ES2198514T3

ES2198514T3 - Cebadores y sondas para la deteccion de la hepatitis c.

Info

Publication number: ES2198514T3
Application number: ES97106534T
Authority: ES
Inventors: Robert M. Resnick; Karen K.Y. Young
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1991-08-27
Filing date: 1992-08-19
Publication date: 2004-02-01
Anticipated expiration: 2012-08-19
Also published as: GR3026312T3; DE69233083T2; ATE161291T1; CN1134666C; US5580718A; JP3790274B2; KR100280758B1; ATE241704T1; DK0529493T3; EP0529493B1; FI108731B; NO311730B1; CA2076793C; EP0787807A3; KR930004479A; EP0787807A2; IL102896A; FI923840L; DE69223562D1; PT787807E

Abstract

ESTA INVENCION PROPORCIONA SONDAS DE OLIGONUCLEOTIDO PARA DETECTAR ACIDOS NUCLEICOS DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C DE LAS CEPAS PROTOTIPO DE EE.UU., JAPON Y HCV-C, ASI COMO INICIADORES DE OLIGONUCLEOTIDO PARA AMPLIFICAR DICHOS ACIDOS NUCLEICOS. LA INVENCION TAMBIEN PROPORCIONA METODOS Y KITS PARA AMPLIFICAR Y DETECTAR DICHOS ACIDOS NUCLEICOS. LOS METODOS DE AMPLIFICACION INCLUYEN PREFERIBLEMENTE LA TRANSCRIPCION INVERSA DEL ARN GENOMICO VIRAL PARA CREAR CADN Y LA AMPLIFICACION SUBSECUENTE DEL CADN MEDIANTE LA REACCION DE CADENA DE POLIMERASA. A CONTINUACION PUEDEN UTILIZARSE SONDAS DE OLIGONUCLEOTIDO PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE ADN AMPLIFICADO MEDIANTE HIBRIDACION.

Description

Cebadores y sondas para la detección de la hepatitis C.

La presente invención proporciona cebadores y sondas mejorados para la detección del virus de la hepatitis C, un agente causante de la hepatitis no-A, hepatitis no-B. Dichos reactivos incluyen especialmente cebadores de oligonucleótidos tanto para la trascripción inversa del genoma del ARN vírico como para la subsiguiente amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa del ADNc así producido. Se proporcionan sondas de oligonucleótidos de secuencias específicas para la detección de las secuencias amplificadas del ácido nucleico del HCV. Los cebadores y sondas son de utilidad en el ensayo de diagnóstico para la detección de la infección por HCV. Este ensayo de diagnóstico tiene importantes aplicaciones tanto en el campo clínico como en el epidemiológico.

El virus de la hepatitis C (HCV) es uno de los virus entre un número desconocido de agentes responsables de la hepatitis no-A, no-B (NANBH). El HCV prototípico se identificó a partir de un clon de ADNc de un virus NANBH de la sangre, obtenido a partir del plasma de un chimpancé infectado, como describe Choo y col., 1989, Science 244: 359-362. Las secuencias de nucleótidos de los genes del HCV de este prototipo están descritas en la Patente Europea Publicación nº 318.216; 388.232 y 398.748. La secuencia de nucleótidos del genoma del HCV se dio a conocer y se comparó con virus afines por Choo y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451-2455.

Desde entonces se han dado a conocer las secuencias de otras cepas. El genoma del HCV muestra un alto grado de heterogeneidad en las secuencias de ácidos nucleicos de los aislados entre sí. El aislamiento del ADNc a partir del genoma de ARN del HCV fue publicado por Kubo y col., 1989, Nuc. Acids Res. 17: 10367-10372. Los autores construyeron un cebador de trascripción inversa basado en la secuencia dada a conocer por Choo y col., 1989, ver más arriba. El fragmento del genoma del HCV aislado mostró el 79,8% de homología con la secuencia del HCV prototipo. Obtenidas mediante un protocolo similar se dieron a conocer las secuencias de tres regiones diferentes por Takeuchi y col., 1990, Gene 91: 287-291. La homología de las secuencias con la secuencia del prototipo se encontró que era baja, a saber, el 73,5% para una de las regiones.

Kato y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9524-9528, dio a conocer la secuencia genómica del HCV de una cepa aislada de pacientes japoneses. La secuencia mostró un 77,4% de homología con el genoma del HCV prototipo en la región comparada. Una secuencia de la región completa de codificación del genoma del HCV publicada en Takamizawa y col., 1991, J. Virol. 65 (3): 1105-1113 mostró un 77% de homología con la cepa del HCV prototipo.

En el Japón, dos cepas principales, designadas con el nombre de K1 y K2, han sido estudiadas tomando como base una región del genoma de 400 nucleótidos. Estas cepas tienen una homología de secuencias con la secuencia del prototipo de HCV, baja, del 67% (ver Enomoto y col., 1990, Biochem. Biophys. Res. Común. 170 (3): 1021-1025). La cepa K2 pudo ser además subdividida en dos grupos, designados con el nombre de Ka y Kb, con aproximadamente el 20% de variación de nucleótidos entre los grupos y aproximadamente el 5% de variación de nucleótidos dentro de cada grupo.

Se han dado a conocer similares de homología con la secuencia del HCV prototipo, por Kato y col., 1990, J. Clin. Invest. 86: 1764-1767. A partir de 15 pacientes, se amplificaron y secuenciaron fragmentos de DNAc. La porción amplificada, 37 nucleótidos correspondientes a las posiciones 3525-3561 de la secuencia del prototipo, mostraron un 68-78% de homología con la secuencia prototipo del HCV.

El ARN genómico del HCV puede ser detectado en sueros mediante la creación del ADNc a partir del ARN genómico, amplificando el ADNc por el método de reacción en cadena de la polimerasa, y a continuación, sondando con oligonucleótidos de la secuencia específica. A causa de la heterogeneidad de las secuencias entre las distintas cepas de HCV, los cebadores sondas deben ser probablemente específicos de las cepas, a no ser que pueda encontrarse una región en la cual la secuencia se conserve a través de las cepas. Una de estas regiones conservadas está en el extremo 5' del genoma del HCV.

La secuencia no codificadora del terminal 5' del genoma del HCV fue dado a conocer por primera vez por Okamoto y col., 1990, Japón J. Exp. Med. 60 (3): 167-177 y en EP-A-461.863. La comparación entre dos cepas sugirió que la secuencia no codificadora del terminal 5' se conserva de una cepa a otra. La naturaleza conservada de la secuencia no codificadora del terminal 5' del genoma del HCV fue descrita también por Han y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1711-1715. Se compararon las secuencias parciales de una región de 341 nucleótidos obtenida a partir de 11 distintos aislados de HCV a partir de individuos de cinco continentes. Siete secuencias tenían una completa homología con la secuencia del prototipo, las restantes cuatro mostraron entre uno y cinco desapareamientos de bases.

Okamoto y col., 1990, Japón J. Exp. Med. 60 (3): 215-222, describió cebadores para varias regiones del genoma del HCV, incluyendo la región no codificadora 5' conservada. Los cebadores seleccionados a partir de regiones conservadas amplificaron con éxito el ácido nucleico de la mayoría de las cepas ensayadas; los cebadores escogidos de regiones heterogéneas amplificaron el ácido nucleico de un pequeño juego de cepas. Sin embargo, la eficacia de la amplificación con estos cebadores fue baja. La referencia describe una amplificación por PCR de dos etapas; el segundo ciclo de amplificación se realizó sobre la región diana previamente amplificada, empleando un segundo juego de cebadores alojados dentro de la región amplificada por el primer juego de cebadores.

Una amplificación por PCR de dos ciclos de amplificación empleando dos juegos de cebadores fue descrita también por Garzón y col., 1990, Lancet 335: 1419-1422. Se amplificó una región que codifica una proteína no estructural (NS5). Debido a la heterogeneidad de las secuencias, hay secuencias de HCV no reconocidas por estos cebadores (ver Garson y col., 1990, Lancet 336:878:879). En consecuencia se ensayaron cebadores en la región no codificadora 5' conservada, pero para obtener una sensibilidad suficiente, fue todavía necesaria una amplificación de dos etapas empleando juegos de cebadores alojados. La amplificación de la región del terminal 5' empleando una amplificación de dos etapas con cebadores alojados fue también descrita por Kanai y col., 1990, Lancet 336: 245.

La amplificación empleando dos ciclos de amplificación con cebadores alojados no es solamente ineficaz sino también aumenta la probabilidad de contaminación. Los problemas de contaminación son ya bien conocidos en la especialidad; la apertura del tubo de reacción para cambiar los cebadores y añadir reactivos entre los pasos de amplificación, debe evitarse el máximo posible. El problema de la contaminación se agrava además por la necesidad de cambiar las condiciones de la reacción entre el paso de trascripción inversa inicial y la subsiguiente amplificación por PCR.

Existe además la necesidad para los oligonucleótidos del cebador para la amplificación de las secuencias del HVC, de que cada uno se escoja de una región conservada de forma que todas o casi todas las cepas sean amplificadas y los métodos de amplificación sean lo suficientemente eficaces para que la amplificación con un juego de cebadores sea suficiente. Existe también la necesidad de que los oligonucleótidos de la sonda para la detección del ADNc amplificado se escojan de una región conservada entre las dos regiones conservadas con las cuales hibridan los cebadores. Es necesario que el protocolo de la reacción y los reactivos permitan efectuar la trascripción inversa y la PCR empleando los mismos reactivos, eliminando con ello la necesidad de abrir el tubo de reacción durante el proceso de amplificación.

Además, el diez por ciento de los casos son no reactivos con la cápsida del prototipo y los antígenos de la cubierta, ver Chaudhary y col., 1991, J. Clinical Microbiology 29: 2329-2330 y Hosein y col., 1991, PNAS 8: 3647-3651. Así, el desarrollo de los diagnósticos basados en la PCR y antígenos codificados por nuevos aislados aumentará la dependencia de los ensayos de diagnóstico con base serológica. La presente invención cumple estas necesidades proporcionando cebadores, sondas y métodos para la detección del HCV.

Los cebadores específicos y las sondas de oligonucleótidos de la secuencia específica proporcionados, pueden ser empleados en una reacción en cadena de la polimerasa para la trascripción inversa homogénea (RT-PCR) que permite la amplificación y detección de las secuencias genómicas del ARN vírico. La eficacia de la amplificación empleando los cebadores y métodos de la presente invención elimina la necesidad de un segundo ciclo de la amplificación por PCR con cebadores incorporados, y la alta sensibilidad del ensayo resultante proporciona una fiable detección del ácido nucleico.

Un aspecto de la invención se refiere a cebadores de oligonucleótidos específicos. La invención proporciona composiciones que comprenden un cebador de oligonucleótidos para la amplificación del ácido nucleico del HCV, en donde dicho cebador es adecuado para la amplificación de una subsecuencia de un ácido nucleico a partir de una cepa o isotipo de HCV seleccionado del grupo formado por las cepas de Japón, US y C9. Los cebadores proporcionaron la función tanto de la trascripción inversa del genoma vírico de ATN como de la subsiguiente amplificación del ADNc producido empleando la reacción en cadena de la polimerasa. Los cebadores hibridan con las secuencias de las regiones conservadas del genoma del HCV y por lo tanto se unen a una gran variedad de cepas. La eficacia de la amplificación empleando los cebadores aportados es suficiente para eliminar la necesidad de un segundo ciclo de amplificación por PCR con cebadores alojados.

Otro aspecto de la invención se refiere a sondas capaces de detectar la presencia de ácido nucleico genómico del HCV independientemente de la cepa. Las sondas son complementarias de las regiones conservadas a través de las cepas. Los ensayos de diagnóstico empleando las sondas de la presente invención pueden detectar un gran número de cepas del HCV sin el compromiso de la especificidad. Así, la invención proporciona composiciones que comprenden una sonda de oligonucleótidos para la detección de la presencia de ácidos nucleicos del virus de la hepatitis C, en donde la sonda es adecuada para la detección de ácido nucleico de una cepa de HCV o una cepa variante seleccionada a partir del grupo formado por las cepas prototipo del Japón, US y C9.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a los kits. Estos kits presentan una gran variedad de formas y pueden contener uno o más reactivos de transcripciones inversas, amplificación, o detección, p. ej. cebadores, sondas, polimerasas, glucosilasas, tampones y nucleósidos trifosfatos.

Otro aspecto de la invención se refiere a métodos para la amplificación y detección del ARN del HCV.

La patente Europea nº 92114115.6 (EP-A-529493) proporciona un kit para la detección de ácido nucleico específico para un aislado de C9 de virus de hepatitis, comprendiendo el kit un compartimiento que contiene una sonda de ácido nucleico que se une sustancialmente a una subsecuencia de ácido nucleico del virus HCV-C9.

