ES2081618T5

ES2081618T5 - Metodo para diagnosticar anomalias de la coagulacion de la sangre.

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Publication number: ES2081618T5
Application number: ES92913443T
Authority: ES
Original assignee: TAC Thrombosis and Coagulation AB
Current assignee: TAC Thrombosis and Coagulation AB
Priority date: 1991-11-13
Filing date: 1992-05-13
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2012-05-13
Also published as: GR3018646T3; DE69207607T2; WO1993010261A1; JPH07501217A; CA2119761C; DK0608235T3; DE608235T1; ATE132909T1; CA2119761A1; EP0608235A1; HK31697A; DE69207607T3; JP2562000B2; DE69207607D1; ES2081618T3; AU666484B2; EP0608235B2; DK0608235T4; AU2198092A; EP0608235B1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO IN VITRO QUE ES PARTICULARMENTE UTIL PARA EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES TROMBOEMBOLICAS, TAL COMO LA TROMBOFILIA HEREDITARIA O NO HEREDITARIA, Y PARA DETERMINAR EL RIESGO POR TROMBOSIS A PROPOSITO DE EMBARAZO, TOMA DE PILDORAS ANTICONCEPTIVAS, CIRUGIA, ETC. EL METODO SE CARACTERIZA EN QUE EL SISTEMA DE COAGULACION EN UNA MUESTRA SE ACTIVA TOTAL O PARCIALMENTE DE UN MODO CONOCIDO DE POR SI E INCUBADO CON PROTEINA C ACTIVADA, DESPUES DE LO CUAL SE DETERMINA EL PROCENTAJE DE REACCION DE CONVERSION DE SUSTRATO COMO COAGULACION O CONVERSION DE UN SUSTRATO CROMOGENICO. EL PORCENTAJE DE CONVERSION OBTENIDO SE COMPARA CON LOS VALORES OBTENIDOS PARA MUESTRAS DE PLASMA NORMAL. SI EL PORCENTAJE SE AUMENTA, ESO INDICA QUE EL INDIVIDUO DEL CUAL SE DERIVA LA MUESTRA PUEDE SUFRIR UNA ENFERMEDAD TROMBOEMBOLICA.

Description

Método para diagnosticar anomalías de la coagulación de la sangre.

La presente invención se refiere a un nuevo método apropiado para diagnóstico de enfermedades tromboembólicas, p. ej. la trombofilia hereditaria. La invención se puede utilizar también para determinar el riesgo de trombosis en mujeres embarazadas, personas que se someten a cirugía, personas que toman fármacos anticonceptivos, etc.

La coagulación de la sangre comprende un sistema complejo de proenzimas interrelacionadas, enzimas y cofactores que realizan su función en las superficies de las plaquetas y células endoteliales activadas. Cuando el sistema se activa, el resultado final es la formación de un coágulo de sangre que contiene fibrina insoluble. La iniciación y terminación de la formación de fibrina se regula cuidadosamente en la homeostasis normal. In vitro, las plaquetas y las superficies de las células endoteliales se reemplazan usualmente con fosfolípidos adecuados. Para la invención, la parte importante del sistema de coagulación es:

1

La parte importante para la invención se refiere a la Proteína C (=PC) y los efectos producidos por la acción de la Proteína C activada (=APC) sobre el sistema de coagulación. La proteína C es un zimógeno que puede ser activado in vitro por la trombina (= Factor II_{a}) sola, la combinación trombina-trombomodulina, ciertos venenos de serpiente, tales como el de Agkistrodon contortrix contortrix, o el Factor X_{a} purificado. La activación de la proteína C endógena de una muestra o la adición de Proteína C activada exógenamente a una muestra de plasma neutralizará los Factores V_{a} y VIII_{a} (degradación) y conducirá a tiempos prolongados para la coagulación de la sangre en muestras de plasma de individuos sanos. Los factores V y VIII son activados por pequeñas cantidades de trombina o Factor X_{a}. La Proteína S es un cofactor para la Proteína C.

Se encuentran deficiencias heterocigóticas hereditarias en Proteína C, Proteína S y Antitrombina III (ATIII, un factor de coagulación que se opone a la coagulación) en aproximadamente 10-15 o de los pacientes con enfermedad tromboembólica diagnosticada antes de la edad de 40 años. Las deficiencias homocigóticas de Proteína C y Proteína S constituyen una amenaza para la vida y los individuos afectados desarrollan trombosis microvascular generalizada y púrpura fulminante en el período neonatal.

Las deficiencias en Proteínas C y S y en ATIII se miden por métodos tanto funcionales como inmunológicos. Una manera de determinar la actividad funcional de Proteína C implica las etapas: mezcla de la muestra de plasma a ensayar con un exceso de plasma humano deficiente en Proteína C y adición de un activador de Proteína C y observación de la conversión del sustrato apropiado. Se han realizado ensayos altamente específicos mediante el empleo de sustratos específicos para Proteína C. Alternativamente, se han utilizado también sustratos para enzimas, p. ej. trombina y Factor X_{a}, actividades que se ven influenciadas por la actividad de la Proteína C activada (es decir, actividades enzimáticas que son generadas o moduladas por APC). En ciertos casos, los ensayos de Proteína C han implicado el aislamiento del zimógeno y una activación y adición subsiguientes del sustrato a la forma activada. Se ha sugerido también llevar a cabo la medida de la actividad de Proteína C en muestras de plasma directamente en la muestra sin adición de plasma deficiente en Proteína C. Sin embargo, tales métodos no discriminarán una anormalidad relacionada con la Proteína C como tal procedente de un trastorno relacionado con factores que interfieren con los efectos causados por la Proteína C (documento WO-A-91/02812).

