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ES2197149T3 - Proteinas de fusion que comprende receptores para dos factores de necrosis tumoral. - Google Patents

Proteinas de fusion que comprende receptores para dos factores de necrosis tumoral.

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ES2197149T3
ES2197149T3 ES93909201T ES93909201T ES2197149T3 ES 2197149 T3 ES2197149 T3 ES 2197149T3 ES 93909201 T ES93909201 T ES 93909201T ES 93909201 T ES93909201 T ES 93909201T ES 2197149 T3 ES2197149 T3 ES 2197149T3
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ES
Spain
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tnf
baselineskip
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dna
seq
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ES93909201T
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Craig A. Smith
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Immunex Corp
Original Assignee
Immunex Corp
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Publication date
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Abstract

PROTEINAS DE FUSION QUE CONSTAN DE UN POLIPEPTIDO RECEPTOR DE FACTOR DE NECROSIS DE TUMOR (TNF-R) Y AL MENOS UN POLIPEPTIDO ADICIONAL DEL RECEPTOR DE INTERLEUCINA-1 (IL-1R) Y UN SEGUNDO POLIPEPTIDO DE TNF-R. UNA DE TALES FUSIONES DE PROTEINAS CONSTA DE UN IL-1R Y DE DOS POLIPEPTIDOS DE TNF-R. LAS PROTEINAS DE FUSION TIENEN USO TERAPEUTICO Y PUEDEN PRODUCIRSE A TRAVES DE TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE.

Description

Proteína de fusión que comprende receptores para dos factores de necrosis tumoral.
Antecedentes de la invención
Es conocido que numerosas citoquinas se unen a proteínas receptoras específicas en la superficie de células diana. Entre las proteínas receptoras específicas que han sido identificadas están los receptores del factor de necrosis tumoral y los receptores de la interleukina-1. Se está haciendo un gran esfuerzo para aislar y caracterizar un gran número de receptores para estudiar sus funciones fisiológicas y para explorar posibles usos terapéuticos. La unión de una molécula diana concreta a un receptor soluble administrado a un paciente puede aliviar trastornos mediados por la molécula diana.
El factor \alpha de necrosis tumoral (TNF\alpha, también conocido como caquectina) y el factor \beta de necrosis tumoral (TNF\beta, también conocido como linfotoxina) son proteínas secretoras endógenas de los mamíferos homólogas capaces de inducir una amplia variedad de efectos sobre un gran número de tipos celulares. Las grandes similitudes en las características estructurales y funcionales de estas dos citoquinas han dado lugar en su denominación colectiva como ``TNF''. Se han aislado clones complementarios de ADNc que codifican TNF\alpha (Pennica y cols., Nature 312:724, 1984) y TNF\beta (Gray y cols., Nature 312:721, 1984), permitiendo una mayor caracterización estructural y biológica de los TNF.
Las proteínas TNF inician su efecto biológico sobre las células mediante su unión a proteínas receptoras específicas para TNF (TNF-R) que se expresan en la membrana plasmática de una célula reactiva al TNF. Inicialmente se demostró que el TNF\alpha y el TNF\beta se unían a un receptor común en la línea celular de carcinoma cervical humano ME-180 (Aggarwal y cols., Nature 318:665, 1985). Hohmann y cols. (J. Biol. Chem. 264:14927, 1989) notificaron que existen al menos dos receptores de superficie celular para TNF diferentes en diferentes tipos celulares, aunque la relación entre estos TNF-R no está clara. Estos receptores tienen una masa molecular aparente de alrededor de 75-80 kDA y alrededor de 55-60 kDA, respectivamente. Además de los receptores de superficie celular para TNF, se han identificado también proteínas solubles de la orina humana capaces de unirse al TNF (Peetre y cols., Eur. J. Haematol. 41:414, 1988; Seckinger y cols., J. Exp. Med. 167:1511, 1988; Seckinger y cols., J. Biol. Chem. 264:11966, 1989; Solicitud de patente UK, Nº de publicación 2 218 101 A para Seckinger y cols.; Engelmann y cols., J. Biol. Chem. 264:11974, 1989).
La interleukina-1\alpha (IL-1\alpha) y la interleukina-1\beta (IL- 1\beta) son hormonas polipeptídicas con una relación lejana que juegan un papel central en la regulación de las respuestas inmune e inflamatoria. Estas dos proteínas actúan sobre gran variedad de tipos celulares y tienen múltiples actividades biológicas. Las actividades biológicas adscritas a la IL-1\alpha y a la IL-1\beta están mediadas al menos por dos clases de receptores unidos a la membrana plasmática que se unen tanto a la IL-1\alpha como a la IL-1\beta. Los receptores de IL-1 expresados en las células B (en adelante denominados receptores IL-1 tipo II) son diferentes de los receptores de IL-1 detectados en las células T y en otros tipos de células (en adelante denominados receptores IL-1 tipo I).
Peppel y cols, 1991, J. Exp. Med 174:1483-1489 describen una proteína dimérica de fusión que consiste en el dominio extracelular del TNF-R humano 55 kD unido a la porción Fc y a la región bisagra de la cadena pesada de una IgG1 murina mediante un péptido linker sensible a la trombina.
Resumen de la invención
La presente invención se dirige a una proteína de fusión con la fórmula:
TNF-R - linker - TNF-R
en el cual el linker es un péptido linker, y cada TNF-R es un TNF-R soluble que es capaz de unirse al TNF.
Los receptores son producidos preferentemente como proteínas de fusión mediante tecnología de ADN recombinante.
La presente invención también proporciona secuencias aisladas de ADN que codifican las proteínas de fusión, vectores de expresión recombinantes que comprenden dichas secuencias de ADN, células huésped que contienen los vectores de expresión y procesos para producir las proteínas de fusión recombinantes mediante el cultivo de las células huésped. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de fusión purificada como se ha descrito anteriormente y un diluyente, transportador o excipiente apropiado. Estas composiciones son útiles en el tratamiento, diagnóstico y estudio de las patologías mediadas por el factor de necrosis tumoral o la interleukina-1.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 presenta un mapa de restricción para un clon de ADNc de IL-1R de tipo I humano. Se muestran los puntos en los cuales ciertos enzimas de restricción cortan el ADNc.
Las figuras 2A-2B representan la secuencia parcial de ADNc y la secuencia de aminoácidos derivada de un clon de TNF-R humano. Los nucleótidos están numerados desde el inicio de la región 5' no traducida. Los aminoácidos están numerados desde el inicio de la secuencia del péptido señal. La secuencia aparente del péptido señal está representada por los aminoácidos -22 a -1. La leucina N-terminal de la proteína TNF-R madura está subrayada en la posición 1. La región transmembrana aparente de los aminoácidos 236 a 265 también está subrayada. Los terminales C de varios TNF-Rs solubles están marcados con una flecha (\updownarrow). Se indican los lugares de corte para ciertas endonucleasas de restricción empleadas en la construcción de vectores de expresión.
La figura 3 representa un vector plásmido que comprende un fragmento de ADN que codifica una proteína de fusión de la fórmula TNF-R-linker-TNF-R, construido como se describe en el ejemplo 11.
La figura 4 representa un vector plásmido que comprende un fragmento de ADN que codifica una proteína de fusión con la fórmula IL-1R-linker-TNF-R- linker-TNF-R, construido como se describe en el ejemplo comparativo 5.
La figura 5 representa tres vectores plásmidos que son intermedios en la construcción de determinados vectores de la presente invención, como se describe en el ejemplo comparativo 5.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se dirige a receptores que comprenden un primer polipéptido TNF-R unido de forma covalente a un segundo polipéptido TNF-R. Los componentes del polipéptido TNF-R están unidos entre sí mediante péptidos de unión. Los polipéptidos TNF-R son derivados de especies mamíferas, preferiblemente humanos.
Preferiblemente los receptores se producen como proteínas de fusión mediante tecnología de ADN recombinante. Una proteína de fusión de la presente invención comprende dos polipéptidos TNF-R y puede ser representada mediante la siguiente fórmula:
TNF-R-linker-TNF-R
en la cual el linker es un péptido linker, y cada TNF-R es un TNF-R soluble que es capaz de unirse al TNF.
Cada componente polipéptido TNF-R de las proteínas de fusión es capaz de unirse de forma independiente al factor de necrosis tumoral (TNF). La inclusión de dos polipéptidos TNF-R adyacentes en la proteína de fusión es ventajosa porque la afinidad de unión al TNF aumenta en comparación a la unión al TNF de un solo polipéptido TNF-R.
Los péptidos linker que pueden ser empleados en la presente invención separan entre sí los polipéptidos TNF-R con una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliega en las estructuras secundaria y terciaria necesarias para la actividad biológica deseada. El péptido linker también debe permitir que los dominios extracelulares del TNF-R adquieran la orientación espacial correcta para formar un sitio de unión al TNF. Los péptidos linker funcionan como espaciadores, en contraposición a los componentes polipéptidicos TNF-R de las proteínas de fusión, que son farmacológicamente activos. Los polipéptidos linker apropiados preferentemente (1) adoptarán una conformación extendida flexible, (2) no serán propensos a desarrollar una estructura secundaria ordenada que pueda interactuar con los dominios funcionales de las proteínas y (3) tendrán un mínimo carácter hidrofóbico o de carga que podría favorecer la interacción con los dominios funcionales de las proteínas. Los típicos aminoácidos de superficie en las regiones flexibles de las proteínas incluyen glicina (Gly), asparagina (Asn) y serina (Ser). Virtualmente cabría esperar que cualquier permutación de secuencias de aminoácidos que contenga Gly, Asn y Ser satisfaga los criterios anteriores para una secuencia de péptido linker. En la secuencia del péptido linker también se pueden emplear otros aminoácidos casi neutros, tales como treonina (Thr) y alanina (Ala). Los péptidos linker adecuados generalmente comprenden una cadena de aminoácidos, preferiblemente de 5 a 100 aminoácidos de longitud y más preferiblemente de 10 a 20 aminoácidos de longitud. Ejemplos de dichos péptidos linker incluyen, pero no se limitan a (Gly_{4}Ser)_{n}, dónde n es 1-12, Gly_{4}SerGly_{5}Ser, y (Gly_{4}SerGly_{5}Ser)_{2}.
Polipéptidos TNF-R
Tal y como se emplean en lo sucesivo, los términos ``receptor TNF'' y ``TNF-R'' se refieren a proteínas que son biológicamente activas ya que son capaces de unirse al factor de necrosis tumoral (TNF). Los tipos de proteínas naturales unidas a la membrana además transducen una señal biológica iniciada por la unión de una molécula de TNF a la célula. En las proteínas de fusión que comprenden más de un polipéptido TNF-R, los polipéptidos TNF-R pueden ser idénticos o diferentes.
Los receptores intactos generalmente incluyen un dominio extracelular que se une a un ligando, un dominio transmembrana hidrofóbico que permanece incrustado en el interior de la bicapa lipídica de la membrana plasmática y un dominio citoplasmático o intracelular que se piensa que transmite una señal biológica a las células efectoras mediante una cascada de reacciones químicas en el citoplasma de la célula. El dominio transmembrana hidrofóbico y una región altamente cargada del dominio citoplasmático adyacente al dominio de transmembrana funcionan de forma conjunta para interrumpir el transporte del receptor TNF a través de la membrana plasmática. El dominio extracelular de las proteínas TNF-R aquí descritas es la porción N-terminal de la proteína, desde el aminoácido 1 al aminoácido inmediatamente precedente a la región de transmembrana. El dominio citoplasmático es aquella porción de la proteína que está localizada inmediatamente a continuación de la región de transmembrana.
El TNF-R natural en su longitud completa es un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 439 de la secuencia mostrada en las figuras 2A y 2B. El ADN y la secuencia de aminoácidos de este TNF-R también se muestra en SEQ ID NOS: 1 y 2. Cuando se incluye la secuencia señal el polipéptido TNF-R comprende los aminoácidos -22 a 439 de la secuencia de las figuras 2A y 2B. La conveniencia de incluir la secuencia señal depende de factores tales como la posición del polipéptido TNF-R en la proteína de fusión y de si la célula huésped deseada procesará una secuencia señal mamífera, tal y como se discute más adelante. La forma madura glicosilada de longitud completa de este TNF-R humano es una glicoproteína que tiene un peso molecular de alrededor de 80 kilodaltons (kDa). Tal y como se usa a lo largo de la especificación, el término ``maduro'' se refiere a una proteína que carece de una secuencia de cabeza o señal como puede estar presente en transcripciones a longitud completa de un gen natural. Una proteína puede comprender una secuencia señal cuando se expresa inicialmente. El corte de la secuencia señal al secretar la proteína de la célula da lugar a la forma madura de la proteína.
Otros polipéptidos TNF-R se describen en la publicación de la solicitud de patente europea número 422,339 (en adelante EP 422,339). Dos polipéptidos TNF-R comprenden arginina (Arg) como residuo 174 pero por lo demás son idénticos a los polipéptidos antes descritos que comprenden los aminoácidos 1 a 439 o -22 a 439, respectivamente, de las figuras 2A y 2B de la presente solicitud. Una secuencia de aminoácidos del TNF-R idéntica a la de las figuras 2A y 2B (de la presente solicitud) excepto por la sustitución de arginina (Arg) por metionina (Met) en la posición174 de la secuencia madura se describe en EP 422,339 (ver la figura 39 de la misma).
En la figura 21 de la EP 422,339 se muestran el ADNc y las secuencias codificadas de aminoácidos de otro polipéptido TNF-R. La región codificadora de la secuencia de ADNc de la figura 21 de la EP 422.339 y la secuencia de aminoácidos codificados por ella se muestran como SEQ ID NOS: 3 y 4 de esta solicitud. Aunque en la EP 422,339 se alude a ella como proteína de 30 kilodalton, se han comunicado otros pesos moleculares para esta proteína. Por ejemplo, se notificó un peso molecular alrededor de 55 kilodaltons por Loetscher y cols. (Cell 61:351, 1990) y en la EP 417,563. Los polipéptidos TNF-R incluyen aquellos que comprenden los aminoácidos 1 a 415 de la secuencia SEQ ID NO: 4, o cuando se desea la secuencia señal, los aminoácidos -40 a 415 de la secuencia SEQ ID NO: 4. En la EP 422,339 se describen métodos para producir esta proteína TNF-R, bien por purificación de la orina o de un medio de cultivo de células U937 o bien por tecnología de ADN recombinante. Este TNF-R se caracteriza por una secuencia N-terminal (para la forma madura de la proteína) Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-, mientras que la secuencia N-terminal de la forma madura de la proteína TNF-R de las figuras 2A-2C es Leu-Pro-Ala-Gln-Val-Ala-.
En la presente invención, el polipéptido TNF-R es un polipéptido TNF-R soluble. Los polipéptidos TNF-R solubles carecen al menos de parte (preferiblemente de toda) la región de transmembrana que favorece la retención de la proteína sobre la superficie celular. Los polipéptidos solubles generalmente también carecen de la región cargada del dominio citoplasmático (localizado inmediatamente a continuación de la región transmembrana), que contribuye a la retención sobre la superficie celular. Preferiblemente, toda la región de transmembrana y el dominio citoplasmático son eliminados de la proteína o sustituidos por aminoácidos hidrofílicos para formar TNF-R soluble. El TNF-R soluble es secretado por la célula y mantiene la actividad biológica deseada.
Son ejemplos de polipéptidos TNF-R solubles aquellos que comprenden los aminoácidos 1-x de la secuencia de la figura 2A, siendo x el aminoácido C-terminal que es seleccionado de un grupo que consiste en cualquiera de los aminoácidos 163-235 de la figura 2A. Ejemplos específicos incluyen polipéptidos que comprenden los aminoácidos 1-163, 1-185 o 1-235 de la figura 2A.
Son ejemplos adicionales de polipéptidos TNF-R solubles aquellos que comprenden los aminoácidos 1-184 o 1-182, -22-184, o -22-182 de la secuencia de las figuras 2A y 2B. Dichas proteínas pueden contener bien metionina o arginina en la posición 174. Los procedimientos para preparar ejemplos de tales polipéptidos TNF-R incluyen los descritos en los ejemplos 17 y 22 de EP 422,339.
