ES2243757T3 - Metodo para seleccionar celulas que expresan anticuerpos. - Google Patents

Abstract

Método para seleccionar células secretoras de un primer anticuerpo, que comprende las etapas de: a) enlazar avidina a la superficie de una célula, b) incubar la célula con un polipéptido biotinilado que comprende al menos un dominio funcional de unión de anticuerpos procedente de la proteína A, proteína G, proteína L, o variantes funcionales de la misma, c) incubar la célula con un segundo anticuerpo o antígeno que se marca fluorescentemente y que reconoce y une un epítopo en el primer anticuerpo, d) seleccionar células marcadas fluorescentemente que han unido una cantidad del segundo anticuerpo, mediante análisis por citometría de flujo.

Description

Método para seleccionar células que expresan anticuerpos.

La presente invención se refiere al campo de la producción biotecnológica. La presente invención tiene como objeto diseñar un método para seleccionar células productoras de anticuerpos y para evaluar la estabilidad de líneas celulares.

La selección de células productoras de anticuerpos frente a las células no productoras y especialmente la selección de líneas celulares altamente productoras es un primer paso importante en el desarrollo de cualquier bioproceso. Para la producción de proteínas de células animales, estas líneas celulares seleccionadas se han aislado tradicionalmente mediante ciclos de clonación por dilución límite seguido de un análisis de los productos. Este proceso tradicional exige mucho tiempo y es caro. Se precisan dos ciclos de clonación para mejorar la confianza teórica de haber conseguido la clonalidad. La clonalidad es importante para evitar la supresión de células altamente productoras por las variantes de baja productividad que normalmente crecen más rápido que células altamente productoras. En total, el proceso tradicional puede tardarse más de 8 meses en llevarse a cabo. Además, las consideraciones prácticas pueden limitar el número de células realmente cribadas y por lo tanto, la detección de clones de células altamente productoras presentes en números bajos puede ser una cuestión de mera casualidad.

La evaluación de la estabilidad de una línea celular durante el proceso de desarrollo puede necesitar una clonación analítica adicional, que puede tardar entre 6 y 7 semanas. Es más, la clonación analítica involucra la evaluación de 200-300 clones, frente al análisis de varios miles posible con la citometría de flujo, una técnica que por lo tanto proporciona un perfil más detallado y exacto de la extensión de la población no productora. Los ensayos previamente publicados no han tenido la sensitividad suficiente como para permitir la resolución y, por lo tanto, la cuantificación de las sub-poblaciones distintas.

El citometría de flujo (CF) también ha permitido vigilar un número muy alto de células y aislar células individuales apropiadas. El CF requiere el marcaje de células con un fluoróforo, cuya fluorescencia se cuantifica mediante CF y debe correlacionarse con la propiedad deseada. Sin embargo, la cantidad de anticuerpo visualizado, unido a la superficie de una línea celular no correlaciona bien con la velocidad de secreción de un anticuerpo soluble (Meilhoc et al., Application of flow cytometric measurement of surface IgG in kinetic analysis of monoclonal antibody synthesis and secretion by murine hybridoma cell-line in low serum and serum-free media, Hybridoma 9, 67-175). Por lo tanto, no ha resultado efectiva la simple tinción del anticuerpo visualizado con un anticuerpo de detección para aislar los clones altamente productivos. Se han elegido dos abordajes fundamentalmente diferentes para superar este problema y para directamente seleccionar células altamente productoras de anticuerpos secretados.

En un primer método, células individuales y el anticuerpo secretado de forma concomitante se encapsulan en gotitas de gel. A continuación, la gotita entera se somete a marcaje y se clasifica mediante el CF. Este método tiene la desventaja de que es difícil usarlo en la práctica, ya que para asegurarse de que sólo una célula ocupe cada gotita, sólo aproximadamente el 5% de las gotitas de gel creadas comprenden una célula mientras que aproximadamente el 95% de las gotitas de gel sometidas al análisis carecen de células. Además, la encapsulación/desencapsulación puede reducir la viabilidad de algunos tipos de células que se utilizan a menudo para la expresión de la proteína recombinante, en particular, células de mieloma NSO.