Se ha reivindicado que la adición de Proteína C activada a una muestra de plasma de un paciente y el estudio del efecto producido ha descubierto una molécula de Factor VIII_{a} defectuosa que no es degradada por la Proteína C activada (B. Dahlback y M. Carlsson, Thromb. Haemost. 65, Resumen 39, 658 (1991)). Sin embargo, los datos suministrados en la presente memoria descriptiva indican sorprendentemente que el paciente en cuestión no podía llevar consigo un Factor VIII/VIII_{a} defectuoso.

Con objeto de determinar la actividad funcional de Proteína S en una muestra de plasma, los métodos más comunes implican mezclar la muestra de plasma con Proteína C activada, un exceso de plasma deficiente en Proteína S y reactivos adicionales necesarios para producir la coagulación (Waart et al., Thromb. Res. 48, 427-37 (1987); Suzuki et al., Thromb. Res. 49, 251-51 (1988); Bertina et al., Thromb. Haemost. 53, 268-72 (1985); y Comp et al., J. Clin. Invest. 74, 2084-88 (1984)). Se ha propuesto también medir la Proteína S por incubación de la muestra de plasma con Factor IX_{a} y Proteína C activada y determinación del tiempo de coagulación o la conversión de un sustrato de trombina cromógeno (KabiVitrum AB (S. Rosen), documento WP-A-91.01382).

El autor de la presente invención ha comprobado que existe un trastorno tromboembólico no reconocido hasta ahora que pueden diagnosticarse por la adición de Proteína C activada a una muestra de paciente que contiene factores de coagulación y medida de una actividad enzimática que es influenciada por la APC añadida. Los resultados experimentales presentados ahora indican que los trastornos en cuestión son afines a uno o más factor(es) de coagulación desconocidos hasta ahora o interacciones desconocidas de factores conocidos. El factor desconocido no es Factor V_{a} o VIII_{a}, que son resistentes a la degradación por APC, o un inhibidor del tipo de las inmunoglobulinas para APC. Los trastornos no están relacionados tampoco con la deficiencia en Proteína S. Por razones de simplificación, se hará referencia al o a los factor(es)/interacción(es) desconocido (s) como un factor desconocido en este texto.

Las muestras ensayadas son muestras de plasma. La invención se ilustrará con relación a muestras de plasma.

De acuerdo con ello, la presente invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar en un ser humano enfermedades tromboembólicas causadas por, o para determinar el riesgo para un ser humano de adquirir la manifestación de, un trastorno de la coagulación de la sangre designado resistencia a APC y reconocido por una respuesta anticoagulante anormalmente baja a la Proteína C exógena activada (abreviada APC) incluso en presencia de niveles normales de Proteína S funcional, Factores V_{a} y VIII_{a}, que son degradados normalmente por APC, y ausencia de anticoagulantes lupus, comprendiendo dicho método determinar para una muestra de plasma que comprende factores de coagulación y derivada de un ser humano, la actividad anticoagulante de APC exógena por medida de la velocidad de conversión del sustrato obtenida para una enzima de la coagulación de la sangre, cuya actividad es influenciada por APC, por las etapas siguientes: (i) incubar dicha muestra de plasma con

(1) APC exógena, o Proteína C exógena junto con reactivos exógenos corrientes para transformar la Proteína C exógena en APC, donde las concentraciones utilizadas en el medio de ensayo final son 25 ng/ml-10 \mug/ml para APC humana, 10 ng/ml-50 \mug/ml para APC no humana, y 5 ng/ml-5 \mug/ml para APC de bovino utilizadas en combinación con 100 ng/ml-20 \mug/ml de proteína S de bovino;

(2) un reactivo (I) exógeno, que activa al menos parcialmente el sistema de coagulación de la sangre de dicha muestra y se selecciona de una manera conocida per se para causar la activación de un factor de coagulación utilizado para la medición en la etapa (ii);

(3) componentes, tales como fosfolípido(s) y sal de Ca^{++}, que son necesarios para la reacción eficaz de los factores de coagulación activados introducidos por la etapa (i) (2); y, si se desea,

(4) un sustrato exógeno para una enzima, siendo influenciada la actividad de dicha enzima por APC;

(ii) medir directamente dicha velocidad de conversión del sustrato obtenida en (i), y

(iii) comparar la velocidad de conversión medida en la etapa (ii) con un valor estándar obtenido a partir de muestras procedentes de individuos normales, muestras que han sido sometidas a las etapas (i) y (ii) esencialmente en las mismas condiciones que la muestra de plasma procedente de dicho ser humano; en cuyo método, una velocidad de conversión del sustrato obtenido para una muestra de plasma en la etapa (ii), que es mayor que el valor estándar indica que dicho ser humano padece o corre el riesgo de adquirir la manifestación de dicho trastorno.

En el caso de que la velocidad de conversión del sustrato no sea normal comparada con el estándar, el individuo del que procede la muestra se clasifica como individuo que padece el trastorno o que corre el riesgo de adquirir la manifestación del trastorno. Una velocidad de conversión incrementada de la muestra indica una enfermedad tromboembólica o un riesgo de dicha enfermedad (en el caso de que el sustrato sea fibrinógeno, una velocidad de conversión incrementada significa un tiempo de coagulación acortado). El significado de una velocidad de conversión disminuida no se conoce en el momento actual (con fibrinógeno como sustrato, una velocidad de conversión disminuida significa un tiempo de coagulación prolongado). Probablemente, el mismo no esté relacionado con ninguna enfermedad.