La proteína TNF-R que se muestra en SEQ ID NO: 4 comprende un péptido señal (denominado aminoácidos -40 a -1) y una región de transmembrana que comienza con el residuo valina en la posición 172. Las formas solubles de esta proteína TNF-R incluyen aquellas que comprenden los aminoácidos -40-w o 1-w de la SEQ ID NO: 4, dónde w es un número de 161-171 (es decir, cualquiera de los aminoácidos 161 a 171 de SEQ ID NO: 4 es el C-terminal). El uso de mutagénesis in vitro dirigida por oligonucleótidos para construir un vector de expresión que codifica una proteína TNF-R biológicamente activa que tiene un aminoácido 161 (asparagina) como aminoácido C-terminal está ilustrado en el ejemplo 7 de EP 422,339. Además, Engelmann y cols. (J. Biol. Chem. 265:1531, 1990) han descrito procedimientos para purificar formas solubles naturales de ambas proteínas TNF-R antes descritas (es decir, formas solubles de las proteínas SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4).
Los procedimientos de ensayo aquí descritos se pueden emplear para confirmar la actividad biológica de otros polipéptidos TNF-R solubles, mas allá de los ejemplos concretos antes expuestos. Los TNF-R solubles pueden ser identificados (y distinguidos de sus homólogos no solubles unidos a la membrana) mediante la separación de células intactas que expresan la proteína deseada del medio de cultivo, por ej., por centrifugación, y analizando en el medio (sobrenadante) la presencia de la proteína deseada. El medio de cultivo puede ser analizado usando procedimientos que son similares o idénticos a los descritos en los siguientes ejemplos. La presencia de TNF-R en el medio indica que la proteína fue secretada por las células y por tanto es una forma soluble de la proteína deseada.
Los terminales N o C de los polipéptidos TNF-R pueden variar conforme a factores tales como el tipo de células huésped empleadas para producir la proteína de fusión mediante tecnología de ADN recombinante y las células concretas a partir de las cuales es purificada la proteína cuando se usa TNF-R no recombinante. Estas variaciones pueden ser atribuibles, por ejemplo, a un procesamiento post-translacional de la proteína diferente en los distintos tipos de células. Las variaciones de la secuencia N o C terminal también pueden resultar de los oligonucleótidos escogidos para reconstruir la secuencia de ADN que codifica cualquiera de los terminales del TNF-R cuando se construyen vectores de expresión.
El procesamiento diferencial puede dar lugar a proteínas TNF-R maduras con un aminoácido N-terminal diferente a los mostrados en la posición 1 de SEQ ID NOS: 2 y 4. Por ejemplo, en determinadas células huésped el procesamiento post-translacional eliminará el residuo de metionina codificado por el codón de iniciación, mientras que en el N-terminal de las proteínas producidas en otras células huésped se conservará el residuo de metionina. Además, es sabido que los terminales N y C varían para la misma proteína, dependiendo de la fuente de la proteína. En algunos casos, la eliminación de aminoácidos en cualquiera de los terminales de la proteína puede ser debida a proteolísis, que ocurre bien intracelularmente o bien durante la purificación. Los terminales N variables también pueden ser el resultado de la separación del péptido señal en determinadas células huésped en un punto diferente al que está entre los aminoácidos -1 y 1 de las secuencias descritas.
Como se describe en los ejemplos 10 y 11 y en la figura 31 de EP 422,339, una proteína TNF-R no recombinante madura purificada de la orina humana carecía de dos aminoácidos N-terminales encontrados en una proteína TNF-R no recombinante purificada de la línea celular de tipo monocitos humanos U937. El aminoácido N-terminal del TNF-R derivado de la orina era el residuo alanina en la posición 3 de SEQ ID NO: 1. Engelmann y cols. (J. Biol. Chem. 265:1531, 1990) describen una proteína que se une al TNF y fue purificada de la orina humana en formas truncadas en varios grados en el terminal N (ver el resumen y la página 1533). La secuencia de aminoácidos N-terminal de un tipo de proteína fue Val-Ala-Phe-Thr-Pro, que corresponde a los aminoácidos 5-9 de SEQ ID NO: 1. Otras formas de la proteína tuvieron bien fenilalanina (aminoácido 7 de SEQ ID NO: 1) o treonina (aminoácido 8 de SEQ ID NO: 1) como aminoácido N-terminal.
Los terminales N y C de las proteínas TNF-R pueden variar por motivos que incluyen los discutidos anteriormente. El aminoácido N-terminal puede ser, por ejemplo, uno de los aminoácidos en las posiciones 1 a 5 de SEQ ID NOS: 2 o 4 para el TNF-R. Los terminales C pueden ser truncados deliberadamente durante la construcción del vector de expresión (por ej. al construir vectores que codifican proteínas solubles como se ha descrito antes) o como resultado de un procesamiento diferencial que puede eliminar hasta alrededor de cinco aminoácidos C-terminales, por ejemplo.
Otros polipéptidos TNF-R adicionales que se pueden emplear mantienen la actividad biológica deseada pero se diferencian de las secuencias originales en que se añaden, eliminan o sustituyen aminoácido(s) en la secuencia original. La actividad biológica de dichas proteínas puede ser confirmada usando los análisis aquí descritos.
Derivados de TNF-R que también están en el ámbito de esta invención incluyen varias formas estructurales de la proteína primaria que mantienen actividad biológica.
Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, por ejemplo, una proteína TNF-R puede estar en forma de sal ácida o básica o puede estar en forma neutra. Los residuos aminoácidos individuales también pueden ser modificados por oxidación o reducción.
La estructura primaria de los aminoácidos puede ser modificada mediante la formación de conjugados covalentes o agregados con otras estructuras químicas, tales como grupos glicosilados, lípidos, fosfatos, grupos acetilo y similares. Los derivados covalentes se preparan uniendo grupos funcionales concretos a cadenas laterales de aminoácidos o a los terminales N o C. Como resultado de eventos de empalme de RNA alternativos pueden generarse variantes de forma natural.
Otras proteínas que pueden ser empleadas en la invención de proteínas de fusión incluyen conjugados de TNF-R con otros polipéptidos, que pueden ser producidos por síntesis en cultivo recombinante como fusiones N-terminales o C-terminales. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser una secuencia peptídica señal (o de cabeza) en la región N-terminal de la proteína que es co-translacionalmente o post-translacionalmente dirige la transferencia de la proteína desde su lugar de síntesis hasta su lugar de acción en el interior o en el exterior de la membrana o pared celular (p. ej. el factor alfa de las levaduras). Las proteínas de fusión pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación de la proteína de fusión. Dichos péptidos incluyen, por ejemplo, poli-His o los péptidos de identificación de antígenos descritos en la patente estadounidense Nº 5,011,912 y en Hopp y cols. Bio/Technology 6:1204, 1988. Uno de esos péptidos es el péptido FLAG(r), Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK), que es altamente antigénico y proporciona un epitopo que se une de forma reversible a un anticuerpo monoclonal específico, permitiendo el análisis rápido y la purificación fácil de la proteína recombinante expresada. Esta secuencia también es específicamente cortada por la enterokinasa mucosa bovina en el residuo que sigue de forma inmediata al par Asp-Lys. Las proteínas de fusión limitadas por este péptido también pueden ser resistentes a la degradación intracelular en E. coli. Un hibridoma murino denominado 4E11 produce un anticuerpo monoclonal que se une al péptido DYKDDDDK en presencia de ciertos cationes metálicos divalentes (como se describe en la patente U.S. 5,011,912) y ha sido depositado en la American Type Culture Collection bajo el número de acceso HB 9259.
Las proteínas de fusión artificiales comprenden TNF-R con o sin un patrón asociado de glicosilación. Los TNF-R expresados en los sistemas de expresión de levaduras o mamíferos, por ej., células COS-7, pueden tener un peso molecular y un patrón de glicosilación similares o ligeramente diferentes a las moléculas naturales, dependiendo del sistema de expresión. La expresión de proteínas recombinantes en bacterias, tales como E. coli proporciona proteínas no glicosiladas. Mediante síntesis y unión de oligonucleótidos o por técnicas específicas de mutagénesis se pueden producir proteínas que tienen sitios de N- glicosilación inactivados. Estas proteínas mutantes pueden ser producidas de forma homogénea y con reducción de carbohidratos con buen rendimiento usando sistemas de expresión de levaduras. Los sitios de N-glicosilación en proteínas eucariotas se caracterizan por el triplete de aminoácidos Asn-A_{1}-Z, donde A_{1} es cualquier aminoácido excepto Pro, y Z es Ser o Thr. En esta secuencia, la asparagina proporciona un aminoácido de cadena lateral para la unión covalente de carbohidratos. Este sitio puede ser eliminado por sustitución de Asn por otro aminoácido o por el residuo Z, eliminando Asn o Z o insertando un aminoácido no-Z entre A_{1} y Z, o un aminoácido diferente a Asn entre Asn y A_{1}. Los procedimientos conocidos para inactivar los sitios de N-glicosilación en proteínas incluyen aquellos descritos en la patente U.S. 5,071972 y EP 276,846. Los aminoácidos 53-55, 59-61, 99-101, 206-208 y 264-266 en SEQ ID NO: 8 son ejemplos de sitios de N-glicosilación en IL-1R tipo II humano. En la proteína IL-1R tipo I (SEQ ID NO: 6) se encuentran sitios potenciales de N-glicosilación en los aminoácidos 80-82, 173-175, 213-215, 229-231, 243-245 y 277-279. En los aminoácidos 171-173 y 358-360 del TNF-R de las figuras 2A y 2B se encuentran sitios de N- glicosilación.
Los residuos de cisteína que no son esenciales para la actividad biológica pueden ser eliminados o sustituidos por otros aminoácidos para impedir la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos en la renaturalización. Por ejemplo, el residuo de cisteína en la posición 178 de la secuencia del TNF-R de las figuras 2A y 2B puede se eliminado. La patente U.S. 4,518,584 describe el uso de una mutagénesis dirigida al sitio para eliminar o reemplazar los residuos de cisteína en una proteína. Otras aproximaciones a la mutagénesis implican la modificación de residuos de aminoácidos dibásicos adyacentes para favorecer la expresión en sistemas de levaduras en los que está presente la actividad de proteasa KEX2. EP 212,914 describe el uso de mutagénesis específica de sitio para inactivar los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 en una proteína. Para preservar la actividad biológica del TNF-R las sustituciones preferiblemente darán lugar a secuencias homólogas o sustituidas de forma conservadora, lo que significa que un determinado residuo aminoácido es reemplazado por un residuo que tenga características fisicoquímicas similares. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala entre sí, o sustituciones de un residuo polar por otro, como entre Lys y Arg; Gly y Asp; o Gln y Asn. Otras sustituciones conservadoras, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tengan características hidrofóbicas similares, son bien conocidas. Además, las diferencias particulares de aminoácidos entre TNF-Rs humanos, murinos o de otros mamíferos son sugestivas de que se pueden hacer otras sustituciones conservadoras sin alterar las principales características biológicas del TNF-R.
Las alteraciones en la secuencia natural de aminoácidos se pueden conseguir por cualquiera de una serie de técnicas conocidas. Se pueden introducir mutaciones en sitios concretos mediante la síntesis de oligonucleótidos que contiene una secuencia mutante, rodeados de sitios de restricción que permiten la unión de la secuencia natural a fragmentos. Después de la unión, la secuencia reconstruida resultante codifica una análogo que tiene la inserción, sustitución o eliminación del aminoácido deseado.
Alternativamente, los procedimientos de mutagénesis dirigida a los oligonucleótidos y específica de sitio se pueden emplear para proporcionar un gen alterado que tenga determinados codones alterados conforme a la sustitución, eliminación o inserción requerida. Métodos ejemplares para realizar las alteraciones antes expuestas son descritos por Walder y cols. (Gene 42:133, 1986); Bauer y cols. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, Enero 1985, 12-19); Smith y cols. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); y las patentes U.S. n^{os} 4,518,584 y 4737,462 describen técnicas adecuadas.
La variante de la secuencia de aminoácidos preferiblemente debe ser idéntica al menos en un 80%, más preferiblemente idéntica en al menos un 90% a la secuencia natural. El porcentaje de similitud puede ser determinado, por ejemplo, comparando la información de la secuencia usando el programa de ordenador GAP, versión 6.0, disponible en el Grupo de Informática Genética de la Universidad de Wisconsin (UWGCG). El programa GAP utiliza el método de alineación de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), revisado por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981). En resumen, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, divididos por el número total de símbolos en la secuencia más corta de las dos. Los parámetros por defecto preferibles para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación única (conteniendo un valor igual a 1 para coincidencias e igual a 0 para no coincidencias) para los nucleótidos y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3.0 para cada disparidad y una penalización adicional de 0.10 para cada símbolo en cada disparidad; y (3) ninguna penalización para disparidades terminales.
Las proteínas capaces de bloquear la unión de IL-1 a los receptores celulares in vivo denominadas en general antagonistas de los receptores IL-1, incluyen las descritas por Eisenberg y cols. (Nature 343: 341, 1990), Hannum y cols. (Nature 343:336, 1990) y Carter y cols (Nature 344: 633, 1990). Estas proteínas antagonistas se unen a los receptores de la IL-1, pero no tienen actividad tipo IL-1 (por ej. no transducen una señal ni producen otros efectos biológicos que resultan de la unión de la IL-1 a un receptor celular de IL-1). Las proteínas antagonistas compiten con la IL-1 por la unión a los receptores IL-1 endógenos, inhibiendo así los efectos biológicos mediados por la IL-1 in vivo.
Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión recombinantes
La presente invención también proporciona secuencias aisladas de ADN que codifican las proteínas de fusión antes descritas. Una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión de la presente invención se construye usando técnicas de ADN recombinante para insertar fragmentos de ADN que codifican los polipéptidos TNF-R en un vector de expresión apropiado. Una secuencia de ADN que codifica el TNF-R es unida a una secuencia de conexión que a su vez es unida a una segunda secuencia que codifica un TNF-R.
En la secuencia de ADN que codifica el polipéptido N-terminal se puede conservar una secuencia de ADN que codifica una secuencia señal N-terminal, mientras que los codones de terminación que impedirían la lectura completa hasta la siguiente secuencia de ADN son eliminados. Por el contrario, en la secuencia de ADN que codifica el polipéptido C-terminal, generalmente se conserva un codón de terminación requerido para finalizar la traducción. Preferiblemente el ADN que codifica una secuencia señal es eliminado de las secuencias de ADN distintas a las que codifican el polipéptido N-terminal.
Mediante cualquier técnica apropiada se puede insertar una secuencia de ADN que codifique el péptido linker deseado entre las secuencias de ADN que codifican los TNF-R y en el mismo marco de lectura. Por ejemplo, se puede unir entre las secuencias que codifican TNF-R un oligonucleótido sintetizado químicamente que codifique el linker y que contenga los sitios de restricción de corte por endonucleasa apropiados.
Alternativamente, una secuencia de ADN sintetizada químicamente puede contener una secuencia complementaria al terminal 3' del TNF-R (sin el codón de terminación), seguida de una secuencia que codifica el linker que es seguida por una secuencia complementaria al terminal 5' del otro TNF-R. Después se utiliza la mutagénesis dirigida de oligonucleótidos para insertar la secuencia que codifica el linker en un vector que contiene una fusión directa del TNF-R. Otra técnica utiliza reacciones en cadena de la polimerasa usando cebadores que comprenden en parte segmentos de una hebra que codifican un péptido linker. Los fragmentos de ADN generados por PCR que codifican dos proteínas diferentes se pueden unir mediante alineamiento de los segmentos complementarios de una hebra que codifican el linker presentes en un terminal de cada fragmento. Los procedimientos preferidos para insertar un segmento de ADN que codifica el linker entre dos secuencias de ADN de TNF-R se describen más adelante en el ejemplo 7.
