ES2197191T3

ES2197191T3 - Proteina de fusion hematopoyetica variante de il-3.

Info

Publication number: ES2197191T3
Application number: ES95908514T
Authority: ES
Inventors: Christopher S. Bauer; Mark Allen Abrams; Sarah Ruth Braford-Goldberg; Maire Helena Caparon; Alan Michael Easton; Barbara Kure Klein; John Patrick Mc Kearn; Peter O. Olins; Kumnan Paik; John Warren Thomas
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1994-02-04
Filing date: 1995-01-25
Publication date: 2004-01-01
Anticipated expiration: 2015-01-25
Also published as: CA2182483C; ATE237641T1; AU700220B2; EP0742796B1; WO1995021197A1; NZ279624A; PT742796E; AU1680595A; DK0742796T3; CA2182483A1; HK1013655A1; US5858347A; EP1323737A3; US6074639A; DE69530374T2; EP0742796A1; JPH09508524A; EP1323737A2; DE69530374D1; US6132991A

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A MOLECULAS DE FUSION COMPUESTAS DE PROTEINAS (MUTEINAS) VARIANTES O MUTANTES DE INTERLEUCINA-3 (HIL-3) HUMANA FUNCIONALMENTE UNIDAS A UNA SEGUNDA COLONIA DE FACTOR ESTIMULANTE (CSF), CITOQUINA, LINFOQUINA, INTERLEUCINA O LA VARIANTE IL-3. ESTAS VARIANTES HIL-3 CONTIENEN SUSTITUCIONES DE AMINOACIDOS Y PUEDEN TENER TAMBIEN SUPRESIONES DE AMINOACIDOS EN AMBOS TERMINALES, EL N- Y EL C-. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE CONTIENEN LAS MOLECULAS DE FUSION Y LOS METODOS PARA USARLAS.

Description

Proteína de fusión hematopoyética variante de IL-3.

La presente invención se refiere a una proteína de fusión que consta de una variante de interleuquina-3 humana definida del polipéptido de la fórmula mostrada en la fig 1; un factor seleccionado entre el grupo compuesto por un factor estimulador de colonias, una citoquina, una linfoquina, una interleuquina y un factor de crecimiento hematopoyético; y opcionalmente un engarce entre las dos secuencias.

Los factores estimuladores de colonias (CSF), que estimulan la diferenciación y/o proliferación de células de médula ósea, han generado mucho interés debido a su potencial terapéutico para restaurar los niveles reducidos de células derivadas de células madre hematopoyéticas. Se han identificado CSF tanto en sistemas humanos como en sistemas murinos y se han distinguido de acuerdo con sus actividades. Por ejemplo, el CSF de granulocitos (G-CSF) y el CSF de macrófagos (M-CSF) estimulan la formación in vitro de colonias de granulocitos neutrófilos y de macrófagos, respectivamente, mientras que el GM-CSF y la interleuquina-3 (IL-3) tienen actividades más amplias y estimulan la formación de colonias tanto de macrófagos como de granulocitos neutrófilos y eosinófilos. La IL-3 también estimula la formación de colonias de mastocitos, de megacariocitos y de eritroides puras y mixtas (cuando se añade eritropoyetina en combinación).

Debido a su capacidad de estimular la proliferación de varios tipos celulares diferentes y de soportar el crecimiento y la proliferación de células progenitoras, la IL-3 tiene capacidad de uso terapéutico en la restauración de cantidades normales de células hematopoyéticas en los casos en los que el número de células se ha reducido debido a enfermedades o a tratamientos terapéuticos tales como radiación y quimioterapia.

La interleuquina-3 (IL-3) es un factor de crecimiento hematopoyético que tiene la propiedad de poder promover la supervivencia, el crecimiento y la diferenciación de las células hematopoyéticas. Entre las propiedades biológicas de la IL-3 se encuentra la capacidad (a) de soportar el crecimiento y la diferenciación de células progenitoras implicadas en todos o en prácticamente todos los linajes de células sanguíneas; (b) interaccionar con células madre multipotenciales tempranas; (c) mantener el crecimiento de células precursoras pluripotentes; (d) estimular la proliferación de células de leucemia mielógena crónica (CML); (e) estimular la proliferación de mastocitos, eosinófilos y basófilos; (f) estimular la síntesis de ADN por células de leucemia mielógena aguda humana (AML); (g) inducir a las células para la producción de leucotrienos e histaminas; (h) inducir la quimiotaxis de leucocitos; e (i) inducir las moléculas de la superficie celular necesarias para la adhesión de leucocitos.

La interleuquina-3 humana madura (hIL-3) consta de 133 aminoácidos. Tiene un puente disulfuro y dos sitios de glicosilación potenciales (Yang, et al., CELL 47: 3 (1986)).

La IL-3 murina (mIL-3) se identificó primero por Ihle, et al., J. IMMUNOL. 126:2184 (1981) como un factor que inducía la expresión de una enzima asociada a las células T, la 20-hidroxiesteroide deshidrogenasa. El factor se purificó hasta la homogeneidad y demostró que regulaba el crecimiento y la diferenciación de numerosas subclases de células progenitoras hematopoyéticas y linfoides tempranas.

En 1984, se aislaron clones de ADNc que codificaban para la IL-3 murina (Fung, et al., NATURE 307:233 (1984) y Yokota, et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. ESTADOS UNIDOS 81:1070 (1984)). La secuencia de ADN murina codificaba para un polipéptido de 166 aminoácidos que incluía un supuesto péptido señal.

La secuencia de IL-3 de gibón se obtuvo usando una biblioteca de expresión de ADNc de gibón. La secuencia de IL-3 de gibón después se usó como una sonda contra una biblioteca genómica humana para obtener una secuencia de IL-3 humana.

Yang, et al., CELL 47:3 (1986) descubrieron homólogos de ADN genómico de gibón y de ser humano de la secuencia de la IL-3 murina. La secuencia humana presentada por Yang, et al. incluía un resto de serina en la posición 8 de la secuencia de la proteína madura. Después de este hallazgo, otros autores informaron sobre el aislamiento de ADNc Pro^{8} hIL-3 que tenían prolina en la posición 8 de la secuencia proteica. De esta forma, parece ser que puede haber dos formas alélicas de hIL-3.

Dorssers, et al., GENE 55:115 (1987), encontraron un clon procedente de una biblioteca de ADNc humana que hibridaba con mIL-3. Esta hibridación fue el resultado del alto grado de homología entre regiones no codificantes 3' de mIL-3 y hIL-3. Este ADNc codificaba para una secuencia de hIL-3 (Pro^{8}).

Los documentos U.S. 4.877.729 y U.S. 4.959.455 describen ADNc de IL-3 humana y de IL-3 de gibón y las secuencias proteicas para las que codifican. La hIL-3 descrita tiene serina en lugar de prolina en la posición 8 en la secuencia proteica.

Clark-Lewis, et al., SCIENCE 231:134 (1986) realizaron un análisis funcional de análogos de IL-3 murina sintetizados con un sintetizador de péptidos automático. Los autores concluyeron que se requería la estructura terciaria estable de la molécula completa para conseguir una actividad completa. Un estudio sobre el papel de los enlaces disulfuro demostró que el reemplazo de las cuatro cisteínas por alanina proporcionaba una molécula con 1/500 de actividad con respecto a la molécula nativa. El reemplazo de dos de los cuatro restos de Cys por Ala (Cys^{79}, Cys^{140} \rightarrow Ala^{79}, Ala^{140}) aumentó la actividad. Los autores concluyeron que en la IL-3 murina se requiere un solo enlace disulfuro entre las cisteínas 17 y 80 para conseguir una actividad biológica que se aproxime a los niveles fisiológicos y que esta estructura probablemente estabiliza la estructura terciaria de la proteína para proporcionar una conformación que sea óptima para la función. (Clark-Lewis, et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. ESTADOS UNIDOS 85:7897 (1988)).

La solicitud de patente internacional (PCT) WO 88/00598 describe IL-3 de tipo de gibón y humano. La hIL-3 contiene un reemplazo de Ser^{8} \rightarrow Pro^{8}. Se sugiere reemplazar Cys por Ser, rompiendo de esta manera el puente disulfuro, y reemplazar uno o más aminoácidos en los sitios de glicosilación.

El documento EP-A-0275598 (WO 88/04691) ilustra que puede delecionarse la Ala^{1} mientras que se retiene la actividad biológica. Se proporcionan algunas secuencias de hIL-3 mutantes, por ejemplo, dos mutantes dobles, Ala^{1} \rightarrow Asp^{1}, Trp^{13} \rightarrow Arg^{13} (pGB/IL-302) y Ala^{1} \rightarrow Asp^{1}, Met^{3} \rightarrow Thr^{3} (pGB/IL-304) y un mutante triple Ala^{1} \rightarrow Asp^{1}, Leu^{9} \rightarrow Pro^{9} , Trp^{13} \rightarrow Arg^{13} (pGB/IL-303).

El documento WO 88/05469 describe cómo pueden obtenerse mutantes de desglicosilación y sugiere que los mutantes de Arg^{54}Arg^{55} y Arg^{108}Arg^{109}Lys^{110} podrían evitar la proteolisis tras la expresión Saccharomyces cerevisiae por la proteasa KEX2. No se describen proteínas mutadas. La glicosilación y la actividad de la proteasa KEX2 sólo son importantes, en este contexto, tras la expresión en levaduras.

El documento WO 88/06161 menciona diversos mutantes que teóricamente pueden ser conformacional y antigénicamente neutros. Las únicas mutaciones realizadas realmente son Met^{2} \rightarrow Ile^{2} e Ile^{131} \rightarrow Leu^{131}. No se describe si se obtuvieron las neutralidades contempladas para estas dos mutaciones.

El documento WO 91/00350 describe proteínas análogas de hIL-3 no glicosiladas, por ejemplo, hIL-3 (Pro^{8}Asp^{15}

\break

Asp^{70}), Met^{3} rhul-3 (Pro^{8}Asp^{15}Asp^{70}); Thr^{4} rhuL-3 (Pro^{8}Asp^{15}Asp^{70}) y Thr^{6} rhuIL-3 (Pro^{8}Asp^{15}Asp^{70}). Se dice que estas composiciones de proteína no presentan ciertos efectos secundarios adversos asociados con la hIL-3 nativa tales como la urticaria resultante de la infiltración de mastocitos y linfocitos en la dermis. Las proteínas de hIL-3 análogas descritas pueden tener en el extremo N Met^{3}, Thr^{4} o Thr^{6}.

El documento WO 90/12874 describe variantes con cisteína añadida (CAV) de IL-3 que tienen al menos un resto aminoacídico natural substituido por un resto de Cys.

El documento U.S. 4.810.643 describe la secuencia de ADN que codifica el G-CSF humano.

El documento WO 91/02754 describe una proteína de fusión compuesta por GM-CSF e IL-3 que tiene mayor actividad biológica que el GM-CSF o la IL-3 solos. También se describen proteínas análogas de IL-3 y de GM-CSF no glicosiladas como componentes de la fusión.

El documento WO 92/04455 describe proteínas de fusión compuestas de IL-3 fusionadas a una linfoquina seleccionada entre el grupo compuesto por IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, EPO y G-CSF.

El documento WO 92/06116 describe proteínas de fusión tales como IL-3/G-CSF, IL-3/Epo o Epo/IL-3, con lo que la proteína de fusión comprende la secuencia entera de IL-3 humana o con lo que la parte de IL-3 puede comprender una secuencia de 79 aminoácidos derivada de la IL-3 humana.

Sumario de la invención

La presente invención comprende una proteína de fusión que consta de

a): una variante interleuquina-3 humana del polipéptido de la fórmula mostrada en la fig. 1 (a.a. 1-133), donde la variación de dicha IL-3 humana nativa es el reemplazo de un aminoácido en las siguientes posiciones y donde el aminoácido de reemplazo se selecciona entre el grupo compuesto por:

: la posición 42 es Asp, Ser, Ile, Leu, Met, Tyr o Ala;

: la posición 45 es Val, Met o Asn;

: la posición 46 es Ser, Gln, His o Val;

: la posición 50 es Asp;

: la posición 51 es Pro o Thr;

: la posición 62 es Pro;

: la posición 76 es Pro;

: la posición 82 es Trp, Asp, Asn, Glu, His, Phe, Ser o Tyr;

: la posición 95 es Arg, Thr, Asn o Ser;

: la posición 98 es Ile, Leu, Ala, Gln, Met, Ser o Val;

: la posición 100 es Arg;

: la posición 101 es Pro, His, Asn, Ile o Leu;

: la posición 105 es Pro;

: la posición 108 es Ala o Ser;

: la posición 116 es Val, Trp, Ala, His, Phe o Tyr;

: la posición 121 es Ile;

: la posición 122 es Ile;

: la posición 123 es Met o Glu; y

donde de 1 a 14 aminoácidos pueden delecionarse opcionalmente del extremo N y/o de 1 a 15 aminoácidos pueden delecionarse opcionalmente del extremo C de dicho polipéptido mutante de interleuquina-3 humana.

b): un factor seleccionado entre el grupo compuesto por un factor estimulador de colonias, una citoquina, una linfoquina, una interleuquina, y un factor de crecimiento hematopoyético;

opcionalmente un engarce entre las secuencias de a) y b); y donde opcionalmente Met-, Ala-, o Met-Ala- precede al primer aminoácido de la proteína de fusión.

Estas muteínas de hIL-3 contienen substituciones de aminoácidos y también pueden tener deleciones de aminoácidos en uno o en los dos extremos N y C terminales. De esta manera, esta invención incluye factores estimuladores de colonias de función mixta formados a partir de polipéptidos unidos covalentemente, pudiendo actuar cada uno de ellos a través de un receptor celular diferente y específico para iniciar actividades biológicas complementarias.

