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EP4436956A1 - Ligands ciblant spécifiquement les transporteurs vésiculaires du glutamate pour l'imagerie à super-résolution - Google Patents

Ligands ciblant spécifiquement les transporteurs vésiculaires du glutamate pour l'imagerie à super-résolution

Info

Publication number
EP4436956A1
EP4436956A1 EP21840977.9A EP21840977A EP4436956A1 EP 4436956 A1 EP4436956 A1 EP 4436956A1 EP 21840977 A EP21840977 A EP 21840977A EP 4436956 A1 EP4436956 A1 EP 4436956A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
group
compound
independently represents
mmol
arh
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP21840977.9A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Nicolas PIETRANCOSTA
Salah El Mestikawy
Véronique BERNARD
Mahamadou DJIBO
Laetitia CHAUSSET-BOISSARIE
Stéphanie DAUMAS
Odile POIREL
Paola CRISTOFARI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Sorbonne Universite
Ecole Normale Superieure de Paris
Universite Paris Cite
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Sorbonne Universite
Universite de Paris
Ecole Normale Superieure de Paris
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Sorbonne Universite, Universite de Paris, Ecole Normale Superieure de Paris filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4436956A1 publication Critical patent/EP4436956A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/48—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9406—Neurotransmitters

Definitions

  • the present invention relates to new ligands of vesicular glutamate transporters VGLUTs, their use in diagnostic techniques for neurodegenerative or psychiatric diseases, and in therapeutic treatments.
  • the invention also relates to new ligands of VGLUTs comprising fluorescent groups compatible with superresolution microscopy studies, as well as their use.
  • the term “super-resolution microscopy” relates to an imaging technique implemented for the spectral analysis and/or the tracking of molecules exhibiting fluorescent properties, this technique is described in the article by Moerner W.E. published in 2015 in the journal Rev. mod. Phys., 2015, 87, 1183-1212.
  • the term “super-resolution microscopy” applies more particularly to two techniques, one of which is called “simultaneous emission depletion” (from the English: “stimulated emission depletion”, known by the acronym STED) and for the other of “stochastic optical reconstruction microscopy”, known by the acronym STORM.
  • vesicular glutamate transporters - such transporters are qualified as VGLUTs - are proteins located on the membrane of presynaptic vesicles located at the level of some of the neuronic synapses of mammals, for example at the level of the synapses of rodents such as mice, and more particularly of certain human neuronic synapses.
  • the vesicular transporters fill the vesicles with glutamate and are among the main players in glutamatergic transmission, that is to say they are among the main players allowing the reconstitution of the stock of neurotransmitters in the presynaptic vesicles.
  • VGLUT1 is a protein also known under the name BNPi, which is the English acronym for “brain-specific Na(+)-dependent inorganic phosphate cotransporter”, and which means “cotransporteur de phosphate inorganique Na(+)-dependent specific to the brain. He was the first of three subclasses to be identified. VGLUT 1 is absent from certain glutamatergic regions of the brain such as the thalamus or the brainstem, as described in the article by Ni, B. et al. J Neurosci, 1995, 15, 5789-5799.
  • VGLUT1 is abundant at the level of excitatory synapses and is thought to be involved in the filling of vesicles in a manner dependent on the electrochemical proton gradient; VGLUT1 is also involved in the transport of glutamate according to studies carried out by Bellocchio, EE et al., detailed in Science, 2000, 289, 957-960, as well as by Takamori, S. et al., in Nature, 2000 , 407 (6801), 189-194.
  • the transporter VGLUT2 which is a protein also known as DNPi, which is the English acronym for “differentiation-associated Na + - dependent inorganic phosphate transporter”, and which means “transporter of inorganic phosphate (Pi) Na + dependent and associated with differentiation”, has been discovered more recently.
  • This protein which therefore belongs to the family of Na + /Pi transporters, has 82% homology with the VGLUT1 isoform, as described in by Aihara, Y. et al., in the article published in J. Neurochem. , 2000, 74 (6), 2622-2625.
  • the third transporter VGLUT3 was brought to light in particular by Gras, C., El Mestikawy, S et al., who described this third vesicular glutamate transporter expressed by cholinergic and serotonergic neurons and published their results in J. Neurosci. , 2002, 22 (13), 5442-5451.
  • This new VGLUT3 isoform shares 72% homology with VGLUT1 and 75% with VGLUT2.
  • the VGLUT3 subtype has a lower expression than subtypes 1 and 2, as it is written in the article by Herzog , E.
  • VGLUT3 has notably been identified in certain specific types of neurons such as in the layers I-III and V-VI of the cerebral cortex, the cortical layers I, V and VI of the striatum, the median and lateral nucleus of the habenula , and the hippocampus.
  • transmembrane transporters as well as the monitoring of the mechanisms for the release of ions and/or small molecules, in particular neurotransmitters such as glutamate or acetylcholine, involved in the biological mechanisms implemented at the level of synapses , can be performed by immunofluorescence as described in the article by Amilhon B. et al., published in Med.Sci., 2008, 24, 1009-1011, or in the article by Edwards, RH et al. , published in Trends Neurosci, 2004, voi.27 N°2, 98-103.
  • the immunofluorescence technique is notably based on the recognition of specific antigens on the surface of transmembrane transporters, such as VGLUTs, and requires the presence of a primary antibody, a secondary antibody and a fluorophore for each protein of interest (here it is in particular one of the VGLUTs type transporters).
  • modified antibodies are molecules of several tens or even several hundreds of kiloDaltons (kDa), which leads to a strong crowding on the surface of the vesicles that one seeks to observe and it is therefore difficult to attribute to a protein of interest in particular the luminous points - which points are usually qualified as “spots” - observed according to the aforementioned superresolution microscopy imaging techniques.
  • the present invention therefore aims to provide new ligands of vesicular glutamate transporters VGLUTs as a tool for the study of glutamatergic transmission, in particular of VGLUT3 transporters, as well as their therapeutic application and for the implementation of diagnostic techniques.
  • the invention also relates to new ligands of VGLUT transporters comprising fluorescent groups compatible with super-resolution microscopy studies.
  • the invention provides a compound of structural formula: in which :
  • - A represents a heterocycle with 6 atoms fused to the phenyl ring and chosen from heterocycles of formula (II) or (III):
  • - Ri independently represents a hydrogen atom, an alkyl group in [Ci to Ce] or a cycloalkyl group in [Ce to Ce];
  • R2 independently represents a hydrogen or halogen atom
  • R3 independently represents a hydrogen atom, or one of the groups selected from a hydroxyl, an alkoxy (alkyloxy) in [Ci to Ce], an amino, an alkylamino in [Ci to Ce];
  • R4 independently represents one of the groups selected from hydrogen, hydroxyl, [Ci-Ce] alkoxy, [Ci-Ce] alkylamino and dialkylamino comprising [Ci-Ce] alkyl radicals;
  • - Q independently represents one of the groups selected from an alkenyl group (such as an alkene comprising a hydrogen on each carbon), alkynyl, azo, amide, a monocyclic group without a heteroatom, a monocyclic group with at least one heteroatom, a polycyclic group without heteroatom, a polycyclic group with at least one heteroatom, a monoaryl, a polyaryl, a heteroaryl, the said groups being substituted by at least one Rs substituent;
  • an alkenyl group such as an alkene comprising a hydrogen on each carbon
  • - Rs independently represents one of the groups selected from an aryl, a diphenyl, a heteroaryl, said Rs group possibly being substituted by at least one Re group;
  • Re independently represents one of the groups selected from hydrogen, halogen, [Ci to Ce] alkyl, hydroxyl, alkoxy, amino group, alkylamino, dialkylamino, nitrile group, nitro group, a sulfhydryl group (thiol), a sulfide group (-S-), a sulfone group (-SO2-; including sulfonic acid -SO3H); or in which Re independently represents a substituent corresponding to a second compound of formula (I) comprising a heterocycle of formula II or III, said second compound of formula (I) being substituted by the same atoms or groups chosen for R1, R2, R3, R4, Q and Rs of the first compound of formula (I), the Rs substituents of each compound of formula (I) substituting for each other to link the two compounds of formula (I);
  • the inventors have also demonstrated that the fluorescent properties of the new ligands of the invention allow the labeling, as well as the observation by super-resolution microscopy of cells and tissues comprising VGLUT transporters.
  • the compound of the invention comprises a heterocycle of formula (II) and corresponds to a coumarin derivative, in which:
  • - Ri independently represents a hydrogen atom, an alkyl group in [Ci to Ce], such as a methyl or an ethyl, or a cycloalkyl group [C3 to Ce;
  • - R2 independently represents a hydrogen or halogen atom;
  • R3 independently represents a hydrogen atom or one of the groups selected from a hydroxyl and an alkoxy (alkyloxy) in [Ci to Ce], an amino, or an alkylamino in [Ci to Ce];
  • - R4 independently represents a hydrogen atom or an OMe, -OH, -NHMe, -N(Me) 2 , -NHEt or -N(Et) 2 group ;
  • - Rs independently represents one of the groups selected from an aryl, a diphenyl, or a heteroaryl, said Rs group possibly being substituted by at least one Re group, if necessary;
  • - Re independently represents a hydrogen or halogen atom, or one of the groups selected from an alkyl in [Ci to Ce], a hydroxyl, an alkoxy, an amino group, an alkylamino, a dialkylamino, a nitrile group , a nitro group, a sulfhydryl group (thiol), a sulfide group (-S-), a sulfone group (-SO 2 -; including sulfonic acid -SO3H);
  • the compound of the invention comprises a heterocycle of formula (II) and corresponds to a coumarin derivative, in which:
  • - Ri is hydrogen or a methyl or ethyl group
  • - Q independently represents one of the groups selected from an alkynyl group and a triazole group substituted by Rs
  • R4 independently represents a hydrogen atom or one of the groups selected from a hydroxyl, a dlethylamino, a methoxy
  • - Rs is a diphenyl substituted by a group Re being a group -NH 2 .
  • the compound of the invention is selected from the following molecules:
  • the compound of the invention comprises a heterocycle of formula (II) and corresponds to a coumarin derivative, in which: - Ri independently represents a hydrogen atom or one of the groups selected from methyl and ethyl;
  • R2 is a hydrogen atom
  • R3 and R4 independently represent a hydrogen atom or one of the groups selected from a hydroxyl, a methoxy and an ethoxy;
  • - Q independently represents one of the groups selected from an alkenyl group and an azo group
  • - Rs independently represents a phenyl para-substituted by a halogen and o/ ⁇ /?o-substituted by a group Re.
  • the compound of the invention comprises a heterocycle of formula (II) and correspond to a coumarin derivative, in which:
  • - Ri independently represents a hydrogen atom or one of the groups selected from methyl and ethyl
  • R2 is a hydrogen atom
  • R3 and R4 independently represent a hydrogen atom or one of the groups selected from a hydroxyl, a methoxy and an ethoxy;
  • - Q independently represents one of the groups selected from an alkenyl group and an azo group
  • - Rs independently represents one of the groups selected from a phenyl para-substituted by a bromine, a phenyl para-substituted by a bromine and ort/io-substituted by a methoxy.
  • the compound derived from coumarin according to the invention is selected from the following molecules: of formula (X) in which:
  • - Ri independently represents a hydrogen atom or one of the groups selected from methyl and ethyl
  • R4 independently represents a hydrogen atom or one of the groups selected from a hydroxyl, a methoxy and an ethoxy
  • the compound derived from coumarin according to the invention is selected from the following molecules: of formula (XI) in which:
  • -Ri independently represents a hydrogen atom, or a methyl or ethyl group
  • R3 independently represents a hydrogen atom, or a methoxy and an ethoxy
  • R4 independently represents a hydrogen atom or one of the groups selected from a hydroxyl, a methoxy and an ethoxy;
  • - Re ortho to the azo group independently represents a hydrogen atom or one of the groups selected from a methoxy and an ethoxy
  • the compound of the invention comprises a heterocycle of formula (III) and corresponds to a quinoline derivative, in which:
  • - Ri independently represents a hydrogen atom, an alkyl group [Ci to Ce] or a cycloalkyl group [Ci to Ce];
  • R2 independently represents a hydrogen or halogen atom
  • R3 independently represents a hydrogen atom or one of the groups selected from a hydroxyl and an alkoxy (alkyloxy) in [Ci to Ce], an amino, or an alkylamino in [Ci to Ce];
  • - R4 independently represents a hydrogen atom or an OMe, -OH, -NHMe, -N(Me) 2 , -NHEt or -N(Et) 2 group ;
  • - Rs independently represents one of the groups selected from an aryl, a diphenyl, or a heteroaryl, said Rs group possibly being substituted by at least one Re group, if necessary;
  • - Re independently represents a hydrogen or halogen atom, or one of the groups selected from an alkyl in [Ci to Ce], a hydroxyl, an alkoxy, an amino group, an alkylamino, a dialkylamino, a nitrile group , a nitro group, a sulfhydryl group (thiol), a sulfide group (-S-), a sulfone group (-SO 2 -; including sulfonic acid -SO3H); or in which R6 represents a substituent corresponding to a second compound of formula (I) comprising a heterocycle of formula III, said second compound of formula (I) being substituted by the same atoms or groups chosen for Ri, R 2 , R3, R4 , Q and Rs of the first compound of formula (I), the R5 substituents of each compound of formula (I) substituting for each other to connect the two compounds of formula (I);
  • the compound of the invention comprises a heterocycle of formula (III) and corresponds to a quinoline derivative, in which:
  • - Ri independently represents a hydrogen atom, an alkyl group [Ci to Ce] or a cycloalkyl group [Ci to Ce];
  • R2 independently represents a hydrogen or halogen atom
  • R3 independently represents a hydrogen atom or one of the groups selected from a hydroxyl and an alkoxy (alkyloxy) in [Ci to Ce], an amino, or an alkylamino in [Ci to Ce];
  • - R4 independently represents a hydrogen atom or an OMe, -OH, -NHMe, -N(Me) 2 , -NHEt or -N(Et) 2 group ;
  • - Rs independently represents one of the groups selected from an aryl, a diphenyl or a heteroaryl, said Rs group possibly being substituted by at least one Re group, if necessary;
  • - Re independently represents a hydrogen or halogen atom, or one of the groups selected from an alkyl in [Ci to Ce], a hydroxyl, an alkoxy, an amino group, an alkylamino, a dialkylamino, a nitrile group , a nitro group, a sulfhydryl group (thiol), a sulfide group (-S-), a sulfone group (-SO 2 -; including sulfonic acid -SO3H); or in which;
  • the compound of the invention comprises a heterocycle of formula (III) and corresponds to a quinoline derivative, in which:
  • - Ri independently represents a hydrogen atom, an alkyl group [Ci to Ce] or a cycloalkyl group [Ci to Ce];
  • R 2 independently represents a hydrogen or halogen atom
  • R3 independently represents a hydrogen atom or one of the groups selected from a hydroxyl and an alkoxy (alkyloxy) in [Ci to Ce], an amino, or an alkylamino in [Ci to Ce];
  • - R4 independently represents a hydrogen atom or an OMe, -OH, -NHMe, -N(Me) 2 , -NHEt or -N(Et) 2 group ;
  • - Rs independently represents one of the groups selected from an aryl, a diphenyl, or a heteroaryl, said Rs group possibly being substituted by at least one Re group, if necessary;
  • - Re independently represents a substituent corresponding to a second compound of formula (I) comprising a heterocycle of formula III, said second compound of formula (I) being substituted by the same atoms or groups chosen for Ri, R 2 , R3, R4, Q and Rs of the first compound of formula (I), the substituents R5 of each compound of formula (I) substituting for each other to link the two compounds of formula (I);
  • the compound of the invention comprises a heterocycle of formula (III) and corresponds to a quinoline derivative, in which:
  • -Ri independently represents a hydrogen atom, or a methyl or ethyl group
  • R3, and R4 are hydrogen atoms
  • -Q is a phenyl group substituted by an Rs phenyl group.
  • the quinoline derivative compound according to the invention is chosen from the following molecules:
  • coumarin derivative within the meaning of the invention designates any molecule comprising a coumarin skeleton according to formula (XIII):
  • quinoline derivative within the meaning of the invention designates any molecule comprising a coumarin skeleton according to formula (XIV):
  • alkyl is meant a saturated, linear or branched monovalent hydrocarbon radical.
  • an alkyl group in [Ci to Ce] is meant an alkyl radical comprising from 1 to 6 carbon atoms such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl and tert-butyl, pentyl and hexyl .
  • alkylene is meant a saturated, linear or branched bivalent hydrocarbon radical.
  • alkoxy is meant an O-alkyl radical.
  • dialkylamino is meant an amino radical substituted by two alkyl radicals, which may be identical or different.
  • the invention also relates to the use of one of the compounds according to the invention, or of one of its salts, as an in vitro or ex-vivo fluorophore probe.
  • the compounds of the invention are used as a fluorophore probe in a biological medium such as a cell culture or a cell tissue.
  • one of the compounds according to the invention, or one of its salts is used as a fluorophore for the study of at least one vesicular glutamate transporter VGLUT.
  • the vesicular glutamate transporter is VGLUT3.
  • salts of the compounds according to the invention are prepared according to techniques well known to those skilled in the art and include those with mineral or organic acids which allow suitable separation or crystallization of the compounds, as well as pharmaceutically acceptable salts.
  • pharmaceutically acceptable is meant that which is useful in the preparation of a pharmaceutical composition which is generally safe, non-toxic and neither biologically nor otherwise undesirable and which is acceptable for veterinary as well as human pharmaceutical use.
  • Such salts include:
  • a metal ion for example an alkali metal ion, an alkaline earth metal ion or an aluminum ion; either coordinates with an organic or inorganic base.
  • Acceptable organic bases include diethanolamine, ethanolamine, N-methylglucamine, triethanolamine, tromethamine and the like.
  • Acceptable inorganic bases include aluminum hydroxide, calcium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate and sodium hydroxide.
  • the invention relates to the use of a substance derived from coumarin comprising a coumarin skeleton according to formula (XIII): or a quinoline derivative substance having a quinoline skeleton according to formula (XIV) for the implementation of an in vitro or ex-vivo diagnostic method for at least one pathology selected from a neurological disease, preferably a psychiatric disease.
  • the substance consists of one of the compounds derived from coumarin or quinoline of the invention in a pharmaceutically acceptable formulation.
  • the diagnostic method implements a fluorescence imaging technique performed by super-resolution microscopy.
  • the invention relates to a coumarin-derived substance comprising a coumarin skeleton according to formula (XIII): or quinoline derivative substance comprising a quinoline skeleton according to formula (III) for its use for the implementation of an in vivo diagnostic method for at least one pathology selected from a neurological disease or a psychiatric disease.
  • said substance consists of one of the compounds derived from coumarin or quinoline according to the invention or one of its salts in an acceptable pharmaceutical formulation.
  • said diagnostic method implements a fluorescence imaging technique performed by super-resolution microscopy.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition for the therapy or fluorescence imaging of a disease selected from at least one neurological disease and at least one psychiatric disease, comprising at least one compound according to the invention or a mixture of these.
  • a disease selected from at least one neurological disease and at least one psychiatric disease, comprising at least one compound according to the invention or a mixture of these.
  • neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, epilepsy, posterior cortical atrophy or amyotrophic lateral sclerosis.
  • the invention also relates to a complex comprising a protein from an animal or human cell, said cell being isolated from the body of said animal or said human, linked to at least one compound according to the invention.
  • Said protein corresponds for example to a cell transporter, that is to say a protein of the cell membrane or of the cytoplasm or of the cell nucleus or of a cell organelle (ie endosome, vesicle), and which binds specifically to one of the compounds of the invention, inducing a cellular response to this compound.
  • the complex comprises a cellular protein corresponding to a glutamate transporter VGLUT, or metabotropic glutamate receptors (mGluR), glutamate channel receptors or even ionotropic glutamate receptors (iGluR) and such as NMDA receptors, kainate and preferably AMPA.
  • the receptor-compound complex is isolated from the animal or human cell.
  • the invention also relates to the use of said protein-compound complex in a molecular screening method.
  • the invention also relates to a kit comprising:
  • VGLUT vesicular glutamate transporter
  • transfected BON cells expressing a VGLUT transporter of the VGLUT1, VGLUT2 and/or VGLUT3 type.
  • a reference compound a known ligand of at least one of the VGLUT transporters and having a known activity or known affinity, such as the so-called “LSP5-2157” inhibitor comprising the following formula:
  • the invention also relates to a method for quantifying vesicular glutamate transporters VGLUTs, comprising the following actions:
  • said method also comprises:
  • the invention also proposes a method for determining a degree of affinity of a compound derived from coumarin or a compound derived from quinoline for a vesicular transporter of glutamate VGLUT, and comprising:
  • a reference complex by incubation of cells expressing a VGLUT transporter with a reference compound exhibiting a known affinity for said VGLUT transporter and with a compound to be analyzed comprising an intrinsic fluorescence or marked by a fluorescent or radioactive label, by for example, the reference compound is LSP5-2187 or brilliant yellow;
  • the invention also proposes a method for determining a degree of affinity of a target compound for a vesicular glutamate transporter VGLUT, and comprising:
  • Figure 1 illustrates the absorption and emission spectra of a compound according to the invention.
  • Figure 2 illustrates the observation and quantification of BON VGLUT3 cells under a confocal microscope following its labeling with examples of fluorescent compounds according to the invention, and the inhibition of the fluorescent signal by LSP5-2127.
  • Figure 3 illustrates a second example of observation and quantification of BON VGLUT3 cells under a confocal microscope following its labeling with examples of fluorescent compounds according to the invention.
  • Figure 4 illustrates the effect on the labeling of BON VGLUT3 cells by examples of fluorescent compounds of the invention according to its ester or acid form.
  • Figure 5 illustrates the fluorescence quantification of striatal slices after incubation in the presence of examples of fluorescent compounds of the invention.
  • Figure 6 illustrates the observation of synaptic vesicles isolated in the presence of one of the fluorescent compounds of the invention.
  • Figure 7 illustrates glutamatergic vesicular labeling by double labeling by immunohistochemistry and by a fluorescent compound according to the invention.
  • the object of the present invention is to provide new ligands for transmembrane transporters, and in particular VGLUTs “vesicular glutamate transporters”, and preferably VGLUT3.
  • the invention aims to provide ligands for VGLUTs having a higher affinity for VGLUTs than that of glutamate and/or making it possible to inhibit the transport of glutamate.
  • the inhibition of glutamate transport by the ligands of the invention is very advantageous in that it allows its use as a modulator of glutamatergic transmission and its therapeutic application in diseases or conditions such as ischemia and addition. Indeed, the inhibition of glutamate release by compounds of the invention would make it possible to reduce collateral damage, for example during a vascular accident.
  • the compounds of the invention bind to VGLUTs thanks to a chemical motif analogous to that of Glu, they are thus capable of fixing functional transporters, advantageously making it possible to study more integrated and living models.
  • they allow the direct or indirect labeling of VGLUTs for the study and monitoring of synaptic processes, as well as for the implementation of methods for diagnosing degenerative or psychiatric diseases in vivo, in vitro, or ex-vivo.
  • the invention proposes to use an intrinsic fluorescent property of the compounds of the invention for the implementation of studies of the glutamatergic system and the screening of new molecules by means of resolution microscopy techniques or by quantification of fluorescence intensity.
  • the compounds of the invention are directly fluorescent and have a very small size, which represents a major advantage compared to the immunohistochemical labeling technique.
  • the compounds of the invention made it possible to mark not only cell cultures, but also the glutamatergic vesicles present in slices of striatum, a living model with more integrity than cell culture. The glutamatergic vesicles are thus visualized with precision thanks to super-resolution microscopy and their labeling by means of the compounds of the invention.
  • the compounds of the invention are also very advantageous in that they are compatible with immunohistochemical labeling. Indeed, the inventors have demonstrated that a double labeling of synaptic vesicles is possible by using one of the fluorescent compounds of the invention to label one of the VGLUTs and labeling by immunohistochemistry to label a second target receptor.
  • the compounds of the invention can also be labeled with additional fluorescent groups, or with radioactive labeling for their implementation in studies of the glutamatergic system, diagnostic methods and the screening of new molecules.
  • additional fluorescent groups or with radioactive labeling for their implementation in studies of the glutamatergic system, diagnostic methods and the screening of new molecules.
  • fluorine-18 or tritium ( 3 H) by techniques known to those skilled in the art, in addition to those described by Dr. Deng, X et al in the article published in Angenwandte Chemie International Edition 2019, 58, 2580-2605 and by Bozkurt, M et al in the article published in Eur J Nucl Med Mol Imaging (2017) 44:1588-1601.
  • the invention also relates to a kit and a method for the identification of VGLUTs transporters, as well as for the determination of a degree of affinity of the new molecules for said VGLUTs.
  • the compounds of the invention correspond to quinoline and coumarin derivatives.
  • the compounds in Table 1 were synthesized.
  • the compounds of the invention are referred to without distinction as “fluorescent compounds”, or “ligands” and “fluorescent ligands” with respect to their affinity for the VGLUT transporters.
  • Vesicular glutamate reuptake was tested as previously described (Kish and Ueda, 1989; Naito and Ueda, 1985; Pietrancosta et al., 2010) with minor modifications. Aliquots of synaptic vesicles from transfected "BON" cells, overexpressing or not the vesicular glutamate transporter VGLUT3 (obtained by differential centrifugation of rat cortex) were diluted in a solution containing 4 mM HEPES-KOH, pH 7.4 and 0 .32M of sucrose. Test compounds were dissolved in 1% ethanol, 1% DMSO (pH was adjusted to 7.4 with 5% KOH) to initial concentrations between 2mM and 200pM.
  • the compounds were then diluted to the desired final concentrations in a solution containing 10 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 0.32 M sucrose, 4 mM KOI, 4 mM MgSO4 (named TPU).
  • Test compounds were pre-incubated in a solution containing 3 mM ATP-Mg, 1 mM L-aspartic acid, 100 ⁇ M glutamate and 0.4 mM nitrogen and 0.4 ⁇ M [3H]- Glutamate (1.547TBq/mmol). After 4 min at 37°C, the reuptake reaction was initiated by the addition of rat synaptic vesicles.
  • This mixture was incubated for 10 min at 37°C before adding ice-cold TPU (3.5 mL) and Quickly filter through a membrane filter (0.45 ⁇ M, 0.5 ⁇ M, Millipore MF part number HAWP02500) using a vacuum manifold.
  • the filters were washed five times with 3.5 mL of cold TPU and placed in scintillation vials with scintillation cocktail (optiphase hisafe 3, catalog number 1200-437, Perkin Elmer).
  • the radioactivity bound to the filters was measured in a Beckman LS 6500 scintillation spectrophometer. The values obtained in the absence of ATP-Mg or in the presence of Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP, 50 pM Sigma reference C2759) were used to determine non-specific activity.
  • CCCP Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone
  • the compounds presenting the highest percentages of inhibition are preferred candidates for the study of the activity of VGLUTs, and the labeling of glutamatergic vesicles.
  • the physico-chemical properties of each ligand were determined using fluorimetry. For each compound, a dilution range was performed and measurements were taken at 1 mM, 316 pM, 100 pM, 31.6 pM, 10 pM, 3.16 pM and 1 pM. In 96-well fluorescence microplates, the absorbance and emission spectra of the ligands could be determined at each concentration using a plate spectrophotometer (Tecan). The absorbance spectra are first measured for each compound in order to determine the maximum absorption wavelength ( ⁇ maxabs). The fluorescence or emission spectra are then determined after excitation of each compound at its ⁇ maxabs, thus making it possible to obtain the maximum fluorescence wavelength ( ⁇ rnaxem). Various parameters specific to each of the compounds were determined:
  • the Stokes shift corresponds to the difference between the peak of the absorption spectrum and the peak of the fluorescence spectrum, i.e.: ⁇ rnaxem - ⁇ maxabs
  • the quantum yield (>): it represents the ratio of the number of photons emitted to the number of photons absorbed by the compound, ie the “probability” for an excited molecule to emit a photon. It takes a value between 0 and 1, 0 corresponding to a non-fluorescent molecule and 1 meaning that there is no de-excitation. Its value is determined using the formula below where Abs: optical density at ⁇ maxabs, AUC: area under the curve of the fluorescence spectrum, n: refractive index of the medium. In this formula, “m” refers to the molecule studied, and “r” to a reference fluorophore. of the fluorescence spectrum, n: refractive index of the medium). In this formula, “m” refers to the molecule studied, and “r” to a reference fluorophore.
  • Figure 1 illustrates the absorption and emission spectra of the reference compound L8, a carboxylic acid from the quinoline family. This is an example of the study carried out on each of the fluorophores studied.
  • the graphic values determined using these spectra are the ⁇ maxabs, the ⁇ maxem and the Stokes shift in each medium.
  • the emission spectra reveal very high fluorescence intensities. The most dilute wells are preferred to see the emission peak of the compound.
  • the change in pH induces a shift in the spectrum for certain fluorophores, a very useful property in vesicular labeling.
  • sensitive pH sensors are widely used in vesicular labeling, given the change in pH between the intra-vesicular medium and the cytoplasm.
  • the intensity of fluorescence emitted can vary, which is another parameter playing in the development of sensitive pH molecules.
  • the experiments are carried out with a BON cell line stably expressing VGLUT3 or a “VGLUT2-venus” fluorescent VGLUT2.
  • Untransfected BON cells wild-type, BON WT
  • the cells are cultured in F-12 Nutrient Mixture Ham (21765-029, Thermo Fisher Scientific) and Dulbecco's Modified Eagle's Medium High Glucose (DMEM HG, 31966021, Thermo Fisher Scientific; vol ume/vol urn), supplemented with 10% of fetal calf serum (FCS, 12483012, Thermo Fisher Scientific) and 1% (v/v) of a mixture of streptomycin (10mg/mL)/penicillin (10000 U/mL) and 0.8 mg/mL Geneticin G418 sulfate (G418, 10131027, Thermo Fisher Scientific), in an incubator at 37°C under 5% CO2.
  • the medium is
  • the cells are cultured in 25 cm 2 culture flasks. When the cells are confluent, they are rinsed with sterile 1 X PBS after aspiration of the medium, then incubated for five minutes at 37°C with a trypsin-EDTA solution (0.05% Trypsin EDTA, 25300054, Thermo Fisher Scientific) . The cell layer is then detached and the cells dissociated from each other. After addition of medium, the cell suspension is centrifuged for 5 minutes at 300 g, then the pellet is diluted 1:3 in order to be put back into culture.
  • trypsin-EDTA solution 0.05% Trypsin EDTA, 25300054, Thermo Fisher Scientific
  • the cell suspension is inoculated at 150,000 cells/well, in twelve-well plates on glass coverslips 19 mm in diameter. For observation, these coverslips are placed in a chamber allowing hermetic fixation of the coverslip in the observation medium, FluorobriteTM DMEM (A1896701, Thermo Fisher Scientific), a transparent medium.
  • FluorobriteTM DMEM A1896701, Thermo Fisher Scientific
  • the cells are incubated at 37° C. in the presence of fluorescent ligands, at the concentrations determined beforehand.
  • the effect of a pretreatment of BON cells with a specific inhibitor of VGLUTs, the substance LSP5-2157, is also carried out to study the inhibitory effect of this substance on the labeling of BON cells with the fluorescent ligands of the invention.
  • the cells are observed in real time under an inverted confocal microscope, with a 63x objective in a room thermostated at 37°C (Leica TCS SP5; cell imaging platform of the Paris-Seine Institute of Biology).
  • the fluorescent molecules studied emitting in the blue, the cells are excited at 405 nm.
  • FIG. 2 illustrates the observation and quantification of BON cells under a confocal microscope, and the inhibition of the fluorescent signal by pretreatment of the cells with the specific inhibitor of VGLUTs, LSP5-2157.
  • Parts A,B,E,F,I,J,M and N show: Wild cells (BON WT) or cells expressing VGLUT3 (BON VGLUT3) incubated with different fluorescent ligands, B09 in AD, CO7 in EH, L8 in IL , G02 in PM.
  • A, E, I and M A weak and homogeneous labeling is detected in the cytoplasm of the cells of the BON WT cells.
  • B, F, J and N After treatment with fluorescent ligands for one hour at 37° C., a punctiform marking appears in the cytoplasm of the BON VGLUT3 cells.