Las secuencias de ADN que codifican TNF-R se pueden aislar mediante cualquier procedimiento convencional apropiado, para ser usadas en la construcción de las secuencias de ADN que codifican las proteínas de fusión. Las secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión para ser expresadas en un microorganismo preferiblemente no contendrán intrones que puedan interrumpir de forma prematura la transcripción de ADN en ARNm; sin embargo, la interrupción prematura de la transcripción puede ser deseable, por ejemplo, cuando resultaría en mutantes que tengan truncamientos ventajosos en el C-terminal, por ejemplo, eliminación de la región de transmembrana para obtener un receptor soluble no unido a la membrana celular. El ADNc del TNF-R se puede aislar por procedimientos que incluyen los descritos en el ejemplo 2.
La secuencia de codificación del TNF-R puede ser obtenida aislando una secuencia que codifica TNF-R de un ADN recombinante o de una biblioteca de ADN genómico. Una biblioteca de ADNc se construye preferiblemente obteniendo ARNm poliadenilado de una línea celular concreta que exprese un TNF-R mamífero, por ejemplo, la línea celular de fibroblastos humanos WI-26 VA4 (ATCC CCL 95.1) y usando el ARNm como patrón para sintetizar ADNc de doble hebra. Posteriormente, el ADNc de doble hebra se empaqueta en un vector recombinante que es introducido en una célula huésped (por ej. una cepa apropiada de E. coli) y propagado. Las secuencias de TNF-R contenidas en la biblioteca de ADNc se pueden identificar revisando la biblioteca con una sonda apropiada de ácido nucleico que sea capaz de hibridar con el ADNc del TNF-R humano. Otra técnica de clonación que puede ser empleada es el procedimiento de expresión directa descrito en el ejemplo 2 más adelante.
Alternativamente, se pueden ensamblar ADNs que codifiquen proteínas TNF-R por unión de subunidades de oligonucleótidos sintéticos correspondientes a toda o a parte de la secuencia de las figuras 2A y 2B para proporcionar una secuencia de codificación completa.
Se pueden aislar clones adicionales de ADNc a partir de bibliotecas de ADNc de otras especies mamíferas por hibridación de especies cruzadas. Para ser usado en hibridación el ADN que codifica el TNF-R puede ser marcado de forma covalente con sustancias detectables tales como un grupo fluorescente, un átomo radioactivo o un grupo quimioluminiscente por métodos ampliamente conocidos para los expertos en la técnica pertinente.
Al igual que la mayoría de genes mamíferos, los receptores de TNF mamífero son presumiblemente codificados por genes multi-exon. Alternativamente, para preparar las proteínas de fusión de la presente invención se consideran útiles construcciones de ARNm que pueden ser atribuidas a acontecimientos de ensamblaje de diferentes ARNm tras la transcripción, y que comparten amplias regiones de identidad o similitud con los ADNc aquí descritos de forma que codifican TNF-R o IL-1R biológicamente activos.
El ADN que codifica polipéptidos TNF-R solubles se puede preparar por cualquiera de numerosas técnicas convencionales. Un fragmento de ADN que codifica el polipéptido soluble deseado puede ser subclonado en un vector de expresión. Los fragmentos de ADN se pueden producir por digestión de una secuencia de longitud completa de ADN clonado con endonucleasas de restricción y aislados por electroforésis en geles de agarosa. Alternativamente, una secuencia deseada de ADN puede ser sintetizada químicamente usando técnicas conocidas. Para insertar el fragmento deseado de ADN en el vector de expresión se pueden utilizar linkers que contengan sitios de corte por endonucleasas o el fragmento puede ser digerido en los puntos de corte presentes en ellos de forma natural.
Los ampliamente conocidos procedimientos de reacción en cadena de la polimerasa también pueden ser utilizados para aislar una secuencia de ADN que codifique un fragmento deseado de una proteína soluble. Esta técnica se ilustra en los posteriores ejemplos.
En otro enfoque, se puede emplear tratamiento enzimático (usando la endonucleasa Bal 31) para eliminar los nucleótidos terminales de un fragmento de ADN para obtener un fragmento que tenga un terminal deseado concreto. Entre los linkers comercialmente disponibles están aquellos para ser unidos a los extremos producidos por la digestión con Bal 31 y que contienen sitios de corte por endonucleasas de restricción. Alternativamente, se pueden sintetizar oligonucleótidos que reconstruyen los terminales N o C de un fragmento de ADN hasta un punto deseado. El oligonucleótido puede contener lugares de corte por endonucleasas de restricción hacia arriba de la secuencia de codificación deseada y puede posicionar un codón de iniciación (ATG) en la secuencia de codificación del terminal N.
Las secuencias de ADN de TNF-R pueden variar con respecto a las mostradas en SEQ ID NOS: 1 y 3. Debido a la conocida degeneración del código genético, puede haber variaciones considerables en las secuencias de nucleótidos que codifican la misma secuencia de aminoácidos, por ejemplo. Secuencias de ADN capaces de hibridarse a las secuencias de ADN de SEQ ID NOS: 1 y 3 - bajo condiciones moderadamente restringidas (55ºC, 5XSSC) y que codifican un polipéptido TNF-R biológicamente activo, son también consideradas secuencias de ADN que codifican TNF-R, respectivamente, en el contexto de la presente invención. Se pueden producir deliberadamente mutaciones en las secuencias naturales de ADN, por ejemplo para producir las sustituciones, eliminaciones e inserciones de aminoácidos antes descritas. Algunas de las mutaciones no serán expresadas en la proteína final. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de nucleótidos para favorecer la expresión, fundamentalmente para evitar bucles en la estructura secundaria en el ARNm transcrito (ver EP 75,444, incorporada aquí como referencia). Otras alteraciones de la secuencia de nucleótidos pueden ser hechas para proporcionar codones que sean más fácilmente traducidos por el huésped seleccionado, por ej., los conocidos codones de preferencia E. coli para la expresión en E. coli. Durante las reacciones en cadena de la polimerasa también pueden ocurrir mutaciones silentes (cambios en la secuencia de ADN que no alteran la secuencia de aminoácidos codificada).
Por supuesto, las mutaciones en las secuencias de nucleótidos deberían proteger la fase de marco de lectura de las secuencias de codificación. Las mutaciones preferiblemente no deben crear regiones complementarias que se puedan hibridar para producir estructuras secundarias de ARNm tales como bucles u horquillas que afectarían negativamente a la traducción del ARNm de las proteínas de fusión.
Así, la presente invención proporciona secuencias de ADN ingeniosas que codifican las proteínas de fusión arriba descritas, de modo que cada secuencia de ADN de TNF-R en la secuencia de ADN de la proteína de fusión es seleccionada de: (a) secuencias de ADN derivadas de la región de codificación de genes nativos de TNF-R mamífero (por ej. ADNc derivado de la región de codificación de las SEQ ID NOS: 1 y 3; (b) secuencias de ADN capaces de hibridarse a una secuencia de ADN de (a) bajo condiciones moderadamente estrictas (50ºC, 2x SSC) y que codifican TNF-R biológicamente activos y (c) secuencias de ADN que degeneran como resultado del código genético a las secuencias de ADN definidas en (a) o (b) y que codifican TNF-R biológicamente activos.
Expresión de proteínas de fusión recombinantes
La presente invención proporciona vectores de expresión recombinantes para expresar ADN que codifica las proteínas de fusión de la presente invención. Los vectores de expresión recombinantes artificiales son construcciones de ADN replicables que contienen una secuencia de ADN sintética o derivada de ADNc que codifican una de las proteínas de fusión antes descritas, unidos de forma operativa a elementos apropiados reguladores de la transcripción o de la traducción. Como ejemplos de elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión de genes se pueden incluir promotores, operadores o ampliadores de la transcripción, una secuencia que codifique lugares adecuados de unión a ARNm ribosomal, y secuencias apropiadas de iniciación y terminación de la transcripción y de la traducción. Adicionalmente se pueden incorporar la capacidad para replicarse en un huésped, generalmente conferida por un origen de la replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformadores. Los elementos de regulación empleados en los vectores de expresión generalmente se derivan de genes de mamíferos, microbios, virus o insectos. También se pueden emplear vectores de expresión derivados de retrovirus.
Las regiones de ADN están unidas de forma operativa cuando están funcionalmente relacionadas entre sí. Se dice que una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión está operativamente unida a uno o más elementos reguladores antes descritos cuando la secuencia de ADN de la proteína de fusión es transcrita o el ARNm resultante es traducido, bajo el control del/de los elemento(s) regulador(es).
Las células huésped transformadas son células huésped que han sido transformadas o transfectadas con ADN ajeno usando técnicas de ADN recombinante. En el contexto de la presente invención, el ADN ajeno incluye una secuencia que codifica la proteína de fusión artificial. Las células huésped pueden ser transformadas con el propósito de clonar o amplificar el ADN ajeno, o pueden ser transformadas con un vector de expresión para la producción de una proteína de fusión bajo el control de promotores adecuados. Son células huésped adecuadas las células procariotas, levaduras o células eucariotas superiores. Pouwels y cols. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985) describen vectores de expresión y clonación apropiados para el uso en células huésped bacterianas, fúngicas, de levaduras o de mamíferos. También se podrían emplear sistemas de traducción libre de células para producir las proteínas de fusión usando ARNs derivados de construcciones de ADN de la presente invención.
Los procariotas incluyen organismos Gram positivos o Gram negativos. Los vectores de expresión procariotas generalmente comprenden uno o más marcadores fenotípicos seleccionables, por ejemplo un gen que codifica proteínas que confieren resistencia a los antibióticos o que proporciona un requerimiento autotrófico, y un origen de la replicación reconocido por el huésped para asegurar la amplificación en el huésped. Son ejemplos de células huésped procariotas adecuadas para la transformación E. coli, bacilos tales como Bacillus subtilis, Salmonella typhymurium y varias especies del género Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también se pueden emplear otros según las preferencias.
Los vectores de expresión útiles para uso en bacterias pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos comercialmente disponibles, que comprenden elementos genéticos del conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEMI (Promega Biotec, Madison, WI, EEUU). Estas secciones ``centrales'' pBR322 se combinan con un promotor apropiado y con la secuencia estructural a expresar. E. coli, típicamente es transformada usando derivados del pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (Bolívar y cols., Gene 2:95, 1977). El pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina, proporcionando medios simples para identificar las células transformadas.
Los promotores usados normalmente en vectores de expresión recombinantes microbianos incluyen el sistema promotor de b-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang y cols., Nature 275:615, 1978; y Goeddel y cols., Nature 281:544, 1979), el sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel y cols., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; y EPA 36,776) y el promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Un sistema de expresión bacteriano particularmente útil utiliza el promotor fago \lambda P_{L} y el represor termoinducible cI857ts. Entre los vectores plásmidos disponibles en la American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor \lambda P_{L} se incluyen el plásmido pHUB2, residente en la cepa de E. coli JMB9 (ATCC 37092) y pPLc28, residente en E. coli RR1 (ATCC 53082).
La proteína de fusión recombinante también puede ser expresada en huéspedes levaduras, preferiblemente de la especie Saccharomyces, tal como S. cervisiae. También se pueden emplear levaduras de otros géneros tales como Pichia o Kluyveromyces. Los vectores de levaduras generalmente contendrán un origen de replicación del plásmido de levadura de 2\mum o una secuencia replicante autónoma (ARS), un promotor, ADN que codifica la proteína de fusión, secuencias para poliadenilación y terminación de la transcripción y un gen de selección. Preferiblemente, los vectores de levaduras incluirán un origen de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación tanto de levaduras como de E. coli, por ej., gen de resistencia a ampicilina de E. coli y el gen trp1 de S. cervisiae, que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, y un promotor derivado de un gen de levadura de alta expresión para inducir la transcripción de una secuencia estructural más abajo. La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula huésped levadura proporciona un medio efectivo para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano.
Las secuencias promotoras adecuadas en los vectores de levadura incluyen los promotores para metalotineína, 3-fosfogliceratoquinasa (Hitzeman y cols., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otros enzimas glicolíticos (Hess y cols., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland y cols., Biochem. 17: 4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfogliceratomutasa, piruvatoquinasa, triofosfatoisomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. En R. Hitzeman y cols., EPA 73,657 se describen vectores y promotores apropiados para uso en expresión en levaduras.
Los vectores de levaduras preferidos se pueden ensamblar usando secuencias de ADN de Pbr322 para la selección y replicación en E. coli (gen y origen de replicación Amp^{\lambda}) y secuencias de ADN de levaduras incluyendo un promotor ADH2 glucosa-reprimible y una guía de secreción de factor \alpha. El promotor ADH2 ha sido descrito por Russell y cols. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) y Beier y cols., (Nature 300:724, 1982). Ventajosamente, un segmento de ADN que codifica una secuencia guía funcional en levaduras se une de forma operativa al extremo 5' del ADN que codifica la proteína de fusión. El péptido guía codificado potencia la secreción de la proteína de fusión desde la célula huésped y generalmente es liberado de la proteína de fusión tras la secreción. A modo de ejemplo, la guía de factor \alpha de levaduras, que dirige la secreción de proteínas heterólogas, puede ser insertado entre el promotor y el gen estructural a expresar. Ver, por ej., Kurjan y cols., Cell 30:922, 1982; y Bitter y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984. La secuencia guía puede ser modificada para contener, cerca de su extremo 3', uno o más sitios de restricción útiles para facilitar la fusión de la secuencia guía a genes ajenos.
Los protocolos apropiados para la transformación de levaduras son conocidos para los expertos en la materia. Una técnica ejemplar es descrita por Hinnen y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, (1978), seleccionando los transformadores Trp^{+} en un medio selectivo que consiste en 0.67% de base nitrogenada para levaduras, 0.5% de casaminoácidos, 2% de glucosa, 10 \mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de uracilo. Las cepas huéspedes transformadas por vectores que comprenden el promotor ADH2 antes descrito pueden cultivarse por expresión en un medio rico consistente en 1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 1% de glucosa suplementado con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La desrepresión del promotor ADH2 ocurre cuando se consume la glucosa del medio. Los sobrenadantes brutos de levaduras son recogidos por filtración y mantenidos a 4º C antes de su ulterior purificación.
Se pueden emplear varios sistemas de cultivo de células de mamíferos o insectos para expresar la proteína recombinante. Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988) revisan sistemas de baculovirus para producción de proteínas heterólogas en células de insectos. Se pueden emplear líneas celulares de mamíferos reconocidas. Son ejemplos de líneas de células huésped mamíferas adecuadas las líneas COS-7 de células renales de mono, descritas por Gluzman (Cell 23: 175, 1981), células L, C127, 3T3 de ovario de hámster chino (CHO), líneas celulares HeLa y BHK. Los vectores de expresión mamíferos pueden comprender elementos no transcritos tales como un origen de replicación, un promotor y ampliador adecuado unido al gen a expresar, y otras secuencias no transcritas cercanas a 5' o 3', y secuencias 5' o 3' no traducidas, tales como sitios necesarios de unión a los ribosomas, un sitio de poliadenilación, sitos donantes y receptores de ensamblajes, y secuencias de interrupción de transcripción.
Las secuencias de control de transcripción y traducción en los vectores de expresión a utilizar para transformar células de vertebrados pueden ser proporcionadas por fuentes virales. Por ejemplo, promotores y ampliadores usados frecuentemente se derivan de polioma, adenovirus 2, virus simio 40 (SV40) y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo, el origen SV40, promotor inicial y tardío, ampliador, sitios de ensamblaje y poliadenilación pueden ser usadas para proporcionar los otros elementos genéticos necesarios para la expresión de una secuencia de ADN heteróloga. Los promotores iniciales y tardíos son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente del virus como un fragmento que contiene además el origen de replicación viral SV40 (Fiers y cols., Nature 273: 113, 1978). También se pueden usar fragmentos SV40 más cortos o más largos, siempre que incluyan la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio BglI localizado en el origen de replicación viral. Se pueden construir vectores ejemplares como describen Okayama y Berg (Mol. Cell Biol. 3:280, 1983). Se puede construir un sistema útil para expresión estable de alto nivel de ADNc de receptores mamíferos en células epiteliales mamarias murinas, sustancialmente como describen Cosman y cols. (Mol. Immunol. 23:935, 1986).