El intervalo de la velocidad de conversión normal puede ser muy amplio. Por consiguiente, podría, como complemento, ser valioso para realizar las etapas (i)-(ii) sobre una muestra de plasma procedente del individuo con exclusión de la incubación de acuerdo con (i) (1) y comparar el resultado obtenido con el que se obtiene de acuerdo con la invención.

La incubación de acuerdo con (i) (2) sirve para introducir un factor de coagulación activado que puede utilizarse para la medida en la etapa (ii). La expresión "parcialmente" significa que la adición del reactivo (I) conduce a la presencia de al menos el Factor IX_{a}. El reactivo (I) puede ser un cierto factor de coagulación o un reactivo que activa el sistema por la vía intrínseca o extrínseca. De acuerdo con ello, el reactivo (I) puede ser Factor IX_{a} o Factor XI_{a} (vía intrínseca), Factor XII_{a} (vía intrínseca), calicreína (vía intrínseca), un activador del contacto (vía intrínseca) tal como caolín, Celite o ácido elágico (vía intrínseca), un reactivo de Tiempo Parcial de Tromboplastina Activada, APTT (del inglés Activated Partial Thromboplastine Time; es decir un reactivo que contiene un fosfolípido y un activador del contacto (vía intrínseca)), tromboplastina tisular (reactivo PT, PT = Tiempo de Protrombina, (vía extrínseca)). En los casos en que es aceptable una especificidad reducida, el reactivo (I) puede ser también Factor X_{a}.

La Proteína C (i) (1) pueden ser de orígenes diversos. En el caso de que la Proteína C y la muestra sean procedentes de especies diferentes, es altamente recomendable incluir Proteína S (cofactor para la Proteína C activada) en la mezcla de incubación. La Proteína C y la Proteína S deben ser procedentes de la misma especie, por ejemplo la Proteína C de bovino requiere Proteína S de bovino. La Proteína C se activa preferiblemente antes de ser añadida, aunque la activación puede realizarse también después que ha sido añadida a la muestra. La activación debe tener lugar en condiciones estandarizadas y definidas. Agentes de activación normales son los indicados en la página 2. También se pueden utilizar formas biológicamente funcionales de las Proteínas C y S producidas por medios recombinantes.

Los componentes utilizados de acuerdo con la etapa (i) (3) dependen del modo empleado y pueden requerir la inclusión de inhibidores de la proteasa plasmática para enzimas distintas de la enzima observada o de un inhibidor de la polimerización de la fibrina. Ca^{2+} puede encontrarse en la forma de una sal soluble en plasma que proporciona el ion Ca^{2+} en forma libre no complejada, es decir que deben evitarse los quelantes de Ca^{2+} potentes. En el medio de ensayo final, la concentración de Ca^{2+} puede seleccionarse dentro de 0,5-50 mM, preferiblemente dentro de 5-15 mM, tal como 6-7 mM. Una concentración demasiado alta puede inhibir el sistema de coagulación.

El sustrato de acuerdo con (i) (4) es normalmente un sustrato sintético para una enzima cuya actividad es influenciada por la Proteína C activada, p. ej. trombina (= Factor Ii_{a}) y Factor X_{a}. Los sustratos sintéticos adecuados son solubles en agua y tienen preferiblemente estructura de oligopéptidos con tres, cuatro o cinco restos de aminoácidos y un grupo terminal amino que está protegido contra el ataque por las amino-peptidasas. La protección se realiza sea por medio de un grupo de protección o por tener un D-aminoácido en el extremo amino. Con objeto de dar una respuesta detectable, el extremo carboxilo de un sustrato sintético se amida con un grupo que puede liberarse específicamente y detectarse por la acción de la proteasa de la coagulación de la sangre pertinente. El grupo a liberar se selecciona entre grupos cromógenos, fluorógenos o quimioluminógenos y otros grupos analíticamente detectables. Véase adicionalmente H.C. Hemker, "Handbook of synthetic substrates for the coagulation and fibrinolytic system", Martinus Nijhoff Publishers, 1983, y J. Fareed et al., "Synthetic peptide substrates in hemostatic testing", en la publicación CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences, Vol. 19, edición 2, 71-134 (1983).

El orden de adición y la incubación varían con el modo de la invención. Por ejemplo, en el caso de que el reactivo (I) sea un reactivo APTT (i) (2) y la conversión del sustrato a observar sea de fibrinógeno en fibrina, se añade el reactivo (I) a la muestra y se deja que el Factor XI se active al máximo a Factor XI_{a}. Se añade luego Ca^{2+} (i) (3) y se mide el tiempo de coagulación. La Proteína C activada de acuerdo con la etapa (i:b) se introduce sea simultáneamente a, antes de o después de la activación a Factor XI_{a}. Se lleva a cabo análogamente un ensayo de PT con adición de tromboplastina tisular (en lugar del reactivo APTT) a la muestra en una cantidad suficiente para la activación de Factor X a Factor X_{a} o Factor IX a Factor IX_{a}. Después de ello, se añade Proteína C activada (i) (1), y por último se mide el tiempo de coagulación como en cualquier ensayo APTT. En caso de que se utilice un sustrato sintético, el mismo se puede añadir en cualquier etapa antes de o al comienzo de la reacción que se observa. Con objeto de realizar la reacción que se observa con especificidad alta, los inhibidores mencionados anteriormente se pueden introducir en cualquier momento adecuado en el medio de reacción. Por ejemplo, puede ser apropiado añadir un inhibidor de trombina junto con un sustrato para Factor X_{a}, cuando se mide la actividad del Factor X_{a}. El mismo inhibidor añadido antes de la adición del sustrato puede, sin embargo, afectar desfavorablemente a la formación del Factor X_{a}.

