niveles de glucosa y fructosa fueron dos veces más altos en plantas pMOG851-5 que en las de tipo silvestre. Las hojas de plantas en condiciones de estrés pMOG851-2 contenían niveles alrededor de tres veces más altos de cada cuatro almidones de carbohidratos no estructurales, sacarosa, glucosa y fructosa, que las hojas de las plantas en condiciones de estrés de tipo silvestre. En las hojas pMOG851-2, los niveles de carbohidratos, como los valores de fluorescencia clorofílica, no difirieron significativamente de los de tipo silvestre. Las plantas con estrés de todas las líneas contenían niveles elevados de glucosa y fructosa comparados con las plantas sin estrés.
Potencial osmótico de plantas con estrés por sequía y testigo
Durante un segundo experimento similar en condiciones de invernadero, las plantas transgénicas mostraron los mismos fenotipos como se describe anteriormente, y de nuevo las plantas pMOG851-5 mostraron mucha menos reducción en el crecimiento en condiciones de estrés por sequía que las plantas pMOG851-2 y de tipo silvestre. El potencial osmótico en las hojas de las plantas en sequía pMOG851-5 (-1,77 \pm 0,39 Mpa) fue significativamente más bajo (P= 0,017) que en las hojas de tipo silvestre (-1,00 \pm 0,08 Mpa); pMOG851-2 mostró valores intermedios (-1,12 \pm 0,05 Mpa). Similarmente, en condiciones de buen riego el potencial osmótico de las plantas pMOG851-5 (-0,79 \pm 0,05 Mpa) fue significativamente más bajo (P= 0,038) que el de las hojas de tipo silvestre (-0,62 \pm 0,03 Mpa), teniendo las plantas pMOG851-2 valores intermedios (-0,70 \pm 0,01 Mpa).
Secado al aire de las hojas desprendidas
Las hojas de pMOG851-2, pMOG851-5 y de tipo silvestre se desprendieron y su peso fresco se midió después de 32 horas de secado al aire. Las hojas de las plantas pMOG851-2 y pMOG851-5 perdieron significativamente menos agua (P<0,05) que las hojas de tipo silvestre: después de 32 horas las hojas de pMOG851-5 y pMOG851-2 habían perdido 44% y 41% de su peso fresco, respectivamente, comparado con el 30% para las plantas de tipo silvestre. En el momento del experimento se cogieron muestras de hojas comparables bien regadas para la determinación del potencial osmótico y el análisis de trehalosa, sacarosa, glucosa y fructosa. Las dos líneas transgénicas tenían potenciales osmóticos menores que el de tipo silvestre (P< 0,05), teniendo las plantas pMOG851-5 el potencial de agua más bajo(-0,63 \pm 0,03 Mpa), las de tipo silvestre el más alto (-0,51 \pm 0,02 Mpa) y las pMOG851-2 intermedio (-0,57 \pm 0,04 Mpa). Los niveles de todos los azúcares ensayados fueron significativamente mayores en las hojas de las plantas pMOG851-5 que en las hojas de tipo silvestre dando como resultado un nivel tres veces más alto de los cuatro azúcares combinados (P= 0,002). Las plantas pMOG851-2 contenían niveles dos veces más altos de los cuatro azúcares combinados (P= 0,09). Los niveles de trehalosa fueron 0,24 \pm 0,02 mg.g^{-1} ps en las plantas pMOG851-5 y por debajo del nivel de detección en pMOG851-2 y de tipo silvestre.
Ejemplo 25 Rendimiento de líneas vegetales de lechuga transgénica TPS y TPP en condiciones de estrés por sequía
Los transformantes primarios TPS y TPP y las plantas testigo de tipo silvestre fueron sometidas a estrés por sequía. Las líneas transgénicas para TPP alcanzaron su punto de marchitación las primeras, luego las plantas testigo, seguidas de las plantas transgénicas TPS indicando que las líneas transgénicas TPS, como se observa en otras especies vegetales, tienen una clara ventaja sobre las plantas TPP y las de tipo silvestre durante condiciones de estrés por sequía.
Ejemplo 26 El florecimiento prematuro de plantas de lechuga está afectado en las plantas transgénicas para PC-TPS o PC-TPP
El florecimiento prematuro de la lechuga está reducido en las plantas transgénicas para PC-TPP (tabla 14). Las plantas de líneas transgénicas para PC-TPS muestran florecimiento prematuro mejorado comparado con las plantas de lechuga de tipo silvestre.