Producción y purificación de la proteína de fusión
La presente invención proporciona un proceso para producir la proteína de fusión recombinante de la presente invención, que comprende el cultivo de una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica dicha proteína de fusión bajo condiciones que favorecen la expresión de la proteína de fusión, que posteriormente es purificada del medio de cultivo o de extractos celulares. Se puede emplear cualquier proceso de purificación adecuado, siendo el procedimiento de elección variable según factores tales como el tipo de células huésped y de si la proteína deseada es o no secretada por la célula huésped. La proteína de fusión será secretada al medio de cultivo cuando se fusiona inicialmente a una secuencia señal o a un péptido guía que funciona en las células huésped o cuando la proteína comprende formas solubles de los polipéptidos TNF-R.
Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante al medio de cultivo pueden ser primero concentrados usando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo la unidad de ultrafiltración de Amicon o Millipore Pellicon. Después de la fase de concentración, el concentrado puede ser aplicado a una matriz de purificación apropiada. Una matriz de afinidad adecuada puede comprender, por ejemplo, TNF. Se puede preparar una matriz de afinidad acoplando TNF humano recombinante a sefarosa cianógena activada por bromuro (Pharmacia) o a hidracida Affigel (Biorad), conforme a las recomendaciones del fabricante. Un procedimiento preferente de purificación es la inmunopurificación usando anticuerpos que se unen a un soporte adecuado. Se recuperan las proteínas que se unen a un anticuerpo específico para TNF-R. De esta manera pueden ser identificadas y aisladas las proteínas inmunoreactivas con anticuerpos específicos para el TNF-R.
Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio de aniones, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos dietilaminoetil (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. Alternativamente, se puede emplear una fase de intercambio de cationes. Entre los intercambiadores de cationes adecuados se incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Son preferibles los grupos sulfopropilo. Para purificar más una composición de proteínas de fusión se pueden emplear una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) empleando un medio de RP-HPLC hidrofóbico, por ej., gel de sílice con grupos metilo u otros grupos alifáticos colgantes.
La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano generalmente es aislada por extracción inicial de pellets celulares, seguida de una o más etapas de concentración, desalinización, intercambio de iones acuosos o cromatografía por exclusión de tamaño. Finalmente, se puede emplear cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para las etapas de purificación final. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas de fusión recombinantes pueden romperse por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación - descongelación, sonicación, rotura mecánica o uso de agentes de lísis celular.
La fermentación de levaduras que expresan proteínas de fusión como una proteína secretada simplifica mucho la purificación. La proteína recombinante secretada que resulta de una fermentación a gran escala puede ser purificada mediante métodos análogos a los descritos por Urdal y cols. (J: Chromatog. 296: 171, 1984), involucrando dos etapas secuenciales de HPLC de fase inversa para la purificación de una proteína recombinante en una columna preparatoria de HPLC.
Para proporcionar una proteína recombinante esencialmente homogénea se pueden utilizar algunas o todas las anteriores etapas de purificación, en varias combinaciones. El cultivo de células recombinantes permite la producción de la proteína de fusión libre de aquellas proteínas contaminantes que normalmente se pueden asociar al TNF-R, como se encuentran en la naturaleza en sus respectivas especies de origen, por ej., en células, exudados celulares o fluidos corporales. Los anteriores procedimientos de purificación están entre aquellos que se pueden emplear para purificar también receptores no recombinantes de la presente invención.
Como alternativa a la producción de receptores artificiales como proteínas de fusión, las proteínas TNF-R se pueden producir y purificar de forma separada, y posteriormente ser unidas entre sí. Se conocen numerosos reagentes útiles para unir una molécula proteica a otra. Por ejemplo en Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois están disponibles para este propósito linkers heterobifuncionales y homobifuncionales. Dichos linkers contienen dos grupos funcionales (por ej., ésteres y/o maleimidas) que reaccionarán con ciertos grupos funcionales en las cadenas laterales de los aminoácidos (por ej., aminas en residuos lisina y sulfhidrilos generados por reducción de residuos cisteína), uniendo así un polipéptido a otro. Son ejemplos de dichos reagentes de unión el N- maleimidobenzoil succinimidil éster y N-hidroxisuccinimida. El reagente y las condiciones de reacción se deben escoger de tal forma que la unión no interfiera con la unión del TNF al receptor. Los polipéptidos TNF-R son preferiblemente conectados mediante uno de los péptidos linker antes descritos que funciona como separador. Un péptido linker se puede acoplar al TNF-R por cualquiera de los procedimientos convencionales usados para unir un polipéptido a otro. Los reagentes de unión disponibles en Pierce Chemical Company como se ha descrito más arriba están entre aquellos que pueden ser empleados. En el péptido linker, por ej. en sus terminales se pueden incluir aminoácidos que tengan cadenas laterales que reaccionen con dichos reagentes.
Composiciones farmacéuticas
La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las proteínas de fusión antes descritas y un transportador, diluyente o excipiente fisiológicamente aceptables. Dichos transportadores, excipientes o diluyentes serán no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. Estas composiciones pueden incluir tampones, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos incluyendo glucosa, sucrosa o dextrinas, agentes quelantes tal como EDTA, glutatión y otros estabilizadores y excipientes. Son ejemplos de diluyentes apropiados el suero salino tamponado neutro y suero salino mezclado con albúmina sérica no específica. Preferiblemente, la composición se formula como liofilizado usando soluciones de excipientes apropiados (por ej., sucrosa) como diluyentes. Las dosis adecuadas se pueden determinar mediante ensayos clínicos. La cantidad y frecuencia de administración dependerá, por supuesto, de factores tales como la naturaleza y severidad de la indicación a tratar, la respuesta deseada, el estado del paciente, etc.
Las patologías mediadas por TNF pueden ser tratadas administrando a un paciente afectado por dicha enfermedad una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de la presente invención en forma de una composición farmacéutica. Se dice que una enfermedad está mediada por el TNF cuando el TNF provoca (directa o indirectamente) la enfermedad o la exacerba. Las proteínas receptoras solubles se pueden usar para unirse de forma competitiva al TNF, inhibiendo así la unión del TNF a los receptores de la superficie celular.
Para uso terapéutico, se administran a un paciente, preferiblemente humano, las proteínas de fusión de la presente invención purificadas para el tratamiento de una forma adecuada a la indicación. Así, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas por inyección en bolus, infusión continua, liberación retardada desde implantes u otra técnica apropiada.
Las proteínas de fusión empleadas en las composiciones farmacéuticas deberían ser purificadas, de forma que la proteína de fusión esté sustancialmente libre de otras proteínas de origen natural o endógeno y contenga menos de un 1% sobre el peso de la proteína de contaminantes residuales de los procesos de producción. Dichas composiciones, sin embargo, pueden contener otras proteínas añadidas como estabilizadores, transportadores, excipientes o tratamientos concomitantes. La proteína de fusión está purificada hasta una homogeneidad sustancial si es detectable como una sola banda proteica en un gel de poliacrilamida mediante tinción argéntica.
Las proteínas de fusión de la presente invención pueden ser administradas para tratar patologías que se sospecha mediadas, al menos en parte, por el TNF, tales como caquexia, artritis reumatoide, diabetes, esclerosis múltiple, fibrosis y silicosis pulmonar, malaria cerebral y rechazo de aloinjertos y xenoinjertos en la enfermedad de injerto contra huésped. El TNF también ha sido implicado en la sepsis y en el shock séptico. Las endotoxinas bacterianas pueden causar sepsis en mamíferos infectados con ciertos tipos de bacterias y se cree que puede estimular los macrófagos para producir factores que incluyen TNF. Folks y cols. (PNAS USA 86:2365, 1989) sugieren que el TNF-\alpha juega un papel importante en la patogénesis de la infección por VIH. TNF-\alpha indujo la expresión de VIH en una línea celular empleada como modelo de latencia de VIH para estudiar la conversión de infección latente a infección productiva.
Ciertas citoquinas (IL-1, IL-2 y otros factores estimuladores de colonias) pueden inducir una producción significativa de TNF en el huésped. Las proteínas de fusión de la fórmula TNF-R-linker-TNF-R pueden ser usadas para tratar efectos secundarios asociados al tratamiento con citoquinas.
El uso de formas solubles de TNF-R en las proteínas de fusión artificiales es ventajoso para ciertas aplicaciones. La purificación de las proteínas de células huésped recombinantes se simplifica, ya que las proteínas solubles son secretadas por las células. Además las proteínas solubles generalmente son más adecuadas para la administración intravenosa y pueden ejercer su efecto terapéutico (unión al TNF) en el torrente sanguíneo. Al unirse al TNF, las proteínas de fusión solubles inhibirán la señal de transducción mediante receptores endógenos de superficie celular para el TNF.
Las proteínas de fusión artificiales también pueden ser usadas como reagentes en inmunoensayos basados en receptores, reagentes en ensayos para TNF o como agentes de unión para purificación de TNF por afinidad.
Ejemplos
Ejemplo 1
Ensayos de unión de TNF
A. Radiomarcaje de TNF\alpha y TNF\beta. El TNF\alpha humano recombinante, en forma de proteína de fusión conteniendo un octapéptido hidrofílico en el terminal N, fue expresado en levadura como proteína secretada y purificado por cromatografía de afinidad (Hopp y cols., Biol/Technology 6:1204, 1988). Se adquirió TNF\beta humano recombinante purificado en R&D Systems (Minneapolis, MN). Ambas proteínas fueron radiomarcadas usando el agente de fase sólida comercialmente disponible, IODO-GEN (Pierce). En este procedimiento se depositaron 5 \mug de IODO-GEN en el fondo de un tubo de vidrio de 10 x 75 mm y se incubaron durante 20 minutos a 4ºC con 75 \mul de sodio fosfato 0.1 M, pH 7.4 y 20 \mul (2mCi) Na ^{125}I. Después esta solución fue transferida a un segundo tubo de vidrio que contenía 5 \mug de TNF\alpha (o TNF\beta) en 45 \mul de PBS durante 20 minutos a 4ºC. La mezcla de reacción fue fraccionada por filtración en gel sobre un lecho de 2 ml de volumen de Sephadex G-25 (Sigma) equilibrado en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 conteniendo 2.5% (w/v) se albúmina sérica bovina (BSA), 0.2% (w/v) de azida sódica y 20 mM de Hepes pH 7.4 (medio de unión). La mezcla final de ^{125}I-TNF fue diluida a una solución de trabajo de 1 x 10^{-6} M en el medio de unión y almacenada hasta un mes a 4ºC sin pérdida detectable de su actividad de unión al receptor. Habitualmente la actividad específica es 1 x 10^{6} cpm/mmol de TNF.
B. Unión a células intactas. Los ensayos de unión a células intactas se realizaron mediante 2 métodos. En el primer método, primero se cultivaron las células bien en suspensión (por ej., U 937) o por adherencia en placas de cultivo tisular (por ej., W126-VA4 o células COS que expresan el receptor de TNF recombinante). Posteriormente las células adherentes fueron retiradas por tratamiento con EDTA 5mM durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Los ensayos de unión se realizaron después mediante un método de separación de aceite ftalato (Dower y cols., J. Immunol. 132: 751, 1984) esencialmente como describen Park y cols (J. Biol. Chem. 261:4177, 1986). La unión no específica de ^{125}I-TNF fue medida en presencia de un exceso molar de 200 veces o más de TNF no marcado. Se incluyó azida sódica (0.2%) en un ensayo de unión para inhibir la internalización de ^{125}I-TNF por las células. En el segundo método, se estudio la capacidad de unión al ^{125}I-TNF de células COS transfectadas con el plásmido que contiene TNF-R y que expresan los receptores TNF en la superficie, mediante el ensayo de unión en placa descrito por Sims y cols. (Science 241:585, 1988).
C. Ensayos de unión de fase sólida. La capacidad del TNF-R de extractos detergentes de células humanas que mantienen la actividad de unión al TNF para ser adsorbido de forma estable a nitrocelulosa proporcionó un método de detectar TNF-R. Los extractos celulares se prepararon mezclando mediante agitación fuerte un pellet celular con un volumen de 2 x de PBS, conteniendo 1% de Triton X-100 y un cóctel de inhibidores de proteasa (fenilmetil sulfonil fluoruro 2mM, pepstatina 10\muM, leupeptina 10\muM, o-fenantrolina 2mM y EGTA 2mM). La mezcla fue incubada en hielo durante 30 minutos, tras lo cual fue centrifugada a 12,000x g durante 15 minutos a 8ºC para eliminar los núcleos y otros restos. Se colocaron alícuotas de dos mililitros del extracto celular en membranas secas de nitrocelulosa BA85/21 (Schleicher y Schuell, Keene, NH) y se dejaron secar. Las membranas fueron incubadas en platos de cultivo tisular durante 30 minutos en solución salina tamponada (0.15 M) con Tris (0.05 M) de pH 7.5, conteniendo 3% w/v de BSA para bloquear lugares de unión no específicos. Después la membrana fue cubierta con 5 x 10^{-11} M ^{125}I-TNF en PBS + 3% BSA e incubada durante 2 h a 4ºC agitándola. Al final de este tiempo, las membranas fueron lavadas 3 veces con PBS, secadas y colocadas en una película Kodak X-Omat AR durante 18 h a -70ºC.
D. Ensayos de transducción de señal. La inhibición de la actividad de transducción de señal del TNF puede ser determinada transfectando células con ADNs de TNF-R recombinante que codifiquen TNF-R unido a la membrana para obtener expresión de receptores recombinantes en la superficie celular. Después las células son puestas en contacto con TNF y se examinan los efectos metabólicos resultantes. Si se produce un efecto que es atribuible a la acción del ligando, y no es atribuible a receptores endógenos de TNF en las células, entonces el receptor recombinante tiene actividad de transducción de señal. Ejemplos de procedimientos para determinar si un polipéptido tiene actividad de transducción de señal son descritos por Idzerda y cols., J. Exp. Med. 171:861 (1990); Curtis y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3045 (1989); Prywes y cols., EMBO J. 5:2179 (1986) y Chou y cols., J. Biol. Chem. 262:1842 (1987). La habilidad de un polipéptido TNF-R soluble para inhibir de forma competitiva la señal de transducción puede ser determinada usando procedimientos similares. Las células o líneas celulares primarias que expresan un receptor TNF endógeno y tienen respuesta biológica detectable al TNF podrían ser utilizadas como alternativa a las células que expresan TNF-R recombinante unido a la membrana. Una disminución en la señal de transducción cuando se añade al ensayo un polipéptido TNF-R soluble indica unión del TNF por el TNF-R soluble, de forma que se une menos TNF a los receptores de TNF de superficie celular para iniciar la transducción de señal.
Ejemplo comparativo 1
Ensayo de unión de IL-1
A. Radiomarcaje de rIL-1\beta. Se preparó IL-1\beta recombinante humana por expresión en E. Coli y purificación hasta la homogeneidad como describen Kronheim y cols. (Biol/Technology 4:1078, 1986). La IL-1\beta fue marcada con reagente Bolton Hunter di-iodo (^{125}I) (New England Nuclear, Genolden, PA). Se mezclaron diez microgramos (0.57 nmol) de proteína en 10\muL de solución salina (0.15 mol/L) tamponada con borato sódico (0.1 mol/L), pH 8.5, y se hicieron reaccionar con 1mCI (0.23 nmol) de reagente de Bolton-Hunter conforme a las instrucciones del fabricante durante 12 horas a 8ºC. Posteriormente, se añadieron 30 \muL de gelatina al 2% y 5 \muL de etiléster de glicina 1 mol/L y la proteína fue separada del reagente de Bolton-Hunter que no había reaccionado en una columna Biogel(tm) P6 (BioRad Laboratories, Richmond, CA) con un volumen de lecho de 1mL. Rutinariamente se observó una incorporación del marcador del 50-60%. La radioiodación produjo actividades específicas en el rango de 1 x 10^{15} a 5 x 10^{15} cpm/mmol^{-1} (0.4 a 2 átomos de I por molécula de proteína), y la electroforésis con gel de sodio dodecil poliacrilamida sulfato reveló un único polipéptido marcado de 17.5 kD, consistente con los valores previamente reportados para IL-1. La proteína marcada fue más de un 98% precipitable en TCA, indicando que el ^{125}I estaba unido de forma covalente a la proteína.