Con objeto de conseguir un resultado específico con respecto al factor desconocido mencionado anteriormente, podría intentarse mantener el contenido de muestra de plasma del paciente del medio de ensayo final tan alto como sea posible. De acuerdo con ello, el contenido de muestra de plasma del paciente en ensayos que tengan una especificidad satisfactoria debe ser >10%, en particular >20% o >35% (volumen/volumen).

Puede ser práctico vender y utilizar los reactivos de acuerdo con (i) (1-4) en combinaciones predosificadas que pueden haberse liofilizado por separado o como mezclas que contengan al menos dos de los componentes dados en (i) (1-4), preferiblemente en las dosis utilizadas para el ensayo. Puede ser también práctico haber realizado la liofilización en el vial a utilizar en el ensayo. Combinaciones adecuadas son (los intervalos de concentración se refieren a valores durante el ensayo, dándose los intervalos preferidos entre paréntesis).

A. Métodos de coagulación basados en APTT y métodos de coagulación dependientes APTT para los factores V y VIII

	1. APC humana	25 ng/ml-10 \mug/ml
	2. Especie de APC (no humana)	10 ng/ml-50 \mug/ml
	3. APC de bovino/Proteína S de bovino,	(10 ng/ml-50 \mug/ml)
	procedente de otra especie no humana	APC: 5 ng/ml-5 \mu/ml
		Proteína S:
		100 ng/ml-20 \mug/ml
		(10 ng/ml-20 \mug/ml)

Todos los reactivos indicados arriba en 1-3 y destinados a ser utilizados en la invención pueden liofilizarse en ausencia o presencia de Ca^{2+}. Si está presente, la cantidad de Ca^{2+} debería dar una concentración de Ca^{2+} de 0,5-30 milimoles/1 en el medio de ensayo final. El fosfolípido se puede incluir en las preparaciones liofilizadas.

B. Métodos de coagulación modificados por APTT en los cuales se ha excluido la activación del factor de contacto

	Factor IX_{a}	0,05 ng/ml-2 \mug/ml
	Factor XI_{a}	0,05 ng/ml-2 \mug/ml
	Factor XII_{a}	0.05 ng/ml-2 \mug/ml
	Calicreína	0.05 ng/ml-2 \mug/ml

No existe limitación alguna en relación con las especies. Se puede utilizar también FIX_{a} junto con cualquiera de las combinaciones A 1-3 con inclusión de la presencia o ausencia de Ca^{2+} y fosfolípido.

C.Métodos cromógenos APTT

Combinaciones de acuerdo con A 1-3 con inclusión de inhibidor de la polimerización de la fibrina (concentración >/= K_{i}, K_{i} = constante de inhibición) y sustrato cromógeno (concentración >/= 0,1K_{m}, K_{m} = constante de Michaelis-Mentens). Alternativamente, el sustrato cromógeno se liofiliza por separado o en presencia de Ca^{2+} que está combinado opcionalmente a su vez con un inhibidos de la polimerización de la fibrina. Como otra alternativa, el sustrato se liofiliza junto con un inhibidor de la polimerización de la fibrina pero en ausencia de Ca^{2+}. Los constituyentes deben proporcionar tales condiciones que no tenga lugar durante su reconstitución una hidrólisis perturbadora del sustrato.

D. Métodos cromógenos modificados por APTT en los cuales se ha excluido la activación del factor de contacto

Combinaciones de reactivos como se ha indicado en B y C.

E. Método de coagulación de PT que utiliza tromboplastina tisular

Reactivos de acuerdo con A 1-3 combinados opcionalmente con Ca^{2+} y/o tromboplastina tisular.

F. Método de coagulación modificado para el defecto de factor V

Factor X_{a}

0,02 ng/ml-0,5 \mug/ml

El Factor X_{a} no está limitado en cuanto a especies. El reactivo puede contener combinaciones de acuerdo con A 1-3 opcionalmente junto con Ca^{2+} y/o fosfolípido.

G. Método cromógeno PT

Combinaciones de acuerdo con C y E anteriores pero con tromboplastina en lugar de fosfolípido.

H. Método cromógeno del factor VIII

Reactivos de acuerdo con A 1-3 empleados en un ensayo estándar cromógeno de Factor VIII. Los reactivos pueden haberse liofilizado junto con cualquiera de Factor IX_{a} \pm Ca^{2+} \pm fosfolípido o Factor X \pm Ca^{2+} \pm fosfolípido, con concentración de Factor X de 0,1 pg/ml-50 pg/ml. El reactivo puede comprender también la inclusión de pequeñas cantidades de trombina y, cuando se incluye Factor X, también Factor IX_{a}. Adicionalmente, puede incluirse un sustrato cromógeno para Factor X_{a} en el reactivo.