En un segundo abordaje, los anticuerpos secretados se retienen mediante sitios de afinidad creados artificialmente con tal de evaluar la cantidad de anticuerpos secretados a continuación mediante el CF. Holmes y colaboradores (J. of Immunol. Methods, 230 (1999), 141-147) describen un ensayo que involucra la biotinilación de proteínas plasmáticas en la membrana a temperatura ambiente. La biotina promociona la unión adicional primero de avidina y segundo de un anticuerpo de captura biotinilado. El anticuerpo de captura reconoce el anticuerpo secretado de una línea celular NSO y lo ancla a la superficie de la célula. La detección por fluorescencia y la clasificación de clones celulares de células altamente productoras presentes en números bajos mediante el CF se consigue a continuación incubando las células con el anticuerpo secretado captado con un tercer anticuerpo marcado fluorescentemente. La adición de un agente de viscosidad tal como la gelatina al medio de incubación evita interferencias entre clones individuales (es decir, la difusión y unión de un anticuerpo secretado de células productoras a células no productoras o de baja producción).

La principal desventaja del método publicado es que proporciona una sensitividad relativamente baja discriminar entre células altamente productoras y las que tienen baja productividad, lo que es necesario para una clasificación exacta de células altamente productoras y las de baja productividad. Con el método publicado, no fue posible detectar la unión de un anticuerpo quimérico secretado de una línea celular dada a la superficie de la célula a través de un anticuerpo de captura. Además, el anticuerpo de captura necesariamente se origina de un cultivo de células mamíferas, que puede contener suero fetal, y que a menudo se estabiliza con albúmina de suero bovino como una preparación comercial de anticuerpos. El uso de un anticuerpo de captura implica, por lo tanto, el riesgo de contaminación viral o de EEB en los cultivos clonales de células.

Es objeto de la presente invención diseñar otro método para detectar eficazmente y seleccionar células individuales apropiadas que expresan el anticuerpo de un conjunto de clones celulares. El objeto se consigue mediante el método según la reivindicación independiente 1. Posibles realizaciones de la invención se muestran en las figuras. Se muestra en:

Fig. 1a: Dibujo esquemático del principio de la captura y detección para ensayar para el anticuerpo secretado y b: comparación de la capacidad de unión para el anticuerpo de captura y la proteína A.

Fig. 2: Análisis de citometría de flujo (CF) de muestras del ensayo de secreción de la invención.

Fig. 3: Análisis de citometría de flujo (CF) de muestras del ensayo de secreción que comparan el efecto de la proteína A con el anticuerpo anti-IgG humano para la captura del anticuerpo secretado.

El método según la presente invención para seleccionar células secretoras de un primer anticuerpo comprende las etapas de:

a)

enlazar una avidina a la superficie de la célula

b)

incubar la célula con un polipéptido que comprende al menos un dominio funcional que une anticuerpos de la proteína G o de la proteína A

c)

incubar la célula con un segundo anticuerpo marcado fluorescentemente y que reconoce y une un epitopo en el primer anticuerpo y lavar para eliminar el segundo anticuerpo no unido después de la incuba- ción

d)

seleccionar células marcadas fluorescentemente que han unido una cantidad del segundo anticuerpo, preferiblemente y oportunamente mediante el análisis fluorescente con citometría de flujo (CF). La CF permite la clasificación simultánea de células con marcaje fluorescente.

La célula productora del anticuerpo puede ser cualquier célula empleada para secretar anticuerpos tales como por ejemplo células de hibridoma, de mieloma, o de OHC. Más preferiblemente, la célula productora es una línea celular de mieloma, más preferiblemente, es una línea celular NSO.

Como consecuencia, el anticuerpo puede producirse de forma natural o puede ser un anticuerpo modificado o un fragmento tal como los anticuerpos quiméricos o monovalentes y bi-específicos, incluyendo los anticuerpos recién conocidos de cadena sencilla y pesada de camellos y llamas (Trenes Biochem. Scien. (2001), 26, 230). Preferiblemente, estos anticuerpos según la presente invención siempre comprenden sitios de unión para la unión de alta afinidad de la proteína bacteriana G o la proteína A tal como se comprende en la porción Fc que ocurre naturalmente de la inmunoglobulina (Ig) de varias clases (IgG, IgA, IgE, IgM). Preferiblemente, el anticuerpo según la presente invención comprende una porción Fc de una IgG. Más preferiblemente, el anticuerpo según la presente invención es una IgG que comprende al menos una cadena pesada de IgG.

