ES2240513T3

ES2240513T3 - Procedimiento para medir la actividad de no-sintasa.

Info

Publication number: ES2240513T3
Application number: ES01967309T
Authority: ES
Inventors: Hagen-Heinrich Hennies; Bernd Sundermann
Original assignee: Gruenenthal GmbH; Chemie Gruenenthal GmbH
Current assignee: Gruenenthal GmbH
Priority date: 2000-09-06
Filing date: 2001-09-04
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2021-09-04
Also published as: PT1315832E; AU2001287711B2; AU8771101A; US20040002129A1; US7045307B2; JP2004522417A; NZ525058A; MXPA03001767A; EP1315832A2; WO2002020831A2; EP1315832B1; HUP0303657A2; CA2417076A1; PL366053A1; DE50106468D1; WO2002020831A3; CA2417076C; DE10043845A1; HUP0303657A3; PL204925B1

Abstract

Procedimiento para medir la actividad NO-sintasa con los siguientes pasos de procedimiento: (a) Incubación de la NO-sintasa con arginina marcada como sustrato en un recipiente de reacción. (b) Segregación de la arginina marcada de la citrulina marcada que eventualmente se ha producido como producto de la reacción enzimática, en un momento en el que aumenta la concentración de citrulina. (c) Medida de la cantidad de la correspondiente arginina separada, caracterizado porque la segregación se realiza a través de una membrana de placa filtrante de intercambio catiónico.

Description

Procedimiento para medir la actividad de NO-sintasa.

La invención se refiere a un procedimiento para medir la actividad NO-sintasa, a un procedimiento correspondiente para la identificación de moduladores de NO-sintasa, especialmente para su aplicación en HTS (high throughput screening - filtrado de alto rendimiento) y la utilización de las correspondientes membranas de placas filtro de intercambio catiónico.

Desde hace más de 100 años la ciencia médica conoce el procedimiento de utilizar nitroglicerina en el tratamiento de enfermedades coronarias cardiacas. Pero tan sólo hace 15 años que se ha descubierto que este efecto es debido a la formación de monóxido de nitrógeno (NO). Desde entonces se ha esclarecido la creciente importancia de esta molécula en diversas publicaciones. Por tanto y especialmente desde el punto de vista farmacológico, adquieren gran importancia las vías de síntesis de NO y especialmente la localización de compuestos que modulan la síntesis de NO.

El NO se forma gracias a las NO-sintasas (EC: 1.14.13.39) (en lo que sigue abreviadas a veces como NO-S). Éstas catalizan la oxidación de L-arginina a L-citrulina y NO a través de N^{G}-hidroxiarginina. Las NO-sintasas tienen en su forma monomérica una masa molecular entre 125 y 155 kDa, sin embargo, solamente son activas como homodímeras. La estructura molecular de las NO-sintasas se asemeja en gran medida a la de las citocromoP450-reductasas. Se conocen diferentes clases de NO-sintasas:

\bullet: las NO-S que inducidas por citoquinas o LPS = iNO-S y

\bullet: las cNO-S constitutivas activadas por Ca^{2+} que a su vez se subdividen en las siguientes subformas:

-: NO-S endoteliales = eNO-S

-: NO-S neuronales = nNO-S

En la literatura existen numerosos ejemplos sobre cómo se puede determinar la actividad de isoenzimas de NO-S conocidas.

Los procedimientos más conocidos son los siguientes:

1) Separación del producto final citrulina por cromatografía de columna

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100

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Las formulaciones enzimáticas se colocan, después de terminar la reacción, sobre columnas de intercambio catiónico individuales. A continuación se eluye la [^{3}H]L-citrulina y se determinan los eluatos en el contador \beta. La desventaja de este método consiste en que por cada formulación enzimática es necesario realizar una cromatografía de columna individual (por ejemplo para microplacas tituladas de 96 pocillos (MTP) se necesitan 96 columnas cromatográficas). Método según: D.S. Bredt y S.H. Snyder, Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 682 (1990).

2) Determinación de NO_{2} con el "Reactivo de Griess"

Además de L-citrulina, también se produce NO como producto final durante la reacción de las NO-S (véase reacción 1), el cual, sin embargo, es inestable, por lo que sigue reaccionando:

2 \ NO + O_{2} \rightarrow 2 \ NO_{2}

2 \ NO_{2} + H_{2}O \rightarrow NO_{2}^{-} + NO_{3}^{-} + 2H^{+}

El NO_{3}^{-} producido ha de reducirse a NO_{2}^{-}. Esto puede realizarse con cadmio o, de forma enzimática, mediante adición de nitrato-reductasa. Debido a que el NADPH de la formulación de NO-S obstaculiza la reacción de Griess con NO_{2}^{-} es necesario eliminar estas reducciones paralelas. Esto se puede realizar de forma enzimática mediante adición de lactato-deshidrogenasa/ piruvato. Después de añadir el reactivo de Griess (1% de sulfanilamida; 0,1% de diclorhidrato de naftilendiamina; 5% de H_{3}PO_{4}) se produce un AZO-colorante de color púrpura que se puede determinar a 543 nm.

La reacción de Griess se desarrolla como sigue:

1

Publicación: L.C. Green, D.A. Wagner, J. Glogowski, P.L. Skipper, J.S. Wishnok, S.R. Tannenbaum, Anal. Biochem. 126, 131 (1982)

La desventaja de este método de medida es que para la determinación de la actividad NO-S son necesarios varios pasos de reacción que han de realizarse por separado y consecutivamente.

3) Medición de quimioluminiscencia

El NO que se produce en la reacción de la NO-S junto con L-citrulina reacciona convirtiéndose en NO_{2}^{-} y NO_{3}^{-} (véase reacción 2). Para medir la quimioluminiscencia, sin embargo, es necesario transformar el NO_{2}^{-} y el NO_{3}^{-} en NO. A continuación se lleva a cabo una reacción con ozono:

NO + O_{3} \rightarrow NO_{2}{}^{*}+ O_{2}

NO_{2}{}^{*} \rightarrow NO_{2} + h\nu

Publicación: S. Archer, FASEB Journal 7, 349 (1993)

La desventaja de este método consiste en que, por un lado, también aquí existen varios pasos de reacción y, por otro lado, es necesario para la reacción producir directamente ozono a un alto costo debido a su corto período de semidesintegración.

4) Determinación de cGMP con ayuda de guanilatociclasa estimulada con NO

En este caso se estudia la actividad de la guanilatociclasa en base a la cantidad de cGMP. Debido a que la guanilatociclasa es activada por NO es posible averiguar así la cantidad de NO producida y la actividad de la NO-S.