En adición, la patente Europea nº 92114115.6 proporciona composiciones que comprenden una secuencia de ácido nucleico viral sustancialmente homóloga a la SEQ ID nº 28. Un clon de cDNA, PHCV-C9, que contiene una secuencia viral de esta índole, denominada aquí aislado C9, se ha depositado en la American Type Culture Collection y tiene el Depósito nº 75265.

La patente Europea nº 92114115.6 también proporciona sondas oligonucleótidas y cebadores para la detección de una secuencia de ácido nucleico específica para el aislado de C9 y variantes relacionadas. Las sondas del invento comprenden, de preferencia, una subsecuencia seleccionada del grupo siguiente:

SEQ ID NO. 33 5'-TTGCCGGAAAGACTGGGTCCTTTC-3' (nt174-197)

SEQ ID NO. 34 5'-CAAAAGAAACACAAACCGCCGCCC-3' (nt374-397)

SEQ ID NO. 35 5'-CCAGCCCATCCCGAAAGATCGGCG-3' (nt527-550)

SEQ ID NO. 36 (MY160)5'-TGTCCGGTCATTTGGGCG-3' (nt216-233)

La patente Europea nº 92114115.6 proporciona además cebadores oligonucleótidos para la amplificación de secuencias de ácido nucleico específicas para un aislado de C9. Los cebadores del invento para amplificar específicamente la variante C9 y aislados relacionados comprende, de preferencia, una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo siguiente de cebadores de línea de entrada:

SEQ ID NO. 37 5'-AAACCCACTCTATGTCCGGTC-3' (nt204-224);

SEQ ID NO. 38 5'-GTACGCCGGAATTGCCGGAAA-3' (nt163-183); y

SEQ ID Nº. 39 5'-CCTCAAAGAAAAACCAAAAGA-3' (nt360-380);

para emplear con uno de los siguientes cebadores de la línea de salida:

SEQ ID NO. 40 5'-TGGCGTCTCCCACGCGGCTGG-3' (nt509-529); y

SEQ ID NO. 41 5'-CTTTCCCCAGGACCTGCCGGT-3' (nt 555-575).

La patente Europea nº 92114115.6 proporciona también sondas que enlazan sustancialmente secuencias del aislado C9 y previamente identificados aislados de Hepatitis C.

Las sondas de esta categoría incluyen:

SEQ ID NO. 42 KY150 5'-CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGT-3'.

La invención proporciona además sondas para la detección de secuencias de HVC distinto al C9, más concretamente la invención proporciona un procedimiento para la detección de la presencia de ácido nucleico genómico de la hepatitis C, en donde dicho ácido nucleico genómico de la hepatitis C se selecciona del grupo que consiste en las cepas prototipo del Japón, U.S. y C9, el cual procedimiento consta de: (a) amplificación de una subsecuencia del ácido nucleico; (b) mezcla del ácido nucleico amplificado con una sonda de oligonucleótidos específica para la subsecuencia en condiciones en las que la sonda se une a la subsecuencia para formar un híbrido dúplex estable; y (c) detección de los híbridos formados entre la subsecuencia y la sonda.

El método puede comprender además, antes del paso (a) el paso de amplificación de una subsecuencia de la secuencia específica del virus. La amplificación se efectúa de preferencia mediante el método de la reacción en cadena de la polimerasa. Los cebadores y las sondas antes citados se emplean de preferencia en los métodos de la invención.

Para ayudar a una mejor comprensión de la invención, se definen a continuación varias expresiones:

``Mezcla de reacción de la amplificación'' se refiere a una solución acuosa que comprende los varios reactivos empleados para amplificar un ácido nucleico diana. Estos incluyen: enzimas, tampones acuosos, sales, ácido nucleico diana y desoxinucleósidos trifosfatos. En función del contexto la mezcla puede ser bien una mezcla completa de reacción de amplificación o bien una mezcla incompleta.

``Sistema de reacción de amplificación'' se refiere a cualquier medio in vitro para la multiplicación de las copas de una secuencia diana de ácido nucleico. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a la, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ADN ligasa, QB ARN replicasa, y sistemas de amplificación basados en la trascripción. Estos implican los reactivos de amplificación múltiple y se describen con más detalle más adelante.

``Tubo(s) de la reacción de amplificación'' se refiere a un recipiente adecuado para contener los reactivos de amplificación. Generalmente, el tubo está construido de componentes inertes de forma que no inhiban o interfieran con el sistema de amplificación que se utiliza. Cuando el sistema requiere un ciclo térmico o un ciclo repetido de calentar y enfriar, el tubo debe ser capaz de resistir el proceso cíclico y, principalmente, ajustarse con precisión a los pocillos del termociclador.

``Reactivos de amplificación'' se refieren a los varios tampones, enzimas, cebadores, desoxinucleósidos trifosfatos (tanto convencionales como no convencionales), y cebadores empleados para llevar a cabo el procedimiento de amplificación seleccionado.

``Amplificación'', la cual se refiere principalmente a un aumento ``exponencial'' del ácido nucleico diana, se utiliza en este estudio para describir tanto un aumento lineal como exponencial del número de una secuencia diana seleccionada de ácido nucleico.

``Se une(n) substancialmente'' se refiere a la hibridación complementaria entre un oligonucleótido y una secuencia diana y abarca desapareamientos de poca importancia que pueden ser adaptados reduciéndola estricticidad de los medios de hibridación para lograr el cebado deseado para las polimerasas de la PCR o detección de la señal de hibridación.

La frase ``biológicamente puro'' se refiere al material que está substancialmente o esencialmente exento de componentes que normalmente lo acompañan como es el caso de su estado nativo. Por ejemplo, los anticuerpos purificados por afinidad o los anticuerpos monoclonales existen en un estado biológicamente purificado.

``Hibridación'' se refiere a la unión de dos ácidos nucleicos individuales monocatenarios mediante el apareamiento de las fases complementarias.

``Ácido nucleico'' se refiere a un polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido, tanto en forma mono como bicatenaria, el cual sino se limita de otra forma, abarcaría los análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden actuar de manera similar a los nucleótidos que se encuentran en la naturaleza.

``Polimerasas de nucleótidos'' se refiere a los enzimas capaces de catalizar la síntesis de ADN o ARN de los precursores nucleósidos trifosfatos. En las reacciones de amplificación de esta invención, las polimerasas son dependientes de un molde y típicamente añaden nucleótidos al extremo 3' de polímero que se está formando. Lo más preferido es que la polimerasa sea termoestable como se describe en la patente U.S. nº 4.889.818 y 5.079.352.

El término ``oligonucleótido'' se refiere a una molécula que comprende dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, tales como cebadores, sondas, fragmentos de ácido nucleico a detectar, y controles de ácido nucleico. El tamaño exacto de un oligonucleótido depende de muchos factores y la función o utilización última del oligonucleótido. Los oligonucleótidos pueden prepararse por cualquier método adecuado, incluyendo por ejemplo, el clonado y restricción de secuencias apropiadas y síntesis química directa mediante un método tal como el método del fosfotriéster de Narang y col., 1979, Meth. Enzymol. 68: 90-99; el método del fosfodiéster de Brown y col., 1979, Meth. Enzymol. 68: 109-151; el método de la dietilfosforamidita de Beaucage y col., 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862; y el método del soporte sólido de la patente U.S. nº 4.458.066.

El término ``cebador'' se refiere a un oligonucleótido, tanto natural como sintético, capaz de actuar como punto de iniciación de la síntesis del ADN en condiciones en las cuales se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario de una cadena de ácido nucleico, es decir, en presencia de cuatro distintos nucleósido trifosfatos y un agente de polimerización (es decir, ADN polimerasa o transcriptasa inversa) en un tampón apropiado y a temperatura adecuada. Un cebador es de preferencia un oligodesoxirribonucleótido monocatenario. La longitud apropiada de un cebador depende del empleo que se pretende del cebador pero típicamente oscila de 15 a 25 nucleótidos. Las moléculas cortas de cebadores requieren generalmente temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. Un cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde pero debe ser suficientemente complementario para hibridar con un molde.

En las versiones descritas de la invención, se proporcionan cebadores y sondas de secuencias específicas. Los expertos en la especialidad encontrarán evidente que con estas versiones puedan prepararse cebadores y sondas adicionales de una secuencia específica p. ej. la adición de nucleótidos en los extremos 5'ó 3', los cuales nucleótidos son complementarios a la secuencia diana o son incomplementarios a la secuencia diana. Siempre que las composiciones de cebadores sirvan como punto de iniciación para la extensión sobre secuencias diana, y siempre que los cebadores y sondas comprendan como mínimo 14 nucleótidos consecutivos contenidos dentro de las versiones ejemplificadas, estas composiciones forman parte del ámbito de la invención.

El término ``cebador'' puede referirse a más de un cebador, particularmente en el caso en donde hay alguna ambigüedad en la información respecto a uno o ambos extremos de la región diana que hay que amplificar. Por ejemplo, si una región muestra niveles significativos de polimorfismo en una población pueden prepararse mezclas de cebadores que amplificaran secuencias alternativas. Un cebador puede marcarse si se desea, incorporando al mismo una marca detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, son marcas de utilidad el ^{32}P, colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (como los que se usan corrientemente en el análisis ELISA), biotina, o haptenos y proteínas para los cuales hay disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales. Una marca puede también ser empleada para ``capturar'' el cebador, de forma que se facilita la inmovilización bien del cebador o del producto de extensión del cebador, tal como el ADN amplificado, sobre un soporte sólido.

``Sonda'' se refiere a un oligonucleótido que se une a través del apareamiento de las bases complementarias, a una subsecuencia de un ácido nucleico diana. Para un experto en la especialidad será evidente que las sondas se unirán típicamente substancialmente a secuencias diana que carecen de una completa complementariedad con la secuencia de la sonda, en función de la estricticidad de las condiciones de hibridación. Las sondas se marcan de preferencia directamente como p. ej. con isótopos, o se marcan indirectamente como p. ej. con biotina a los cuales se puede unir más tarde un complejo de estreptavidina. Analizando la presencia o ausencia de la sonda, se puede detectar la presencia o ausencia de la diana.

``Recombinante'' cuando se refiere a una sonda de ácido nucleico, se refiere a un oligonucleótido que está exento de proteínas nativas y ácido nucleico típicamente asociado con sondas aisladas a partir de las células, que contienen naturalmente la secuencia de la sonda como una parte de su genoma nativo. Las sondas recombinantes incluyen las obtenidas por medios de amplificación tales como la PCR y métodos genéticos de clonado en donde las bacterias se transforman con la sonda recombinante.

El término ``transcriptasa inversa'' se refiere a un enzima que cataliza la polimerización de los desoxirribonucleósidos trifosfatos para formar los productos de extensión del cebador que son complementarios de un molde de ácido rubonucleico. El enzima inicia la síntesis en el extremo 3' del cebador y continúa hacia el extremo 5' del molde hasta que la síntesis termina. Ejemplos de agentes de polimerización adecuados que convierten la secuencia del ARN diana en una secuencia complementaria copia del ADN (ADNc), son la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar y la polimerasa del ADN del Thermus thermophilus, una polimerasa de ADN termoestable con actividad de transcriptasa inversa.

Los términos ``oligonucleótido de una secuencia específica'' y ``SSO'' se refieren a oligonucleótidos que tienen una secuencia, llamada ``región de hibridación'', exactamente complementaria a la secuencia que se va a detectar, típicamente secuencias características de un alelo particular o variante, el cual es ``condiciones estrictas de hibridación de la secuencia específica'', hibridará solamente esta secuencia diana exactamente complementaria. Relajando la estricticidad de las condiciones de hibridación permitirá que se tolere el desapareamiento de las secuencias; el grado de desapareamiento tolerado puede controlarse mediante un ajuste adecuado de las condiciones de hibridación. En función de las secuencias que van a analizarse, pueden emplearse uno o más oligonucleótidos de la secuencia específica. Los términos ``sonda'' y ``sonda SSO'' se emplean intercambiándolos con ``SSO''.

Una ``secuencia específica de'' un aislado vírico particular, es una secuencia única del aislado, que es, no compartida por otros aislados previamente caracterizados. Una sonda que contenga una subsecuencia complementaria a una secuencia específica de un aislado típicamente no hibridará con la porción correspondiente del genoma de otros aislados en condiciones estrictas (p. ej. lavado del soporte sólido en 2xSSC, SDS 0,1% a 70ºC).

Un antígeno o epitopo específico de un aislado particular es uno que es único para el aislado y no es compartido por otros aislados previamente caracterizados. Una inmunoglobulina generada contra el antígeno o epitopo no interreaccionará con antígenos en aislados previamente caracterizados en ensayos estándar, como p. ej. ELISA.