  • C, G, K and O Pre-incubation with LSP5 significantly decreases fluorescent labeling. The images are presented in negative.
  • D, H, L and P Quantification of the treatment effect.
  • Pretreatment with LSP5 decreases the fluorescence intensity for ligands B09, L8 and G02.
  • the values measured in the BON VGLUT3 cells with or without pretreatment with LSP5 do not differ significantly.
  • Statistical analysis Kruskal-Wallis test followed by Dunn's post-hoc test, NS: not significant, * p ⁇ 0.01;***p ⁇ 0.0001.
  • Figure 3 illustrates the observation and quantification of BON cells under a confocal microscope.
  • Wild-type cells BON WT
  • cells expressing VGLUT3 BON VGLUT3
  • various reference fluorescent ligands L8, YL151, D04, C07, C05, B09, G02, F11.
  • fluorescent labeling is visible in the BON cells.
  • the treatment effect is analyzed by quantifying the fluorescence intensity in each cell type.
  • FIG. 4 illustrates the quantification of the effect of the treatment by the ligands according to their acid or ester form.
  • the effect of the treatment (1 h, 37° C.) in its acid and ester form is compared with the absence of treatment.
  • the ester form induces a significant increase in fluorescence compared to the acid form in BON cells expressing VGLUT3.
  • Statistical analysis Kruskal-Wallis test followed by Dunn's post-hoc test. NS: not significant, ***:p ⁇ 0.0001.
  • the compatibility of the fluorescent compounds of the invention was determined in brain slices of newborn babies with mice, a study model with more integrity than cell culture.
  • mice aged 4 to 7 days are decapitated.
  • the brains are removed and then placed in Neurobasal mediumTM-A (10888022, ThermoFisher Scientific) enriched with 2% of B-27TM Plus (A3582801, ThermoFisher Scientific) and 1% (volume/volume) of a mixture of streptomycin ( 10 mg/mL)/penicillin (10,000 U/mL).
  • the brains are cut into 500 ⁇ m thick slices (Tissue Chopper McIlwain, model TC752) and then dissociated from each other.
  • the slices corresponding to the striatum are selected and incubated for one hour in the medium in the presence of 25 ⁇ M of fluorescent ligand, or without a fluorescent molecule for the controls. Incubations in the presence or in the absence of the reference VGLUT inhibitor were carried out.
  • This inhibitor is the molecule LSP5-17 being capable of displacing the binding of ligands in cell culture.
  • FIG. 4 illustrates the quantification of fluorescence of slices of striatum after incubation in the presence of fluorescent compounds of the invention.
  • the slices are incubated for 1 h at 37° C. in the presence of 25 ⁇ M of compound. Acquisitions were carried out under a confocal microscope (x5 objective) and the average fluorescence intensity for each slice was quantified. The acid or ester forms of the test compound were compared with incubated control slices in medium without ligand.
  • Statistical analysis Kruskal-Wallis test followed by Dunn's post-hoc test. Ns: not significant,*:p ⁇ 0.1 **:p ⁇ 0.001,***:p ⁇ 0.0001.
  • Figure 5 shows the compatibility of the fluorescent compounds of the invention with the slice model. All ester-form compounds show significantly higher labeling than control slices. Logically, certain acids which allowed significant fluorescent labeling on the BON cell do not show here any increase in fluorescence compared to the control slices. Indeed, the permeating character of the compounds previously studied (FIG. 3) is here a predominant factor. The permeability of the model slices is much lower than that of cells in vitro. Therefore, hydrophobic compounds are significantly more effective when using this model. Surprisingly, there is no significant difference between compounds G02 and F11, as was the case in BON cell culture. It is therefore possible to use either of these compounds interchangeably.
  • the isolated synaptic vesicles are a model of choice in determining the distribution of the VAChT and VGLUT3 transporters at the vesicular level.
  • the major pitfall in the use of this model is the absence of a protocol for its use and of results regarding their compatibility with super-resolution microscopy.
  • the observability of fluorescent labeling in the vesicles was tested, as well as the effect of super-resolution STED microscopy on this model.
  • the different manipulations were carried out on rat or mouse synaptic vesicles, originating from the striatum or the cortex.
  • the fluorescent compounds to be studied are diluted in sucrose buffer (0.32 M TPS) so as to obtain 10 ⁇ M of compound in the final observation medium.
  • Vesicles were diluted in sucrose buffer (TPS) and then observed in transport buffer (with 3 mM ATP and 1 mM Aspartate) at 5 ⁇ g of vesicles per ⁇ L of medium.
  • TPS sucrose buffer
  • transport buffer with 3 mM ATP and 1 mM Aspartate
  • the addition of the TPS containing the vesicles triggers the activity of the vesicular transporters and therefore the recapture of the fluorescent compound present in the medium.
  • the main pitfall being the buoyancy of the vesicles in the medium which could make them unobservable, the observations were made on Ibidi plates whose lamellae have a polymer coating which makes them adherent.
  • Synaptic vesicles from rat cortex isolated are then incubated in the presence of ATP and the fluorescent ligand G02 at 37°C and are then observed by confocal microscopy as well as by super-resolution microscopy (STED).
  • STED super-resolution microscopy
  • control wells were analyzed. No fluorescent signal is detected in wells containing only isolated vesicles (without fluorescent ligand), or only the fluorescent compound (without vesicles).
  • Tests were carried out in order to verify the compatibility of the new fluorescent ligands of the invention and labeling by immunohistochemistry. Indeed, in the long term, combining labeling of VAChT by immunohistochemistry and of VGLUT3 by a fluorescent ligand would make it possible to obtain more information on the distribution of these vesicular transporters in the striatum.
  • FIG. 7 illustrates glutamatergic vesicular labeling by immunohistochemistry and the fluorescent ligand referenced G02 according to the invention.
  • isolated glutamatergic synaptic vesicles were doubly labeled by immunostaining of VGLUT1 (in red) and the fluorescent ligand G02 (in green). Observations were made using confocal and STED microscopy.
  • Figure 18 shows that it is possible to immunolabel the synaptic vesicles under these conditions, but also that immunohistochemistry is compatible with the use of the compounds.
  • the spots obtained are clear and resolved, validating the use of STED in the context of these manipulations. In order to analyze more precisely the colocalization of the spots, it is seems more appropriate to use lower and therefore more separated concentrations of vesicles.
  • R 2 H, OH, OMe, NEt 2
  • Et diethyl malonate
  • R 2 H, OH, OMe, NEt ;
  • R 'Pr (Meldrum's Acid)
  • R' H, Et
  • the desired product was obtained as a white solid (12.72 g, 48% yield) from 2-hydroxy-benzaldehyde (15 g, 122.8 mmol, 1 equiv.), diethyl malonate (147 mmol, 1.2 equiv.), a catalytic quantity of piperidine (13 mmol, 10 mol%) dissolved in 150 mL of absolute ethanol according to General Procedure 1.
  • 6-iodo-7-substituted-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylic acid was synthesized according to the following general scheme:
  • Ethyl 6-azido-7-substituted-2-oxo-2/-/-chromene-3-carboxylate was synthesized according to the following general scheme:
  • Ci6Hi 8 N 2 O6 PM 334.32 g.mol- 1
  • Ci6HiiBrN2C>3 PM 359. 17 g. soft 1
  • Ethyl (E)-ethyl 6-((4'-aminobiphenyl-4-yl)diazenyl)-7-substituted-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate derivatives were synthesized according to the following procedure:
  • General Procedure 3 Formation of Azo Bonds
  • the desired product was obtained as an amber solid (38 mg, 76% yield) from A111-I, 2-oxo-6-(phenyldiazenyl)-2H-chromene-3-carboxylate ( E)-ethyl (50 mg, 0.17 mmol) in 1:1 Toluene/30% KOHaq according to General Procedure 6; 1 H NMR (500 MHz, DMSO + A few drops of DCI) 5H: 8.85 (s, 1 H, CHCCO2H), 8.43 (s, 1 H, ArH), 8.
  • Ci9Hi 5 BrN 2 O 5 PM 431.24 g.mol- 1
  • Ci7HnBrN 2 O 5 PM 403. 18 g.mol- 1
  • the desired product was obtained as an amber solid (26 mg, 46% yield) from C111-I,6-((4-bromo-2-methoxyphenyl)diazenyl)-2H-chromene-3 - (E)-ethyl carboxylate (60 mg, 0.14 mmol) 1:1 MeOH/(KOHAq 30%) according to general procedure 6; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6 + a few drops of DCI) 5H: 8.
  • Ci8Hi 3 BrN 2 06 PM 433.21 g.mol- 1
  • Ci5Hi3BrN 2 O4 PM 365. 18 g.mol- 1
  • Ci 8 Hi3BrN 2 O6 PM 433.21 g.mol- 1
  • Ci3HgBrN2O2 PM 305. 13g. soft 1
  • Ci8Hi 3 BrN 2 O4 PM 401.21 g.mol- 1
  • Ci6HgBrN2C>4 PM 373. 16 g.mol' 1
  • Ci9Hi 5 BrN 2 O5 PM 431.24 g.mol- 1
  • Ci7HnBrN 2 O 5 PM 403. 18 g.mol- 1
  • Ci9Hi 7 BrN 2 O 5 PM 431.24 g.mol- 1
  • Ci7HnBrN 2 O 5 PM 403. 18 g.mol- 1
  • Ci6H9BrN 2 O 5 PM 389. 16 g.mol- 1
  • Ci7Hi 9 NSi PM 265.42 g.mol- 1
  • Iodocoumarin Derivatives (0.25 mmol, 1 equiv.), Alkyne (0.5 mmol, 2 equiv.), Bis(diphenylphosphino)palladium dichloride (0.0125 mmol, 5% equiv.), Cul (0.025 mmol, 10% equiv.) and NEt3 (2 mmol, 8 equiv.) were dissolved in 2 mL of DMF and stirred at t.e.r. for 4 p.m. (unless otherwise specified). The progress of the reaction was followed by TLC using CH2Cl2-MeOH 10:1 as eluent. After the reaction was complete, the solvent was evaporated in vacuo and the solid residue was purified by flash chromatography using the CH2Cl2-EtOAc step-gradient solvent system as eluent. The following new compounds were prepared using this procedure.
  • 6-iodo-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylic acid (0.2 g, 0.64 mmol, 1 equiv.) in DMF (5 mL) was placed in reaction with 4'-ethynyl-[1,1'-biphenyl]-4-amine (0.146 g, 0.76 mmol, 1.2 equiv.), bis(diphenylphosphino)palladium dichloride (22 mg, 0.032x10 -3 mmol, 5%), Cul (12 mg, 0.063x10-3 mmol, 10% equiv.) and NEt3 (0.705 mL, 5.06 mmol, 8 equiv.).
  • Azidocoumarin derivatives (1.5 mmol, 1 equiv.), an alkyne (1.8 mmol, 1.2 equiv.), and Cul (0.025 mmol, 10% equiv.) were dissolved in 3 mL of DMSO degassed and stirred at 60°C for 16 h (unless otherwise specified) under argon. After the reaction was complete, water was added and the resulting slurry was removed by filtration. The residue was washed successively with water, DCM and Et2O then dried to give the desired compound. If the residue is soluble with respect to the solvent system, the solid was purified by flash chromatography using the CH2Cl2-MeOH step gradient solvent system as eluent. The following new compounds were prepared using this procedure.
  • Ci6H 9 BrN 2 O5 PM 389. 16 g.mol- 1
  • the copper-phenanthroline complex is prepared according to the protocol described by Kirai et al. 7
  • 6-Bromoquinoline is obtained by the Pfitzinger reaction (a modification of Friedlander's method). In this reaction, 5-bromoisatin is condensed with sodium pyruvate in a basic medium (KOH) to produce quinoline 2-4,dicarboxylic acid. 1 ' 3-6 This quinoline is purified by precipitation at pH 3.
  • Quinoline diethyl 2,4 dicarboxylic ester is obtained by esterification in the presence of SOCI2 under reflux of ethanol.
  • the compound LSP013-172 is obtained by condensation of 6-bromoquinoline diethyldicarboxylate and 4,4'-divinylbiphenyl, this coupling reaction (HECK) is catalyzed by palladium (II) acetate in the presence of K3PO4 as base and N -dimethylacetamide. 8
  • Tetraethyl 6,6'-(biphenyl-4,4'-diyl)diquinoline-2,4-dicarboxylate (70mg, 0.1mmol) was dissolved in a 1:1 solvent solution of THF and H2O. To this solution was added sodium hydroxide (24 mg, 0.6 mmol). The reaction mixture was monitored by TLC (ethyl acetate/cyclohexane 1:1). The THF/H2O solution was removed under vacuum and the desired product was dissolved in water and precipitated with 6 M HCl (pH 3). Red solid (30 mg, 51%).
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Abstract

La présente invention concerne des nouveaux ligands de transporteurs vésiculaires du glutamate VGLUTs et leur utilisation dans de méthodes de diagnostic et des applications thérapeutiques. L'invention concerne également l'utilisation de propriétés fluorescentes de nouveaux ligands dans des études de microscopie en super- résolution. La présente invention concerne aussi la préparation et l'utilisation de tels composés. En particulier, des nouveaux dérivés de la coumarine et de la quinoléine sont proposés pour l'étude des systèmes glutamatergiques, notamment de « transporteurs vésiculaires du glutamate » VGLUTs. Les composés se lient au VGLUTs grâce à un motif chimique similaire au Glutamate et peuvent être transportés à l'intérieur de cellules par lesdits récepteurs. Les propriétés fluorescentes des composés de l'invention permettent un marquage, et une visualisation très précise par microscopie de haute résolution, des vésicules glutamatergiques dans des modèles in vitro et ex-vivo.

Description

Description
Titre de l'invention : Ligands ciblant spécifiquement les transporteurs vésiculaires du glutamate pour l'imagerie à super-résolution
La présente invention concerne des nouveaux ligands des transporteurs vésiculaires du glutamate VGLUTs, leur utilisation dans des techniques de diagnostic de maladies neurodégénératives ou psychiatriques, et dans des traitements thérapeutiques. L’invention concerne également des nouveaux ligands des VGLUTs comportant des groupements fluorescents compatibles avec des études de microscopie en superrésolution, ainsi que leur utilisation.
Dans le contexte de l’invention, le terme « microscopie de super-résolution » concerne une technique d’imagerie mise en œuvre pour l’analyse spectrale et/ou le suivi de molécules présentant des propriétés fluorescentes, cette technique est exposée dans l’article de Moerner W.E. publié en 2015 dans la revue Rev. Mod. Phys., 2015, 87, 1183-1212. Le terme « microscopie de super-résolution » s’adresse plus particulièrement à deux techniques qualifiées pour l’une de « déplétion par émission simultanée » (de l’anglais : « stimulated emission depletion », connu sous l’acronyme STED) et pour l’autre de « microscopie de reconstruction optique stochastique » (de l’anglais : « stochastic optical reconstruction microscopy », connu sous l’acronyme STORM).
D’autre part, les transporteurs vésiculaires du glutamate - de tels transporteurs sont qualifiés de VGLUTs - sont des protéines situées sur la membrane des vésicules présynaptiques localisées au niveau de certaines des synapses neuroniques des mammifères, par exemple au niveau des synapses des rongeurs tels que les souris, et plus particulièrement de certaines synapses neuroniques humaines. Les transporteurs vésiculaires assurent le remplissage des vésicules par le glutamate et sont parmi les principaux acteurs de la transmission glutamatergique, c'est-à-dire qu’ils figurent parmi les acteurs principaux permettant la reconstitution du stock de neurotransmetteurs dans les vésicules présynaptiques. Trois sous-types de VGLUTs sont à distinguer et sont respectivement désignés par les acronymes : VGLUT1 , VGLUT2 et VGLUT3. En raison de la concentration élevée du glutamate dans le cytosol (1 -10 mM), ces transporteurs possèdent des affinités faibles pour le glutamate (Km = 1 -5 mM). Ces faibles affinités sont cependant associées à une grande sélectivité permettant à ces transporteurs la translocation spécifique du glutamate par rapport aux acides aminés structurellement similaires comme l’aspartate ou la glutamine. Les VGLUTs sont des marqueurs spécifiques du système glutamatergique et leur seule présence sur la membrane d’une vésicule confirme, de façon certaine, le phénotype glutamatergique, comme cela est décrit par Takamori, S. et al dans l’article publié dans Nature, 2000, 407 (6801 ), 189-194. Le transporteur VGLUT1 est une protéine également connue sous l’appellation BNPi, qui est l’acronyme anglais pour « brain-specific Na(+)-dependent inorganic phosphate cotransporter», et qui signifie « cotransporteur de phosphate inorganique Na(+)- dépendant spécifique au cerveau». Il a été le premier des trois sous classes à avoir été identifié. Le VGLUT 1 est absent de certaines régions glutamatergiques du cerveau comme le thalamus ou le tronc cérébral, comme cela est décrit dans l’article de Ni, B. et al. J Neurosci, 1995, 15, 5789-5799. Le transporteur VGLUT1 est abondant au niveau des synapses excitatrices et serait impliqué dans le remplissage des vésicules de façon dépendante du gradient électrochimique de proton ; le VGLUT1 est en outre impliqué dans le transport du glutamate selon des études réalisées par Bellocchio, E. E. et al., détaillée dans Science, 2000, 289, 957-960, ainsi que par Takamori, S. et al., dans Nature, 2000, 407 (6801), 189-194.
En parallèle, le transporteur VGLUT2, qui est une protéine également connue sous l’appellation DNPi, qui est l’acronyme anglais pour « differentiation-associated Na+- dependent inorganic phosphate transporter », et qui signifie « transporteur de phosphate inorganique (Pi) dépendant de Na+ et associé à la différenciation », a été découvert plus récemment. Cette protéine qui appartient donc à la famille des transporteurs Na+/Pi présente 82% d’homologie avec l’isoforme VGLUT1 , comme cela est décrit dans par Aihara, Y. et al., dans l’article publié dans J. Neurochem., 2000, 74 (6), 2622-2625.
Le troisième transporteur VGLUT3, a été notamment mis au jour par Gras, C., El Mestikawy, S et al., lesquels ont décrit ce troisième transporteur vésiculaire du glutamate exprimé par les neurones cholinergiques et sérotoninergiques et publiés leurs résultats dans J. Neurosci., 2002, 22 (13), 5442-5451. Cette nouvelle isoforme VGLUT3, partage 72% d’homologie avec VGLUT1 et 75% avec VGLUT2. En termes de biodistribution dans les organismes des mammifères dits supérieurs, et en particulier dans l’organisme humain, le sous-type VGLUT3 a une expression moins importante que les sous-types 1 et 2, comme cela est écrit dans l’article de Herzog, E. et al., qui a été publié dans Neuroscience, 2004, 123 (4), 983-1002. La présence de VGLUT3 a notamment été identifiée dans certains types spécifiques de neurones tels que dans les couches l-lll et V-VI du cortex cérébral, les couches corticales I, V et VI du striatum, le noyau médian et latéral de l’habenula, et l’hippocampe.
L’étude de ces transporteurs transmembranaires, tout comme le suivi des mécanismes de relargage des ions et/ou des petites molécules, en particulier les neurotransmetteurs tels que le glutamate ou l’acétylcholine, impliquées dans les mécanismes biologiques mis en œuvre au niveau des synapses, peut être réalisé par immunofluorescence comme cela est décrit dans l’article d’Amilhon B. et al., publié dans Med.Sci., 2008, 24, 1009-1011 , ou dans l’article de Edwards, R. H. et al., publié dans Trends Neurosci, 2004, voi.27 N°2, 98-103. Dans ce cadre, la technique d’immunofluorescence est notamment basée sur la reconnaissance d’antigènes spécifiques à la surface des transporteurs transmembranaires, tels que les VGLUTs, et requiert la présence d’un anticorps primaire, d’un anticorps secondaire et d’un fluorophore pour chaque protéine d’intérêt (ici il s’agit en particulier de l’un des transporteurs de type VGLUTs). De tels anticorps modifiés sont des molécules de plusieurs dizaines, voire plusieurs centaines de kiloDaltons (kDa), ce qui entraîne un fort encombrement à la surface des vésicules que l’on cherche à observer et il est par conséquent difficile d’attribuer à une protéine d’intérêt en particulier les points lumineux - lesquels points sont usuellement qualifiés de « spot » - observés selon les techniques d’imagerie par microscopie de superrésolution précitées.
Il existe donc un intérêt à développer et utiliser des ligands fluorescents spécifiques des VGLUT permettant de s’affranchir de l’utilisation d’anticorps et ainsi de visualiser directement les transporteurs vésiculaires - grâce à leur taille bien inférieure à celle des complexes d’anticorps primaire et secondaire - ou sur des systèmes biologiques non fixés (vivant). Carrigan, C. N. et al., décrivent dans J. Med. Chem., 2002, 45, 2260- 2276, la mise en œuvre de dérivés de quinoline identifiés comme étant des inhibiteurs potentiels du relargage du glutamate par les VGLUTs ; il existe cependant un besoin de développer de nouvelles molécules reconnues par les récepteurs des VGLUTs et qui montrent plus particulièrement une forte affinité pour VGLUT3.
EXPOSE DE L’INVENTION
La présente invention a donc pour but de proposer des nouveaux ligands des transporteurs vésiculaires du glutamate VGLUTs comme outil pour l’étude de la transmission glutamatergique, notamment des transporteurs VGLUT3, ainsi que leur application thérapeutique et pour la mise en œuvre de techniques de diagnostic. L’invention a comme objet également des nouveaux ligands des transporteurs VGLUTs comportant des groupements fluorescents compatibles avec des études de microscopie en super-résolution.
À cette fin, l’invention propose un composé de formule développée : dans lequel :
- A représente un hétérocycle à 6 atomes fusionné au noyau phényle et choisi parmi les hétérocycles de formule (II) ou (III) :
- Ri représente indépendamment un atome d’hydrogène, un groupement alkyle en [Ci à Ce] ou un groupement cycloalkyl en [Ce à Ce] ;
- R2 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou d’halogène ;
- R3 représente indépendamment un atome d’hydrogène, ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle, un alcoxy (alkyloxy) en [Ci à Ce], un amino, un alkylamino en [Ci à Ce] ;
- R4 représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un hydrogène, un hydroxyle, un alcoxy en [Ci à Ce], un alkylamino en [Ci à Ce] et un dialkylamino comportant des radicaux alkyles en [Ci à Ce] ;
- Q représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un groupement alcényle (tel qu’un alcène comportant un hydrogène sur chaque carbone), alcynyle, azo, amide, un groupe monocyclique sans hétéroatome, un groupe monocyclique avec au moins un hétéroatome, un groupe polycyclique sans hétéroatome, un groupe polycyclique avec au moins un hétéroatome, un monoaryle, un polyaryle, un hétéroaryle, lesdits groupements étant substitués par au moins un substituant Rs;
- Rs représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un aryle, un diphényle, un hétéroaryle ledit groupement Rs pouvant être substitué par au moins un groupement Re;
- Re représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un hydrogène, un halogène, un alkyle en [Ci à Ce], un hydroxyle, un alkoxy, un groupe amino, un alkylamino, un dialkylamino, un groupe nitrile, un groupe nitro, un groupe sulfhydryle (thiol), un groupe sulfure (-S-), un groupe sulfone (-SO2- ; dont acide sulfonique -SO3H) ; ou dans lequel Re représente indépendamment un substituant correspondant à un deuxième composé de formule (I) comportant un hétérocycle de formule II ou III, ledit deuxième composé de formule (I) étant substitué par les mêmes atomes ou groupements choisis pour Ri, R2, R3, R4, Q et Rs du premier composé de formule (I), les substituants Rs de chaque composé de formule (I) se substituant entre eux pour relier les deux composés de formule (I) ;
Ri ne représentant pas un atome d’hydrogène :
- lorsque A représente un hétérocycle de formule (II) et Q représente un groupement -0=0- ou -N=N-, substitué par un groupement Rs aryle substitué avec un Re alcoxy ou alkylamino ;
- ou lorsque A représente un hétérocycle de formule (III) et Q représente un groupement -N=N- ou phényle.
Les inventeurs ont démontré de manière tout à fait inattendue que les composés listés précédemment dans le cadre de l’invention ont une capacité à se lier de façon spécifique aux VGLUTs, grâce à la mise en œuvre de test de recapture vésiculaire, en réalisant plus particulièrement des tests sur des cellules « BON » transfectées surexprimant ou non le transporteur vésiculaire de glutamate VGLUT3. Une lignée cellulaire « BON » qualifie des cellules dérivées d’un carcinome pancréatique humain ; l’article de Ramet L. et al., publié dans J Neurosci, 2017, 37(15), 4181 -4199, décrit de telles cellules et leur utilisation pour la caractérisation de transporteurs de type VGLUT.
Les inventeurs ont également démontré que les inhibiteurs spécifiques de références de type bleu trypan bloquent également la fixation des nouveaux ligands. Dans ce cadre, il a aussi été démontré que l'ajout de KOI sur les cellules induit une chute du marquage vésiculaire des cellules BON surexprimant VGLUT3 suggérant de possibles propriétés de faux neurotransmetteurs fluorescents (FFN). De tels résultats montrent le potentiel d’application évident de ces molécules pour le suivi en temps réel du trafic vésiculaire sur des systèmes vivants.
Enfin, les inventeurs ont également démontré que les propriétés fluorescentes des nouveaux ligands de l’invention permettent le marquage, ainsi que l’observation par microscopie de super-résolution des cellules et des tissus comportant des transporteurs VGLUT.
Dans un mode de réalisation, le composé de l’invention comporte un hétérocycle de formule (II) et correspond à un dérivé de la coumarine, dans lequel :
- Ri représente indépendamment un atome d’hydrogène, un groupement alkyle en [Ci à Ce], tel qu’un méthyle ou un éthyle, ou un groupement cyclo alkyle [C3 à Ce; - R2 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou d’halogène ;
- R3 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle et un alcoxy (alkyloxy) en [Ci à Ce], un amino, ou un alkylamino en [Ci à Ce] ;
- R4 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou un groupement, OMe, -OH, -NHMe, -N(Me)2, -NHEt ou -N(Et)2 ;
- Q représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un groupement triazole, hétéroaryle, dyphenyle, -C=C-, -C=C-, -N=N-, - C(O)-NH, lesdits groupements étant substitués par au moins un substituant Rs ;
- Rs représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un aryle, un diphényle, ou un hétéroaryle, ledit groupement Rs pouvant être le cas échéant, substitué par au moins un groupement Re;
- Re représente indépendamment un atome d’hydrogène ou d’halogène, ou l’un des groupements sélectionnés parmi un alkyle en [Ci à Ce], un hydroxyle, un alkoxy, un groupe amino, un alkylamino, un dialkylamino, un groupe nitrile, un groupe nitro, un groupe sulfhydryle (thiol), un groupe sulfure (-S-), un groupe sulfone (-SO2- ; dont acide sulfonique -SO3H) ;
Ri ne représentant pas un atome d’hydrogène :
- lorsque A représente un hétérocycle de formule (II) et Q représente un groupement -C=C- ou -N=N- substitué par un groupement Rs aryle substitué avec un R6 alcoxyou alkylamino ;
Selon un autre mode de réalisation, le composé de l’invention comporte un hétérocycle de formule (II) et correspond à un dérivé de la coumarine, dans lequel :
- Ri est un hydrogène ou un groupement méthyl ou éthyle ;
- R2 et R3 sont des hydrogènes
- Q représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un groupe un groupe alcynyle et groupe triazole substitué par Rs
- R4 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle, un dléthylamino, un méthoxy ; et
- Rs est un diphényle substitué par un groupe Re étant un groupe -NH2.
Selon un mode de réalisation préféré, le composé de l’invention est sélectionné parmi les molécules suivantes :
Selon un autre mode de réalisation, le composé de l’invention comporte un hétérocycle de formule (II) et correspond à un dérivé de la coumarine, dans lequel : - Ri représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un méthyl et un éthyle ;
- R2 est un atome d’hydrogène ;
- R3 et R4 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle, un méthoxy et un éthoxy ;
- Q représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un groupe alcényle et un groupe azo ; et
- Rs représente indépendamment un phényl para-substitué par un halogène et o/ï/?o-substitué par un groupement Re.
Selon un autre mode de réalisation, le composé de l’invention comporte un hétérocycle de formule (II) et correspondent à un dérivé de la coumarine, dans lequel :
- Ri représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un méthyl et un éthyle ;
- R2 est un atome d’hydrogène ;
- R3 et R4 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle, un méthoxy et un éthoxy ;
- Q représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un groupe alcényle et un groupe azo ;
- Rs représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un phényle para-substitué par un brome un phényle para-substitué par un brome et ort/io-substitué par un méthoxy.
Dans un mode de réalisation, le composé dérivé de la coumarine selon l’invention est sélectionné parmi les molécules suivantes : de formule (X) dans laquelle :
- Ri représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un méthyl et un éthyle ;
- R4 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle, un méthoxy et un éthoxy ; et
- Re représente un atome d’hydrogène ;
Dans un mode de réalisation, le composé dérivé de la coumarine selon l’invention est sélectionné parmi les molécules suivantes : de formule (XI) dans laquelle :
-Ri représente indépendamment un atome d’hydrogène, ou un groupement méthyle ou éthyle,
- R3 représente indépendamment un atome d’hydrogène, ou un méthoxy et un éthoxy ;
- R4 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle, un méthoxy et un éthoxy ;
- Re en ortho du groupement azo représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un méthoxy et un éthoxy ; et
- Re en para du groupement azo représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un hydrogène et un halogène (X), de préférence X=Br, et dans lequel mode de réalisation Ri représente de préférence un hydrogène.
Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le composé de l’invention comporte un hétérocycle de formule (III) et correspond à un dérivé de la quinoléine, dans lequel :
- Ri représente indépendamment un atome d’hydrogène, un groupement alkyle en [Ci à Ce] ou un groupement cyclo alkyle [Ci à Ce] ;
- R2 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou d’halogène ;
- R3 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle et un alcoxy(alkyloxy) en [Ci à Ce], un amino, ou un alkylamino en [Ci à Ce] ;
- R4 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou un groupement, OMe, -OH, -NHMe, -N(Me)2, -NHEt ou -N(Et)2 ;
- Q représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un groupement triazole, hétéroaryle, dyphenyle, -C=C-, -C=C-, -N=N-, - C(O)-NH, lesdits groupements étant substitués par au moins un substituant Rs ;
- Rs représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un aryle, un diphényle, ou un hétéroaryle, ledit groupement Rs pouvant être le cas échéant, substitué par au moins un groupement Re;
- Re représente indépendamment un atome d’hydrogène ou d’halogène, ou l’un des groupements sélectionnés parmi un alkyle en [Ci à Ce], un hydroxyle, un alkoxy, un groupe amino , un alkylamino, un dialkylamino, un groupe nitrile, un groupe nitro, un groupe sulfhydryle (thiol), un groupe sulfure (-S-), un groupe sulfone (-SO2- ; dont acide sulfonique -SO3H) ; ou dans lequel R6 représente un substituant correspondant à un deuxième composé de formule (I) comportant un hétérocycle de formule III, ledit deuxième composé de formule (I) étant substitué par les mêmes atomes ou groupements choisis pour Ri, R2, R3, R4, Q et Rs du premier composé de formule (I), les substituants R5 de chaque composé de formule (I) se substituant entre eux pour relier les deux composés de formule (I) ;
Ri ne représentant pas un atome d’hydrogène :
- lorsque A représente un hétérocycle de formule (III) et Q représente un groupement -N=N- ou phényle.
Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le composé de l’invention comporte un hétérocycle de formule (III) et correspond à un dérivé de la quinoléine, dans lequel :
- Ri représente indépendamment un atome d’hydrogène, un groupement alkyle en [Ci à Ce] ou un groupement cyclo alkyle [Ci à Ce] ;
- R2 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou d’halogène ;
- R3 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle et un alcoxy(alkyloxy) en [Ci à Ce], un amino, ou un alkylamino en [Ci à Ce] ;
- R4 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou un groupement, OMe, -OH, -NHMe, -N(Me)2, -NHEt ou -N(Et)2 ;
- Q représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un groupement triazole, hétéroaryle, dyphenyle, -C=C-, -C=C-, -N=N-, - C(O)-NH, lesdits groupements étant substitués par au moins un substituant Rs ;
- Rs représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un aryle, un diphényle, ou un hétéroaryle, ledit groupement Rs pouvant être le cas échéant, substitué par au moins un groupement Re; - Re représente indépendamment un atome d’hydrogène ou d’halogène, ou l’un des groupements sélectionnés parmi un alkyle en [Ci à Ce], un hydroxyle, un alkoxy, un groupe amino , un alkylamino, un dialkylamino, un groupe nitrile, un groupe nitro, un groupe sulfhydryle (thiol), un groupe sulfure (-S-), un groupe sulfone (-SO2- ; dont acide sulfonique -SO3H) ; ou dans lequel;
Ri ne représentant pas un atome d’hydrogène :
- lorsque A représente un hétérocycle de formule (III) et Q représente un groupement -N=N- ou phényle.
Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le composé de l’invention comporte un hétérocycle de formule (III) et correspond à un dérivé de la quinoléine, dans lequel :
- Ri représente indépendamment un atome d’hydrogène, un groupement alkyle en [Ci à Ce] ou un groupement cyclo alkyle [Ci à Ce] ;
- R2 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou d’halogène ;
- R3 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle et un alcoxy(alkyloxy) en [Ci à Ce], un amino, ou un alkylamino en [Ci à Ce] ;
- R4 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou un groupement, OMe, -OH, -NHMe, -N(Me)2, -NHEt ou -N(Et)2 ;
- Q représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un groupement triazole, hétéroaryle, dyphenyle, -C=C-, -C=C-, -N=N-, - C(O)-NH, lesdits groupements étant substitués par au moins un substituant Rs ;
- Rs représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un aryle, un diphényle, ou un hétéroaryle, ledit groupement Rs pouvant être le cas échéant, substitué par au moins un groupement Re;
- Re représente indépendamment un substituant correspondant à un deuxième composé de formule (I) comportant un hétérocycle de formule III, ledit deuxième composé de formule (I) étant substitué par les mêmes atomes ou groupements choisis pour Ri, R2, R3, R4, Q et Rs du premier composé de formule (I), les substituants R5 de chaque composé de formule (I) se substituant entre eux pour relier les deux composés de formule (I) ;
Ri ne représentant pas un atome d’hydrogène :
- lorsque A représente un hétérocycle de formule (III) et Q représente un groupement -N=N- ou phényle. Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le composé de l’invention comporte un hétérocycle de formule (III) et correspond à un dérivé de la quinoléine, dans lequel :
-Ri représente indépendamment un atome d’hydrogène, ou un groupement méthyle ou éthyle,
-R2, R3, et R4 sont des atomes d’hydrogène ;
-Q est un groupement phényle substitué par un groupement Rs phenyle.
De préférence, le composé dérivé de quinoléine selon l’invention est choisi parmi les molécules suivantes :
Le terme « dérivé de la coumarine » au sens de l’invention désigne toute molécule comportant un squelette coumarine selon la formule (XIII) : Le terme « dérivé de la quinoléine » au sens de l’invention désigne toute molécule comportant un squelette coumarine selon la formule (XIV) :
Par alkyle, on entend un radical monovalent hydrocarboné saturé, linéaire ou ramifié. Par un groupement alkyle en [Ci à Ce] on entend un radical alkyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone tel que méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, isobutyle, sec-butyle et tertbutyle, pentyle et hexyle.
Par alkylène, on entend un radical bivalent hydrocarboné saturé, linéaire ou ramifié.
Par alcoxy, on entend un radical 0-alkyle.
Par dialkylamino, on entend un radical amino substitué par deux radicaux alkyles, lesquels pouvant être identiques ou différents.
L’invention concerne également l’utilisation de l’un des composés selon l’invention, ou de l’un de ses sels, en tant que sonde fluorophore in vitro ou ex-vivo. Avantageusement, les composés de l’invention sont utilisés comme sonde fluorophore dans un milieu biologique tel qu’une culture cellulaire ou un tissu cellulaire.
Dans un mode de réalisation préféré, l’un des composés selon l’invention, ou de l’un de ses sels, est utilisé en tant que fluorophore pour l’étude d’au moins un transporteur vésiculaire du glutamate VGLUT. Par exemple, le transporteur vésiculaire du glutamate est VGLUT3.
Les sels des composés selon l'invention sont préparés selon des techniques bien connues de I ‘homme de l’art et comprennent ceux avec des acides minéraux ou organiques qui permettent une séparation ou une cristallisation convenable des composés, ainsi que des sels pharmaceutiquement acceptables. Par « pharmaceutiquement acceptable » on entend ce qui est utile dans la préparation d'une composition pharmaceutique qui est généralement sûr, non toxique et ni biologiquement ni autrement non souhaitable et qui est acceptable pour une utilisation vétérinaire de même que pharmaceutique humaine. De tels sels comprennent :
(1 ) les sels d'addition d'acide formés avec des acides minéraux tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide nitrique, l'acide phosphorique et similaires ; ou formés avec des acides organiques tels que l'acide acétique, l'acide benzène-sulfonique, l'acide benzoïque, l'acide camphre-sulfonique, l'acide citrique, l'acide éthane- sulfonique, l'acide fumarique, l'acide glucoheptonique, l'acide gluconique, l'acide glutamique, l'acide glycolique, l'acide hydroxynaphtoïque, l'acide 2- hydroxyéthanesulfonique, l'acide lactique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide mandélique, l'acide méthanesulfonique, l'acide muconique, l'acide 2- naphtalènesulfonique, l'acide propionique, l'acide salicylique, l'acide succinique, l'acide dibenzoyl-L-tartrique, l'acide tartrique, l'acide p- toluènesulfonique, l'acide triméthylacétique, l'acide trifluoroacétique et similaires ; ou
(2) les sels formés lorsqu'un proton acide présent dans le composé parent soit est remplacé par un ion métallique, par exemple un ion de métal alcalin, un ion de métal alcalino-terreux ou un ion d'aluminium ; soit se coordonne avec une base organique ou inorganique. Les bases organiques acceptables comprennent la diéthanolamine, l'éthanolamine, N- méthylglucamine, la triéthanolamine, la trométhamine et similaires. Les bases inorganiques acceptables comprennent l'hydroxyde d'aluminium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de potassium, le carbonate de sodium et l'hydroxyde de sodium.
Dans un autre aspect, l’invention concerne l’utilisation d’une substance dérivée de la coumarine comportant un squelette coumarine selon la formule (XIII) : ou d’une substance dérivée de la quinoléine comportant un squelette quinoléine selon la formule (XIV) pour la mise en œuvre d’une méthode de diagnostic in vitro ou ex-vivo d’au moins une pathologie sélectionnée parmi une maladie neurologique de préférence une maladie psychiatrique.
Selon un mode de réalisation, la substance consiste en l’un des composés dérivés de la coumarine ou de la quinoléine de l’invention dans une formulation pharmaceutique acceptable.
Selon un mode de réalisation, la méthode de diagnostic met en œuvre une technique d’imagerie de fluorescence réalisée par microscopie de super-résolution.
Dans un autre aspect, l’invention concerne une substance dérivée de la coumarine comportant un squelette coumarine selon la formule (XIII) : ou substance dérivée de la quinoléine comportant un squelette quinoléine selon la formule (III) pour son utilisation pour la mise en œuvre d’une méthode de diagnostic in vivo d’au moins une pathologie sélectionnée parmi une maladie neurologique ou une maladie psychiatrique. De préférence, ladite substance consiste en l’un des composés dérivés de la coumarine ou de la quinoléine selon l’invention ou l’un de ses sels dans une formulation pharmaceutique acceptable. Par exemple, ladite méthode de diagnostic met en œuvre une technique d’imagerie de fluorescence réalisée par microscopie de super-résolution.
Dans un autre aspect, l’invention concerne une composition pharmaceutique pour la thérapie ou l’imagerie par fluorescence d’une maladie sélectionnée parmi au moins une maladie neurologique et au moins une maladie psychiatrique, comprenant au moins un composé selon l’invention ou un mélange de ceux-ci. Par exemple, les maladies neurodégénératives, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, l’épilepsie, l'atrophie corticale postérieure ou encore la sclérose latérale amyotrophique.
L’invention concerne également un complexe comportant une protéine d’une cellule animale ou humaine, ladite cellule étant isolée du corps dudit animal ou dudit humain, lié à au moins un composé selon l’invention. Ladite protéine correspond par exemple à un transporteur cellulaire, c’est à dire une protéine de la membrane cellulaire ou du cytoplasme ou du noyau cellulaire ou d’organite cellulaire (i.e. endosome, vésicule), et qui se lie spécifiquement à l’un des composés de l’invention, induisant une réponse cellulaire à ce composé. Par exemple, le complexe comporte une protéine cellulaire correspondant à un transporteur du glutamate VGLUT, ou des récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR), des récepteurs-canaux du glutamate ou encore récepteurs ionotropiques du glutamate (iGluR) et tels que des récepteurs NMDA, kaïnate et de préférence AMPA. Selon un mode de réalisation, le complexe récepteur - composé est isolé de la cellule animale ou humaine.
L’invention concerne également l’utilisation dudit complexe protéine- composé dans une méthode de criblage moléculaire.
L’invention concerne également un kit comportant :
- un composé dérivé de la coumarine ou de la quinoléine selon l’invention,
-un composé de référence se liant audit transporteur VGLUT, et optionnellement
- des cellules exprimant un transporteur vésiculaire de glutamate VGLUT, tel que des cellules BON transfectées exprimant un transporteur VGLUT de type VGLUT1 , VGLUT2 et/ou VGLUT3.
Par un composé de référence on entend un ligand connu d’au moins l’un des transporteurs VGLUTs et ayant une activité connue ou affinité connue, tel que l’inhibiteur dit « LSP5-2157 » comportant la formule suivante :
Ou le composé inhibiteur dit « brilliant yellow » comportant la formule suivante : L’invention concerne également une méthode de quantification des transporteurs vésiculaires de glutamate VGLUTs, comportant les actions suivantes :
- le marquage des cellules à analyser avec l’un des composés dérivés de la coumarine ou de la quinoléine selon l’invention pour former un complexe d’étude, ledit composé comportant une fluorescence intrinsèque et/ou comportant au moins un marquage radioactif ou fluorescent ;
- l’observation et quantification d’un marquage des cellules par mesure d’une intensité de fluorescence et/ou de radioactivité dudit complexe ;
- la détermination d’une présence ou d’une concentration de transporteurs VGLUTs en fonction de ladite intensité de marquage mesurée.
De préférence, ladite méthode comporte également :
- la préincubation des cellules à analyser avec un inhibiteur de référence se liant audit transporteur VGLUT ; et
- la détermination d’une diminution ou absence de marquage desdites cellules par ladite étape de préincubation, ladite diminution de marquage ou absence de marquage confirmant la sélectivité du marquage pour ledit transporteur VGLUT.
L’invention propose également une méthode de détermination d’un degré d’affinité d’un composé dérivé de la coumarine ou d’un composé dérive de la quinoléine pour un transporteur vésiculaire du glutamate VGLUT, et comportant :
- la formation d’un complexe de référence par incubation des cellules exprimant un transporteur VGLUT avec un composé de référence présentant une affinité connue pour ledit transporteur VGLUT et avec un composé à analyser comportant une fluorescence intrinsèque ou marqué par un marquage fluorescent ou radioactif, par exemple le composé de référence est le LSP5-2187 ou le brilliant yellow ;
- la formation d’un complexe d’étude comportant des cellules exprimant un récepteur vésiculaire VGLUT avec ledit composé à analyser ;
- la mesure de la fluorescence ou de la radioactivité du complexe de référence et du complexe d’étude ;
- la détermination d’un degré d’affinité dudit composé à analyser en fonction d’un différentiel de fluorescence ou radioactivité mesurée entre le complexe d’étude et le complexe de référence.
Enfin, l’invention propose également une méthode de détermination d’un degré d’affinité d’un composé cible pour un transporteur vésiculaire du glutamate VGLUT, et comportant :
- la formation d’un complexe de référence par incubation des cellules exprimant un transporteur VGLUT avec un composé cible à analyser, et l’un des composés selon l’invention comportant une fluorescence intrinsèque et/ou marqué par un marquage fluorescent ou radioactif, et
-la formation d’un complexe d’étude comportant des cellules exprimant un transporteur vésiculaire VGLUT avec ledit composé cible ;
- mesure de la fluorescence ou de la radioactivité du complexe de référence et du complexe d’étude ; - détermination d’un degré d’affinité dudit composé cible en fonction d’un différentiel de marquage fluorescent ou radioactif mesuré entre le complexe d’étude et le complexe de référence.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 illustre les spectres d’absorption et d’émission d’un composé selon l’invention.
La Figure 2 illustre l’observation et la quantification des cellules BON VGLUT3 au microscope confocal suite à son marquage avec des exemples de composés fluorescents selon l’invention, et l’inhibition du signal fluorescent par le LSP5-2127.
La Figure 3 illustre un deuxième exemple d’observation et de quantification des cellules BON VGLUT3 au microscope confocal suite à son marquage avec des exemples de composés fluorescents selon l’invention.
La Figure 4 illustre l’effet sur le marquage des cellules BON VGLUT3 par des exemples de composés fluorescents de l’invention en fonction de sa forme ester ou acide.
La Figure 5 illustre la quantification de fluorescence des tranches de striatum après incubation en présence des exemples de composés fluorescents de l’invention.
La Figure 6 illustre l’observation de vésicules synaptiques isolées en présence d’un des composés fluorescents de l’invention.
La Figure 7 illustre un marquage vésiculaire glutamatergique par un marquage double par immunohistochimie et par un composé fluorescent selon l’invention.
DESCRIPTION DETAILLEE
La présente invention a comme objet de fournir des nouveaux ligands des transporteurs transmembranaires, et notamment des VGLUTs « transporteurs vésiculaires du glutamate », et de manière préférentielle de VGLUT3. En particulier, l’invention vise à fournir des ligands de VGLUTs comportant une affinité supérieure aux VGLUTs que celle du glutamate et/ou permettant d’inhiber le transport du glutamate.
L’inhibition du transport de glutamate par les ligands de l’invention est très avantageuse en ce qu’elle permet son utilisation comme modulateur de la transmission glutamatergique et son application thérapeutique dans des maladies ou affections comme l’ischémie et l’addition. En effet, l’inhibition du relargage de glutamate par les composés de l’invention permettrait de diminuer les dommages collatéraux, par exemple lors d’un accident vasculaire.
En particulier, les composés de l’invention se lient aux VGLUTs grâce à un motif chimique analogue à celui du Glu, ils sont ainsi capables de fixer des transporteurs fonctionnels, permettant avantageusement d’étudier des modèles plus intégrés et vivants. Par exemple, ils permettent le marquage directe ou indirecte des VGLUTs pour l’étude et suivi des processus synaptiques, ainsi que pour la mise en œuvre de méthodes de diagnostic des maladies dégénératives ou psychiatriques in vivo, in vitro, ou ex-vivo. En effet, les ligands de l’invention vont permettre d’identifier les zones du cerveau exprimant des VGLUTs ainsi que leur niveau d’expression, ce qui permet d’identifier et suivre l’évolution des maladies dégénératives comme la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, l'atrophie corticale postérieure ou encore la sclérose latérale amyotrophique.
Dans un mode de réalisation préféré, l’invention propose d’utiliser une propriété fluorescente intrinsèque des composés de l’invention pour la mise en œuvre des études du système glutamatergique et le criblage des nouvelles molécules au moyen de techniques de microscopie en résolution ou par quantification de l’intensité de fluorescence.
Avantageusement, les composés de l’invention sont directement fluorescents et présentent une très faible taille, ce qui représente un atout majeur par rapport à la technique du marquage immunohistochimique. Par exemple, les composés de l’invention ont permis de marquer non seulement des cultures cellulaires, mais aussi les vésicules glutamatergiques présentes dans des tranches de striatum, un modèle vivant plus intègre que la culture cellulaire. Les vésicules glutamatergiques sont ainsi visualisées avec précision grâce à la microscopie de super-résolution et leur marquage au moyen des composés de l’invention.
Les composés de l’invention sont également très avantageux en ce qu’ils sont compatibles avec un marquage immunohistochimique. En effet, les inventeurs ont démontré qu’un double marquage des vésicules synaptiques est possible en utilisant l’un des composés fluorescents de l’invention pour marquer l’un des VGLUTs et un marquage par immunohistochimie pour marquer un deuxième récepteur cible.
Les composés de l’invention peuvent être également marqués par des groupements fluorescents supplémentaires, ou par un marquage radioactif pour leur mise en œuvre dans des études du système glutamatergique, des méthodes de diagnostic et le criblage des nouvelles molécules. Par exemple par un marquage au fluor-18 ou au tritium (3H) par des techniques connues par l’homme du métier, en outre celles décrites par Dr. Deng, X et al dans l’article publié dans Angenwandte Chemie International Edition 2019, 58, 2580-2605 et par Bozkurt, M et al dans l’article publié dans Eur J Nucl Med Mol Imaging (2017) 44 :1588-1601.
Enfin, l’invention concerne également un kit et une méthode pour l’identification des transporteurs VGLUTs, ainsi que pour la détermination d’un degré d’affinité des nouvelles molécules pour lesdits VGLUTs.
Les composés de l’invention correspondent à des dérivés de la quinoléine et de la coumarine. A titre d’exemples illustratifs de l’invention, les composés dans le tableau 1 ont été synthétisés.
Tableau 1 - Liste de composés selon l’invention et en référence aux figures.
Un récapitulatif des différents composés synthétisés dans le cadre de la présente invention, ainsi que de sa synthèse sont données en dernière partie de la description.
I. PARTIE EXPERIMENTALE
Dans le cadre de la présente invention les composés de l’invention sont référés indistinctement comme « composés fluorescents », ou « ligands >> et « ligands fluorescents » par rapport à son affinité pour les transporteurs VGLUTs.
1.1 Détermination de l’affinité pour les VGLUTs
Tel qu’il a été déjà mentionné, les inventeurs ont démontré de manière tout à fait inattendue que les composés listés précédemment dans le cadre de l’invention ont une capacité à se lier de façon spécifique aux VGLUTs, grâce à la mise en œuvre du test de recapture vésiculaire. La ECso a également été déterminée pour plusieurs des composés de l’invention. La méthodologie et les résultats de ces essais sont présentés ci-après.
Test de recapture vésiculaire
La recapture vésiculaire de glutamate a été testé comme décrit précédemment (Kish et Ueda, 1989 ; Naito et Ueda, 1985 ; Pietrancosta et al., 2010) avec des modifications mineures. Des aliquotes de vésicules synaptiques des cellules « BON >> transfectées surexprimant ou non le transporteur vésiculaire de glutamate VGLUT3 (obtenues par centrifugation différentielle de cortex de rat) ont été diluées dans une solution contenant 4 mM HEPES-KOH, pH 7,4 et 0,32M de saccharose. Les composés testés ont été dissous dans de l'éthanol à 1 %, du DMSO à 1 % (le pH a été ajusté à 7,4 avec du KOH 5%) jusqu'aux concentrations initiales comprises entre 2mM et 200pM. Les composés ont ensuite été dilués à des concentrations finales souhaitées dans une solution contenant 10 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 0.32 M sucrose, 4 mM KOI, 4 mM MgSO4 (nommée TPU). Les composés testés ont été pré-incubés dans une solution contenant 3 mM d'ATP-Mg, 1 mM d'acide L-aspartique, 100 pM de glutamate et 0,4 mM d'azote et 0,4 pM [3H]-Glutamate (1 ,547TBq/mmol). Après 4 min à 37 °C, la réaction de recapture a été initiée par l'addition de vésicules synaptiques de rat. Ce mélange a été incubé 10 min à 37 °C avant d'ajouter du TPU glacé (3,5 mL) et de le filtrer rapidement à travers un filtre à membrane (0,45 pM, 0,5 pM, Millipore MF référence HAWP02500) en utilisant un collecteur sous vide. Les filtres ont été lavés cinq fois avec 3,5 mL de TPU froid et placés dans des fioles à scintillation avec un cocktail de scintillation (optiphase hisafe 3, référence 1200-437, Perkin Elmer). La radioactivité liée aux filtres a été mesurée dans un spectrophomètre à scintillation Beckman LS 6500. Les valeurs obtenues en l'absence d'ATP-Mg ou en présence de Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP, 50 pM référence Sigma C2759) ont été utilisées pour déterminer l'activité non spécifique.
Comme il ressort du tableau 2 et du tableau 3, l’ensemble des composés sont capables d’inhiber, au moins partiellement le transport vésiculaire du glutamate, démontrant ainsi leur affinité supérieure vis-à-vis des récepteurs VGLUT’s. D’après leur ECso, les composés LSP17-1124 et LSP17-1173, et le LSP17-1125 et LSP17-1126 sont très avantageux en ce qu’ils sont effectifs à une très faible concentration.
Enfin, les composés présentant les plus hauts pourcentages d’inhibition sont des candidats préférés pour l’étude de l’activité des VGLUTs, et le marquage des vésicules glutamatergiques.
L’ensemble des composés restent toutefois d’intérêt pour d’autres applications tel que le criblage des nouveaux ligands des VGLUTs et des applications thérapeutiques et de diagnostic.
Tableau 2-Résultats composés dérivés de la coumarine selon l’invention.
Tableau 3 Résultats composés dérivés de la quinoléine selon l’invention l.ll Détermination des propriétés de fluorescence des composés de l’invention
Les propriétés physico-chimiques de chaque ligand ont été déterminées grâce à la fluorimétrie. Pour chaque composé, une gamme de dilution a été effectuée et les mesures ont été prises à 1 mM, 316 pM, 100 pM, 31 ,6 pM, 10 pM, 3 ,16 pM et 1 pM. Dans des microplaques de fluorescence à 96 puits, les spectres d’absorbance et d’émission des ligands ont pu être déterminés à chaque concentration grâce à un spectrophotomètre de plaque (Tecan). Les spectres d’absorbance sont d’abord mesurés pour chaque composé de façon à déterminer la longueur d’onde maximale d’absorption (Àmaxabs). Les spectres de fluorescence, ou d’émission, sont ensuite déterminés après excitation de chaque composé à sa Àmaxabs, permettant ainsi d’obtenir la longueur d’onde maximale de fluorescence (Àrnaxem). Différents paramètres propres à chacun des composés ont été déterminés :
Le déplacement de Stokes : il correspond à la différence entre le pic du spectre d’absorption et le pic du spectre de fluorescence, soit : Àrnaxem - Àmaxabs
Le coefficient d’absorption molaire (s) : il reflète la capacité des solutions à absorber la lumière et est déterminé par la formule 8= A/(C./)(A : densité optique à la Àmaxabs, C : concentration du composé, / : constante correspondante à la longueur du trajet optique). £ est exprimé en L.cm’1.mol’1.
- Le rendement quantique ($>) : il représente le rapport du nombre de photons émis sur le nombre de photons absorbés par le composé, soit la « probabilité » pour qu'une molécule excitée émette un photon. Il prend une valeur entre 0 et 1 , 0 correspondant à une molécule non fluorescente et 1 signifiant qu’il n’y a aucune désexcitation. Sa valeur est déterminée grâce à la formule ci-après où Abs : densité optique à la Àmaxabs, AUC : aire sous la courbe du spectre de fluorescence, n : indice de réfraction du milieu. Dans cette formule, « m » fait référence à la molécule étudiée, et « r >> à un fluorophore de référence. du spectre de fluorescence, n : indice de réfraction du milieu). Dans cette formule, « m » fait référence à la molécule étudiée, et « r >> à un fluorophore de référence.
La détermination de £ et <t> nécessite l’utilisation d’une molécule fluorescente de référence pour laquelle ces deux paramètres sont connus. À cause de son motif fluorescent de type coumarine, donc proche de ceux des composés étudiés, la coumarine-343 (£=44300 L.cm-1.mol-1 et $>=0,63 dans l’éthanol) a été utilisée comme fluorophore de référence. Ces deux paramètres ont été recalculés dans le milieu de dilution des composés (DMSO), et ont servi de référence dans le calcul de chaque ligand. Afin d’étudier l’effet d’une variation de pH sur l’intensité de fluorescence des composés, les mesures des spectres d’absorption et d’émission ont été réalisées dans trois milieux de dilution différents :
• DMSO : diméthylsulfoxyde pur
• Tampon phosphate pH 7,2 (0,2 M)
• Tampon phosphate pH 5,5 (0,2 M)
La figure 1 illustre les spectres d’absorption et d’émission du composé référencé L8, un acide carboxylique de la famille des quinoléines. C’est un exemple de l’étude réalisée sur chacun des fluorophores étudiés. Les valeurs graphiques déterminées grâce à ces spectres sont la Àmaxabs, la Àmaxem et le déplacement de Stokes dans chaque milieu. Les spectres d’émission révèlent des intensités de fluorescence très importantes. Les puits les plus dilués sont préférés pour voir le pic d’émission du composé.
Les résultats obtenus graphiquement grâce aux spectres d’excitation et d’émission et par le calcul via les propriétés de la coumarine 343 sont regroupés dans le Tableau 2 ci- dessous.
Tableau 2 : Propriétés physico-chimiques des composés fluorescents de l’invention
Le changement de pH induit un décalage du spectre pour certains fluorophores, une propriété très utile dans le marquage vésiculaire. En effet, les senseurs pH sensibles sont très utilisés dans le marquage vésiculaire, étant donné le changement de pH entre le milieu intra-vésiculaire et le cytoplasme. De plus, pour certains composés, même si le pic d’émission ne varie pas selon le tampon, l’intensité de fluorescence émise peut varier, ce qui est un autre paramètre jouant dans le développement de molécules pH sensibles.
LUI Activité sur cellule a) Culture des cellules BON et marquage aux ligands fluorescents de l’invention
Les expériences sont réalisées avec une lignée de cellule BON exprimant de façon stable VGLUT3 ou un VGLUT2 fluorescent « VGLUT2-venus ». Des cellules BON non transfectées sauvages (« wild-type », BON WT), sont utilisées comme contrôles. Les cellules sont cultivées dans un milieu F-12 Nutrient Mixture Ham (21765-029, Thermo Fisher Scientific) et Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium High Glucose (DMEM HG, 31966021 , Thermo Fisher Scientific ; vol ume/vol urne), complété avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF, 12483012, Thermo Fisher Scientific) et 1 % (volume/volume) d’un mélange de streptomycine (10mg/mL)/pénicilline (10000 U/mL) et 0,8 mg/mL de Généticine G418 sulfate (G418, 10131027, Thermo Fisher Scientific), dans un incubateur à 37°C sous 5% de CO2. Pour les clones ayant subi une transfection, le milieu est enrichi avec 0,8 mg/mL de Généticine G418 sulfate (G418, 10131027, Thermo Fisher Scientific).
Les cellules sont mises en culture dans des flasques de culture de 25 cm2. Lorsque les cellules sont à confluence, elles sont rincées avec du PBS 1 X stérile après aspiration du milieu, puis incubées cinq minutes à 37°C avec une solution de trypsine- EDTA (0,05% Trypsine EDTA, 25300054, Thermo Fisher Scientific). Le tapis cellulaire est alors décollé et les cellules dissociées les unes des autres. Après addition de milieu, la suspension cellulaire est centrifugée 5 minutes à 300 g, puis le culot est dilué au 1 :3 afin d’être remis en culture.
Deux jours avant chaque expérience, après trypsination des cellules d’une flasque de culture, la suspension cellulaire est ensemencée à 150 000 cellules/puits, dans des plaques de douze puits sur des lamelles de verre de 19 mm de diamètre. Pour l’observation, ces lamelles sont placées dans une chambre permettant une fixation hermétique de la lamelle dans le milieu d’observation, Fluorobrite™ DMEM (A1896701 , Thermo Fisher Scientific), un milieu transparent.
Avant chaque observation, les cellules sont incubées à 37°C en présence de ligands fluorescents, aux concentrations déterminées préalablement. L’effet d’un prétraitement des cellules BON avec un inhibiteur spécifique de VGLUTs, la substance LSP5-2157, est également effectué pour étudier l’effet inhibiteur de cette substance sur le marquage des cellules BON avec les ligands fluorescents de l’invention.
Les cellules sont observées en temps réel au microscope confocal inversé, avec un objectif 63x dans une chambre thermostatée à 37°C (Leica TCS SP5 ; plateforme d’imagerie cellulaire de l’institut de Biologie Paris-Seine). Les molécules fluorescentes étudiées émettant dans le bleu, les cellules sont excitées à 405 nm.
La figure 2 illustre l’observation et la quantification des cellules BON au microscope confocal, et l’inhibition du signal fluorescent par un prétraitement des cellules avec l’inhibiteur spécifique de VGLUTs, le LSP5-2157. Les parties A,B,E,F,I,J,M et N montrent : Des cellules sauvages (BON WT) ou exprimant VGLUT3 (BON VGLUT3) incubées avec différents ligands fluorescents, B09 en A-D, CO7 en E-H, L8 en l-L, G02 en M-P. A,E,I et M. Un marquage faible et homogène est détecté dans le cytoplasme des cellules des cellules BON WT. B, F, J et N : Après traitement par les ligands fluorescents pendant une heure à 37°C, un marquage punctiforme apparaît dans le cytoplasme des cellules BON VGLUT3. C,G,K et O : La pré-incubation avec le LSP5 diminue significativement le marquage fluorescent. Les images sont présentées en négatif. D,H,L et P : Quantification de l’effet du traitement. Différentes acquisitions de cellules sont réalisées au microscope confocal. L’intensité de fluorescence augmente de façon significative dans les cellules BON VGLUT3 (n=20,21 , 40 et 35 pour B09, C07, L8 et G02) par rapport aux cellules BON WT (n=29, 44, 45, 21 ). Le prétraitement par le LSP5 (n=32, 23, 28, 15) diminue l’intensité de fluorescence pour les ligands B09, L8 et G02. En revanche, pour le ligand C07, les valeurs mesurées dans les cellules BON VGLUT3 avec ou sans prétraitement par le LSP5 ne diffèrent pas de façon significative. Analyse statistique : Test de Kruskal-Wallis suivi du test post-hoc de Dunn, NS : non significatif, * p<0,01 ; ***p<0,0001.
La figure 3 illustre l’observation et quantification des cellules BON au microscope confocal. Des cellules sauvages (BON WT) ou exprimant VGLUT3 (BON VGLUT3) sont incubées avec différents ligands fluorescents références : L8, YL151 , D04, C07, C05, B09, G02, F11 . Après traitement par les ligands fluorescents pendant 20 minutes à 37°C, un marquage fluorescent est visible dans les cellules BON. L’effet du traitement est analysé en quantifiant l’intensité de fluorescence dans chaque type cellulaire. L’intensité du marquage augmente de façon significative dans les cellules BON VGLUT3 (n=42, 27, 41 , 36, 36, 46, 27, 44 et 35 pour L8, YL151 , D04, C07, 005, B09, G02 et F11 ) par rapport aux cellules BON WT (n=46, 34, 45, 47, 51 , 36, 43, 36). Analyse statistique : Test de Mann Whitney, NS : non significatif, ** p=0,0042 ; ***p<0,0001.
Comme observé sur les figures 2 et 3, tous les composés testés montrent une augmentation significative du marquage fluorescent dans les cellules exprimant VGLUT3, soulignant leur spécificité pour VGLUT3. Selon les composés, l’intensité de fluorescence des cellules exprimant VGLUT3 est très variable. Plusieurs facteurs sont à prendre en compte dans ces variations de fluorescence. Certains composés sont naturellement plus fluorescents que d’autres, ce qui peut par exemple être dû à la nature de leur motif fluorescent (quinoléine ou coumarine). Pour un même composé, le fait qu’il soit sous une forme ester ou un acide influe également sur l’intensité de marquage. b) Effet de la forme ester ou la forme carboxylique sur le marquaqe des cellules BON VGLUT3.