Publicación: M. Feelisch, E:a: Noack, Eur. J. Pharmacol. 139, 19 (1987); Mayer, Schmidt, Humbert, Böhme, Biochem. Biophys. Research Commun. 164, 678 (1989)

La desventaja de este método estriba en que se trata de una reacción de acoplamiento enzimático. Además, las reacciones de acoplamiento enzimático, en la mayoría de los casos, no permiten medir una velocidad inicial, para determinar claramente la velocidad lineal de reacción es necesario que las concentraciones de sustratos se sitúen dentro del rango de saturación de las enzimas (\sim100 K_{m}). Esto puede ser un considerable factor coste. Con esta reacción, por lo demás, tampoco es constante la actividad de la guanilatociclasa ya que se estimula solamente por el NO generado durante la reacción de acoplamiento.

Debido que en la investigación farmacológica moderna es necesario realizar un considerable número de medidas en un corto espacio de tiempo, en especial debido a que se investigan grandes cantidades de diferentes sustancias, las llamadas librerías, en cuanto a sus potenciales y aplicables efectos fisiológicos individuales, se llevan a cabo los llamados procedimientos HTS (High-Throughput Screening). Aquí se aplican procedimientos de ensayo que se puedan automatizar, que sean lo más sencillos y rápidos posible y en especial que se realicen, por tanto, con un mínimo de pasos de procedimiento sencillos automatizados y sin necesidad de pasos manuales intermedios. Basta un "procedimiento bruto" que solamente ha de suministrar un resultado si - no. En este sentido no es forzosamente necesario que las medidas estén dentro del rango de velocidad lineal inicial de las reacciones enzimáticas. Las manipulaciones que requieren tiempo, como puede ser tomar cantidades parciales alícuotas, incubar reacciones (enzimáticas) de acoplamiento, centrifugaciones, procesos que no se pueden automatizar, etc. se eliminan desde un principio durante un método de procesado HTS. Al mismo tiempo, sin embargo, los ensayos han de suministrar resultados fiables. Por esta razón, para el proceso HTS tiene una importancia decisiva la precisión del ensayo, es decir el "signal to noise ratio" (ratio señal-ruido) debería ser lo más alto posible para que no sea necesario obtener precisión en el resultado mediante una determinación doble, triple o, incluso, cuádruple, lo que va en contra de la obtención de un alto rendimiento.

Todas las reacciones 1) a 4) arriba indicadas, sin embargo, no son compatibles con HTS debido a que aquí las reacciones enzimáticas de acoplamiento, la toma de partes alícuotas, los pasos de centrifugado, los pasos de separación cromatográfica en columnas etc. se oponen a un "high throughput screening". El coste en tiempo o bien en pasos de procedimiento para conseguir la precisión necesaria es demasiado alto para un procedimiento HTS y los procedimientos no se pueden automatizar en gran medida.

El objetivo de la presente invención consiste, por tanto, en desarrollar un procedimiento simplificado para medir la actividad NO-sintasa, especialmente también un procedimiento para identificar moduladores de NO-sintasa. En especial, este procedimiento debía poder aplicarse en HTS, "High-Throughput-Screening".

Este objetivo se alcanza por un procedimiento de medida de la actividad NO-sintasa que sigue los siguientes pasos de procedimiento:

(a): incubación de la NO-sintasa con arginina marcada como sustrato en un recipiente de reacción,

(b): separación de la arginina marcada de la citrulina marcada, producida, en caso dado como producto de la reacción enzimática en el momento en que aumenta la concentración de citrulina,

(c): medida de la cantidad correspondiente de arginina separada,

donde la separación se realiza a través de una membrana de placa filtrante de intercambio catiónico.

En el sentido de esta invención, se entiende por:

\bullet: Incubación, la introducción y permanencia de un objeto biológico, en este caso una enzima, NO-S, en un medio al que, bajo ciertas circunstancias, se añaden o se han añadido otros compuestos, por ejemplo el sustrato enzimático. Se seleccionan las condiciones adecuadas (en la mayoría de los casos fisiológicamente próximas) para conseguir un efecto determinado, en este caso el desarrollo de una reacción enzimática, de la transformación catalizada por NO-S de arginina en citrulina y NO. Estas condiciones se consiguen, por ejemplo, controlando la temperatura, el pH, la coenzima o bien los cofactores y/o el tiempo de reacción, etc.

\bullet: Recipiente de reacción, un recipiente en el que se puede desarrollar una reacción química en condiciones controladas, pero también una segregación debida a un enlace o a otras fuerzas físicas, por ejemplo un tubo eppendorf, una cubeta o matraz de cultivo, un tubo de ensayo, un tubo de centrifugado o un pocillo de una placa microtitulada. Aquí, el recipiente de reacción también puede estar subdividido en compartimentos mediante membranas permeables selectivas y/o no ha de estar sellado, en especial no forzosamente de forma estanca al líquido, ni siquiera en la parte inferior del recipiente. De esta forma, los recipientes de reacción también pueden tener en un lado (normalmente en el lado inferior) una membrana permeable selectiva, por ejemplo una membrana de placa filtrante, columnas cerradas o placas microtituladas. En el recipiente de reacción se produce la incubación (paso a) así como, preferentemente, la segregación (paso b).

\bullet: Segregación, la separación local de la arginina de la citrulina de manera que -al contrario que en la formulación de incubación que contiene ambas sustancias en forma homogénea y en una determinada relación- se producen áreas separadas, de forma que la arginina está concentrada prácticamente por completo en un área en la que la citrulina ha desaparecido casi por completo en comparación con la concentración anterior y otro área donde se producen las condiciones inversas. La segregación puede realizarse, por ejemplo, de forma física mediante filtros de tamaño o de peso molecular, a través de cargas (por intercambio catiónico, por cromatografía o por aplicación de una tensión) o, por ejemplo, mediante centrifugado. En el caso según invención, la segregación se realiza a través de una membrana de placa filtrante.

\bullet: Marcado, se consigue medir una molécula, por ejemplo mediante el acoplamiento con otra molécula que permite generar una señal de medida (por ejemplo fluorescencia, luminiscencia, ión metálico) o utilizando átomos radiactivos durante su síntesis (marcación radiactiva).

\bullet: Momento en que aumenta la concentración de citrulina se refiere al momento en el que la reacción todavía se desarrolla en dirección al producto citrulina, es decir no se ha alcanzado todavía ningún punto final.