El término ``substancialmente idéntico'' indica que dos o más secuencias de nucleótidos poseen en común una gran mayoría de sus secuencias. Generalmente, esto será por lo menos aproximadamente el 90% de su secuencia y de preferencia aproximadamente el 95% de su secuencia. Otra indicación de que las secuencias son substancialmente idénticas es si hibridan con la misma secuencia de nucleótidos en condiciones estrictas (ver p. ej. Sambrook y col., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1985). Las condiciones estrictas se determinan en función de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Generalmente las condiciones estrictas se eligen de forma que sean aproximadamente 5ºC por debajo del punto de fusión térmico (Tm) de la secuencia específica a una potencia iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (a una determinada potencia iónica y pH) a la cual el 50% de la secuencia diana híbrida con una sonda perfectamente pareja. Típicamente, las condiciones estrictas serán aquellas en las cuales la concentración de sales es por lo menos aproximadamente un 0,2 molar a pH 7 y la temperatura es por lo menos aproximadamente 60ºC.

``Subsecuencia'' se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una parte de una secuencia más larga de ácidos nucleicos.

El término ``región diana'' se refiere a la región de un ácido nucleico que se está analizando y que puede incluir una región polimórfica.

El término ``enzima polimerasa termoestable'' se refiere a un enzima que es relativamente estable al calor y cataliza la polimerización de nucleósido trifosfatos para formar los productos de extensión del cebador que son complementarios a una de las cadenas de ácidos nucleicos de la secuencia diana. El enzima inicia la síntesis en el extremo 3'del cebador y continua hacia el extremo 5' del molde hasta que la síntesis termina. Un enzima de polimerasa termoestable purificado se describe con más detalle en la patente U.S. nº 4.889.818.

La figura 1 representa una alineación de la secuencia C9 de la nueva variante de HCV, cuatro variantes afines, y los aislados del HCV prototipos del Japón y U.S.

El virus de la hepatitis C es un pequeño virus de RNA que contiene una molécula individual de RNA, de sentido positivo, de aproximadamente 10.000 nucleótidos de longitud. El genoma contiene un único, largo marco abierto de lectura que se cree se traduce en una única, gran poliproteína que a continuación es procesada. El marco abierto de lectura empieza en el nucleótido 343 (empleando el sistema de numeración a partir del virus prototipo) al que sigue una región no traducida (UTR). La secuencia 5'UTR se conserva relativamente y puede ser importante en la replicación y regulación vírica. El extremo 5' de la región modificadora también se conserva. Ciertos cebadores y sondas de la presente invención hibridan en la región conservada en el extremo 5' del genoma del HCV.

Las secuencias de oligonucleótidos de las regiones de hibridación de los cebadores y sondas de la invención se presentan más adelante. Los expertos en la especialidad se darán cuenta que una secuencia de oligonucleótidos empleada como región de hibridación de un cebador puede usarse también como región de hibridación de una sonda. La idoneidad de una secuencia de cebador para ser empleado como una sonda depende de las características de hibridación del cebador. Análogamente, un oligonucleótido empleado como una sonda puede usarse como un cebador.

Los oligonucleótidos representados en la Tabla 1 son cebadores o sondas de sentido positivo (línea de entrada). El listado está en el orden basado en la posición del extremo 3' del oligonucleótido cuando híbrida con un ácido nucleico genómico. Los oligonucleótidos que hibridan lo más cerca del extremo 5' del genoma son los primeros de la lista.

TABLA 1

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Oligo  \+  Listado  \+  Secuencias  \+
 Posición \cr  \+  Secuencias  \+ \+  (nt) \cr  KY65
\+ SEQ ID NO: 1 \+ 5'-CCAAGCTTCACCATAGATCACT \+
16-29\cr  KY79 \+ SEQ ID NO: 2 \+
5'-GGCGACACTCCACCATAGATCACT \+
6-29\cr  KY98 \+ SEQ ID NO: 3 \+
5'-CCAAGCTTAGATCACTCCCCTGTGAGGAACT \+
21-44\cr  KY96 \+ SEQ ID NO: 4 \+
5'-CCAAGCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCAT \+
50-74\cr  KY80 \+ SEQ ID NO: 5 \+
5'-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT \+
56-79\cr  KY144 \+ SEQ ID NO: 6 \+
5'-ACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT \+
54-79\cr  KY83 \+ SEQ ID NO: 7 \+
5'-CCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCA \+
99-128\cr  KY84 \+ SEQ ID NO: 8 \+
5'-GAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACC \+
149-175\cr  KY85 \+ SEQ ID NO: 9 \+
5'-ACCCGCTCAATGCCTGGAGAT \+
194-214\cr  KY67 \+ SEQ ID NO: 10 \+
5'-CGAAGCTTGCTAGCCGAGTAGT \+
236-250\cr  KY80 \+ SEQ ID NO: 11 \+
5'-CCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGT \+
227-250\cr  KY88 \+ SEQ ID NO: 12 \+
5'-GTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGT \+
251-275\cr  KY86 \+ SEQ ID NO: 13 \+
5'-GGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGT \+
288-317\cr  KY87 \+ SEQ ID NO: 14 \+
5'-GACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCG \+
482-505\cr}

La Tabla 2 incluye los oligonucleótidos que actúan como cebadores o como sondas de sentido negativo (línea de salida). Se utiliza la misma ordenación interna que en la tabla 1.

TABLA 2

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Oligo  \+  Listado  \+  Secuencias  \+
 Posición \cr  \+  Secuencias  \+ \+  (nt) \cr  KY153
\+ SEQ ID NO: 15 \+ 5'-CCCAACACTACTCGGCTAGCAGTCT \+
232-256\cr  KY149 \+ SEQ ID NO: 16 \+
5'-AAGGCCTTTCGCGACCCAACACTACT \+
245-278\cr  KY148 \+ SEQ ID NO: 17 \+
5'-CACAAGGCCTTTCGCGACCCAACACT \+
248-273\cr  KY78 \+ SEQ ID NO: 18 \+
5'-CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT \+
276-299\cr  KY145 \+ SEQ ID NO: 19 \+
5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT \+
276-301\cr  KY95 \+ SEQ ID NO: 20 \+
5'-GGGAATTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT \+
276-298\cr  KY100 \+ SEQ ID NO: 21 \+
5'-CGAGGTTGCGACCGCTCGGAAGT \+
483-505\cr  KY110 \+ SEQ ID NO: 22 \+
5'-AGGTTGCGACCGCTCGGAAGT \+
483-503\cr  KY109 \+ SEQ ID NO: 23 \+
5'-AATGCCATAGAGGGGCCAAGG \+
573-593\cr  KY111 \+ SEQ ID NO: 24 \+
5'-ATTGCCATAGAGGGGCCAAGG \+
573-594\cr  KY99 \+ SEQ ID NO: 25 \+
5'-CAGAATTCATTGCCATAGAGGGGCCAAGGAT \+
570-592\cr  KY68 \+ SEQ ID NO: 26 \+
5'-CAGAATTCGCCCTCATTGCCAT \+
586-599\cr  KY82 \+ SEQ ID NO: 27 \+
5'-CCCACCCCAAGCCCTCATTGCCAT \+
586-610\cr}

Varios oligonucleótidos poseen regiones de hibridación modificadas para incluir un sitio de restricción hacia el extremo 5' de la molécula. El sitio de restricción se introduce en el producto amplificado cuando uno de estos oligonucleótidos se emplea como cebador. Las condiciones iniciales de hibridación se escogen de tal forma que los desapareamientos de los pares de bases alrededor del sitio de restricción, son tolerados. Los desapareamientos cerca del extremo 5' son mejor tolerados que los cercanos al extremo 3' de un cebador. Los oligonucleótidos KY65 (SEQ ID NO. 1), KY98 (SEQ ID NO. 3), KY96 (SEQ ID NO. 4), y KY67 (SEQ ID NO. 10), son cebadores de línea de salida y contienen un sitio Hindi. Los oligonucleótidos KY95 (SEQ ID NO. 20), KY99 (SEQ ID NO. 26), y KY68 (SEQ ID NO. 27), son cebadores de línea de salida y contienen un sitio EcoRI. La incorporación de dichos sitios de restricción en el producto amplificado facilita el clonado del producto amplificado.

La patente Europea nº 92114115.6 proporciona también un nuevo aislado de HCV. La mayoría de aislados están relacionados con una o dos cepas de HCV. La primera es una cepa prototipo de U.S. descrita en la Publicación de la Patente Europea nº 318.216, 388.232, y 398.748. La segunda es una cepa japonesa descrita por Kato y col., (ver más arriba). Las dos cepas difieren hasta un 30% en regiones de genes no estructurales putativos, pero muestran una homología superior al 98% en la región 5' no traducida, y una homología del 92% en la porción 5' del gen de la cápsida o del núcleo.

El aislado de la patente Europea nº 92114115.6, al que se denomina C9, está más distantemente relacionado con ambas cepas. Este nuevo aislado, es un 93% similar a la región de consenso 5' no traducida. Tiene solamente una homología aproximadamente del 85% en la porción 5' de la región de genes del núcleo tanto con el prototipo o con la cepa japonesa (ver tabla 3, más adelante).

El aislado C9 (SEQ ID NO. 28) e isotipos afines, R45 (SEQ ID NO. 30), R43 (SEQ. ID NO. 32), R110 (SEQ ID NO. 31) y R116 (SEQ ID NO. 29) (ver figura 1), fueron clonados en los sitios de restricción RI/HindIII en pBS(+) adquirido en Stratagene como se ha descrito más arriba. Los virus variantes fueron clonados empleando dianas de ADN vírico purificado y métodos de clonación por PCR como se ha descrito en la patente U.S. nº 4.800.159. Los plásmidos resultantes se transformaron en el interior de la cepa E. coli DG101 (ATCC depósito nº 47043).

Las secuencias de nucleótidos a partir de la secuencia 5' no traducida y el extremo 5' del gen de la cápside del aislado prototipo C9 y cuatro aislados afines, se describen y representan a continuación en C9 (SEQ ID NO. 28), R116 (SEQ ID NO. 29), R45 (SEQ ID NO. 30), R110 (SEQ ID NO. 31), e R43 (SEQ ID NO. 32).Las secuencias representadas no incluyen los cebadores KY96 (SEQ ID NO. 4), y Ky99 (SEQ ID NO. 25), que se emplearon para facilitar la clonación de las secuencias víricas.

C9 - SEQ ID NO. 28

1	ACTGTCTTCA	CGCAGAAAGC	GTCTAGCCAT	GGCGTTAGTA	TGAGTGTCGT
51	ACAGCCTCCA	GGCCCCCCCC	TCCCGGGAGA	GCCATAGTGG	TCTGCGGAAC
101	CGGTGAGTAC	ACCGGAATTA	CCGGAAAGAC	TGGGTCCTTT	CTTGGATAAA
151	CCCACTCTGT	GTCCGGTCAT	TTGGGCGTGC	CCCCGCAAGA	CTGCTAGCCG
201	AGTAGCGTTG	GGTTGCGAAA	GGCCTTGTGG	TACTGCCTGA	TAGGGTGCTT
251	GCGAGTGCCC	CGGGAGGTCT	CGTAGACCGT	GCATCATGAG	CACAAATCCT
301	AAACCTCAAA	GAAAAACCAA	AAGAAACACA	AACCGCCGCC	CACAGGACGT
351	TAAGTTTCCG	GGTGGCGGCC	AGATCGTTGG	CGGAGTTTAC	TTGCTGCCGC
401	GCAGGGGCCC	CAGGTTGGGT	GTGCGCGCGA	CAAGAAAGAC	TTCCGAGCGA
451	TCCCAGCCGC	GTGGGAGACG	CCAGCCCATC	CCAAAAGATC	GGCGCTCCAC
501	CGGCAAGTCC	TGGGGAAAGC	CAGGAT

R116 -SEQ ID NO. 29

1	GGCGTTAGTA	TGAGTGTCGT	ACAGCCTCCA	GGCCCCCCCC	TCCCGGGAGA
51	GCCATAGTGG	TCTGCGGAAC	CGGTGAGTAC	GCCGAATTAC	CGGAAAGACT
101	GGGTCCTTTC	TTGGATAAAC	CCACTCTATG	TCCGGTCATT	TGGGCGTCCC
151	CCGCAAGACT	GCTAGCCGAG	TAGCGTTGGG	TTGCGAAAGG	CCTTGTGGTA
201	CTGCCTGATA	GGGTGCTTGC	GAGTGCCCCG	GGAGGTCTCG	TAGACCGTGC
251	ATCATGAGCA	CAGATCCTAA	ACCTCAAAGA	AAAACCAAAA	GAAATACAAA
301	CCGCCGCCCA	CAGGACGTCA	AGTTCCCGGG	TGGCGGCCAG	ATCGTTGGCG
351	GAGTTTACTT	GCTGCCGCGC	AGGGGCCCCA	GGTTGGGTGT	GCGCACAACA
401	AGGAAGACTT	CCGAGCGATC	CCAGCCGCGT	GGAAGACGCC	AGCCCATCCC
451	GAAAGATCGG	CGCTCCACCG	GTAAGTCCTG	GGGAAAGCCA	GGAT