La presente invención comprende una proteína de fusión que consta de

a): una variante de interleuquina-3 humana del polipéptido de la fórmula mostrada en la fig. 1 (a.a. 1-133) donde la variación de dicha IL-3 humana nativa es el reemplazo de un aminoácido en las siguientes posiciones y donde el aminoácido de reemplazo se selecciona entre el grupo compuesto por:

: la posición 42 es Asp, Ser, Ile, Leu, Met, Tyr o Ala;

: la posición 45 es Val, Met o Asn;

: la posición 46 es Ser, Gln, His o Val;

: la posición 50 es Asp;

: la posición 51 es Pro o Thr;

: la posición 62 es Pro;

: la posición 76 es Pro;

: la posición 82 es Trp, Asp, Asn, Glu, His, Phe, Ser o Tyr;

: la posición 95 es Arg, Thr, Asn o Ser;

: la posición 98 es Ile, Leu, Ala, Gln, Met, Ser o Val;

: la posición 100 es Arg;

: la posición 101 es Pro, His, Asn, Ile o Leu;

: la posición 105 es Pro;

: la posición 108 es Ala o Ser;

: la posición 116 es Val, Trp, ala, His, Phe o Tyr;

: la posición 121 es Ile;

: la posición 122 es Ile;

: la posición 123 es Met o Glu; y

En otra realización, dicha proteína de fusión de la invención es una proteína de fusión en la que en dicho polipéptido variante de interleuquina-3 humana, se delecionan de 1 a 14 aminoácidos del extremo N (posiciones 1 a 14) y/o se delecionan de 1 a 15 aminoácidos del extremo C (posiciones 119 a 133) de dicho polipéptido variante de interleuquina-3 humana.

En una realización adicional, dicha proteína de fusión es una proteína de fusión donde en dicho polipéptido variante de interleuquina-3 humana se delecionan de 1 a 14 aminoácidos del extremo N (posiciones 1 a 14) y/o se delecionan de 1 a 8 aminoácidos del extremo C (posiciones 126 a 133) de dicho polipéptido variante de interleuquina-3 humana.

Preferiblemente, dicho factor de la proteína de fusión de la invención se selecciona entre el grupo compuesto por: GM-CSF, CSF-1, G-CSF, G-CSF (Ser^{17}), Meg-CSF, M-CSF, eritropoyetina (EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF, ligando flt3/flk2, hormona de crecimiento humana, factor de crecimiento de células B, factor de diferenciación de células B, factor de diferenciación de eosinófilos y factor de células madre (SCF).

En una realización preferida, dicho factor se selecciona entre el grupo compuesto por: G-CSF, GM-CSF y G-CSF (Ser^{17}).

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión detallada anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona además una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión detallada anteriormente.

La presente invención proporciona además un método para producir una proteína de fusión, que comprende: cultivar en un medio de crecimiento una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión anterior de una manera que permita la expresión de dicha proteína de fusión, y recuperar dicha proteína de fusión.

La presente invención también se refiere al uso de la proteína de fusión detallada anteriormente para uso en el tratamiento de situaciones en las que se desea un aumento de la producción de células hematopoyéticas.

Además, la presente invención se refiere al uso de la proteína de fusión detallada anteriormente para preparar un medicamento para el tratamiento de situaciones en las que se desea un aumento de la producción de células hematopoyéticas.

Además, la presente invención se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las moléculas de fusión de hIL-3, sistemas de expresión microbianos relacionados y procesos para fabricar las moléculas de fusión usando los sistemas de expresión microbianos.

Estas moléculas de fusión pueden caracterizarse por tener la actividad habitual de los dos péptidos que forman la molécula de fusión o pueden caracterizarse adicionalmente por tener una actividad biológica o fisiológica mayor que simplemente la función aditiva de la presencia de IL-3 o el segundo factor estimulador de colonias solo. La molécula de fusión también puede proporcionar de forma inesperada un mayor efecto sobre la actividad o una actividad diferente de la esperada por la presencia de IL-3 o el segundo factor estimulador de colonias o variante de IL-3. La molécula de fusión también puede tener un mejor perfil de actividad que puede incluir la reducción de actividades biológicas indeseables asociadas con la hIL-3 nativa.

La presente invención también se refiere a mutantes de hIL-3 como se han definido anteriormente en los que se han delecionado de 1 a 14 aminoácidos del extremo N y/o se han delecionado de 1 a 15 aminoácidos del extremo C, que contienen de 1 a 3 substituciones de aminoácidos, a los que se ha fusionado un segundo factor estimulador de colonias o variante de IL-3. Las moléculas de fusión preferidas de la presente invención se componen de variantes de hIL-3 en las que se han delecionado los aminoácidos 1 a 14 del extremo N, y se han delecionado los aminoácidos 126 a 133 del extremo C, fusionadas a un segundo factor estimulador de colonias o variante de IL-3.

La presente invención también proporciona moléculas de fusión que pueden funcionar como antagonistas de IL-3 o como fragmentos antigénicos discretos para la producción de anticuerpos útiles en protocolos de inmunoensayo e inmunoterapia. Los antagonistas de hIL-3 serían particularmente útiles en el bloqueo del crecimiento de ciertas células cancerosas tales como AML, CML y ciertos tipos de cánceres linfoides B. Otras situaciones en las que los antagonistas serían útiles incluyen aquellas en las que ciertas células sanguíneas se producen en números anormalmente altos o se están activando por ligandos endógenos. Los antagonistas competirían eficazmente por los ligandos, presumiblemente hemopoyetinas naturales incluyendo, y sin limitación, IL-3, GM-CSF e IL-5, que podrían inducir o aumentar el crecimiento de las células cancerígenas en virtud de su capacidad de unirse al complejo del receptor de IL-3 mientras se reducen las propiedades de activación intrínsecas del ligando. La IL-3, el GM-CSF y/o la IL-5 también intervienen en ciertas respuestas asmáticas. Un antagonista del receptor de IL-3 puede tener la utilidad en esta enfermedad bloqueando la activación mediada por receptores y el reclutamiento de células inflamatorias.

Además del uso de las moléculas de fusión de la presente invención in vivo, se prevé que los usos in vitro incluirían la capacidad de estimular la médula ósea y la activación y el crecimiento de células sanguíneas antes de la infusión en pacientes.

La figura 1 es el gen de la IL-3 humana para la expresión en E. Coli (pMON5873), que codifica la secuencia polipeptídica de la IL-3 humana natural (de tipo silvestre) [Sec ID Nº:128], más una metionina iniciadora, como se expresa en E. Coli, con los aminoácidos numerados desde el extremo N de la hIL-3 natural.

La presente invención incluye una proteína de fusión que consta de una variante de interleuquina-3 humana (hIL-3) del polipéptido mostrado en la fig. 1 como se ha definido anteriormente, un factor seleccionado entre el grupo compuesto por un factor estimulador de colonias, una citoquina, una linfoquina, una interleuquina y un factor de crecimiento hematopoyético y un engarce entre las secuencias de a) y b), donde opcionalmente Met-, Ala- o Met-Ala- precede al primer aminoácido de la proteína de fusión. De esta manera, esta invención incluye factores estimuladores de colonias de función mixta formados a partir de polipéptidos unidos covalentemente, pudiendo actuar cada uno de ellos a través de un receptor celular diferente y específico para iniciar actividades biológicas complementarias. La hematopoyesis requiere una serie compleja de acontecimientos celulares en los que las células madre generan continuamente grandes poblaciones de células en proceso de maduración de todos los linajes principales. Actualmente hay al menos 20 reguladores conocidos con actividad proliferativa hematopoyética. La mayoría de estos reguladores proliferativos pueden estimular uno u otro tipo de formación de colonias in vitro, siendo bastante característico el patrón preciso de formación de colonias estimulada por cada regulador. Dos reguladores no estimulan exactamente el mismo patrón de formación de colonias, según se evalúa por los números de colonias o, lo que es más importante, por el patrón de linajes y de maduración de las células que constituyen las colonias en desarrollo. Las respuestas proliferativas pueden analizarse más fácilmente en sistemas de cultivo in vitro simplificados. Pueden distinguirse tres parámetros bastante diferentes: la alteración del tamaño de las colonias, la alteración del número de colonias y el linaje. Dos o más factores pueden actuar sobre la célula progenitora, induciendo la formación de un número mayor de células hijas y aumentando de esta manera el tamaño de las colonias. Dos o más factores pueden permitir la proliferación de un mayor número de células progenitoras, porque existen subseries distintas de células progenitoras que responden exclusivamente a un factor o porque algunos progenitores requieren la estimulación por dos o más factores antes de poder responder. Es probable que la activación de receptores adicionales en una célula por el uso de dos o más factores aumente la señal mitótica debido a la coalescencia de rutas de señales inicialmente diferentes en una ruta final común que alcanza el núcleo (Metcalf, 1989). Otros mecanismos podrían explicar la sinergia. Por ejemplo, si una ruta de señalización está limitada por una activación intermedia de una ruta de señalización adicional por un segundo factor, se puede obtener una respuesta superaditiva. En algunos casos, la activación de un tipo de receptor puede inducir una mayor expresión de otros receptores (Metcalf, 1993). Entonces, dos o más factores pueden producir un patrón diferente de linajes celulares a partir de un solo factor. El uso de moléculas de fusión puede tener la ventaja clínica potencial resultante de una respuesta proliferativa que no es posible por ningún factor individual.

Los factores hematopoyéticos y otros factores de crecimiento pueden agruparse en dos familias distintas de receptores relacionados: (1) receptores de tirosina quinasa, incluyendo los del factor de crecimiento epidérmico, M-CSF (Sherr, 1990) y SCF (Yarden et al., 1987); y (2) receptores hematopoyéticos, que no contienen un dominio de tirosina quinasa, pero que presentan una homología evidente en su dominio extracelular (Bazan, 1990). En este último grupo se incluyen la eritropoyetina (EPO) (D'Andrea et al., 1989), GM-CSF (Gearing et al., 1989), IL-3 (Kitamura et al., 1991), G-CSF (Fukunaga et al., 1990), IL-4 (Harada et al., 1990), IL-5 (Takaki et al., 1990), IL-6 (Yamasaki et al., 1988), IL-7 (Goodwin et al., 1990), ILF (Gearing et al., 1991) e IL-2 (Cosman et al., 1987). La mayoría de este último grupo de receptores existen en una forma de alta afinidad como heterodímeros. Después de la unión al ligando, las cadenas \alpha específicas se asocian con al menos otra cadena de receptor (cadena \beta, cadena \gamma). Muchos de estos factores comparten una subunidad de receptor común. Las cadenas \alpha para GM-CSF, IL-3 e IL-5 comparten la misma cadena \beta (Miyajima et al., 1992) y los complejos receptores para IL-6, LIF e IL-11 comparten una cadena \beta común (gp130) (Taga et al., 1989; Taga et al., 1992; Gearing et al., 1992). Los complejos receptores de IL-2, IL-4 e IL-7 comparten una cadena \gamma común (Montonari et al., 1993; Russell et al., 1993; Masayuki et al., 1993).

El uso de múltiples factores también puede tener ventajas potenciales al reducir las exigencias sobre las células productoras de factores y sus sistemas de inducción. Si hay limitaciones en la capacidad de una célula de producir un factor, al reducir las concentraciones requeridas de cada uno de los factores por medio de su uso en combinación se pueden reducir de forma útil las exigencias sobre las células productoras del factor. El uso de factores múltiples puede reducir la cantidad de los factores que serían necesarias, probablemente reduciendo la probabilidad de respuestas adversas.

La proteína de fusión de la presente invención consta de una variante de interleuquina-3 humana del polipéptido de la fórmula mostrada en la fig. 1 (a.a. 1-133), donde la variación de dicha IL-3 humana nativa es el reemplazo de un aminoácido en las siguientes posiciones y donde el aminoácido de reemplazo se selecciona entre el grupo compuesto por:

: la posición 42 es Asp, Ser, Ile, Leu, Met, Tyr o Ala;

: la posición 45 es Val, Met o Asn;

: la posición 46 es Ser, Gln, His o Val;

: la posición 50 es Asp;

: la posición 51 es Pro o Thr;

: la posición 62 es Pro;

: la posición 76 es Pro;

: la posición 82 es Trp, Asp, Asn, Glu, His, Phe, Ser o Tyr;

: la posición 95 es Arg, Thr, Asn o Ser;

: la posición 98 es Ile, Leu, Ala, Gln, Met, Ser o Val;

: la posición 100 es Arg;

: la posición 101 es Pro, His, Asn, Ile o Leu;

: la posición 105 es Pro;

: la posición 108 es Ala o Ser;

: la posición 116 es Val, Trp, Ala, His, Phe o Tyr;

: la posición 121 es Ile;

: la posición 122 es Ile;

: la posición 123 es Met o Glu; y

donde pueden delecionarse opcionalmente de 1 a 14 aminoácidos del extremo N y/o pueden delecionarse opcionalmente de 1 a 15 aminoácidos del extremo C de dicho polipéptido mutante de interleuquina-3 humana;

b) un factor seleccionado entre el grupo compuesto por un factor estimulador de colonias, una citoquina, una linfoquina, una interleuquina, y un factor de crecimiento hematopoyético;

opcionalmente un engarce entre la secuencia de a) y b); y donde opcionalmente Met-, Ala-, o Met-Ala- precede al primer aminoácido de la proteína de fusión.

El polipéptido variante de la interleuquina-3 humana y el factor tienen una actividad diferente pero complementaria.