La avidina según la presente invención es una avidina aviar convencional (de aproximadamente 67 kD) o cualquier otro homologo funcional de la misma, es decir, que une la biotina, estreptavidina (60 kD9 de las especies de Estreptomices o cualquier variante modificada químicamente o genéticamente de estas avidinas que ocurren de forma natural. Un ejemplo de una variante modificada es la neutravidina (Pierce, Rockford/IL), que es una avidina desglicosilada sin el hidrato de carbono, con un pl de entre 6-7 y con modificaciones adicionales para que no comprenda el dominio tripéptidico RYD comprendido en la estreptavidina que puede mediar la unión no específica a los receptores de la superficie de la célula. Preferiblemente, la avidina según la presente invención es una avidina aviar, una avidina aviar desglicosilada, o es una neutravidina. Más preferiblemente, la avidina según la presente invención es una neutravidina. Tal neutravidina demuestra la capacidad máxima de unión de biotina, estando dicha capacidad aproximadamente en el intervalo de 14 \mug de biotina/mg de proteína.

La avidina puede asociarse a la superficie de la célula mediante, por ejemplo, la reticulación. Pueden emplearse reactivos convencionales de reticulación bifuncionales bien conocidos en el estado de la técnica que comprenden grupos reactivos tales como los oxiranos, los aldehídos, los succinimidos, o compuestos fotoreactivos tales como N-[N-4-azido-tetrafluorobenzoil)biocitiniloxi]succinimido, SAND (sulfosuccinimidil 2-[m-azido-o-nitrobenzamido]-etil-1,3-ditiopropionato). Por supuesto, la reticulación no ocurre ni con grupos reactivos de lípidos (por ejemplo, la hidroxifunción de fosfatidilserina) ni, más probablemente, con los grupos reactivos visualizados en la superficie de las proteínas de la membrana.

En una realización preferida, la avidina se sujeta de forma no covalente a la superficie de la célula después de haber asociado a la superficie de la célula un resto biotina de forma covalente, mediante un reactivo monofuncional de reticulación que lleva un marcador de biotina. Más preferiblemente, esta biotinilación se lleva a cabo a una temperatura por debajo de los 10ºC, más preferiblemente a aproximadamente 4ºC o menos. A esta temperatura, la eficacia de biotinilación aumenta con el tiempo. Oportunamente, el tiempo de reacción para la biotinilación de la superficie de la célula está en el intervalo de 30-60 minutos.

Si se capta la avidina en la superficie de la célula mediante un marcador de biotina en la superficie de la célula, además es preferible que las células se incuben en una solución que comprenda al menos 50 \mug/ml de avidina, más preferiblemente al menos 100 \mug/ml de avidina, el término "avidina" refiriéndose a la avidina según la presente invención. Las moléculas de avidina normalmente tienen aproximadamente 4 sitios de unión para biotina. Si se emplea un marcador de biotina para revestir la superficie de la célula y la avidina se incuba a continuación en un exceso del marcador de biotina asociado de forma covalente a la superficie de la célula, un marcador de biotina se unirá a una molécula de avidina, dejando abiertos aproximadamente 3 sitios adicionales de unión para marcadores de biotina.

Más preferido es que el resto biotina que está asociado de forma covalente a la superficie de la célula y que tiene la función de anclar avidina de forma no covalente a la superficie de la célula esté asociado a la superficie de la célula mediante un resto espaciador, por ejemplo, una cadena alquilo linear, que se extiende hasta al menos 10 \ring{A}, más preferiblemente hasta al menos 20 \ring{A}, y lo más preferiblemente hasta al menos 30 \ring{A}.

En la siguiente etapa del método según la presente invención, un polipétido biotinilado que engloba al menos un sitio de unión de anticuerpos se incuba con células marcadas con avidina y se une a avidina que está ahora asociada a la superficie de la célula. El dominio de unión de anticuerpos según la presente invención no se deriva de la porción que une los antígenos o la porción que determina la complementariedad de una inmunoglobulina o de un fragmento de inmunoglobulina. Es un polipéptido no derivado de inmunoglobulina que une anticuerpos. El polipéptido puede ser, por ejemplo, la proteína A (Surolia A. et al., 1982, Protein A: Nature's Universal Antibody, TIBS 7, 74-78; Langone, J., 1982, Protein A of staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors, Adv in Immunology, 32: p156-241), la proteína G o la proteína L. La proteína L viene de las especies de Peptostreptococcus y es única ya que tiene la capacidad de unir a través de interacciones de cadena kappa corta sin interferir con el sitio de unión de antígenos de un anticuerpo (Kastern, W. et al., 1992, Structure of protein L and identification of a repeated immunoglobulin Light-chain binding domain, J. Biol. Chem. 267, 12820-12825), de modo que une a todas las clases de Ig además de a fragmentos variables de una cadena (ScFV) y fragmentos Fab.