\bullet: Medida, en este sentido se ha de entender la cuantificación de la sustancia marcada con el aparato adecuado.

\bullet: Membrana de placa filtrante, se trata de una membrana plana, es decir una superficie límite permeable que puede filtrar líquidos, esto es que retiene determinados componentes de un líquido.

Aquí se seleccionó como procedimiento la segregación entre el sustrato y el producto final utilizando una membrana de placa filtrante, con lo cual, mediante un simple paso de filtración, se lleva a cabo una separación cuantitativa entre el sustrato y los productos finales sin que sea necesario captar distintas fracciones de elución. Mediante este "sencillo paso de filtración" se alcanza una gran precisión siendo innecesarias determinaciones dobles o triples. La sola introducción de esta membrana de placa filtrante permite la aplicación efectiva del procedimiento, por ejemplo en un HTS, pero en general también para determinaciones sencillas que no complican la actividad NO-S. Como sustrato especialmente preferente se utiliza L-arginina marcada, lo que, entre otros, conduce a la formación de L-citrulina como producto.

Además, comparando las determinaciones del valor IC50, según el método de Bredt y Snyder (1990), de diferentes inhibidores conocidos de NO-S de "segregación del producto final citrulina con ayuda de cromatografía de columna", indicada bajo el número 1, teniendo en cuenta la situación de la técnica, y según un procedimiento que, de acuerdo con la invención, también es preciso y válido en este sentido, el procedimiento según la invención a pesar de su estructuración sencilla sorprendentemente puede concurrir tranquilamente de forma cualitativa con los métodos estándar costosos según Bredt y Snyder (1990).

Especialmente preferente es realizar el procedimiento de manera que en al menos uno de los recipientes de reacción se añada a la fórmula de incubación en el paso (a) una sustancia de la que ha de comprobarse si es un modulador, especialmente activador o inhibidor, de preferencia inhibidor, de NO-sintasa. Con ello se entiende la utilización en un "Screening-Assay" (ensayo de filtración) mediante el que se ensayan sustancias en cuanto a su efectividad fisiológica. Aquí, como modulador se entiende una molécula que influye sobre el comportamiento -en este caso de NO-S-, especialmente en lo referente a una actividad mayor (activador) o menor (inhibidor) hasta llegar a un bloqueo completo.

En especial, un objeto de la invención es también un procedimiento para identificar moduladores de NO-sintasa que implica los siguientes pasos de procedimiento:

(a): incubación de una sustancia a ensayar bajo condiciones adecuadas con la NO-sintasa y arginina marcada en un recipiente de reacción,

(b): segregación de la arginina marcada de la citrulina marcada producida, en caso dado como producto de la reacción enzimática, en el momento en el que aumenta la concentración de citrulina,

(c): medida de la cantidad correspondiente de arginina segregada,

donde la segregación se realiza a través de una membrana de placa filtrante de intercambio catiónico.

En este contexto, bajo "una sustancia a ensayar", se entiende en especial un compuesto de molecularidad inferior cuyo efecto sobre la actividad de la NO-S se quiere ensayar. Es especialmente preferente que el procedimiento sirva para la identificación de un activador o inhibidor, de preferencia un inhibidor, de la NO-sintasa.

Además, en un tipo de realización preferente del procedimiento según la invención, el medio de incubación se elimina del recipiente de reacción durante la segregación de acuerdo con el paso (b). Con medio de incubación se indica el medio en el que se produce la incubación según el paso (a) y en el que están disueltos el sustrato (arginina marcada), NO-S, los productos que se obtienen (es decir citrulina marcada y NO) y sus productos derivados, así como coenzimas o cofactores y que, junto con estas sustancias disueltas o eventualmente suspendidas, constituye la formulación de incubación según el paso (a). Es especialmente preferente que el medio de incubación se elimine en gran medida, mejor casi por completo, en particular completamente. Con ello se alude también, en especial, a una eliminación a través de la membrana de placa filtrante de intercambio catiónico, donde "en gran medida" significa que quedan sólo pocas gotas del medio, "casi por completo" significa que solamente la membrana de placa filtrante de intercambio catiónico contiene pequeñas cantidades del medio de incubación y "completamente" significa que el medio se ha eliminado mediante el lavado de la membrana de placa filtrante de intercambio catiónico o mediante secado. Además, es preferente que durante la eliminación del medio de incubación se separe la arginina marcada del medio de incubación. Como "productos derivados" en el sentido de esta invención se entienden otros productos derivados de los productos, por ejemplo NO_{2}^{-} ó NO_{3}^{-} especialmente. Una coenzima es un compuesto no proteinógeno de molecularidad inferior que se necesita como un cosustrato ligado sólo temporalmente y en forma suelta con una enzima, por ejemplo NADPH. Cofactores es un término colectivo para sustancias de molecularidad inferior cuya presencia es necesaria, o puede serlo, en las reacciones enzimáticas, por ejemplo Ca^{2+}, calmodulina.

En referencia a la segregación según el paso (b), es además preferente que durante la segregación según el paso (b) se separen adicionalmente de la arginina marcada cofactores o coenzimas, la NO-sintasa, NO y los productos derivados y/o la NO-sintasa. Con ello se entiende la segregación de las sustancias añadidas al medio de incubación en la formulación de incubación según el paso (a) exceptuando el sustrato. Debido a que estas sustancias, en la mayoría de los casos, son solubles en agua, esto se produce normalmente durante la eliminación del medio de incubación.

Intercambiadores catiónicos son sustancias que durante el intercambio admiten cantidades equivalentes de cationes desconocidos líquidos. Las membranas de placa filtrante pueden ser, preferentemente, filtros de papel o filtros textiles o estar compuestas de otros materiales sólidos porosos o con perforaciones, por ejemplo metal, vidrio o cerámica o contenerlo. En el primer caso se entienden filtros basados en papel o materiales textiles. En el último caso se hace referencia a, por ejemplo, tamices (filtros) recubiertos de gel o resina o filtros de arcilla o de vidrio. Además, también es preferente que los grupos funcionales para el intercambio catiónico estén fijados a las membranas de placas filtrantes. Aquí, los grupos funcionales son grupos negativos que sirven como punto de enlace para los cationes y están unidos al portador, aquí las membranas de placa filtrante, por ejemplo de manera covalente, pero eventualmente también a través de enlaces iónicos fuertes.

Los grupos funcionales preferentes que se utilizan en las membranas de placa filtrante de intercambio catiónico empleadas en el procedimiento según la invención son los grupos fosfato, carbonato, fosfonato, sulfato y/o sulfonato, en especial grupos fosfato.