\newpage

R45 - SEQ ID NO. 30

1	GGCGTTAGTA	TGAGTGTCGT	ACAGCCTCCA	GGCCCCCCCC	TCCCGGGAGA
51	GCCATAGTGG	TCTGCGGAAC	CGGTGAGTAC	GCCGAATTGC	CGGAAAGACT
101	GGGTCCTTTC	TTGGATAAAC	CCACTCTATG	TCCGGTCATT	TGGGCGTCCC
151	CCGCAAGACT	GCTAGCCGAG	TAGCGTTGGG	TTGCGAAAGG	CCTTGTGGTA
201	CTGCCTGATA	GGGTGCTTGC	GAGTGCCCAG	GGAGGTCTCG	TAGACCGTGC
251	ATCATGAGCA	CAAATCCTAA	ACCCCAAAGA	AAAACCAAAA	GAAACACAAA
301	CCGCCGCCCA	CAGGACGTTA	AGTTCCCGGG	TGGCGGCCAG	ATCGTTGGCG
351	GAGTTTACTT	GATGCCGCGC	AGGGGCCCCA	GGTTGGGTGT	GCGCGCGACG
401	AGGAAGACTT	CCGAGCGATC	CCAGCCGCGT	GGGAGACGCC	AGCCCATCCC
451	GAAAGATCGG	CGTTCCACCG	GCAAGTCCTG	GGGAAAGCCA	GGAT

R110 - SEQ ID NO. 31

1	GGCGTTAGTA	TGAGTGTCGT	ACAGCCTCCA	GGCCCCCCCC	TCCCGGGAGA
51	GCCATAGTGG	TCTGCGGAAC	CGGTGAGTAC	GCCGAATTGC	CGGAAAGACT
101	GGGTCCTTTC	TTGGATTAAC	CCACTCTATG	TCCGGTCATT	TGGGCGTCCC
151	CCGCAAGACT	GCTAGCCTAG	TAGCGTTGGG	TTGCGAACGG	CCTTGTGGTA
201	CTGCCTGATA	GGGTGCTTGC	GAGTGCCCCG	GGAGGTCTCG	TAGACCGTGC
251	ATCATGAGCA	CAAATCCTAA	ACCTCAAAGA	AAAACCAAAA	GAAACACAAA
301	CCGCCGCCCA	CAGGACGTCA	AGTTCCCGGG	AGGCGGTCAG	ATCGTTGGCG
351	GAGTTTACTT	GCTGCCGCGC	AGGGGCCCCA	GGTTGGGTGT	GCGCGCGACA
401	AGGAAGACTT	CCGAGCGATC	CCAGCCGCGT	GGGAGACGCC	AGCCCATCCC
451	GAAAGATCGG	CGCTCCACCG	GCAAGTCCTG	GGGAAAGCCA	GGAT

R43 - SEQ ID NO. 32

1	GGCGTTAGTA	TGAGTGTCGT	ACAGCCTCCA	GGCCCCCCCC	TCCCGGGAGA
51	GCCATAGTGG	TCTGCGGAAC	CGGTGAGTAC	ACCGAATTAC	CGGAAAGACT
101	GGGTCCTTTC	TTGGATAAAC	CCACTCTATG	TCCGGTCATT	TGGGCGTCCC
151	CCGCAAGACT	GCTAGCCTAG	TAGCGTTGGG	TTGCGAACGG	CCTTGTGGTA
201	CTGCCTGATA	GGGTGCTTGC	GAGTGCCCCG	GGAGGTCTCG	TAGACCGTGC
251	ATCATGAGCA	CAAATCCTAA	ACCTCAAAGA	AAAACCAAAA	GAAACACAAA
301	CCGCCGCCCA	CAGGACGTCA	AGTTCCCGGG	TGGCGGCCAG	ATCGTTGGCG
351	GAGTTTACTT	GCTGCCGCGC	AGGGGCCCCA	GGTTGGGTGT	GCGCGCGACA
401	AGGAAGACTT	CCGAACGGTC	CCAGCCGCGT	GGGAGGCGCC	AGCCCATCCC
451	AAAAGATCGG	CGCTCCACCG	GCAAGTCCTG	GGGAAAGCCA	GGAT

Los clones que contenían las secuencias víricas han sido depositados en la American Type Culture Collection, Baltimore, Maryland, como sigue:

Aislado	SEQ ID NO	Nombre del plásmido	ATCC depósito nº	Fecha del
				depósito
C9	29	pHCV-C9	75265	2 julio 1992
R110	32	pHCV-R110	75266	2 julio 1992

El plásmido pHCV-C9 contiene la secuencia C9 de la nueva variante. La alineación de las cuatro variantes afines con las secuencias C9 está representada en la figura 1. Las fuentes de los datos de las secuencias de los nuevos aislados fueron los siguientes: HCV-J1, HCV-J4 (Okamoto y col., 1990, Japón J. Exp. Med. 6(3): 167-177); HCV-J (Kato y col., 1990, Mol. Biol. Med. 7:495-501); HCV-BK (Takamizawa y col., 1991, J. Virol. 65: 1105-1113); y HCV-1 US-PT (Han y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1711-1715). La numeración está de acuerdo con Kato y col., 1990, Proc. Natl. Acd. Sci. USA 87: 9524-9528.

TABLA 3 Determinación de los nucleótidos y homología de la secuencia de aminoácidos del aislado C9 con el prototipo US (PT-HCV) y los aislados japoneses (J-HCV)

Secuencias	Aislado	PT-HCV	J-HCV
5' UTR
Nucleótido
(255)	C9	92,9%	92,9%
	J-HCV	98,8%	-
Núcleo
Nucleótido
(244)	C9	84,9%	85,1%
	J-HCV	92,1%	-
Aminoácido
(80)	C9	91,3%	90,0%
	J-HCV	98,7	-

La patente Europea nº 92114115.6 proporciona materiales y métodos para ensayos que son específicos para el aislado C9 y distinguir el aislado de otros aislados de la hepatitis. Estos métodos se basan en la hibridación del ácido nucleico con o sin la utilización de la PCR para amplificar las secuencias diana. En otras versiones, los métodos emplean inmunoglobulinas específicas del aislado C9.

Las secuencias de oligonucleótidos de los cebadores y sondas específicas del C9 están compendiadas en la tabla 4 que sigue a continuación.

TABLA 4

Sondas
SEQ ID NO. 36	MY160	5'-TGTCCGGTCATTTGGGCG-3'	(nt216-233)
SEQ ID NO. 33	(1)	5'-TTGCCGGAAAGACTGGGTCCTTTC-3'	(nt174-197)
SEQ ID NO. 34	(2)	5'-CAAAAGAAACACAAACCGCCGCCC-3'	(nt374-397)
SEQ ID NO. 35	(3)	5'-CCAGCCCATCCCGAAAGATCGGCG-3'	(nt527-550)
Cebadores de línea de entrada
SEQ ID NO. 37	(1)	5'-AAACCCACTCTATGTCCGGTC-3'	(nt204-224)
SEQ ID NO. 38	(2)	5'-GTACGCCGGAATTGCCGGAAA-3'	(nt163-183)
SEQ ID NO. 39	(3)	5'-CCTCAAAGAAAAACCAAAAGA-3'	(nt360-380)
Cebadores de línea de salida
SEQ ID NO. 40	(4)	5'-TGGCGTCTCCCACGCGGCTGG-3'	(nt509-529)
SEQ ID NO. 41	(5)	5'-CTTTCCCCAGGACCTGCCGGT-3'	(nt555-575)

El sistema de numeración empleado para la identificación de los nucleótidos está descrito en Kato y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., ver más arriba.

Un oligonucleótido, KY150 (SEQ ID NO. 42) es de utilidad para la detección tanto del aislado C9 como de los aislados del prototipo HCV conocidos anteriormente. Este oligonucleótido tiene la secuencia siguiente:

5'-CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGT-3'

Para los expertos en la especialidad será evidente que cualquier par de cebadores de la línea de entrada/línea de salida, indicados en la tabla 4, es adecuado para la amplificación específica del aislado C9 e isotipos afines. Será también evidente la selección de una sonda específica del C9 adecuada para la hibridación de la subsecuencia del ácido nucleico amplificado empleando como guía las posiciones del nucleótido indicadas en la tabla 4.

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En una versión preferida, los cebadores de la invención se emplean conjuntamente con una amplificación, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), del ácido nucleico diana. Debido a que el HCV es un virus de RNA, el primer paso de la amplificación es la síntesis de una copia del ADN (ADNc) de la región que hay que amplificar. La trascripción inversa puede efectuarse como un paso separado, o como se describe más adelante, en una reacción homogénea de la reacción en cadena de la polimerasa y de la trascripción inversa (RT-PCR), una modificación de la reacción en cadena de la polimerasa para la amplificación del ARN.

Aunque el procedimiento PCR es ya bien conocido en la especialidad (ver patente U.S. nº 4.683.195; 4.683.202; y 4.965.188), a continuación se facilita una información general sobre el mismo para una mayor claridad y plena comprensión de la invención para los no familiarizados el procedimiento PCR.

Para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana de una muestra, por el procedimiento PCR, la secuencia debe ser accesible a los componentes del sistema de amplificación. En general esta accesibilidad se asegura aislando los ácidos nucleicos a partir de la muestra. Se conocen en la especialidad una gran variedad de técnicas para extraer los ácidos ribonucleicos de las muestras biológicas. Por ejemplo, los descritos en Rotbart y col., 1989, en PCR Technology (Erlich ed., Stockton Press, Nueva York) y Han y col., 1987, Biochemistry 26: 1617-1625. Alternativamente, si la muestra es fácilmente disgregable, el ácido nucleico no necesita ser purificado antes de la amplificación con el método PCR, es decir, si la muestra está compuesta de células, en particular linfocitos o monocitos de sangre periférica, la lisis y la dispersión de los componentes intracelulares puede lograrse simplemente, suspendiendo las células en un tampón hipotónico.

El primer paso de cada ciclo de la PCR implica la separación del ácido nucleico dúplex. Por supuesto, si el ácido nucleico diana es monocatenario, es decir, ARN de una única cadena, no es necesario ningún paso de separación inicial durante el primer ciclo. Una vez las cadenas están separadas, el próximo paso de la PCR implica la hibridación de las cadenas separadas con cebadores que flanquean la secuencia diana. Los cebadores se extienden a continuación para formar copias complementarias de las cadenas diana. Para una amplificación PCR con éxito, los cebadores se seleccionan de forma que la posición a la cual cada cebador híbrida a lo largo de una secuencia dúplex sea tal que el producto de extensión sintetizado a partir de un cebador, cuando se separa del molde (complemento), sirve como un molde para la extensión del otro cebador. El ciclo de desnaturalización, hibridación y extensión, se repite tantas veces como es necesario para obtener la cantidad deseada de ácido nucleico amplificado.

En la versión preferida del procedimiento PCR, la separación de las cadenas se logra calentando la mezcla de reacción a una temperatura lo suficientemente alta durante un tiempo suficiente para ocasionar la desnaturalización del duplex, pero no para ocasionar una desnaturalización de la polimerasa (ver patente U.S. nº 4.965.188). Una desnaturalización por calor típica implica temperaturas que oscilan de aproximadamente 80ºC a 105ºC durante tiempos que van de segundos a minutos. Sin embargo, la separación de las cadenas, puede lograrse también por cualquier método adecuado de desnaturalización, incluyendo medios físicos, químicos o enzimáticos. La separación de las cadenas puede inducirse mediante una helicasa, por ejemplo, o un enzima capaz de presentar actividad helicasa. Por ejemplo, el enzima RecA tiene una actividad helicasa en presencia de ATP. Las condiciones de reacción adecuadas para la separación de las cadenas mediante helicasa ya es conocida en la especialidad (ver Khun Hoffmann-Berling, 1978, CSH-Quantitative Biology 43: 63-67; y Radding, 1982, Ann. Rev. Genetics 16: 405-436).