TABLA 14 Florecimiento de plantas de lechuga
Líneas Nº total 1. 2. 3. 4. 5.
PC-TPP de plantas Florecimiento Florecimiento Fluorescencia Aplastamiento Completamente
Normal reducido visible visible vegetativa
1A 4 4
2A 3 1 2
3A 2 2
4A 5 1 1 1 2
5A 5 1 1 3
7A 1 1
8A 5 4 1
9A 5 5
10A 3 1 2
11A 5 2 3
12A 4 4
Control 5 5
Ejemplo 27 Rendimiento de plantas de tomate transgénicas para TPS y TPP
Las construcciones usadas en los experimentos de transformación del tomate: 35S TPP, PC-TPS, PC-TPS as-trehalasa, PC-TPP, E8-TPS, E8-TPP, E8 TPS E8 as-trehalasa. Las plantas transgénicas para el gen TPP dirigidas por el promotor de plastocianina y el promotor 35S revelaron fenotipos similares a los observados en otras plantas: despigmentación de las hojas, formación reducida de flores o ausencia de formación de flores dando lugar a frutos pequeños o ausencia de frutos. Un número pequeño de líneas transgénicas 35S-TPP generaron frutos extremadamente grandes. Esos frutos revelaron un crecimiento potenciado del pericarpio. Las plantas transgénicas para los genes TPS dirigidas por el promotor de plastocianina y promotor 35S no formaron hojas pequeñas en forma de lanza. Algunas plantas severamente atrofiadas no formaron hojas pequeñas verde oscuras. Las plantas transgénicas para PC-TPS y PC as-trehalosa formaron hojas más pequeñas y verdes más oscuras comparadas con las plantas testigo.
El color y el borde de la hoja de plantas transgénicas para TPS y TPP dirigidos por 35S o PC se distinguían claramente de forma similar a lo que se observa en otros cultivos.
Las plantas que albergan el gen TPS y TPP bajo el control del promotor E8 específico de fruto no mostraron ninguna diferencia fenotípica comparada con los frutos de tipo silvestre. Las plantas transgénicas para E8 TPS E8 como trehalasa produjeron frutos aberrantes con una piel amarilla y una maduración incompleta.
Ejemplo 28 Realización de plantas de patata transgénicas para as-trehalase y/o TPS
Construcciones: 35S as-trehalasa 
\hskip0,4cm
(pMOG1027) 
\hskip0,2cm
y
\hskip0,2cm
35S as-trehalasa Pat TPS 
\hskip0,4cm
(pMOG1027 (845-11/22/28))
Las plantas que expresan 35S as-trehalasa y pat-TPS de modo simultáneo fueron generadas por retransformación de líneas pat-TPS (resistentes contra kanamicina) con la construcción pMOG1027, albergando la construcción 35S as-trehalasa y un gen marcador resistente a higromicina, dando como resultado los genotipos pMOG1027 (845-11), pMOG1027 (845-22) y pMOG1027 (845-28).
Se indujeron microtubérculos in vitro y se determinó el peso fresco de los microtubérculos. El rendimiento del peso fresco promedio fue aumentado por las líneas transgénicas que albergan pMOG1027 (pMOG845-11/22/28). La biomasa de peso fresco de los microtubérculos obtenidos a partir de las líneas transgénicas para pMOG1027 sólo fue ligeramente más alto que el de las plantas testigo de tipo silvestre. Las plantas resultantes se hicieron crecer en el invernadero y se determinó el rendimiento del tubérculo (Fig. 33). Las líneas transgénicas para el 35S as-trehalasa o una combinación de 35S as-trehalasa y pat-TPS dieron significativamente más masa de tubérculo comparado con las líneas testigo. La determinación del almidón no reveló ninguna diferencia en el contenido de almidón de los tubérculos producidos por líneas de plantas que tenían un rendimiento más alto (Fig. 34). Un gran número de las líneas 1027(845-11/22/28) produjeron tubérculos por encima del suelo fuera de los brotes axilares de las hojas, que indicaban una profunda influencia de las construcciones usadas en el desarrollo de la planta. Las líneas de plantas transgénicas para 35S as-trehalasa no formaron tubérculos por encima del suelo.