I. Método cromógeno del factor V

Reactivos de acuerdo con C y F con o sin inclusión de protrombina (0,02 ng/ml-50 \mug/ml). Se pueden incluir reactivos APTT en combinaciones A-D, con tal que los mismos no se sometan a liofilización juntamente con Ca^{2+}. Las enzimas activas y sus sustratos pueden liofilizarse conjuntamente como se ha descrito recientemente (documento EP-A-318.571).

La invención tiene por objeto en primer lugar un método con objeto de encontrar individuos que necesiten diagnóstico adicional, pero comprende también ensayos de factores específicos de acuerdo con los párrafos F, H e I anteriores. La selección apropiada del reactivo (I) y la del sustrato a observar (i) (4) afinan la posibilidad de encontrar en qué casos se encuentra un trastorno diagnosticado en el sistema de coagulación. En principio, el método de la invención detectará trastornos relacionados con interacciones defectuosas entre la Proteína C activada y el Factor V_{a}, Factor VIII_{a}. El método detectará también la presencia de inhibidores de la Proteína C activada, y anormalidades en interacciones no reconocidas hasta ahora y factores influenciados por la activación de la Proteína C o la actividad de la Proteína C activada.

La invención se ilustrará a continuación por medio del descubrimiento del inventor de un paciente que padece un nuevo trastorno en el sistema de coagulación de la sangre.

Parte experimental Informe del caso

El individuo objeto del estudio es un varón nacido en 1942. En 1961, presentó el primer episodio de trombosis venosa profunda en una de sus piernas. Después de esto, se encontró sano y sin presentar trombosis alguna durante casi 20 años. Entre 1980 y 1987 presentó episodios de trombosis múltiples, que aparecían al menos una vez al año. Los sucesos trombóticos se trataron con antagonistas de la vitamina K durante hasta tres meses. Se comprobó positivamente un trombo con flebografía al menos en dos ocasiones. El individuo objeto del estudio ha desarrollado un síndrome post-trombótico en sus piernas. El mismo no sufre ningún otro trastorno. En 1987, dejó de fumar y al mismo tiempo comenzó a tomar diariamente aspirina. Durante 1987-1991, no ha sufrido ningún episodio trombo-embólico. Tanto los miembros varones como las hembras de la familia del paciente tienen historias similares con episodios múltiples de trombosis venosa profunda. Un hermano suyo 10 años mayor había presentado trombosis venosa profunda en múltiples ocasiones, la mayoría de las cuales ocurrieron entre las edades de 45 y 50 años. El individuo objeto del estudio informa también que un tío suyo de la rama materna ha tenido una historia clínica con episodios múltiples de trombosis. La madre del paciente nació en 1905, y ha presentado episodios en los cuales se ha sospechado clínicamente la existencia de trombosis venosa profunda. Dos hermanos más y una hermana han sufrido incidentes en los que se ha sospechado trombosis.

Métodos de coagulación e inmunológicos conocidos utilizados como complemento para el método de diagnosis de la invención.

El tiempo parcial de tromboplastina activada (APTT, Organon Technica), Owren's P&P, el tiempo de trombina y el tiempo de reptilasa se determinaron con métodos estándar. La antitrombina III se midió con un ensayo amidolítico (Coatestº ATIII, Kabi Diagnostica, Mólndal, Suecia). Se determinaron los niveles de antígeno de Proteína S y Proteína C total y libre con métodos inmunoquímicos descritos previamente (Malm J. et al., Br. J. Haemat. 68, 437-443 (1988). La actividad de la función de Proteína C se analizó con un sustrato sintético después de activación con el veneno de Agkistrodon contortrix contortrix utilizando un estuche comercialmente asequible (Coatest® Protein C, Kabi Diagnostica AB, Mölndal, Suecia).

La absorción de IgA, IgG e IgM se realizó como se ha descrito previamente (Dahlbäck B. et al., Blood 62, 218-225 (1983).

Se llevó a cabo también un segundo ensayo de Proteína C funcional como se ha descrito anteriormente (Hickton C.M., Thromb. Res. 41 501-8, (1986)). El método incluía absorción de plasma con citrato de bario. Las proteínas que se fijaron al citrato de bario se eluyeron y el producto eluido se incubó con un complejo trombina-trombomodulina para activar la Proteína C. La cantidad de APC después de la activación se cuantificó utilizando un ensayo de coagulación APTT.

Métodos de la invención

1. Se utilizó un método basado en APTT para determinar el efecto anticoagulante de APC purificada en el plasma del paciente. En este método (ensayo APC-APTT) se midió la prolongación mediada por APC del tiempo de APT como sigue: se incubaron 0, 1 ml de plasma con 0, 1 ml de reactivo APTT durante 5 minutos a 37ºC antes de la adición de 0,1 ml de una mezcla APC-Ca^{2\text{*}} (0-20 \mug/ml de APC en Tris-HC1 10 mM, NaCl 0,15 M, cloruro de calcio 30 mM, pH 7,5, que contenía 0,1% de seroalbúmina de bovino (BSA)) que inició la coagulación de la sangre. Se preparó la APC como ha sido descrito previamente (Dahlbäck B. et al., J. Biol. Chem. 261, 12022-12027 (1986)). El ensayo se llevó a cabo con APC de bovino con o sin la presencia de Proteína S de bovino.

Normalmente, los ensayos APTT se llevan a cabo sin adición de NaCl. De acuerdo con ello, pero también debido a que NaCl prolonga los tiempos de coagulación, se prefiere llevar a cabo este modo de la invención sin adición de NaCl.