Según la presente invención, el uso de estos dominios de unión de anticuerpos que comprenden un polipéptido conduce a una sensitividad potenciada en un ensayo de secreción según la presente invención, lo que permite una discriminación suficiente de clones de células altamente productoras de las de baja o nula productividad. El ensayo de secreción según la presente invención también permite una evaluación rápida y fácil de la estabilidad de la línea celular. Una evaluación de la estabilidad de la línea celular durante un proceso de desarrollo de una línea celular tradicionalmente requería una clonación analítica de al menos 200-300 clones, que puede tardar entre 6 y 7 semanas. En combinación con la citometría de flujo, el ensayo que es objeto de esta aplicación tiene una sensitividad suficiente como para resolver y cuantificar poblaciones de productividad baja o nula de miles de células, y por lo tanto, se proporcionan datos sobre la estabilidad de la línea celular en sólo 5 horas.

Preferiblemente, el dominio de unión de anticuerpos es de la proteína A a la proteína G. La proteína A de las especies de Staphylococcus y la proteína G de las especies de Streptococcus son conocidas como agentes proteicos que unen específicamente a la porción Fc de anticuerpos (Boyle M, Bacterial Immunoglobulin-Binding proteins, Academic Press, San Diego 1990). Se ha encontrado un uso amplio en la biotecnología para la purificación por afinidad de la IgG de casi cualquier especie o subclase animal. La proteína A estafilococal une a un sitio similar en el fragmento Fc de la IgG, como también hace la proteína G estreptococal, lo que implica en ambos casos, por ejemplo, los residuos humanos de IgG-Fc 252-254, 433-435 y 311, tal como demostraron Deisenhofer y colaboradores (1981, Biochemistry 20; 2361-2370) y Sauer-Eriksson et al. (1995, Structure 3, 265-278).

Además, WO 00/7428 describe un dominio aislado de unión de anticuerpos B 1 de polipéptido de la proteína bacteriana G que une a un fragmento Fab de una IgG pero no une sustancialmente un fragmento Fc de una IgG. El uso de este dominio B 1 es otra realización preferida de la presente invención.

En general, los dominios de anticuerpos según la presente invención pueden usarse como dominios aislados o como proteínas de fusión con otros grupos de polipéptido. También es posible fusionar varios dominios de unión de anticuerpos de, por ejemplo, las proteínas A, G, L, o de variantes aún funcionales de las mismas que han sido modificadas artificialmente mediante la sustitución, deleción o inserción de aminoácidos. También es posible emplear variantes de, por ejemplo, las proteínas A, G, L, etc., respectivamente, que llevan deleciones o que están truncadas.

Preferiblemente, el polipéptido no comprende ningún sitio o sólo 1-2 sitios de glicosilación, más preferiblemente, carece de cualquier hidrato de carbono.

Preferiblemente, un polipéptido que comprende al menos cuatro sitios de unión de anticuerpos, más preferiblemente la proteína A intacta de un peso molecular de aproximadamente 42 kD se emplea en la presente invención. Tal proteína A intacta tiene sitios de unión de alta afinidad para las porciones Fc de IgG. En combinación con la naturaleza multivalente de avidina para restos biotina, esto conduce a una amplificación considerable de la cantidad de anticuerpo secretado unido y por lo tanto a una amplificación de la señal.

La biotinilación de un polipéptido puede realizarse con cualquiera de los métodos descritos arriba para la biotinilación de la superficie de la célula. Adicionalmente, es también posible y convenientemente conjugar un resto biotina con tiramina, cuya reticulación covalente al polipéptido se cataliza con radicales libres de oxígeno generados por la peroxidasa de hidrógeno en presencia del peroxido de hidrógeno.

También es posible, y esto constituye un objeto adicional de la invención, emplear un conjugado de polipéptido-avidina, en donde dicho polipéptido lleva al menos un dominio de unión de anticuerpos de la proteína A o la proteína G. La reticulación de los grupos de polipéptido y de proteína, respectivamente, se conoce en el estado de la técnica bioquímica y puede realizarse con una variedad de agentes (Fasold et al., Bifunctional reagents for the crosslinking of proteins, Angew, Chem. Int. Ed. Engl. (1971), 10: 795-801). Por ejemplo, el acoplamiento a grupos aminos de los aminoácidos lisinas mediante esteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) es bien conocido en el estado de la técnica. Asimismo, las realizaciones preferidas y las definiciones de la presente invención se aplican a este objeto.