La figure 4 illustre la quantification de l’effet du traitement par les ligands selon leur forme acide ou ester. Pour un même composé, l’effet du traitement (1 h, 37°C) sous sa forme d’acide et d’ester est comparé à l’absence de traitement. Pour trois des quatre ligands testés, la forme ester induit une augmentation significative de fluorescence par rapport à la forme acide dans les cellules BON exprimant VGLUT3. Analyse statistique : test de Kruskal-Wallis suivi du test post-hoc de Dunn. NS : non significatif, ***:p<0,0001.
Les résultats montrent une augmentation significative du marquage lorsque le ligand est un ester pour trois des quatre composés étudiés. Cette augmentation significative pour les esters n’avait pas été observée au fluorimètre, ce qui signifie que cette fluorescence importante n’est pas une propriété intrinsèque des esters. Les acides ont une meilleure affinité pour les VGLUTs : ils présentent des EC50 plus basses d’après les mesures en uptake vésiculaire. La forme acide des composés correspond à une forme hydrophile, alors que les esters sont hydrophobes. Ce phénomène est déjà décrit pour certains marqueurs fluorescents (notamment la Calcéine) : la forme hydrophobe permet au composé de traverser la membrane plasmique. La molécule est ensuite clivée par les esterases intracellulaires, qui produisent la forme hydrophile, soit l’acide correspondant. Cette forme possède une affinité supérieure pour le transporteur, ce qui explique l’augmentation significative de fluorescence en présence des esters. Cette augmentation est donc le reflet d’une pénétration supérieure du composé.
I.IV Tranches de striatum et marquage aux ligands fluorescents de l’invention
La compatibilité des composés fluorescents de l’invention a été déterminée dans des tranches de cerveau des nouveaux-nés souriceux, un modèle d’étude plus intègre que la culture cellulaire.
Des souriceaux âgés de 4 à 7 jours sont décapités. Les cerveaux sont prélevés puis placés dans du Milieu neurobasal™-A (10888022, ThermoFisher Scientific) enrichi avec 2% de B-27™ Plus (A3582801 , ThermoFisher Scientific) et 1 % (volume/volume) d’un mélange de streptomycine (10 mg/mL)/pénicilline (10 000 U/mL). Les cerveaux sont coupés en tranches de 500 pm d’épaisseur sont (Tissue Chopper McIlwain, modèle TC752) puis dissociées les unes des autres. Les tranches correspondant au striatum sont sélectionnées et incubées une heure dans le milieu en présence de 25pM de ligand fluorescent, ou sans molécule fluorescente pour les contrôles. Des incubations en présence ou en l’absence de l’inhibiteur de référence des VGLUT ont été réalisées. Cet inhibiteur est la molécule LSP5-17 étant capable de déplacer la fixation des ligands en culture cellulaire.
Les tranches de cerveau ont été incubées en présence de chacun des composés selon l’invention D04, C07, C05, B09, L8, YL151 , G02, F11 (Voir correspondances de références au tableau 1 ). La figure 4 illustre la quantification de fluorescence des tranches de striatum après incubation en présence de composés fluorescents de l’invention. Les tranches sont incubées 1 h à 37°C en présence de 25pM de composé. Des acquisitions ont été réalisées au microscope confocal (objectif x5) et l’intensité de fluorescence moyenne pour chaque tranche a été quantifiée. Les formes acide ou ester du composé étudié ont été comparées avec des tranches contrôles incubées dans du milieu sans ligand. Analyse statistique : test de Kruskal-Wallis suivi d’un test post-hoc de Dunn. Ns : non significatif,* :p<0,1 ** :p<0,001 ,*** :p<0,0001.
La figure 5 montre la compatibilité des composés fluorescents de l’invention avec le modèle de tranche. Tous les composés de forme ester présentent un marquage significativement plus élevé que les tranches contrôles. De façon logique, certains acides qui permettaient un marquage fluorescent significatif sur cellule BON ne montrent ici aucune augmentation de fluorescence par rapport aux tranches contrôles. En effet, le caractère perméant des composés précédemment étudié (Figure 3) est ici un facteur prédominant. La perméabilité du modèle de tranches est bien moins importante que celle de cellules in vitro. Par conséquent, les composés hydrophobes sont nettement plus efficaces lorsqu’on utilise ce modèle. De façon surprenante, il n’y a aucune différence significative entre les composés G02 et F11 , comme c’était le cas en culture de cellules BON. Il est donc possible d’utiliser indifféremment l’un ou l’autre de ces composés. En revanche, pour tous les autres ligands, la forme ester induit une augmentation de fluorescence plus significative que la forme acide. Ces manipulations tendent donc à privilégier l’utilisation des composés C07, B09, YL151 , G02 et F11 dans le modèle de tranche.
I.V Microscopie de super-résolution
Observation de vésicules synaptiques isolées
Au vu des résultats préliminaires obtenus, les vésicules synaptiques isolées sont un modèle de choix dans la détermination de la répartition des transporteurs VAChT et VGLUT3 au niveau vésiculaire. L’écueil majeur dans l’utilisation de ce modèle est l’absence de protocole d’utilisation et de résultats quant à leur compatibilité avec la microscopie de super-résolution. Dans un premier temps, l’observabilité d’un marquage fluorescent dans les vésicules a été testée, ainsi que l’effet de la microscopie de super-résolution STED sur ce modèle.
Les différentes manipulations ont été réalisées sur des vésicules synaptiques de rat ou de souris, provenant du striatum ou du cortex.
Matériel et méthodes De manière similaire aux tests de recapture vésiculaire, les composés fluorescents à étudier sont dilués dans du tampon de sucrose (TPS 0,32 M) de façon à obtenir 10pM de composé dans le milieu final d’observation. Les vésicules ont été diluées dans du tampon sucrose (TPS), puis observées dans un tampon de transport (avec de l’ATP à 3 mM et de l’Aspartate à 1 mM ) à 5 pg de vésicules par pL de milieu. En présence d’ATP, l’ajout du TPS contenant les vésicules déclenche l’activité des transporteurs vésiculaires et donc la recapture du composé fluorescent présent dans le milieu. L’écueil principal étant la flottabilité des vésicules dans le milieu qui pourrait les rendre inobservables, les observations ont été effectuées sur des plaques Ibidi dont les lamelles ont un revêtement de polymère qui les rend adhérentes.
Des vésicules synaptiques de cortex de rat isolées sont ensuite incubées en présence d’ATP et du ligand fluorescent G02 à 37°C puis sont observées en microscopie confocale ainsi qu’en microscopie de super- résolution (STED). Afin de s’assurer que le marquage observé correspond bien aux ligands fluorescents accumulés à la surface ou à l’intérieur des vésicules, des puits contrôles ont été analysés. Aucun signal fluorescent n’est détecté dans des puits ne contenant que des vésicules isolées (sans ligand fluorescent), ou que le composé fluorescent (sans vésicules). Ces données suggèrent que le composé ne précipite pas dans le milieu d’observation et ne crée pas d’artefacts sur les résultats obtenus.
Résultats : La figure 6 montre un premier résultat essentiel et prometteur quant à l’utilisation des vésicules synaptiques comme modèle d’étude (Analyse statistique : Mann-Whitney : ***p<0,0001 ). En effet, il apparaît que des vésicules synaptiques fluorescentes peuvent être observées, sans traitement préalable des lamelles et sans dénaturer les vésicules. De plus, l’effet STED est observé sur ces vésicules isolées : la taille des spots observés diminue significativement après l’application du laser de déplétion. Il est d’ailleurs important de souligner qu’après déconvolution et mesure de la taille des spots, ces derniers mesurent environ 50 nm, ce qui correspond à la taille d’une vésicule synaptique. Les vésicules pourraient donc être observées de façon très isolées, sans précipiter et former des clusters.
Marquage vésiculaire glutamatergiques par ligand immunohistochimie et un ligand fluorescent selon l’invention
Des essais ont été effectués afin de vérifier la compatibilité des nouveaux ligands fluorescents de l’invention et un marquage par immunohistochimie. En effet, à terme, combiner un marquage de VAChT par immunohistochimie et de VGLUT3 par un ligand fluorescent permettrait d’obtenir davantage d’informations sur la répartition de ces transporteurs vésiculaires dans le striatum.
La figure 7 illustre le marquage vésiculaire glutamatergique par immunohistochimie et le ligand fluorescent référencé G02 selon l’invention. En particulier, Des vésicules synaptiques glutamatergiques isolées ont été doublement marquées par un immunomarquage de VGLUT1 (en rouge) et le ligand fluorescent G02 (en vert). Les observations ont été réalisées en microscopie confocale et STED. La figure 18 montre qu’il est possible d’immuno-marquer les vésicules synaptiques dans ces conditions, mais aussi que l’immunohistochimie est compatible avec l’utilisation des composés. Les spots obtenus sont nets et résolus, validant l’utilisation du STED dans le cadre de ces manipulations. Afin d’analyser plus précisément la colocalisation des spots, il semble plus approprié d’utiliser des concentrations de vésicules plus faibles et donc plus séparées.
Ce résultat préliminaire est prometteur quant à de futures manipulations sur la répartition de VAChT et VGLUT3 dans les interneurones cholinergiques striataux, et permet de valider une nouvelle utilisation des ligands fluorescents des VGLUTs.
Il SYNTHESE DES MOLECULES ET RECAPITULATIF DE COMPOSES SYNTHETISES ll.l Synthèse dérivé de la coumarine
4-substituté-2H-chromen-2-on
A une solution de résorcinol (3,747 g, 34 mmol, 1 équiv.) dans H2SO4 (50 mL) a été ajouté de l'acétoacétate d'éthyle (3,8 mL, 228 mmol, 1 ,2 équiv.). Le mélange a été agité pendant 1 h à 0 °C et a ensuite été versé dans de la glace pilée. Le solide a été filtré, lavé et précipité dans de l'éthanol frais pour obtenir le composé pur final sous forme de solide blanc (4,61 g, rendement de 77%) 141 b, 143b ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 10,49 (s, 1 H, OH), 7,59 (d, 1 H, J = 8,5 Hz, ArH), 6,80 (dd, 1 H, J = 2 Hz, 8. 5 Hz, CHCHCOH), 6.70 (d, 1 H, J = 2 Hz, HOCCHCO), 6.12 (s, 1 H, CHCOOC), 2.36 (s, 3 H, CH3) ; 13C RMN (125.78 MHz, DMSO-d6) 5C : 161.1 , 160. 2, 154.8, 153.5, 126.6, 112.81 , 111 .9, 110.2, 102.1 , 18.06 ; HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- : calculé, pour [CIOH?03]-, 175.0401 , trouvé 175.0393.
7-substituté-2-oxo-2H-chromene-3-i
R2 = H, OH, OMe, NEt2 R = Et (Malonate de diéthyle), R2 = H, OH, OMe, NEt; R = 'Pr (Acide de Meldrum) R' = H, Et
Procedure générale 1 : Synthèse de I’ Ethyl 7-substituté-2-oxo-2H-chromene-3- carboxylate
Un mélange de benzaldéhyde correspondant (1 mmol, 1 équiv.), de malonate de diéthyle (1 ,2 mmol, 1 ,2 équiv.), de quantité catalytique de pipéridine (10 mol%) et de quelques gouttes d'acide acétique glacial ont été ajoutés dans de l'éthanol absolu (1 ,2 mL). La réaction a été portée à reflux pendant 16 h. Le précipité formé a été filtré, lavé avec de l'éthanol, séché et trituré dans de l'EtOH pour donner le 2-oxo-2H- chromène-3-carboxylate d'éthyle 7-substitué pur en rendement indiqué.
Procedure générale 2: 7-substituté-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylique acide
Une solution d’Ethyl 2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (1 mmol) et de NaOH (37 mmol) dans de l'éthanol (1 ,5 mL) a été portée à reflux pendant 16 h. Après refroidissement, le mélange réactionnel a été évaporé à sec. Le résidu a été dissous dans l'eau et acidifié avec de l'acide chlorhydrique dilué (pH = 1 - 2). Le précipité a été filtré, séché et trituré dans l'éthanol pour donner le produit pur acide 2-oxo-2H- chromène-3-carboxylique 7-substitué en rendement indiqué carboxylique.
Ethyl 2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (249)
C12H10O4 PM = 218.21 g. mol'1
Le produit désiré a été obtenu sous forme d'un solide blanc (12,72 g, rendement de 48%) à partir de 2-hydroxy-benzaldéhyde (15 g, 122,8 mmol, 1 équiv.), de malonate de diéthyle (147 mmol, 1 ,2 équiv.), d'une quantité catalytique de pipéridine (13 mmol, 10 mol%) dissoute dans 150 mL d'éthanol absolu selon la Procédure Générale 1. 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.76 (s, 1 H, CHCCO2Et), 7.93 (dd, 1 H, J = 1.6 Hz, 7.6 Hz ArH), 7.74 (m, 1 H, ArH), 7. 43 (d, 1 H, J = 8,5 Hz, ArH), 7.43 (td, 1 H, J = 7,5 Hz, J = 1 Hz, ArH), 4.30 (q, 2 H, J = 7 Hz, CH2CH3), 1 . 31 (t, 3 H, J = 7 Hz, CH2CH3) ; 13C NMR (125.78 MHz, DMSO-d6) 5C : 162.6, 155.9, 154.5, 148.6, 134.4, 130.2, 124. 8, 117.8, 117.7, 116.1 , 61.2, 14.0 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [CI2HIIO4]+, 219.0652, trouvé 219.0641.
2-oxo-2H-chromene-3-carboxylique acide (54) C10H6O4 PM= 190.15 g. mor
Le produit désiré a été obtenu sous forme de blanc (9,83 g, rendement de 89%) à partir de 2-oxo-2H-chromène-3-carboxylate d'éthyle (12,72 g, 58,3 mmol), NaOH (2,16 mol, 37 équiv.) dissous dans 90 mL d'éthanol selon la procédure générale 2. 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.16 (s, 1 H, CHCCO2H), 7.76 (dd, 1 H, J = 1.5 Hz, 7.5 Hz ArH), 7.66 (m, 1 H, ArH), 7.44 (d, 1 H, J = 8.2 Hz, ArH), 7. 40 (td, 1 H, J = 7,5 Hz, J = 1 Hz, ArH) ; 13C RMN (125,78 MHz, CDCI3) 5C : 162,5, 157,6, 153,4, 141 ,4, 132,5, 128,9, 125,2, 124,8, 118,4, 116,2.
Ethyl 7-hydroxy-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (88)
C12H10O5 PM = 234.20 g. mol- 1
Le produit désiré a été obtenu en rendement quantitatif sous forme d'un solide ambré à partir de 2,4-dihydroxy-benzaldéhyde (1 ,38 g, 10 mmol) selon la procédure générale 1 . 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 11 .06 (br, 1 H, OH), 8.67 (s, 1 H, CHCCO2Et), 7.75 (d, 1 H, J = 8.5 Hz, ArH), 6.84 (dd, 1 H, J = 2. 5 Hz, 8,5 Hz ArH), 6,73 (d, 1 H, J = 8,5 Hz, CHCOH), 4,26 (q, 2 H, J = 7 Hz, CH2CH3), 1 ,29 (t, 3 H, J = 7 Hz, CH2CH3). 13C NMR (125.78 MHz, CDCI3) 5C : 164.0, 162.9, 157.1 , 156.4, 149.4, 132.1 , 113.9, 112.1 , 110.4, 101 .8, 60.8, 14.1 . HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- : calculé pour [C12H9O5]-, 233.0455, trouvé 233.0447.
Ethyl 7-hydroxy-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (52)
CIOH605 PM = 206. 15 g.mo/-1
Le produit souhaité a été obtenu sous la forme d'un solide ambre (1 ,2 g, rendement de 46%) à partir du 7-hydroxy-2-oxo-2H-chromène-3-carboxylate d'éthyle (3 g, 12,81 mmol) selon la procédure générale 2 ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 8,68 (s, 1 H, CHCCO2H), 7. 74 (d, 1 H, J = 8,5 Hz, ArH), 6,85 (dd, 1 H, J = 2,5 Hz, 8,5 Hz, ArH), 6,74 (d, 1 H, J = 2,5 Hz, J = 1 Hz, CHCOH). 13C NMR (125.78 MHz, CDCI3) 5C : 164.2, 163.9, 157.6, 156.9, 149.3, 132.0, 113.9, 112.5, 110.6, 101 .8. HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- : calculé, pour [C10H5O5]-, 205.0142, trouvé 205.0142.
Ethyl 7-(diethylamino)-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (250)
C16H19NO4 PM = 289.33 g. mol'1
Le produit désiré a été obtenu sous forme de solide jaune (13,38 g, rendement de 73%) à partir de 4-(diéthylamino)-2-hydroxybenzaldéhyde (12,24 g, 63. 34 mmol) selon la Procédure Générale 1 ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.54 (s, 1 H, CHCCO2Et), 7.62 (d, 1 H, J = 8.5 Hz, ArH), 6.77 (dd, 1 H, J = 2.5 Hz, 9.0 Hz, ArH), 6. 53 (d, 1 H, J = 2.0 Hz, ArH), 4.23 (q, 2 H, J = 7.5 Hz, CH2CH3), 3.48 (q, 4 H, J = 7.5 Hz, NCH2CH3), 1.28 (t, 3 H, J = 7.5 Hz, CH2CH3), 1.14 (t, 3 H, J = 7. 5 Hz, NCH2CH3) ; 13C NMR (125.78 MHz, DMS0-d6) 5C : 163.3, 157.9, 156.9, 152.7, 149.1 , 131.7, 109.7, 107.4, 106.9, 95.8, 60.3, 44.3, 14.2 (x2), 12.3 (x2). HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [CieH2oN04]+, 290.1387, trouvé 290.1376.
7-(diethylamino)-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylique acide (56)
C16H19NO4 PM= 261.27 g.mol'1
Le produit souhaité a été obtenu sous la forme d'un solide jaune (2,25 g, rendement de 20%) à partir du 7-(diéthylamino)-2-oxo-2H-chromène-3-carboxylate d'éthyle (10,12 g, 38,77 mmol) selon la procédure générale 2 ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 12,48 (br, 1 H, COOH), 8,59 (s, 1 H, CHCCOOH), 7,64 (d, 1 H, J = 9 Hz, ArH), 6. 79 (dd, 1 H, J = 2.5 Hz, 9.0 Hz, ArH), 6.57 (d, 1 H, J = 2.5 Hz, ArH), 3.49 (q, 4 H, J = 7.0 Hz, NCH2CH3), 1.14 (t, 6 H, J = 7. 5 Hz, NCH2CH3) ; 13C NMR (125.78 MHz, CDCI3) 5C : 164.4, 159.5, 157.9, 152.9, 149.4, 131.6, 110.0, 107.3, 107.1 , 95.9, 44.4 (x2), 12.3 (x2).
6-iodo-7-substituté-coumarine
La 6-iodo-7-substituté-2-oxo-2 H-chromene-3-carboxylique acide a été synthétisée selon le schéma général suivant :
Procédure générale 1 : Synthèse of Ethyl 6-iodo-7-substituté-2-oxo-2H- chromene-3-carboxylate
A une solution de dérivés de 2-hydroxybenzaldéhyde 7-substitués (1 mmol, 1 équiv.) et de malonate de diéthyle (1 ,2 équiv.) dans de l'éthanol absolu (1 ,2 mL), on a ajouté une quantité catalytique de pipéridine (10 mol%) et quelques gouttes d'acide acétique glacial. Le mélange réactionnel a été porté à reflux pendant 16 h. Le précipité formé a été filtré, lavé avec de l'éthanol, séché et précipité dans EtOH pour donner le 6-iodo-7-substitué-2-oxo-2H-chromène-3-carboxylate d'éthyle.
2-hydroxy-5-iodobenzaldehyde (251 ) C7H5IO2 PM = 248.02 g. mol'1
A une solution de 2-hydroxybenzaldéhyde (20 g, 164 mmol, 1 équiv.) dans AcOH (140 mL) a été ajouté ICI (29,4 g, 181 mmol, 1 ,1 équiv.). Le mélange a ensuite été agité pendant 16 h à 40 °C. Ensuite, la réaction brute a été extraite avec Et2Û (3x 200 mL) et une solution saturée de Na2S2Û3. La couche organique a été concentrée sous vide et précipitée dans Et2Û/pentane pour obtenir le produit pur final sous forme de solide blanc (10,1 g, rendement de 37 %) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 10. 92 (s, 1 H, OH), 10.16 (s, 1 H, CHO), 7.88 (d, 1 H, J = 2.5 Hz, ArH), 7.78 (dd, 1 H, J = 2.5 Hz, 8.5 Hz ArH), 6.85 (d, 1 H, J = 8.5 Hz, CHCOH). 13C NMR (125,78 MHz, DMSO-d6) 5C : 189,7, 160,3, 144,1 , 136,7, 124,58, 120,1 , 81 ,4.
Ethyl 6-iodo-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (76) l^^^^ ,COOEt LU ^^0^0
C12H9IO4 PM = 344. 10 g. mol'1
Le produit souhaité a été obtenu sous la forme d'un solide blanc (4 g, rendement de 72%) à partir de 2-hydroxy-5-iodobenzaldéhyde (10 g, 40,3 mmol) selon la procédure générale 1 ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8,16 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8,25 (d, 1 H, J = 2,2 Hz, ArH), 7,94 (dd, 1 H, J = 2,2 Hz, 8,7 Hz, ArH), 7. 20 (d, 1 H, J = 8.7 Hz, ArH), 4.24 (q, 2 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3), 1.24 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3) ; 13C RMN (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 162.3, 155. 5, 154.1 , 147.2, 142.2, 138.0, 120.0, 118.5, 118.4, 88.3, 61 .3, 14.0 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C12H9IO4], 344.9613, trouvé 344.9629
6-iodo-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylique acide (63)
C10H5IO4 PM = 316.05 g. mol'1
Le produit souhaité a été obtenu sous la forme d'un solide blanc (3,5 g, rendement de 93%) à partir du 6-iodo-2-oxo-2H-chromène-3-carboxylate d'éthyle (4,0 g, 11 ,62 mmol) selon la procédure générale 2 ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8,65 (s, 1 H, CHCCO2H), 8,29 (d, 1 H, J = 2,2 Hz, ArH), 7. 99 (dd, 1 H, J = 2.2, 8.7 Hz, ArH), 7.25 (d, 1 H, J = 8.7 Hz, ArH) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 163.8, 156.2, 154. 1 , 146.9, 142.1 , 138.0, 120.3, 119.4, 118.5, 88.4 ; HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- : calculé pour [C10H4IO4]-, 314.9152, trouvé 314.9160.
2-hydroxy-5-iodo-4-methoxybenzaldehyde (252) C8H7IO3 PM = 278.44 g. mol'1
A une solution de 2-hydroxy-4-méthoxy-benzaldéhyde (13,5 g, 89 mmol, 1 équiv.) dans AcOH (75 ml_) a été ajouté ICI (15,8 g, 98 mmol, 1 ,1 équiv.). Le mélange a ensuite été agité pendant 16 h à 40 °C. Ensuite, le brut a été concentré sous vide et précipité dans Et2Û/pentane pour obtenir le produit pur final sous forme de solide blanc (9,5 g, rendement de 49 %) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 11. 14 (s, 1 H, OH), 9.99 (s, 1 H, CHO), 8.00 (s, 1 H, CHCI), 6.57 (s, 1 H, CHCOH), 3.88 (s, 3 H, OCH3) ; 13C NMR (125.78 MHz, DMSO-d6) 5C : 189.5, 163.4, 163.2, 139.7, 118.1 , 99.9, 74.7, 56.8.
Ethyl 6-iodo-7-methoxy-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (68)
C13H11IO5 PM = 374. 13 g. mol'1
Le produit souhaité a été obtenu en rendement quantitatif sous la forme d'un solide blanc à partir de 2-hydroxy-5-iodobenzaldéhyde (9 g, 32 mmol) selon la procédure générale 1 ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.68 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8.36 (s, 1
H, CHCI), 7.13 (s, 1 H, CHCO), 4.28 (q, 2 H, J = 7. 1 Hz, CH2CH3), 3.96 (s, 3 H, OCH3),
I .30 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 162.6, 162.4, 157.0, 155. 9, 148.0, 139.6, 114.9, 113.4, 99.3, 81.9, 61.0, 57.6, 14.1 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé, pour [Ci3Hi2lOs]+, 374.9724, trouvé 374.9717.
6-iodo-7-methoxy-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylique acide (64)
C11H7IO5 PM = 346.07 g. mol'1
Une solution de 6-iodo-7-méthoxy-2-oxo-2H-chromène-3-carboxylate d'éthyle (1 ,47 g, 3,93 mmol) et de NaOH aq 10% (6 mL) dans de l'éthanol (6 mL) a été portée à reflux pendant 16 h. Après refroidissement, le mélange réactionnel a été évaporé à sec ; le résidu a été dissous dans de l'eau et acidifié avec de l'acide chlorhydrique dilué (pH 1 - 2). Le précipité a été filtré, séché et cristallisé à partir d'éthanol pour donner le composé désiré sous forme de solide blanc (1 ,3 g, rendement 96 %) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8,67 (s, 1 H, CHCCO2H), 8,36 (s, 1 H, CHCi), 7. 12 (s, 1 H, CHCO), 3.96 (s, 3 H, OCH3) ; 13C RMN (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 163.9 ; 162.2, 156.9, 156.6, 147.7, 139. 5, 114.6, 113.5, 99, 3, 81.8, 57.5 ; HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- : calculé, pour [CnHelOs]-, 344.9265, trouvé 344.9260.
7-(diethylamino)-6-iodo-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylique acide (65) C14H14INO4 PM = 346.07 g. mol'1
Un mélange d'acide éthyl 7-(diéthylamino)-2-oxo-2H-chromène-3-carboxylique (2.0 g, 7.65 mmol, 1 équiv.) dans EtOH (15 mL) et 382 mL de NaOHaq 5% a été refroidi à 0 °C. Ensuite, I2 (2,33 g, 9,19 mmol, 1 ,2 équiv.) dans une solution de Kl aq sat. Kl aq a été ajouté goutte à goutte et la réaction a été agitée pendant 2 heures. Ensuite, la réaction brute a été acidifiée avec HCl aq, concentrée dans le vide et extraite avec des portions de 150 ml d'Et20. La couche organique a été séchée sur MgSC puis concentrée sous vide pour obtenir le produit pur final sous forme de solide jaune (2,22 g, rendement de 75 %). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 13.08 (br, 1 H, COOH), 8.64 (s, 1 H, CHCCO2H), 8.40 (s, 1 H, CHCI), 7.11 (s, 1 H, CHCN), 3.19 (q, 4 H, J = 7 Hz, NCH2CH3), 1. 02 (t, 6 H, J = 7 Hz, NCH2CH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 163.9, 157.4, 156.80, 155.7, 147.5, 140.9, 115.3, 111.0, 109.8, 91.8, 46.2 (x2), 12.1 (x2).
4-(benzyloxy)-2-hydroxybenzaldehyde (72)
C14H12O3 PM= 228.08 g.mol-1
A une solution de 2,4-dihydroxybenzaldéhyde (9 g, 65,16 mmol, 1 équiv.), dans MeCN ( 660 mL) a été ajouté NaHCO3 (12,04 g, 143 mmol, 2,2 équiv.) et du bromure de benzyle (8,52 mL, 71 ,67 mmol, 1 ,1 équiv.). Le mélange a été agité sous reflux pendant 2 h. Le brut a ensuite été extrait avec de l'EtOAc (3x 200 mL). La couche organique a été concentrée sous vide et purifiée par chromatographie sur colonne de gel de silice (Cyclohexane/AcOEt 95:5 à 80:20). Le produit pur a été obtenu sous forme d'un solide blanc (15 g, rendement de 50 %) ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 11 .44 (s, 1 H, OH), 9.70 (s, 1 H, CHO), 7.42 (d, 1 H, J = 8.9 Hz, ArH), 7.39 (m, 5 H, ArH), 6.60 (dd, 1 H, J = 2.2 Hz, 8.5 Hz, ArH), 6.5 (d, 1 H, J = 2. 2 Hz, ArH), 5.01 (s, 2 H, CH2Ar) ; 13C RMN (125.78 MHz, CDCI3) 5C : 194.6, 166.1 , 164.7, 135.9, 135.5, 129.0 (x2), 128. 6, 127.8 (x2), 115.6, 109.2, 101.9, 70.6 ; HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- : calculé pour [C14H11O3]-, 227.0714, trouvé 227.0706.
4-(benzyloxy)-2-hydroxy-5-iodobenzaldehyde (71 )
C14H11IO3 PM = 354. 14 g.mol-1
Une solution de monochlorure d'iode (1 ,7 g, 10,52 mmol), dans de l'acide acétique glacial (5,3 mL) a été ajoutée goutte à goutte à une solution de 4-(benzyloxy)-2- hydroxybenzaldéhyde (2,0 g, 8,77 mmol), dans de l'acide acétique glacial (13 mL) sous agitation. On a laissé le mélange remuer à température ambiante pendant 2 h, puis la suspension résultante a été éliminée par filtration. Le résidu a été dissous avec de I'EtOAc, lavé avec une solution saturee de Na2S2Û3, séché sur MgSO4 et concentré dans le vide pour donner le composé sous forme d'un solide blanc (1.31 g, 60% de rendement) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 11.16 (br, 1 H, OH), 9.97 (s, 1 H, CHO), 8.03 (s, 1 H, CHCI), 7.50 (d, 2 H, J = 7.2 Hz, ArH), 7. 43 (t, 2 H, J = 7.6 Hz, ArH), 7.36 (t, 2 H, J = 7.3 Hz, ArH), 6.66 (s, 1 H, CHCO), 5.25 (s, 2 H, CH2Ar) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 189.4, 162.8, 162. 2, 139.6, 135.7, 128.3 (x2), 127.8, 127.0 (x2), 118.1 , 101.0, 75.0, 70.3 ; HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- : calculé pour [C14H10IO3]-, 352.9680, trouvé 352.9687.
2,4-dihydroxy-5-iodobenzaldehyde (69)
C7H5IO3 PM = 264.02 g. mol'1
A une solution de 71 , 4-(benzyloxy)-2-hydroxy-5-iodobenzaldéhyde (2,35 g, 6,63 mmol) dans du Dichloromethane (DCM) sec (85 mL) a été ajoutée goutte à goutte une solution de BBr3 (1 ,0 M dans DCM, 20 mL, 20 mmol) à -78 °C sous N2. Le mélange réactionnel a été agité à cette température pendant 2 h puis réchauffé à 0 °C (pendant 1 h), de l'eau a ensuite été ajoutée et le mélange réactionnel a été agité pendant une heure supplémentaire. La couche aqueuse a été extraite avec DCM ; les couches organiques combinées ont été lavées avec de la saumure, séchées sur MgSO4 et concentrées sous vide. Le résidu a été lavé avec du cyclohexane pour donner le composé désiré sous forme de solide beige (1 ,48 g, rendement 86%) ; 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 11 ,45 (br, 1 H, OH), 10,88 (br, 1 H, OH), 9,91 (s, 1 H, CHO), 7. 94 (s, 1 H, CHCI), 6.52 (s, 1 H, CHCO) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 188.7, 163.1 , 162.5, 139.9, 117.6, 102.0, 74.0 ; HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- : calculé pour [C7H4IO3]-, 262.9211 , trouvé 262.9214.
2-hydroxy-5-iodo-4-(methoxymethoxy)benzaldehyde (253)
C9H9IO4 PM = 308.07 g.mol'1
A un mélange de 2,4-dihydroxy-5-iodobenzaldéhyde (3 g, 14,22 mmol, 1 équiv.), K2CO3 (2 g, 14,7 mmol, 1 ,2 équiv.) chauffé à reflux sous argon (3x), on a ajouté de l'acétone (60 mL) et du chloro(méthoxy)méthane (1 ,1 mL, 13,65 mmol, 1 ,2 équiv.). Le mélange a été agité à 25 °C pendant 16 h. Puis l'acétone a été éliminée et le solide a été extrait avec H2O/AcOEt. Le produit a été obtenu sous forme de solide blanc après purification par chromatographie sur colonne de gel de silice avec [gradient de 9:1 à 7:3] Cyclohexane/AcOEt (2. 63 g, rendement de 60%) ; RMN 1 H (500 MHz, DMSO- d6) 5H : 11.04 (s, 1 H, OH), 9.98 (s, 1 H, CHO), 7.99 (s, 1 H, CHCI), 6.69 (s, 1 H, CHCO), 5.31 (s, 2 H, CH2O), 3.40 (s, 3 H, OCH3). 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 189.2, 162.5, 160.9, 139.5, 119.0, 102.5, 94.6, 75.4, 56.1. HR-MS (ESI, m/z) [M- H]- : calculé pour [CgHsIC ]-, 306.9473, trouvé 306.9463.