La extensión dependiente del molde, de los cebadores de la PCR, se cataliza mediante un agente de polimerización en presencia de cantidades adecuadas de cuatro desoxirribonucleósidos trifosfatos (típicamente dATP, dGTP, dCTP y dTTP) en un medio de reacción compuesto de sales apropiadas, cationes metálicos, y un sistema tampón de pH. Los agentes de polimerización adecuados son enzimas ya conocidos para catalizar la síntesis del ADN dependiente del molde. Debido a que la hepatitis C es un virus de ARN, el molde inicial para la extensión del cebador es el ARN. Son agentes de polimerización adecuados para la síntesis de una secuencia complementaria de ADN copia (ADNc), a partir del molde de ARN, la transcriptasa inversa (RT), tal como la RT del virus de la mieloblastosis aviar, la RT del virus de la leucemia del ratón de Moloney, o la polimerasa del ADN de Thermus thermophilus (Tth), una polimerasa de ADN termoestable, con actividad de transcriptasa inversa comercializada por Perkin Elmer. Típicamente, el molde genómico del duplex ARN/ADNc se desnaturaliza por el calor durante la primera desnaturalización un paso después del paso de la trascripción inversa inicial que deja la cadena del ADN disponible como un molde de amplificación. Las polimerasas adecuadas para emplear como un molde de ADN incluyen, por ejemplo, la E. Coli ADN polimerasa I o un fragmento Klenow, la T_{4} ADN polimerasa, la Tth polimerasa y la Taq polimerasa, una ADN polimerasa termoestable aislada del Thermus aquaticus y desarrollada y fabricada por Hoffmann-La Roche y comercializada por Perkin Elmer. El último enzima se usa ampliamente en la amplificación y secuenciación de los ácidos nucleicos. Las condiciones de la reacción para el empleo de la Taq polimerasa son ya conocidas en la especialidad y están descritas en Gelfand, 1989, PCR Technology, ver más arriba.

Cuando se amplifica el ARN, se efectúa un paso de transcripción inversa (RT) para crear una copia de ADN (ADNc) del ARN. La patente PCT publicada nº WO 91/09944 publicada en 11 julio 1991, describe una transcripción inversa a alta temperatura mediante una polimerasa termoestable que actúa también en la amplificación PCR. La RT a alta temperatura proporciona una mayor especificidad y eficacia del cebador. En una ``RT-PCR homogénea'' los mismos cebadores y polimerasa son suficientes tanto para los pasos de la transcripción inversa como para los pasos de la amplificación PCR, y las condiciones de la reacción están optimizadas de forma que ambas reacciones tengan lugar a la vez sin un cambio de reactivos. La ADN polimerasa del Thermus thermophilus, una polimerasa de ADN termoestable que puede actuar como una transcriptasa inversa, se emplea para todos los pasos de extensión del cebador, independientemente del molde. Los dos procesos pueden efectuarse sin tener que abrir el tubo para cambiar o añadir reactivos; solamente el perfil de la temperatura se ajusta entre el primer ciclo (molde de ARN) y el resto de los ciclos de amplificación (molde de ADN).

El extremo terminal 5' del genoma del HCV está previsto que tenga una estructura secundaria significativa que podría inhibir la transcripción inversa con una transcriptasa inversa tal como la RT del virus de la leucemia de ratón Moloney, interfiriendo la hibridación del cebador. Desgraciadamente aumentando la temperatura de la reacción para desnaturalizar la estructura secundaria, también se inactiva la mayoría de enzimas de transcriptasa inversa. El empleo de la actividad de la transcriptasa inversa de la ADN polimerasa del Thermus thermophilus recombinante (rTth), permite que la síntesis del ADNc tenga lugar a elevada temperatura sin inactivación de los enzimas. Los cebadores de la presente invención permanecen hibridados al molde de RNA a esta elevada temperatura de la transcripción inversa.

El método de la PCR puede efectuarse en una forma a base de pasos, en donde después de cada paso se añaden nuevos reactivos, en una forma en donde todos los reactivos se añaden simultáneamente, o en una forma de pasos parciales, en donde se añaden reactivos frescos o diferentes después de un número dado de pasos. Por ejemplo, si la separación de cadenas se induce mediante el calor y la polimerasa es sensible al calor, entonces, la polimerasa tiene que añadirse después de cada ciclo de separación de la cadena. Sin embargo, si por ejemplo, se emplea una helicasa para la desnaturalización o si se emplea una polimerasa termoestable para la extensión, entonces todos los reactivos pueden añadirse inicialmente o alternativamente, si las relaciones molares de los reactivos son consecuentes con la reacción, los reactivos pueden reponerse periódicamente a medida que van consumiéndose por la reacción de síntesis.

Los expertos en la especialidad ya saben que el proceso de la PCR se efectúa más corrientemente como un proceso automatizado con un enzima termoestable. En este proceso, la temperatura de la mezcla de reacción sigue un ciclo a través de una región de desnaturalización, una región de reasociación del cebador y una región de la reacción de extensión. Alternativamente, la temperatura de reasociación y la de extensión, pueden ser la misma. La RT-PCR descrita en los ejemplos emplea esta ciclación de la temperatura en dos pasos. Una máquina específicamente adaptada para emplear con un enzima termoestable está comercialmente disponible.

Los expertos en la especialidad están al corriente de los problemas de contaminación de una PCR por el ácido nucleico amplificado procedente de la amplificación de reacciones anteriores y no específicas. Un método para reducir estos problemas permite la degradación enzimática de cualquier ADN amplificado procedente de reacciones anteriores y reduce la amplificación no específica. La amplificación por PCR se efectúa en presencia de dETP en lugar de dTTP. El producto resultante de doble cadena, que contiene uracilo está sujeto a la degradación por la uracil-N-glucosilasa (UNG), mientras que el ADN normal que contiene timina, no se degrada por la ENG. Añadiendo UNG a la mezcla de reacción de amplificación antes de que empiece la amplificación, se degrada todo el ADN que contiene uracilo que podía servir de diana. Debido a que la única fuente de ADN que contiene uracilo es el producto amplificado de una reacción anterior, este método esteriliza eficazmente la mezcla de reacción, eliminando el problema de la contaminación procedente de reacciones anteriores (``carry over''). La misma UNG se vuelve temporalmente inactiva por el calor, de forma que los pasos de desnaturalización del procedimiento de amplificación sirven también para inactivar la UNG. Se forman por lo tanto nuevos productos de amplificación, si bien se incorpora uracilo, en un ambiente efectivamente exento de UNG y no se degradan.

Una versión preferida de la invención utiliza un método de RT/PCR homogénea que incorpora un paso de esterilización. Esta reacción de no adición, de un tubo, sirve para esterilizar la reacción RT-PCR previniendo la contaminación por reacciones anteriores y proporcionando un producto de PCR detectable amplificado a partir de una muestra que contiene un ARN diana. Este método esta ejemplificado en el ejemplo 6.

Aunque la versión preferida incorpora la amplificación por RT-PCR, la amplificación de secuencias diana de una muestra puede efectuarse por cualquier método conocido, tal como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación por transcripción, y replicación autosostenida de la secuencia, cada uno de los cuales proporciona la suficiente amplificación de forma que la secuencia diana puede ser detectada por hibridación del ácido nucleico con una sonda SSO. Alternativamente pueden emplearse métodos que amplifican la sonda a niveles detectables, tales como la amplificación de la Q\beta-replicasa. El término ``sonda'' abarca los oligonucleótidos de la secuencia específica empleados en los procedimientos anteriores; por ejemplo, los dos o más oligonucleótidos empleados en la LCR son ``sondas'' para los propósitos de la presente invención, aunque algunas versiones de la LCR requieren la ligación de las sondas para indicar la presencia de un alelo.

La hibridación de sondas de una secuencia específica es un paso importante para la realización con éxito de los presentes métodos. Las sondas de oligonucleótidos de una secuencia específica de la presente invención hibridan específicamente con un segmento particular del genoma del HCV y tienen desapareamientos desestabilizantes con las secuencias de otros organismos. En condiciones de hibridación suficientemente estrictas, las sondas hibridan específicamente sólo en secuencias exactamente complementarias. La estricticidad de las condiciones de hibridación puede relajarse para tolerar cantidades variables de desapareamientos de secuencias. La detección del producto amplificado utiliza esta hibridación de la secuencias específica para asegurar la detección de solamente la diana amplificada correcta, disminuyendo con ello la posibilidad de una falsa positiva causada por la presencia de secuencias homólogas a partir de organismos afines.

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Los métodos de análisis para detectar híbridos formados entre sondas SSO y secuencias de ácidos nucleicos puede requerir que las sondas posean características adicionales además de la región de hibridación. Por ejemplo, si en primer lugar la sonda se inmoviliza, como en el formato de ``dot blot'' (``transferencia de puntos'') ``inverso'' que se describe más adelante, la sonda puede contener también largos tramos de poli-dT que pueden fijarse a un soporte de nylon por irradiación, una técnica descrita con más detalle en la Patente PCT publicación nº 89/11548. En el formato ``dot blot'', la diana inmovilizada se híbrida con sondas que contienen un compuesto empleado en el procedimiento de detección, como se describe más adelante.

Las sondas de la invención pueden ser sintetizadas y marcadas empleando las técnicas descritas más arriba para la síntesis de oligonucleótidos. La sonda puede marcarse en el extremo 5' con ^{32}P incubando la sonda con ^{32}P-ATP y quinasa. Una marca no radioactiva adecuada para las sondas SSO es la peroxidasa de rábano silvestre (HRP). Los métodos para preparar y detectar las sondas de detección conteniendo esta marca están descritos en los ejemplos que figuran más adelante y en las patentes U.S. nº 4.914.210 y 4.962.029. Para una información adicional sobre el empleo de dichas sondas marcadas, ver la patente U.S. nº 4.789.630; Saiki y col., 1988, N. Eng. J. Med. 319: 537-541; y Bugawan y col., 1988, Bio/Technology 6: 693-947. El uso de cromógenos incluyen el colorante rojo leuco y la 3,3',5,5'-tetrametil-bencidina (TMB).

Las sondas de la invención pueden emplearse para determinar si las secuencias víricas están presentes en una muestra, determinando si las sondas SSO se unen a las secuencias víricas presentes en la muestra. Métodos de análisis adecuados a los propósitos de la presente invención para detectar híbridos formados entre las sondas SSO y las secuencias de ácido nucleico en una muestra, son ya conocidos en la especialidad. Por ejemplo, la detección puede efectuarse empleando un formado ``dot blot'', como se describe en los ejemplos. En el formato ``dot blot'', la muestra amplificada que no ha sido marcada se una a un soporte sólido, tal como una membrana, la membrana se incuba con la muestra marcada en condiciones de hibridación adecuadas, la sonda sin hibridar se elimina por lavado, y el filtro se controla para detectar la presencia de sonda unida. Cuando se analizan múltiples muestras con una única sonda, el formato ``dot blot'' es perfectamente útil. Muchas muestras pueden inmovilizarse en posiciones discretas sobre una única membrana e hibridarse simultáneamente sumergiendo la membrana en una solución de la sonda.

Un método alternativo que es perfectamente útil cuando deben emplearse un gran número de diferentes sondas, es un formado ``dot blot'' ``inverso'', en el cual la secuencia amplificada contiene una marca, y la sonda se une al soporte sólido. Este formato sería útil si el ensayo de la presente invención se usara como un ensayo de una batería de ensayos a realizar simultáneamente. En este formato, las sondas SSO sin marcar se unen a la membrana y se exponen a la muestra marcada en condiciones estrictas apropiadas de hibridación. A continuación, se elimina la muestra marcada sin hibridar, lavando en condiciones estrictas adecuadas, y el filtro se controla seguidamente para detectar la presencia de secuencias unidas.

Tanto los ensayos directos como los ensayos ``dot blot'' inversos pueden efectuarse convenientemente en una placa de microtitulación. Las sondas pueden fijarse a la albúmina de suero bovino (BSA), por ejemplo, la cual se adhiere a la placa de microtitulación, con lo cual se inmoviliza la sonda.

En otro sistema adecuado de ensayo, una sonda marcada se añade durante el proceso de amplificación por PCR. Cualquier sonda SSO que híbrida con un ADN diana durante cada paso de síntesis se degrada mediante la actividad 5' a 3' exonucleasa de una polimerasa, p. ej. la Taq polimerasa. A continuación, se detecta el producto de degradación de la sonda. De esta forma, la presencia de un producto degradado indica que la hibridación entre la sonda SSO y el ADN diana ha tenido lugar.

Las secuencias de nucleótido obtenidas anteriormente constituyen un importante aspecto de la presente invención. Aunque solamente se muestra una cadena de la secuencia, los expertos en la especialidad reconocen que la otra cadena de la secuencia puede deducirse de la información representada anteriormente. Esta información permite la construcción de otras sondas y cebadores de la invención.

La presente invención se refiere también a kits, unidades con varios recipientes que contienen componentes útiles para llevar a cabo el presente método. Un kit útil puede contener sondas SSO para detectar el ácido nucleico del virus de la hepatitis C. En algunos casos las sondas SSO pueden fijarse a una membrana soporte adecuada. El kit contiene también cebadores para la RT-PCR, ya que dichos cebadores son útiles en la versión preferida de la invención. Otros componentes útiles del kit incluyen por ejemplo, la transcriptasa inversa o polimerasa, el substrato de nucleósido trifosfatos, los medios empleados para el marcado (por ejemplo, un conjugado avidina-enzima, y un substrato de enzima y cromógeno si la marca es la biotina), y los tampones adecuados para la transcripción inversa, PCR o reacciones de hibridación. Además de los componentes anteriores, el kit puede contener también instrucciones para efectuar el método en cuestión.