Preferiblemente, el resto biotina se enlaza con el polipéptido mediante un resto espaciador, cuyo brazo espaciador tiene una longitud de al menos 15 \ring{A}, más preferiblemente de al menos 22 \ring{A}, y lo más preferiblemente de al menos 30 \ring{A}. Brazos espaciadores apropiados pueden ser, por ejemplo, grupos alquilo lineales. Tales brazos espaciadores extendidos reducen el impedimento estérico al unir a varias moléculas biotiniladas en un complejo de avidina.

Es adicionalmente preferido que el dominio de unión de anticuerpos que comprende un polipéptido según la presente invención lleve al menos 3 restos biotina enlazados de forma covalente con el polipéptido o proteína, más preferiblemente al menos 6 restos biotina, y más preferiblemente 6-10 moléculas de biotina por polipéptido o proteína, respectivamente. El grado de biotinilación del polipéptido se regula fácilmente mediante el número de grupos reactivos en el polipéptido (por ejemplo, grupos amino de lisina, grupos sulfhidrilo de cisteína) y la proporción de reactivo de biotinilación a polipéptido al llevar a cabo la biotinilación.

El segundo anticuerpo de detección según la presente invención puede ser un anticuerpo convencional o un fragmento de anticuerpo, marcado fluorescentemente, que se une específicamente al anticuerpo secretado primero, cuya expresión por un clon de una célula se vigila mediante el método de la presente invención. En el alcance de la presente invención, se entiende que el "anticuerpo de detección" también comprende cualquier combinación apropiada de un primer y segundo anticuerpos de detección, aunque sólo el segundo está marcado fluorescentemente, tal como se emplea convencionalmente en técnicas relacionadas tales como técnicas de ELISA. Del mismo modo, un antígeno marcado fluorescentemente reconocido por el primer anticuerpo secretado, puede utilizarse para la detección. Oportunamente, entre las etapas b y c de la presente invención, un periodo corto de incubación en medio de un cultivo celular permite que se saturen sitios de unión de anticuerpos artificialmente creados en la superficie de la célula con el anticuerpo secretado.

Preferiblemente, durante o, a lo más tardar, después de incubar las células con el polipéptido biotinilado según el método de la presente invención, las células se cultivan en un medio que comprende un agente que aumenta la viscosidad. Esta medida evita alimentación cruzada entre las células mediante un aumento artificial de la viscosidad del medio. Dicho agente puede ser, por ejemplo, celulosa de metilo, PEG, almidón, polisacáridos de algas, bacterias o plantas, o gelatina. En una realización preferida, se emplea la gelatina a una concentración de al menos el 10% (p/p).

En otra especialmente preferida realización, durante o a lo más tardar después de incubar las células con el polipéptido biotinilado y antes de teñir las células con el anticuerpo o antígeno marcado fluorescentemente según el método de la presente invención, las células se cultivan en un medio que comprende la proteína A no biotinilada, u otro dominio de unión de anticuerpos no captante competidor que comprende un polipéptido según la presente invención, a una concentración de al menos 0,5 \mug/mL, más preferiblemente a una concentración de al menos 4 \mug/mL, lo más preferiblemente a una concentración de al menos 8 \mug/mL. Oportunamente, la proteína A no captante competidora o semejante se utiliza en combinación con un agente que aumente la viscosidad tal como se ha descrito anteriormente, para evitar la alimentación cruzada entre células.

Preferiblemente, antes de teñir las células con el anticuerpo o antígeno marcado fluorescentemente según el método de la presente invención y después de haber permitido que el anticuerpo secretado se una al polipéptido biotinilado que se ha inmovilizado en la superficie de la célula, un tercer anticuerpo bloqueante se añade a las células, por ejemplo, a una concentración de al menos 0,5 a 5 mg/ml. Dicho tercer anticuerpo bloqueante es capaz de unirse a los sitios de unión de anticuerpos del polipéptido biotinilado que quedan pero el antígeno o el anticuerpo marcado fluorescentemente empleado para la detección ni lo reconoce ni lo une. Esta medida contribuye adicionalmente a eliminar la alimentación cruzada tardía entre clones y así se mejora la sensitividad y la discriminación del ensayo de la presente invención. Huelga decir que dicha medida puede combinarse de cualquier forma con otra medida propuesta, por ejemplo, un agente que aumenta la viscosidad y/o la proteína A no biotinilida competidora y agentes semejantes, con tal de potenciar de forma aditiva la discriminación y por tanto la sensitividad del ensayo.