Construcciones: Pat as-trehalasa 
\hskip0,4cm
(pMOG1028) 
\hskip0,2cm
y
\hskip0,2cm
Pat as-trehalasa Pat TPS 
\hskip0,4cm
(pMOG1028 (845-11/22/28))
Las plantas que expresan Pat as-trehalasa y Pat-TPS de modo simultáneo fueron generadas mediante retransformación de las líneas Pat-TPS (resistentes contra kanamicina) albergando la planta pMOG1028, la construcción Pat as-trehalase y un gen marcador resistente a la higromicina, dando como resultado los genotipos pMOG1028(845-11), pMoG1028(845-22) y pMOG1028(845-28). Las plantas se hicieron crecer en el invernadero y se determinó el rendimiento del tubérculo (Fig. 35). Un número de líneas transgénicas pMOG1028 dieron significativamente más masa de tubérculo comparado con las líneas testigo. Las plantas transgénicas individuales para Pat TPS y Pat as-trehalasa revelaron un rendimiento de tubérculos variable desde casi rendimiento nulo hasta un rendimiento comparable o mayor al de las líneas testigo (Fig. 35).
Construcción: PC as-trehalasa 
\hskip0,5cm
(pMOG1092)
Las plantas transgénicas para pMOG1092 se hicieron crecer en el invernadero y se determinó el rendimiento de tubérculos. Varias líneas formaron hojas verde más oscuras comparadas con las de los testigos. El rendimiento del tubérculo fue significativamente potenciado comparado con las plantas no transgénicas (Fig. 36).
Construcción: PC as-trehalasa PC-TPS 
\hskip0,5cm
(pMOG1130)
Las plantas transgénicas para pMOG1130 se hicieron crecer en el invernadero y se determinó el rendimiento de tubérculos. Varias líneas transgénicas desarrollaron hojas pequeñas verde oscuro y un crecimiento severamente atrofiado indicando que los efectos fenotípicos observados cuando las plantas son trasformadas con TPS es más severo cuando el gen as-trehalasa se expresa simultáneamente (véase el Ejemplo 21). El rendimiento de la masa de tubérculos varió
entre un rendimiento casi nulo hasta un rendimiento más significativo comparado con las plantas testigo (Fig. 37).
Ejemplo 29 Sobreexpresión de un cADN de trehalasa de patata en N. tabacum
Construcción: trehalasa dp35S CaMV 
\hskip0,5cm
(pMOG1078)
Los transformantes de tabaco primarios transgénicos para pMOG1078 revelaron un fenotipo diferente del tabaco de tipo silvestre, algunos transgénicos tienen un color de hoja verde oscuro y una hoja más gruesa (la morfología de la hoja no tiene forma de lanza) indicando una influencia de la expresión del gen trehalasa en el metabolismo vegetal. Las semillas de los autotransformantes primarios fueron sembradas y seleccionadas en kanamicina. El fenotipo mostró segregar de un modo mendeliano en la generación S1.
Depósitos
Los siguientes depósitos se realizaron bajo el tratado de Budapest. Los clones se depositaron en la Oficina Central Central Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, P.O. Box 273, 3740 AG Baarn, Holanda el 21 de abril de 1997 y recibieron los siguientes números:
Escherichia coli DH5alpha/pMOG1192 CBS 692,97
DH5alpha/pMOG1240 CBS 693,97
DH5alpha/pMOG1241 CBS 694,97
DH5alpha/pMOG1242 CBS 695,97
DH5alpha/pMOG1243 CBS 696,97
DH5alpha/pMOG1244 CBS 697,97
DH5alpha/pMOG1245 CBS 698,97 
\vskip1.000000\baselineskip
Clones depositados
pMOG1192
alberga el cADN bipartito TPS/TPP de Helianthus annuus insertado en el vector multi copia pGEM-T (Promega).
pMOG1240
alberga el fragmento de cADN "825" pb de TPS del tabaco insertado en pCRscript (Stratagene).
pMOG1241
alberga el fragmento de cADN "840" pb de TPS del tabaco insertado en en el pGEM-T (Promega).
pMOG1242
alberga el fragmento de cADN "630" pb de TPS del tabaco insertado en el pGEM-T (Promega).
pMOG1243
alberga el fragmento cADN de TPP "543" pb de tabaco insertado en el pGEM-T (Promega).
pMOG1244
alberga el fragmento de cADN de TPP "723" pb de tabaco insertado en el plasmado pUC18.
pMOG1245
alberga el fragmento de TPP "447" pb de tabaco insertado en el pGEM-T (Promega).