Por actividad complementaria se entiende una actividad que aumenta o cambia la respuesta a otro modulador celular. El polipéptido variante de interleuquina-3 humana se fusiona directamente o a través de un segmento de engarce al factor. El término ``directamente'' define fusiones en las que los polipéptidos se unen sin un engarce peptídico. El engarce es un agente químico unido o un segmento polipeptídico al que se fusionan en fase tanto el polipéptido variante de interleuquina-3 humana como el factor, siendo lo más común que el engarce sea un péptido lineal al que se unen el polipéptido variante de interleuquina-3 humana y el factor por medio de enlaces amida que unen el extremo carboxi del polipéptido variante de la interleuquina-3 humana al extremo amino del engarce y el extremo carboxi del engarce al extremo amino del factor. Por ``fusionado en fase'' se entiende que no hay ninguna terminación de la traducción o alteración entre las fases de lectura del polipéptido variante de la interleuquina-3 humana. Una lista no exclusiva de otros factores de crecimiento, factores estimuladores de colonias (CSF), citoquinas, linfoquinas, interleuquinas y factores de crecimiento hematopoyético dentro de la definición del factor que puede fusionarse a un polipéptido variante de hIL-3 de la presente invención incluye GM-CSF, CSF-1, G-CSF, Meg-CSF, M-CSF, eritropoyetina (EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF, ligando flt3, hormona de crecimiento humana, factor de crecimiento de células B, factor de diferenciación de células B, factor de diferenciación de eosinófilos y factor de células madre (SCF) también conocido como factor de Steel o ligando c-kit. Además, esta invención incluye el uso de moléculas de factor modificadas o secuencias de ADN mutadas o modificadas que codifican estas moléculas de factor.

El engarce generalmente es un polipéptido con una longitud comprendida entre 1 y 500 aminoácidos. Los engarces que unen las dos moléculas preferiblemente están diseñados para (1) permitir que las dos moléculas se plieguen y actúen independientemente entre sí, (2) no tener una tendencia a desarrollar una estructura secundaria ordenada que pueda interferir con los dominios funcionales de las dos proteínas, (3) tener características hidrófobas o cargadas mínimas que puedan interaccionar con los dominios de la proteína funcional y (4) proporcionar una separación estérica del polipéptido variante de interleuquina-3 humana y el factor de tal forma que los dos puedan interaccionar simultáneamente con sus receptores correspondientes en una sola célula. Típicamente, los aminoácidos superficiales en regiones flexibles de proteínas incluyen Gly, Asn y Ser. Sería de esperar que prácticamente cualquier permutación de secuencias de aminoácidos que contuviera Gly, Asn y Ser cumpliera los criterios anteriores para una secuencia de engarce. En la secuencia de engarce también pueden usarse otros aminoácidos neutros, tales como Thr y Ala. En los engarces también pueden incluirse otros aminoácidos debido a la adición de sitios de restricción únicos en la secuencia del engarce para facilitar la construcción de las fusiones.

Los engarces preferidos de la presente invención incluyen secuencias seleccionadas entre el grupo de fórmulas:

(Gly_{3}Ser)_{n}, (Gly_{4}Ser)_{n}, (Gly_{5}Ser)_{n}, (Gly_{n}Ser)_{n} o (AlaGlySer)_{n}.

Un ejemplo de un engarce muy flexible es la región espaciadora rica en (GlySer) presente dentro de la proteína pIII de los bacteriófagos filamentosos, por ejemplo, los bacteriófagos M13 o fd (Schaller et al., 1975). Esta región proporciona una región espaciadora larga y flexible entre dos dominios de la proteína de la superficie pIII. La región espaciadora consta de la secuencia de aminoácidos:

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La presente invención también incluye engarces en los que se incluye una secuencia de reconocimiento de endopeptidasas. Tal sitio de escisión puede ser valioso para separar los componentes individuales de la fusión para determinar si se pliegan apropiadamente y son activos in vitro. Los ejemplos de diversas endopeptidasas incluyen, pero sin limitación, plasmina, enteroquinasa, calicreína, uroquinasa, activador de plasminógeno tisular, clostripaína, quimosina, colagenasa, proteasa de veneno de víbora de Russell, enzima de escisión después de prolina, proteasa de V8, trombina y factor Xa.

Ciertos segmentos de engarce peptídicos de la región de bisagra de la cadena pesada de inmunoglobulinas IgG, IgA, IgM, IgD o IgE proporcionan una relación angular entre los polipéptidos unidos. Son especialmente útiles las regiones de bisagra en las que las cisteínas se reemplazan por serinas. Los engarces preferidos de la presente invención incluyen secuencias derivadas de la región de bisagra gamma 2b de la IgG murina en la que las cisteínas se han cambiado por serinas. Estos engarces también pueden incluir un sitio de escisión por endopeptidasas.

Los ejemplos de tales engarces incluyen las siguientes secuencias seleccionadas entre el grupo de secuencias

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Sin embargo, la presente invención no se limita por la forma, el tamaño o el número de secuencias de engarce empleadas y el único requisito del engarce es que funcionalmente no interfiera de manera adversa con el plegamiento y la función de las moléculas individuales de la fusión.

Un método alternativo para conectar dos factores de crecimiento hematopoyéticos es por medio de una interacción no covalente. Tales proteínas complejadas pueden describirse por una de las fórmulas:

R1-C1 + R2-C2; o C1-R1 + C2-R2; C1-R1 + R2-C2; o C1-R1 + R2-C2

donde R1 es una variante de hIL-3 del polipéptido de la fórmula mostrada en la fig. 1 y que puede tener porciones de la molécula de hIL-3 delecionada, y R2 es un factor estimulador de colonias como se ha detallado anteriormente con una actividad diferente pero complementaria. Una lista no exclusiva de otros factores estimuladores de colonias (CSF), citoquinas, linfoquinas, interleuquinas y factores de crecimiento hematopoyéticos dentro de la definición del factor que puede fusionarse a un polipéptido variante de hIL-3 de la presente invención, incluye GM-CSF, CSF-1, G-CSF, Meg-CSF, M-CSF, eritropoyetina (EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9; IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF, factor de crecimiento de células B, factor de diferenciación de células B, factor de diferenciación de eosinófilos y factor de células madre (SCF) también conocido como factor de Steel o ligando c-kit. Los dominios C1 y C2 son de estructura química idéntica o no idéntica, típicamente proteicos, que pueden formar una asociación específica no covalente. Los complejos entre C1 y C2 dan como resultado una relación estequiométrica de uno a uno entre R1 y R2 para cada complejo. Son ejemplos de dominios que se asocian dominios de ``cierre de cremallera de leucina'' de factores de transcripción, dominios de dimerización de represores de la transcripción bacteriana y dominios constantes de inmunoglobulina. Los enlaces covalentes unen la variante de hIL-3 y C1, y el factor y C2, respectivamente. Como se indica en las fórmulas, los dominios C1 y C2 pueden estar presentes en el extremo N o en el extremo C de su factor de crecimiento hematopoyético correspondiente (R). Estos dominios de multimerización (C1 y C2) incluyen los derivados de la familia de proteínas bZIP (Abel et al., 1989; Landshulz et al., 1988; Pu et al., 1993; Korarides et al., 1988) así como dominios de multimerización de la familia de proteínas de hélice-bucle-hélice (Abel et al., 1989; Murre et al., 1989; Tapscott et al., 1988; Fisher et al., 1991). Las fusiones preferidas de la presente invención incluyen factores estimuladores de colonias dimerizados en virtud de su incorporación como fusiones traduccionales de los dominios de dimerización de cierre de cremallera de leucina de las proteínas de la familia bZIP Fos y Jun. El dominio de cierre de cremallera de leucina de Jun puede interaccionar con dominios idénticos. Por otra parte, el dominio de cierre de cremallera de leucina de Fos interacciona con el dominio de cierre de cremallera de leucina Jun, pero no interacciona con otros dominios de cierre de cremallera de leucina Fos. Las mezclas de Fos y Jun predominantemente dan como resultado la formación de heterodímeros Fos-Jun. Por consiguiente, cuando se fusiona a factores estimuladores de colonias, el dominio Jun puede usarse para dirigir la formación de homo o heterodímeros. La formación preferente de heterodímeros puede conseguirse si uno de los patrones del factor estimulador de colonias se modifica por ingeniería genética para poseer el dominio de cierre de cremallera de leucina Jun, mientras que el otro se modifica por ingeniería genética para poseer el dominio de cierre de cremallera Fos.

También pueden añadirse péptidos para facilitar la purificación o identificación de proteínas de fusión (por ejemplo, poli-His). También puede añadirse un péptido muy antigénico que permita un rápido ensayo y una fácil purificación de la proteína de fusión por un anticuerpo monoclonal específico.

Como se usa en este documento, la interleuquina-3 humana corresponde a la secuencia de aminoácidos (1-133) representada en la figura 1 y (15-125) hIL-3 corresponde a la secuencia de 15 a 125 aminoácidos del polipéptido de hIL-3 y moléculas variantes de hIL-3 que se modifican después de la traducción (por ejemplo, por glicosilación).

``La secuencia de aminoácidos mutante'', ``proteína mutante'' o ``polipéptido mutante'' se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que varía de una secuencia nativa o se codifica por una secuencia de nucleótidos que intencionadamente se ha hecho variante de una secuencia nativa. ``Proteína mutante'', ``proteína variante'' o ``muteína'' significa una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos mutante e incluyen polipéptidos que difieren de la secuencia de aminoácidos de la hIL-3 nativa debido a deleciones de aminoácidos, substituciones o ambas. ``Secuencia nativa'' se refiere a una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico que es idéntica a una forma de tipo silvestre o nativa de un gen o proteína.

La IL-3 humana puede caracterizarse por su capacidad de estimular la formación de colonias por células progenitoras hematopoyéticas humanas. Las colonias formadas incluyen eritroides, granulocitos, megacariocitos, macrófagos granulocíticos y mezclas de los mismos. La IL-3 humana ha demostrado una capacidad de restaurar la función de la médula ósea y de poblaciones de células sanguíneas periféricas a niveles terapéuticamente beneficiosos en estudios realizados inicialmente en primates y posteriormente en seres humanos (Gillio, A. P., et al. (1990); Ganser, A, et al. (1990); Falk, S., et al. (1991). Otras actividades de la hIL-3 incluyen la capacidad de estimular la migración de leucocitos y la quimiotaxis; la capacidad de inducir leucocitos humanos para producir altos niveles de mediadores inflamatorios tales como leucotrienos e histamina; la capacidad de inducir la expresión en la superficie celular de moléculas necesarias para la adhesión de leucocitos; y la capacidad de inducir respuestas inflamatorias dérmicas y fiebre. Muchas o todas estas actividades biológicas de hIL-3 implican la transducción de señales y la unión de receptores de alta afinidad. Las moléculas de fusión de la presente invención pueden presentar propiedades útiles tales como tener una actividad biológica similar o mayor en comparación con la hIL-3 nativa o tener una mejor vida media o menos efectos secundarios adversos, o una combinación de estas propiedades. También pueden ser útiles como antagonistas. Las moléculas de fusión que tienen una actividad pequeña o nula en comparación con la hIL-3 nativa también pueden ser útiles como antagonistas, como antígenos para la producción de anticuerpos para uso en inmunología o inmunoterapia, como sondas genéticas o como intermedios usados para construir otras muteínas de hIL-3 útiles.

Las nuevas moléculas de fusión de la presente invención preferiblemente tendrá al menos una propiedad biológica de la IL-3 humana y del otro factor estimulador de colonias o de la variante de IL-3 a la que se fusiona y puede tener más de una propiedad biológica de tipo IL-3, o una propiedad mejorada, o una reducción en una propiedad biológica indeseable de la IL-3 humana. Algunos polipéptidos mutantes de la presente invención también pueden presentar un perfil de efectos secundarios mejorado. Por ejemplo, pueden presentar una reducción en la liberación de leucotrienos o en la liberación de histamina en comparación con la hIL-3 nativa o (15-125) hIL-3. Tales propiedades biológicas de hIL-3 o de tipo hIL-3 pueden incluir una o más de las siguientes características biológicas y actividades in vivo e in vitro.

Una de tales propiedades es el soporte del crecimiento y la diferenciación de las células progenitoras destinadas a los linajes eritroide, linfoide y mieloide. Por ejemplo, en un ensayo de médula ósea humana convencional, una propiedad biológica de tipo IL-3 es la estimulación de colonias de tipo granulocítico, colonias de tipo megacariocítico, colonias de tipo de monocitos/macrófagos y estallidos eritroides. Otras propiedades de tipo IL-3 son la interacción con células madre multipotenciales tempranas, el mantenimiento del crecimiento de células precursoras pluripotentes, la capacidad de estimular la proliferación de células de leucemia mielógena crónica (CML), la estimulación de la proliferación de mastocitos, la capacidad de soportar el crecimiento de diversas líneas celulares dependientes de factores, y la capacidad de activar progenitores de células de médula ósea inmaduras. En la técnica se han descrito otras propiedades biológicas de la IL-3. La IL-3 humana también tiene algunas actividades biológicas que en algunos casos pueden ser indeseables, por ejemplo, la capacidad de estimular la liberación de leucotrienos y la capacidad de estimular el aumento de la síntesis de histamina en cultivos de bazo y de médula ósea e in vivo.

La actividad biológica de la hIL-3 y de las proteínas de fusión de hIL-3 de la presente invención se determina por medio de la síntesis de ADN por células de leucemia mielógena aguda (AML) humanas. La línea celular dependiente de factores AML 193 se adaptó para uso en el ensayo de la actividad biológica. La actividad biológica de la hIL-3 y de las proteínas de fusión de hIL-3 de la presente invención también se determina contando las unidades formadoras de colonias en un ensayo de médula ósea.