Aquí, las membranas de placas filtrantes, si se trata de filtros de papel, tienen un espesor de 10,00 mm a 0,10 mm, preferentemente de 1,00 mm a 0,15 mm, en especial de 0,50 mm a 0,20 mm, en particular de 0,23 mm. Además, también es preferente que las membranas de placa filtrante sean intercambiadores catiónicos con una capacidad de intercambio \geq 1,0 \muEq/cm^{2}, preferentemente \geq 10,0 \muEq/cm^{2}, en especial \geq 18,0 \muEq/cm^{2}. Aquí, estas placas filtrantes pueden tener una velocidad de flujo >100 mm/30 min, preferentemente de 125 mm/30 min.

En un tipo de realización especialmente preferente del procedimiento según invención, el paso (a) se lleva a cabo paralelamente en varios recipientes de reacción y de forma prácticamente simultánea, en especial simultáneamente, y/o el paso (b) paralelamente en varios recipientes de reacción casi de forma simultánea, en especial simultáneamente, especialmente en lo referente al inicio de la incubación en el paso (a) y/o al inicio de la segregación en el paso (b). Aquí es especialmente preferente que los recipientes de reacción estén unidos, y particularmente que se trate de pocillos de una placa microtitulada. Aquí, se entiende como pocillo las concavidades de una placa microtitulada en las que se introducen las formulaciones de incubación o las probetas. Como placas microtituladas que se pueden utilizar en los procedimientos según la invención son adecuadas, especialmente, aquellas que tienen < 96 pocillos, preferentemente 24 ó 48 pocillos, ó \geq 96 pocillos, especialmente 96, 384, 864 ó 1.536 pocillos.

Además, es preferente que los recipientes de reacción utilizados en el procedimiento según la invención, para el paso (a) y/o (b), tengan un volumen de capacidad \leq 2 ml, preferentemente \leq 1 ml, en especial \leq 1 ml, \leq 800 \mul, \leq 350 \mul, \leq 300 \mul, \leq 250 \mul, \leq 200 \mul, \leq 150 \mul, \leq 100 \mul, \leq 50 \mul, \leq 30 \mul ó \leq 5 \mul.

En un tipo de realización especialmente preferente del procedimiento según la invención, la segregación según el paso (b) se realiza aspirando el medio de incubación del paso (a) a través de la membrana de placa filtrante. Aquí se aplica una presión negativa en el lado de la membrana de placa filtrante opuesto a la formulación de incubación. Con "medio de incubación" se quiere decir el medio en el que se produce la incubación según el paso (a) y en el que se han disuelto el sustrato, la NO-S, productos y productos derivados así como coenzimas o cofactores. En otro tipo de realización especialmente preferente del procedimiento según la invención después de la segregación según el paso (b) se desecha la fracción que contiene la citrulina marcada separada de la arginina marcada. El término "fracción" se refiere a una cantidad parcial de la formulación de incubación existente antes de la segregación, en este caso el medio de incubación con determinados componentes disueltos. En este caso, es aquella parte del medio en el que la citrulina marcada de la formulación de incubación existe, en gran medida, por completo y la arginina marcada de la formulación de incubación original (prácticamente) ya no existe. Precisamente estos dos últimos tipos de realización facilitan todavía más considerablemente la manipulación y la automatización del ensayo y lo convierten en especialmente adecuado para un HTS.

En otro procedimiento preferente según la invención, el sustrato separado después de la segregación según el paso (b) está presente sobre o en la membrana de placa filtrante, donde, preferentemente, está enlazado.

Especialmente preferente es cuando el marcado permite la medida del sustrato mediante radiactividad, fluorescencia, luminiscencia o el cambio de espectro o color. En un tipo de realización especialmente preferente la medida del sustrato se realiza en un contador de escintilación después de añadir líquido de escintilación a la membrana de placa filtrante. Con esto se quiere decir, en especial, que, en un paso particularmente preferente del procedimiento, después de la segregación según el paso (b) la membrana de placa filtrante, sobre la que aparece la arginina marcada, se seca bien por separado o bien como placa microtitulada que comprende varias membranas de placa filtrante, por ejemplo en un armario de secado. A continuación, las placas microtituladas (MTP) se sellan por su lado posterior, las membranas filtrantes individuales, por el contrario, se colocan en recipientes de escintilación. A continuación se vierte el líquido de escintilación sobre las membranas filtrantes, se cierran las mismas (MTP sellado en su lado anterior) y en un contador, un contador de escintilación, se realiza el recuento.

En otra variante del procedimiento, los pasos (a) y (b) no se realizan en el mismo recipiente de reacción. También esta variante es especialmente adecuada para HTS. Con esto se quiere decir, en especial, que la formulación de incubación del paso (a) se lleva a otro recipiente que contiene, por ejemplo, la membrana de placa filtrante y que se realiza en el paso (b). Así, por ejemplo, se llevan paralelamente las formulaciones de incubación desde una placa microtitulada a otra placa microtitulada cuyos pocillos tienen en el fondo una membrana de placa filtrante fijada por un tamiz permeable al líquido. Aquí puede tener lugar, entonces, por ejemplo, la segregación mediante la aplicación de una presión negativa en el lado inferior de la membrana de placa filtrante, donde se aspira el medio de incubación junto con, por ejemplo, la citrulina marcada, y la arginina marcada permanece sobre o en la membrana de placa filtrante en el fondo de los pocillos.

Otra variante especialmente interesante del procedimiento según la invención prevé que después de la segregación según el paso (b) se realice un paso de lavado, preferentemente \leq 3 veces, especialmente 1 vez, preferentemente con agua o con una solución tampón, especialmente con un volumen \leq 10 ml, de preferencia \leq 5 ml, en especial \leq 3 ml, en particular \leq 2 ml. El volumen del líquido de lavado se refiere a cantidad por cada formulación de incubación separada (paso b) según el paso a), preferentemente, por tanto, por cada recipiente de reacción. También esto puede mejorar la aplicación del HTS y permitir, en especial una mayor precisión del ensayo. Aquí, el volumen de lavado puede ser claramente mayor que el volumen de los recipientes de reacción si paralelamente a la adición del líquido de lavado, éste se extrae de nuevo, por ejemplo mediante succión. Si este no es el caso, el volumen de las fracciones de lavado corresponde, preferentemente, al volumen máximo del recipiente de reacción en el que se realiza el paso (b).