\vskip1.000000\baselineskip
Lista de los clones relevantes pMOG\alm{3} y pVDH\alm{3} 1. Vectores binarios
pMOG23
vector binario (alrededor de 10 kb) que alberga el marcador de selección NPTII
pMOG22
derivado de pMOG23, el gen NPTII ha sido reemplazado por el gen HPT que le da resistencia a higromicina.
pVDH 275
vector binario derivado de pMOG23, alberga un casette de expresión con promotor de plastocianina-terminador nos.
pMOG402
derivado de pMOG23, se ha establecido una mutación puntual en el gen NPTII, ningún sitio de restricción KpnI está presente en el sitio de clonaje múltiple.
pMOG800
derivado de pMOG402 con sitio KpnI restablecido en el sitio de clonaje múltiple.
\newpage
2. Construcciones de expresión de TPS/TPP
pMOG 799
35S-TPS-3'nos^{1}
pMOG 810
igual con marcador Hyg
pMOG 845
Pat-TPS-3'PotPiII
pMOG 925
igual con marcador Hyg
pMOG 851
35S-TPS-3'nos 35S-TPP(atg)^{2}
pMOG 1010
dp35S CaMV amv secuencia líder TPP(gtg) PotPiII
pMOG 1142
igual con marcador Hyg
pMOG 1093
TPS-3'nos de Plastocianina
pMOG 1129
igual con marcador Hyg
pMOG 1177
TPS-3'PotPiII 3'nos de Plastocianina
pVDH 318
idéntico al pMOG1177
\quad
funcionalmente idéntico al pMOG1093
pMOG 1124
-TPP (gtg) 3'PotPiII 3'nos de Plastocianina
pVDH 321
idéntico al pMOG1124
pMOG 1128
Patatin TPP(gtg) 3'PotPiII
pMOG 1140
E8-TPS-3'nos
pMOG 1141
E8-TPP(gtg)-3'PotPiII
\vskip1.000000\baselineskip
3. Construcciones de Trehalase
pMOG 1028
patatin as-trehalasa 3'PotPiII, marcador de resistencia a higromicina
pMOG 1078
dp35S CaMV amv líder trehalasa 3'nos
pMOG 1090
dp35S CaMV amv líder as-trehalasa 3'nos
pMOG 1027
idéntico con marcador Hyg
pMOG1092
as-trehalasa-3'nos de Plastocianina
pMOG1130
-as trehalasa-3'nos de Plastocianina TPS-3'nos de plastocianina
pMOG 1153
E8-TPS-3'nos E8-as trehalasa-3'PotPiII
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
^{1} Todas las construcciones albergan el marcador de selección NPTII a menos que se indique lo contrario
\quad
^{2} Se han usado dos tipos de construcciones TPP como se describe en Goddijn y otros (1997) Plant Physio 1.113, {}\hskip0,1cm 181.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: MOGEN International nv
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Einsteinweg 97
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Leiden
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Holanda
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 2333 CB
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: (0) 71-5258282
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: (0) 71-5221471
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DEL INVENTO: Regulación del metabolismo modificando el nivel de trehalosa-6-fosfato
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 57
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA DE LECTURA COMPUTERIZADA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO MEDIO: disquette
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión # 1,25 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: EP 96.201.225.8
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE ARCHIVO: 03-MAYO-1996
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE SOLICITUD: EP 96.202.128.3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
FECHA DE ARCHIVO: 26-JULIO-1996
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
NÚMERO DE SOLICITUD: EP 96.202.395.8
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
FECHA DE ARCHIVO: 29-AGOSTO-1996
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1450 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN : 21...1450
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
18
19
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 476 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
21
22 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 835 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HERBA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 18..818
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
23
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 272 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
25
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HERBA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGCTTATGT TGCCATATAG AGTAGAT 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTAGTTGCCA TGGTGCAAAT GTTCATATG 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO : ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAYITIATIT GGRTICAYGA YTAYCA 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TIGGITKITT YYTICAYAYI CCITTYCC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GYIACIARRT TCATICCRTC IC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 743 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 .. 743
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
OTRA INFORMACIÓN: / parcial
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10
27
28 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 247 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
29 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 395 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN o mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Nicotina tabacum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Samsun NN
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO TISULAR: hoja
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.. 395
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: / parcial
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
31
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 131 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LASECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 491 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN amARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Nicotiana tabacum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Samsun NN
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO DE TEJIDO: Hoja
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/ CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1.. 491
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 163 aminadcidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminodcidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 361 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Nicotiana tabacum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Samsun NN
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO TISULAR: Hoja
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
37 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 118 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucléicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN o mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Nicotiana tabacum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Samsun NN
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO TISULAR: Hoja
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAAACCCAC AGGATGTAAG CAAAGTTTTA GTTTTTGAGA TCTCTTGGCA TCAAGCAAAG 
\hfill
60 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAGAGGAAG TCACCCGATT CGTGCTGTGC GTAGGGATGA CAGATCGGAC GACTTAGA 
\hfill
118 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 417 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Nicotiana tabacum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Samsun NN
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO TISULAR: Hoja
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 411 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Nicotiana tabacum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Samsun NN
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO TISULAR: Hoja
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 405 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NUMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Nicotiana tabacum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Samsun NN