Otros ensayos basados en células in vitro también pueden ser útiles para determinar la actividad de las moléculas de fusión que dependen de los factores estimuladores de colonias que comprende la fusión. A continuación se proporcionan ejemplos de otros ensayos útiles.

Ensayo de proliferación de TF-1: la línea de células TF-1 se obtuvo a partir de la médula ósea de un paciente con eritroleucemia (Kitamura et al., 1989). Las células TF-1 responden a IL-3, GM-CSF, EPO e IL-5.

Ensayo de proliferación de 32D: 32D es una línea celular dependiente de IL-3 murina que no responde a la IL-3 humana, pero responde al G-CSF humano que no presenta restricción de especie.

Ensayo de proliferación de T1165: las células T1165 son una línea de células murinas dependientes de IL-6 (Nordan et al., 1986) que responden a la IL-6 y a la IL-11.

Ensayo de meg-CSF de Coágulos de Plasma Humano: usado para ensayar la actividad de formación de colonias de megacariocitos (Mazur et al., 1981).

La proteína de fusión de la presente invención tiene una actividad biológica similar o mejorada en relación con la hIL-3 nativa o el factor o variante de IL-3.

Las proteínas de fusión de la presente invención pueden tener actividad de hIL-3 o actividad de tipo hIL-3. Por ejemplo, pueden poseer una o más de las actividades biológicas de la hIL-3 nativa y pueden ser útiles en la estimulación de la producción de células hematopoyéticas por células progenitoras humanas o de primate. La proteína de fusión de la presente invención y las composiciones farmacéuticas que la contienen pueden ser útiles en el tratamiento de situaciones en las que las poblaciones de células hematopoyéticas se han reducido o destruido debido a una enfermedad o a tratamientos tales como radiación y/o quimioterapia. Las composiciones farmacéuticas que contienen moléculas de fusión de la presente invención pueden administrarse por vía parenteral, intravenosa o subcutánea.

La hIL-3 nativa posee una considerable actividad inflamatoria y se ha demostrado que estimula la síntesis de los metabolitos del ácido araquidónico LTC_{4}, LTD_{4} y LTE_{4}; la síntesis de histamina y la liberación de histamina. Ciertos ensayos clínicos humanos realizados con la hIL-3 nativa han documentado respuestas inflamatorias (Biesma, et al., BLOOD, 80:1141-1148 (1992) y Postmus, et al., J. CLIN. ONCOL., 10:1131-1140 (1992)). Un estudio reciente indica que los leucotrienos están implicados en las acciones de la IL-3 in vivo y pueden contribuir significativamente a los efectos biológicos del tratamiento con IL-3 (Denzlinger, C. et al., BLOOD, 81:2466-2470 (1993)).

Algunas moléculas de fusión de la presente invención pueden tener un mejor perfil terapéutico que la hIL-3 nativa. Por ejemplo, algunas moléculas de fusión de la presente invención pueden tener una actividad de factor de crecimiento similar o más potente que la hIL-3 nativa sin tener un aumento similar o correspondiente en la estimulación del leucotrienos o histamina. Sería de esperar que estas moléculas de fusión tuvieran un perfil terapéutico más favorable, ya que la cantidad de polipéptido que necesita administrarse para conseguir la actividad de factor de crecimiento deseada (por ejemplo, la proliferación celular) tendría un menor efecto estimulador de leucotrienos o de histamina. En estudios realizados con la hIL-3 nativa, la estimulación de factores inflamatorios ha sido un efecto secundario indeseable del tratamiento. La reducción o eliminación de la estimulación de mediadores de la inflamación proporcionaría una ventaja con respecto al uso de la hIL-3 nativa.

Las nuevas moléculas de fusión de la presente invención también pueden ser útiles como antagonistas que bloquean el receptor de hIL-3 por medio de la unión específica al mismo y la prevención de la unión del agonista.

Una ventaja potencial de las nuevas moléculas de fusión de la presente invención, particularmente las que retienen una actividad similar o mejor que la de la hIL-3 nativa, es que puede usarse una cantidad más pequeña de la muteína biológicamente activa para producir el efecto terapéutico deseado. Esto hace que sea posible reducir el número de tratamientos necesarios para producir el efecto terapéutico deseado. El uso de cantidades más pequeñas también puede reducir la posibilidad de cualquier efecto antigénico potencial u otros posibles efectos secundarios indeseables. Por ejemplo, si puede conseguirse un efecto terapéutico deseado con una menor cantidad de polipéptido, es posible reducir o eliminar los efectos secundarios asociados con la administración de la IL-3 nativa, tales como la estimulación de leucotrienos y/o la liberación de histamina. Las nuevas moléculas de fusión de la presente invención también pueden ser útiles en la activación de células madre o progenitores que tengan un bajo número de receptores.

La presente invención también incluye las secuencias de ADN que codifican para las proteínas de fusión, secuencias de ADN que son substancialmente similares y realizan substancialmente la misma función, y secuencias de ADN que difieren de los ADN que codifican las moléculas de fusión de la invención sólo debido a la degeneración del código genético. En la presente invención también se incluyen; los intermedios oligonucleotídicos usados para construir los ADN mutantes; y los polipéptidos codificados por estos oligonucleótidos. Estos polipéptidos pueden ser útiles como antagonistas o como fragmentos antigénicos para la producción de anticuerpos útiles en protocolos de inmunoensayo e inmunoterapia.

Los compuestos de esta invención se realizan preferiblemente por técnicas de ingeniería genética ahora convencionales en la técnica, Patente de Estados Unidos 4.935.233 y Sambrook et al ``Molecular Cloning. A Laboratory Manual'', Cold Spring Harbor Laboratory (1989)]. Un método para crear los genes mutantes de hIL-3 (15-125) preferidos es la mutagénesis de cassette [Wells, et al. (1985)] en la que una parte de la secuencia codificante de hIL-3 en un plásmido se reemplaza por oligonucleótidos sintéticos que codifican las substituciones de aminoácidos deseadas en una porción del gen entre dos sitios de restricción. De forma similar, pueden realizarse substituciones de aminoácidos en el gen hIL-3 de longitud completa, o en genes que codifican variantes de hIL-3 en las que se han delecionado de 1 a 14 aminoácidos del extremo N y/o se han delecionado de 1 a 15 aminoácidos del extremo C. Si se ensamblaran apropiadamente estos oligonucleótidos, podrían codificar variantes de hIL-3 con las substituciones de aminoácidos deseados y/o deleciones de los extremos N y/o C. Los especialistas en la técnica pueden crear estas y otras mutaciones mediante otros métodos de mutagénesis que incluyen; mutagénesis dirigida a oligonucleótidos [Zoller y Smith (1982, 1983, 1984), Smith (1985), Kunkel (1985), Taylor, et al. (1985), Deng y Nickoloff (1992)] o reacción en cadena de la polimerasa (PCR) [Saiki, (1985)].

Pueden fabricarse pares de oligonucleótidos sintéticos complementarios que codifiquen el gen deseado y pueden hibridar entre sí. La secuencia de ADN del oligonucleótido codificaría la secuencia para los aminoácidos del gen deseado a excepción de los substituidos y/o delecionados de la secuencia.

El ADN plasmático puede tratarse con las endonucleasas de restricción elegidas y después unirse a los oligonucleótidos hibridados. Las mezclas unidas pueden usarse para transformar células JM101 competentes de manera que sean resistentes a un antibiótico apropiado. Pueden recogerse colonias individuales y el ADN plasmídico puede examinarse por análisis de restricción y/o secuenciación del ADN para identificar los plásmidos con los genes deseados.

La fusión de las secuencias de ADN de la variante de hIL-3 con la secuencia de ADN del otro factor estimulador de colonias o de la variante de IL-3 puede conseguirse por medio del uso de vectores intermedios. Como alternativa, un gen puede clonarse directamente en un vector que contiene el otro gen. Pueden usarse engarces y adaptadores pueden usarse para unir las secuencias de ADN, así como para reemplazar secuencias perdidas, cuando haya un sitio de restricción interno en la región de interés. De esta forma, el material genético (ADN) que codifica un polipéptido, el engarce peptídico, y el otro polipéptido se inserta en un vector de expresión adecuado que se usa para transformar bacterias, levaduras, células de insecto o células de mamífero. El organismo transformado se cultiva y la proteína se aísla por técnicas convencionales. Por lo tanto, el producto resultante es una nueva proteína que tiene una variante de hIL-3 unida mediante una región de engarce a un segundo factor estimulador de colonias o una variante de IL-3.

Otro aspecto de la presente invención proporciona vectores de ADN plasmídico para uso en la expresión de estas nuevas moléculas de fusión. Estos vectores contienen las nuevas secuencias de ADN descritas anteriormente que codifican para los nuevos polipéptidos de la invención. Los vectores apropiados que pueden transformar microorganismos capaces de expresar las proteínas de fusión incluyen vectores de expresión que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para las moléculas de fusión unidas a secuencias reguladoras de la transcripción y de la traducción que se seleccionan de acuerdo con las células hospedadoras usadas.

En la presente invención se incluyen vectores que incorporan secuencias modificadas como las descritas anteriormente y son útiles en la producción de los polipéptidos de fusión. El vector empleado en el método también contiene secuencias reguladoras seleccionadas en asociación operativa con el ADN que codifica las secuencias de la invención y capaces de dirigir la replicación la expresión del mismo en células hospedadoras seleccionadas.

Como aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para producir las nuevas proteínas de fusión. El método de la presente invención implica cultivar en un medio de crecimiento una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la invención de una manera que permita la expresión de dicha proteína de fusión y la recuperación de dicha proteína de fusión. Pueden ser células o líneas celulares adecuadas ciertas células bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E. Coli son bien conocidas como células hospedadoras en el campo de la biotecnología. Los ejemplos de tales cepas incluyen cepas JM101 de E. Coli [Obukowicz, et al. (1992)]. En la presente invención también se incluye la expresión de la proteína de fusión utilizando un vector de expresión cromosómico para E. Coli basado en el bacteriófago Mu (Weinberg et al., 1993). En este método también pueden emplearse diversas cepas de B. subtilis. También están disponibles muchas cepas de células de levadura conocidas para los especialistas en la técnica como células hospedadoras para la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Cuando se expresan en el citoplasma de E. Coli, las proteínas de fusión de la variante de hIL-3 mencionadas anteriormente de la presente invención también pueden construirse con Met-Ala- en el extremo N, de forma que tras la expresión, la Met se retire por escisión dejando Ala en el extremo N. Las moléculas de fusión de la presente invención pueden incluir polipéptidos de fusión que tienen Met-, Ala- o Met-Ala- unidos al extremo N. Cuando las moléculas de fusión se expresan en el citoplasma de E. Coli, se obtienen polipéptidos con y sin Met unida al extremo N. Los extremos N de las proteínas obtenidas en el citoplasma de E. Coli se ven afectados por un procesamiento post-traduccional por la metionina aminopeptidasa (Ben-Bassat et al., 1987) y posiblemente por otras peptidasas. Estas moléculas de fusión mutantes también pueden expresarse en E. Coli fusionando un péptido señal al extremo N. Este péptido señal se escinde del polipéptido como parte del proceso de secreción. La secreción en E. Coli puede usarse para obtener el aminoácido correcto en el extremo N (por ejemplo, Asn^{15} en el polipéptido hIL-3 (15-125)) debido a la naturaleza precisa de la peptidasa señal. Esto está en contraste con la heterogeneidad que puede observarse en el extremo N de proteínas expresadas en el citoplasma en E. Coli.

También son adecuadas para uso en la presente invención células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino (CHO). En Kaufman, R. J. (1987) High level production of proteins in mammalian cells, en Genetic Engineering, Principles and Methods, vol. 9, J. K. Setlow, editor, Plenum Press, Nueva York, se revisan métodos generales para la expresión de genes extraños en células de mamífero. Se construye un vector de expresión en el que un promotor fuerte capaz de funcionar en células de mamífero dirige la transcripción de una región codificante del péptido señal de secreción eucariota, que se fusiona traduccionalmente a la región codificante para la molécula de fusión. Por ejemplo, pueden usarse plásmidos tales como pcDNA I/Neo, pRc/RSV, y pRc/CMV (obtenido a partir de Invitrogen Corp., San Diego, California). La región codificante del péptido señal de secreción eucariota puede proceder del propio gen de hIL-3 o puede proceder de otra proteína de mamífero secretada (Bayne, M.L. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 84, 2638-2642). Después de la construcción del vector que contiene el gen de la variante de hIL-3, el ADN del vector se utiliza para transfectar células de mamífero. Tales células pueden ser, por ejemplo, las líneas COS7, HeLa, BHK, CHO, o líneas L de ratón. Las células pueden cultivarse, por ejemplo, en medio DMEM (JRH Scientific). La variante de hIL-3 secretada en el medio puede recuperarse por procedimientos bioquímicos convencionales después de la expresión transitoria de 24 a 72 horas después de la transfección de las células o después del establecimiento de líneas celulares estables tras la selección con respecto a la resistencia a neomicina. En la técnica se conoce la selección de células hospedadoras de mamífero adecuadas y de métodos para la transformación, el cultivo, la amplificación, la selección y la producción y purificación del producto. Véase, por ejemplo, Gething y Sambrook, Nature, 293:620-625 (1981) o, como alternativa, Kaufman et al, Mol. Cell. Biol., 5 (7):1750-1759 (1985) o Howley et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.419.446. Otra línea celular de mamífero adecuada es la línea celular COS-1 de mono. Una línea celular de mamífero similarmente útil es la línea celular CV-1.