B. Ensayo de inhibición de la unión para IL-1R unido a la membrana. ``IL-1'' se refiere de forma colectiva a IL-1\alpha y a IL-1\beta. La constante de inhibición de la unión de una proteína IL-1R puede ser determinada por ensayos de inhibición de la unión en los que son incubadas concentraciones variables de un competidor (IL-1\beta o IL-1\alpha) con una cantidad constante de IL-1\beta o IL- 1\alpha radiomarcadas y con células que expresan el IL-1R. El competidor no radiomarcado se une al receptor e impide que el ligando radiomarcado se una al receptor. Los ensayos de unión se realizaron con un método de separación con aceite ftalato esencialmente como describen Dower y cols., J. Immunol. 132:751, 1984 y Park y cols., J. Biol. Chem. 261:4177, 1986. Brevemente, se incubaron células huésped que expresan un IL-1R recombinante unido a la membrana en placas de seis pozos (Costar, Cambridge, MA) a 4ºC durante 2h con ^{125}I- IL- 1\beta en 1 ml de medio de unión (Medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 combinando 2% de BSA, 20mM de tampón Hepes y 0.1% de azida sódica, pH 7.2). La azida sódica se incluyó para inhibir la internalización y degradación de ^{125}I-IL-1 por las células a 37ºC. Las placas fueron incubadas en un agitador giratorio durante 1 hora a 37ºC. Después se transfirieron alícuotas replicadas de la mezcla de incubación a tubos de centrifugación de polietileno que contienen una mezcla de aceite ftalato que comprende 1.5 partes de dibutilftalato, a 1 parte de bis(s-etilhexil)ftalato. También se incluyeron tubos de control conteniendo un exceso 100x molar de IL-1\beta no marcada para determinar la unión no específica. Se separaron las células unidas a ^{125}I-IL-1 de la ^{125}I-IL-1 no unida por centrifugación durante 5 minutos a 15,000X g en un Eppendorf Microfuge. Después se determinó en un contador gamma la radioactividad asociada a las células.
C. Ensayo de inhibición de unión para IL-1R soluble. La constante de inhibición de unión de un IL-1R humano soluble puede ser determinada por un ensayo de inhibición de unión en el cual se incuban concentraciones variables de un competidor IL-1\beta con una cantidad constante de I-IL-1\beta radiomarcada y células CB23 (una línea celular de linfocitos B de sangre de cordón umbilical transformada con virus de Epstein Barr) que expresa el tipo II de IL-1R. En los ensayos que afectan al IL-1R tipo I soluble, las células CB23 se pueden sustituir por una línea celular que exprese receptores IL-1 tipo I endógenos. Los ensayos de unión se realizaron con un método de separación con aceite ftalato esencialmente como describen Dower y cols., J. Immunol. 123:751, 1984 y Park y cols., J. Biol. Chem. 261:4177, 1986. Brevemente, se transfectaron células CVI-EBNA (mamíferas) con el vector de expresión pDC406 que contiene ADNc que codifica un IL-1R tipo II humana soluble como se describe en el ejemplo 10. Los sobrenadantes de las células se cultivaron 3 días después de la transfección y se diluyeron de forma seriada en medio de unión (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 conteniendo 2% de BSA, 20 mM de tampón Hepes, y 0.2% de azida sódica, pH 7.2) placas de seis pozos hasta un volumen de 50 \mul/pozo. Los sobrenadantes fueron incubados con 50 \mul de 9 x 10^{-10} M ^{125}I-IL- 1\beta y 2.5 x 10^{6} células CB23 a 8ºC durante 2 horas con agitación. Después se transfirieron alícuotas duplicadas de 60 \mul de la mezcla de incubación a centrifugadoras de polietileno conteniendo una mezcla de aceite ftalato comprendiendo 1.5 partes de dibutilftalato, 1 parte de bis(s-etilhexil)ftalato. También se incluyeron un tubo de control negativo conteniendo 3 x 10^{-6} M IL-1\beta no marcada para determinar la unión no específica (100% de inhibición) y un tubo de control positivo conteniendo 50 ml de medio de unión solo con IL-1\beta radiomarcada para determinar la máxima unión. Las células unidas a ^{125}I-IL-1\beta se separaron de la ^{125}I-IL-1\beta no unida por centrifugación durante 5 minutos a 15,000 X g en una Eppendorf Microfuge. Los sobrenadantes conteniendo ^{125}I-IL-1\beta no unido se desecharon y las células fueron lavadas cuidadosamente con medio de unión helado. Las células fueron incubadas en 1 ml de tripsina-EDTA a 37ºC durante 15 minutos y después recolectadas. Después se determinó con un contador gamma la radioactividad asociada a las células. La capacidad del IL-1R soluble para inhibir la unión de IL-1\alpha a receptores celulares endógenos puede ser determinada por el mismo procedimiento. Se pueden emplear técnicas análogas en ensayos con TNF-R soluble.
Ejemplo 2
Aislamiento de ADNc de TNF-R humano por expresión directa de la proteína activa en células COS-7
Se cribaron varias líneas celulares humanas con respecto a la expresión de TNF-R basándose en su capacidad para unir TNF marcado con ^{125}I. Se halló que la línea celular de fibroblastos humanos WI-26 VA4 (ATCC CCL 95.1) expresa un número razonable de receptores por célula. Los estudios de equilibrio de unión mostraron que la línea celular exhibía una unión bifásica al ^{125}I-TNF con aproximadamente 4,000 sitios de alta afinidad (K_{a} = 1 x 10^{10} M^{-1}) y 15,000 sitios de baja afinidad (K_{a} = 1 x 10^{8} M^{-1}) por célula.
Se construyó un biblioteca de ADNc de tamaño indeterminado por transcripción inversa de ARNm poliadenilado aislado de ARN total extraído de fibroblastos humanos WI-26VA4 cultivados en presencia de mitógeno Pokeweed usando técnicas estándar (Gubler y cols., Gene 25:263, 1983; Ausubel y cols., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 1987). Las células fueron recogidas provocando la lísis celular en una solución de hidrocloruro de guanidina y ARN total aislado como se ha descrito antes (March y cols., Nature 315: 641, 1985).
Se aisló ARN poli A^{+} por cromatografía con oligo dT celulosa y se preparó ADNc de doble hebra por un método similar al de Gubler y Hoffman (Gene 25:263, 1983). Brevemente, se convirtió el ARN poli A^{+} a un híbrido de ARN-ADNc por transcriptasa inversa usando oligo dT como cebador. El híbrido ARN-ADNc se convirtió después en ADN de doble hebra usando RNAasa H en combinación con ADN polimerasa I. El ADNc de doble hebra resultante fue dotado de extremos romos con T4 ADN polimerasa. Al ADNc con extremos romos se añaden adaptadores para linker Ecori (que tienen sitios Not1 internos) que estaban fosforilados solo en un extremo (Invitrogen). El ADNc adaptado para linkers se trató con T4 polinucleotidokinasa para fosforilar la región 5' colgante del adaptador de linker y los linkers no unidos se eliminaron haciendo circular el ADNc por una columna CL4B Sepharose. El ADNc adaptado para linkers fue ligado a una concentración equimolar de bacteriófago \lambdagt10 con EcoRI cortado y brazos desfosforilados (Huynh y cols., DNA Cloning: A Practical Approach, Glover, ed., IRL Press, pp. 49-78). El ADN ligado fue empaquetado en partículas de fago usando un kit comercialmente disponible para generar una biblioteca de recombinantes (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA). Los recombinantes fueron amplificados colocando el fago en un césped bacteriano de la cepa E. Coli c600(hfl^{-}).
El fago ADN fue purificado de la biblioteca de ADNc \lambdagt10 y se escindieron las inserciones de ADNc por digestión con el enzima de restricción Not1. Tras la electroforésis del producto de digestión a través de un gel de agarosa, se aislaron los ADNc mayores de 2,000 pb.
Los ADNc resultantes fueron ligados en el vector de expresión eucariota pCA V/NOT, que fue diseñado para expresar secuencias de ADNc insertadas en su sitio de clonación múltiple cuando es transfectado a células mamíferas. El pCA V/NOT fue ensamblado de pDC201 (un derivado del pMLSV, previamente descrito por Cosman y cols., Nature 312:768, 1984), SV40 y ADN de citomegalovirus y comprende, en el orden de la dirección de transcripción desde el origen de replicación: (1) secuencias SV40 de coordinados 5171-270, incluyendo el origen de replicación, secuencias ampliadoras y promotoras tempranos y tardíos; (2) secuencias de citomegalovirus incluyendo las regiones promotoras y ampliadoras (nucleótidos 671 a +63 de la secuencia publicada por Boechart y cols. (Cell 41:521, 1985); (3) secuencias de adenovirus-2 conteniendo el primer exon y parte del intrón entre el primer y el segundo exones de la guía tripartita, el segundo exon y parte del tercer exon de la guía tripartita y un sitio de clonación múltiple (MCS) conteniendo los sitios para Xho1, Kpn1, Sma1, Not1 y Bgl1, (4) secuencias SV40 de coordinados 4127-4100 y 2770-2533 que incluyen señales de poliadenilación y terminación para la transcripción temprana; (5) secuencias derivadas de pBR322 y secuencias asociadas a virus VAI y VAII de pDC201, con secuencias de adenovirus 10532-11156 conteniendo genes VAI y VAII, seguidos de secuencias pBR322 de 4363-2486 y 1094-375 conteniendo el gen de resistencia a la ampicilina y el origen de replicación. pCA V/NOT ha sido depositado en la American Type Culture Collection bajo el número de acceso ATCC 68014.
La biblioteca de ADNc WI-26 VA4 en pCA V/NOT resultante fue usada para transformar la cepa E. coli DH5\alpha y los recombinantes se colocaron en placas para proporcionar aproximadamente 800 colonias por placa y suficientes placas para proporcionar aproximadamente 50,000 colonias totales por cribado. Se rasparon las colonias de cada placa, se juntaron y se preparó un plásmido de ADN de cada conjunto. El ADN juntado se usó después para transfectar una capa subconfluyente de células COS-7 de mono usando dextrano DEAE seguido de tratamiento con cloroquina, como describen Luthman y cols. (Nucl. Acids Res. 11:1295, 1983) y McCutchan y cols. (J. Natl. Cancer Inst. 41:351, 1986). Las células fueron cultivadas durante 3 días para permitir la expresión transitoria de las secuencias insertadas. Después de 3 días, se descartaron los sobrenadantes de los cultivos celulares y se estudió la unión a TNF en las monocapas celulares en cada placa como sigue. Se añadieron a cada placa 3 ml de medio de unión conteniendo 1.2 x 10^{-11} M de FLAG(r)-TNF marcado con ^{125}I y se incubaron las placas a 4ºC durante 120 minutos. Posteriormente se desechó este medio y cada placa se lavó una vez con medio de unión frío (conteniendo TNF no marcado) y dos veces con PBS frío. Los bordes de cada placa se rompieron, dejando un disco plano que se puso en contacto con una película de rayos X durante 72 horas a -70ºC usando una pantalla intensificadora como describen Sims y cols., Science 241:585 (1988). Se visualizó la actividad de unión al TNF en las películas expuestas como un foco oscuro sobre un fondo relativamente uniforme.
Después de que se hubieran cribado de esta manera aproximadamente 240,000 recombinantes de la biblioteca, se detectó un grupo de transfectantes que proporcionaba focos de unión al TNF que eran claramente aparentes sobre el fondo de exposición. Entonces se usó una reserva congelada de bacterias del grupo positivo para obtener placas de aproximadamente 150 colonias. Se hicieron réplicas de dichas placas en filtros de nitrocelulosa, y las placas se rasparon y se preparó ADN plásmido y se transfectó como se ha descrito antes para identificar una placa positiva. Las bacterias de las colonias individuales de la réplica en nitrocelulosa de esta placa se hicieron crecer en cultivos de 0.2 ml, que fueron usados para obtener ADN plásmido, que fue transfectado a células COS-7 como se ha descrito antes. De esta manera, se aisló un único clon que era capaz de inducir la expresión de TNF-R humano en células COS. El vector de expresión pCA V/NOT conteniendo este c-ADN de TNF-R ha sido depositado en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA (Accesion No. 68088) bajo el nombre pCAV/NOT-TNF-R.
Ejemplo 3
Construcción de ADNc que codifican huTNF-R\Delta235 soluble
Se construyó un ADNc soluble que codifica huTNF-R\Delta235. La proteína codificada comprende la secuencia de aminoácidos -22 a 235 de la Figura 2A. El procesamiento de la secuencia señal da lugar a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos 1 a 235 de la figura 2A. Se escindió un fragmento de 840 pb de pCAV/NOT-TNF-R con los enzimas de restricción Not1 y Pvu2. Not1 corta en el sitio de clonación múltiple de pCAV/NOT-TNF-R y Pvu2 corta en la región de codificación del TNF-R 20 nucleótidos 5' de la región de transmembrana. Para reconstruir el extremo 3' de las secuencias del TNF-R, se sintetizaron dos oligonucleótidos y se alinearon para crear el siguiente linker de oligonucleótidos:
SEQ ID NO: 9 (ver original, pág. 33)
Este linker de oligonucleótidos tiene sitios terminales de restricción Pvu2 y Bg12, regenera 20 nucleótidos del TNF-R, seguidos de un codón de terminación (subrayado) y un sitio de restricción BamH1 (para poder aislar el TNF-R soluble completo por digestión con Not1/BamH1). Después el oligonucleótido fue ligado a la inserción de 840 pb Not1/Pvu2 TNF-R en Bg12/Not1 corte pCAV/NOT para obtener psohuTNF-R\Delta235/CAVNOT, que fue transfectado en células COS-7 como se ha descrito antes. Este vector de expresión indujo la expresión de TNF-R humano soluble que fue capaz de unirse al TNF.
Ejemplo 4
Construcción de ADNcs que codifican huTNF-R\Delta185 soluble
Se construyó un ADNc que codifica huTNF-R\Delta185 soluble teniendo la secuencia de aminoácidos -22-185 de la figura 2A (o aminoácidos 1-185 después de procesar la secuencia señal en una célula huésped apropiada) por excisión de un fragmento de 640 pb de pCVA/NOT-TNF-R con los enzimas de restricción Not1 y Bg12. Not1 corta en el sitio de clonación múltiple de pCVA/NOT-TNF-R y Bg12 corta en la región de codificación del TNF-R en el nucleótido 637, que esta 237 nucleótidos 5' de la región de transmembrana. Se sintetizaron los siguientes linkers de oligonucleótidos:
SEQ ID NO: 10 (ver original, pág. 33)
SEQ ID NO: 11 (ver original, pág. 33)
Estos linkers de oligonucleótidos reconstruyen el extremo 3' de la molécula del receptor hasta el nucleótido 708 seguida de un codón de terminación (subrayado). Estos oligonucleótidos se unieron a la inserción de 640 pb Not1 TNF-R en el corte Not1 de pCAV/NOT para obtener el vector de expresión psolTNF-R\Delta185/CAVNOT que fue tranfectado a células COS-7 como se ha descrito arriba. Este vector de expresión indujo la expresión de TNF-R soluble humano que fue capaz de unirse al TNF.
Ejemplo 5
Construcción de ADNcs que codifican huTNF-R\Delta163 soluble
Se construyó un ADNc que codifica huTNF-R\Delta163 soluble teniendo la secuencia de aminoácidos -22-163 de la figura 2A (1-163 después de procesar la secuencia señal) por excisión de un fragmento de 640 pb de pCVA/NOT-TNF-R con los enzimas de restricción Not1 y Bg12 como se ha descrito en el ejemplo 4. Se sintetizaron los siguientes linkers de oligonucleótidos:
SEQ ID NO: 12 (ver original, pág. 34)
Este linker de oligonucleótidos reconstruye el extremo 3' de la molécula del receptor hasta el nucleótido 642 (aminoácido 163), seguida de un codón de terminación (subrayado). Este oligonucleótido se unió a la inserción de 640 pb Not1 TNF-R en el corte Not1 de pCAV/NOT para obtener el vector de expresión psolTNF-R\Delta163/CAVNOT que fue transfectado a células COS-7 como se ha descrito arriba. Este vector de expresión indujo la expresión de TNF-R soluble humano que fue capaz de unirse al TNF en el ensayo de unión descrito en el ejemplo 1.