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO TISULAR: Hoja
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20
\vskip1.000000\baselineskip
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 427 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Nicotiana tabacum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Samsun NN
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO TISULAR: Hoja
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21
\vskip1.000000\baselineskip
41 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LASEQ ID NO: 22
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 315 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Nicotiana tabacum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Samsun NN
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO TISULAR: Hoja
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22
\vskip1.000000\baselineskip
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 352 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Nicotiana tabacum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Samsun NN
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO TISULAR: Hoja
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LASECUENCIA: SEQ ID NO: 23
\vskip1.000000\baselineskip
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2640 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Helianthus annuus 
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO TISULAR: Hoja
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 171.. 2508
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: incierto
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: reemplaza (2141.. 2151, "ccatnnntta")
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: incierto
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: reemplaza (2141.. 2151, "ccatnnntta"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
44
45
46
47
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 779 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
49
50
51 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2130 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Helianthus annuus 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZCIÓN: 171.. 2130
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
52
53
54
55 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 653 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 27:
56
57
58 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 390 pares de besaes
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENT1DO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Helianthus annuus 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZCIÓN: 3 .. 258
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
59 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 85 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
60 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAIGGRTTI ACICKDATIG CICC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATHGTIGTIW SIAAYMRIYT ICC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucléicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
YTITGGCCIA TITTYCAYTA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGRTCIARIA RYTCYTTIGC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 34
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares do bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCRTCIGTRA ARTCRTCICC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTYGAYTAYG AYGGIACIYT 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGIYTIWBNG CIGARCAYGG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE I.A SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATIGCIAARC CIGTIATGAA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCIACIGTRC AIGCRAAIAC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA IA SEQ ID NO: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2982 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 64 .. 2982
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:
61
63
64
65 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 973 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40
\vskip1.000000\baselineskip
67
68
69
70 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 300 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oryza sativa 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
71 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 627 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Selaginella lepidophylla 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4 .. 627
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: / parcial
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:
73
74 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 208 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:
75
76 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 645 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL: Selaginella lepidophylla 
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44
77
78 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 498 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
79 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 463 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:
80 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 394 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
81 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 428 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 48:
83 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 481 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
84 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 50
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 395 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
85 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 431 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oryza sativa 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
OTRA INFORMACIÓN: / standard_name= "GENBANK ID: D22143"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
86 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 496 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NUMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oryza sativa 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
OTRA INFORMACIÓN: / standard_name= "GENBANK ID: 40048"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52
\vskip1.000000\baselineskip
87 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 288 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NUMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oryza sativa 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
88 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2207 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Solanum tuberosum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Kardal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 161...1906
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 842..850
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: función: "sitio de glicosilación putativo"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:
\vskip1.000000\baselineskip
89
90
91
92 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 581 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:
93
94
95 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCAGATCTG GCCACAAA 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
N AMERO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGCTCGTCT GCAGGTGC 
\hfill
18

Claims (54)

1. Método para la simulación del flujo de carbono en la dirección glicolitica en una célula vegetal mediante la disminución de la disponibilidad intracelular de trehalosa-6-fosfato.