Cuando se desee, pueden utilizarse células de insecto como células hospedadoras en el método de la presente invención. Véase, por ejemplo, Miller et al, Genetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press 1986) y referencias citadas en este documento. Además, en Summers, M. D. y Smith, G. E. (1987) - A manual of methods for Baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555, se describen métodos generales para la expresión de genes extraños en células de insecto. Se construye un vector de expresión que comprende un vector de transferencia de Baculovirus, en el que un promotor fuerte de Baculovirus (tal como el promotor de polihedron) dirige la transcripción de una región codificante del péptido de señal de secreción eucariota, que está fusionado traduccionalmente a la región codificante para el polipéptido de fusión. Por ejemplo, puede usarse el plásmido pVL1392 (obtenido a partir de Invitrogen Corp., San Diego, California). Después de la construcción del vector que lleva el gen que codifica el polipéptido de fusión, se contransfectan dos microgramos de este ADN con un microgramo de ADN de Baculovirus (véase Summers & Smith, 1987) en células de insecto, cepa SF9. El Baculovirus recombinante puro que lleva la molécula de fusión se usa para infectar células cultivadas, por ejemplo, en medio sin suero Excell 401 (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas). La molécula de fusión secretada en el medio puede recuperarse por procedimientos bioquímicos convencionales. Los sobrenadantes de células de mamífero o de insectos que expresan la proteína de fusión pueden concentrarse primero usando cualquiera de varias unidades de concentración comerciales.

Las moléculas de fusión de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una reducción de los niveles de células mieloides, eritroides, linfoides o megacariocitos del sistema hematopoyético o combinaciones de las mismas. Además, pueden ser útiles para activar células mieloides y/o linfoides maduras. Entre las situaciones susceptibles al tratamiento con los polipéptidos de la presente invención se encuentran la leucopenia, una reducción en el número de leucocitos circulantes (glóbulos blancos) en la sangre periférica. La leucopenia puede inducirse por exposición a ciertos virus o a radiación. A menudo, es un efecto secundario de diversas formas de terapia para el cáncer, por ejemplo exposición a fármacos quimioterapéuticos o radiación, y de infección o hemorragia. El tratamiento terapéutico de la leucopenia con estas moléculas de fusión de la presente invención puede evitar efectos secundarios indeseables producidos por el tratamiento con fármacos disponibles en la actualidad.

Las moléculas de fusión de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento de la neutropenia y, por ejemplo, en el tratamiento afecciones tales como anemia aplástica, neutropenia cíclica, neutropenia idiopática, síndrome de Chediak-Higashi, lupus sistémico eritematoso (SLE), leucemia, síndrome mielodisplásico y mielofibrosis.

La molécula de fusión de la presente invención puede ser útil al tratamiento o prevención de la trombocitopenia. Actualmente, la única terapia para la trombocitopenia es la transfusión de plaquetas que son caras y que conllevan los riesgos significativos de infección (VIH, VHB) y aloinmunización. La molécula de fusión puede aliviar o disminuir la necesidad de transfusiones de plaquetas. La trombocitopenia grave puede deberse a defectos genéticos tales como la anemia de Fanconi o los síndromes de Wiscott-Aldrich o de May-Hegglin. La trombocitopenia adquirida puede producirse por auto- o alo-anticuerpos, tal como en la trombocitopenia púrpura inmune, lupus sistémico eritematoso, anemia hemolítica o incompatibilidad entre el feto y la madre. Además, la esplenomegalia, la coagulación intravascular diseminada, la púrpura trombocitopénica trombótica, la infección o las válvulas cardíacas protésicas pueden ocasionar trombocitopenia. La trombocitopenia grave también puede producirse por quimioterapia y/o terapia de radiación o por un cáncer. La trombocitopenia también puede deberse a una invasión de la médula por un carcinoma, linfoma, leucemia o fibrosis.

Las moléculas de fusión de la presente invención pueden ser útiles en la movilización de progenitores hematopoyéticos y células madre en la sangre periférica. Se ha demostrado que ciertos progenitores derivados de sangre periférica son eficaces en la reconstitución de pacientes en la situación de trasplante de médula autólogo. Se ha demostrado que los factores de crecimiento hematopoyéticos, incluyendo G-CSF y GM-CSF aumentan el número de progenitores circulantes y las células madre en la sangre periférica. Esto ha simplificado el procedimiento para la extracción de células madre periféricas y ha reducido drásticamente el coste del procedimiento disminuyendo el número de féresis requeridas. La molécula de fusión puede ser útil en la movilización de células madre y potenciar adicionalmente la eficacia del trasplante de células madre periféricas.

Otro uso clínico proyectado de factores de crecimiento ha sido la activación in vitro de progenitores hematopoyéticos y células madre para la terapia génica. Para tener el gen de interés incorporado en el genoma del progenitor hematopoyético o célula madre, se necesita estimular la división celular y la replicación del ADN. Las células madre hematopoyéticas completan el ciclo celular a una frecuencia muy baja, lo que significa que ciertos factores de crecimiento pueden ser útiles para promover la transducción génica y, por lo tanto, aumentar las expectativas clínicas para la terapia génica.

Muchos fármacos pueden producir una represión de la médula ósea o deficiencias hematopoyéticas. Son ejemplos de tales fármacos AZT, DDI, agentes alquilantes y anti-metabolitos usados en quimioterapia, antibióticos tales como cloranfenicol, penicilina, ganciclovir, daunomicina y sulfa-fármacos, fenotiazonas, tranquilizantes tales como meprobamato, analgésicos tales como aminopirina y dipirona, anticonvulsivantes tales como fenitoína o carbamazepina, y antitiroideos tales como propiltiouracilo y metimazol, y diuréticos. Las moléculas de fusión de la presente invención pueden ser útiles en la prevención o tratamiento de la represión de la médula ósea o en deficiencias hematopoyéticas que a menudo se producen en pacientes tratados con estos fármacos.

También pueden producirse deficiencias hematopoyéticas como resultado de infecciones virales, microbianas o parasitarias y como resultado del tratamiento de la enfermedad renal o insuficiencia renal, por ejemplo, de la diálisis. Las moléculas de fusión de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento de tal deficiencia hematopoyética.

El tratamiento de la deficiencia hematopoyética puede incluir la administración de una composición farmacéutica que contiene las moléculas de fusión a un paciente. Las moléculas de fusión de la presente invención también pueden ser útiles para la activación y amplificación de células precursoras hematopoyéticas por medio del tratamiento de estas células in vitro con las proteínas de fusión de la presente invención antes de inyectar las células a un paciente.

Diversas inmunodeficiencias, por ejemplo de linfocitos T y/o B, o trastornos inmunes, por ejemplo la artritis reumatoide, también pueden verse afectadas beneficiosamente por el tratamiento con las moléculas de fusión de la presente invención. Las inmunodeficiencias pueden ser el resultado de infecciones virales, por ejemplo por HTLVI, HTLVII o HTLVIII, de una exposición severa a la radiación, de una terapia contra el cáncer o el resultado de otro tratamiento médico. Las moléculas de fusión de la presente invención también pueden ser útiles, solas o en combinación con otras hematopoyetinas, en el tratamiento de otras deficiencias de células sanguíneas, incluyendo trombocitopenia (deficiencia de plaquetas) o anemia. Los nuevos polipéptidos también pueden ser útiles en el tratamiento de pacientes que se recuperan de transplantes de médula ósea in vivo y ex vivo, y en el desarrollo de anticuerpos monoclonales y policlonales generados por métodos convencionales para uso de diagnóstico o terapéutico.

Otros aspectos de la presente invención son composiciones terapéuticas para tratar las afecciones mencionadas anteriormente. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más de las moléculas de fusión de la presente invención en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede ser útil para administrarse por vía parenteral, intravenosa o subcutánea. La composición terapéutica de esta invención está preferiblemente en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, sin pirógenos. La preparación de tal solución proteica parenteralmente aceptable, teniendo en cuenta debidamente el pH, la isotonicidad, la estabilidad y similares, está dentro de la experiencia en la técnica.

El régimen de dosificación implicado en un método para tratar las afecciones descritas anteriormente se determinará por el médico a cargo del caso considerando diversos factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, el estado, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, el momento de administración y otros factores clínicos. Generalmente, un régimen diario puede estar en el intervalo de 0,2-150 \mug/kg de proteína de fusión por kilogramo de peso corporal. Este régimen de dosificación hace referencia a un nivel convencional de actividad biológica que reconoce que la IL-3 nativa generalmente posee una CE_{50} de o aproximadamente de 10 picomolar a 100 picomolar en el ensayo de proliferación de AML descrito en este documento. Por lo tanto, las dosificaciones se ajustarían con respecto a la actividad de una proteína de fusión dada frente a la actividad de la IL-3 (de referencia) nativa, y sería razonable indicar que los regímenes de dosificación pueden incluir dosis tan bajas como de 0,1 microgramos y tan altas como de 1 miligramo por kilogramo de peso corporal al día. Además, pueden existir circunstancias específicas en las que las dosificaciones de la molécula de fusión se ajusten por encima o por debajo del intervalo de 10-200 microgramos por kg de peso corporal. Éstas incluyen la coadministración con otro factor estimulador de colonias o variante de IL-3 o factores del crecimiento; la coadministración con fármacos quimioterapéuticos y/o radiación; el uso de una proteína de fusión glicosilada; y diversas cuestiones relacionadas con el paciente mencionadas anteriormente en esta sección. Como se ha indicado anteriormente, el método terapéutico y las composiciones también pueden incluir la coadministración con otros factores humanos. Una lista no exclusiva de otras hematopoyetinas apropiadas, CSF, citoquinas, linfoquinas, factores de crecimiento hematopoyéticos e interleuquinas para coadministración simultánea o en serie con las proteínas de fusión de la presente invención incluye GM-CSF, CSF-1, G-CSF, Meg-CSF, M-CSF, eritropoyetina (EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF, factor de crecimiento de células B, factor de diferenciación de células B y factor de diferenciación de eosinófilos, factor de células madre (SCF) también conocido como factor de Steel o ligando c-kit, o combinaciones de los mismos. La dosificación mencionada anteriormente debe ajustarse para compensar tales componentes adicionales presentes en la composición terapéutica. El progreso del paciente tratado puede controlarse mediante una evaluación periódica del perfil hematológico, por ejemplo, el recuento diferencial de células y similares.

Materiales y métodos para la expresión de moléculas de fusión en E. Coli

A menos que se indique otra cosa, todos los agentes químicos de especialidad se obtienen en Sigma Co., (St. Louis, MO). Las endonucleasas de restricción, la polinucleótido quinasa de T4, el fragmento grande de la ADN polimerasa I de E. Coli y la ADN ligasa de T4 se obtienen en New England Biolabs (Beverly, Massachusetts).

Cepas de Escherichia coli

Cepa JM101: delta (pro lac), supE, thi, F' (traD36, rpoAB, lacI-Q, lacZdeltaM15) (Messing, 1979). Esta cepa puede obtenerse en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, número de acceso 33876. MON 105 (W3110 rpoH358) es un derivado de W3110 (Bachmann, 1972) y se le ha asignado el número de acceso ATCC 55204. Cepa GM48: dam-3, dcm-6, gal, ara, lac, thr, leu, tonA, tsx (Marinus, 1973) se usa para obtener un ADN plasmático que no esté metilado en la secuencia GATC.

Genes y plásmidos

El gen usado para la producción de hIL-3 en E. Coli se obtiene a partir de British Biotechnology Incorporated, Cambridge, Inglaterra, con el número de catálogo BBG14. Este gen se transporta en un plásmido basado en pUC designado pP0518. Pueden obtenerse muchos otros genes CSF humanos a partir de R&D Systems, Inc. (Minn, MN) incluyendo alfa IL-1, beta IL-1, IL-2, IL-4, Il-5, IL-6, IL-7, IL-8, G-CSF, GM-CSF y LIF.

Los plásmidos usados para la producción de hIL-3 en E. Coli contienen elementos genéticos cuyo uso se ha descrito (Olins et al., 1988; Olins y Rangwala, 1990). El replicón usado es el de pBR327 (Covarrubias, et al., 1981) que se mantiene en un número de copias de aproximadamente 100 en la célula (Soberon et al., 1980). En los plásmidos está presente un gen que codifica la proteína beta-lactamasa. Esta proteína confiere resistencia a ampicilina a la célula. Esta resistencia sirve como fenotipo seleccionable con respecto a la presencia del plásmido en la célula.

Para los vectores de expresión citoplasmáticos, el promotor de la transcripción procede del gen recA de E. Coli (Sancar et al., 1980). Este promotor, designado precA, incluye el sitio de unión a la ARN polimerasa y el sitio de unión al represor de lexA (el operador). Este segmento de ADN proporciona una transcripción de alto nivel que se regula aunque el promotor recA esté en un plásmido con el origen de replicación de pBR327 (Olins et al., 1988) incorporado en este documento como referencia.

El sitio de unión a ribosomas usado es el del gen 10 del fago T7 (Olins et al., 1988). Éste se codifica en un fragmento de 100 pares de bases (pb) localizado de forma adyacente al precA. En los plásmidos usados en esta invención, la secuencia de reconocimiento para la enzima NcoI (CCATGG) sigue al g10-L. Es en este sitio NcoI donde los genes de hIL-3 se unen al plásmido. Es de esperar que la secuencia de nucleótidos en esta unión se reconozca en el ARNm como un sitio de inicio funcional para la traducción (Olins et al., 1988). Los genes de hIL-3 usados se modificaron por ingeniería genética para tener un sitio de reconocimiento HindIII (AAGCTT) cadena debajo de la secuencia codificante del gen. En este sitio HindIII hay un fragmento RsaI de 514 pares de bases que contiene el origen de replicación del fago monocatenario f1 (Dente et al., 1983; Olins, et al., 1990) ambos incorporados en este documento como referencia. Un plásmido que contiene estos elementos es pMON2341. Otro plásmido que contiene estos elementos es pMON5847, que se ha depositado en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 con el número de acceso ATCC 68912.