Ejemplo 6
Construcción de ADNcs que codifican huTNF-R\Delta142 soluble
Se construyó un ADNc que codifica huTNF-R\Delta142 soluble teniendo la secuencia de aminoácidos -22-142 de la figura 2A (1-142 después de procesar la secuencia señal) por excisión de un fragmento de 550 pb de pCVA/NOT-TNF-R con los enzimas de restricción Not1 y AlwN1. AlwN1 corta en la región de codificación del TNF-R en el nucleótido 549. Se sintetizó el siguiente linker de oligonucleótidos:
SEQ ID NO: 13 (ver original, pág. 34)
Estos linker de oligonucleótidos reconstruye el extremo 3' de la molécula del receptor hasta el nucleótido 579 (aminoácido 142), seguida de un codón de terminación (subrayado). Estos oligonucleótido se unió a la inserción de 550 pb Not1/AlwN1 TNF-R en el corte Not1/Bg12 de pCAV/NOT para obtener el vector de expresión psolTNF-R\Delta142/CAVNOT que fue transfectado a células COS-7 como se ha descrito arriba. Este vector de expresión no indujo la expresión de TNF-R soluble humano capaz de unirse al TNF. Se cree que esta construcción particular no consiguió expresar TNF-R biológicamente activo porque se eliminaron uno o más residuos esenciales de cisteína (por ej., Cis157 o Cis163) necesarios para el enlace intramolecular (para la formación de la estructura terciaria adecuada de la molécula de TNF-R).
Ejemplo comparativo 2
Aislamiento de clones de ADNc de IL-1R tipo I humano
Se aisló el ADNc que codifica la proteína IL-1R tipo I humano por hibridación en una sonda derivada de ADNc de IL-1R tipo I murino. La clonación de este ADNc de IL-1R murino se describe en el ejemplo 4 de EP 318,296. Se depositó un vector conteniendo el ADNc murino en la American Type Culture Collection bajo el nombre GEMBL78 el 19 de Noviembre de 1987 y se le dio el número de acceso ATCC67563.
Un fragmento de 2356 pares de bases (pb) de este clon murino 78 depositado se aisló como describen Sims y cols. (Science 241:585, 1988) y se radiomarcó por traslación de mellas usando una ADN polimerasa I como sonda. El método empleado fue sustancialmente similar al descrito por Maniatis y cols. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p. 109).
La sonda se usó para cribar bibliotecas de ADNc humano con respecto al IL-1R humano, como describen Sims y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:8946, 1989. Se construyó una biblioteca de ADNc por transcripción inversa de ARNm poliadenilado aislado de ARN total extraído de células cultivadas de una línea celular de linfocitos T humanos designada clon 22, descrita por Acres y cols. (J. Immunol. 138:2132, 1987). Estas células fueron cultivadas en medio RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal como describen Acres y cols. (supra), en presencia de 10 ng/ml de anticuerpo OKT3 y 10 ng/ml de IL-2 humana. El ADNc se transformó en doble-hebra usando ADN polimerasa I, con extremos romos con T4 ADN polimerasa, metilada con EcoRI metilasa para proteger los sitios de división EcoRI en el ADNc, y ligada a linkers EcoRI. Las construcciones resultantes fueron digeridas con EcoRI para eliminar todas menos una copia de los linkers en cada extremo del ADNc, y ligadas a los brazos cortados con EcoRI y desfosforilados del bacteriófago \lambdagt10 (Huynh y cols., DNA Cloning: A Practical Approach, Glover, ed, IRL Press, pp. 49-78.). El ADN ligado fue empaquetado en partículas fago usando un kit comercialmente disponible (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA 92121) para generar una biblioteca de recombinantes. Los recombinantes fueron colocados en placas de E. coli cepa C600(hf1-) y cribados por técnicas estándar de hibridación de placa bajo condiciones de rigurosidad moderada (50ºC, 6 x SSC).
Tras varias rondas de cribado, se aislaron nueve clones de la biblioteca que se hibridaron con la sonda de ADNc. Los clones se purificaron y se usaron para preparar un ADN bacteriófago que fue digerido con EcoRI. Los productos de digestión se sometieron a electroforésis en gel de agarosa, secados sobre filtros de nylon y reevaluados con respecto a la hibridación. Los clones fueron digeridos con EcoRI seguido de electroforésis preparatoria en gel de agarosa, y después subclonados a un del vector de clonación estándar pBR322 derivado cortado con Eco-RI (pGEMBL) conteniendo un polilinker que tiene un único sitio EcoRI, un sitio BamH1 y muchos otros sitios de restricción únicos. Un vector ejemplar de este tipo es descrito por Dente y cols. (Nucl. Acids Res. 11: 1645, 1983).
El mapeo y secuenciación de las restricciones de un clon de IL-1R humano de 4.8 kb indicó que el clon incluía una secuencia que codificaba 518 aminoácidos que exhibían un 80% de identidad respecto a la secuencia murina correspondiente en la región extracelular o N-terminal distal a la región de transmembrana, un 63% de identidad en la región de transmembrana y un 87% de identidad en la región citoplasmática o C-terminal. Se marcó con ^{32}P un fragmento EcoRI-NsiI de 440 pb derivado de la porción 5' del clon de IL-1R humano por traslación de mella como se ha descrito antes y se usó para cribar un biblioteca de ADNc producida por imprimación aleatoria de ARNm del clon 22 de la línea de células T humanas preparado como se ha descrito arriba. Se aislaron 23 clones que hibridaban la sonda y se analizaron por mapeo de restricción. La secuenciación de uno de estos clones proporcionó la información de la secuencia correspondiente a los restantes 34 aminoácidos N-terminales de la proteína humana. El ADN y la secuencia deducida de aminoácidos de la región completa de codificación del IL-1R tipo I humano se muestran en las SEQ ID NOS: 5 y 6. Esta proteína IL-1R humana comprende 569 aminoácidos (incluyendo un péptido señal de 20 aminoácidos), e incluye 16 residuos de cisteína, 13 de los cuales son comunes a los genes murino y humano. Además, la secuencia humana incluye seis sitios de potencial N-glicosilación, de los cuales 5 son comunes a los ratones y a los humanos.
Ejemplo comparativo 3
Aislamiento de ADNc que codifica IL-1R tipo II
Se aisló una secuencia de ADN que codifica IL-1R tipo II humano de una biblioteca de ADNc preparada usando métodos estándar, por transcripción inversa de ARN poliadenilado aislado de la línea CB23 de células B humanas linfoblastoides, descrita por Benjamin & Dower, Blood 75:2017, 1990. Brevemente, la línea celular CB23 es una línea celular de linfocitos de sangre umbilical (CB) transformados con EBV, que fue derivada usando los métodos descritos por Benjamin y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3547, 1984.
La biblioteca CB23 se cribó mediante expresión directa modificada de fragmentos unidos de ADNc en la línea celular de riñón de mono CV-1/EBNA-1 usando un vector de expresión mamífero (pDC406) que contiene los orígenes de replicación derivados de SV40, virus Epstein-Barr y pBR322. pDC406 es un derivado de HAV-EO descrito por Dower y cols., J. Immunol. 142: 4314 (1989). pDC406 difiere de HAV-EO por la eliminación del intron presente en la secuencia guía tripartita de adenovirus 2 en HAV-EO. La línea celular CV-1/EBNA-1 se derivó por transfección de la línea celular CV-1 con el gen que codifica el antígeno nuclear 1 del virus Epstein-Barr (EBNA-1) y con un vector que contiene las secuencias reguladoras del CMV, de forma que el EBNA-1 se expresa bajo el control de ampliadores/promotores inmediatos-precoces del CMV humano. El gen EBNA-1 permite la replicación episomal de vectores de expresión tales como pDC406 que contienen el origen de replicación del EBV.
Se identificaron inicialmente transfectantes que expresaban IL-1R de tipo II biológicamente activo, usando una técnica autoradiográfica de placas modificada, sustancialmente como describen Gearing y cols., EMBO J. 8:3667, 1989. Brevemente, se transfectaron células CV-1/EBNA-1 con ADN miniprep en pDC406 de mezclas de clones de ADNc directamente sobre placas de vidrio y se cultivaron durante 2-3 días para permitir la expresión transitoria de IL-1R de tipo II. Las placas que contenían las células transfectadas fueron incubadas después con un medio conteniendo ^{125}I-IL-1\beta, lavadas para eliminar la IL- 1\beta marcada no unida, fijadas con glutaraldehído e introducidas en una emulsión fotográfica líquida y expuestas en la oscuridad. Después de revelar las placas, se examinaron individualmente con un microscopio y se identificaron las células positivas que expresaban el IL-1R tipo II por la presencia de gránulos de plata autoradiográficos sobre un fondo claro.
Usando esta aproximación, se cribaron aproximadamente 250,000 ADNc en grupos de aproximadamente 3,000 ADNc usando el método autoradiográfico de placas hasta que el estudio de uno de los grupos transfectantes mostró múltiples células claramente positivas respecto a la unión de IL-1\beta. Después este grupo fue dividido en grupos de 500 y cribado de nuevo por autoradiografía de placas. Se identificó un grupo positivo. Este grupo fue dividido de nuevo en grupos de 75 y cribado por ensayos de unión en placa analizado por cuantificación de ^{125}I-IL-1\beta. Las células fueron raspadas y contadas para determinar cual de los grupos de 75 era positivo. Las colonias individuales de este grupo de 75 fueron cribadas hasta que se identificó un único clon que dirige la síntesis de la proteína de superficie con actividad detectable de unión a la IL- 1\beta. Este clon se aisló y su inserción se secuenció para determinar la secuencia del ADNc del IL-1R de tipo II humano que se presenta junto con la secuencia de aminoácidos codificada por él en la SEQ ID NOS: 7 y 8. El vector de clonación pDC406 que contiene el ADNc del IL-1R de tipo II humano, designado pHu IL-1R-II 75, fue depositado en células huésped E. coli en la American Type Culture Collection, Rockville, MD. USA (ATCC) el 5 de Junio de 1990 bajo el número de acceso ATCC 68337. El depósito se hizo bajo las condiciones del Tratado de Budapest.
Al igual que la mayoría de genes mamíferos, el IL-1R de tipo II mamífero presumiblemente es codificado por genes multi-exon.
Ejemplo comparativo 4
Construcción y expresión de ADNcs que codifican IL-1R de tipo II soluble humano
Se construyó un ADNc que codifica IL-1R de tipo II soluble humano (teniendo la secuencia de aminoácidos -13 -333 de SEQ ID NO: 8) por amplificación con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando la longitud completa del clon 75 de ADNc de IL-1R de tipo II (ATCC 68337) en el vector pDC406 (descrito en el ejemplo comparativo 3) como patrón. En primer lugar se construyeron el siguiente cebador 5' de oligonucleótidos (SEQ ID NO: 14) y cebador 3' de oligonucleótidos (SEQ ID NO: 15):
SEQ ID NO: 14 (ver original, pág. 38)
SEQ ID NO: 15 (ver original, pág. 38)
El cebador 5' corresponde a los nucleótidos 31-51 de la región no traducida del clon 75 de IL-1R tipo II humano (SEQ ID NO: 7) con un sitio de restricción SalI añadido en 5'; esta secuencia de nucleótidos es capaz de alinearse con la hebra (-) complementaria a los nucleótidos 31-51 del clon 75 humano. El cebador 3' es complementario a los nucleótidos 1191-1172 (que incluyen nucleótidos de sentido contrario que codifican 3 aminoácidos del clon 75 de IL-1R humano tipo II y que tiene un añadido en 5' de un sitio de restricción NotI y un codón de terminación.
Los siguientes reagentes PCR se añadieron a un tubo Eppendorf microfuge de 1.5 ml: 10 \mul de tampón 10X PCR (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8.3 a 25ºC, 15 mM MgCl_{2}, y 1 mg/ml de gelatina) (Perkins-Elmer Cetus, Norwalk, CN), 10 \mul de una solución 2mM conteniendo cada uno dNTP (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dGTP y 2 mM dTTP), 2.5 unidades (0.5 \mul de solución estándar de 5000 unidades/ml) de Taq ADN polimerasa (Perkins-Elmer Cetus), 50 ng de ADN patrón y 5 \mul de una solución 20 \muM de cada uno de los anteriores cebadores de oligonucleótidos y 74.5 \mul de agua hasta un volumen final de 100 \mul. La mezcla final se cubrió después con 100 \mul de aceite de parafina. La PCR se llevó a cabo usando un ciclador térmico de ADN (Ericomp, San Diego, CA) inicialmente desnaturalizando el patrón a 94º durante 90 segundos, realineamiento a 55º durante 75 segundos y extendiendo el ADNc a 72º durante 150 segundos. Se llevó a cabo la PCR durante 20 ciclos adicionales de amplificación usando un programa en etapas (desnaturalización a 94º, 25 seg; alineamiento a 55º, 45 segundos; extensión a 72º, 150 seg), seguida de una extensión de 5 minutos a 72º.
La muestra fue separada del aceite de parafina y el ADN extraído por extracción con fenolcloroformo y cromatografía de columna giratoria sobre G-50 (Boehringer Mannheim). Se separó una alícuota de 10 \mul del ADN extraído por electroforésis en agarosa 1% SeaKern (FMC BioProducts, Rockland, ME) y se tiño con bromuro de etidio para confirmar que el tamaño del fragmento de ADN era consistente con el producto predicho.
Después se digirieron 20 \mul de los productos de ADNc amplificado con PCR con enzimas de restricción SalI y NotI usando procedimientos estándar. Después se separó el fragmento de restricción SalI/NotI en agarosa 1.2% Seaplaque gelificante a baja temperatura (LGT) y se aisló la banda que representaba el fragmento. El fragmento se ligó al vector pDC406 por un método estándar de ligado ``en gel''. El vector resultante fue transfectado en células CV1-EBNA y se expresó la proteína soluble IL-1R.
Ejemplo 7
Construcción de un vector que codifica di-TNF-R
Se construyó como sigue un vector que codifica una proteína de fusión de la fórmula TNF-R-péptido linker - TNF-R y que se muestra en la figura 3. También se muestran en las figuras 2A y 2B los correspondientes sitios de corte por enzimas de restricción en la secuencia del TNF-R.
El vector se expresión construido en el ejemplo 3 y designado psol huTNF-R\Delta235/CAVNOT se digirió con el enzima de restricción Not I, que corta en el sitio de clonación múltiple del vector pCAV/NOT (es decir, hacia arriba de la secuencia del TNF-R insertada en el mismo). El saliente generado por la digestión con Not I fue llenado usando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I para producir un extremo romo. Después el vector fue digerido con Bam HI que corta hacia debajo del codón de terminación que sigue al codón para el aminoácido 235, como se muestra en el ejemplo 3.
El fragmento romo NotI/Bam HI conteniendo la secuencia del TNF-R fue aislado por procedimientos convencionales e insertado en un vector plásmido designado pCAV/DHFR que había sido digerido con Sma I y Bgl II. El vector pCAV/DHFR es un vector de expresión que contiene las secuencias del promotor SV40 hacia arriba de un sitio de clonación múltiple y otras características como se describe para el pCAV/NOT en el ejemplo 2, y contiene también un gen de dihidrofolato reductasa como marcador seleccionable. El gen DHFR confiere una ventaja selectiva sobre otras células mamíferas DHFR^{-} que han tomado el vector, cuando son cultivadas en presencia de metotrexate (MTX). La digestión con Sma I produce extremos romos a los cuales se unen los extremos romos Not I del fragmento que contiene el TNF-R. La unión destruye los sitios BamHI y Bgl II. Células E. coli son transformadas con la mezcla de unión por procedimientos convencionales. Se recupera el plásmido de ADN de las células huésped y se confirma la construcción deseada por análisis de restricción. El vector resultante que contiene la inserción de TNF-R se denomina pCAV/DHFR/TNF-R.