Un tipo de ejecución preferente del procedimiento prevé que como NO-sintasa se utilice una NO-sintasa recombinante, siendo especialmente específica del subtipo NO-sintasa, preferentemente una eNO-S, iNO-S ó nNO-S específica humana, de ratas o ratones, en especial también \alpha- o \beta-nNO-S. Por NO-S recombinante se entiende una NO-S producida mediante manipulación genética tecnológica. Por ejemplo, partiendo de la secuencia de un gen clonado de NO-S se crea un constructo de ADN recombinante, por ejemplo un vector de clonación o mejor de expresión. Con éste se transfecta entonces una célula que expresa a continuación el gen bajo condiciones de cultivo especiales y forma la proteína, la NO-S recombinante. En este contexto, los términos siguientes significan:

-: Constructo de ADN (recombinante): designación general para cualquier tipo de moléculas de ADN producidas por unión in vitro de moléculas de ADN.

-: Vector de clonación: designación general para moléculas de ácido nucleico que sirven como portadoras de genes extraños o partes de estos genes.

-: Vector de expresión: designación para vectores de clonación de construcción especial que, tras su introducción en una célula huésped adecuada, permiten la trascripción y traducción del gen extraño clonado en el vector.

Especialmente preferente es cuando la NO-sintasa utilizada en el procedimiento según la invención es un extracto bruto (en lo que sigue algunas veces llamado extracto bruto de NO-S) procede de tejido de vertebrados, en especial de mamíferos. Aquí, el extracto bruto puede obtenerse de roedores y/o del SNC y/o puede ser un sobrante obtenido de un homogenado, especialmente el sobrante de un homogenado de cerebelo de rata o ratón. Aquí se toma tejido del SNC (sistema nervioso central) de un roedor, preferentemente de rata o ratón, en especial el cerebelo, éste se homogeneiza, se centrifuga y el sobrante se utiliza como extracto bruto neuronal de NO-S. Un ejemplo de un procedimiento de producción correspondiente se describe en los Ejemplos.

Además es preferente que la cantidad de proteína utilizada en la formulación de incubación del procedimiento según el paso (a) por cada mm^{2} de la membrana de placa filtrante empleada en el paso (b) sea como máximo \leq 5,0 \mug, especialmente \leq 2,5 \mug, en particular \leq 1,0 \mug. Las cantidades de proteínas indicadas son valores basados en la experiencia por encima de los cuales puede quedar obturada la membrana de placa filtrante durante la segregación, especialmente durante la eliminación por aspiración.

La NO-S purificada (también por ejemplo la enzima recombinante) necesita, además del sustrato y la coenzima NADPH, otras coenzimas/cofactores, como tetrahidrobiopterina (BH_{4}), FAD, FMN, calmodulina (CaM) y Ca^{++} (A.J. Hobs, A. Higgs, S. Moncada, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 39, 191, 1999). Por esta razón, en el procedimiento según la invención es preferente en primer lugar que se añadan a la formulación de incubación del paso a) cofactores o bien coenzimas y/o NADPH. En especial, a la formulación de incubación se pueden añadir calmodulina, Ca^{2+}, tetrahidrobiopterina, FAD y/o FMN.

Para mantener el coste de un HTS lo más bajo posible, como alternativa también se puede trabajar con los extractos brutos de NO-S mencionados, renunciando a la adición de una gran parte de las coenzimas arriba mencionadas. Es decir, al utilizar el extracto bruto de NO-S neuronal antes citado se puede renunciar a la utilización de BH_{4}, CaM, FAD y FMN. Por esta razón es especialmente preferente que al utilizar el extracto bruto de NO-S arriba descrito se añadan a la formulación de incubación NADPH y Ca^{2+}, en especial, como únicos cofactores o coenzimas. Precisamente esta variante es particularmente económica.

Además, en el procedimiento según la invención es preferente que la formulación de incubación se prepare en una solución tampón como medio de incubación y también que la incubación tenga lugar en el paso (a) a temperatura ambiente, 37ºC, 25ºC, 10ºC ó 4ºC, en especial a temperatura ambiente.

Además, es preferente que la segregación según el paso (b) tenga lugar 1-600 min, en especial 3 - 120 min, en particular 5 - 60 min después del inicio de la incubación en el paso (a). Estos tiempos dependen particularmente de la actividad de la NO-S utilizada.

Una forma especialmente preferente para llevar a cabo el procedimiento según la invención es la adecuada para HTS (High-Throughput-Screening), particularmente sencilla, reproducible y también fácilmente automatizable.

Un criterio decisivo para la calidad de un procedimiento de ensayo (assays), especialmente para un HTS, es el ratio "signal-to-noise", es decir el ratio entre las señales de medida bajas y el promedio del ruido de fondo (sin señal). En este caso habría que buscar una relación especialmente grande. Este es el caso de los procedimientos según la invención. Estos muestran, especialmente en los tipos de realización preferentes, un ratio "signal-to-noise" \geq 4, especialmente \geq 5, en particular \geq 6 ó \geq 10.

Es especialmente preferente que el procedimiento sirva para la medida de la actividad de NO-sintasa y/o la identificación de moduladores de NO-sintasa, especialmente activadores o inhibidores, cuando se trata de un procedimiento según la invención, muy en particular, cuando se trata de procedimientos dentro del marco de un HTS (high-throughput-screening).

Los siguientes Ejemplos y Figuras pretenden explicar la invención sin que el objeto de ésta se limite a los mismos.

Figuras y Ejemplos Figuras

La Figura 1 muestra gráficamente el resultado obtenido de un "Screening-Assay" (ensayo de filtración) según el Ejemplo 4 y corresponde a la Tabla 3. Los ejes X e Y corresponden a la subdivisión alfanumérica de una placa microtitulada de 96 pocillos y el eje Z a los "corrected counts per minute" (ccpm) (recuentos corregidos por minuto) medidos, a las desintegraciones radiactivas corregidas en el valor cero y el factor quench, contadas en el contador ("counter").