2. Método para la inhibición del flujo de carbono en la dirección glicolitica en una célula vegetal mediante el aumento de la disponibilidad intracelular de trehalosa-6-fosfato.
3. Método para la inhibición de la fotosíntesis en una célula mediante la disminución de la disponibilidad intracelular de trehalosa-6-fosfato.
4. Método para la estimulación de la fotosíntesis en una célula mediante el aumento de la disponibilidad intracelular de trehalosa-6-fosfato.
5. Método para la estimulación de actividad relacionada con el sumidero mediante el aumento de la disponibilidad intracelular de trehalosa-6-fosfato.
6. Método para la estimulación del crecimiento de una célula o tejido vegetal mediante la disminución de la disponibilidad intracelular de trehalosa-6-fosfato.
7. Método para aumentar el metabolismo de células de la planta mediante la disminución de la disponibilidad intracelular de trehalosa-6-fosfato.
8. Método para la aumentar el rendimiento de las plantas mediante el aumento de la disponibilidad intracelular de trehalosa-6-fosfato.
9. Método según las reivindicaciones 1, 3, 6 ó 7, caracterizado en que dicha disminución de la concentración intracelular de trehalosa-6-fosfato está afectada por un aumento en la actividad de trehalosa-fosfato-fosfatasa (TPP).
10. Método según la reivindicación 9, caracterizado en que el incremento en la actividad TPP se consigue mediante la transformación de dichas células con un vector o una construcción génica capaz de expresar la enzima TPP.
11. Método según la reivindicación 10, caracterizado en que dichas células son transformadas con un vector o una construcción génica que comprende un gen heterólogo que codifica TPP.
12. Método según las reivindicaciones 1, 3, 6 ó 7, caracterizado en que dicha reducción de la concentración intracelular de trehalosa-6-fosfato se efectúa mediante una disminución en la actividad trehalosa-fosfato-sintasa (TPS).
13. Método según la reivindicación 12, caracterizado en que dicha disminución en la actividad TPS se efectúa mediante la transformación de dichas células con un vector o una construcción génica capaz de expresar una molécula que inhibe el TPS.
14. Método según la reivindicación 13, caracterizado en que dicho vector o construcción génica comprende el gen antisentido de TPS.
15. Método según la reivindicación 9, caracterizado en que dicha disminución es debida a la mutación de la enzima TPP endógena.
16. Método según la reivindicación 9, caracterizado en que la disminución de trehalosa-6-fosfato se efectúa mediante la sobreexpresión relativa de una fosfo-alfa (1,1) glucosidasa.
17. Método según las reivindicaciones 2, 4, 5 u 8, caracterizado en que dicho aumento de la concentración intracelular de trehalosa-6-fosfato se efectúa mediante un aumento en la actividad TPS.
18. Método según la reivindicación 17, caracterizado en que dicho aumento es debido, bien a la mutación de la enzima endógena TPS o bien a que el aumento en la actividad TPS se consigue mediante la transformación de dichas células con un un vector o construcción génica capaz de expresar la enzima TPS.
19. Método según la reivindicación 18, caracterizado en que dichas células se transforman con un vector o una construcción génica que comprende un gen heterólogo que codifica TPS.
20. Método según las reivindicaciones 2, 4, 5 u 8, caracterizado en que dicho aumento de la concentración intracelular de trehalosa-6-fosfato se efectúa mediante una reducción en la actividad TPP.
21. Método según la reivindicación 20, caracterizado en que dicha disminución en la actividad TPP se efectúa mediante la transformación de dichas células con un vector o una construcción génica capaz de expresar una molécula que inhibe el TPP.
22. Método según la reivindicación 21, caracterizado en que dicho vector o construcción génica comprende el gen antisentido de TPP.
23. Método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1-22, caracterizado en que dicha célula o células están localizadas en una planta.
24. Método según la reivindicación 23, caracterizado en que dicha planta es una planta transgénica.
25. Método según la reivindicación 24, caracterizado en que dicha planta transgénica es producida mediante transformación con Agrobacterium tumefaciens.
26. Un vector de clonación que comprende un gen antisentido para TPS, que tras la expresión en una célula vegetal es capaz de impedir la actividad funcional del gen TPS endógeno de dicha célula vegetal.
27. Un vector de clonación que comprende un gen antisentido para TPP, que tras la expresión en una célula vegetal es capaz de impedir la actividad funcional del gen TPP endógeno de dicha célula vegetal.