Ejemplos

En todos los experimentos, las células se recogieron durante la fase de crecimiento exponencial del cultivo discontinuo con la viabilidad superior al 95%, tal como se ensayó mediante técnicas estándares de recuento de células teñidas.

1. Experimento comparativo

Se empleó la línea celular 6A1(100)3 (obtenida de Lonza Biologies) derivada de la línea celular de mieloma NSO. Es una línea celular transfectante GS (Bebbington C. et al., 1992, High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase (GS) gene as an amplifiable selectable marker, Bio/Technology 10: 169-175) que secreta el anticuerpo IgG cB72.3 humano quimérico específico para el antígeno de tumor de mama TAG73. Las células se trataron exactamente tal como se ha descrito en la publicación de Holmes y colaboradores (ibid.). El resultado fue decepcionante, sin que se observara ninguna diferencia reproducible y estadísticamente significativa en la fluorescencia entre células secretoras y una línea celular no tratadas de control negativo (línea celular NSO ECACC núm. 85110503). El experimento se repitió con una línea celular transfectada de mieloma no productora de GS y con la IgG humana añadida de forma exógena a las células, y otra vez, no se percibió ninguna diferencia en la fluorescencia media.

2. Ensayo de secreción 2.1 Captura de anticuerpo secretado

El principio de la captura y detección de un anticuerpo secretado se muestra de forma esquemática en la figura 1. La línea celular 6A1(100)3 que secreta el anticuerpo quimérico cB72.3 se seleccionó de nuevo como el modelo experimental. La matriz de secreción se construyó tal como se describe a continuación. 10^{7} células 6A1(100)3 se lavaron en 25 mL de pH8 PBS y se suspendieron de nuevo en 1 mL de 1 mg/mL de biotina NHS-LC (núm. de catálogo 21336, succinimidil-6-(biotinamido)hexanoato; Pierce, Rockford, IL/EE.UU.) en PBS fisiológico estándar. Después de 40 minutos de incubación a 4ºC, las células se lavaron dos veces en PBS (pH7), y se suspendieron de nuevo en 1 mL de PBS (pH7). Se añadieron 128 \muL de una solución de 1 mg/mL de neutravidina^{TM} (Pierce, UK) para proporcionar una concentración final de 1 \mug/mL: la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación, se añadieron 52 \muL de una solución de 1 mg/mL de proteína A biotinilada (Pierce, Rockford, IL/EE.UU.; con 6-10 marcadores de biotina por proteína) y se incubó la solución durante 15 minutos más a temperatura ambiente. La concentración de proteína A biotinilada aplicada para incubación todavía no saturó los sitios de unión. Experimentos independientes confirmaron que aún a una concentración de 120 \mug/mL de proteína A biotinilada, la unión no se aproximaba a la saturación (datos no presentados).

Las muestras a emplear como controles positivos se dosificaron a continuación con el volumen apropiado de IgG cB72.3 purificada para proporcionar una concentración de 6,6 \mug/mL.

Las muestras a emplear como controles negativos consistían en células que carecían de una matriz de afinidad para la proteína de captura de biotina/avidita. Estas muestras se procesaron tal como otras muestras, empezando con su incubación en el medio de secreción.

Todas las muestras a emplear en el ensayo completo de secreción se expusieron al siguiente procedimiento: las células se resuspendieron en 10 mL de medio de secreción (medio de cultivo de células tal como se describe en Holmes P. et al., Improved cell line development by a high throughput affinitiy capture surface display technique to select for high secretors, J. of Immunological Methods, 230 (1999), 141-147, para el cultivo de la línea celular NSO 6A1(100)-3 con el medio enriquecido con gelatina 10%). Este medio también contenía 8 \mug/mL de la proteína A no biotinilada (Sigma, UK) con tal de captar el anticuerpo que se difunde desde las células de modo que se evite que se una a células no productoras. Las células se incubaron en el medio de secreción durante 15 minutos a 4ºC.

2.2 El marcado fluorescente

El anticuerpo secretado unido se detectó con el conjugado FITC anti-humano murino de cadena ligera kappa (Sigma, UK) a una dilución final de 1/500.