Ejemplo 1 Procedimiento general para un ensayo HTS-NO-S

En el ensayo HTS-NO-S se utiliza como sustrato arginina radiactiva. El volumen de ensayo puede seleccionarse según el tipo de placa microtitulada (MTP) en el rango entre 25 \mul y 250 \mul. Dependiendo de la fuente de enzimas utilizada se añaden cofactores y coenzimas. La incubación de las formulaciones en esta placa microtitulada (MTP de ensayo) según el paso (a) se realiza a temperatura ambiente y requiere, según la actividad enzimática empleada (unidades) entre 5 y 60 minutos. Al final de la incubación (paso (a)) se coloca la placa en un recogedor de células equipado con MTP que tiene como fondo filtrante una membrana de intercambio catiónico (MTP filtrante). Todas las fórmulas del ensayo MTP se llevan a esta MTP filtrante y se aspiran a través de una placa filtrante de intercambio catiónico, un filtro de papel cargado con grupos fosfato. La MTP filtrante se lava a continuación con una solución tampón o con agua. De esta manera queda ligado el sustrato de arginina restante en el intercambiador catiónico, mientras que la citrulina radiactiva formada enzimáticamente se elimina por lavado. Después de secar la MTP filtrante y después de añadir líquido de escintilación es posible recontar la arginina enlazada en un contador de escintilación. Una reacción de NO-S no inhibida se refleja en una radiactividad reducida. Una reacción enzimática inhibida significa que la arginina radiactiva no ha sido transformada. Es decir, en el filtro se encuentra una radiactividad alta.

El ensayo puede realizarse con una concentración de sustrato muy pequeña (por ejemplo 50 nM). También bajo estas condiciones el ratio "signal to noise" aún está situado por encima de 6. Al utilizar concentraciones de sustrato superiores puede alcanzarse una relación superior a 10. Debido a este procedimiento extremadamente sencillo (el contenido de una MTP de ensayo solamente es aspirado a través de una placa filtrante que contiene un intercambiador catiónico (en la MTP filtrante), cuya radiactividad se mide entonces) se pueden filtrar por cada instalación HTS existente varios cientos de miles de compuestos de una librería en pocos días.

Ejemplo 2 Ejemplos de materiales utilizados

- Monoclorhidrato de L-[2, 3, 4-^{3}H]-arginina; Nº de referencia NET-1123, NEN

- CaCl_{2} libre de agua; nº de referencia 2388.1000; Merck

- 1,4-ditiotreitol (DTT), nº de referencia 708984; ROCHE

- Na_{2}EDTA-dihidrato; nº de referencia 03680; FLUKA

- HEPES, nº de referencia H-3375; SIGMA

- NADPH, sal tetrasódica; nº de referencia 1585363; ROCHE

- TRIS; nº de referencia 93349; FLUKA

Tampón para la preparación de enzima:

: 50 mM Tris-HCl con 1 mM EDTA: el pH del tampón se ajusta a 7,4 a 4ºC

Tampón (medio) de incubación:

: 50 mM HEPES con 1 mM de EDTA; 1,25 mM CaCl_{2} y 1 mM ditiotreitol.

: El pH del tampón se ajusta a 7,4 a 25ºC

Medio de lavado: H_{2}O

Ejemplo 3 Preparación de la enzima

Como tejido de partida se utilizan cerebelos de rata. Por cada cerebelo de rata se añade 1 ml de solución tampón para la preparación de la enzima (4ºC). Se anestesian y sacrifican los animales, se obtiene un preparado del tejido del cerebelo y se desintegra con un homogeneizador Polytron durante 1 minuto a 6.000 rpm.

: \downarrow

Centrifugado a 4ºC durante 15 minutos a 20.000 g

: \downarrow

Decantación del sobrante y congelación por fracciones a -80ºC (desechar el precipitado)

El sobrante del tejido que contiene nNO-S es estable durante mucho tiempo bajo estas condiciones de almacenamiento, no obstante, debería descongelarse solamente una vez y no congelarse de nuevo.

Ejemplo 4 Ejemplo para un ensayo HTS-NO-S según los Ejemplos 1 a 3 a) Formulación de incubación (paso (a))

Se utilizan MTPs de 96 pocillos con una capacidad \leq 250 \mul por pocillo.

Secuencia de pipeteado, véase Tabla 1.

TABLA 1

101

Después de finalizar el proceso de pipeteado se coloca una tapa sobre esta MTP (MTP de ensayo). Se incubación a 25ºC, lo que corresponde a temperatura ambiente (RT), durante 5-60 minutos, según la cantidad y actividad de la enzima utilizada.

b) Paso de aspiración (paso (b))

A continuación se transfiere el contenido de la MTP de ensayo, por ejemplo con ayuda de un recogedor de células de 96 pocillos, a una MTP de intercambio catiónico de 96 pocillos (MTP filtrante) y se aspira. A continuación se realiza un único lavado con 200 ml de H_{2}O (de una cubeta).

c) Paso de medida (paso (c))

Después se seca la placa durante 1 hora a 60ºC en un armario de secado. Se sella el lado del fondo con precisión mediante un "back seal" (junta hermética posterior) desde la parte inferior. A continuación, se añaden con una pipeta 35 \mul del escintilador por pocillo. Se sella ahora la parte superior de la placa con un "top seal" (junta hermética superior). Después de un tiempo de espera de 1 hora se puede medir la placa en un contador \beta (la medida también se puede realizar mucho más tarde puesto que la señal de medida permanece estable).

En el método HTS es recomendable unir, antes de iniciar el paso de pipeteado, el medio de incubación, la solución de NADPH y de enzimas para no tener que realizar tres pipeteados separados, que requieren más tiempo. El volumen de ensayo también se puede reducir con las mismas concentraciones.

Ejemplo 5 Utilización de un procedimiento según los Ejemplos 2 - 4 en el filtrado

Se utilizaron:

TABLA 2

102

\newpage

Sustancias de ensayo:	1 x 10^{-5}M en la formulación
Estándar interno:	7-nitroindazol, 1 x 10^{-5} en la formulación
NADPH:	0,5 mM en la formulación
[^{3}H]-sustrato:	50 nM en la formulación
Tiempo de incubación:	30 minutos a temperatura ambiente

Todos los demás parámetros y pasos del procedimientos son según se ha indicado anteriormente (véase Ejemplo 4).

La Tabla 3 muestra una serie de ensayos en la que se ensayaron 80 sustancias (posiciones A2-A11; B2-B11; C2-C11; D2-D11; E2-E11; F2-F11; F2-G11 y H2-H11). Aquí la subdivisión alfanumérica corresponde a la de una placa microtitulada de 96 pocillos y se indican las desintegraciones radiactivas recontadas en el contador, corregidas en el valor cero y el factor quench, unidades de medida "corrected counts per minute" ccpm.

Las formulaciones completas, pero sin enzima, indican al 100% el contenido inicial de [^{3}H]-arginina ("max" = posiciones A1; B1; C1; A12; B12; C12).