Los siguientes fragmentos de ADN se aislaron para ser usados en la preparación de un vector que codifica dos polipéptidos TNF-R separados por un péptido linker.
(A)
Fragmento Asp718 (un enzima de restricción) a Esp I del vector pCAV/DHFR/TNF-R. Asp 718 corta el vector hacia arriba de la secuencia TNF-R insertada. EspI (disponible en U.S. Biochemicals) corta la secuencia de TNF-R en la posición mostrada en la figura 2A. El fragmento deseado tiene una longitud aproximada de 6.7 kilopares de bases (kpb) e incluye las secuencias del vector en el extremo 3' de una secuencia de TNF-R.
(B)
Fragmento Asp718 a PvuII del vector de expresión construido en el ejemplo 4 y denominado psol huTNF-R\Delta235/CAVNOT. Asp 718 corta el vector hacia arriba de la secuencia de TNF-R insertada. El fragmento deseado de 865 pb incluye una secuencia TNF-R que se extiende desde la secuencia señal 5' hasta el sitio Pvu II mostrado en el ejemplo 4.
(C)
Un oligonucleótido de doble hebra que tiene la secuencia (SEQ ID NOS: 16 y 17):
(ver original, pág. 41)
(D)
Fragmento Bgl a EspI del vector de expresión construido en el ejemplo 4 y denominado psol huTNF-R\Delta235/ CAVNOT. El fragmento deseado tiene una longitud aproximada de 304 pb. Bgl I corta en el codón para el aminoácido 5 (Val) del TNF-R; Esp I corta la secuencia del TNF-R en la posición mostrada en la figura 2A; el resto (extremo 3') de la secuencia que codifica el TNF-R soluble es proporcionado por el fragmento (A).
El oligonuclétido (C) es preparado por procedimientos convencionales para la síntesis química de oligonucleótidos. El oligonucleótido reconstruye el extremo 3' de la primera secuencia de TNF-R desde el sitio Pvu II hasta el último aminoácido del dominio extracelular (Asp en posición 235). El oligonucleótido también contiene una secuencia en marco que codifica el péptido linker Gly_{4}SerGly_{5}Ser. La secuencia de esta porción del oligonucleótido puede ser variada si se desea codificar otros péptidos linker. El olignonucleótido C también reconstruye el extremo 5' de la secuencia del segundo TNF-R desde un codón para leucina, el primer aminoácido de la proteína madura, hasta un codón parcial para valina (aminoácido 5) con el saliente 3', que regenerará el codón de Val cuando se una al saliente complementario en el extremo del fragmento D digerido por Bgl I.
Los fragmentos de ADN nombrados en A-D se unieron entre sí en las posiciones mostradas en la figura 3, para formar un vector denominado pCAV DHFR Di-TNF-R que codifica una proteína de fusión de la presente invención. Se transforman células E. coli con la mezcla de unión por procedimientos convencionales. El plásmido de ADN es recuperado de las células huésped y la construcción deseada es confirmada mediante análisis de restricción. El polipéptido TNF-R de arriba codificado por este vector de expresión contiene los aminoácidos -22 a 235 de SEQ ID NO: 2 (es decir, un TNF-R soluble, incluyendo la secuencia señal N-terminal y el dominio extracelular completo sin codón de terminación). El polipéptido TNF-R de abajo carece de la secuencia señal y contiene los aminoácidos 1-235 de SEQ ID NO: 2 con un codón de terminación posicionado inmediatamente después del aminoácido 235. El péptido linker de esta construcción particular es Gly_{4}SerGly_{5}Ser.
Se transfectan células mamíferas con el vector de expresión por procedimientos convencionales y se cultivan para producir la proteína de fusión deseada. Una línea celular mamífera adecuada es una línea de células de ovario de hámster chino DHFR^{-} denominada CHO-K1 y disponible en la American Type Culture Collection, Rockville, MD, bajo el número de acceso CCL61. Las células pueden ser transfectadas con el vector de expresión por precipitación estándar con fosfato de calcio, esencialmente como describen Graham y van der Eb, Virology 52:456 (1983). Las células transfectadas son cultivadas bajo condiciones convencionales apropiadas, y se confirma la presencia de la proteína de fusión deseada en el medio de cultivo mediante estudios tales como los descritos en el ejemplo 1 y en el ejemplo comparativo 1.
Otra línea celular mamífera apropiada es la línea celular COS-7. En un experimento, se transfectaron células COS-7 con el vector de expresión que codifica el dímero de TNF-R descrito arriba y se cultivaron para permitir la expresión para permitir la expresión del dímero. Se analizó la capacidad del sobrenadante no concentrado (conteniendo el dímero secretado) para inhibir la unión de TNF\alpha murino radioiodado a la célula U937 (una línea celular de tipo monocito humano que posee receptores endógenos para TNF). El ensayo de inhibición de unión fue realizado conforme a procedimientos convencionales, similares a los descritos en el ejemplo 2, apartado C. Los tubos de control negativo (para medir la unión no específica) contenían TNF\alpha no radiomarcado, células U937 y TNF\alpha radioiodado. Los tubos de control positivo (para medir la máxima unión no inhibida de TNF\alpha radioiodado a las células U937) contenían medio de unión, células U937 y TNF\alpha radioiodado. El sobrenadante que contenía el dímero inhibió la unión del TNF a las células U937 en más de un 90% de lo que se observó para el control positivo.
Ejemplo comparativo 5
Proteína de fusión comprendiendo un polipéptido IL-1R y dos polipéptidos TNF-R
Se construye como sigue un vector plásmido conteniendo ADN que codifica una proteína de fusión de la fórmula IL-1R-péptido linker-TNF-R-péptido-linker- TNF-R.
Se aisló ADNc que codifica un polipéptido IL-1R tipo I soluble y se amplificó usando procedimientos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocidos. Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos para ser usados como cebadores en la reacción PCR:
SEQ ID NO: 18 (ver original, pág. 42)
SEQ ID NO: 19 (ver original, pág. 43)
Estos oligonucleótidos, así como los discutidos más adelante se sintetizan por procedimientos convencionales, por ej., usando una máquina automatizada de síntesis de ADN, tal como las disponibles en Biosearch, Inc., San Rafael, California o en Applied Biosystems. El patrón empleado en la reacción PCR es un vector plásmido preparado mediante inserción de ADNc de IL-1R de tipo I humano en un vector denominado SF CAV. El vector SF CAV es un vector de expresión mamífero mostrado en la figura 5 (que representa el uso de SF CAV en la construcción de un vector adicional descrita más adelante). Se depositó el SF CAV en células E. coli en la American Type Culture Collection el 27 de Febrero de 1992, bajo los términos del tratado de Budapest y se le adjudicó el número de acceso 68922.
Las secuencias SV40, CMV, pA y VA y el gen de resistencia a la ampicilina en SF CAV son igual a lo descrito para pCAV/NOT en el ejemplo 2 anterior y también en el ejemplo 8 y en la figura 3 de la aplicación PCT WO 90/05183. Un sitio de clonación múltiple posicionado entre las secuencias de la guía tripartita (TPL) del adenovirus-2 y pA contiene sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción XhoI, KpnI, SmaI, NotI y BglI. La secuencia TPL difiere de la del pCAV/NOT en que la región que se supone que es perjudicial para la construcción de los vectores que codifican IL-1R ha sido borrada de la secuencia del SF CAV TPL. El impacto negativo sobre los vectores IL-1R puede ser posiblemente atribuible al promotor críptico en la secuencia no deseable, del cual se expresa proteína no deseada en E. coli. Un nivel bajo de expresión de IL-1R humano del promotor críptico puede ser tóxico para la bacteria.
SF CAV es digerido con SmaI, que reconoce un sitio de restricción único en el sitio de clonación múltiple y produce extremos romos. Se produce un fragmento de ADN que contiene ADNc de IL-1R tipo I por digestión con StyI/BglII, seguida de llenado de los salientes usando el fragmento Klenow de ADN polimerasa I para generar extremos romos. StyI corta en el nucleótido 49 y BglII corta en el nucleótido 1997 de SEQ ID NO: 5. El fragmento de ADNc de IL-1R es unido en el interior del fragmento de vector SF CAV digerido con SmaI, y se transforman células E. coli con la mezcla de la unión por procedimientos estándar. El vector resultante se recubre con células E. coli y se usa como patrón en la reacción PCR.
El cebador 5' (SEQ ID NO: 18) corresponde a la secuencia de 17 nucleótidos en el vector hacia arriba del ADNc de IL-1R insertado. El cebador 3' (SEQ ID NO: 19) incluye un segmento complementario a los nucleótidos 1060-1079 de la SEQ ID NO: 5, que codifica los aminoácidos 306 (codón parcial) a 312, cerca del C- terminal del dominio extracelular. El cebador 3' también contiene una secuencia que codifica el péptido linker Gly_{4}SerGly_{5}Ser.
Se lleva a cabo una reacción PCR usando cualquier procedimiento apropiado, tales como los descritos por Sarki y cols., Science 239:487 (1988); en Recombinant DNA Methodology, Wu y cols., eds., Academic Press Inc., San Diego (1989), pp. 189-196; y en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis y cols., eds., Academic Press, Inc (1990). Un ejemplo de procedimiento PCR adecuado es el siguiente. Todas las temperaturas están en grados centígrados. Se añaden los siguientes reagentes PCR a un tubo Eppendorf Microfuge de 0.5 ml: 10 \mul de tampón 10X PCR (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8.3 a 25ºC, 15 mM MgCl_{2}, y 1 mg/ml de gelatina) (Perkins-Elmer Cetus, Norwalk, CN), 8 \mul de una solución 2.5 mM conteniendo cada uno dNTP (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dGTP y 2 mM dTTP), 2.5 unidades (0.5 \mul de solución estándar de 5000 unidades/ml) de Taq ADN polimerasa (Perkins-Elmer Cetus), 1 ng de patrón de ADN y 100 picomoles de cada uno de los cebadores de oligonucleótidos y agua hasta un volumen final de 100 \mul. La mezcla final se cubre después con 100 \mul de aceite de parafina. La PCR se llevó a cabo usando un ciclador térmico de ADN (Ericomp, San Diego, CA). El patrón es desnaturalizado a 94º durante 5 minutos y se lleva a cabo la PCR durante 25 ciclos de amplificación usando un programa en etapas (desnaturalización a 94º, 1.5 minutos; alineamiento a 60º, 1 minuto; extensión a 72º, 1 minuto).
La electroforésis de una alícuota de la mezcla de reacción en 1% de agarosa SeaKern de fusión a baja temperatura (LMT) (FMC BioProducts, Rockland, ME) y la tinción con bromuro de etidio permite visualizar un fragmento simple de ADN del tamaño esperado como producto de reacción de la PCR. El fragmento de ADN amplificado por PCR comprende una secuencia vector corta, que incluye un sitio de restricción Asp718, hacia arriba de la secuencia que codifica los aminoácidos 1(Asp) a 312 (Thr) del IL-1R, seguida de un segmento de hebra simple que codifica el péptido linker.
Se lleva a cabo una segunda reacción PCR para aislar y amplificar un fragmento de ADNc que codifica un polipéptido TNF-R soluble. El molde fue el vector denominado psolhuTNF-R \Delta235/CAVNOT en el ejemplo 5, que contiene una inserción de ADNc que codifica los aminoácidos -22 a 235 de la SEQ ID NO: 1 del TNF-R. Los cebadores empleados en la reacción son:
SEQ ID NO: 20 (ver original, pág. 44)
SEQ ID NO: 21 (ver original, pág. 44)
El cebador 5' (SEQ ID NO: 20) comprende un péptido linker que codifica un segmento complementario al péptido linker que codifica la porción del cebador de la SEQ ID NO: 19. El segmento que codifica el linker es seguido de codones para los primeros seis aminoácidos del TNF-R maduro (Leu a Ala).
El cebador 3' (SEQ ID NO: 21) comprende los nucleótidos complementarios a los nucleótidos 461-478 de la SEQ ID NO: 1 del TNF-R que codifican los aminoácidos 103 (Tyr, codón parcial) a 109 (Gln, codón parcial). Este cebador también engloba un sitio de restricción EspI que está presente de forma natural en esta porción de la proteína TNF-R.
El procedimiento de la reacción PCR es como se ha descrito antes. El fragmento de ADN amplificado por esta segunda reacción PCR comprende el segmento antes descrito que codifica el linker seguido de una secuencia que codifica los aminoácidos 1 (Leu) a 109 (Gln, codón parcial) del TNF-R. Este fragmento de ADN es visualizado mediante electroforésis tras tinción del gel con bromuro de etidio, como se ha descrito arriba. Se lleva a cabo una tercera reacción PCR para aislar un fragmento amplificado de ADN de doble hebra que comprende las secuencias IL-1R y TNF-R separadas por una secuencia linker. Se combinan los siguientes reagentes en un tubo de 0.5 ml:
3 \muL (alrededor de 5-10 ng) del fragmento de ADN del péptido linker del IL-1R amplificado en la primera reacción PCR anterior - se toma directamente una alícuota de 3 \muL de la agarosa LMT con una micropipeta, usando luz UV para visualizar la banda deseada en el gel teñido con bromuro de etidio.
3 \muL (alrededor de 5-10 ng) del fragmento de ADN del péptido linker del TNF-R amplificado en la segunda reacción PCR anterior - se toma directamente una alícuota de 3 \muL de la región de la agarosa LMT que contiene la banda deseada.
10 \muL de tampón 10 X PCR (descrito antes)
100 pmoles del oligonucleótido de SEQ ID NO: 18 como cebador 5'
100 pmoles del oligonucleótido de SEQ ID NO: 21 como cebador 3'
4 \muL de una solución 2.5 mM conteniendo cada uno de los cuatro dNTPs
0.5 \muL de Taq ADN polimerasa (5 unidades/\muL)
agua hasta un volumen final de 100 \muL
Los ciclos de reacción PCR se llevan a cabo a las temperaturas y durante los periodos de tiempo especificados arriba. Después de la etapa inicial de desnaturalización, se alinean los segmentos complementarios de los dos fragmentos de ADN que codifican los péptidos linker. El producto final de la reacción es un fragmento de ADN amplificado de doble hebra con extremos romos de alrededor de 1370 pb de longitud, que comprende una secuencia de ADN de IL-1R hacia arriba de la secuencia que codifica un péptido linker, seguida de una secuencia de ADN de TNF-R.
Se hace reaccionar una alícuota de 25 \muL de la mezcla de esta tercera reacción PCR, sin purificar, con los enzimas de restricción Asp718 y EspI. Asp 718 corta hacia arriba de la secuencia del IL-1R, como se ha comentado antes. EspI corta en la secuencia del TNF-R, como se muestra en la figura 2A y se ha discutido antes. La endonucleasa de restricción Cell II es un isoesquizómero de EspI y puede sustituir a EspI. El fragmento deseado, en adelante denominado fragmento E, es purificado por procedimientos convencionales, tales como separación por electroforésis en gel, por ej., en un gel de agarosa Seaplaque de fusión a baja temperatura al 1%, y aislamiento de la banda que representa al fragmento deseado.
Se aislaron dos fragmentos adicionales de ADN denominados F y G y se unieron con el fragmento E para construir un vector de expresión con una segunda secuencia TNF-R unida (vía una secuencia de péptido linker) hacia abajo del fragmento de ADN de IL-1R-linker-TNF-R preparado antes. El vector resultante y las posiciones de los fragmentos E, F y G contenidos en el mismo se muestran en la figura 4.
El fragmento de ADN denominado F es preparado por digestión del vector mostrado en la figura 3 y construido en el ejemplo 11 con EspI. Se aísla un fragmento 3' conteniendo una porción 3' del TNF-R (que se extiende desde el sitio EspI mostrado en la figura 2A hasta el codón para el aminoácido 235) seguido de una secuencia que codifica un péptido linker Gly_4SerGly_5Ser, que es seguido de una segunda secuencia de TNF-R que se extiende desde el codón para el aminoácido 1 (Leu) hasta el sitio EspI en la secuencia del segundo TNF-R (hacia abajo) del vector de la figura 3. Este fragmento, de alrededor de 739 pares de bases de longitud, se denomina en adelante fragmento F.