Ethyl 7-hydroxy-6-iodo-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (67)
C12H9IO5 PM = 360. 10 g.mol-1
Le produit souhaité a été obtenu sous la forme d'un solide beige (0,3 g, rendement de 15%) à partir de 2,4-dihydroxy-5-iodobenzaldéhyde (1 ,48 g, 5,6 mmol) selon la procédure générale 1 ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 11. 95 (br, 1 H, OH), 8.63 (s, 1 H, CHCCOEt), 8.31 (s, 1 H, CHCI), 6.79 (s, 1 H, CHCOH), 4.25(q, 2 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3), 1.27 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3). ethyl 6-iodo-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (207)
C14H13IO6 PM= 404. 15 g. mol-1
Le produit souhaité a été obtenu sous la forme d'un solide beige (2,1 g, rendement de 80 %) à partir de 2-hydroxy-5-iodo-4-(méthoxyméthoxy)benzaldéhyde (2,0 g, 6. 49 mmol) selon la Procédure Générale 1 ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.67 (s, 1 H, CHCCOEt), 8.40 (s, 1 H, CHCI), 7.14 (s, 1 H, CHCOH), 5.43 (s, 2 H, CH2O), 4. 28 (q, 2 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3), 3.43 (s, 3 H, OCH3), 1.30 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3) ; 13C RMN (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 162.5, 159.5, 156.3, 155. 7, 147.7, 139.8, 114.6, 114.1 , 101 ?5, 94.9, 82.6, 61.0, 56.3, 14.0 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [Ci4Hi4lO6]+, 404.9830, trouvé 404.9822.
6-azido-7-substituted-Coumarine:
L’ethyl 6-azido-7-substituted-2-oxo-2/-/-chromene-3-carboxylate a été synthétisé selon le schéma général suivant:
C12H9NO6 PM = 263.20 g.mol-1
A une solution de coumarine (5 g, 22.9 mmol) dans H2SO4 (95%, 9 mL) a été ajoutée goutte à goutte à température ambiante une solution d'acide nitrique (70%, 9 mL). Après 5 h, la réaction a été refroidie par addition d'eau, puis la suspension résultante a été éliminée par filtration. Le résidu a été séché pour donner le composé se présente (4.44 g, rendement 82%) sous la forme d’un solide jaune ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO- d6) 5H : 8.92 (m, 2 H, CHCCOzEt, CHCNO2), 8.50 (dd, 1 H, J = 2.8 Hz, 9.1 Hz, CHCNO2), 7.65 (d, 1 H, J = 9.1 Hz, CHCO), 4.32 (q, 2 H, J = 7. 1 Hz, CH2CH3), 1.32 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 162.1 , 158.0, 155.0, 147.6, 143.6, 128. 5, 126.0, 119.5, 118.2, 117.7, 61.5, 14.0 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [Ci2HioNOe]+, 264.0503, trouvé 264.0507.
Ethyl 6-amino-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (255)
C12H11NO4 PM = 233.22 g.mol-1
A une solution de coumarine (5 g, 22,9 mmol, 1 équiv.) dans un mélange de H2O-EtOH (1 :1 , 80 mL) a été ajoutée goutte à goutte une suspension de NH4CI (0,98 g, 18,3 mmol, 0,8 équiv.) et de Fe(0) (7,13 g, 127 mmol, 6 équiv.). Le mélange réactionnel a été porté à reflux pendant 1 heure. Après refroidissement, la suspension noire obtenue a été filtrée à travers un tampon de célite® et lavée avec une solution de THF/EtOH. Après évaporation sous vide, le résidu a été purifié par chromatographie flash sur gel de silice en éluant avec DCM/MeOH (9:1 ) pour donner une huile jaune (2. 25 g, rendement de 60%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.54 (s, 1 H, CHCCO2Et), 7.15 (d, 1 H, J = 8.9 Hz, CH CO), 6.99 (dd, 1 H, J = 2.7, 8.9 Hz, CHCNH2), 6.89 (d, 1 H, J = 2. 7 Hz, CHCNH2), 5.42 (br, 2 H, NH2), 4.27 (q, 2 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3), 1 .32 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 163.0, 156. 4, 148.5, 146.3, 145.7, 121.6, 118.1 , 117.5, 116.5, 11 1.1 , 61.0, 14.0 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [Ci2Hi2NO4]+, 234.0761 , trouvé 264.0562.
Ethyl 6-azido-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (83)
C12H9N3O4 PM = 259.22 g.mol-1
A une solution de coumarine (2,25 g, 9,65 mmol, 1 équiv.) dans HCl 17% (30 mL) a été ajoutée goutte à goutte à 0 °C une solution de NaNÛ2 (0,99 g, 14,48 mmol, 1 ,5 équiv.) dans l'eau (4,35 mL). Le mélange réactionnel a été agité à cette température pendant 30 minutes, puis une solution de NaNs (0,94 g, 14,48 mmol, 1 ,5 équiv.) dans l'eau (6,6 mL) a été ajoutée goutte à goutte. Le mélange réactionnel a été réchauffé à température ambiante et agité pendant 1 h supplémentaire. La suspension résultante a été filtrée puis séchée pour donner un solide brun (2,05 g, rendement de 82%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8,73 (s, 1 H, CHCCO2Et), 7,15 (d, 1 H, J = 7,74 Hz, CH CN), 7. 46 (m, 2 H, ArH), 4.30 (q, 2 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3), 1.31 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 162.4, 155.7, 151. 7, 147.7, 136.0, 125.3, 119.4, 118.7, 118.6, 117.8, 61.3, 14.0 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C12H9N3O4], 260.0666, trouvé 260.0667.
Ethyl 7-methoxy-6-nitro-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (258)
C13H11NO7 PM = 293.23 g.mol-1
A un mélange refroidi (0 °C) de H2SO4 concentré à 95% / acide nitrique à 70% (1 :1 , 25.76 mL) a été ajoutée en 30 minutes la coumarine (8 g, 32.44 mmol) sous forme solide. Le mélange réactionnel a ensuite été agité pendant 2 h à température ambiante puis refroidi par addition d'eau et la suspension résultante a été éliminée par filtration. Le résidu a été séché pour donner le composé se présentant (6,94 g, rendement de 73%) sous la forme d'un solide bronze ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8,80 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8,64 (s, 1 H, CHCNO2), 7,44 (s, 1 H, CHCOMe), 4,29 (q, 2 H, J = 7,1 Hz, CH2CH3), 4,03 (s, 3 H, OCH3), 1. 30 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3) ; 13C RMN (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 162.2, 158, 5, 156.8, 155.3, 148.1 , 136.2, 127. 7, 115.9, 110.6, 101.8, 61.2, 57.9, 14.0 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [CI3HI2NO7]+, 294.0608, trouvé 294.0603. ethyl 6-amino-7-methoxy-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (201)
C13H13NO5 PM= 263.25 g.mol-1
A une solution de coumarine (2,6 g, 8,85 mmol, 1 équiv.) dans un mélange de H2O- EtOH (1 :1 , 26 mL) a été ajoutée goutte à goutte une suspension de NH4CI (0,54 g, 10,18 mmol, 1 ,2 équiv.) et de Fe(0) (3,95 g, 70 mmol, 8 équiv.). Le mélange réactionnel a été porté à reflux pendant 1 heure. Après refroidissement, la suspension noire résultante a été filtrée à travers un tampon de célite® et lavée avec une solution de THF/EtOH. Après évaporation sous vide, le résidu a été purifié par chromatographie flash sur gel de silice éluant avec DCM/MeOH (9:1 ) pour donner une huile jaune (1 g, rendement 42%) ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 8.38 (s, 1 H, CHCCO2Et), 6.77 (s, 1 H, CHCNO2), 6. 74 (s, 1 H, CHCOMe), 4.32 (q, 2 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3), 3.93 (s, 3 H, OCH3), 1 .34 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3) ; 13C RMN (62. 9 MHz, CDCI3) 5C : 164.1 , 157.9, 153.8, 151.1 , 149.0, 134.4, 114.5, 111.7, 11 1.3, 98.7, 61.8, 56.5, 14.5. HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [Ci3Hi4NO5]+, 264.0866, trouvé 264.0861.
Ethyl 6-azido-7-methoxy-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (82) C13H11N3O5 PM = 289.24 g.mol-1
A une solution de coumarine (1 g, 3,80 mmol, 1 équiv.) dans HCI 17% (10 mL) a été ajoutée goutte à goutte à 0 °C une solution de NaNO2 (0,39 g, 5,70 mmol, 1 ,5 équiv.) dans l'eau (1 ,31 mL). Le mélange réactionnel a été agité à cette température pendant 30 minutes puis une solution de NaN3 (0,37 g, 5,79 mmol, 1 ,5 équiv.) dans l'eau (2,6 mL) a été ajoutée goutte à goutte. Le mélange réactionnel a été réchauffé à température ambiante et agité pendant 1 h supplémentaire. La suspension résultante a été filtrée puis séchée pour donner un solide de couleur bronze (0,65 g, rendement de 60%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8,70 (s, 1 H, CHCCO2Et), 7. 68 (s, 1 H, CH CN), 7.21 (s, 1 H, CHCOMe), 4.27 (q, 2 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3), 3.96 (s, 3 H, OCH3), 1.30 (t, 3 H, J = 7. 1 Hz, CH2CH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 162.5, 157.0, 155.9, 154.0, 148.3, 125.1 , 120.4, 114.2, 111.1 , 100.3, 60.9, 57.9, 57.0, 14.0.
Ethyl 7-(diethylamino)-6-nitro-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (197)
Ci6Hi8N2O6 PM = 334.32 g.mol-1
Le produit souhaité a été obtenu sous la forme d'un solide jaune (2,2 g, rendement de 60%) à partir de 4-(diéthylamino)-2-hydroxy-5-nitrobenzaldéhyde (1 ,11 g, 4. 66 mmol) selon la Procédure Générale 1 ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.68 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8.40 (s, 1 H, CHCNO2), 7.06 (s, 1 H, CHCOMe), 4.26 (q, 2 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3), 3. 30 (q, 4 H, J = 7.0 Hz, NCH2CH3), 1 .29 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3), 1.11 (t, 6 H, J = 7.0 Hz, NCH2CH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 162.7, 157.6, 155.9, 148. 6, 147.5, 136.9, 129.6, 113.2, 108.2, 108.3, 104.3, 61.1 , 45.9 (x2), 14.2, 12.2 (x2) ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [Ci6Hi9N2O4]+, 335.1238, trouvé 335.1242.
Ethyl 6-amino-7-(diethylamino)-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (189)
C16H20N2O4 PM = 304.34 g.mol'1
A une solution de coumarine (2,2 g, 6,58 mmol, 1 équiv.) dans un mélange de H2O- EtOH (1 :1 , 20 mL) a été ajoutée goutte à goutte une suspension de NH4CI (0,4 g, 7,57 mmol, 1 ,2 équiv.) et de Fe(0) (2,93 g, 52,67 mmol, 8 équiv.). Le mélange réactionnel a été porté à reflux pendant 1 heure. Après refroidissement, la suspension noire résultante a été filtrée à travers un tampon de célite® et lavée avec une solution de THF/EtOH. Après évaporation sous vide, le résidu a été purifié par chromatographie flash sur gel de silice en éluant avec Cyclohexane/EtOAc (8:2 à 6:4) pour donner un solide brun (1. 17 g, rendement 54%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.50 (s, 1 H, CHCCO2Et), 6.97 (s, 1 H, CHCNH2), 6.93 (s, 1 H, CHCO), 4.87 (s, 2 H, NH2), 4.25 (q, 2 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3), 3. 09 (q, 4 H, J = 7.1 Hz, NCH2CH3), 1 .29 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3), 0.97 (t, 6 H, J = 7.0 Hz, NCH2CH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMS0-d6) 5C : 163.2, 156.8, 148.5, 148. 3, 144.6, 140.7, 113.8, 112.9, 111.4, 108.0, 60.8, 44.2 (x2), 14.1 , 12.0 (x2) ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C16H21N2O4R, 305.1496, trouvé 305.1499.
6-azido-7-(diethylamino)-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylique acid (85)
C14H14N4O4 PM = 302.29 g.mol-1
A une solution de coumarine (1 ,40 g, 4,60 mmol, 1 équiv.) dans HCI 17% (12 mL) a été ajoutée goutte à goutte à 0 °C une solution de NaNC (0,476 g, 6,90 mmol, 1 ,5 équiv.) dans l'eau (1 ,0 mL). Le mélange réactionnel a été agité à cette température pendant 30 minutes, puis une solution de NaNs (0,448 g, 6,90 mmol, 1 ,5 équiv.) dans l'eau (2,14 mL) a été ajoutée goutte à goutte. Le mélange réactionnel a été réchauffé à température ambiante et agité pendant 1 h supplémentaire. La suspension résultante a été filtrée puis séchée pour donner un solide brun (0,3 g, rendement de 22%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8. 66 (s, 1 H, CHCCO2Et), 7.71 (s, 1 H, CHCN), 6.86 (s, 1 H, CHCO), 3.39 (q, 4 H, J = 6.9 Hz, CH2CH3), 0. 97 (t, 6 H, J = 7,0 Hz, NCH2CH3) ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C14H15N4O4]+, 303.1088, trouvé 303.1499.
Aryldiazenyl coumarines
(E)-8-((4-bromophenyl)diazenyl)-7-hydroxy-4-methyl-2H-chromen-2-one (157)
Ci6HiiBrN2C>3 PM = 359. 17 g. mol'1
La 4-bromoaniline (0,808 g, 4,70 mmol, 1 équiv.), NaNC (0,37 g, 6,27 mmol, 1 ,2 équiv.), et la 7-hydroxy-4-méthyl-2H-chromen-2-one (0,83 g, 4,70 mmol, 1 équiv.) ont été mélangé selon la procédure générale 3. La réaction brute a été filtrée puis purifiée par chromatographie sur colonne de gel de silice (cyclohexane/acétate d'éthyle 7:3) pour obtenir le produit désiré sous forme d'un solide rouge vif (0,28 g, rendement de 17%) 130a ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 13,21 (s, 1 H, OH), 7,97 (dd, J = 2 Hz, J = 7 Hz, 2 H, ArH), 7. 86 (m, 3 H, ArH), 7.05 (d, J = 9.5 Hz, 1 H, CHCOH), 6.35 (d, J = 1 Hz, 1 H, CHCCHs), 2.46 (d, , J = 1 Hz, 3 H, CH3) ; 13C NMR (125. 78 MHz, DMSO-d6) 5C : 159.3, 154.8, 153.6, 152.0, 149.3, 132.8 (x2), 130.7, 125.5, 125.3, 124.3 (x2), 114.3, 112.8, 111.4, 18.9.
Synthèse des dérivés ethyl 7-substitutés-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylique acides:
Les dérivés Ethyl (E)-ethyl 6-((4'-aminobiphenyl-4-yl)diazenyl)-7-substituted-2- oxo-2H-chromene-3-carboxylate ont été synthétisés selon la procédure suivante:
X = H, Br X = H, Br X = H, Br X = H, Br R1 = H, OMe Ra = H,OMe, OH, OMOM, R1 = H, OMe R1 = H, OMe
R3 = H, OMe Rb = H, OMe R2 = H,OMe,
OH -> O(CO)Ph <a> O(CO)Ph -> OH (b>
OMOM OMOM -> OH (c>
R3 = H, OMe R3 = H, OMe i: HCl (18 équiv.), NaNO2 (1.2 équiv.), EtOH/H2O (1 :1), 0 - 5 °C, 1 h ; ii: pH = 8 - 9, EtOH/H2O (1 :1), 0 - 5 °C, 2 h iii: malonate de diéthyle (1.2 équiv.), pipéridine (0.4 équiv.) EtOH, reflux, 6 h (d) ; iv: KOH (50 équiv.), Toluène, 25 °C, 16 h Procédure générale 3: formation des liaisons azo
A une suspension fraîche (0 °C) d’aniline (1 mmol, 1 équiv.) dans HCL 12N/EtOH 1 :1 (3 mL), on a ajouté goutte à goutte une solution aqueuse de NaNC (1 ,2 mmol, 1 ,2 équiv, 1 M) Après 1 h d'agitation à cette température, le mélange a été ajouté goutte à goutte à une solution basique (pH = 8 - 9) froide (0 °C) du 2-hydroxybenzaldyde correspondant (1 mmol, 1 équiv.) dans 1 :1 H2O/EtOH (10 mL). Le mélange a été agité pendant 2 h à 0 °C. Le pH a été maintenu à 8 - 9 avec une solution de NaOHaq à 10%. La purification a été effectuée selon le cas spécifique pour obtenir le produit pur final.
Procédure générale 4: La condensation de Knoevenagel
A une solution du 2-hydroxy-phénydiazenhyl-benzaldéhyde correspondant (1 mmol, 1 équiv.) dans de l'éthanol absolu (8 mL) a été ajouté du malonate de diéthyle (1 ,2 mmol, 1 ,2 équiv.) et de la pipéridine (0,4 mmol, 40 mol%). Le mélange a été porté à reflux pendant 6 h. On a ensuite laissé la réaction brute atteindre la température ambiante et on l'a purifiée selon le cas.
Procédure générale 5: Le couplage de Suzuki
Un mélange sous argon (3x) de 4-(4,4,5,5-tétraméthyl-1 ,3,2-dioxaborolan-2-yl)aniline (1 mmol, 1 équiv.), de dérivé de phényl-diazényl-coumarine (2. 2 mmol, 2,2 équiv.), K2CO3 (5 mmol, 5 équiv.) et bromure de tétrabutylammonium (0,2 mmol, 0,2 équiv.) a été introduit dans du Toluène/H2O 2:1 (23 mL). Le mélange a été purgé pendant 15 minutes, puis Pd(PPh3)4 (10% mmol, 0,1 équiv.) a été ajouté. Le mélange a été agité à 80 °C pendant 36 h. Le composé pur final a été obtenu après purification selon le cas spécifique.
Procédure générale 6: hydrolyse des Esters
A une solution du correspondant éthyl-2-oxo-(phényldiazényl)-chromène-3- carboxylate (1 mmol, 1 équiv.) dans un mélange 1 :1 Toluène/KOHaq 30%, ou 1 :1 MeOH/KOHaq 30% (20 mL). Le mélange a été agité pendant une nuit à 25° C. Puis du H2SO4.conc 95% concentré a été ajouté pour précipiter le produit. Le solide a été filtré et lavé avec Et2Û pour obtenir le composé final désiré dans le rendement indiqué.
(E)-2-hydroxy-5-(phenyldiazenyl)benzaldehyde (165)
C13H10N2O2 PM = 226.23 g.mol-1
Le Chlorydrate d'aniline (0,52 g, 4 mmol, 1 équiv.), NaNO2 (0,335 g, 4,8 mmol, 1 ,2 équiv.), EtOH/HCI 12N 1 :1 (12 mL), 2-hydroxybenzaldéhyde (0,42 mL, 4 mmol, 1 équiv.) ont été mélangé selon la Procédure Générale 3. La réaction brute a ensuite été filtrée. Le solide a été lavé avec Et20. Après élimination de l'éthanol, le filtrat a été soumis à une extraction acide avec 3x100 mL d'acétate d'éthyle et une solution 1 M d'acide chlorhydrique. Le produit pur a été obtenu après purification par chromatographie sur colonne de gel de silice avec du cyclohexane/éthyle 9:1 comme un solide d'or aztèque (0,22 g, rendement de 24%) ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 11.30 (s, 1 H, OH), 10.02 (s, 1 H, CHO), 8.19 (d, J = 2.5 Hz, 1 H, ArH), 8. 17(dd, J = 2,5 Hz, 9 Hz, 1 H, ArH), 7,46 (dd, J = 1 Hz, 8 Hz, 1 H, ArH), 7,49 (m, 3 H, ArH), 7,11 (d, J = 8,5 Hz, 1 H, ArH) ; 13C RMN (125. 78 MHz, CDCI3) 5C : 196.8, 164.0, 152.6, 146.2, 131.3, 130.9, 129.5, 129.4 (x2), 123.0 (x2), 120.6, 118.8.
(E)-ethyl 2-oxo-6-(phenyldiazenyl)-2H-chromene-3-carboxylate (175)
C18H14N2O4 PM = 322.31 g.mol-1
Le composé 156, le (E)-2-hydroxy-5-(phényldiazényl)benzaldéhyde (0,226 g, 1 mmol, 1 équiv.), le malonate de diéthyle (0,168 mL, 1 mmol, 1 équiv.) et la pipéridine (40 pL, 0,4 mmol, 40 mol%) ont été mélangé ensemble dans 8 mL d'éthanol absolu selon la Procédure Générale 4. A la fin, l'éthanol a été éliminé. Ensuite, une extraction acide avec de l'acétate d'éthyle (3 x 100 mL) et une solution d'acide chlorhydrique 1 M a été effectuée, suivie d'une chromatographie sur colonne de gel de silice avec du cyclohexane/acétate d'éthyle [gradient de 9:1 à 1 :1]. Le composé pur a été obtenu sous forme de solide jaune (0,14 g, rendement de 62%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO- d6) 5H : 8.94 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8. 50 (d, J = 2 Hz, 1 H, ArH), 8.22 (dd, J = 2 Hz, 8.5 Hz, 1 H, ArH), 7.91 (dd, J = 0.5 Hz, 8 Hz, 2 H, ArH), 7.63 (m, 4 H, ArH), 4. 32 (q, 2 H, CH2CH3), 1.33 (t, 3 H, CH2CH3) ; 13C RMN (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 162.4, 156.1 , 155.6, 151.7, 148.5, 148.3, 131.9, 129.6 (x2), 127. 0, 125.4, 122.7 (x2), 118.6, 118.5, 117.6, 61.4, 14.1 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [Ci8Hi5N2Q4]+, 323.1026, trouvé 323.1032.
(E)-2-oxo-6-(phenyldiazenyl)-2H-chromene-3-carboxylique acide (LSP9-4126)
C16H10N2O4 PM = 294.26 g.mol-1
Le produit souhaité a été obtenu sous la forme d'un solide ambré (38 mg, rendement de 76%) à partir de A111 -I, du 2-oxo-6-(phényldiazényl)-2H-chromène-3-carboxylate de (E)-éthyle (50 mg, 0. 17 mmol) dans 1 :1 Toluène/KOHaq 30% selon la Procédure Générale 6 ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO + Quelques gouttes de DCI) 5H : 8.85 (s, 1 H, CHCCO2H), 8.43 (s, 1 H, ArH), 8. 116 (s, 1 H, ArH), 7.86 (s, 2 H, ArH), 7.58 (m, 4 H, ArH) ; 13C NMR (125.78 MHz, DMSO + Quelques gouttes de DCI) 5c : 164.1 , 156.8, 156.5, 152.2 ; 148.8, 148. 7, 132.4, 130.1 (x2), 127.2, 126.0, 123.1 (x2) ; 119.6, 119.0, 118.1 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [Ci8HnN2O4]+, 295.0713, trouvé 295.0720.
(E)-ethyl 7-methoxy-2-oxo-6-(phenyldiazenyl)-2H-chromene-3-carboxylate (259)
C19H16N2O5 PM = 352.34 g.mol'1
L'aniline chlorhydratée (1 ,296 g, 10 mmol, 1 équiv.), NaNC (0,759 g, 11 mmol, 1 ,1 équiv.), EtOH/HCI 12N 1 :1 (30 mL), 2-hydroxy-4-méthoxybenzaldéhyde (1 ,522 g, 10 mmol, 1 équiv.), ont été pris selon la Procédure Générale 3. La réaction brute a ensuite été filtrée. Le résidu a été lavé avec Et20. Le filtrat a été concentré sous vide puis extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x100 mL) et une solution de HCl 1 M. Le produit pur (E)-2-hydroxy-4-méthoxy-5-(phényldiazényl)benzaldéhyde a été obtenu après chromatographie sur colonne de gel de silice avec 7:3 cyclohexane/acétate d'éthyle sous forme de poudre bronze (0,69 g). (0,213 g, 0,83 mmol, 1 équiv.) de cet intermédiaire a ensuite été pris dans du malonate de diéthyle (0,128 mL, 1 mmol, 1 ,2 équiv.), de la pipéridine (34 pL, 0,33 mmol, 40 mol%) et 6 mL d'éthanol absolu selon la Procédure Générale 4. L'éthanol a été éliminé à la fin du processus. Ensuite, une extraction acide avec de l'EtOAc (3 x 100 mL) et une solution aqueuse de HCl 1 M a été effectuée, suivie d'une chromatographie sur colonne de gel de silice avec 7:3 de cyclohexane/acétate d'éthyle. Le composé pur a été obtenu sous forme de poudre bronze en (96 mg, rendement de 33%) ; 1 H
NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 8.56 (s, 1 H, CHCCO2Et), 7.90 (dd, J = 1 . 5 Hz, 8 Hz, 2 H, ArH), 7.87 (s, 1 H, ArH), 7.50 (m, 3 H, ArH), 6.98 (s, 1 H, ArH), 4.39 (q, 2 H, CH2CH3), 4.09 (s, 3 H, OCH3), 1. 39 (t, 3 H, CH2CH3) ; 13C NMR (125.78 MHz, CDCI3) 5C : 163.2, 162.2, 158.9, 156.7, 153.1 , 149.5, 140.2, 131.8, 129.4, 129.0, 123.4, 119. 8, 117.5, 115.8, 111.4, 100.4, 62.1 , 57.2, 14.5 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour calcd. pour [CigHi7N2O5]+, 353.1132, trouvé 353.1127.
(E)-7-methoxy-2-oxo-6-(phenyldiazenyl)-2H-chromene-3-carboxylique acide (LSP9-4108)
C17H12N2O5 PM = 324.29 g.mol-1
Le produit souhaité a été obtenu sous la forme d'un solide de couleur bronze (33 mg, rendement de 92%) à partir de 250, 7-méthoxy-2-oxo-6-(phényldiazényl)-2H- chromène-3-carboxylate de (E)-éthyle (36 mg, 0,1 mmol) dans 1 :1 Toluène/(KOHaq 30%) selon la Procédure Générale 6 ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.81 (s, 1 H, CHCCO2H), 8.06 (s, 1 H, ArH), 7. 86 (dd, J = 2 Hz, 8 Hz, 2 H, ArH), 7.60 (m, 3 H, ArH), 7.37 (s, 1 H, ArH), 4.09 (s, 3 H, OCH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 163.9, 161.2, 158.2, 156.5, 152. 3, 149.1 , 139.1 , 131.6, 129.5 (x2), 122.6 (x2), 117.4, 115.6, 111.1 , 100.7, 57.1 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [CI7HI3N2O4]+, 325.0819, trouvé 325.0820.
(E)-2,4-dihydroxy-5-(phenyldiazenyl)benzaldehyde (174)
C13H10N2O3 PM = 242.23 g.mol-1
Le chlorhydrate d'aniline (1 ,296 g, 10 mmol, 1 équiv.), NaNO2 (0,75 g, 12 mmol, 1 ,2 équiv.), EtOH/HC1 12N 1 :1 (30 mL), le 2, 4-dihydroxybenzaldéhyde (1 ,381 g, 10 mmol, 1 équiv.) ont été mélangé selon la procédure générale 3. La réaction brute a ensuite été filtrée ; le solide a été lavé avec Et20, le filtrat a été concentré sous vide puis extrait avec EtOAc (3 x 200 mL) et une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 M. Le produit pur a été obtenu après chromatographie sur colonne de gel de silice avec Cyclohexane / acétate d'éthyle [gradient de (9:1 ) à (1 :1 )] comme une poudre bronze (0,69 g, rendement de 28%) ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 14,1 (s, 1 H, OH), 11 ,6 (s, 1 H, OH), 9,8 (s, 1 H, CHO), 8,2 (s, 1 H, CHCHO), 7. 8 (dd, J = 1 ,5 Hz, 8,5 Hz, 2 H, ArH), 7,5 (m, 3 H, ArH), 6,5 (s, 1 H, CHCOH) ; 13C NMR (125,78 MHz, CDCI3) : 194,5, 166,0, 162,3, 150,1 , 141. 1 , 132,6, 131 ,6, 129,7 (x2), 122,3 (x2), 115,8, 105,2 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]- : calculé pour [Ci2HgN2O2]-, 241.0619, trouvé 241.0610. (E)-ethyl 7-hydroxy-2-oxo-6-(phenyldiazenyl)-2H-chromene-3-carboxylate (183)
C18H14N2O5 PM = 338.31 g. mol'1
A un mélange sous flux d'argon (3x) de 164, (E)-2,4-dihydroxy-5- (phényldiazényl)benzaldéhyde (0,32 g, 1 mmol, 1 équiv.) avec Et3N (0,151 ml_, 1 ,2 mmol, 1 ,2 équiv.) dans 20mL de DCM a été ajouté de l'anhydride benzoïque (0,272 g, 1 ,2 mmol, 1 ,2 équiv.). Après une nuit d'agitation à 25 °C, le brut de réaction a été extrait avec 3 x 100 mL de DCM et une solution d'acide chlorhydrique 1 M pour obtenir une poudre de bronze Un mélange du réactif de départ et du produit désiré a été obtenu (taux de conversion = 63%). Le mélange a été directement engagé dans l'étape suivante sans purification supplémentaire ; HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- : calcd. pour [C2OH13N2O4]-, 345.0881 , trouvé 345.0877. Cet intermédiaire (0,2 g, 0,58 mmol, 1 équiv.) a ensuite été pris dans du malonate de diéthyle (0,36 mL, 2,3 mmol, 4 équiv.), de la pipéridine (95 pL, 0,93 mmol, 1 ,6 équiv.) et de l'éthanol absolu selon la procédure générale 4. A la fin, la réaction brute a été concentrée sous vide. Ensuite, une extraction acide avec 3 x 100 mL d'acétate d'éthyle et une solution d'acide chlorhydrique 1 M a été effectuée, suivie d'une chromatographie sur colonne de gel de silice avec 7:3 de cyclo h exan e/acétate d'éthyle. Le composé pur a été obtenu sous forme d'un solide de couleur bronze (0,11 g, rendement de 89%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 12.01 (s, 1 H, OH), 8.85 (s, 1 H, CHCCO2H), 8.25 (s, 1 H, ArH), 7.99 (dd, J = 1 .5 Hz, 8 Hz, 2 H, ArH), 7.61 (m, 3 H, ArH), 7. 04 (s, 1 H, CHCOH), 4.28 (q, 2 H, CH2CH3), 1.31 (t, 3 H, CH2CH3) ; 13C NMR (125.78 MHz, DMSO-d6) 5C : 162.6, 160. 7, 158.0, 155.8, 155.6, 149.6, 137.0, 131.7, 129.5 (x2), 122.8 (x2), 122.4, 114.2, 111.0, 104.0, 61.0, 14.1.
(E)-7-hydroxy-2-oxo-6-(phenyldiazenyl)-2H-chromene-3-carboxylique acide (LSP9-4153)
C16H10N2O5 PM= 310.26 g.mol-1
Le produit souhaité a été obtenu sous la forme d'un solide de couleur bronze (38 mg, rendement de 31 %) à partir de 174, 7-hydroxy-2-oxo-6-(phényldiazényl)-2H- chromène-3-carboxylate de (E)-éthyle (21 mg, 0,06 mmol) dans 1 :1 Toluène/(KOHaq 30%) selon la procédure générale 6 ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 12.02 (s, 1 H, OH), 8.81 (s, 1 H, CHCCO2H), 8. 24 (s, 1 H, ArH), 7.99 (m, 2 H, ArH), 7.61 (m, 3 H, ArH), 7.04 (s, 1 H, CHCOH) ; 13C NMR (125.78 MHz, DMSO-d6) 5C : 163.9, 160.4, 158.0, 156.5, 151. 6, 149.3, 137.0, 131.7 (x2), 129.5, 122.8 (x2), 122.5, 114.9, 111.2, 104.1 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C16H10N2O5H 311.0662, trouvé 311.0665.