Las formulaciones completas (con enzima) muestran la conversión en [^{3}H]-citrulina y NO debido a que el contenido de [^{3}H]-arginina se ha reducido ("min" = contenido de [^{3}H]-arginina mínimo = reacción enzimática sin inhibir; posiciones D1, E1, F1; D12; E12 y F12). Esto, sin embargo, puede superarse con los activadores de NO-S puesto que ahí se convierte todavía más arginina que con la enzima sin modular de manera que resta todavía menos radiactividad en el filtro.

Como estándar interno (referencia) se utilizó el inhibidor de NO-S 7-nitroindazol en una concentración de 1 x 10^{-5} M ("Ref" = G1; H1; G12 y H12).

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(Tabla pasa a página siguiente)

2

\newpage

De los 80 compuestos ensayados, 3 muestran una inhibición de NO-S (posiciones A2; C2 y B7; N = 1).

El valor medio para la sustancia de referencia, 7-nitroindazol (= estándar interno, 1 x 10^{-5}M en la fórmula) es:

\overline{x} = 12697 \pm 1050 \ ccpm \ (\overline{x} \ \pm SD; N=4)

Esta concentración de 7-nitroindazol ha sido seleccionada intencionadamente de manera que se encuentre en el rango de aproximadamente un 50% de inhibición.

El valor medio de los datos "máx" (sin enzima, valor de referencia para el 100% de [^{3}H]-arginina) es como sigue:

\overline{x} = 19746 \pm 607 \ ccpm \ (\overline{x} \ \pm SD; N=6)

El valor medio de los datos "min" (reacción enzimática sin inhibición) da como resultado la siguiente radiactividad:

\overline{x} = 3 158 \pm 334 \ ccpm \ (\overline{x} \ \pm SD; N=6)

Por tanto, en este ejemplo el rango total de medida es de 16588 ccpm (19746 - 3158 ccpm).

Ejemplo 6 Medida de los valores IC50 de diferentes sustancias de referencia con uno de los métodos según la invención y comparativa con la medida de citrulina según la técnica usual actual mediante cromatografía de columna según D.S. Bredt y S.H. Snyder, Proc. Natl. Acad. Sci 87, 682 (1990)

La medida de citrulina mediante cromatografía de columna se realizó según la descripción de D.S. Bredt y S.H. Snyder, Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 682-685 (1990), donde el sustrato [^{3}H]-arginina estaba presente en la formulación en una concentración de 50 nM y la enzima era nNO-S aislada de cerebelo de rata tal como se describe en el Ejemplo 3. La segregación se realizó por medio de cromatografía de columna.

El procedimiento según la invención correspondía al procedimiento según el Ejemplo 4, donde también aquí el [^{3}H]-sustrato, es decir la [^{3}H]-arginina, estaba presente en la formulación en una concentración de 50 nM y la enzima era nNO-S aislada de cerebelo de rata según se describe en el Ejemplo 4. La segregación se realizó según la invención, a través de placas multitituladas de intercambio catiónico de 96 pocillos (MTP/MTP filtrante).

Como sustancias de ensayo se utilizaron los siguientes inhibidores de NO-S conocidos para la determinación de los valores IC50 en diferentes concentraciones en ambos ensayos a comparar:

\bullet 7-nitroindazol

\bullet 1-(2-trifluorometilfenil)imidazol (= TRIM)

\bullet N^{G}-monometil-L-arginina (= L-NMMA)

\bullet N5-(1-imino-3-butenil)-L-ornitina (= vinil-L-NIO)

\bullet N-[3-(aminometil)bencil]acetamidina (= 1400W)

\bullet N5-[iminopropilamino)metil]-L-ornitina (= N-Pr-L-Arg)

Los resultados se pueden ver en la Tabla 4 siguiente.

TABLA 4

103

Como se puede ver en la Tabla 4, los valores IC50 medidos con los dos métodos diferentes están muy próximos y se diferencian en las 6 sustancias, incluso en el caso más desfavorable, únicamente en un factor 2,4. Esto constituye una prueba clara de que ambos métodos son totalmente adecuados para la determinación del IC50 y que, por tanto, el procedimiento según la invención es un procedimiento muy válido para la determinación de la inhibición de NO-S, siendo perfectamente comparable en cuanto a calidad con los métodos estándar conocidos y mucho más costosos debido a la cromatografía de columnas, el método de citrulina según Bredet y Snyder (1990). En vista del hecho de que el procedimiento según la invención es mucho más sencillo, favorable e incluso capaz de HTS, el procedimiento según la invención constituye una gran ventaja.

Claims

1. Procedimiento para medir la actividad NO-sintasa con los siguientes pasos de procedimiento:

(a): Incubación de la NO-sintasa con arginina marcada como sustrato en un recipiente de reacción.

(b): Segregación de la arginina marcada de la citrulina marcada que eventualmente se ha producido como producto de la reacción enzimática, en un momento en el que aumenta la concentración de citrulina.

(c): Medida de la cantidad de la correspondiente arginina separada,

caracterizado porque la segregación se realiza a través de una membrana de placa filtrante de intercambio catiónico.

2. Procedimiento para la identificación de moduladores de NO-sintasa con los siguientes pasos del procedimiento:

(a): Incubación de una sustancia con NO-sintasa y arginina marcada como sustrato a ensayar en, como mínimo, un recipiente de reacción.