En los plásmidos de expresión de secreción, el promotor de la transcripción procede de los genes ara B, A, y D de E. coli (Greenfield et al}., 1978). Este promotor se denomina pAraBAD y está contenido en un fragmento de restricción SacII, BglII de 323 pares de bases. La secuencia directora de secreción LamB(Wong et al., 1988, Clement et al., 1981) está unida al extremo N del gen de hIL-3 en la secuencia de reconocimiento para la enzima NcoI (5'CCATGG3'). Los genes de hIL-3 usados se modificaron por ingeniería genética para tener un sitio de reconocimiento HindIII (5'AAGCTT3') después de la secuencia codificante del gen.

Métodos de ADN recombinante Ensamblaje de genes sintéticos

Los genes variantes de hIL-3 y otros genes de CSF pueden construirse por el ensamblaje de oligonucleótidos sintéticos. Se diseñan oligonucleótidos sintéticos de forma que hibriden en pares complementarios, con extremos salientes monocatenarios, y cuando los pares se ensamblen de manera apropiada darán como resultado una secuencia de ADN que codifica una porción del gen deseado. Las substituciones de aminoácidos en el gen de hIL-3 se realizan diseñando los oligonucleótidos para que codifiquen las substituciones deseadas. Los oligonucleótidos complementarios se hibridan a una concentración de 1 picomol por microlitro en tampón de unión más NaCl 50 mM. Las muestras se calientan en un vaso de precipitados de 100 ml de agua hirviendo y se dejan enfriar lentamente a temperatura ambiente. Un picomol de cada uno de los pares de oligonucleótidos hibridados se une con aproximadamente 0,2 picomoles de ADN plasmídico, digerido con las enzimas de restricción apropiadas, en tampón de unión (Tris 25 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 10 mM, ATP 1 mM, espermidina 2 mM) con ADN ligasa de T4 obtenida en New England Biolabs (Beverly, Massachusetts) en un volumen total de 20 \mul a temperatura ambiente durante una noche.

Reacción en cadena de la polimerasa

Las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (denominada en lo sucesivo PCR) (Saiki, 1985) usaron el kit de reactivos y el aparato de ciclos térmicos de Perkin-Elmer Cetus (Norwalk, CT.). La PCR se basa en una ADN polimerasa termoestable de Thermus aquaticus. La técnica de PCR es un método de amplificación de ADN que imita el proceso de replicación de ADN natural, ya que el número de moléculas de ADN se duplica después de cada ciclo de una forma similar a la replicación in vivo. La extensión mediada por la ADN polimerasa es en la dirección 5' a 3'. El término ``cebador'', como se usa en este documento, se refiere a una secuencia de oligonucleótidos que proporciona un extremo en el que la ADN polimerasa puede añadir nucleótidos que son complementarios a una secuencia de nucleótidos. Esta última secuencia de nucleótidos se denomina ``plantilla'', con la que hibridan los cebadores. El producto de PCR amplificado se define como la región comprendida entre los extremos 5' de los cebadores de extensión. Como los cebadores tienen secuencias definidas, el producto tendrá extremos discretos, correspondientes a las secuencias de los cebadores. La reacción de extensión del cebador se realiza usando 20 picomoles (pmoles) de cada uno de los oligonucleótidos y 1 picogramo de ADN plasmídico de plantilla durante 35 ciclos (1 ciclo se define como 94 grados C durante un minuto, 50 grados C durante dos minutos y 72 grados durante tres minutos.). La mezcla de reacción se extrae con un volumen igual de fenol/cloroformo (50% de fenol y 50% de cloroformo, volumen/volumen) para retirar las proteínas. La fase acuosa, que contiene el ADN amplificado, y una fase de disolvente se separan por centrifugación durante 5 minutos en una microcentrífuga (Modelo 5414, Eppendorf Inc, Fremont CA.). Para precipitar el ADN amplificado, la fase acuosa se retira y se transfiere a un tubo limpio al que se añaden 0,1 volúmenes de NaOAc 3M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol (al 100%, almacenado a menos 20 grados C). La solución se mezcla y se pone sobre hielo seco durante 20 minutos. El ADN se sedimenta por centrifugación durante 10 minutos en una microcentrífuga y la solución se retira del sedimento. El sedimento de ADN se lava con etanol al 70%, y el etanol se retira y se seca en un concentrador speedvac (Savant, Farmingdale, Nueva York). El sedimento se resuspende en 25 microlitros de TE (Tris-HCl 20 mM, pH 7,9, EDTA 1 mM). Como alternativa, el ADN se precipita añadiendo un volumen igual de NH_{4}OAc 4M y un volumen de isopropanol [Treco et al., (1988)]. La solución se mezcla y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos y se centrifuga. Estas condiciones precipitan selectivamente fragmentos de ADN mayores que \sim20 bases y se usan para retirar cebadores oligonucleotídicos. Un cuarto de la reacción se digiere con enzimas de restricción [Higuchi, (1989)] y, después de finalizar la digestión, se calienta a 70 grados C para inactivar las enzimas.

Recuperación de plásmidos recombinantes a partir de mezclas de unión

Se hacen competentes células JM101 de E. Coli para captar ADN. Típicamente, se cultivan de 20 a 100 ml de células en medio LB hasta una densidad de aproximadamente 150 unidades Klett y después se recogen por centrifugación. Las células se resuspenden en una mitad del volumen de cultivo de CaCl_{2} 50 mM y se mantienen a 4ºC durante una hora. Las células se recogen de nuevo por centrifugación y se resuspenden en un décimo del volumen de cultivo de CaCl_{2} 50 mM. Se añade ADN a un volumen de 150 \mul de estas células, y las muestras se mantienen a 4ºC durante 30 minutos. Las muestras se cambian a 42ºC durante un minuto, se añade 1 ml de LB, y las muestras se agitan a 37ºC durante 1 hora. Se extienden células de estas muestras sobre placas que contienen ampicilina para seleccionar los transformantes. Las placas se incuban durante una noche a 37ºC. Se recogen colonias individuales y se cultivan en LB suplementado con ampicilina durante una noche a 37ºC con agitación. A partir de estos cultivos, se aísla el ADN para el análisis de restricción.

Medio de cultivo

Para el cultivo de las células para aislar el ADN se usa medio LB (Maniatis et al., 1982). Para los cultivos en los que se produce una molécula de fusión recombinante, se usa medio mínimo M9 suplementado con casaminoácidos al 1,0%, y caseína hidrolizada con ácidos, Difco (Detroit, Michigan). Los ingredientes en el medio M9 son los siguientes: 3 g/litro de KH_{2}PO_{4}, 6 g/l de Na_{2}HPO_{4}, 0,5 g/l de NaCl, 1 g/l de NH_{4}Cl, MgSO_{4} 1,2 mM, CaCl_{2} 0,025 mM, glucosa al 0,2% (glicerol al 0,2% con el promotor AraBAD), casaminoácidos al 1%, 0,1 ml/l de oligoelementos (por litro, 108 g de FeCl_{3}\cdot6H_{2}O, 4,0 g de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 7,0 de CoCl_{2}\cdot2H_{2}O, 7,0 g de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 8,0 g de CuSo_{4}\cdot5H_{2}O, 2,0 g de H_{3}BO_{3}, 5,0 g de MnSO_{4}\cdotH_{2}O, y 100 ml de HCl concentrado). Se usa bacto agar para medios sólidos y se añade ampicilina a medios LB tanto líquidos como sólidos a 200 microgramos por mililitro.

Producción de moléculas de fusión en E. Coli con vectores que emplean el promotor recA

Se cultivan cepas de E. Coli que llevan los plásmidos de interés a 37ºC en medio M9 más casaminoácidos con agitación en un baño de agua Gyrotory modelo G76 procedente de Brunswick Scientific (Edison, New Jersey). El cultivo se controla con un medidor Klett Summerson (filtro verde 54), Klett Mfg. Co. (Nueva York, Nueva York). A un valor de Klett de aproximadamente 150, se retira una alícuota del cultivo (normalmente 1 ml) para un análisis de proteínas. Al cultivo restante se le añade ácido nalidíxico (10 mg/ml) en NaOH 0,1 N hasta una concentración final de 50 \mug/ml. Los cultivos se agitan a 37ºC durante 3 a 4 horas después de la adición de ácido nalidíxico. A lo largo de todo el cultivo bacteriano se mantiene un alto grado de aireación para conseguir una producción máxima del producto génico deseado. Las células se examinan con microscopio óptico para comprobar la presencia de cuerpos refringentes (RB). Se retiran alícuotas de un mililitro del cultivo para el análisis del contenido de proteínas.

Fraccionación de células E. Coli que producen proteínas de fusión en el citoplasma

La primera etapa en la purificación de las moléculas de fusión es sonicar las células. Se resuspenden alícuotas del cultivo procedentes de sedimentos celulares en tampón de sonicación: Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 50 mM y PMSF 0,1 mM. Estas células resuspendidas se someten a varios estallidos de sonicación repetidos usando la micropunta de un rompedor de células Sonicator, modelo W-375 obtenido en Heat Systems-Ultrasonics Inc. (Farmingdale, Nueva York). El grado de sonicación se controla examinando los homogeneizados con un microscopio óptico. Cuando casi todas las células se han roto, los homogeneizados se fraccionan por centrifugación. Los sedimentos, que contienen la mayoría de los cuerpos refractarios, están muy enriquecidos en proteínas de fusión.

Métodos Extracción, replegado y purificación de moléculas de fusión expresadas como cuerpos refractarios en E. coli

Estas proteínas de fusión pueden purificarse por una diversidad de métodos convencionales. Algunos de estos métodos se describen con detalle en Methods in Enzymology, Volumen 182 ``Guide to Protein Purification'' editado por Murray Deutscher, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Las proteínas de fusión que se producen como cuerpos de inclusión insolubles en E. Coli pueden solubilizarse en altas concentraciones de desnaturalizante, tales como Guanidina HCl o Urea, incluyendo ditiotreitol o beta mercaptoetanol como agente de reducción. El plegamiento de la proteína en una conformación activa puede realizarse mediante diálisis secuencial a concentraciones inferiores de desnaturalizante sin agente de reducción.

En algunos casos, las proteínas plegadas pueden purificarse por afinidad usando reactivos de afinidad tales como mAbs o subunidades de receptores unidas a una matriz adecuada. Como alternativa, (o además) la purificación puede realizarse usando cualquiera de una diversidad de métodos cromatográficos tales como: intercambio iónico, exclusión molecular o cromatografía hidrófoba o HPLC de fase inversa.

ELISA de sandwich de hIL-3

Las concentraciones de proteínas de fusión pueden determinarse usando un ELISA de sándwich basado en un anticuerpo apropiado purificado por afinidad. Se recubren placas de microtitulación (Dynatech Immulon II) con 150 \mul de anticuerpo de cabra anti-rhIL-3 a una concentración de aproximadamente 1 \mug/ml en NaHCO3 100 mM, pH 8,2. Las placas se incuban durante una noche a temperatura ambiente en una cámara que mantiene la humedad al 100%. Se vacían los pocillos y los sitios reactivos restantes en la placa se bloquean con 200 \mul de solución que contiene PBS 10 mM, BSA al 3% y Tween 20 al 0,05%, pH 7,4, durante 1 hora a 37ºC y con un 100% de humedad. Se vacían los pocillos y se lavan 4 veces con NaCl 150 mM que contiene Tween 20 al 0,05% (tampón de lavado). Después, cada pocillo recibe 150 \mul de tampón de dilución (PBS 10 mM que contiene BSA al 0,1%, Tween 20 al 0,01%, pH 7,4), que contiene patrón de rhIL-3, tampón de control, de muestra o de dilución solo. Se prepara una curva patrón con concentraciones que varían de 0,125 ng/ml a 5 ng/ml usando una solución madre de rhIL-3 (concentración determinada por análisis de composición de aminoácidos). Las placas se incuban durante 2,5 horas a 37ºC y con un 100% de humedad. Se vacían los pocillos y cada placa se lava 4 veces con tampón de lavado. Después, cada pocillo recibió 150 \mul de una dilución óptima (determinada en un formato de ensayo de tablero de ajedrez) de anticuerpo de cabra anti-rhIL-3 conjugado con peroxidasa de rábano picante. Las placas se incuban durante 1,5 horas a 37ºC y con un 100% de humedad. Se vacían los pocillos y cada placa se lava 4 veces con tampón de lavado. Después, cada pocillo recibió 150 \mul de solución de substrato ABTS (Kirkegaard y Perry). Las placas se incuban a temperatura ambiente hasta que aparece un color en los pocillos patrón que contienen 5 ng/ml de rhIL-3, en una intensidad suficiente como para proporcionar una absorbancia entre 0,5 y 1,0 cuando se lee a una longitud de onda de ensayo de 410 nm y a una longitud de onda de referencia de 570 nm en un lector de placas de microtitulación Dynatech. Las concentraciones de rhIL-3 inmunorreactiva en muestras desconocidas se calculan a partir de la curva patrón usando un software suministrado con el lector de placas.