Ejemplo 1

En la RT-PCR homogénea, la misma polimerasa actúa a la vez de transcriptasa inversa y DNA polimerasa. Esto permite tanto la transcripción inversa inicial del ARN genómico de HCV como la subsiguiente amplificación del ADNc que se realizan en el mismo tubo sin tener necesidad de abrir el tubo entre los distintos pasos para cambiar los reactivos.

Los ácidos nucleicos se aislaron del suero o plasma empleando el kit de extracción del ácido nucleico IsoQuick™ de MicroProbe. Todas las amplificaciones se efectuaron empleando un TC9600 Thermocycler™ y tubos MicroAmp™, ambos de Perkin Elmer, en volúmenes totales de reacción de 20 \mul. Los reactivos para cada reacción de 20 \mul están compendiados en la tabla 5, a continuación:

TABLA 5

Mezcla de reacción RT-PCR H_{2}O	6,3 \mul
10X Tampón de reacción RT: (Tris-HCl 100 mM (pH 8,3), KCl 900 mM)	2,0 \mul
MnCl_{2} (10 mM, 0,85 mM concentración final)	1,7 \mul
DNTP (2 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y DTTP en H_{2}O, pH 7,0)	2,0 \mul
Cebador KY78 (SEQ ID NO. 18)(1,5 \muM en H_{2}O, 3 picomoles/concentración final reacción)	2,0 \mul
Cebador KY80 (SEQ ID NO. 5)(1,5 \muM en H_{2}O, 3 picomoles/concentración final reacción)	2,0 \mul
ADN polimerasa rTth (Perkin Elmer, Norwalk), CT, USA; 0,18 \muM ó 2,5 unidades/\mulen IX
tampón de almacenamiento del enzima (Tris-HCl 20 \muM (pH 7,5), KCl 100 mM, EDTA	0,1 \muM
DTT 1 \muM, Tween™ 20 (Pierce Surfactants) 0,2%, glicerina 50% [v/v])	2,0 \mul
Ácido nucleico molde (<250 ng total en dH_{2}O)	2,0 \mul

El TC9600 se programó con el siguiente perfil de temperatura: después de un precalentado a 70ºC durante 1 minuto, se interrumpió el programa el tiempo suficiente para introducir los tubos de reacción, el programa se reinició, y se mantuvo la temperatura a 70ºC durante 15 minutos para permitir la transcripción inversa. A continuación, la temperatura de reacción se aumentó a 95ºC durante 1minuto para desnaturalizar el duplex ARN - ADNc. Seguidamente, la temperatura de reacción se sometió a dos ciclos de 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 20 segundos, seguido de 38 ciclosa de 90ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 20 segundos. Finalmente, la temperatura de reacción se mantuvo a 60ºC durante 4 minutos para el paso de extensión final, se enfrió a 15ºC, y se mantuvo a esta temperatura hasta que el análisis de la muestra amplificada pudo realizarse.

Ejemplo 2

Empleando el método de detección con el formado ``dot blot'', se desnaturaliza una pequeña porción del AND amplificado y se aplica a un filtro de nylon, el cual se híbrida a continuación con una sonda marcada. La región de hibridación de la sonda es la KY88 (SEQ ID NO. 12), y la sonda se marca radioactivamente con ^{32}P. Alternativamente, la sonda puede conjugarse covalentemente con peroxidasa de rábano silvestre (HRP) para obtener un medio de detección no isotópico en presencia de un substrato cromogénico o quimioluminiscente.

La reacción de amplificación se efectúa generalmente como se ha descrito en el ejemplo 1. A continuación, se desnaturaliza el producto amplificado por PCR, mediante un tratamiento con álcali. A 5 \mul del producto de la PCR se añaden 5 \mul de EDTA 0,5M, pH 8,0, 8 \mul de NaOH 5N, y 82 \mul de H_{2}O. La mezcla se deja en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos para completar la desnaturalización.

Se preparan filtros de nylon BioDyne™ B (Pall Corp., Glen Cove, NY, USA), sumergiéndolos en H_{2}O durante 5 a 10 minutos y se lavan luego con 200 \mul de H_{2}O después de que el ``dot blot'' múltiple (Bio-Dot™ de Bio Rad, Richmond, CA, USA) está preparado. Después de la desnaturalización, se aplican al vacío, 100 \mul de la mezcla de la muestra a la membrana de nylon empleando el aparato de ``dot blot''. A continuación se enjuaga cada pocillo con 200 \mul de NaoH 0,4 N y el filtro completo se enjuaga brevemente con 2X SSC, y se seca al aire hasta que no quedan trazas de líquido. El ADN se inmoviliza y se retícula con el filtro de nylon mediante radiación ultravioleta con un flujo de 1200 mJ/cm^{2} con una caja de iluminación de UV Stratalinker™ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) (ajuste del ``autorreticulado'').

Los filtros se ``pre-hibridan'' sumergiéndolos en tampón de hibridación (5X SSPE, 5X solución de Denhardt, SDS 0,1%, 50 \mug/ml de ADN de esperma de arenque) en bolsas sellables por el calor a 50ºC (agitador de aire) durante por lo menos 30 minutos. A continuación se reemplaza el tampón por una cantidad igual de la misma solución conteniendo 1-2 x 10^{5} cpm/ml de sonda, y el filtro se deja hibridar entre 2 horas y toda la noche a 50ºC.

Después de la hibridación se lavan los filtros tres veces en 2X SSPE/0,1% SDS; dos veces durante 20 minutos a temperatura ambiente, y seguidamente una vez durante veinte minutos a la temperatura altamente estricta de 60ºC. A continuación, los filtros se secan con papel secante, se cubren con una cubierta de plástico y se exponen a una película de rayos X a -70ºC con una o dos pantallas de intensificación.

Un método alternativo de visualización consiste en hibridar con sondas de oligonucleótidos conjugados con peroxidasa de rábano silvestre, preparados como se ha descrito por Levenson y Chang, 1989, en ``PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications'' (``Protocolos de PRC: Una guía de métodos y aplicaciones'') (Innis y col., eds., Academic Press, San Diego), págs. 92-112, y Saiki y col., 1988, N. Eng. J. Med. 319: 537-541, cada uno de los cuales se incorpora como referencia. La hibridación se efectúa con 2 pmoles de sonda HRP-SSO por 5 ml de solución de hibridación.

Después del lavado, los filtros que van a revelarse con un substrato de un colorante cromogénico, se enjuagan con citrato de sodio 100 mM, pH 5,0, a continuación se colocan en citrato de sodio 100 mM, pH 5,0 que contiene 0,1 mg/ml de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina por mililitro (Fluka), y 0,0015 por ciento de peróxido de hidrógeno, y se incuba con una suave agitación durante 10 a 30 minutos a temperatura ambiente. Los filtros revelados se enjuagan en agua y se fotografían inmediatamente. El sistema de detección con TMB se prepara y se emplea substancialmente como se ha descrito en el kit tipificador de ADN AmpliType™DQ\alpha comercializado por Perkin Elmer. En otra versión, los filtros se revelan con el sistema de detección quimio-luminiscente (ECL; Amersham, Arlington Heights, IL, USA). Los filtros se enjuagan en PBS durante 5 minutos y se colocan en la solución ECL durante 1 minuto con suave agitación. Los filtros se exponen a continuación a una película de rayos X a temperatura ambiente durante 1 a 5 minutos.

Ejemplo 3

En esta versión de la invención se emplea el formato de ``dot blot'' inverso. La región de hibridación de la sonda es KY88 (SEQ ID NO. 12), KY150 (SEQ ID NO. 42) o MY160 (SEQ ID NO. 36), y la sonda se fija a una membrana. El ADN diana amplificado se híbrida con la sonda previamente unida a la membrana, como se describe en Saiki y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 6230-6234; y en el inserto del producto del kit tipificador de AND AmpliType® DQalpha, comercializado por Perkin Elmer. Los cebadores de la amplificación se biotinan, como describen Levenson y Chang, 1989, ver más arriba, de forma que cualquier ADN amplificado que híbrida con las sondas unidas a la membrana puede detectarse fácilmente.

En una versión, la detección se efectúa mediante la reacción de la peroxidasa de rábano silvestre con estreptavidina (SA-HRP) con cualquier ADN amplificado biotinado, hibridado con la sonda unida a la membrana. De esta forma, el HRP se une a través de la interacción SA-biotina, al ADN amplificado y puede emplearse para generar una señal mediante una gran variedad de medios ya conocidos, como p. ej. la generación de un compuesto coloreado mediante la coloración de la tetrametilbencidina (ver patente U.S. nº 4.789.630).

Aunque la sonda puede fijarse a la membrana por cualquier medio, un método preferido consiste en ``añadir una cola'' a la región de hibridación de la sonda con una secuencia mucho más larga de poli-dT. La ``cola'' resultante de poli-dT puede reaccionar a continuación con grupos amino de una membrana de nylon para fijar la sonda covalentemente a la membrana. Esta reacción puede facilitarse mediante irradiación UV.

La desoxirribonucleotidil transferasa terminal (TdT, Ratliff Biochemicals; para las reacciones anteriores presupone una concentración de aproximadamente 120 unidades/\mul, lo cual es 100 pmoles/\mul), puede usarse para crear una cola de poli-dT, aunque se puede también sintetizar la sonda con cola en un sintetizador comercialmente disponible. Cuando se utiliza un sintetizador de ADN para construir la sonda con cola, sin embargo, se coloca la cola en el extremo 5' de la sonda, de forma que la terminación prematura de la cadena, no deseada, tiene lugar primeramente en la región de la cola.

Las reacciones de la TdT deben efectuarse en un volumen de aproximadamente 100 \mul que contienen 1X TdT de sales, 200 pmoles de oligonucleótido, DTT 800 \muM, y 60 unidades de Tdt. 10X TdT de sales consta de K-cacodilato 1,000 mM, CoCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 2 mM, Tris-Cl 250 mM, pH 7,6 y se prepara como ha descrito Roychoudhury y Wu, Meth. Enzymol. 65: 43-62. Si es conveniente puede prepararse una solución en stock 10X de dTTP 8 mM (neutralizada a pH 7 con NaOH).

La reacción del TdT debe efectuarse a 37ºC durante dos horas y a continuación se interrumpe mediante la adición de 100 \mul de EDTA 10 mM, pH 8. La concentración final del oligonucleótido con cola es 1 \muM (1 pmol/\mul), y la longitud de la cola del homopolímero es aproximadamente de 400 restos. La longitud de la cola puede cambiarse ajustando la relación de dTTP a oligonucleótido. Las sondas con cola pueden almacenarse a -20ºC hasta el momento de usarlas.

La membrana de nylon preferida para el formato de ``dot blot'' inverso es la membrana de nylon Biodyne™ B, de 0,45 micras de tamaño de poro, fabricada por Pall y comercializada también por ICN como membrana de nylon BioTrans™. Las sondas pueden aplicarse en forma de manchas sobre la membrana muy convenientemente con el aparato para ``dot blot'' Bio-Dot™ fabricado por BioRad. Cada sonda se aplica en forma de mancha en una situación discreta única en la membrana. Aproximadamente 2 a 10 picomoles de cada sonda con cola se mezcla previamente con 50 a 100 \mul de tampón TE antes de la aplicación al aparato de ``dot blot''. Una vez efectuado el ``dot blot'', se coloca la membrana brevemente sobre un papel absorbente para separar el líquido en exceso. A continuación se coloca la membrana en el interior de una caja de iluminación, como p. ej. la caja de iluminación Stratalinker™ fabricada por Stratagene, y se expone de 50 a 60 milijulios/cm^{2} de flujo a 254 nm para fijar la sonda con cola a la membrana de nylon. Después de un breve enjuague durante aproximadamente 15 minutos con solución de hibridación para eliminar la sonda no unida, la membrana está lista para la hibridación con el producto de la PCR, biotinilado.

Los productos de la amplificación por PCR, se desnaturalizan calentando a 95ºC durante 3 a 10 minutos y se añaden 40 \mul del producto desnaturalizado de la PCR a cada panel de la sonda para la hibridación. La hibridación se efectúa a 57ºC durante 20 minutos en un baño maría con agitación en un tampón de hibridación compuesto de 0,5X SSPE, 0,25% de SDS, y 5X de solución de Denhardt (20X SSPE contiene EDTA 0,02, NaH_{2}PO_{4} 0,2M, NaCl 3,6 M, NaOH 0,11M, ajustado a pH 7,4). El tampón de hibridación se sustituye con 3 ml de una solución que consiste en 25 \mul de SA-HRP en 3,1 ml de tampón de hibridación, y se incuba durante 20 minutos a 57ºC en un baño maría con agitación.

El lavado se efectúa en un tampón de lavado de 2X SSPE y 0,1% de SDS. Después de un breve enjuague de la membrana en 10 ml de tampón de lavado, se efectúa un estricto lavado de 12 minutos en 10 ml de tampón, a 57ºC. A continuación se efectúa otro lavado de 5 minutos a temperatura ambiente, seguido de un lavado de 5 minutos en 10 ml de citrato de sodio 0,1M, pH 5,0.