2. Con objeto de determinar el efecto de APC sobre el Factor V del plasma, se añadieron concentraciones crecientes de APC (10 \mul diluidos en Tris-HC1 10 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,5, que contenía 0,1% de BSA) a 0,09 ml de plasma. Inmediatamente después de la adición de APC, se añadieron 0,1 ml de cefalina de cerebro de conejo (diluida en NaCl 0,15 M) y 0,1 ml de CaCl_{2} 30 mM. Después de incubación durante 15 segundos a 37ºC, se inició la coagulación con 0,1 ml de Factor X_{a} (150 ng/ml diluidos en Tris-HC1 10 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,5, que contenía 0,11^{0}5 de BSA). En ausencia de APC, esta concentración de Factor X_{a} dio un tiempo de coagulación aproximado de 30 segundos en el plasma testigo utilizado. El Factor X_{a} se preparó como se ha descrito anteriormente (Dahlb ck B. et al., J. Biol. Chem. 261, 12022-12027 (1986)).

3. Se utilizó una modificación de un ensayo comercial de Factor VIII (Coatest® Factor VIII, Kabi Diagnostica AB, Mólndal, Suecia) para analizar el efecto de APC sobre el Factor VIII del plasma. El plasma del paciente o plasma testigo (25 pl 1/125 a 1/400 en Tris-HC1 10 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,5, que contenía 0,1 w de BSA) se incubó con 75 pl del reactivo del estuche que contenía Factor IX_{a}, Factor X, fosfolípido y Ca^{l*}. Inmediatamente antes del ensayo, se añadieron a este reactivo concentraciones crecientes de APC (0, 1--100 pg/ml) . Después de 20 minutos de incubación a 37ºC, se añadieron 50 pl de una mezcla del sustrato sintético (2,7 nM) (Bz-Ile-Glu(y-OR)-GlyArg-pNA = S-2222, Kabi Diagnostica, Mólndal, Suecia) y el inhibidor de trombina (60 pM) (N-dansil-(p-guanidino)-Phe-piperidida = I-2581, Kabi Diagnostica AB, Mölndal, Suecia). Después de incubación durante 10 minutos más a 37ºC, la reacción se interrumpió por la adición de 150 pl de ácido cítrico (1 M) y se midió la absorbancia a 405 nm. Se construyó una curva estándar para el Factor VIII utilizando plasma normal diluido desde 1/100 a 1/800.

Resultados de los métodos utilizados en el proceso de la investigación

El tiempo de APT junto con los valores para ATIII y Proteína S eran normales y el paciente no mostraba indicación alguna de la presencia de anticoagulantes del lupus. El nivel de Proteína C en plasma era normal, tanto cuando se midió con el método inmunológico como con el ensayo funcional, que incluía activación de la Proteína C con veneno de serpiente y cuantificación de APC con un sustrato sintético.

El ensayo de Proteína C funcional con citrato de bario dio consistentemente valores de Proteína C más bajos para el producto eluido cuando se diluyó en relación 1:10 en comparación con 1:40. Esto podría indicar la presencia de un inhibidor para APC. Con objeto de comprobar este punto, se empleó el ensayo APC-APTT de la invención. El tiempo de coagulación obtenido era siempre más corto que para el plasma testigo. Con objeto de descartar un inhibidor del tipo de las inmunoglobulinas, el plasma del paciente se agotó por completo en IgA, IgG, o IgM por absorción. El tiempo de coagulación acortado no desapareció. Los resultados encontrados podrían ser debidos a una deficiencia en Proteína S funcional. Sin embargo, esta posibilidad se desechó dado que la APC de bovino, cuando se añade con o sin Proteína S de bovino es considerablemente menos eficaz en la prolongación del tiempo de APT del plasma del individuo objeto del estudio en comparación con la prolongación en el plasma testigo.

Un tercer mecanismo posible para la resistencia observada a APC fue que el Factor V_{a} o el Factor VIII_{a} del individuo objeto del estudio podrían ser resistentes a la escisión por APC. Para esclarecer esta posibilidad, se idearon ensayos que medían directamente la inhibición de los Factores V_{a} y VIII_{a} del plasma por APC. Utilizando el ensayo de coagulación basado en el Factor X_{a} (descrito anteriormente), se encontró que la inhibición del Factor V_{a} del paciente por APC era normal, lo cual sugería que el Factor V_{a} en el plasma del paciente se degradara de una manera normal por la adición de APC exógena. Este experimento descartó la posibilidad de un anticuerpo inhibidor de la Proteína C que explicara la resistencia a APC. Para ensayar la posibilidad restante, es decir que APC no pudiera degradar el Factor VIII_{a} del individuo objeto del estudio, se ensayó el efecto de APC añadida en un ensayo de Factor VIII_{a}. Sin embargo, se encontró que el Factor VIII_{a} del individuo objeto del estudio era degradado normalmente por la APC añadida cuando se comparó con plasma testigo. Este descubrimiento es contrario a la publicación anterior del autor de la invención (B. Dahlbäck y M. Carlsson, Thromb. Haemost. 65, Resumen 39, 658 (1991)).