(E)-5-((4-bromo-2-methoxyphenyl)diazenyl)-2-hydroxybenzaldehyde (167)
C1dH11BrN,O PM = 335. 15 gmol'1
Le 4 - bromo-2-méthoxy-aniline (0,404 g, 2 mmol, 1 équiv.), NaNO2 (0,15 g, 2,2 mmol, 1 ,1 équiv.), 1 :1 EtOH/HCI 12N (6 mL), 2-hydroxybenzaldéhyde (0,21 mL, 2 mmol, 1 équiv.) a été mélangé selon la Procédure Générale 3. Ensuite, on a laissé la réaction brute précipiter. Le solide a été filtré et lavé avec de l'éthanol et de l'éther frais. Puis une trituration a été effectuée avec du cyclohexane/pentane/dichlorométhane pour obtenir le produit pur final sous forme de solide ambré (0,57 g, rendement de 63%) ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 11. 30 (s, 1 H, OH), 10.00 (s, 1 H, CHO), 8.16 (m, 1 H, ArH), 8.56 (d, J = 2.5 Hz, 1 H, ArH), 7.54 (d, J = 8.5 Hz, 1 H, ArH), 7. 23 (d, J = 3 Hz, 1 H, ArH), 7.16 (dd, J = 2 Hz, 8.5 Hz, 1 H, ArH), 7.09 (d, J = 8.5 Hz, 1 H, ArH), 4.01 (s, 3 H, OCH3) ; 13C NMR (125.78 MHz, CDCI3) 5C : 196. 8, 164.0, 157.5, 146.6, 141.1 , 131.5, 129.3, 126.7, 124.3, 118.8, 118.3, 116.5, 56.8 ; HR-MS (ESI, m/z) [M- H]- : calculé pour [Ci4H BrN2O3]-, 332.9880, trouvé 332.9872.
(E)-ethyl 6-((4-bromo-2-methoxyphenyl)diazenyl)-2H-chromene-3-carboxylate
Ci9Hi5BrN2O5 PM = 431.24 g.mol-1
Le composé 158, le (E)-5-((4-bromo-2-méthoxyphényl)diazényl)-2- hydroxybenzaldéhyde (0,416 g, 1 ,24 mmol, 1 équiv.), le malonate de diéthyle (0,19 mL, 1 ,24 mmol, 1 équiv.) et la pipéridine (50 pL, 0,4 mmol, 40 mol%) ont été mélangé ensemble dans 9 mL d'éthanol absolu selon la Procédure Générale 4. A la fin, la réaction brute a été concentrée sous vide. Ensuite, une extraction acide dans du toluène (3 x 50 mL) avec de l'eau/acide acétique 2:1 a été effectuée pour obtenir le produit pur final sous forme de solide ambré (0,323 g, rendement de 60%) ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 8. 60 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8.20 (dd, 1 H, J = 2 Hz, 8.5 Hz, ArH), 8.13 (d, 1 H, J = 2.5, ArH), 7.57 (d, 1 H, J = 8 Hz, ArH), 7.45 (d, 1 H, J = 8.5 Hz, ArH), 7.25 (d, 1 H, J = 1. 5 Hz, ArH), 7.16 (dd, 1 H, J = 2 Hz, 8.5 Hz, ArH), 4.42 (q, 2 H, CH2CH3), 4.02 (s, 3 H, OCH3), 1.40 (t, 3H, CH2CH3) ; 13C NMR (125.78 MHz, CDCI3) 5C : 163.0, 157.9, 156.6, 156.4, 149. 8, 148.6, 140.9, 128.7, 127.6, 124.4, 124.3, 119.3, 119.4, 118.4, 118.2, 117.9, 116.7, 62.4, 58.8, 14.5 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C19H16N2O5]+, 431 .0237, trouvé 431 .0230.
(E)-6-((4-bromo-2-methoxyphenyl)diazenyl)-2H-chromene-3-carboxylique acide (LSP9-3161)
Ci7HnBrN2O5 PM = 403. 18 g.mol-1
Le produit souhaité a été obtenu sous la forme d'un solide ambré (26 mg, rendement de 46%) à partir du C111 -I, 6-((4-bromo-2-méthoxyphényl)diazényl)-2H-chromène-3- carboxylate de (E)-éthyle (60 mg, 0,14 mmol) 1 :1 MeOH/(KOHaq 30%) selon la procédure générale 6 ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6 + quelques gouttes de DCI) 5H : 8. 82 (s, 1 H, CHCCO2H), 8.35 (s, 1 H, ArH), 8.07 (dd, J = 2.5 Hz, 8.5 Hz, 1 H, ArH), 7.55 (d, J = 8.5 Hz, 1 H, ArH), 7.44 (m, 2 H, ArH), 7. 22 (dd, J = 1 ,5 Hz, 8 Hz, 1 H, ArH), 3,92 (s, 3 H, OCH3) ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [Ci7HnBrN2O5]+, 402.9924, trouvé 404.9904.
(E)-ethyl 6-((4-bromo-2-methoxyphenyl)diazenyl)-8-methoxy-2H-chromene-3- carboxylate (181)
C2oHi7BrN206 PM= 461 ,26 g.mol'1
Le composé (E)-5-((4-bromo-2-méthoxyphényl)diazényl)-2-hydroxy-3- méthoxybenzaldéhyde (0,38 g, 1 ,04 mmol, 1 équiv.), malonate de diéthyle (159 mL, 1 ,04 mmol, 1 équiv.) et la pipéridine (42 pL, 0,4 mmol, 40 mol%) ont été mélangé dans 8 mL d'éthanol absolu selon la Procédure Générale 4. A la fin, la réaction brute a été concentrée sous vide. Ensuite, une extraction acide dans le toluène (3 x 100 mL) avec de l'eau/acide acétique 2:1 a été effectuée pour obtenir le produit pur final sous forme de solide bronze (0. 22g, rendement 45%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO- d6) 5H : 8.92 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8.06 (d, J = 2 Hz, 1 H, ArH), 7.75 (d, J = 2 Hz, 1 H, ArH), 7.54 (d, J = 2 Hz, 1 H, ArH), 7.49 (d, J = 8. 5 Hz, 1 H, ArH), 7,28 (dd, J = 2 Hz, 8,5 Hz, 1 H, ArH), 4,32 (q, 2 H, CH2CH3), 4,02 (s, 3 H, OCH3), 4,01 (s, 3 H, OCH3), 1 ,33 (t, 3 H, CH2CH3) ; 13C RMN (62. 9 MHz, DMSO-d6) 5C : 162.4, 157.3, 155.3, 148.8, 148.6, 147.2, 146.0, 140.3, 126.4, 123.7, 118.7, 118.5, 118.0, 117.9, 116.8, 107.5, 61.4, 56.7, 56,4, 14.1.
(E)-6-((4-bromo-2-methoxyphenyl)diazenyl)-8-methoxy-2H-chromene-3- carboxylique acide (LSP9-3163)
Ci8Hi3BrN206 PM = 433,21 g.mol-1
Le produit désiré a été obtenu sous forme d'un solide orange (43 mg, rendement de 59%) à partir de 171 , le 6-((4-bromo-2-méthoxyphényl)diazényl)-8-méthoxy-2H- chromène-3-carboxylate de (E)-éthyle (77 mg, 0. 17 mmol) dans 1 :1 MeOH/(KOHaq 30%)selon la procédure générale 6 ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.84 (s, 1 H, CHCCO2H), 8.04 (d, J = 2 Hz, 1 H, ArH), 7.72 (d, J = 2 Hz, 1 H, ArH), 7. 53 (d, J = 2 Hz, 1 H, ArH), 7.49 (d, J = 8.5 Hz, 1 H, ArH), 7.27 (dd, J = 2 Hz, 8.5 Hz, 1 H, ArH), 4.01 (s, 3 H,OCH3), 4.00 (s, 3 H, OCH3) ; 13C RMN (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 163.8, 157. 2, 155.8, 148.5, 147.9, 147.2, 145.8, 140.3, 126.4, 123.7, 118.7, 118.1 , 118.0, 116.8, 106.8, 56.5, 56.3 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [Ci8Hi4BrN2O6]+, 433.0030, trouvé 433.0207.
(E)-5-((4-bromo-2-methoxyphenyl)diazenyl)-2-hydroxy-4-methoxybenzaldehyde
Ci5Hi3BrN2O4 PM = 365. 18 g.mol-1
La 4 - bromo-2-méthoxy-aniline (0,808 g, 4 mmol, 1 équiv.), NaNO2 (0,307 g, 4,4 mmol, 1 ,1 équiv.), EtOH/HCI 12N 1 :1 (12 mL), 2-hydroxy-4-méthoxy-benzaldéhyde (0,608 g, 4 mmol, 1 équiv.) a été mélangé selon la Procédure Générale 3. Ensuite, on a laissé la réaction brute précipiter. Le solide a été filtré et lavé par de l'éthanol et de l'éther frais pour obtenir le produit pur désiré sous forme de solide rouge barn (0,98 g, rendement 67%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 11 . 57 (s, 1 H, OH), 10.17 (s, 1 H, CHO), 7.87 (s, 1 H, H6), 7.48 (d, J = 1.5 Hz, 1 H, ArH), 7.36 (d, J = 8.5 Hz 1 H, ArH), 7.23 (dd, J = 1.5 Hz, 8. 5 Hz 1 H, ArH), 6.76 (s, 1 H, H3), 4.01 (s, 3 H,OCH3), 3.99 (s, 3 H, OCH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 162.5, 161.4, 158.3, 157.3, 155.8, 149.6, 140.9, 139. 5, 136.2, 123.7, 118.1 , 117.6, 116.7, 114.8, 111.0, 100.7, 61.0, 57.1 , 56.6, 14.0 ; HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- : calculé pour [Ci5Hi2BrN2O4]-, 362.9986, trouvé 362.9985.
(E)-ethyl 6-((4-bromo-2-methoxyphenyl)diazenyl)-7-methoxy-2H-chromene-3- carboxylate (179)
C2oHi7BrN20e PM= 461.26 g.mol'1
Le composé 162, le (E)-5-((4-bromo-2-méthoxyphényl)diazényl)-2-hydroxy-4- méthoxybenzaldéhyde (0,727 g, 1 ,99 mmol, 1 équiv.), le malonate de diéthyle (0,31 mL, 1 ,04 mmol, 1 équiv.) et la pipéridine (80 pL, 0,4 mmol, 40 mol%) ont été mélangé ensemble dans 15 mL d'éthanol absolu selon la Procédure Générale 4. A la fin, le mélange a été concentré sous vide. Ensuite, on a laissé le mélange précipiter dans de l'AcOEt/pentane. Le solide a été filtré et a été avec un peu d'Et20 pour obtenir le produit pur final comme solide rouge brun (0.55g, 60% de rendement) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8. 54 (s, 1 H, CHCCO2Et), 7.82 (s, 1 H, ArH), 7.52 (d, J = 8.5 Hz, 1 H, ArH), 7.23 (d, J = 1.5 Hz, 1 H, ArH), 7.14 (dd, J = 1.5 Hz, 8.5 Hz, 1 H, ArH), 6.96 (s, 1 H, ArH), 4. 38 (q, 2 H, CH2CH3), 4.08 (s, 3 H,OCH3), 4.02 (s, 3 H, OCH3), 1.38 (t, 3 H, CH2CH3) ; 13C RMN (125.78 MHz, DMSO-d6) 5C : 163.2, 162.0, 158.9, 157.7, 156.6, 149.5, 141. 6, 140.7, 127.4, 124.4, 1 18.7, 117.8, 116.5, 115.8, 111.4, 100.3, 62.1 , 57.2, 56.8, 14.5 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C2oHi8BrN20e]+, 461 .0343, trouvé 461 .0337.
(E)-6-((4-bromo-2-methoxyphenyl)diazenyl)-7-methoxy-2H-chromene-3- carboxylique acide (LSP-4150)
Ci8Hi3BrN2O6 PM = 433.21 g.mol-1
Le produit souhaité a été obtenu sous la forme d'un solide rouge grange (8 mg, rendement de 9 %) à partir de 169, (E)-éthyl 6-((4-bromo-2-méthoxyphényl)diazényl)- 7-méthoxy-2H-chromène-3-carboxylate (0,1 g, 0,22 mmol) dans 1 :1 MeOH/(KOHaq 30%) selon la procédure générale 6. Le produit a été purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant un mélange 6:4:0, 5% de DCM-AcOEt-AcOH ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 9. 00 (s, 1 H, CHCCO2H), 7.88 (d, 1 H, J = 1.5 Hz, ArH), 7.82 (d, 1 H, J = 1.5 Hz, ArH), 7.57 (d, 1 H, J = 9 Hz, ArH), 7.27 (d, 1 H, J = 1.5 Hz, ArH), 7. 17 (dd, 1 H, J = 2 Hz, 9 Hz, ArH), 4.09 (s, 3 H,OCH3), 4.03 (s, 3 H, OCH3) ; 13C NMR (125.78 MHz, CDCI3) 5C : 163.5, 162.2, 158.0, 151.9, 150.4, 148.5, 145. 8, 140.8, 128.1 , 124.4, 119.2, 118.5, 118.3, 116.7, 116.0, 109.1 , 57.0, 56.8 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [Ci8Hi3BrN2O6Na]+, 454.9849, trouvé 456.9847.
(E)-5-((4-bromophenyl)diazenyl)-2-hydroxybenzaldehyde (166)
Ci3HgBrN2O2 PM = 305. 13 g. mol'1
La 4-bromoaniline (1 ,72 g, 10 mmol, 1 équiv.), NaN02 (0,85 g, 12 mmol, 1 ,2 équiv.), EtOH/HCI 12N 1 :1 (30 mL), 2-hydroxybenzaldéhyde (1 ,04 mL, 10 mmol, 1 équiv.) ont été mélangés selon la Procédure Générale 3. A la fin, on a laissé le mélange précipiter. Le résidu a été filtré et lavé avec de l'éthanol et de l'éther frais pour obtenir le produit pur désiré sous forme d'un solide jaune terreux (3,04 g, rendement de 99%) ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 11 ,33 (s, 1 H, OH), 10,02 (s, 1 H, CHO), 8,19 (d, J = 2,5 Hz, 1 H, ArH), 8. 16 (dd, J = 2,5 Hz, 9 Hz, 1 H, ArH), 7,76 (d, J = 9 Hz 2 H, ArH), 7,63 (d, J = 9 Hz 2 H, ArH), 7,11 (d, J = 8,5 Hz, 1 H, ArH) ; 13C RMN (125. 78 MHz, CDCI3) 5C : 196.7, 164.2, 161.3, 146.0, 132.6 (x2), 130.9, 129.8, 125.7 (x2), 124.5 (x2), 120.6, 118.9.
(E)-ethyl 6-((4-bromophenyl)diazenyl)-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (176)
Ci8Hi3BrN2O4 PM = 401.21 g.mol-1
Le composé 157, le (E)-5-((4-bromophényl)diazényl)-2-hydroxybenzaldéhyde (3,3 g, 10 mmol, 1 équiv.), le malonate de diéthyle (1 ,53 mL, 12 mmol, 1 ,2 équiv.) et la pipéridine (0,4mL, 0,4 mmol, 40 mol%) ont été pris ensemble dans 77 mL d'éthanol absolu selon la Procédure Générale 4. La réaction brute a ensuite été filtrée. Le résidu a été lavé avec de l'éthanol frais et Et20. Le filtrat a été concentré sous vide puis extrait avec de l'acétate d'éthyle (3 x 200 mL) et une solution d'acide chlorhydrique 1 M. La couche organique a été séchée sur MgSO4, concentrée sous vide. Le produit pur final a été obtenu sous forme de poudre marron claire après chromatographie sur colonne de gel de silice avec 8:2 Cyclohexane / acétate d'éthyle (2.57 g, rendement 56%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8. 60 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8.21 (dd, J = 2.5 Hz, 6.5 Hz, 1 H, ArH), 8.16 (d, J = 2.5 Hz, 1 H, ArH), 7.79 (d, J = 9 Hz, 2 H, ArH), 7.65 (d, J = 9 Hz, 2 H, ArH), 7. 46 (d, J = 9 Hz, 1 H, ArH), 4.42 (q, 2 H, CH2CH3), 1.41 (t, 3 H, CH2CH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 163.0, 156.8, 156.3, 151.2, 149.2, 148.5, 132. 7 (x2), 128.2, 126.5, 124.8, 124.7 (x2), 119.5, 118.4, 118.0, 62.4, 14.5 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [Ci8Hi4BrN2O4]+, 401 .0131 , trouvé 403.0106. (E)-6-((4-bromophenyl)diazenyl)-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylique acide (LSP9-3160)
Ci6HgBrN2C>4 PM = 373. 16 g.mol'1
Le produit désiré a été obtenu sous forme d'un solide ambré (54 mg, rendement de 98%) à partir de 166, du 6-((4-bromophényl)diazényl)-2-oxo-2H-chromène-3 carboxylate de (E)-éthyle (56 mg, 0. 16 mmol) dans 1 :1 toluène/(KOHaq 30%) selon la procédure générale 6 ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO + quelques gouttes de DCI) 5H : 8.95 (s, 1 H, CHCCO2H), 8.55 (d, J = 5 Hz, 1 H, ArH), 8. 27 (m, 2 H, ArH), 7.91 (m, 4 H, ArH), 7.68 (d, j = 9 Hz, 1 H, ArH) ; 13C NMR (125.78 MHz, DMSO + Quelques gouttes de DCI) 5C : 163.6, 156.2, 156.1 , 150.6, 148. 1 , 148.1 , 132.6 (x2), 126.7, 125.7, 125.3, 124.5 (x2), 119.2, 118.5, 117.6 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [Ci6H9BrN2O4Na]+, 394.9638, trouvé 291.0657.
(E)-ethyl 6-((4'-aminobiphenyl-4-yl)diazenyl)-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylate (236)
C24H19N3O4 PM = 413.43 g.mol-1
Un mélange (3x) balayé à l'argon de 4-(4,4,5,5-tétraméthyl-1 ,3,2-dioxaborolan-2- yl)aniline (0,223 g, l equiv, 0,48 mmol), de 6-((4-bromophényl)diazényl)-2-oxo-2H- chromène-3-carboxylate de (E)-éthyle (0,46 g, 1 ,06 mmol, 2,2 équiv.), de K2CO3 (0,334 g, 2,45 mmol, 5 équiv. ) et le bromure de tétrabutylammonium (31 mg, 0,01 mmol, 0,2 équiv.), Pd(PPh3)4 (56 mg, 10 mol%., 0,05 mmol) a été mélangé dans 2:1 toluène/eau sous reflux pendant 30 h selon la procédure générale 5. A la fin, une extraction basique avec 3 x 100 mL d'acétate d'éthyle et une solution de KOHaq 1 M a été effectuée. La purification a été faite par chromatographie sur colonne de gel de silice cyclohexane/acétate d'éthyle/Et3N [gradient de 70:30:0,1 à 50:50:0,1]. Le produit pur a été obtenu sous forme de poudre de couleur terre de sienne foncée (80 mg, rendement de 40%) ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 8.62 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8.23 (dd, J = 2 Hz, J = 9 Hz, 1 H, ArH), 8. 17 (d, J = 2,5 Hz, 1 H, ArH), 7,96 (dd, J = 2 Hz, 8,5 Hz, 2 H, ArH), 7,69 (dd, J = 2 Hz, 8,5 Hz, 2 H, ArH), 7,49 (m, 3 H, ArH), 6,77 (d, J = 8. 5 Hz, 1 H, ArH), 4.43 (q, 2 H, CH2CH3), 1.42 (t, 3 H, CH2CH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 158.5 ; 150.9 ; 149.6 ; 148.7 ; 144.8 ; 128.4 (x2) ; 128.3, 127. 0 (x2), 124.4, 123.9 (x2) ; 118.4, 117.9, 115.6 (x2), 62.4, 35.7, 25.1 , 14.5 ; HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- : calcd. pour [C24H18N3O4]+, 412.1303, trouvé 412.1309.
(E)-5-((4-bromophenyl)diazenyl)-2-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde (168)
CuHnBrNsOs PM= 335. 15 g. mol'1
La 4-bromoaniline (0,172 g, 10 mmol, 1 équiv.), NaNO2 (0,75 g, 11 mmol, 1 ,1 équiv.), EtOH/HCI 12N 1 :1 (30 mL), le 2-hydroxy-3-méthoxy-benzaldéhyde (0,152 g, 10 mmol, 1 équiv.) ont été mélangé selon la Procédure Générale 3. Ensuite, on a laissé la réaction brute précipiter. Le solide a été filtré et lavé avec de l'éthanol et de l'éther frais pour obtenir le produit pur sous la forme d'un solide bronze (3,04 g, rendement de 94%) ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 11 ,65 (s, 1 H, OH), 9,82 (s, 1 H, CHO), 7,96 (s, 1 H, ArH), 7,74 (dd, J = 2 Hz, 7 Hz, 2 H, ArH), 7. 62 (dd, J = 2 Hz, 7 Hz, 2 H, ArH), 6.60 (s, 1 H, CHCOCH3), 4.06 (s, 3 H, OCH3) ; 13C NMR (125.78 MHz, CDCI3) 5C : 196.6, 155.0, 151.3, 149.6, 145. 7, 132.6 (x2), 125.6, 124.5 (x2), 124.2, 120.2, 108.2, 56.7 ; HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- : calculé pour [C14H10BrN2O3]-, 332.9880, trouvé 332.9886.
(E)-ethyl 6-((4-bromophenyl)diazenyl)-8-methoxy-2H-chromene-3-carboxylate (180)
Ci9Hi5BrN2O5 PM = 431.24 g.mol-1
Le composé 159, le (E)-5-((4-bromophényl)diazényl)-2-hydroxy-3- méthoxybenzaldéhyde (1 ,670 g, 5 mmol, 1 équiv.), le malonate de diéthyle (0,763 mL, 5 mmol, 1 équiv.) et la pipéridine (0,204 mL, 0,4 mmol, 40 mol%) ont été mélangé ensemble dans 36 mL d'éthanol absolu selon la Procédure Générale 4. A la fin, la réaction brute a été concentrée sous vide. Ensuite, une extraction acide dans du toluène (3 x 150 mL) avec de l'eau/acide acétique 2:1 a été effectuée pour obtenir le produit pur final sous forme de solide bronze (1 ,25g, rendement de 58%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8,90 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8,13 (d, J = 2 Hz, 1 H, ArH), 7,82 (m, 4 H, ArH), 7,80 (d, J = 2 Hz, 1 H, ArH), 4. 32 (q, 2 H, CH2CH3), 4.03 (s, 3 H, OCH3), 1.33 (t, 3 H, CH2CH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 162.4, 155.2, 150.5, 148.7, 148.0, 147.3, 146.3, 132. 6 (x2), 125.3, 124.5 (x2), 119.1 , 118.7, 118.5, 106.6, 61.4, 56.4, 14.0 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C19H16BrN2O5]+, 431.0237, trouvé 431.0231.
(E)-6-((4-bromophenyl)diazenyl)-8-methoxy-2H-chromene-3-carboxylique acide (LSP9-3162)
Ci7HnBrN2O5 PM = 403. 18 g.mol-1
Le produit désiré a été obtenu sous la forme d'un solide bronze (0,175 g, rendement de 62 %) à partir de 170 (E)-éthyl 6-((4-bromophényl)diazényl)-8-méthoxy-2H- chromène-3-carboxylate (0,3 g, 0. 7 mmol) dans 1 :1 MeOH/(KOHaq 30%) selon la procédure générale 6 ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6 ) 5H : 8.85 (s, 1 H, CHCCO2H), 8.12 (d, J = 2 Hz, 1 H, ArH), 7.86 (d, J = 9 Hz, 2 H, ArH), 7. 82 (d, J = 9 Hz, 2 H, ArH), 7.79 (d, J = 9 Hz, 2 H, ArH), 7.79 (d, J = 2 Hz, 1 H, CHOCH3), 4.03 (s, 3 H, OCH3) ; 13C NMR (125.78 MHz, DMSO-d6 ) 5C : 163.8, 155. 8, 150.5, 147.9, 147.3, 146.2, 132.6, 125.2, 124.5, 119.8, 119.2, 118.7, 106.1 , 56.4 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C17H11 BrN2O5]+, 402.9924, trouvé 4404.9909.
(E)-5-((4-bromophenyl)diazenyl)-2-hydroxy-4-methoxybenzaldehyde (171 )
CuHnBrNsOs PM = 335. 15 g. mol'1
La 4 - Bromoaniline (3,44 g, 20 mmol, 1 équiv.), NaNO2 (1 ,7 g, 24 mmol, 1 ,2 équiv.), EtOH/HCI 12N 1 :1 (60 mL), 2-hydroxy-4-méthoxy-benzaldéhyde (3,04 g, 10 mmol, 1 équiv.) a été mélangé selon la Procédure Générale 3. Ensuite, on a laissé la réaction brute précipiter. Le solide a été filtré et lavé par de l'éthanol et de l'éther frais. Le filtrat a été concentré sous vide puis extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x400 mL) et une solution d'acide chlorhydrique 1 M. Le produit a été obtenu sous la forme d'un solide bronze après purification par chromatographie sur colonne de gel de silice avec 7:3 cyclohexane / acétate d'éthyle (5.9 g, rendement 87%) ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 11.65 (s, 1 H, OH), 9.82 (s, 1 H, CHO), 7.96 (s, 1 H, ArH), 7.75 (dd, J = 2 Hz, 6.5 Hz, 2 H, ArH), 7. 62 (dd, J = 2 Hz, 6.5 Hz, 2 H, ArH), 6.65 (s, 1 H, ArH), 4.06 (s, 3 H, OCH3) ; 13C NMR (125.78 MHz, CDCI3) 5C : 195.6, 166.6, 164.3, 151 .9, 136. 6, 132.6 (x2), 125.4, 124.6 (x2), 122.3, 114.5, 100.6, 57.0 ; HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- calculé pour [C14H10BrN2O3]-, 332.9880, trouvé 332.9876. (E)-ethyl 6-((4-bromophenyl)diazenyl)-7-methoxy-2H-chromene-3-carboxylate (178)
Ci9Hi7BrN2O5 PM = 431.24 g.mol-1
Le composé 161 , le (E)-5-((4-bromoph5nyl)diazényl)-2-hydroxy-4- méthoxybenzaldéhyde (2,78 g, 8,31 mmol, 1 équiv.), le malonate de diéthyle (1 ,27 mL, 8,31 mmol, 1 équiv.) et la pipéridine (0,34 mL, 0,4 mmol, 40 mol%) ont été mélangé ensemble dans 100 mL d'éthanol absolu selon la Procédure Générale 4. A la fin, la réaction brute a été concentrée sous vide. Ensuite, une extraction acide dans du toluène (3 x 150 mL) avec de l'eau/acide acétique 2:1 a été effectuée pour obtenir le produit pur final sous forme de solide bronze (2g, rendement de 56%) ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 8. 54 (s, 1 H, CHCCO2Et), 7.88 (s, 1 H, CHCN), 7.78 (dd, J = 2 Hz, 6.5 Hz, 2 H, ArH), 7.64 (dd, J = 2 Hz, 6.5 Hz, 2 H, ArH), 6.98 (s, 1 H, CHCO), 4. 39 (q, 2 H, CH2CH3), 4.09 (s, 3H, OCH3), 1.39 (t, 3 H, CH2CH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 163.2 ; 162.2 ; 159.0 ; 156.6 ; 151 .7 ; 149.4 ; 139.9 ; 132. 7 (x2) ; 126.3 ; 124.8 (x2) ; 117.5 ; 115.9 ; 111.4 ; 100.5 ; 62.1 ; 57.2 ; 14.5 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C19H18BrN2O5]-, 431 .0237, trouvé 431 .0231 .
(E)-6-((4-bromophenyl)diazenyl)-7-methoxy-2H-chromene-3-carboxylique acide (LSP9-3164)
Ci7HnBrN2O5 PM = 403. 18 g.mol-1
Le produit souhaité a été obtenu sous la forme d'un solide de couleur terre de sienne foncée (45 mg, rendement de 41 %) à partir de 150 6-((4-bromophényl)diazényl)-7- méthoxy-2H-chromène-3-carboxylate de (E)-éthyle (0,11 g, 0,26 mmol, 1 équiv.) dans 1 :1 Toluène/(KOHaq 30%) selon la Procédure Générale 6 ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.79 (s, 1 H, CHCCO2H), 8. 08 (s, 1 H, ArH), 7.82 (m, 4 H, ArH), 7.37 (s, 1 H, CHOCH3), 4.09 (s, 3 H, OCH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 163.9, 161.4, 158.5, 156.4, 151.1 , 149. 1 , 138.9, 132.6, 131.7, 125.0, 124.5, 121.3, 117.5, 115.7, 111 .2, 100.8, 57.2 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C17H12BrN2O5]- , 402.9924, trouvé 402.9939.
(E)-ethyl 6-((4'-aminobiphenyl-4-yl)diazenyl)-7-methoxy-2-oxo-2H-chromene-3- carboxylate (237)
C25H21N3O5 PM = 443.45 g. mol'1
Un mélange balayé à l'argon de 4-(4,4,5,5-tétraméthyl-1 ,3,2-dioxaborolan-2-yl)aniline (0,557 g, 1 ,21 mmol, 1 équiv.), de 6-((4-bromophényl)diazényl)-7-méthoxy-2H- chromène-3-carboxylate de (E)-éthyle (1 ,143 g, 2,65 mmol, 2. 2 équiv.), K2CO3 (0,83 g, 6 mmol, 5 équiv.) et bromure de tétrabutylammonium (77 mg, 0,24 mmol, 20 mol%), Pd(PPh3)4 (0,14 g, 0,12 mmol, 10 mol%.) a été mélangé dans du toluène/eau 2:1 selon la procédure générale 5. A la fin, le mélange a été extrait avec 3 x 200 mL d'acétate d'éthyle et une solution 1 M de KOH. La purification a été faite par chromatographie sur colonne de gel de silice cyclohexane / acétate d'éthyle / Et3N (1 :1 :0,1 %). Le produit pur a été obtenu sous forme de solide de couleur terre de sienne foncée (283 mg, rendement de 63%) ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 8.57 (s, 1 H, CHCCO2Et), 7.95 (dd, J = 2 Hz, j = 7 Hz, 2 H, ArH), 7. 88 (s, 1 H, CHCN), 7.67 (dd, J = 2 Hz, 6.5 Hz, 2 H, ArH), 7.48 (dd, J = 2 Hz, 6.5 Hz, 2 H, ArH), 6.98 (s, 1 H, CHO), 6.76 (dd, J = 2 Hz, 6.5 Hz, 2 H, ArH), 4. 39 (q, 2 H, CH2CH3), 4.10 (s, 3 H, OCH3), 1.39 (t, 3 H, CH2CH3) ; 13C NMR (125.78 MHz, CDCI3) 5C : 163.5, 162.1 , 158.7, 156.7, 151.5, 149.6, 147.0, 144.5, 140.0, 130.2, 128. 4 (x2), 127.0 (x2), 124.0 (x2), 117.4, 116.7, 115.6 (x2), 111.4, 100.4, 62.1 , 57.2, 14.5 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C25H21 N3O5]+, 444.1554, trouvé 444.1549.
(E)-6-((4'-aminobiphenyl-4-yl)diazenyl)-7-methoxy-2-oxo-2H-chromene-3- carboxylique acid (LSP9-4089)
C23H17N3O5 PM= 415.40 g. mol'1
Le composé 224 (0,11 g, 0,24 mmol, 1 équiv.) a été mélangé dans 7 mL de Toluène/(KOHaq 30%) 1 :1 selon la Procédure Générale 6 pour obtenir le produit pur désiré sous forme de poudre de couleur terre de sienne foncée (48 mg, rendement 48%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6 + quelques gouttes de DCI) 5H : 8. 73 (s, 1 H, CHCCO2H), 7.98 (s, 1 H, CHCN), 7.87 (m, 4 H, ArH), 7.85 (d, J = 8.5 Hz, 2 H, ArH), 7.52 (d, J = 8. 5 Hz, 2 H, ArH), 7.24 (s, 1 H, CHCO), 4.03 (s, 3 H, OCH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6 + quelques gouttes de DCI) 5C : 163.9 ; 161 .5 ; 158.4 ; 156.9 ; 151.7, 149.5, 141.8, 139.3, 139. 1 , 131.11 , 128.3 (x2), 128.0 (x2), 124.3 (x2), 123.6 (x2), 117.6, 15.3, 111.3, 100.8, 57.4 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C23H18N3O5]+, 416.1241 , trouvé 416.1241.