Ensayo de proliferación de AML para la Interleuquina-3 humana bioactiva

La línea celular dependiente de factor AML 193 se obtuvo a partir de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Esta línea celular, establecida a partir de un paciente con leucemia mielógena aguda, es una línea celular dependiente de factor de crecimiento que mostró un mayor crecimiento en medio suplementado con GM-CSF (Lange, B., et al., (1987); Valtieri, M., et al., (1987). También se ha documentado la capacidad de las células AML 193 para proliferar en presencia de IL-3 humana. (Santoli, D., et al., (1987)). Se usó una variante de línea celular, AML 193 1.3, que se adaptó para el crecimiento a largo plazo en IL-3 lavando los factores de crecimiento y privando a las células AML 193 dependientes de citoquina de los factores de crecimiento durante 24 horas. Después, las células se volvieron a cultivar a 1x10^{5} células/pocillo en una placa de 24 pocillos en un medio que contenía 100 U/ml de IL-3. Las células tardaron aproximadamente dos meses en crecer rápidamente en IL-3. Estas células se mantienen como AML 193 1.3 posteriormente, suplementando el medio de cultivo de tejidos (véase más adelante) con IL-3 humana.

Las células AML 193 1.3 se lavan 6 veces en una solución salina equilibrada de Hanks fría (HBSS, Gibco, Grand Island, NY) centrifugando las suspensiones celulares a 250 x g durante 10 minutos seguido de la decantación del sobrenadante. Las células sedimentadas se resuspenden en HBSS y el procedimiento se repite hasta que se completan seis ciclos de lavado. Las células lavadas seis veces mediante este procedimiento se resuspenden en medio de cultivo de tejidos a una densidad que varía de 2 x 10^{5} a 5 x 10^{5} células viables/ml. Este medio se prepara suplementando medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM, Hazleton, Lenexa, KS) con albúmina, transferrina, lípidos y 2-mercaptoetanol. La albúmina bovina (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) se añade a una concentración de 500 \mug/ml; la transferrina humana (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) se añade a una concentración de 100 \mug/ml; el lípido de soja (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) se añade a una concentración de 50 \mug/ml; y el 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO) se añade a una concentración de 5 x 10^{-5} M.

Se realizan diluciones en serie de interleuquina-3 humana o de proteína de fusión (muteína de hIL-3) en series triplicadas en medio de cultivo de tejidos suplementado como se ha indicado anteriormente, en placas de cultivo de tejidos Costar 3596 de 96 pocillos. Cada pocillo contenía 50 \mul de medio que contenía interleuquina-3 o proteína de fusión una vez terminadas las diluciones en serie. Los pocillos de control contenían medio de cultivo de tejidos solo (control negativo). A cada pocillo se le añaden suspensiones de células AML 193 1.3 preparadas como se ha indicado anteriormente introduciendo en cada pocillo, con la ayuda de una pipeta, 50 ml (2,5 x 10^{4} células). Las placas de cultivo de tejidos se incuban a 37ºC con un 5% de CO_{2} en aire humidificado durante 3 días. En el día 3, se añaden 0,5 \muCi de ^{3}H-timidina (2 Ci/mM, New England Nuclear, Boston, MA) en 50 \mul de medio de cultivo de tejidos. Los cultivos se incuban a 37ºC con un 5% de CO_{2} en aire humidificado durante 18-24 horas. El ADN celular se recoge en mallas de filtro de vidrio (Pharmacia LKB, Gaithersburg, MD) usando un recolector de células TOMTEC (TOMTEC, Orange, CT) que utilizaba un ciclo de lavado con agua seguido de un ciclo de lavado con etanol al 70%. Las mallas de filtro se dejan secar al aire y después se ponen en bolsas de muestra a las que se añade fluido de centelleo (Scintiverse II, Fisher Scientific, St. Louis, MO o BetaPlate Scintillation Fluid, Pharmacia LKB, Gaithersburg, MD). Se cuentan las emisiones beta de las muestras de los pocillos de cultivo de tejidos individuales en un contador de centelleo LKB Betaplate modelo 1205 (Pharmacia LKB, Gaithersburg, MD) y los datos se expresan como cuentas por minuto de ^{3}H-timidina incorporada en las células de cada pocillo de cultivo de tejidos. La actividad de cada preparación de interleuquina-3 humana o de la preparación de la proteína de fusión se cuantifica midiendo la proliferación celular (incorporación de ^{3}H-timidina) inducida por concentraciones graduadas de interleuquina-3 o de proteína de fusión. Típicamente, en estos ensayos se cuantifican intervalos de concentraciones de 0,05 pM - 10^{5} pM. La actividad se determina midiendo la dosis de interleuquina-3 o de molécula de fusión que proporciona el 50% de la proliferación máxima [EC_{50} = 0,5 x (cuentas medias máximas por minuto de ^{3}H-timidina incorporada por pocillo entre cultivos por triplicado de todas las concentraciones de interleuquina-3 ensayadas - proliferación de fondo medida mediante la incorporación de ^{3}H-timidina observada en cultivos por triplicado que carecen de interleuquina-3]. Este valor de EC_{50} también es equivalente a 1 unidad de bioactividad. Cada ensayo se realiza con interleuquina-3 nativa como patrón de referencia de forma que puedan asignarse los niveles de actividad relativa.

Ensayo de metilcelulosa

Este ensayo proporciona una aproximación razonable de la actividad de crecimiento de factores estimuladores de colonias para estimular células de médula ósea normal para que produzcan diferentes tipos de colonias hematopoyéticas in vitro (Bradley et al., 1966, Pluznik et al., 1965).

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Métodos

Se obtienen aproximadamente 30 ml de aspirado de médula ósea normal, sana, recién preparada, a partir de individuos. En condiciones estériles, se diluyen muestras a 1:5 con una solución 1XPBS (Nº 14040.059 Life Technologies, Gaithersburg, MD.) en un tubo cónico de 50 ml (Nº 25339-50 Corning, Corning MD). Se deposita Ficoll (Histopaque-1077 Sigma H-8889) debajo de la muestra diluida y se centrifuga a 300 x g durante 30 minutos. La banda de células mononucleares se retira y se lava dos veces en 1XPBS y una vez con BSA PBS al 1% (CellPro Co., Bothel, WA). Se cuentan las células mononucleares y se seleccionan las células CD34+ usando la columna del Kit Ceprate LC (CD34) (CellPro Co., Bothel, WA). Esta fraccionación se realiza porque todas las células madre y progenitoras dentro de la médula ósea presentan el antígeno superficial CD34. Como alternativa, puede usarse médula ósea entera o sangre periférica.

Se establecen cultivos en pocillos por triplicado con un volumen final de 0,1 ml en placas de cultivo de tejidos de 48 pocillos (Nº 3548 Costar, Cambridge, MA). El medio de cultivo se adquiere en Terry Fox Labs. (medio HCC-4330 (Terry Fox Labs, Vancouver, B.C., Canadá)). Se añaden 600-1000 células CD34+ por pocillo. Se añaden IL-3 nativa y molécula de fusión para proporcionar concentraciones finales que varían de 0,001 nM a 10 nM. Se añaden G-CSF y GM-CSF y ligando C-Kit a una concentración final de 0,1 nm. La IL-3 nativa y las moléculas de fusión se suministran internamente. El ligando C-Kit (Nº 255-CS), el G-CSF (Nº 214-CS) y el GM-CSF (Nº 215-GM) se adquieren en R&D Systems (Minneapolis, MN). Los cultivos se resuspenden usando un repetidor Eppendorf y se distribuyen 0,1 ml por pocillo. Los cultivos de control (respuesta basal) no recibieron factores estimuladores de colonias. Los cultivos de control positivo recibieron medio acondicionado (células humanas estimuladas con PHA: Terry Fox Lab. H2400). Los cultivos se incuban a 37ºC con un 5% de CO_{2} en aire humidificado.

Las colonias hematopoyéticas que se consideran mayores de 50 células se cuentan en el día de la respuesta máxima (días 10-11) usando un microcospio de fase inversa Nikon con una combinación de objetivos de 40 aumentos. Los grupos de células que contienen menos de 50 células se denominan agrupamientos. Como alternativa, las colonias pueden identificarse extendiendo las colonias en un portaobjetos y sometiéndolas a una tinción o pueden recogerse, resuspenderse y centrifugarse en portaobjetos Cytospin para la tinción.

Ensayos de factor de crecimiento hemopoyético de sangre de cordón humano

Tradicionalmente se usan células de médula ósea para realizar ensayos in vitro de la actividad del factor estimulador de colonias (CSF) hematopoyético. Sin embargo, no siempre se dispone de médula ósea humana, y existe una variabilidad considerable entre los donadores. La sangre del cordón umbilical es comparable a la médula ósea como fuente de células madre hematopoyéticas y progenitores (Broxmeyer et al., 1992; Mayani et al., 1993). A diferencia de la médula ósea, la sangre de cordón se puede adquirir más fácilmente de una base regular. También se puede reducir la variabilidad del ensayo reuniendo células obtenidas recientemente de varios donadores o crear un banco de células crioconservadas para este fin. Por medio de la modificación de las condiciones de cultivo y/o del análisis de los marcadores específicos de linaje, debe ser posible realizar un ensayo específicamente con respecto a las colonias de granulocitos/macrófagos (CFU-GM), con respecto a la actividad CSF de megacariocitos, o con respecto a la actividad de células formadoras de colonias con un alto potencial proliferativo (HPP-CFC).

Métodos

Se aíslan células mononucleares (MNC) a partir de sangre de cordón en las 24 horas posteriores a su obtención, usando un gradiente de densidad convencional (1,077 g/ml de Histopaque). Se han enriquecido adicionalmente MNC de sangre de cordón con respecto a células madre y progenitoras mediante varios procedimientos, incluyendo la selección inmunomagnética de células CD14-, CD34+; la visualización de la fracción SBA-, CD34+ usando matraces recubiertos de Applied Immune Science (Santa Clara, CA); y la selección de CD34+ usando una columna de avidina CellPro (Bothell, WA). Para el ensayo se usan fracciones enriquecidas en células CD34+ crioconservadas o aisladas recientemente. Se preparan cultivos por duplicado para cada dilución en serie de la muestra (intervalo de concentraciones de 1 pm a 1204 pm) con 1 x 104 células en 1 ml de medio que contiene un 0,9% de metocelulosa sin factores de crecimiento adicionales (Methocult H4230 de Stem Cell Technologies, Vancouver, BC). En algunos experimentos, se usó Methocult H4330 que contenía eritropoyetina (EPO) en lugar de Methocult H4230 o Factor de Células Madre (SCF), y se añadieron 50 ng/ml (Biosource International, Camarillo, CA). Después del cultivo durante 7-9 días, se cuentan las colonias que contienen >30 células. Para descartar la variación subjetiva en la puntuación, los ensayos se puntúan siguiendo un diseño ciego.

Liberación de sulfidoleucotrieno mediada por IL-3 a partir de células mononucleares humanas

El siguiente ensayo se usa para medir la liberación de sulfidoleucotrieno mediada por IL-3 a partir de células mononucleares humanas.

Se recoge sangre humana que contiene heparina y se deposita sobre un volumen igual de medio de Ficoll-Paque (Pharmacia Nº 17-0840-02) listo para el uso (con una densidad de 1,077 g/ml). El Ficoll se calienta a temperatura ambiente antes del uso y se utilizan tubos de poliestireno transparentes de 50 ml. El gradiente de Ficoll se centrifuga a 300 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente usando un rotor H1000B en una centrífuga refrigerada Sorvall RT6000B. La banda que contiene las células mononucleares se retira cuidadosamente, el volumen se ajusta a 50 ml con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (Gibco Laboratories, Nº de cat. 310-4040 PK), se centrifuga a 400 x g durante 10 minutos a 4ºC y el sobrenadante se retira cuidadosamente. El sedimento celular se lava dos veces con tampón HA [Hepes 20 mM (Sigma Nº H-3375), NaCl 125 mM (Fischer Nº S271-500), KCl 5 mM (Sigma Nº P-9541), glucosa 0,5 mM (Sigma Nº G-5000), albúmina de suero humano al 0,025% (Calbiochem Nº 126654) y se centrifuga a 300 x g durante 10 minutos a 4ºC. Las células se resuspenden en tampón HACM (tampón HA suplementado con CaCl2 1 mM (Fisher Nº C79-500) y MgCl2 1 mM (Fisher Nº M-33) a una concentración de 1 x 106 células/ml y se transfieren 180 \mul a cada pocillo de placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Se deja que las células se aclimaten a 37ºC durante 15 minutos. Las células se ceban añadiendo 10 \mul de una solución madre 20 X de diversas concentraciones de citoquina a cada pocillo (típicamente IL3 100000, 20000, 4000, 800, 160, 32, 6,4, 1,28 y 0 fM). Las células se incuban durante 15 minutos a 37ºC. La liberación de sulfidoleucotrieno se activa por la adición de 10 \mul de 20 X (1000 nM) de fmet-leu-phe (Calbiochem Nº 344252) a una concentración final de FMLP 50 nM e incubando durante 10 minutos a 37ºC. Las placas se centrifugan a 350 x g a 4ºC durante 20 minutos. Los sobrenadantes se retiran y se ensayan con respecto a los sulfidoleucotrienos usando el kit de EIA de Leucotrieno C4 de Cayman (Nº de Cat. 420211) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La hIL-3 nativa se procesa como un control convencional en cada ensayo.

Pueden encontrase otros detalles conocidos para los especialistas en la técnica en T. Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) y referencias citadas en dicho documento, incorporado en este documento como referencia; y en J. Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), y referencias citadas en dicho documento, incorporado en este documento como referencia.

En el documento WO 94/12639, publicado el 9 de junio de 1994, pueden encontrarse detalles adicionales sobre las variantes de IL-3 de la presente invención.

En los documentos WO 92/04455 y WO 91/02754 pueden encontrarse detalles adicionales sobre cómo fabricar la proteína de fusión.

En las Patentes de Estados Unidos 4.810.643, 5.218.092 y en la Solicitud de Patente E.P. 02174004 pueden encontrarse detalles adicionales sobre los CSF y las variantes de los mismos.