Para investigar si el efecto de APC era hereditario, se analizaron 18 miembros de la familia utilizando el ensayo APC-APTT. Diez (varones y hembras) de los 18 miembros de la familia ensayados no respondían a APC con prolongación normal de sus tiempos de coagulación, lo cual sugiere que la molécula del factor responsable del efecto es resistente a APC. Este resultado demuestra que la molécula defectuosa se heredaba y estaba presente en los miembros de la familia que no daban una prolongación normal de sus tiempos de coagulación. Es digno de mención que, en ausencia de APC añadida, los tiempos de APT de estos individuos y del individuo objeto del estudio eran más cortos que en el caso de los testigos. Esto puede sugerir una degradación parcial de las moléculas factor pertinentes durante los ensayos APTT de plasma normal. Para ensayar la sensibilidad de la prueba APC-APTT en cuanto a la presencia de resistencia a APC, se analizaron mezclas de plasma del individuo objeto del estudio y normal (1:1, 1:10 y 1:100). Cuando se añadió a la mezcla 1:1, APC era igualmente ineficaz en la prolongación del tiempo de coagulación que cuando se añadió al plasma de individuo objeto del estudio. Se observó la mitad de la prolongación normal cuando se ensayó la mezcla 1:10, mientras que la mezcla 1:100 se comportó como el plasma testigo. Así pues, el ensayo APC-APTT no discriminaba entre la presencia de 50% y 100% de moléculas factor resistentes a APC, lo que sugería que el método era un método de escrutinio útil para la identificación de estados portadores.

Dado que la carencia encontrada de prolongación sustancial del tiempo de coagulación no está relacionada con los Factores VIII_{a} y V_{a} o con un inhibidos de la Proteína C del tipo de las inmunoglobulinas o una interacción Proteína S-APC defectuosa, el efecto debe asociarse con toda probabilidad a un factor de coagulación no reconocido hasta ahora.

El ensayo APC-APTT de acuerdo con la invención se ha llevado también sobre muestras de plasma de aproximadamente 100 pacientes con trombosis diagnosticada. Aproximadamente el 10% de los pacientes dieron acortamiento de sus tiempos de coagulación en comparación con el estándar. No pudo observarse carácter hereditario aparente alguno. Ninguno de los pacientes se había encontrado positivo en otros ensayos para la determinación de trastornos de la coagulación.

Se ha llevado a cabo un método APC-APTT similar al método 1 bajo el encabezamiento Métodos de la Invención 1 dado anteriormente sobre muestras de plasma de pacientes deficientes en Proteína S. En este modo específico, la cantidad de APC se ajustó de tal manera que los plasmas normales acumulados dieran como resultado una prolongación del tiempo de coagulación de 40 segundos. El nuevo tipo de pacientes que ha detectado el autor de la invención dieron entonces una prolongación del tiempo de coagulación de 0-15 segundos, mientras que el plasma de pacientes con deficiencia diagnosticada de proteína S dieron un tiempo de prolongación que estaba próximo al normal. Con objeto de comprobar ulteriormente la influencia de la deficiencia en Proteína S se ensayó también plasma normal que se había hecho deficiente en Proteína S por inmuno-adsorción. El tiempo de prolongación decrecía aproximadamente en un 50%, lo cual indica que la prolongación medida para el nuevo grupo de pacientes del autor de la invención no está causada por deficiencia en Proteína S. Se ha añadido también proteína S a plasma procedente del nuevo grupo de pacientes y se ha llevado a cabo el método de la invención sobre dicho plasma. El resultado ha sido que la prolongación del tiempo de coagulación no está normalizada, lo cual soporta adicionalmente que el método de la invención no mide la Proteína S.

Por variación del contenido de plasma en el medio de ensayo se comprobó experimentalmente que deben evitarse concentraciones de plasma demasiado bajas en el medio de ensayo final.

Digestión por restricción de ADN, PCR e hibridación para ensayar una herencia del trastorno asociada al gen X del factor VIII

ADN procedente de tres familiares (el individuo objeto del estudio, su madre y uno de sus hermanos) que eran sospechosos de llevar un gen responsable del trastorno se sometió a PCR con multiplicación del gen del Factor VIII y escisión subsiguiente con Bcl 1 como se ha descrito anteriormente (Kogan et al., N. Engl. J. Med. 317, 985-90 (1987)).

En la población humana, este tratamiento conduce a dos fragmentos diferentes (142 kb y 91 kb, respectivamente). El ADN de un individuo llevará genes que den ambos fragmentos o solamente uno de los fragmentos. El ADN de la madre daba ambos fragmentos de 142 kb y 91 kb, mientras que uno de sus hijos daba solamente el fragmento de 142 kb y el otro sólo el fragmento de 91 kb. Esto es una indicación clara de que los hijos han recibido de su madre genes del Factor VIII diferentes. El trastorno investigado no pudo asociarse por consiguiente a un gen perteneciente a un cromosoma X.