2-hydroxy-4-(methoxymethoxy)benzaldehyde (184)
C9H10O4 PM = 182. 17 g.mol-1
A un mélange de 2,4-dihydroxybenzaldéhyde (1 ,96 g, 14,22 mmol, 1 équiv.), K2CO3 (5,9 g, 42,66 mmol, 3 équiv.) chauffé à reflux sous argon (3x), on a ajouté de l'anhydride dioxanique (45 mL) et du chloro(méthoxy)méthane (1 ,26 g, 15,64 mmol, 1 ,1 équiv.). Le mélange a été agité à 80 °C pendant 4 h. Ensuite, la réaction brute a été extraite avec H2O/AcOEt. Le produit a été obtenu sous forme de solide blanc après purification par chromatographie sur colonne de gel de silice avec [gradient de 9:1 à 7:3] Cyclohexane/AcOEt (1 ,04g, rendement de 40%) ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 11 ,34 (s, 1 H, OH), 9,72 (s, 1 H, CHO), 7,43 (d, 1 H, J = 8,5, CHCCHO), 6. 63 (dd, 1 H, J = 2 Hz, 8,5 Hz, CHCOCH2CH3), 6,59 (d, 1 H, J = 2, CHCOH), 5,230 (s, 2 H, OCH2OCH3), 3,46 (s, 3 H, OCH2CH3) ; 13C RMN (62. 9 MHz, CDCI3) 5C : 194.8 ; 164.6 ; 164.4 ; 135.6 ; 116.2 ; 109.3 ; 103.7 ; 94.3 ; 36.7 ; HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- : calculé pour [C9H9O4]-, 181.0506, trouvé 181.0495.
(E)-ethyl 6-((4-bromophenyl)diazenyl)-7-(methoxymethoxy)-2-oxo-2H- chromene-carboxylate (1861
C2oHi7BrN20e PM = 461.26 g.mol'1
La 4-bromoaniline (0,69 g, 4 mmol, 1 équiv.), NaNO2 (0,33 g, 4,8 mmol, 1 ,2 équiv.), EtOH/HCI 12N 1 :1 (12 mL), 2-hydroxy-4-(méthoxyméthoxy)benzaldéhyde 115, (0,73 g, 4 mmol, 1 équiv.) a été mélangé selon la procédure générale 3. Ensuite, la réaction brute a été concentrée sous vide et purifiée par chromatographie sur colonne de gel de silice avec du cyclohexane/AcOEt [gradient de 9:1 à 7:3]. Le solide impur (0.82 g) du produit désiré et du réactif de départ a été obtenu (44% du produit désiré). Le mélange a été directement engagé dans l'étape suivante sans autre purification. Cet intermédiaire (0.77 g, 2.93 mmol, 1 équiv.) a ensuite été mélangé dans du malonate de diéthyle (0.54 mL, 3.52 mmol, 1 .2 équiv.), de la pipéridine (0.12 mL, 1 .17 mmol, 40 mol%) et 40 mL d'éthanol absolu selon la Procédure Générale 4. A la fin, le mélange a été concentré sous vide, extrait avec de l'eau et de l'EtOAc (36 x 100 mL) puis purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice avec du cyclohexane/AcOEt [gradient de 95/5 à 70:30]. Le produit souhaité a été obtenu sous la forme d'un solide bronze (69 mg, rendement de 12%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.86 (s, 1 H, CHCCOOEt), 8. 14 (s, 1 H, CHCN), 7.84 (d, 2 H, J = 9.0 HZ, ArH), 7.81 (d, 2 H, J = 9.0 HZ, ArH), 7.38 (s, 1 H, CHCOCH2CH3), 5.56 (s, 2 H, OCH2OCH3), 4. 39 (q, 2 H, J = 7.0 HZ, CH2CH3), 3.48 (s, 3 H, OCH2CH3), 1.39 (t, 3 H, J = 7.0 HZ, CH2CH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 162. 4, 158.8, 157.9, 155.6, 151.1 , 149.3, 139.5 (x2), 132.7, 125.3, 124.5 (x2), 118.0, 115.6, 112.1 , 103.5, 95.3, 61.1 , 56.4, 14.0.
(E)-6-((4-bromophenyl)diazenyl)-7-hydroxy-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylique acid (LSP9-5096)
Ci6H9BrN2O5 PM = 389. 16 g.mol-1
A une solution du composé 117, le 6-((4-bromophényl)diazényl)-7-(méthoxyméthoxy)- 2-oxo-2H-chromène-carboxylate de (E)-éthyle (69 mg, 0,15 mmol) dans EtOH (10 mL) a été ajouté NaOHaq 10% (10 mL). Le mélange a été agité sous reflux pendant 2 h. La réaction brute a été acidifiée avec H2SO4.conc 95% (0,05 mol, pH = 1 ) puis agitée sous 40 °C pendant 15 minutes. Le mélange a ensuite été extrait avec AcOEt (3x 200 mL) et une solution 1 M de H2SO4. La couche organique a ensuite été concentrée sous vide et purifiée par chromatographie sur colonne de gel de silice avec 6:4:0, 5% de DCM/AcOEt/AcOH. Le produit pur a été obtenu sous la forme d'un solide vert foncé (55 mg, rendement 94%) ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 13.57 (s, 1 H, OH), 8. 94 (s, 1 H, CHCCOOH), 8.33 (s, 1 H, CHCN), 7.78 (dd, 2 H, J = 2 Hz, 7.0 HZ, ArH), 7.70 (dd, 2 H, J = 2 Hz, 7.0 HZ, ArH), 7.03 (s, 1 H, CHCOH). 13C NMR (62,9 MHz, CDCI3) 5C : 164,0, 162,7, 160,6, 157,4, 151 ,2, 148,8, 136,2, 135,6, 133,3 (x2), 127,7, 124,3 (x2), 118,5, 112,3, 106,3. HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C16H9BrN2O5Na]+, 410.9587, trouvé 410.9589.
Ill Arylvinyl coumarines
Obtention de composé vinyl-H d'-biphenyll-4-amine :
La 4'-ethvnyl-n ,T-biphenyll-4-amine a été obtenue selon le schéma réactionnel suivant: 4-iodo-4'-nitro-1 ,1 '-biphenyl (120)
CI2H8INO2 PM = 325. 10 g.mol-1
Du biphényle (30 g, 0,195 mol, 1 équiv.) et de l'iode (15 g, 0,059 mol, 30 mol%) ont été pris dans de l'acide acétique (20 mL). Ensuite, du HNO3 conc. (70%, 72 mL) a été lentement ajouté pendant 1 h dans le cadre d'une formation rigoureuse de gaz, et le mélange résultant a été agité pendant 1 h à 70 °C. Le mélange réactionnel refroidi a ensuite été versé dans de l'eau (100 mL), et le solide beige a été filtré, lavé avec de l'eau, trituré dans du toluène 100 mL, filtré et lavé avec du toluène (11 ,96 g, rendement 27 %) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8,31 (dd, 2 H, J = 2,0 HZ, J = 6. 5 HZ, ArH), 7.96 (dd, 2 H, J = 2.0 HZ, J = 6.5 HZ, ArH), 7.90 (dd, 2 H, J = 2.0 HZ, J = 6.5 HZ, ArH), 7.60 (dd, 2 H, J = 2.0 HZ, J = 6. 5 HZ, ArH) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 146.9, 145.5, 138.0 (x2), 137.3, 129.3 (x2), 127.7 (x2), 124.1 (x2), 96.0.
4'-iodo-[1 ,1 '-biphenyl]-4-amine (119)
C12H10IN PM = 295. 12 g.mol-1
Le composé 4-iodo-4'-nitrobiphényle (14,65 g, 0,045 mol, 1 équiv.) a été dissous dans l'acide acétique (80 mL) et la poudre de FeO (7,55 g, 0,135 mol, 3 équiv.) a été ajoutée lentement en 10 min à la solution à reflux. Après avoir chauffé pendant 15 min, la solution a été refroidie à température ambiante et versée dans de la glace pilée. Un composé jaune pâle a précipité de la solution (9,19 g, rendement de 70 %) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 6,72 (br, 2 H, ArH), 7,33 (br, 4 H, ArH), 7,66 (br, 2 H, ArH). (littérature, Zhang et al., 2008 ).
4'-((trimethylsilyl)ethynyl)-[1 ,1 '-biphenyl]-4-amine (118)
Ci7Hi9NSi PM= 265.42 g.mol-1
Un mélange de 4'-iodo-[1 ,1 '-biphényl]-4-amine (2,06 g, 6,98 mmol, 1 équiv.), éthynyltriméthylsilane (1 ,08 ml, 7,68 mmol, 1 ,1 équiv.), Cul (66 mg, 0. 349 mmol, 5% équiv.) et PdCl2(PPh3)2 (147 mg, 0,209 mmol, 3% équiv.) dans de la triéthylamine sèche (33 ml) a été chauffé au reflux pendant 16 h sous argon. Le mélange réactionnel a été filtré sur Celite® et lavé avec EtOAc. Le filtrat a été évaporé sous vide, le résidu a été purifié par chromatographie flash sur gel de silice en éluant avec un mélange de Cyclohexane/EtOAc (9:1 à 4:6) pour donner un solide abricot (1 ,63 g, rendement 88%). dont la RMN donne les pics caractéristiques suivants ; 1 H NMR (250 MHz, CDCI3) 5H : 7.45 (m, 4 H, ArH), 7.395 (d, 2 H, J = 8.3 Hz, ArH), 6.72 (d, 2 H, J = 8.3 Hz, ArH), 3. 73 (br, 2 H, NH2), 0.24 (s, 9 H, SiCH3) ; 13C NMR (125.78 MHz, CDCI3) 5C : 145.4, 141.36, 132.6, 130.8, 128.1 , 126.2, 121.0, 111.6, 105.5, 94.5, 0.3. 4’-ethynyl-[1 ,1 '-biphenyl]-4-amine (114)
CuHiiN PM= 193.24 g.mol-1
Une solution de 4'-((triméthylsilyl)éthynyl)-[1 ,1 '-biphényl]-4-amine (1 ,63 g, 6,14 mmol) et de NaOH 10% (14,6 ml_) dans du méthanol (61 mL) a été portée à reflux pendant 16 h. Après refroidissement, le mélange réactionnel a été évaporé à sec. Le résidu a été purifié par chromatographie flash sur gel de silice en éluant avec Cyclohexane:EtOAc (9:1 à 1 :9) pour donner un solide orange pâle (1 . 02 g, rendement 86%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 7.56 (dd, 2 H, J = 1.5, J = 6.5, ArH), 7.46 (dd, 2 H, J = 1 .5, J = 6.5, ArH), 7.40 (dd, 2 H, J = 1 .5, J = 6. 5, ArH), 6.65 (dd, 2 H, J = 1.5, J = 6.5, ArH), 5.31 (s, 2 H, NH2), 4.14 (s, 1 H, CH) ; 13C RMN (125.78 MHz, DMSO-d6) 5C : 148.9 ; 141.0 ; 132. 1 (x2) ; 127.2 (x2) ; 126.0 ; 125.2 (x2) ; 118.6 ; 114.1 (x2) ; 83.7 ; 80.6 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calcd. pour [CI4HI2N]+, 194.0964, trouvé 194.0963.
(E)-4'-(2-(4,4,5,5-tetramethyl-1 ,3,2-dioxaborolan-2-yl)vinyl)-[1 ,1 '-biphenyl]-4- amine (115)
C20H24BNO2 PM= 321.22 g.mol-1
Une solution sous argon de 114, 4'-éthynyl-[1 ,1 '-biphényl]-4-amine (0,6 g, 3,1 mmol, 1 équiv.) dans du toluène anhydre (20 mL) et du RuHCI(CO)(PPh3)3 (0,14 g, 0,15 mmol, 5 équiv.) a été agitée pendant 5 minutes. Puis le 4,4,5,5-Tétraméthyl-1 ,3,2- dioxaborolane (1 ,99 g, 15,5 mmol, 5 équiv.) a été ajouté. Le mélange a été agité pendant 18 h à 50 °C. La réaction brute a été concentrée dans le vide puis extraitée avec Et20 et une solution saturée de NaHCOs. La couche organique a été concentrée sous vide et purifiée par chromatographie sur colonne de gel de silice avec 50:50 (Cyclohexane/AcOEt). Le produit pur a été obtenu sous forme d'huile vert foncé (0.86 g, rendement 89 %) ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 7.56 (m, 4 H, ArH)7.49 (d, 2 H, J = 8.5, ArH), 7.30 (d, 1 H, J = 16.5, ArH), 6.64 (d, 2 H, J = 8.5, ArH), 6.10 (d, 1 H, J = 16. 5, CHCH), 5.27 (s, 2 H, NH2), 1.25 (s, 12 H, CH3COB), 1.16 (s, 12 H, CH3COB) ; 13C NMR (125.78 MHz, CDCI3) 5C : 149. 0, 148.7, 141.3, 134.2, 127.5 (x2), 127.0 (x2), 126.5, 125.3 (x2), 114.2 (x2), 82.9, 81.3, 73.5, 24.6, 24.4.
Analoques d’ArvIvinvI coumarines:
(E)-2-oxo-6-styryl-2H-chromene-3-carboxylique acide (LSP16-2074)
C18H12O4 PM= 292.29 g.mol-1
Une solution sous argon du composé 242, 6-iodo-2-oxo-2H-chromène-3-carboxylate d'éthyle (0,2 g, 0,58 mmol, 1 équiv.,) ; K2CO3 (0,4 g, 2,9 mmol, 5 équiv.) ; Pd(PPh3)4 (0,135 g, 0,116 mmol, 20 mol%,) dans du THF/eau 4:1 (10 mL) a été agitée pendant 15 minutes. Puis l'acide trans-2-phénylvinyl-boronique (0,112 g, 0,755 mmol, 1 ,3 équiv.) a été ajouté. Le mélange a été porté à reflux pendant 12 h. La réaction brute a ensuite été concentrée sous vide. Le mélange a été acidifié avec une solution 1 M de HCl et extrait dans Et20 (2 x 100 mL) et AcOEt (2 x 100 mL). La couche organique a été séchée sur Na2SO4, concentrée dans le vide puis précipitée dans DCM / Pentane pour obtenir un solide qui a été pris dans EtOH/KOHaq 1 M (10 mL) sous reflux pendant 4 h. La réaction brute a ensuite été acidifiée avec H2SO4 1 M. Le solide jaune a été filtré et lavé avec quelques gouttes Et20 pour obtenir le produit pur final en (82 mg, rendement 48%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO_d6) 5H : 8.71 (s, 1 H, CHCOOH), 8.10 (d, 1 H, J = 2 Hz, ArH), 7. 99 (dd, 1 H, J = 2 Hz, J = 8,5 Hz, ArH), 7.62 (d, 2 H, J = 7,5 Hz, ArH), 7.46 (d, 1 H, J = 8,5 Hz, ArH), 7.41 (m, 2 H, ArH), 7.32 (s, 2H, CHCH), 7.29 (d, 1 H, J = 7,5 Hz, ArH) ; 13C NMR (125. 78 MHz, DMSO_d6) 5C : 163.9, 156.6, 153.8, 148.1 , 136.6, 134.0, 132.0, 129.5, 128.7 (x2), 127.3, 127.4, 126. 5 (x2), 118,8, 188,2, 116,5 ; HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- : calculé pour [C-isHnC ]-, 291.0663, trouvé 291.0664.
(E)-7-methoxy-2-oxo-6-styryl-2H-chromene-3-carboxylique acide (LSP16-2077) C19H14O5 PM = 322.31 g.mol'1
Une solution d'un composé 243, 6-iodo-7-méthoxy-2-oxo-2H chromène-3-carboxylate d'éthyle (0,8 g, 2,14 mmol, 1 équiv.,) ; K2CO3 (1 ,48 g, 10,7 mmol, 5 équiv.) ; Pd(PPh3)4 (0,5 g, 0,43 mmol, 20 mol%,) dans du THF/eau 4:1 (20 mL) a été agitée pendant 15 minutes. Puis l'acide trans-2-phénylvinylboronique (0,32 g, 2,14 mmol, 1 équiv.) a été ajouté. Le mélange a été porté à reflux pendant 12 h. La réaction brute a ensuite été concentrée sous vide. Le mélange a été acidifié avec une solution 1 M de H2SO4. Le solide a été filtré (0.455 g) puis a été trituré dans de l'EtOH chaud ( 70 mL) pendant 1 h sous reflux. Le solide jaune a ensuite été filtré et lavé avec quelques gouttes de EtOH et Et20 chauds pour obtenir le produit pur final (67 mg, rendement 10 %) ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 12. 82 (s, 1 H, COOH), 8.89 (s, 1 H, CHCOOH), 7.85 (s, 1 H, ArH), 7.53 (d, 2 H, J = 8.5 Hz, ArH), 7.38 (d, 1 H, J = 7.5 Hz, ArH), 7. 36 (d, 1 H, J = 8 Hz, ArH), 7.35 (d, 1 H J = 16.5 Hz, CHCH), 7.29 (m, 1 H, ArH), 7.15 (d, 1 H, J = 16.5 Hz, CHCH), 6.92 (s, 1 H, CHOCH3), 4. 03 (s, 3 H, OCH3) ; 13C NMR (125.78 MHz, CDCI3) 5C : 164.7, 163.6, 163.2, 156.5, 151.4, 137.1 , 132.3, 129.0, 128.6, 127.4, 127.2, 127.1 , 120.9, 112.5, 111.6, 99.2, 56.8. HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [Ci9Hi50s]+, 323.0914, trouvé 323.0928.
(E)-ethyl 7-hvdroxy-2-oxo-6-styryl-2H-chromene-3-carboxylate (209)
C20H16O5 PM = 336.34 g.mol'1
Une solution sous argon du composé 196, 6-iodo-7-(méthoxyméthoxy)-2-oxo-2H- chromène-3-carboxylate d'éthyle (0,865 g, 2,14 mmol, 1 équiv.) ; K2CO3 (1 ,48 g, 10,7 mmol, 5 équiv.) ; Pd(PPhs)4 (0,5 g, 0,43 mmol, 20 mol%) dans 4:1 THF/eau (20 mL) a été agitée pendant 15 minutes. Puis l'acide trans-2-phénylvinylboronique (0,32 g, 2,14 mmol, 1 équiv.) a été ajouté. Le mélange a été porté à reflux pendant 12 h. La réaction brute a ensuite été concentrée sous vide. Le mélange a été acidifié avec H2SO4.conc 95% (22 mmol, pH = 1 ), puis agité pendant 15 min à 40 °C. Le solide a été filtré puis trituré dans de l'EtOH chaud (70 mL) pendant 1 h sous reflux. Le solide jaune a ensuite été purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (en utilisant le gradient 8:2 à 4:6 de Cyclohexane/EtOAc) pour obtenir le produit pur final (112 mg, rendement de 15 %) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 11 . 40 (s, 1 H, OH), 8.67 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8.18 (s, 1 H, ArH), 7.57 (d, 2 H, J = 8.5 Hz, ArH), 7.40 (d, 1 H, J = 7.5 Hz, ArH), 7.39 (d, 1 H, J = 7. 5 Hz, ArH), 7.36 (d, 1 H J = 16.5 Hz, CHCH), 7.28 (m, 1 H, ArH), 7.26 (d, 1 H, J = 16.5 Hz, CHCH), 6.81 (s, 1 H, CHOH), 4.26 (q, J = 7 Hz, 3 H, CH2CH3), 1 .30 (t, J = 7 Hz, 2 H, CH2CH3) ; 13C RMN (125. 78 MHz, CDCI3) 5C : 162.8, 161.3, 156.2, 155.9, 149.3, 137.1 , 129.4, 128.8, 128.4, 128.3, 128.2, 127.7, 126.4, 122.9, 121.6, 112.6, 110.7, 101.8, 60.8, 14.1. (E)-6-(2-(4'-amino-[1 ,T-biphenyl]-4-yl)vinyl)-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylique acid (LSP16-2072)
C24H14NO4 PM= 383.40 g.mol-1
Une solution sous flux d'argon de 242, 6-iodo-2-oxo-2H-chromène-3-carboxylate d'éthyle (0,2 g, 0,58 mmol, 1 équiv.) ; K2CO3 (0,4 g, 2,9 mmol, 5 équiv.) ; Pd(PPh3)4 (0,135 g, 0. 116 mmol, 20 mol%) dans 4:1 THF/eau (10 mL), 82, (E)-4'-(2-(4, 4,5,5- tétraméthyl-1 ,3,2-dioxaborolan-2-yl)vinyl) [1 ,1 '-biphényl]-4-amine (0,134 g, 0,69 mmol, 1 ,2 équiv.) a été porté à reflux pendant 12 h. La réaction brute a ensuite été concentrée sous vide. Le mélange a été extrait avec de l'eau et de l'AcOEt (3 x 100 mL). La couche organique a été séchée sur Na2SO4, concentrée sous vide puis précipitée dans du pentane pour obtenir un solide qui a été trituré dans de l'EtOAc chaud. Le solide beige a ensuite été filtré et lavé avec quelques H2O et Et2<3 pour obtenir le produit pur final sous forme de solide jaune (30 mg, rendement de 13%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO_d6) 5H : 8.72 (s, 1 H, CHCOOH), 8.11 (d, 1 H, J = 2 Hz, ArH), 8.01 (dd, 1 H, J = 2.0 Hz, 8.5 Hz, ArH), 7.69 (s, 2 H, ArH), 7. 48 (d, 1 H, J = 8.5 Hz), 7.35 (br, 1 H), 7.28 (br, 3 H), 7.10 (br, 3 H), 7.01 (br, 4 H) ; 13C RMN (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 127.4, 127.4, 127. 4, 126.3, 147.9, 131.8, 128.8, 127.1 , 126.9, 125.9, 116.3 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé, pour [C24H14O4Na+]+, 406.1050, trouvé 406.1054.
(E)-ethyl 6-(2-(4'-amino-[1 ,1 '-biphenyl]-4-yl)vinyl)-7-methoxy-2-oxo-2H- chromene-3-carboxylate (LSP16-2085)
C27H23NO5 PM = 441.48 g.mol-1
Une solution sous flux d'argon de B49-II, 6-iodo-7-méthoxy-2-oxo-2H-chromène-3- carboxylate d'éthyle (0,932 g, 2,49 mmol, 1 équiv.) ; K2CO3 (1 ,728 g, 12,5 mmol, 5 équiv.) ; Pd(PPh3)4 (0,58 g, 0. 5 mmol, 20 mol%) dans 4:1 THF/eau (25 mL), 82, (E)- 4'-(2-(4,4,5,5-tétraméthyl-1 ,3,2-dioxaborolan-2-yl)vinyl) [1 ,T-biphényl]-4-amine (0,134 g, 0,69 mmol, 1 ,2 équiv.) a été porté à reflux pendant 12 h. La réaction brute a ensuite été concentrée sous vide. Le mélange a été extrait avec de l'eau et de l'AcOEt (3 x 100 mL). La couche organique a été séchée sur MgSO4, filtrée à travers un tampon de célite® et concentrée sous vide pour obtenir le produit final sous forme de solide brun (0.305g, rendement 69%) ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 8.54 (s, 1 H, CHCOOEt), 7.75 (s, 1 H, ArH), 7.54 (s, 4 H, ArH), 7. 43 (d, 2 H, J = 8.5 Hz, ArH), 7.35 (d, 1 H, J = 16.5 Hz, CHCH), 7.12 (d, 1 H, J = 16.5 Hz, CHCH), 6.62 (s, 1 H, CHOCH3), 6. 75 (d, 2 H, J = 8,5 Hz, CHCNH2), 4,39 (q, 2 H, J = 7,5 HZ, CH2CH3), 3,98 (s, 3 H, OCH3), 1 ,40 (t, 3 H, J = 7,5 HZ, CH2CH3).
(E)-ethyl 6-(2-(4'-amino-[1 ,1 '-biphenyl]-4-yl)vinyl)-7-methoxy-2-oxo-2H- chromene-3-carboxylate (LSP16-2043)
C28H26N2O4 PM= 454.52g. mol'1
Une solution sous flux d'argon du composé 7-(diethylamino)-6-iodo-2-oxo-2H- chromene-3-carboxylic acid, acide 7-(diéthylamino)-6-iodo-2-oxo-2H-chromène-3- carboxylique (0,1 g, 0,26 mmol, 1 équiv.) ; Na2CO3 (0,372 g, 1 ,3 mmol, 5 équiv.) ; Pd(PPh3)4 (0,06 g, 0. 05 mmol, 20 mol%) dans 4:1 THF/eau (6 mL), 82, (E)-4'-(2- (4,4,5,5-tétraméthyl-1 ,3,2-dioxaborolan-2-yl)vinyl) [1 ,1 '-biphényl]-4-amine (0,1 g, 0,31 mmol, 1 ,2 équiv.) a été porté à reflux pendant 12 h. La réaction brute a ensuite été concentrée sous vide. Le mélange a été extrait avec une solution sat. NH4Claq et Et20 (2 x 100 mL) et DCM (2 x 100 mL). La couche organique a été séchée sur Na2SO4, concentrée sous vide puis purifiée par chromatographie sur colonne de gel de silice (en utilisant 6:4:0, 5% DCM/AcOEt/AcOH) pour obtenir le produit pur final sous forme de solide jaune (26 mg, rendement de 22%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6 + quelques gouttes de TFA-d) 5H : 8.54 (s, 1 H, CHCOOH), 8. 08 (s, 1 H, ArH), 7.58 (s, 4 H, ArH), 7.40 (d, 2 H, J = 8.5 Hz, ArH), 7.15 (d, 2 H, J = 5.5 Hz, ArH), 6.99 (s, 1 H, ArH), 6.64 (d, 2 H, J = 8.5 Hz, ArH), 3. 30 (q, 4 H, J = 7,0 HZ, CH2CH3), 1 ,09 (t, 6 H, J = 7,0 HZ, CH2CH3) ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C2/8H27N2O4]+, 453.1820, trouvé 455.1984carboxylique Procedure générale 7: Synthèse des Arylethylnyl coumarines par couplage de Sonoqashira coupling.
Des dérivés d'iodocoumarine (0,25 mmol, 1 équiv.), un alcyne (0,5 mmol, 2 équiv.), du dichlorure de bis(diphénylphosphino)palladium (0. 0125 mmol, 5% équiv.), Cul (0,025 mmol, 10% équiv.) et NEt3 (2 mmol, 8 équiv.) ont été dissous dans 2 mL de DMF et agités à t.e.r. pendant 16 h (sauf indication contraire). La progression de la réaction a été suivie par CCM en utilisant le mélange CH2CI2-MeOH 10:1 comme éluant. Une fois la réaction terminée, le solvant a été évaporé sous vide et le résidu solide a été purifié par chromatographie éclair en utilisant le système de solvant à gradient graduel CH2CI2-EtOAc comme éluant. Les nouveaux composés suivants ont été préparés en utilisant cette procédure.
2-oxo-6-(phenylethynyl)-2H-chromene-3-carboxylique acide (LSP17-1044)
C18H10O4 PM = 290.27 g. mol'1
Selon la procédure générale 7, l'acide 6-iodo-2-oxo-2H-chromène-3-carboxylique (0,1 g, 0,31 mmol, 1 équiv.) dans du DMF (2,5 mL) a été mis en réaction avec du phénylacétylène (70 pL, 0,63 mmol, 2 équiv.), du dichlorure de bis(diphénylphosphino)palladium (11 mg, 0. 158x10-3 mmol, 5% équiv.), Cul (6 mg, 0,316x10-3 mmol, 10% équiv.) et NEt3 (0,35 mL, 2,53 mmol, 8 équiv.) qui, après chromatographie sur colonne (90% CH2CI2, 10% MeOH), a donné la phényléthynyl- coumarine (0. 100 g, rendement 77%) sous forme de solide brun ; RMN 1 H (500 MHz, CDCI3) 5H : 8.90 (s, 1 H, CHCCO2H), 7.88 (s, 1 H, CH), 7.87 (dd, 1 H, J = 2.5 Hz, 7.5 Hz, ArH), 7.53 (m, 2 H, ArH), 7.46 (d, 1 H, J = Hz) ; 7.37 (m, 3 H, ArH) ; RMN 13C (62. 9 MHz, DMSO-d6) 5C : 163.8, 162.3, 154.0, 151.0, 138.6, 133.1 , 131.9 (x2), 129.3, 128.7 (x2), 122.3, 118. 7, 117,7 (x2), 115,8, 91 ,2, 86,5 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé, pour [C18H1104]+, 291.0652, trouvé 291.0657.
7-methoxy-2-oxo-6-(phenylethynyl)-2H-chromene-3-carboxylique acide (LSP17- 1046)
C19H12O5 PM = 320.30 g. mol'1
Selon la procédure générale 7, l'acide 6-iodo-7-méthoxy-2-oxo-2H-chromène-3- carboxylique (0,1 g, 0,28 mmol, 1 équiv.) dans du DMF (2,3 mL) a été mis en réaction avec du phénylacétylène (64 pL, 0,58 mmol, 2 équiv.), du dichlorure de bis(diphénylphosphino)palladium (10 mg, 0. 144x10-3 mmol, 5% équiv.), Cul (5,5 mg, 0,289x10-3 mmol, 10% équiv.) et NEt3 (0,322 mL, 2,31 mmol, 8 équiv.) qui, après chromatographie sur colonne (90% CH2CI2, 10% MeOH), a donné la phényléthynylcoumarine (0. 067 g, rendement de 73%) comme un solide brun ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 13.11 (br, 1 H, OH), 8.70 (s, 1 H, CHCCO2H), 8. 07 (s, 1 H, CH), 7.53 (dd, 2 H, J = 2.0, 7.5 Hz, ArH), 7.43 (m, 3 H, ArH), 7.20 (s, 1 H, ArH), 3.99 (s, 3 H, OCH3) ; 13C RMN (62. 9 MHz, DMSO-d6) 5C : 164.1 , 163.9, 156.7, 156.6, 148.1 , 134.2, 131.2 (x2), 128.8, 128.7 (x2), 122.1 , 114.9, 111. 4, 109,3, 99,4, 93,3, 84,0, 57,0 ; HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- : calculé pour [C19H11O5]-, 319.0612, trouvé 319.0606. carboxylique.
7-(diethylamino)-2-oxo-6-(phenylethynyl)-2H-chromene-3-carboxylique acide (LSP17-1042)
C22H19NO4 PM = 361.31 g.mol-1
Selon la procédure générale 7, le 7-hydroxy-6-iodo-2-oxo-2H-chromène-3-carboxylate d'éthyle (0,1 g, 0,26 mmol, 1 équiv.) dans du DMF (2,3 mL) a été mis en réaction avec du phénylacétylène (56 pL, 0,52 mmol, 2 équiv.), du dichlorure de bis(diphénylphosphino)palladium (9 mg, 0,129x10-3 mmol, 5% équiv. ), Cul (4,9 mg, 0,258x10-3 mmol, 10% équiv.) et NEt3 (0,288 mL, 2,06 mmol, 8 équiv.) qui, après chromatographie sur colonne (90% CH2CI2, 10% MeOH), a donné la phényléthynyl- coumarine (0,031 g, rendement de 32%) sous forme de solide brun ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 12. 79 (br, 1 H, OH), 8.59 (s, 1 H, CHCCO2H), 7.97 (s, 1 H, CH), 7.52 (dd, 2 H, J = 2.0, 7.8 Hz, ArH), 7.42 (m, 3 H, ArH), 6. 74 (s, 1 H, ArH), 3.67 (q, 4 H, J = 7.0 Hz, NCH2CH3), 1 .22 (t, 6 H, J = 7.0 Hz, NCH2CH3) ; 13C NMR (62. 9 MHz, DMSO-d6) 5C : 164.1 , 157.7, 156.3, 154,5, 148.1 , 137.7, 130.8 (x2), 128.7 (x2), 128.5, 122.4, 111.3, 109.1 , 106. 9, 100,8, 92,4, 88,1 , 45,3 (x2), 12,9 (x2) ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C22H2o04N]+, 362.1387, trouvé 362.1385.