Los siguientes ejemplos ilustrarán la invención con más detalle, aunque se entenderá que la invención no se limita a estos ejemplos específicos.

Ejemplo 1 Construcción de un plásmido de expresión para moléculas de fusión

Construcción de un plásmido que codifica una proteína de fusión compuesta de la proteína variante de IL-3 encontrada en el plásmido pMON13252 (documento WO94/12639 publicado el 9 de junio de 1994), seguida de un sitio de escisión proteolítica del factor Xa, seguido de la región de bisagra de la IgG 2b murina, en la que las cisteínas se han reemplazado por serinas, como secuencia de engarce polipeptídica entre las dos proteínas de la fusión, y seguida de G-CSF. El plásmido, pMON13252, se digiere con EcoRI (que está interno en el gen de la variante de IL-3) y HindIII (que está después de los codones stop para la variante de IL-3) y se purifica el fragmento de restricción EcoRI, HindIII de 3900 pares de bases. Los elementos genéticos derivados de pMON13252 son el gen de la beta-lactamasa (AMP), el origen de replicación de pBR327, el promotor recA, el sitio de unión a ribosomas de g10L, las bases que codifican los aminoácidos 15-105 del gen de la variante (15-125)IL-3 y el origen de replicación del fago f1. Se diseñan pares de oligonucleótidos sintéticos complementarios para reemplazar la porción del gen de la variante de IL-3 después del sitio EcoRI (bases que codifican los aminoácidos 106-125), la secuencia de ADN que codifica el sitio de escisión del factor Xa, la secuencia de ADN que codifica el engarce polipeptídico y un sitio de restricción Af1III para permitir la clonación del segundo gen en la fusión. Cuando se ensamblan de manera apropiada, los oligonucleótidos producen una secuencia de ADN que codifica los componentes mencionados anteriormente en fase, con extremos de restricción EcoRI y HindIII. Dentro de esta secuencia de ADN, también se crean sitios de restricción únicos para permitir el reemplazo posterior de regiones específicas por una secuencia que tenga una función similar (por ejemplo, una región de engarce polipeptídica alternativa). Se crea un sitio de restricción SnaBI único en el extremo de gen de 13252 que permite la clonación de otros genes en la posición C-terminal de la fusión. Se crea un sitio XmaI único entre la secuencia que codifica el sitio de escisión del factor Xa y la región que codifica el engarce polipeptídico. Se crea un sitio Af1III único después de la región de engarce que permite la clonación de la proteína N-terminal de la fusión. El fragmento 3900 pares de bases de pMON13252 se une con los oligonucleótidos ensamblados y se utiliza para transformar una cepa de E. Coli apropiada. Los clones resultantes se seleccionan por medio de análisis de restricción y se secuencia el ADN para confirmar que se crea la secuencia de ADN deseada. El plásmido resultante se usa como intermedio en el que pueden clonarse otros genes en forma de un fragmento NcoI,HindIII en los sitios Af1III y HindIII para crear la fusión deseada. Los salientes creados por NcoI y Af1III son compatibles, pero las secuencias flanqueantes de los sitios de reconocimiento de restricción son diferentes. Los sitios NcoI y Af1III se pierden como resultado de la clonación. Los sitios de las restricciones mencionados anteriormente se usan como ejemplos y no se limitan a los descritos. También puede crearse por ingeniería genética otro sitio de restricción único que tenga la función de permitir el reemplazo de las regiones. El plásmido que codifica la fusión resultante es ADN secuenciado para confirmar que se obtiene la secuencia de ADN deseada. Otros genes de la variante de IL-3 u otros genes de factores estimuladores de colonias pueden alterarse de una manera similar por técnicas de ingeniería genética para crear los sitios de restricción apropiados que permitan la clonación en la posición C-terminal o N-terminal de la construcción de fusión descrita anteriormente. Asimismo, pueden crearse por ingeniería genética sitios de escisión por peptidasa o engarces polipeptídicos alternativos en los plásmidos de fusión.

El plásmido, pMON13252, codifica la variante (15-125)hIL-3 con la siguiente secuencia de aminoácidos (documento WO 94/12639, páginas 214, 215):

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Ejemplo 2 Expresión, extracción, replegado y purificación de proteínas de fusión como cuerpos refractarios en E. Coli

Se cultivan durante una noche cepas de E. Coli que llevan los plásmidos de interés a 37ºC y se diluyen a la mañana siguiente, aproximadamente a 1/50, en medio M9 reciente más casaminoácidos. El cultivo se desarrolla a 37ºC durante tres a cuatro horas hasta la mitad del crecimiento logarítmico (OD600=\sim1) con agitación vigorosa. Se añade ácido nalidíxico (10 mg/ml) en NaOH 0,1 N a una concentración final de 50 \mug/ml. Los cultivos se desarrollan a 37ºC durante tres a cuatro horas después de la adición de ácido nalidíxico. A lo largo de todo el crecimiento bacteriano se mantiene un alto grado de aireación para conseguir la producción máxima de la proteína de fusión deseada. En los casos en los que las proteínas de fusión se producen como cuerpos de inclusión insoluble en E. Coli, las células se examinan con un microscopio óptico para comprobar la presencia de cuerpos refractarios (RB).

La primera etapa en la purificación de las moléculas de fusión es sonicar las células. Se resuspenden alícuotas del cultivo procedentes de sedimentos celulares en tampón de sonicación: Tris 10 mM, pH 8,0 EDTA 1 mM, NaCl 50 mM y PMSF 0,1 mM. Estas células resuspendidas se someten a varios estallidos de sonicación repetidos usando la micropunta de un rompedor de células Sonicator, modelo W-375 obtenido en Heat Systems-Ultrasonics Inc. (Farmingdale, Nueva York). El grado de sonicación se controla examinando los homogeneizados con un microscopio óptico. Cuando casi todas las células se han roto, los homogeneizados se fraccionan por centrifugación. Los sedimentos, que contienen la mayoría de los cuerpos refractarios, están muy enriquecidos con proteínas de fusión.

Las proteínas de fusión que se producen como cuerpos de inclusión insolubles en E. Coli pueden solubilizarse en altas concentraciones de desnaturalizante, tales como guanidina HCl o urea que incluyen ditiotreitol o beta mercaptoetanol como agente reductor. El plegamiento de la proteína en una conformación activa puede conseguirse por medio de una diálisis secuencial a concentraciones menores de desnaturalizante sin agente reductor.

En algunos casos, las proteínas plegadas pueden purificarse por afinidad usando reactivos de afinidad tales como mAbs o subunidades de receptores unidas a una matriz adecuada. Como alternativa, (o además) la purificación puede realizarse usando una cualquiera de una diversidad de métodos cromatográficos tales como: intercambio iónico, exclusión molecular o cromatografía hidrófoba o HPLC de fase inversa. Estos y otros métodos de purificación de proteínas se describen con detalle en Methods in Enzymology, Volumen 182 ``Guide to Protein Purification'' editado por Murray Deutscher, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Ejemplo 3 Determinación de la actividad in vitro de proteínas de fusión

La concentración proteica de la proteína de fusión puede determinarse usando un ELISA de sándwich basado en un anticuerpo policlonal purificado por afinidad. Como alternativa, la concentración proteica puede determinarse por composición de aminoácidos. La bioactividad de la molécula de fusión puede determinarse en varios ensayos in vitro en comparación con la IL-3 nativa, la variante de IL-3 o el G-CSF solo o conjuntamente. Uno de tales ensayos es el ensayo de proliferación de células AML-193. Las células AML-193 responden a IL-3 y a C-GSF, lo cual permite determinar la bioactividad combinada de la fusión de variante de IL-3/G-CSF. Además, pueden usarse otras líneas celulares dependientes de factores, tales como 32D que es una línea celular dependiente de IL-3 murina. La actividad de IL-3 es específica de especie, mientras que G-CSF no lo es, por lo tanto, puede determinarse independientemente la bioactividad del componente G-CSF de la fusión variante de IL-3/G-CSF. El ensayo de metilcelulosa puede usarse para determinar el efecto de la proteína de fusión de variante de IL-3/G-CSF sobre la expansión de las células progenitoras hematopoyéticas y el patrón de los diferentes tipos de colonias hematopoyéticas in vitro. El ensayo de metilcelulosa también puede proporcionar una estimación de la frecuencia de precursores, ya que se mide la frecuencia de progenitores por 100.000 células de entrada. Se han usado cultivos dependientes de estroma a largo plazo para definir progenitores hematopoyéticos y células madre primitivas. Este ensayo puede usarse para determinar si la proteína de fusión estimula la expansión de progenitores y/o células madre primitivas. Además, pueden realizarse cultivos de dilución limitante que indicarán la frecuencia de los progenitores primitivos estimulados por las moléculas de fusión.

El sitio de escisión del factor Xa es útil para escindir la proteína de fusión después de que se haya purificado y replegado para separar los componentes IL-3 y G-CSF de la fusión. Después de la escisión con el factor Xa, los componentes IL-3 y G-CSF de la fusión pueden purificarse hasta la homogeneidad y ensayarse por separado para demostrar que ambos componentes están en una conformación activa después de expresarse, replegarse y purificarse como una fusión.

En este documento se muestran aminoácidos mediante las abreviaturas convencionales de una o tres letras, como se indica a continuación:

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Denominación abreviada \+ \+ Aminoácido\cr  A \+ Ala \+ Alanina\cr 
C \+ Cys \+ Cisteína\cr  D \+ Asp \+ Ácido aspártico\cr  E \+ Glu \+
Ácido glutámico\cr  F \+ Phe \+ Fenilalanina\cr  G \+ Gly \+
Glicina\cr  H \+ His \+ Histidina\cr  I \+ Ile \+ Isoleucina\cr  K
\+ Lys \+ Lisina\cr  L \+ Leu \+ Leucina\cr  M \+ Met \+
Metionina\cr  N \+ Asn \+ Asparagina\cr  P \+ Pro \+ Prolina\cr  Q
\+ Gln \+ Glutamina\cr  R \+ Arg \+ Arginina\cr  S \+ Ser \+
Serina\cr  T \+ Thr \+ Treonina\cr  V \+ Val \+ Valina\cr  W \+ Trp
\+ Triptófano\cr  Y \+ Tyr \+
Tirosina\cr}

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Claims

1. Una proteína de fusión que consta de:

a): una variante interleuquina-3 humana del polipéptido de la fórmula mostrada en la fig. 1 (a.a.1-133), donde la variación de dicha IL-3 humana nativa es el reemplazo de un aminoácido en las siguientes posiciones y donde el aminoácido de reemplazo se selecciona entre el grupo compuesto por:

: la posición 42 es Asp, Ser, Ile, Leu, Met, Tyr o Ala;

: la posición 45 es Val, Met o Asn;

: la posición 46 es Ser, Gln, His o Val;

: la posición 50 es Asp;

: la posición 51 es Pro o Thr;

: la posición 62 es Pro;

: la posición 76 es Pro;

: la posición 82 es Trp, Asp, Asn, Glu, His, Phe, Ser o Tyr;

: la posición 95 es Arg, Thr, Asn o Ser;

: la posición 98 es Ile, Leu, Ala, Gln, Met, Ser o Val;

: la posición 100 es Arg;

: la posición 101 es Pro, His, Asn, Ile o Leu;

: la posición 105 es Pro;

: la posición 108 es Ala o Ser;

: la posición 116 es Val, Trp, Ala, His, Phe o Tyr;

: la posición 121 es Ile;

: la posición 122 es Ile;

: la posición 123 es Met o Glu; y

b): un factor seleccionado entre el grupo compuesto por un factor estimulador de colonias, una citoquina, una linfoquina, una interleuquina, y un factor de crecimiento hematopoyético; y

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, donde en dicho polipéptido variante de la interleuquina-3 humana se han delecionado de 1 a 14 aminoácidos del extremo N (posiciones 1 a 14) y/o se han delecionado de 1 a 15 aminoácidos del extremo C (posiciones 119 a 133) de dicho polipéptido variante de interleuquina-3 humana.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o 2, en la que en dicho polipéptido variante de la interleuquina-3 humana se han delecionado de 1 a 14 aminoácidos del extremo N (posiciones 1 a 14) y/o se han delecionado de 1 a 8 aminoácidos del extremo C (posiciones 126 a 133) de dicho polipéptido variante de interleuquina-3 humana.

4. La proteína de fusión de la reivindicación 1, 2 o 3, donde dicho factor se selecciona entre el grupo compuesto por: GM-CSF, CSF-1, G-CSF, G-CSF (Ser^{17}), Meg-CSF, M-CSF, eritropoyetina (EPO), IL-1, IL-4, IL-2, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF, ligando flt3/flk2, hormona de crecimiento humana, factor de crecimiento de células B, factor de diferenciación de células B, factor de diferenciación de eosinófilos y factor de células madre (SCF).

5. La proteína de fusión de la reivindicación 4, en la que dicho factor se selecciona entre el grupo compuesto por: G-CSF, GM-CSF y G-CSF (Ser^{17}).

6. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión de una de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de una de las reivindicaciones 1 a 5.

8. Un método para producir una proteína de fusión, que comprende: cultivar en un medio de crecimiento una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7 de una manera que permita la expresión de dicha proteína de fusión, y recuperar dicha proteína de fusión.

9. La proteína de fusión de una de las reivindicaciones 1 a 5, para uso para el tratamiento de situaciones en las que se desea un aumento de la producción de células hematopoyéticas.

10. Uso de la proteína de fusión de una de las reivindicaciones 1 a 5 para preparar un medicamento para el tratamiento de situaciones en las que se desea la producción de células hematopoyéticas.