Claims

1. Un método in vitro para diagnosticar en un ser humano enfermedades tromboembólicas causadas por, o para determinar el riesgo para un ser humano de adquirir la manifestación de, un trastorno de la coagulación de la sangre designado resistencia a APC y reconocido por una respuesta anticoagulante anormalmente baja a la Proteína C exógena activada (abreviada APC) incluso en presencia de niveles normales de Proteína S funcional, Factores Va y VIIIa, que son degradados normalmente por APC, y ausencia de anticoagulantes del lupus, comprendiendo dicho método determinar para una muestra de plasma que comprende factores de coagulación y derivada de dicho ser humano, la actividad anticoagulante de APC exógena por medida de la velocidad de conversión del sustrato obtenida para una enzima de la coagulación, cuya actividad es influenciada por APC, por las etapas
siguientes:

(i) incubar dicha muestra de plasma con

(3) componentes que son necesarios para la reacción eficaz de los factores de coagulación activados introducidos por la etapa (i)(2), es decir, fosfolípido(s) y sal de Ca^{++}, dando una concentración de Ca^{2+} de 0,5-30 mmoles/l en el medio de ensayo final; y, si se desea,

(iii) comparar la velocidad de conversión medida en la etapa (ii) con un valor estándar obtenido a partir de muestras procedentes de individuos normales, muestras que han sido sometidas a las etapas (i) y (ii) en las mismas condiciones que la muestra de plasma procedente de dicho ser humano;

en cuyo método, una velocidad de conversión del sustrato obtenida para una muestra de plasma en la etapa (ii), que es mayor que el valor estándar indica que dicho ser humano padece o corre el riesgo de adquirir la manifestación de dicho trastorno.

2. El método de la reivindicación 1, en el cual el medio de ensayo final tiene un contenido de muestra de plasma del paciente de al menos 10% (volumen/volumen).

3. El método de la reivindicación 1, en el cual el medio de ensayo final tiene un contenido de plasma del paciente de al menos 20% (volumen/volumen).

4. El método de la reivindicación 1, en el cual el medio de ensayo final tiene un contenido de plasma del paciente de al menos 35% (volumen/volumen).

5. El método de las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, en el cual el reactivo (I) es un reactivo de tiempo parcial de tromboplastina activada (APTT) que comprende fosfolípido(s) y un activador de contacto de la vía intrínseca.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual la muestra de plasma se incuba con los componentes de (i) (1), (i) (3) y, en caso deseado, (i) (4) después de una preincubación de la muestra con reactivo (I) durante un tiempo suficiente para activar el sistema de coagulación de la sangre de la muestra.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual la APC exógena de (i) (1) está constituida por APC humana purificada.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el cual la APC exógena de (i) (1) está constituida por APC de bovino.

9. El método de la reivindicación 8, en el cual la APC de bovino se añade a la muestra junto con proteína S de bovino.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16, en el cual la muestra de plasma se incuba en la etapa (i) con Proteína C exógena humana o Proteína C no humana, p. ej. de bovino.

11. El método de la reivindicación 10, en el cual la Proteína S derivada de la misma especie que la Proteína C se utiliza como aditivo ulterior en la etapa (i).

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el cual la muestra de plasma se incuba con los componentes de (1) a (3) en la etapa (i) después de lo cual se mide la conversión del fibrinógeno endógeno en fibrina en la etapa (ii) por la vía de la formación de coágulo.

13. El método de la reivindicación 1, en el cual el reactivo (I) es

a): los componentes necesarios para activar el sistema de coagulación de la sangre de la muestra por la vía intrínseca, tales como un reactivo APTT, un activador del contacto, Factor IX_{a}, Factor XI_{a}, Factor XII_{a} y/o calicreína, y/o

(b): los componentes necesarios para activar el sistema de coagulación de la sangre por la vía extrínseca, p.ej. tromboplastina tisular,

y los componentes de acuerdo con (i) (1), (i) (3) e (i) (4) se añaden simultáneamente con o, en caso apropiado, después que se ha dejado incubar el reactivo (I) con la muestra durante un tiempo suficiente para activar la vía intrínseca o la vía extrínseca.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el reactivo (I) es Factor X_{a} exógeno o Factor IX_{a} exógeno.

15. El método de la reivindicación 14, en el cual la incubación se realiza en presencia de protrombina exógena.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el reactivo (I) es Factor X exógeno en exceso con relación al Factor X endógeno de la muestra y en combinación con Factor IX_{a} exógeno, posiblemente junto con trombina.

17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicación 1 y 13 a 16, en el cual está presente sustrato exógeno y se mide su conversión, si es necesario junto con un inhibidor de la polimerización de la fibrina.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual el sustrato exógeno es específico para Factor X_{a} y está presente junto con un inhibidor de la polimerización de la fibrina.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual el sustrato exógeno es específico para la trombina y está presente un inhibidor de la polimerización de la fibrina.

20. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 13 a 19, en el cual está presente un inhibidor de la polimerización de la fibrina junto con el sustrato exógeno durante la incubación y en el cual se mide la conversión del sustrato exógeno, siendo dicho sustrato exógeno un péptido sintético que comprende un grupo detectable.

21. El método de la reivindicación 20, en el cual dicho péptido está constituido por menos de cinco restos de aminoácidos y un grupo que se libera específicamente y se hace analíticamente detectable por acción de la enzima, p.ej. por acción de trombina o Factor X_{a}, estando fijado dicho grupo en un enlace amídico al extremo carboxilo del péptido y seleccionándose de grupos cromógenos, fluorógenos y quimiluminógenos (= sustrato cromógeno).

22. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el cual al menos uno de los materiales de (i) (1) a (i) (4) está presente en forma liofilizada que se reconstituye en conexión con el ensayo.

23. El método de la reivindicación 1, en el cual, en la etapa (iii) se compara también la velocidad de conversión medida para la muestra de plasma en la etapa (ii) con la velocidad de conversión obtenida para una muestra de plasma derivada de dicho ser humano, muestra que se ha sometido a la etapa (i) y (ii) en las mismas condiciones que la primera muestra de plasma, pero en ausencia del o de los componentes de (i) (1).