28. Planta caracterizada en que ella o una de sus antecesoras está transformada con un vector o una construcción génica que comprende la secuencia nucleotídica que codifica un gen antisentido de TPP, conteniendo todavía dicha planta dicha secuencia nucleotídica.
29. Planta caracterizada en que ella o una de sus antecesoras está transformada con un vector o una construcción génica que comprende la secuencia nucleotídica que codifica un gen antisentido de TPS, conteniendo todavía dicha planta dicha secuencia nucleotídica.
30. Uso de trehalosa-6-fosfato para influir en la partición de carbohidratos en las células vegetales.
31. Uso de trehalosa-6-fosfato para aumentar la biomasa.
32. Uso de trehalosa-6-fosfato para afectar la actividad hexoquinasa in vivo en las células vegetales.
33. Uso de trehalosa-6-fosfato para afectar la función de señalización de hexoquinasa in vivo en las células vegetales.
34. Uso de trehalosa-6-fosfato para afectar la síntesis de la pared celular.
35. Método para la prevención del endulzamiento en frío mediante el aumento de la disponibilidad intracelular de trehalosa-6-fosfato.
36. Método para la inhibición de invertasa en la remolacha después de la cosecha mediante el aumento de la disponibilidad intracelular de trehalosa-6-fosfato.
37. Método según las reivindicaciones 35 ó 36, caracterizado en que el incremento de la disponibilidad intracelular de T-6-P resulta del aumento de la actividad trehalosa fosfato sintasa.
38. Método según la reivindicación 35, caracterizado en que la regulación de la disponibilidad de T-6-P está específicamente alterada en tubérculos de patata, preferiblemente caracterizado en que un gen que codifica la trehalosa fosfato sintasa se expresa específicamente en los tubérculos, más preferible que dicho gen es el gen TPS de Escherichia coli.
39. Método según la reivindicación 36, caracterizado en que la regulación de la disponibilidad de T-6-P está alterada específicamente en las raíces de la remolacha, preferiblemente caracterizado en que un gen que codifica la trehalosa fosfato sintasa se expresa específicamente en las raíces.
40. Método según las reivindicaciones 1-22, caracterizado en que la expresión de TPP o TPS está limitada a un tejido específico.
41. Método según las reivindicaciones de 1-22, caracterizado en que la expresión de TPP o TPS está bajo el control de un promotor inducible.
42. Método para la estimulación del flujo de carbono en la dirección glicolítica en una célula vegetal mediante la expresión de trehalosa-6-fosfato fosfatasa.
43. Método para la inhibición del flujo de carbono en la dirección glicolítica en una célula vegetal mediante la expresión de trehalosa-6-fosfato sintasa.
44. Método para la inhibición de la fotosíntesis en una célula mediante la expresión de trehalosa-6-fosfato fosfatasa.
45. Método para la estimulación de la fotosíntesis en una célula mediante la expresión de trehalosa-6-fosfato sintasa.
46. Método para la estimulación de la actividad relacionada con el sumidero mediante la expresión de trehalosa-6-fosfato sintasa.
47. Método para la estimulación del crecimiento de una célula vegetal o tejido vegetal mediante la expresión de trehalosa-6-fosfato fosfatasa.
48. Método para aumentar el metabolismo de células vegetales mediante la expresión de trehalosa-6-fosfato fosfatasa.
49. Método para la prevención del endulzamiento en frío mediante la expresión de trehalosa-6-fosfato sintasa.
50. Método para la prevención de florecimiento prematuro mediante la disminución de la disponibilidad intracelular de trehalosa-6-fosfato.
51. Método para la prevención del florecimiento prematuro mediante la expresión de trehalosa-6-fosfato fosfatasa.
52. Método para la inducción de florecimiento prematuro mediante el aumento de la disponibilidad intracelular de trehalosa-6-fosfato.
53. Método para la inducción de florecimiento prematuro mediante la expresión de trehalosa-6-fosfato sintasa.
54. Método para aumentar el rendimiento de las plantas mediante la transformación con una enzima que codifica la trehalosa-6-fosfato fosfatasa.
ES97923086T 1996-05-03 1997-05-02 Regulacion del metabolismo por modificacion del nivel de trehalosa-6-fosfato. Expired - Lifetime ES2243997T3 (es)

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