La unión del cromógeno se efectúa en 5 ml de solución cromógena que consiste en 5 ml de citrato de sodio 0,1M, 5 \mul de peróxido de hidrógeno 3% y 0,25 ml de cromógeno (TMB de Perkin Elmer) durante 25-30 minutos a temperatura ambiente. Se efectuaron tres lavados de 10 minutos en agua destilada a temperatura ambiente. Un lavado final de 1X PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos puede generar una señal de calidad. Durante estos pasos que incluyen el cromógeno, la membrana debe protegerse de la luz mediante una cubierta de lámina de aluminio. La membrana revelada debe fotografiarse para tener un registro permanente de la misma.

Ejemplo 4

En esta versión de la invención se emplea el formato de una placa de microtitulación. La sonda se fija en un pocillo de una placa de microtitulación. El ADN diana amplificado se hibrida con la sonda fijada como se ha descrito más arriba. Como en el ejemplo precedente, los cebadores de la amplificación se biotinan para permitir la detección del ADN amplificado, el cual híbrida con las sondas fijadas.

En primer lugar, las sondas deseadas conjugadas con BSA se dejan que se absorben por la superficie de plástico de los pocillos individuales. A continuación, estos pocillos se bloquean con una proteína como p. ej. albúmina de suero bovino. De preferencia se emplean placas de microtitulación de 96 pocillos, adquiribles en la firma Corning.

Una vez se ha completado la amplificación, los tubos de PCR se sacan del termociclador (adquirible en la firma Perkin Elmer). Se añaden cien microlitros de solución de desnaturalización a cada tubo de PCR. Se utiliza una punta nueva de pipeta para cada tubo. En una versión, la detección no pudo efectuarse inmediatamente. En este caso, los tubos de PCR se mantuvieron durante la noche de 2ºC a 8ºC. Las reacciones de amplificación desnaturalizadas se volvieron viscosas después de un almacenamiento de 2ºC a 8ºC. Se calentaron los tubos brevemente de 25ºC a 30ºC antes de abrir los tubos para poder utilizar fácilmente la pipeta.

Se extrajeron un número apropiado de ocho tiras de los pocillos de la placa de microtitulación (como mínimo, 2 tiras) y se colocaron en el marco de la placa de microtitulación. Se pipetearon cien microlitros de tampón de hibridación en cada pocillo de la placa de microtitulación.

La solución de desnaturalización contiene NaOH 0,4M; EDTA 80 mM y 0,005% de azul de timol. El tampón de hibridación/neutralización contiene: NaSCN 2,5M; NaH_{2}PO_{4} 80 mM; NH_{2}PO_{4} 10 mM; y Tween™ 20 0,125%. Se comprueba el pH antes de usar, el cual debe ser de 5,0 \pm 0,2.

Empleando puntas insertadas con un pipeteador multicanal, se pipetearon 25 \mul de reacción de amplificación desnaturalizada, de cada tubo de PCR de la cubeta a la correspondiente posición del pocillo de la placa de microtitulación. La placa se cubrió con la tapa de la placa de microtitulación y se golpeó suavemente de 10 a 15 veces en el lateral de la placa. Los pocillos en los cuales se había pipeteado el reactivo correcto, viraron a un color amarillo claro. En aquellos en que no se observó ningún cambio o solamente un ligero cambio en el color azul, se añadió un exceso de amplicon. El ensayo se continúa cuando aumentan los valores positivos de OD, pero los valores negativos de OD no influyen. La placa se incubó durante 60 minutos a 37ºC.

Después de la incubación, la placa se lavó cinco veces con solución de lavado. El lavado de la placa debe ser efectuado manualmente o con un lavador automático de placas de microtitulación programado adecuadamente. Para el lavado, se emplea un tampón de lavado 1X para PCR. Un tampón de lavado concentrado 10X de PCR, se preparó como sigue: 9,94 gramos por litro de fosfato monosódico (dibásico); 4,41 gramos por litro de fosfato disódico (monobásico); 3,722 gramos por litro de EDTA; 87,66 gramos por litro de cloruro de sodio; 13,7 gramos por litro de Tween™20; y 10 gramos por litro de Pro Clin 300 (Rohm and Haas, Philadelphia, PA). Se ajusta el pH de la solución con ácido fosfórico (se prefiere un pH de 6,5-7,1).

Para el lavado manual el contenido de la placa se vació y se sacudió con ligeros golpes hasta sequedad. Se añadieron trescientos microlitros de solución de lavado a cada pocillo de la placa que se analizaba, y la placa se dejó secar durante 15 a 30segundos. La placa se vació de nuevo y se sacudió con ligeros golpes hasta sequedad. Este proceso de lavado se repitió cuatro veces más.

Para un lavador automático de placas de microtitulación, se utilizó el siguiente procedimiento. Se aspiró el contenido de los pocillos. El lavador se programó para añadir 350 microlitros de solución de lavado de trabajo a cada pocillo de la placa que se analizaba, se sumergió durante 30 segundos y se aspiró. Los pasos se repitieron cuatro veces más. A continuación se sacudió la placa con ligeros golpes hasta sequedad.

Se añadieron cien microlitros de conjugado a cada pocillo de la placa que se analizaba. El conjugado avidina-HRP se prepara como sigue. El diluyente contiene 0,1 molar; 0,25% de Emulsit 25 (DKS International, Inc., Tokio, Japón); 1,0% de Kathon CG (Rohm and Hass, Philadelphia, PA); 0,1% de fenol; 1,0% de globulinagamma bovino. La solución se ajustó a pH 7,3 con HCl concentrado. A este diluyente se añadieron 10 nM de avidina conjugada (Vector Labs, Burlingame, CA). A continuación se cubrió la placa y se incubó 50 minutos a 37ºC y se lavó de nuevo como se ha descrito más arriba. El substrato de trabajo se preparó mezclando 2,0 ml de substrato. A y 0,5ml de substrato B para cada múltiplo de dos tiras de placas de microtitulación de 8 pocillos (16 ensayos). El substrato A contiene 3 de peróxido de hidrógeno; 6,5 mM de citrato y 0,1% de Kathon CG. El substrato B contiene 4,2 mM de 3,3',5,5' tetrametilbencidina y 40% de dimetilformamida. El substrato de trabajo se preparó no más de tres horas antes de su utilización y se almacenó protegido de la luz solar.

Se añadieron cien microlitros de substrato de trabajo (mezcla de substratos A y B) a cada pocillo de la placa que se analiza. A continuación se cubrió la placa y se incubó en la oscuridad durante 10 minutos a temperatura ambiente (de 20ºC a 25ºC). Se añadieron cien microlitros del reactivo de interrupción (H_{2}SO_{4} al 5%) a cada pocillo que se analiza. Se midió la absorbancia de cada pocillo de 450 mM al cabo de una hora después de añadir el reactivo de interrupción. El valor de la absorbancia se registró para la muestra y como control.

Ejemplo 5

Los oligonucleótidos de la presente invención proporcionan numerosas combinaciones de cebadores y sondas que pueden emplearse en la amplificación de secuencias genómicas del HCV, y para la detección del producto amplificado. Se ha analizado un gran número de oligonucleótidos para determinar su eficacia como cebadores en una amplificación RT-PCR.

Las reacciones de la amplificación PCR se efectuaron con varios pares de oligonucleótidos empleando los métodos descritos en el ejemplo 1. El producto amplificado se detectó por los métodos estándar de separación y tinción por electroforesis con gel de agarosa (Sambrock y col., ver más arriba). Cada uno de los cebadores de línea de entrada KY65 (SEQ ID NO. 1) y KY98 (SEQ ID NO. 3) actuó con eficacia con cada uno de los cebadores de línea de salida KY68 (SEQ ID NO. 26), KY95 (SEQ ID NO. 20), y KY99 (SEQ ID NO. 25), en las secuencias de amplificación del HCV. El KY67 (SEQ ID NO. 10) actuó eficazmente tanto con el KY68 (SEQ ID NO. 26) como con el KY99 (SEQ ID NO. 25). Cada uno de los cebadores de línea de entrada KY80 (SEQ ID NO. 5), KY83 (SEQ ID NO. 7), KY84 (SEQ ID NO. 8), KY85 (SEQ ID NO. 9), y KY144 (SEQ ID NO. 6) actuaron eficazmente con cada uno de los cebadores de línea de salida KY78 (SEQ ID NO. 18), KY95 (SEQ ID NO. 20), KY145 (SEQ ID NO. 19), KY148 (SEQ ID NO. 17), y KY149 (SEQ ID NO. 16). Finalmente cada uno de los cebadores de línea de entrada KY80 (SEQ ID NO. 5), y KY81 (SEQ ID NO. 11) actuaron con eficacia con el KY100 (SEQ ID NO. 21).

El producto de amplificación de la amplificación PCR utilizando los KY78 (SEQ ID NO. 18), KY80 (SEQ ID NO. 5) como cebadores se detectó mediante el sondaje con cada uno de los KY88 (SEQ ID NO. 12), KY84 (SEQ ID NO. 8), y KY85 (SEQ ID NO.9), utilizando los métodos descritos en el ejemplo 2, ver más arriba.

Los cebadores KY153 (SEQ ID NO. 15), KY159 (SEQ ID NO. 16), y KY148 (SEQ ID NO. 17), no pueden utilizarse con ninguno de los cebadores de línea de entrada que son de línea de salida de KY85. El extremo 3' de KY78 (SEQ ID NO. 18) es adyacente al extremo 3' de KY88 (SEQ ID NO. 12), por lo que aunque estos dos cebadores podrían funcionar como un par cebador, la falta de una secuencia separadora hace imposible el sondaje independiente. El cebador KY85 (SEQ ID NO. 13) puede emparejarse solamente con el KY100 (SEQ ID NO. 21), KY99 (SEQ ID NO. 25), KY109 (SEQ ID NO. 23) y KY111 (SEQ ID NO. 24). El cebador KY87 (SEQ ID NO. 14) puede emparejarse solamente con el KY99 (SEQ ID NO. 25), KY109 (SEQ ID NO. 23) y KY111 (SEQ ID NO.24).

Los KY84 (SEQ ID NO. 8), KY85 (SEQ ID NO. 9), KY87 (SEQ ID NO. 14), y KY148 (SEQ ID NO. 17), descritos más arriba son de utilidad para la detección de aislados conocidos de HCV distintos del aislado C9. Las sondas y cebadores compendiados en la tabla 3 son específicos para la ampliación y detección del -C9 y variantes afines y para la exclusión de prototipos de HCV de Japón y U.S.

Son ejemplos de cebadores para la amplificación específica de prototipos del HCV de Japón y U.S. y no del HCV-C9, los siguientes: KY84 (SEQ ID NO. 8), KY85 (SEQ ID NO. 9), KY148 (SEQ ID NO. 17) y KY87 (SEQ ID NO. 14). Los cebadores para la amplificación de los prototipos de HCV del Japón, U.S. y C9, incluyen los KY67 (SEQ ID NO. 10), KY78 (SEQ ID NO. 18), KY80 (SEQ ID NO. 5), KY81 (SEQ ID NO. 11), y KY83 (SEQ ID NO. 7), KY86 (SEQ ID NO. 13), KY88 (SEQ ID NO 12), y KY95 (SEQ ID NO. 20), KY1000 (SEQ ID NO. 21), KY144 (SEQ ID NO. 6) y KY145 (SEQ ID NO. 19), y KY153 (SEQ ID NO. 15). Los cebadores KY65 (SEQ ID NO. 1), y KY68 (SEQ ID NO. 27), KY98 (SEQ ID NO. 3), KY99 (SEQ ID NO.25), KY109 (SEQ ID NO. 23), KY111 (SEQ ID NO. 24) y KY149 (SEQ ID NO. 16), son adecuados para la amplificación de los prototipos de HCV del Japón y U.S. y aislados variantes afines, y pueden ser adecuados también para la detección del HCV-C9 e isotipos afines.

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Son ejemplos de sondas para la detección de los prototipos del HCV del Japón, U.S. y C9 y variantes afines, las siguientes: KY67 (SEQ ID NO. 19), KY78 (SEQ ID NO. 18), KY81 (SEQ ID NO. 11), KY86 (SEQ ID NO. 13), KY95 (SEQ ID NO. 20), KY150 (SEQ ID NO. 42), y KY145 (SEQ ID NO. 19). Las sondas para la detección del prototipo de HCV del Japón y U.S., y variantes afines, las cuales sondas no detectan el prototipo de HCV-C9 incluyen los KY83 (SEQ ID NO. 7), KY87 (SEQ ID NO. 14), KY84 (SEQ ID NO. 8), KY88 (SEQ ID NO. 12), KY85 (SEQ ID NO. 9), KY100 (SEQ ID NO. 21), KY148 (SEQ ID NO. 17) y KY149 (SEQ ID NO. 16). Las sondas KY65 (SEQ ID NO. 1), KY68 (SEQ ID NO. 26), KY82 (SEQ ID NO. 27), KY99 (SEQ ID NO. 25), KY109 (SEQ ID NO. 23), y KY111 (SEQ ID NO. 24), KY80 (SEQ ID NO. 5), KY144 (SEQ ID NO. 6), y KY153 (SEQ ID NO. 15), son adecuadas para la detección del prototipo de HCV del Japón y U.S. y aislados variantes afines y puede también ser adecuada para la detección del HCV-C9 y variantes afines.