El fragmento g que contiene las secuencias de los vectores (incluyendo DHFR) y una porción 3' de una secuencia de TNF-R es aislado de un vector ``splice-free'' como sigue. El vector pCAV/DHFR/TNF-R preparado en el ejemplo 11 contiene una secuencia que se cree que es perjudicial para la construcción de vectores que codifican IL-1R, posiblemente debido a un promotor críptico en esa secuencia del cual se expresa una proteína no deseada en E. coli. Se preparó un derivado de pCAV/DHFR/TNF-R reemplazando un fragmento NdeI/Asp 718 del vector ``splice-free'' SF CAV (ATCC 68922, descrito antes). La construcción está representada en la figura 5.
SF CAV es digerido con NdeI y Asp 718 (sitios únicos en este plásmido) y se aísla un fragmento de alrededor de 500 pb, representado como H en la figura 5. El fragmento H carece de la secuencia no deseada encontrada en el fragmento correspondiente de pCAV/DHFR/TNF-R.
El vector pCAV/DHFR/TNF-R preparado en el ejemplo 11 y mostrado en la figura 5 es digerido con Asp718, EspI, y NdeI. Se aísla un fragmento Asp718/EspI de alrededor de 495 pb (fragmento I). También se aísla un fragmento NdeI/EspI de alrededor de 4637 pb.
Los fragmentos de ADN H, I y J preparados arriba se unen para formar el vector ``splice-free'' SF CAV/DHFR/TNF-R mostrado en la figura 5. Se transforman células E. coli con la mezcla de unión mediante procedimientos convencionales. Se recupera ADN plásmido de las células huésped y se confirma la construcción deseada mediante análisis de restricción. Después SF CAV/DHFR/TNF-R es digerido con Asp718 y EspI. El fragmento llamado G en la figura 5 contiene secuencias de vectores (incluyendo DHFR) y el extremo 3' de una secuencia de TNF-R (desde el sitio EspI interno hasta el codón para el aminoácido 235 seguido de un codón de terminación) y es aislado por procedimientos convencionales.
Los fragmentos de ADN E, F y G preparados arriba se unen para formar el vector mostrado en la figura 4 (y denominado SF CAV/DHFR tri-R). Se transforman células E. coli con la mezcla de unión y se recupera el plásmido deseado como se ha descrito antes. La proteína de fusión codificada por este vector comprende (desde el N- hasta el C-terminal) los aminoácidos -20 a 312 del IL-1R tipo I (SEQ ID NO:5); un péptido linker Gly_{4}SerGly_{5}Ser; aminoácidos 1 a 235 del TNF-R (SEQ ID NO:1); un péptido linker Gly_{4}SerGly_{5}Ser; y un segundo polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 235 de la SEQ ID NO: 1.
Se transfectan células mamíferas con el vector de expresión por procedimientos convencionales y se cultivan para producir la proteína de fusión deseada. Una línea celular mamífera adecuada es un línea celular de ovario de hámster Chino DHFR-, denominada CHO-K1 y disponible de la American Type Culture Collection, Rockville, MD, bajo el número de acceso CCL61. Las células pueden ser transfectadas con el vector de expresión por precipitación estándar con fosfato de calcio, esencialmente como describen Graham y van der Eb, Virology 52:456 (1983). Las células transfectadas son cultivadas bajo condiciones adecuadas convencionales y se confirma la presencia de la proteína de fusión deseada en el medio de cultivo por ensayos tales como los descritos en el ejemplo 1 y en el ejemplo comparativo 1.
La secuenciación de ADN de un vector de expresión construido como se describe antes puso de manifiesto dos mutaciones puntuales en las secuencias que codifican la proteína de fusión, que podrían haber ocurrido durante la PCR. La ``T'' en posición 437 de la SEQ ID NO: 5 (IL-1R tipo II) se cambió por una ``C'' y la ``C'' en posición 687 de SEQ ID NO:1 (TNF-R) se cambió por una ``T''. Estas mutaciones son silentes, por lo que la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión IL-1R- péptido linker - TNF-R - péptido linker - TNF-R (en adelante llamada receptor trimérico) es como se ha descrito antes.
Se transfectaron células COS-7 con el vector de expresión y se cultivaron para permitir la expresión del receptor trimérico. Se analizó la habilidad del sobrenadante concentrado 5X (conteniendo el receptor trimérico secretado) para inhibir la unión de TNF\alpha murino radioiodado (0.5 nM) a células U937 (una línea celular de células tipo monocitos humanos que posee receptores endógenos para TNF). El ensayo de inhibición de unión se realizó conforme a procedimientos convencionales, similares a los descritos en el ejemplo 2, sección C. Los tubos de control negativos (para medir la unión no específica) contenían TNF\alpha no radiomarcado, células U937, y TNF\alpha radiomarcado. Los tubos de control positivos (para medir la unión máxima no inhibida de TNF\alpha a células U937) contenía medio de unión, células U937, y TNF\alpha radiomarcado. El sobrenadante conteniendo el receptor trimérico inhibió alrededor del 100% de la unión de TNF a células U937 que fue observada para el control positivo.
El sobrenadante concentrado 5X conteniendo el receptor trimérico también se ensayó con respecto a su habilidad para inhibir la unión de IL-1\alpha humana radioiodada (0.14 nM) a células EL4 6.1, que presentan receptores endógenos de IL-1. La línea celular EL4 6.1 se derivó de un línea celular de tioma murino, como describen MacDonald y cols. (J. Immunol. 135:3944, 1985). Los tubos de control negativos (para medir la unión inespecífica) contenían IL-1\alpha no radiomarcada, células EL4 6.1 e IL-1\alpha radiomarcada. Los tubos de control positivos (para medir la unión no inhibida de IL-1\alpha a células EL4 6.1) contenían medio de unión, células EL4 6.1 e IL-1\alpha radiomarcada. El sobrenadante conteniendo el receptor trimérico inhibió alrededor del 52% de la unión de IL a células EL4 6.1 que fue observada para el control positivo.
Ejemplo comparativo 6
Proteína de fusión que comprende un polipéptido IL-1R y un polipéptido TNF-R
Los fragmentos E y G preparados en el ejemplo comparativo 5 pueden ser unidos entre sí para formar un vector que contiene la secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión de la fórmula IL-1R-péptido linker-TNF-R, en la cual el péptido linker es Gly_{4}SerGly_{5}Ser. IL-1R y TNF-R son polipéptidos solubles como se ha descrito en el ejemplo 5. La proteína de fusión del ejemplo comparativo 5 es preferible debido a la mejor unión al TNF que se alcanza cuando se emplean dos polipéptidos TNF-R en vez de uno.
Se transfectaron células COS-7 con el vector de expresión y se cultivaron para permitir la expresión de la proteína de fusión IL-1R-péptido linker-TNF-R. Se analizó la habilidad del sobrenadante concentrado 5X (conteniendo el receptor trimérico secretado) para inhibir la unión de IL-1\alpha humana radioiodada (0.14 nM) a células EL4 6.1 (una línea celular derivada de tioma murino que posee receptores para IL-1 como se ha descrito en el ejemplo comparativo 5). El procedimiento del ensayo de inhibición de unión fue similar al descrito en el ejemplo comparativo 1, sección C, y los controles positivos y negativos fueron como se describe en el ejemplo 5. El sobrenadante conteniendo la proteína de fusión inhibió alrededor del 53% de la unión de IL-1 a células EL4 6.1 que fue observada para el control positivo.
Proteínas de fusión adicionales
El experto apreciará que las técnicas aquí descritas pueden ser empleadas para producir proteínas de fusión adicionales de la presente invención, más allá de las realizaciones ilustrativas presentadas en los ejemplos precedentes. El péptido linker puede ser variado mediante la síntesis de un oligonucleótido que codifique una secuencia de péptido linker diferente, por ejemplo. Otros fragmentos alternativos de las proteínas TNF-R pueden ser aislados empleando cebadores de PCR para alinear con respecto a una porción diferente de las secuencias de ADN descritas definiendo así los terminales del fragmento deseado. Los oligonucleótidos usados para regenerar un terminal de un fragmento de ADN (por ej. el oligonucleótido empleado en el ejemplo 5) pueden ser variados para posicionar el codón de terminación después de cualquier aminoácido deseado. Además, la elección del vector de expresión dependerá de las células huésped previstas.
Breve descripción del listado de secuencias
SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 muestran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificados de un ADNc de TNF-R humano. La proteína madura está definida por los aminoácidos 1-439. El péptido señal está definido por los aminoácidos -22 a -1. La región de transmembrana está definida por los aminoácidos 236-265.
SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 muestran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificados de la región codificadora de un ADNc de TNF-R humano. Este TNF-R es una proteína diferente del TNF-R de las SEQ ID NO: 1 y 2. La proteína madura está definida por los aminoácidos 1-415. El péptido señal está definido por los aminoácidos -40 a -1. La región de transmembrana está definida por los aminoácidos 172-192.
SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 muestran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificados de un ADNc de IL-1R tipo I humano. La proteína madura está definida por los aminoácidos 1-549. El péptido señal está definido por los aminoácidos -22 a -1. La región de transmembrana está definida por los aminoácidos 317-336.
SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 muestran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificados de un ADNc de IL-1R tipo II humano. La proteína madura está definida por los aminoácidos 1-385. El péptido señal está definido por los aminoácidos -13 a -1. La región de transmembrana está definida por los aminoácidos 331-356.
SEQ ID NO: 9-15 y 18-21 representan oligonucleótidos empleados para construir varios plásmidos recombinantes, como se describe en la sección de ejemplos.
SEQ ID NOS: 16 y 17 representa un oligonucleótido y la secuencia de aminoácidos codificada por él, que incluye una secuencia de péptido linker Gly_{4}SerGly_{5}Ser. Este oligonucleótido se emplea en la construcción del vector descrito en el ejemplo 11.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE: Smith, Craig A.
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteínas de Fusión comprendiendo receptor del factor de necrosis tumoral
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(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 21
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(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
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(A)
DESTINATARIO: Immunex Corporation
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(B)
CALLE: 51 University Street
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(C)
CIUDAD: Seattle
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(D)
ESTADO: Washington
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(E)
PAÍS: EE.UU.
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(F)
CÓDIGO POSTAL: 98101
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(v)
SOPORTE ELECTRÓNICO:
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(A)
TIPO DE SOPORTE: Disquette
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(B)
ORDENADOR: IBM PC Compatible
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOSJMS-DOS
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(D)
SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versión #1.25
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(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
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(A)
NUMERO DE SOLICITUD:
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
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(C)
CLASIFICACIÓN:
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(vii)
DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
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(A)
NUMERO DE SOLICITUD: US 479,661
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-FEB-1990
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(vii)
DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
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(A)
NUMERO DE SOLICITUD: US 523,635
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 10-MAY-1990
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(vii)
DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NUMERO DE SOLICITUD: US 701,415
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 16-JUN-1991
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(vii)
DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NUMERO DE SOLICITUD: US 821,716
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 14-JAN-1992
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(viii)
INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:
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(A)
NOMBRE: Seese, Kathryn A.
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(B)
NUMERO DE REGISTRO: 32,172
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA: 2502
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(ix)
INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (206) 587-0430
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(B)
TELEFAX: (206) 587-0606
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1641 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: Simple
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(D)
TOPOLOGÍA: Linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Horno sapiens
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO DE CÉLULA: Fibroblasto
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
LÍNEA CELULAR: WI-26 VA4
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
BIBLIOTECA: WI-26 VA4
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 1
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 88..1473
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_peptide
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 154..1470
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sig_peptide
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 88..153
\vskip0.666000\baselineskip
(x)
INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
AUTORES: Smith, Craig A. Davis, Terri Anderson, Dirk Solam, Lisabeth Beckman, M.P. Jerzy, Rita Dower, Steven K Cosman, David Goodwin, Rayomnd G.
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TITULO: A Receptor for Tumor Necrosis Factor Defines an Unusual Family of Cellular and Viral Proteins
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
REVISTA: Science
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
VOLUMEN: 248
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
PAGINAS: 1019-1023
\vskip0.333000\baselineskip
(G)
FECHA: 25 de Mayo de 1990
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1
1
2
3 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 461 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
4
5 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1368 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: Simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Horno sapiens
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: lambda-gt10-7ctnfbp
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..1366
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_peptide
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 121..1363
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sig_peptide
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..120
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3
6
7
8 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 455 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
9
10 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3011 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: Simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Horno sapiens
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLON: HUIL-1 R
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 84..1793
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_peptide
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 144..1790
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sig_peptide
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 84..143
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
11
12
13
14 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 569 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
15
16
17 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1357 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Acido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: Simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Horno sapiens
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO CELULAR: Célula B humana linfoblastoide
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
LÍNEA CELULAR: CB23
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
CLON: pHuIL-1 RI175
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 154..1350
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_peptide
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 193.1347
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sig_peptide
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 154..192
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
18
19 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 398 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
20
21 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: Simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CTGAAGGGAG CACTGGCGAC TAAGGATCCA 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: Simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GATCTGTAAC GTGGTGGCCA TCCCTGGGAA TGCAAGCATG GATGC 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: Simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
211 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: Simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GATCTGTTGA GC 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: Simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CTGAAACATC AGACGTGGTG TGCAAGCCCT CTTAAA 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: Simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GCGTCGACCT AGTGACGCTC ATACAAATC 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: Simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GCGCGGCCGC TCAGGAGGAG GTTCCTTGA CTG 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PAR SEQ ID NO: 16:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: Simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3..65
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
22 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
23 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: Simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
ACCGAGGGAC CTGAGCG 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 51 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: Simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TGAGCCGCCG CCACCGCCGG ATCCACCGCC ACCAGTGACT GGATATATTA ACT 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 51 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: Simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GGTGGCGGTG GATCCGGCGG TGGCGGCGGC TCATTGCCCG CCCAGGTGGC A 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: Acido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: Simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GCTTGCTCAG CGCGCAGT 
\hfill

Claims (8)

1. Una proteína de fusión con la fórmula:
TNF-R - linker - TNF-R
En la cual el linker es un péptido linker, y cada uno de los TNF-R es un TNF-R soluble que es capaz de unirse al TNF-.
2. Una proteína de fusión conforme a la reivindicación 1, en la cual el péptido linker comprende los aminoácidos 5 a 100 seleccionados del grupo consistente en glicina, asparagina, serina, treonina y alanina.
3. Una proteína de fusión conforme a la reivindicación 1 o a la reivindicación 2, en la cual cada TNF-R soluble comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en los aminoácidos 1-x y -22-x de SEQ ID NO:1, en la cual x representa un número entre 163 y 235.
4. Una proteína de fusión conforme a la reivindicación 1, en la cual cada TNF-R es codificado por un ADN codificador de TNF-R seleccionado del grupo consistente en ADN comprendiendo la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, y ADN capaz de hibridarse bajo condiciones moderadamente restrictivas a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, en la cual dicho ADN codificador de TNF-R codifica un polipéptido TNF-R biológicamente activo.
5. Una secuencia aislada de ADN que codifica una proteína de fusión conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN conforme a la reivindicación 5.
7. Un proceso para producir una proteína de fusión de la fórmula:
TNF-R - linker - TNF-R
Comprendiendo el cultivo de una célula huésped transformada con un vector de expresión conforme a la reivindicación 6 bajo condiciones que favorecen la expresión de dicha proteína de fusión y la recuperación de dicha proteína de fusión.
8. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un diluyente, excipiente o transportador apropiado.
ES93909201T 1992-03-30 1993-03-26 Proteinas de fusion que comprende receptores para dos factores de necrosis tumoral. Expired - Lifetime ES2197149T3 (es)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
US86071092A 1992-03-30 1992-03-30
US860710 1992-03-30

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