(c): Medida de la cantidad de la arginina correspondiente separada,

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el procedimiento sirve para la identificación de un activador o inhibidor, de preferencia un inhibidor, de la NO-sintasa.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque durante la segregación de acuerdo con el paso (b) (tal como se describe en la reivindicaciones 1 ó 2) el medio de incubación se elimina del recipiente de reacción.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque el medio de incubación se elimina en gran medida, especialmente casi por completo, de preferencia completamente.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado porque la arginina marcada se separa del medio de incubación.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque durante la segregación de acuerdo con el paso (b) (según se describe en las reivindicaciones 1 ó 2) se separan de la arginina marcada, además, los cofactores o las coenzimas, la NO-sintasa, NO y los productos derivados y/o la NO-sintasa.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque las membranas de placa filtrante son filtros de papel o textiles o son de otros materiales sólidos porosos o con perforaciones, como por ejemplo metal, vidrio o cerámica o contienen estos materiales.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque los grupos funcionales para el intercambio catiónico están unidos con las membranas de la placa filtrante.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 8 ó 9, caracterizado porque los grupos funcionales del intercambiador catiónico son grupos fosfato, carbonato, fosfonato, sulfato y/o sulfonato, de preferencia grupos fosfato.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque las membranas de placa filtrante son filtros de papel con un espesor de 10,00 mm a 0,10 mm, de preferencia 1,00 mm a 0,15 mm, especialmente 0,50 mm a 0,20 mm, en particular 0,23 mm.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque las membranas de placa filtrante son intercambiadores de cationes con una capacidad de intercambio \geq 1,0 \muEq/cm^{2}, especialmente \geq 10,0 \muEq/cm^{2}, de preferencia \geq 18,0 \muEq/cm^{2}.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el paso (a) (según se describe en las reivindicaciones 1 ó 2) se realiza de forma paralela en varios recipientes de reacción prácticamente de forma simultánea, de preferencia simultáneamente, y/o porque el paso b) (según se describe en las reivindicaciones 1 ó 2) se realiza paralelamente en varios recipientes de reacción casi de forma simultánea, de preferencia simultáneamente.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque los recipientes de reacción están interconectados, porque se trata, especialmente, de pocillos de una placa microtitulada.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque la placa microtitulada tiene < 96 pocillos, de preferencia 24 ó 48 pocillos, ó \geq 96 pocillos, especialmente 96, 384, 864 ó 1536 pocillos.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque los recipientes de reacción para el paso (a) y/o el paso (b) (según se describe en las reivindicaciones 1 ó 2) tienen un volumen de capacidad \leq 2 ml, especialmente \leq 1 ml, de preferencia \leq 1 ml, \leq 800 \mul, \leq 350 \mul, \leq 300 \mul, \leq 250 \mul, \leq 200 \mul, \leq 150 \mul, \leq 100 \mul, \leq 50 \mul, \leq 30 \mul ó \leq 5 \mul.

17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque la segregación se realiza de acuerdo con el paso (b) (según se describe en las reivindicaciones 1 ó 2) mediante la aspiración del medio de incubación del paso (a) a través de la membrana de placa filtrante.

18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque después de la segregación de acuerdo con el paso (b) (según se describe en las reivindicaciones 1 ó 2) se desecha la fracción que contiene la citrulina marcada separada de la arginina marcada.

19. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque después de la segregación de acuerdo con el paso (b) (según se describe en las reivindicaciones 1 ó 2) la arginina marcada separada está presente sobre o en la membrana de placa filtrante.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, caracterizado porque la arginina marcada está unida a o en la membrana de placa filtrante.

21. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el marcado permite la medición de la arginina mediante medida de la radiactividad, fluorescencia, luminiscencia o cambios de espectro o de color.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado porque la medida de la arginina marcada se realiza mediante un contador de escintilación después de añadir líquido de escintilación sobre la membrana de placa filtrante.

23. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque el paso (a) y el paso (b) (según se describe en las reivindicaciones 1 ó 2) no se realiza en el mismo recipiente de reacción.

24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque después de la segregación de acuerdo con el paso (b) se lleva a cabo un paso de lavado, de preferencia \leq 3 veces, especialmente 1 vez, de preferencia con agua o con una solución tampón, especialmente con un volumen \leq 10 ml, especialmente \leq 5 ml, de preferencia de \leq 3 ml, particularmente \leq 2 ml.

25. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque como NO-sintasa se utiliza NO-sintasa recombinante.

26. Procedimiento según la reivindicación 25, caracterizado porque la NO-sintasa es específica de un subtipo, especialmente eNO-S, iNO-S ó nNO-S específica del ser humano, de rata o de ratón, especialmente también \alpha- o \beta-nNO-S.

27. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque la NO-sintasa utilizada es parte de un extracto bruto de tejido de vertebrados, preferentemente de mamíferos.

28. Procedimiento según la reivindicación 27, caracterizado porque el extracto bruto se ha obtenido de roedores y/o proviene del SNC y/o es el sobrante obtenido de un homogenado, especialmente el sobrante de un homogenado de cerebelo de rata o de ratón.

29. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 28, caracterizado porque la cantidad de proteína utilizada en la formulación de incubación, de acuerdo con el paso (a) (según se describe en las reivindicaciones 1 ó 2), por mm^{2} de membrana de placa filtrante utilizada en el paso b) ha de ser como máximo \leq 5,0 \mug, especialmente \leq 2,5 \mug, de preferencia \leq 1,0 \mug.

30. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado porque se añaden cofactores o coenzimas a la formulación de incubación de acuerdo con el paso (a) de las reivindicaciones 1 ó 2.

31. Procedimiento según la reivindicación 30, caracterizado porque a la formulación de incubación se añade NADPH.

32. Procedimiento según la reivindicación 30 ó 31, caracterizado porque a la formulación de incubación se añaden calmodulina, Ca^{2+}, tetrahidrobiopterina, FAD y/o FMN.

33. Procedimiento según una de las reivindicaciones 27 ó 28, caracterizado porque a la formulación de incubación se añaden NADPH y Ca^{2+}.

34. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 33, caracterizado porque se prepara la formulación de incubación de acuerdo con el paso (a) (según se describe en las reivindicaciones 1 ó 2) en un tampón como medio de incubación.

35. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 34, caracterizado porque la incubación en el paso (a) (según se describe en las reivindicaciones 1 ó 2) se realiza a temperatura ambiente, a 37ºC, 25ºC, 10ºC ó 4ºC, de preferencia a temperatura ambiente.

36. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 35, caracterizado porque la segregación de acuerdo con el paso (b) (según se describe en las reivindicaciones 1 ó 2) se realiza 1-600 min, especialmente 3 - 120 min, de preferencia 5 - 60 min después del inicio de la incubación según el paso (a).

37. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 36, caracterizado porque en el procedimiento se trata de un procedimiento HTS (High-Throughput-Screening).

38. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 37, caracterizado porque el procedimiento tiene un ratio señal-ruido ("signal-to-noise") \geq 4, especialmente \geq 5, de preferencia \geq 6 ó \geq 10.

39. Utilización de una membrana de placa filtrante de intercambio catiónico en un procedimiento que sirve para medir la actividad de NO-sintasa, donde la membrana de placa filtrante sirve para segregar la arginina marcada.

40. Utilización según la reivindicación 39, caracterizada porque el procedimiento sirve para medir la actividad de NO-sintasa y/o para la identificación de moduladores de NO-sintasa, de preferencia activadores o inhibidores.

41. Utilización según la reivindicación 40, caracterizada porque se trata de un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 38.

42. Utilización según una de las reivindicaciones 39 a 41, caracterizada porque el procedimiento se trata de un procedimiento dentro del marco de un HTS (high-throughput-screening).