Ejemplo 6

Un método preferido es la amplificación RT/PCR homogénea del ARN del HCV en presencia de UNG. El método de amplificación homogénea de RT-PCR descrito en el ejemplo 1, se modificó para incluir un paso de esterilización. El protocolo descrito más adelante demuestra que las reacciones de RT y PCR incorporan dUTP. La esterilización tiene lugar a 50ºC antes del paso de la RT. A las elevadas temperaturas de reacción de la RT-PCR, la UNG es inactiva, y los productos que contienen dU no son degradados. Dos unidades de UNG (Perkin Elmer) esterilizaron con éxito una contaminación equivalente a 0,25 \mul de una amplificación de 100 \mul hecha con 10.000 copias de RNA. Cantidades más altas de UNG, por ejemplo, hasta 6 unidades por 100 \mul de reacción son también adecuadas.

Se añadieron los componentes de la mezcla de reacción en el siguiente orden:

	\mul/Rx
Glicerina 50% 16,00	16,00
10X RT Rxn. Tampón (Tris-HCl 100 mM (pH 8,3) KCl 900 mM)	10,00
DGTP (10 mM); 200 \muM final	2,00
DATP (10 mM); 200 \muM final	2,00
DUTP (20 mM); 200 \muM final	1,00
DCTP (10 mM); 200 \muM final	2,00
KY80 (SEQ ID NO. 5) a 15 \muM (15 pmoles cada/rxn final); (+) cebador de cadena biotinilada	1,00
KY78 (SEQ ID NO. 18) a 15 \muM (15 pmoles cada/rxn final); cadena (-) biotinil, cebador de RT	1,00
UNG: 1 unidad/\mul	2,00
ADN polimerasa del rTth: 2,5 U/\mul en tampón de almacenamiento del enzima 1X*	4,00
MnCl_{2} (10 mM); 0,9 mM final	9,00
Mezcla madre por tubo	50,00
ARN (con fondo** de soporte en H_{2}O)	50,00
Total volumen de reacción	100,00

* Tampón 1X de almacenamiento del enzima = (Tris-HCl [pH 7,5] 20 mM, KCl 100 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1
mM, 0,5% de Tween™ 20 [Pierce Surfactamps], 50% de glicerina [v/v]).
** 1 mg de RNA homopolimérico poli-rA, de Pharmacia (el poli-rA nº 27 tiene un S_{20,w} medio de 8,8 (margen 6-
13) o algunos productos no específicos a la temperatura de reasociación empleados a niveles de entrada de menos
de 200 ng por reacción. Se han examinado el ADN del timo de ternera, ADN de PBL, ADN de placenta humana y
ADN de la línea celular K562, y se comportan de forma similar.

Procedimiento

1.: Conectar el termociclador TC9600 para precalentar la cubierta.

2.: Preparar la mezcla de reacción a temperatura ambiente.

3.: Colocar los tubos en el termociclador y pulsar ``Run'' (``en marcha'') para reiniciar el termociclador.

4.: Poner en marcha la máquina en la señal nº 8.

5.: Condiciones solicitadas de termociclado.

: Señal 1: Mantener 2 minutos a 50ºC (paso de esterilización (UNG)).

: Señal 2: Mantener 15 minutos a 70ºC (paso de transcripción inversa).

: Señal 3: Mantener 1 minuto a 95ºC.

: Señal 4: Dos temp. PCR 15 seg. a 95ºC y 10-30 seg. a 60ºC durante 2 ciclos.

: Señal 5: Dos temp. PCR 15 seg. a 90ºC y 10-30 seg. a 60ºC durante 38 ciclos.

: Señal 6: Mantener a 72ºC durante 1 hora.

: Señal 7: Mantener a 15ºC sin definir.

: Señal 8: Enlazar señales: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7.

En el paso 5, señal 2, el tiempo de 15 minutos de reacción puede rebajarse a 5 minutos sin disminuir la eficiencia de la reacción. En el paso 5, señal 5, para moldes G + C largos, puede ser preferible aumentar la temperatura de desnaturalización a 95ºC. El análisis de los productos de la reacción mediante el formato del ensayo con la placa de microtitulación, dio generalmente como resultado unos valores de la absorbancia mayores de 0,8 para muestras positivas y = 0,5 para muestras negativas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): ASPIRANTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: F. Hoffmann-La Roche Ltd.

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CALLE: Grenzacherstrase 124

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CIUDAD: Basilea

\vskip0.333000\baselineskip

(D): ESTADO: BS

\vskip0.333000\baselineskip

(E): PAÍS: Suiza

\vskip0.333000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): CH-4070

\vskip0.333000\baselineskip

(G): TELÉFONO: (0) 61 688 24 03

\vskip0.333000\baselineskip

(H): TELEFAX: (0)61 688 13 95

\vskip0.333000\baselineskip

(I): TELEX: 962292/965512 hlc ch

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TÍTULO DEL INVENTO: Cebadores y sondas para detección de hepatitis C.

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS. 42

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): FORMA LEBILE DE ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TIPO MEDIO: disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release nº 1,0, Versión nº 1,25 (EPO)

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 751.305

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 27-AGOSTO-1991

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº. 1:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCAAGCTTCA CCATAGATCA CT

\hfill

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:2:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGCGACACTC CACCATAGAT CACT

\hfill

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCAAGCTTCA ATCACTCCCC TGTGAGGAAC T

\hfill

31

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 4:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCAAGCTTCA CGCAGAAAGC GTCAGCCCAT

\hfill

30

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 5:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCAAAAGCG TCTAGCCATG GCGT

\hfill

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 6:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ACGCAGAAAG CGTCTAGCCA TGGCGT

\hfill

26

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 7:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCTCCAGGAC CCCCCCTCCC GGGAGAGCCA

\hfill

30

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 8:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GAGTACACCG GAATTGCCAG GACGACC

\hfill

27

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 9:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ACCCGCTCAA TGCCTGGAGA T

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 10:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CGAAGCTTGC TAGCCGAGTA GT

\hfill

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 11:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCGCAAGACT GCTAGCCGAG TAGT

\hfill

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 12:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GTTGGGTCGC GAAAGGCCTT GTGGT

\hfill

25

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 13:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGTGCTTGCG AGTGCCCCGG GAGGTCTCGT

\hfill

30

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 14:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GACTTCCGAG CGGTCGCAAC CTCG

\hfill

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 15:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCCAACATA CTCGGCTAGC AGTCT

\hfill

25

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 16:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AAGGCCTTTC GCGACCCAAC ACTACT

\hfill

26

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 17:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CACAAGGCCT TTCGCGACCC AACACT

\hfill

26

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 18:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTCGCAAGCA CCCTATCAGG CAGT

\hfill

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 19:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CACTCGCAAG CACCCTATCA GGCAGT

\hfill

26

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 20:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGGAATTCGC AAGCACCCTA TCAGGCAGT

\hfill

29

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 21:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CGAGGTTGCG ACCGCTCGGA AGT

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 22:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AGGTGCGAC CGCTCGGAAG T

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 23:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 23:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AATGCCATAG AGGGGCAAG G

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 24:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 24:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ATTGCCATAG AGGGGCAAG G

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 25:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 25:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CAGAATTCAT TGCCATAGAG GGGCCAAGGA T

\hfill

31

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 26:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 26:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CAGAATTCGC CCTCATTGCC AT

\hfill

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 27:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 27:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCCACCCCAA GCCCTCATTG CCAT

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 28:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 526 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 28:

1

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 29:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 494 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 29:

9

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 30:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 494 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 30:

10

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 31:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 494 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 31:

11

12

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 32:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 494 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 32:

13

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 33:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 33:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TTGCCGGAAA GACTGGGTCC TTTC

\hfill

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 34:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 34:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CAAAAGAAAC ACAAACCGCC GCCC

\hfill

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 35:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 35:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCAGCCCATC CCGAAAGATC GGCG

\hfill

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 36:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 36:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TGTCCGGTCA TTTGGGCG

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 37:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 37:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AAACCCACTC TATGTCCGGT C

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 38:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 38:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GTACGCCGGA ATTGCCGGAA A

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 39:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 39:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCTCAAAGAA AAACCAAAAG A

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 40:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 40:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TGGCGTCTCC CACGCGGCTG G

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 41:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 41:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTTTCCCCAG GACCTGCCGG T

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº 42:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 42:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CATAGTGGTC TGCGGAACCG GTGAGT

\hfill

26

Claims

1. Un oligonucleótido para detectar ácido nucleico del virus de hepatitis C en donde dicho oligonucleótido tiene una secuencia elegida del grupo constituido por

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 KY65 \+ SEQ ID NO: 1\cr  KY98 \+ SEQ ID NO: 3\cr  KY80 \+ SEQ ID
NO: 5\cr  KY144 \+ SEQ ID NO: 6\cr  LY83 \+ SEQ ID NO: 7\cr  KY84 \+
SEQ ID NO: 8\cr  KY85 \+ SEQ ID NO: 9\cr  KY67 \+ SEQ ID NO: 10\cr 
KY81 \+ SEQ ID NO: 11\cr  KY88 \+ SEQ ID NO: 12\cr  KY86 \+ SEQ ID
NO: 13\cr  KY87 \+ SEQ ID NO: 14\cr  KY153 \+ SEQ ID NO: 15\cr 
KY149 \+ SEQ ID NO: 16\cr  KY148 \+ SEQ ID NO: 17\cr  KY78 \+ SEQ ID
NO: 18\cr  KY145 \+ SEQ ID NO: 19\cr  KY95 \+ SEQ ID NO: 20\cr 
KY100 \+ SEQ ID NO: 21\cr  KY109 \+ SEQ ID NO: 23\cr  KY111 \+ SEQ
ID NO: 24\cr  KY99 \+ SEQ ID NO: 25\cr  KY68 \+ SEQ ID NO: 26, y\cr 
KY82 \+ SEQ ID NO:
27\cr}

y su complemento.

2. El oligonucleótido de la reivindicación 1, el cual está marcado.

3. Un procedimiento para detectar un ácido nucleico de un virus de hepatitis C, caracterizado porque se utiliza como una sonda un oligonucleótico como el reivindicado en la reivindicación 1 ó 2.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, que comprenden adicionalmente una etapa de amplificación, en donde se amplifica primero una subsecuencia del genoma de virus de hepatitis C, con lo que dicha amplificación se obtiene de preferencia con el empleo del método de reacción de cadena de polimerasa.

5. Un procedimiento para amplificar ácido nucleico a partir de un virus de hepatitis C, caracterizado porque se utiliza como un cebador un oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, caracterizado porque se amplifica una subsecuencia del ácido nucleico de hepatitis C en la muestra utilizando el par cebador:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 KY80 \+ SEQ ID NO: 5\cr  KY78 \+ SEQ ID NO:
18\cr}

\newpage

7. Un procedimiento para detectar un ácido nucleico a partir de un virus de hepatitis C, caracterizado porque un oligonucleótido elegido del grupo de:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 KY84 \+ SEQ ID NO: 8\cr  KY85 \+ SEG ID NO: 9\cr  KY88 \+ SEQ ID
NO:
12\cr}

se utiliza como una sonda y en donde una subsecuencia del ácido nucleico de la hepatitis C en la muestra se amplifica primero utilizando el par cebador:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 KY80 \+ SEQ ID NO: 5\cr  KY78 \+ SEQ ID NO:
18.\cr}

8. Un kit para detectar la presencia de un ácido nucleico de un virus de hepatitis C, comprendiendo el kit un compartimiento que contiene como una sonda oligonucleótida de un oligonucleótido como se reivindica en la reivindicación 1 ó 2.

9. Un kit para amplificar un ácido nucleico a partir de un virus de hepatitis C, comprendiendo el kit un compartimiento que contiene como cebador(es) uno o mas oligonucleótidos reivindicado en la reivindicación 1 ó 2, y uno o mas reactivos de transcripción inversa o amplificación, comprendiendo opcionalmente como sonda(s) uno o mas oligonucleótidos de conformidad con la reivindicación 1 ó 2.

10. Empleo de un oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 como un cebador.

11. Empleo de un oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 como una sonda.

12. Empleo de un oligonucleótido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 para amplificar una región 5'-terminal del genoma de una cepa de HCV.