Las células tratadas cómo se describe en el epígrafe 2.1 se lavaron una vez en 25 mL de PBS (pH 7) y 320 \muL de 1 mg/mL de anticuerpo bloqueante de IgG murino (Sigma, UK) se añadieron y se mezclaron con el sedimento celular y se incubó durante 5 minutos. A continuación, las células se lavaron una segunda vez con 25 mL de PBS (pH 7) y se resuspendieron en 1 mL de PBS, se añadieron 5 \muL de anticuerpo de detección FITC anti-humano murino de cadena ligera kappa, y las células se incubaron durante 15 minutos. Después de un lavado adicional en 25 mL de PBS, las células se resuspendieron en 1 mL de PBS para un análisis por citometría de flujo.

2.3 Citometría de flujo

Después de teñir las células tal como se ha descrito en el epígrafe anterior, se analizaron con un citómetro de flujo Coulter Epics Elite Flor a una excitación de 488 nm y detección de 515 nm. Se utilizó el logaritmo de dispersión lateral frente al logaritmo de dispersión frontal para identificar la población viable que se utilizó para sincronizar la señal y se midió el nivel de fluorescencia (y por tanto la cantidad de anticuerpo unido) para esta población. Las distribuciones para (A) el control negativo (es decir, sin la matriz de afinidad), (B) células con anticuerpo secretado captado por la matriz de afinidad, y (C) las células de control positivo incubadas con IgG purificada añadida de forma exógena, captada por la matriz de afinidad se muestran en la figura 2 como recuento de células frente a la intensidad de fluorescencia. Las células secretoras B mostraron una fluorescencia media de 19.3, que correspondió con un aumento de 50 veces en la fluorescencia media frente al control negativo A. El control positivo C tuvo un medio de 59.5, lo que supuso un aumento de 125 veces con respecto al control negativo. Se presentan los valores numéricos de la fluorescencia media según la figura 2 en la tabla 1.

TABLA 1

Muestra	Fluorescencia media [unidades arbitrarias]
A: control negativo	0,4
B: células secretoras	19,3
C: control positivo (+ IgG exógena)	59,5

Ejemplo comparativo

La eficacia de la unión del anticuerpo biotinilado de captura a un anticuerpo secretado en la superficie de célula se comparó con aquélla de la proteína A biotinilada. En el experimento comparativo, el ensayo de secreción se llevó a cabo exactamente como se ha descrito en el epígrafe 2 con la excepción de que el PBS sin cualquier agente para aumentar la viscosidad se empleó para la incubación en vez del medio secretor para todas las muestras. Además del control negativo estándar (A), control positivo (C) y células secretoras cB72.3 (D) tal como se ha descrito en las secciones anteriores, una muestra adicional (B) se preparó sustituyendo la proteína A biotinilada con el anticuerpo murino de captura específico para IgG Fc anti-humano (Sigma, UK) que se inmovilizó en la superficie de la célula mediante una incubación a 50 \mug/mL durante 15 minutos, correspondiendo esta concentración a una concentración cerca de saturación y siendo comparable con la cantidad de proteína A utilizada en los experimentos anteriores. La muestra (B) se incubó a continuación con IgG humana añadida exógenamente y se procesó adicionalmente tal como se ha descrito para el control positivo más arriba. Las distribuciones para todas las muestras se muestran en la figura 3 como el recuento celular frente a la intensidad de fluorescencia después de un análisis de fluorescencia por citometría de flujo, tal como se utilizó en la figura 2 (figura 3: A: control negativo, B: anticuerpo de captura, C: control positivo, proteína A, D: proteína A secretada cB72.3). Los valores medios numéricos según las distribuciones presentadas en la figura 3 se detallan en la tabla 2. El uso del anticuerpo de captura con el producto del modelo de IgG humana (muestra B) proporcionó un aumento de 5 veces en la fluorescencia media en comparición con las células de control negativo. Sin embargo, cuando se empleó la proteína A (muestra C), hubo un aumento de 80 veces en la fluorescencia media, lo que demuestra que la proteína A fue más eficaz que el anticuerpo de captura. La proteína A también fue altamente eficaz cuando se utilizó la técnica para captar y detectar la cB72.3 secretada, con un aumento de aproximadamente 55 veces en la fluorescencia media en comparación con el control negativo.

Las muestras preparadas exactamente como se ha descrito en Holmes et al. (ibidem) no mostraron ningún aumento respecto al control negativo (datos no presentados).

TABLA 2

Muestra	Fluorescencia media [unidades arbitrarias]
A: control negativo	0.6
B: anticuerpo de captura + IgG exógena	2.8
C: proteína de captura A + IgG exógena	46.3
D: proteína de captura A + cB72.3 secretada	32.9

Una comparación de los datos del experimento B con los de los experimentos C y D muestra claramente que la sustitución de un anticuerpo de captura por la proteína A proporciona mejoras sustanciales en la sensitividad de detección y la capacidad de unión, respectivamente. Teóricamente, la proteína A debería tener un exceso de dos sitios de unión (en total, 4) en comparación con el anticuerpo de captura, y así poder permitir que se duplique la cantidad de anticuerpo secretado unido (en teoría, una potenciación de la intensidad de un factor de 2). Esta expectación habría supuesto un máximo teórico ya que un anticuerpo de unión de alta afinidad puede exceder la afinidad de unión de la proteína A en aproximadamente una orden de magnitud. Al contrario, la potenciación de la intensidad por la proteína A realmente observada frente al anticuerpo de captura de aproximadamente un factor de 15 a 20 considerablemente excede el valor predicho teóricamente, de forma sorprendente por alguna razón desconocida.

La figura 1b muestra la comparación de la capacidad de unión para la captura de la porción Fc de unión de anticuerpos de IgG añadida exógenamente frente a la proteína A que une esta IgG exógena. Las muestras se prepararon esencialmente tal como se ha descrito en las partes actuales de esta sección, salvo que tanto la cantidad de anticuerpo de captura como la de la proteína A, respectivamente, utilizadas para la incubación se duplicaron con tal de asegurar una unión de saturación. Se añadió IgG purificada al volumen definido de sedimento celular con tal de asegurar una concentración precisamente predeterminada de IgG exógena durante la incubación.

Claims (15)

1. Método para seleccionar células secretoras de un primer anticuerpo, que comprende las etapas de:

a)

enlazar avidina a la superficie de una célula,

b)

incubar la célula con un polipéptido biotinilado que comprende al menos un dominio funcional de unión de anticuerpos procedente de la proteína A, proteína G, proteína L, o variantes funcionales de la misma,

c)

incubar la célula con un segundo anticuerpo o antígeno que se marca fluorescentemente y que reconoce y une un epítopo en el primer anticuerpo,

d)

seleccionar células marcadas fluorescentemente que han unido una cantidad del segundo anticuerpo, mediante análisis por citometría de flujo.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido biotinilado es una proteína G o una proteína A.

3. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la avidina se une a la superficie de la célula después de haber realizado una biotinilación covalente de la superficie de la célula.

4. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque durante o, a lo más tardar, después de la incubación con el polipéptido biotinilado, las células se cultivan en un medio que comprende un agente para aumentar la viscosidad.

5. Método para seleccionar células secretoras de un primer anticuerpo, que comprende las etapas de

1)

enlazar avidina a la superficie de la célula, en donde la avidina se conjuga con un polipéptido que comprende al menos un dominio funcional de unión de anticuerpos procedente de la proteína G o de la proteína A,

2)

incubar la célula con un segundo anticuerpo o antígeno que se marca fluorescentemente y que reconoce y une un epitopo en el primer anticuerpo,

3)

seleccionar las células marcadas fluorescentemente que han unido una cantidad del segundo anticuerpo, mediante análisis por citometría de flujo.

6. Método según la reivindicación 5, caracterizado porque la avidina se une a la superficie de la célula después de realizar una biotinilación covalente de la superficie de la célula.

7. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la célula es una célula secretora de anticuerpos.

8. Método según la reivindicación 7, caracterizado porque la célula es una célula de hibridoma, de mieloma, o OHC.

9. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo comprende sitios de unión para la unión de alta afinidad de la proteína bacteriana G o A.

10. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo es una IgG o comprende una porción Fc de una IgG.

11. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la avidina es neutravidina.

12. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el resto biotina se enlaza con el polipéptido mediante un resto espaciador, grupo espaciador que tiene una longitud de al menos 15 \ring{A}.

13. Método según la reivindicación 1 ó 12, caracterizado porque el polipéptido biotinilado lleva al menos 3 restos biotina enlazados de forma covalente con el polipéptido.

14. Método según la reivindicación 13, caracterizado porque el polipéptido biotinilado comprende de 6 a 10 restos biotina.

15. Método según la reivindicación 3 ó 5, caracterizado porque la biotinilación de la superficie de la célula se ha realizado a una temperatura de menos de 10ºC.