Ethyl 7-hydroxy-2-oxo-6-(phenylethynyl)-2H-chromene-3-carboxylate (266) C20H14O5 PM = 334.32 g. mol'1
Selon la procédure générale 7, le 7-hydroxy-6-iodo-2-oxo-2H-chromène-3-carboxylate d'éthyle (0,150 g, 0,41 mmol, 1 équiv.) dans du DMF (3,5 mL) a été mis en réaction avec du phénylacétylène (91 pL, 0. 83 mmol, 2 équiv.), le dichlorure de bis(diphénylphosphino)palladium (14 mg, 0,208x10-3 mmol, 5% équiv.), Cul (7,9 mg, 0,416x10-3 mmol, 10% équiv.) et NEt3 (0,464 mL, 3,33 mmol, 8 équiv.). Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante avant d'être trempé par l'eau. Le mélange aqueux a été extrait avec CH2CI2, séché sur MgSO4 et concentré sous vide, ce qui, après chromatographie sur colonne (90% CH2CI2, 10% MeOH), a donné la phényléthynyl-coumarine (0,066 g, rendement 47%) sous forme de solide brun ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 8.90 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8.24 (s, 1 H, OH), 7.94 (d, 2 H, J = 7. 0 Hz, ArH), 7.81 (s, 1 H, CH), 7.63 (s, 1 H, CH), 7.55 (m, 2 H, ArH), 7.46 (m, 1 H, ArH), 4.31 (q, 2 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3), 1.32 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3) ; 13C RMN (62. 9 MHz, DMSO-d6) 5C : 162,5, 157,2, 157,0, 155,9, 152,5, 149,3, 129,2, 128,9 (x2), 128,6, 126,4, 124,6 (x2), 122,3, 115,2, 114,5, 101 ,4, 98,8, 60,9, 13,8.
7-hydroxy-2-oxo-6-(phenylethynyl)-2H-chromene-3-carboxylique acide (LSP17- 1177)
C18H10O5 PM = 306.27 g. mol'1
Une solution de 7-hydroxy-2-oxo-6-(phényléthynyl)-2H-chromène-3-carboxylate d'éthyle (60 mg, 0,18 mmol) et de NaOH 10% (0,3 mL) dans de l'éthanol (1 mL) a été portée à reflux pendant 16 h. Après refroidissement, le mélange réactionnel a été évaporé à sec ; le résidu a été dissous dans de l'eau et acidifié avec de l'acide chlorhydrique dilué (pH 1 - 2). Le précipité a été filtré, lavé avec de l'éthanol pour donner le composé désiré (40 mg, rendement 74%) comme un solide brun ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 8. 89 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8.21 (s, 1 H, OH), 7.95 (dd, 2 H, J = 1 .6, 8.3 Hz, ArH), 7.80 (s, 1 H, CH), 7.61 (s, 1 H, CH), 7.54 (t, 2 H, J = 7. 8 Hz, ArH), 7.45 (t, 1 H, J = 7.4 Hz, ArH) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 164.0, 157.4, 157.1 , 156.9, 152.6, 149.3, 129.4, 129. 1 (x2), 128.3, 124.8 (x2), 122.4, 116.1 , 114.9, 101.6, 99.0 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C18H1105]+, 307.0601 , trouvé 306.0611.
6-((4'-amino-[1 ,T-biphenyl]-4-yl)ethynyl)-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylique acide (LSP17-1125)
C24H15NO4 PM= 381.38 g. mol'1
Selon la procédure générale 7, l'acide 6-iodo-2-oxo-2H-chromène-3-carboxylique (0,2 g, 0,64 mmol, 1 équiv.) dans du DMF (5 mL) a été mis en réaction avec la 4'-éthynyl- [1 ,1 '-biphényl]-4-amine (0,146 g, 0. 76 mmol, 1 ,2 équiv.), le dichlorure de bis(diphénylphosphino)palladium (22 mg, 0,032x10-3 mmol, 5%), Cul (12 mg, 0,063x10-3 mmol, 10% équiv.) et NEt3 (0,705 mL, 5,06 mmol, 8 équiv.). De l'eau a été ajoutée au mélange réactionnel ; le résidu a été filtré et lavé avec DCM, MeOH et Et20 pour donner le composé désiré (0.070 g, rendement de 29%) comme un solide brun ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.72 (s, 1 H, CHCCO2H), 8.11 (d, 1 H, J = 1 .5 Hz CHCC), 7.83 (m, 3 H, ArH), 7.74 (d, 2 H, J = 8. 0 Hz ArH), 7.66 (m, 3 H), 7.48 (d, 3 H, J = 8.5 Hz ArH), 7.45 (d, 1 H, J = 9.0 Hz, ArH) ; 13C RMN (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 169.3, 164.0, 156. 6, 154.7, 148.0, 139.7, 139.5, 137.0, 133.4, 133.1 , 132.4, 131.2, 128.5, 128.4, 127.5, 127.4, 124.3, 121.9, 119.5, 119.1 , 118.7, 117.2, 89.8, 88.9.
6-((4'-amino-[1 ,T-biphenyl]-4-yl)ethynyl)-7-methoxy-2-oxo-2H-chromene-3- carboxylique acide (LSP17-1127)
C25H17NO5 PM = 411.41 g. mol'1
Selon la procédure générale 7, l'acide 6-iodo-7-méthoxy-2-oxo-2H-chromène-3- carboxylique acide (0,2 g, 0,58 mmol, 1 équiv.) dans du DMF (4,6 mL) a été mis en réaction avec de la 4'-éthynyl-[ 1 ,1 '-biphényl]-4-amine (0. 134 g, 0,69 mmol, 1 ,2 équiv.), le dichlorure de bis(diphénylphosphino)palladium (20 mg, 0,029x10-3 mmol, 5% équiv.), Cul (11 mg, 0,058x10-3 mmol, 10% équiv.) et NEt3 (0,644 mL, 4,62 mmol, 8 équiv.). De l'eau a été ajoutée au mélange réactionnel ; le résidu a été filtré et lavé avec DCM, MeOH et Et20 pour donner le composé désiré (0,145 g, rendement de 61 %) sous forme de solide brun ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.05 (s, 1 H, CHCCO2H), 7. 60 (m, 6 H, ArH), 7.51 (d, 2 H, J = 8.5 Hz, ArH), 7.43 (d, 2 H, J = 6 Hz, ArH), 7.19 (s, 1 H, CHCOCH3), 6. 64 (s, 2 H, NH2), 3,99 (s, 3 H, OCH3) ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour C25H 18NO5, 412.1179, trouvé 412.1189. 6-((4'-amino-[1 ,T-biphenyl]-4-yl)ethynyl)-7-(diethylamino)-2-oxo-2H-chromene- 3-carboxylique acide (LSP17-1126)
C28H24N2O4 PM= 452.50 g.mol'1
Selon la procédure générale 7, le 7-hydroxy-6-iodo-2-oxo-2H-chromène-3-carboxylate d'éthyle (0,2 g, 0,56 mmol, 1 équiv.) dans du DMF (4,1 mL) a été mis en réaction avec de la 4'-éthynyl-[ 1 ,1 '-biphényl]-4-amine (120 mg, 0. 62 mmol, 1 ,2 équiv.), le dichlorure de bis(diphénylphosphino)palladium (18 mg, 0,03 x10-3 mmol, 5% équiv.), Cul (10 mg, 0,056x10-3 mmol, 10% équiv.) et NEt3 (0,576 mL, 4,13 mmol, 8 équiv.). De l'eau a été ajoutée au mélange réactionnel ; le résidu a été filtré et lavé avec DCM, MeOH et Et20 pour donner le composé désiré se présentant (0,22 g, rendement de 95%) comme un solide brun ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8,62 (br, 1 H, CHCCO2H), 7,96 (s, 1 H, CH), 7,60 (d, 2 H, J = 8. 4 Hz, ArH), 7.49 (d, 2 H, J = 7.7 Hz, ArH), 7.41 (d, 2 H, J = 8.6 Hz, ArH), 6.74 (s, 1 H, CHCN), 7.41 (d, 2 H, J = 8.3 Hz, ArH), 3. 70 (q, 4 H, J = 6,9 Hz, NCH2CH3), 1 ,25 (t, 6 H, J = 6,9 Hz, NCH2CH3) ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour C28H25O4N2, 453.1809, trouvé 453.1814.
Ethyl-6-((4'-amino-[1 ,T-biphenyl]-4-yl)ethynyl)-7-hydroxy-2-oxo-2H-chromene-3- carboxylate (261)
C26H19NO5 PM = 425.43 g.mol-1
Selon la procédure générale 7, le 7-hydroxy-6-iodo-2-oxo-2H-chromène-3-carboxylate d'éthyle (0,15 g, 0,42 mmol, 1 équiv.) dans du DMF (3,3 mL) a été mis en réaction avec de la 4'-éthynyl-[1 ,1 '-biphényl]-4-amine (96 mg, 0. 51 mmol, 1 ,2 équiv.), du dichlorure de bis(diphénylphosphino)palladium (15 mg, 0,021 x10-3 mmol, 5% équiv.), Cul (8 mg, 0,042x10-3 mmol, 10% équiv.) et NEt3 (0,464 mL, 3,33 mmol, 8 équiv.) ). De l'eau a été ajoutée au mélange réactionnel ; le résidu a été filtré. Le filtrat a été concentré dans le vide puis lavé avec DCM, MeOH et Et20 pour donner le composé désiré se présentant (0.112 g, rendement 63%) comme un solide brun ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 8. 88 (s, 1 H, CHCCO2H), 8.19 (s, 1 H, OH), 7.91 (d, 2 H, J = 8.4 Hz, ArH), 7.79 (s, 1 H, CH), 7.70 (d, 2 H, J = 8.3 Hz, ArH), 7.56 (s, 1 H, CHCO), 7.46 (d, 2 H, J = 8. 2 Hz, ArH), 6.66 (d, 2 H, J = 8.4 Hz, ArH), 5.14 (s, 2 H, NH2), 4.30 (q, 2 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3), 1.32 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMS0-d6) 5C : 162. 8, 157.7, 157.3, 156.2, 152.7, 149.7, 149.0, 141.6, 132.9, 127.2 (x2), 126.9, 126.1 , 126.0, 125.7 (x2), 125.4 (x2), 122.2, 115.4, 114.7, 114.3, 100.9, 99.0, 61.2, 14.2.
6-((4'-amino-[1,T-biphenyl]-4-yl)ethynyl)-7-hydroxy-2-oxo-2H-chromene-3- carboxylique acide (LSP17-1173)
C24H15NO5 PM = 397.38 g.mol-1
Une solution d'éthyl-6-((4'-amino-[1 ,1'-biphényl]-4-yl)éthynyl)-7-hydroxy-2-oxo-2H- chromène-3-carboxylate (60 mg, 0,18 mmol) et de NaOH 10% (0,3 mL) dans de l'éthanol (1 mL) a été chauffée à reflux pendant 16 h. Après refroidissement, le mélange réactionnel a été évaporé à sec ; le résidu a été dissous dans de l'eau et acidifié avec de l'acide chlorhydrique dilué (pH 1 - 2). Le précipité a été filtré, lavé avec de l'éthanol pour donner le composé désiré se présentant (0.11 g, 74%, contaminé avec NH4CI) comme un solide brun ; 1 H NMR (500 MHz, CDCI3) 5H : 8.90 (s, 1 H, CHCCO2H), 8.20 (s, 1 H, OH), 7.92 (d, 2 H, J = 8.6 Hz, ArH), 7.79 (s, 1 H, CH), 7.71 (d, 2 H, J = 8. 4 Hz, ArH), 7.57 (s, 1 H, CHCO), 7.47 (d, 2 H, J = 8.7 Hz, ArH), 6.67 (d, 2 H, J = 8.3 Hz, ArH) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 162.0, 157. 6, 157.1 , 157.0, 152.6, 149.4, 148.8, 141.5, 127.2 (x2), 126.8, 126.1 , 125.9, 125.6 (x2), 125.3 (x2), 122.1 , 115.9, 114.8, 114.2(x2), 100.8, 98.9. -triazoles coumarines :
R2 = H = > TFA (0.6 équiv.),
DCM , 25 °C, 16 h
R2 = OMe = > NaOH (4 équiv.),
EtOH/H2O (1 :1), reflux, 16 h
Procedure générale 8: Synthèse des Aryl-triazoles coumarines par Chimie click.
Des dérivés d'azidocoumarine (1 ,5 mmol, 1 équiv.), un alcyne (1 ,8 mmol, 1 ,2 équiv.), et Cul (0,025 mmol, 10% équiv.) ont été dissous dans 3 mL de DMSO dégazé et agités à 60 °C pendant 16 h (sauf indication contraire) sous argon. Une fois la réaction terminée, de l'eau a été ajoutée et la suspension résultante a été éliminée par filtration. Le résidu a été successivement lavé avec de l'eau, du DCM et de l'Et20 puis séché pour donner le composé désiré. Si le résidu est soluble par rapport au système de solvant, le solide a été purifié par chromatographie flash en utilisant le système de solvant à gradient graduel CH2CI2-MeOH comme éluant. Les nouveaux composés suivants ont été préparés en utilisant cette procédure.
Ethyl 2-oxo-6-(4-phenyl-1 H-1 ,2,3-triazol-1 -yl)-2H-chromene-3-carboxylate (262)
C20H15N3O4 PM = 361.35 g. mol'1
Selon la procédure générale 8, le 6-azido-2-oxo-2H-chromène-3-carboxylate d'éthyle (0,4 g, 1 ,54 mmol, 1 équiv.) dans du DMSO (3 mL) a été mis en réaction avec du phénylacétylène (0,204 mL, 1 ,85 mmol, 1 ,2 équiv.), et du Cul (29 mg, 0,154 mmol, 10 % équiv. ) qui, après chromatographie sur colonne (90% CH2CI2, 10% MeOH), a donné la coumarine phényltriazolique en rendement quantitatif (0,56 g) sous forme de solide brun ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 9,30 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8,83 (s, 1 H, CHN), 8,54 (d, 1 H, J = 2,7 Hz, CHCN), 8. 25 (dd, 1 H, J = 2.7, 8.9 Hz, CHCN), 7.94 (d, 2 H, J = 7.7 Hz, ArH), 7.77 (d, 1 H, J = 9.0 Hz, CHCO), 7.51 (t, 2 H, J = 7. 6 Hz, ArH), 7.40 (t, 1 H, J = 7.4 Hz, ArH), 4.32 (q, 2 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3), 1.33 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3) ; 13C RMN (62. 9 MHz, DMSO-d6) 5C : 162.2, 155.5, 153.8, 147.7, 147.4, 132.9, 129.9, 129.0 (x2), 128.3, 125.7, 125.3 (x2), 121. 0, 119.8, 119.1 , 118.5, 117.7, 61.3, 14.0 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C20H16N3O4]+, 362.1135, trouvé 362.1140. 2-oxo-6-(4-phenyl-1 H-1 ,2,3-triazol-1 -yl)-2H-chromene-3-carboxylique acide (LSP17-1100)
C18H11N3O4 PM = 333.30 g.mol-1
A une solution de 2-oxo-6-(4-phényl-1 H-1 ,2,3-triazol-1 -yl)-2H-chromène-3-carboxylate d'éthyle (0,35 g, 0,485 mmol) dans DCM (1 ml_) a été ajouté du TFA (0,883 ml_) et le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 16 h. Le mélange réactionnel a été évaporé à sec ; le résidu a été dissous dans l'eau et acidifié avec de l'acide chlorhydrique dilué (pH 1 - 2). Le précipité a été filtré, lavé avec de l'éthanol pour donner le composé désiré se présentant (0.32 g, rendement quantitatif) comme un solide brun ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 9.30 (s, 1 H, CHCCO2H), 8.79 (s, 1 H, CHN), 8.52 (d, 1 H, J = 2.6 Hz, CHCN), 8.24 (dd, 1 H, J = 2.7, 9.0 Hz, CHCN), 7. 94 (d, 2 H, J = 7,7 Hz, ArH), 7,70 (d, 1 H, J = 9,0 Hz, CHCO), 7,51 (t, 2 H, J = 7,9 Hz, ArH), 7,40 (t, 1 H, J = 7,3 Hz, ArH) ; 13C RMN (62. 9 MHz, DMSO-d6) 5C : 163,7, 156,1 , 153,8, 147,5, 147,1 , 133,0, 130,0, 129,0, 128,3 (x2), 125,6, 125,3 (x2), 121 ,0, 121 ,0, 119,9, 118,7, 117,8.
Ethyl 7-methoxy-2-oxo-6-(4-phenyl-1 H-1 ,2,3-triazol-1 -yl)-2H-chromene-3- carboxylate (263)
Ci6H9BrN2O5 PM = 389. 16 g.mol-1
Selon la procédure générale 8, le 6-azido-7-méthoxy-2-oxo-2H-chromène-3- carboxylate d'éthyle (0,3 g, 1 ,03 mmol, 1 équiv.) dans du DMSO (2 mL) a été mis en réaction avec du phénylacétylène (0,136 mL, 1 ,24 mmol, 1 ,2 équiv.), et du Cul (19. 7 mg, 0.103 mmol, 10%) qui, a donné la coumarine phényltriazol sous forme d'un solide brun (0.212 g, rendement 52%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.97 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8.83 (s, 1 H, CHN), 8.32 (s, 1 H, CHCN), 7.95 (d, 2 H, J = 8. 0 Hz, ArH), 7.49 (t, 2 H, J = 7.7 Hz, ArH), 7.45 (s, 1 H, CHCO), 7.94 (t, 1 H, J = 7.6 Hz, ArH), 4.30 (q, 2 H, J = 7. 1 Hz, CH2CH3), 4.01 (s, 3 H, OCH3), 1 .31 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 162. 3, 156.8, 156.6, 155.5, 148.2, 146.2, 129.9, 128.9 (x2), 127.9, 126.9, 125.3 (x2), 123.3, 123.0, 114.9, 110. 9, 100,6, 60,9, 57,3, 13,8 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C16H10N2O5]+, 392.1241 , trouvé 392.1245.
7-methoxy-2-oxo-6-(4-phenyl-1 H-1 ,2,3-triazol-1 -yl)-2H-chromene-3- carboxylique-acid (LSP17-1116)
C19H13N3O5 PM = 363.32 g. mol'1
Une solution de 7-méthoxy-2-oxo-6-(4-phényl-1 H-1 ,2,3-triazol-1 -yl)-2H-chromène-3- carboxylate d'éthyle (100 mg, 0,25 mmol) et de NaOH 10% (0,384 mL) dans de l'éthanol (0,084 mL) a été portée à reflux pendant 16 h. Après refroidissement, le mélange réactionnel a été évaporé à sec ; le résidu a été dissous dans de l'eau et acidifié avec de l'acide chlorhydrique dilué (pH 1 - 2). Le précipité a été filtré, lavé avec de l'éthanol pour donner le composé désiré se présentant (58 mg, 63%, contaminé avec NH4CI) comme un solide brun ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.96 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8.80 (s, 1 H, CHN), 8.30 (s, 1 H, CHCN), 7.94 (d, 2 H, J = 8.0 Hz, ArH), 7. 49 (t, 2 H, J = 7.8 Hz, ArH), 7.44 (s, 1 H, CHCO), 7.38 (t, 1 H, J = 7.3 Hz, ArH), 4.00 (s, 3 H, OCH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 163. 8, 156.8, 156.7, 156.3, 148.1 , 146.4, 130.1 , 128.9 (x2), 128.1 , 127.1 , 125.3 (x2), 123.5, 123.1 , 115.7, 111.2, 100.7, 57.4.
7-(diethylamino)-2-oxo-6-(4-phenyl-1 H-1 ,2,3-triazol-1 -yl)-2H-chromene-3- carboxylique acid (LSP17-1153)
C22H20N4O4 PM = 404.42 g.mol'1
Selon la procédure générale 8, le 6-amino-7-(diéthylamino)-2-oxo-2H-chromène-3- carboxylate (0,100 g, 0,33 mmol, 1 équiv.) dans du DMSO (0,6 mL) a été mis en réaction avec du phénylacétylène (0,043 mL, 0,39 mmol, 1 ,2 équiv.), et du Cul (6. 3 mg, 0.033 mmol, 10% équiv.), ce qui a donné la phényltriazol coumarine sous forme d'un solide brun (0.06 g, rendement de 45%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.92 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8.64 (br, 1 H, CHN), 7.95 (s, 1 H, CHCN), 7. 93 (d, 2 H, J = 7,5 Hz, ArH), 7.48 (t, 2 H, J = 7,7 Hz, ArH), .48 (t, 1 H, J = 7,5 Hz, ArH), 7.10 (s, 1 H, CHCO), 2. 94 (q, 4 H, J = 7.2 Hz, NCH2CH3), 0.94 (t, 6 H, J = 7.1 Hz, NCH2CH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6) 5C : 164. 1 , 157.1 , 156.6, 156.3, 150.2, 147.8, 146.9, 130.2, 130.2, 129.0 (x2), 128.2, 125.4 (x2), 124.7, 123.7, 110. 4, 105,8, 45,1 (x2), 12,2 (x2) ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C22H21N4O4I+, 405.1557, trouvé 405.1574.
Ethyl-6-(4-(4'-amino-[1 ,1 '-biphenyl]-4-yl)-1 H-1 ,2,3-triazol-1 -yl)-2-oxo-2H- chromene-3-carboxylate (264)
C26H20N4O4 PM = 452.46 g. mol'1
Selon la procédure générale 8, le 6-azido-2-oxo-2H-chromène-3-carboxylate de B53- I éthyle (0,800 g, 3,08 mmol, 1 équiv.) dans du DMSO (7 mL) a été mis en réaction avec la 4'-éthynyl-[ 1 ,1 '-biphényl]-4-amine (0,716 mL, 3,70 mmol, 1 ,2 équiv.), et Cul (59 mg, 0,308 mmol, 10% équiv. ) qui a donné la coumarine phényltriazolique sous forme d'un solide brun (1 ,23 g, rendement 87%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6 + quelques gouttes de TFA-d) 5H : 9. 29 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8.77 (s, 1 H, CHN), 8.49 (d, 1 H, J = 2.5 Hz, CHCN), 8.23 (dd, 1 H, J = 2.5, 9.0 Hz, CHCN), 8.02 (d, 2 H, J = 8. 0 Hz, ArH), 7.83 (d, 2 H, J = 8.4 Hz, ArH), 7.79 (d, 2 H, J = 8.4 Hz, ArH), 7.62 (d, 1 H, J = 9.0 Hz, CHCO), 7.48 (t, 2 H, J = 8. 5 Hz, ArH), 4.28 (q, 2 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3), 1 .29 (t, 3 H, J = 7.1 Hz, CH2CH3) ; 13C NMR (62.9 MHz, DMSO-d6 + quelques gouttes de TFA-d) 5C : 162. 5, 155.8, 154.2, 147.9, 147.3, 140.1 , 138.8, 133.3, 133.2, 130.8, 129.9, 128.3, 128.1 , 127.5, 127.3, 126.2, 125.8, 124.1 , 124. 1 , 121.1 , 120.0, 119.3, 118.8, 117.9, 61.5, 13.9 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C26H2iN4O4]+, 453.1557, trouvé 453.1571.
6-(4-(4'-amino-[1 ,1 '-biphenyl]-4-yl)-1 H-1 ,2,3-triazol-1 -yl)-2-oxo-2H-chromene-3- carboxylique acid (LSP17-1115)
C24H16N4O4 PM = 424.41 g. mol'1
Une solution d'éthyl-6-(4-(4'-amino-[1 ,T-biphényl]-4-yl)-1 H-1 ,2,3-triazol- 1 -yl)-2-oxo- 2H-chromène-3-carboxylate (0,186 g, 0,411 mmol) et de NaOH 10% (0,6 mL) dans de l'éthanol (0,6 mL) a été chauffée à reflux pendant 16 heures. 6 mL) a été porté à reflux pendant 16 h. Après refroidissement, le mélange réactionnel a été évaporé à sec ; le résidu a été dissous dans l'eau et acidifié avec de l'acide chlorhydrique dilué (pH 1 - 2). Le précipité a été filtré, lavé avec de l'éthanol pour donner le composé désiré se présentant (0.165 g, 95% de rendement) comme un solide brun ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6 + quelques gouttes de TFA-d) 5H : 9.29 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8.77 (s, 1 H, CHN), 8.49 (d, 1 H, J = 2.5 Hz, CHCN), 8. 23 (dd, 1 H, J = 2.5, 9.0 Hz, CHCN), 8.02 (d, 2 H, J = 8.0 Hz, ArH), 7.83 (d, 2 H, J = 8.4 Hz, ArH), 7.79 (d, 2 H, J = 8.4 Hz, ArH), 7. 62 (d, 1 H, J = 9,0 Hz, CHCO), 7,48 (t, 2 H, J = 8,5 Hz, ArH), 4,28 (q, 2 H, J = 7,1 Hz, CH2CH3), 1 ,29 (t, 3 H, J = 7,1 Hz, CH2CH3). ethyl 6-(4-(4'-amino-[1 ,1 '-biphenyl]-4-yl)-1 H-1 ,2,3-triazol-1 -yl)-7-methoxy-2-oxo- 2H-chromene-3-carboxylate (265)
C27H22N4O5 PM = 482.49 g.mol'1
Selon la procédure générale 8, le 6-azido-7-méthoxy-2-oxo-2H-chromène-3- carboxylate d'éthyle B53-II (0,32 g, 1 ,1 mmol, 1 équiv.) dans du DMSO (2,2 mL) a été mis en réaction avec la 4'-éthynyl-[1 ,1 '-biphényl]-4-amine (0,256 g, 1 ,32 mmol, 1 ,2 équiv. ), et Cul (21 mg, 0,110 mmol, 10% équiv.) ce qui a donné la coumarine phényltriazol sous forme d'un solide brun (0,462 g, rendement 86%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.96 (s, 1 H, CHCCO2Et), 8.84 (s, 1 H, CHN), 8.33 (S, 1 H, CHCN), 7.94 (d, 2 H, J = 8. 5 Hz, ArH), 7.67 (d, 2 H, J = 8.5 Hz, ArH), 7.47 (s, 1 H, OCH3), 7.45 (d, 2 H, J = 8.5 Hz, ArH), 6.67 (d, 2 H, J = 8. 5 Hz, ArH), 4,31 (q, 2 H, J = 7,5 Hz, CH2CH3), 4,02 (s, 3 H, J = 7,0 Hz, OCH3), 1 ,32 (t, 3 H, J = 7 Hz, CH2CH3) ; 13C RMN (125. 78 MHz, DMSO-d6) 5C : 162,5, 157,0, 156,8, 155,8, 148,5, 146,4,
140.3, 132,8, 127,4, 127,1 , 126,9, 125,7 (x2), 125,7 (x2), 125,3, 123,3, 123,1 , 115,1 ,
114.4, 114,4, 114,3, 111 ,1 , 100,8, 61 ,1 , 57,5, 14,0.
6-(4-(4'-amino-[1 ,1 '-biphenyl]-4-yl)-1 H-1 ,2,3-triazol-1 -yl)-7-methoxy-2-oxo-2H- chromene-3-carboxylique acid (LSP17-1124)(D04)
C25H18N4O5 PM = 454.43 g.mol'1
Une solution 6-(4-(4'-amino-[1 , 1 '-biphényl]-4-yl)-1 H-1 ,2,3-triazol-1-yl)-7-méthoxy-2- oxo-2H-chromène-3-carboxylate d'éthyle (0,440 g, 0,912 mmol) et de NaOHaq 10% (1 ,40 mL) dans de l'éthanol (1. 40 mL) a été porté à reflux pendant 16 h. Après refroidissement, le mélange réactionnel a été évaporé à sec ; le résidu a été dissous dans l'eau et acidifié avec de l'acide chlorhydrique dilué (pH 1 - 2). Le précipité a été filtré, lavé avec DCM et Et20. Le solide impur a ensuite été trituré dans EtOH-H2O (80°C) pendant 1 heure. Le solide a ensuite été filtré et lavé avec de l'EtOH chaud pour donner le composé (4-(4'-amino-[1 , 1 '-biphenyl]-4-yl)-1 H-1 ,2,3-triazol-1 -yl)-7- methoxy-2-oxo-2Hchromene- 3-carboxylate sous forme de solide brun (0,12 g, rendement de 29%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8. 96 (s, 1 H, CHCCO2H), 8.81 (s, 1 H, CHN), 8.31 (S, 1 H, CHCN), 7.67 (d, 2 H, J = 8.5 Hz, ArH), 7.94 (d, 2 H, J = 8.5 Hz, ArH), 7. 46 (S, 1 H, CHOCH3) 7.44 (d, 2 H, J = 8.5 Hz, ArH), 76.67 (d, 2H, J = 8.5 Hz, ArH), 4.02 (s, 3 H, OCH3) ; 13C NMR (125.78 MHz, DMSO-d6) 5C : 163. 9, 156.9, 156.8, 156.4, 148.3, 146.4, 140.3, 127.1 , 127.1 (x2), 125.8 (x2), 125.7 (x2), 123.3, 123.2, 115.7, 114.4 (x2), 111.3, 100.8, 57.5.
6-(4-(4'-amino-[1 ,1 '-biphenyl]-4-yl)-1 H-1 ,2,3-triazol-1 -yl)-7-(diethylamino)-2-oxo- 2H-chromene-3-carboxylique acid (LSP17-1154a)
C28H25N5O4 PM = 495.53g. mol'1
Selon la procédure générale 8, l'acide 6-azido-7-(diéthylamino)-2-oxo-2H-chromène- 3-carboxylique carboxylique (0,1 g, 0,33 mmol, 1 équiv.) dans du DMSO (0,6 mL) a été mis en réaction avec la 4'-éthynyl-[1 ,1 '-biphényl]-4-amine (77 mg, 0,397 mmol, 1 ,2 équiv.), et Cul (6. 3 mg, 0.033 mmol, 10% équiv.) ce qui a donné la coumarine phényltriazol sous forme d'un solide brun (79 mg, rendement 48%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.88 (s, 1 H, CHCCO2H), 8.67 (s, 1 H, CHN), 8.03 (d, 2 H, J =
8.5 Hz, ArH), 87.94 (s, 1 H, CHCN), 7. 81 (d, 2 H, J = 8,5 Hz, ArH), 7,76 (d, 2 H, J =
8.5 Hz, ArH), 7,47 (d, 2 H, J = 8,5 Hz, ArH), 7,07 (s, 1 H, CHCNEt2), 2. 93 (q, 4 H, J = 7.0 Hz, NCH2CH3), 0.93 (t, 6 H, J = 7.0 Hz, NCH2CH3) ; 13C NMR (125.78 MHz, DMSO-d6) 5C : 169.5, 164. 1 , 156.6, 150.6, 148.6, 146.9, 140.3, 138.9, 130.7, 130.4, 130.1 , 128.1 (x2), 127.5, 126.3, 125.2, 124.2 (x2), 123.9, 113. 9, 111.0, 106.2, 45.4 (x2), 12.10(x2) ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calculé pour [C28H26N5O4]+, 496.1979, trouvé 496.1994
Synthèse des Arylcoumarines :
Procédure qénérale 9 : Synthèse de la Suzuki-
Des dérivés d'iodocoumarine (0,63 mmol, 1 équiv.), de l'ester phénylboronique (0,75 mmol, 1 ,2 équiv.), du Na2CO3 (0,316 mmol, 5 équiv.) et du Pd(PPh3)4 (0,126 mmol, 20% équiv.) ont été dissous dans un mélange de THF-H2O (4:1 , 10 mL) et agités au reflux pendant 16 h (sauf indication contraire) sous argon. Une fois la réaction terminée, de l'eau a été ajoutée et la suspension résultante a été éliminée par filtration. Le résidu a été successivement lavé avec de l'eau, du DCM et de l'Et20 puis séché pour donner le composé désiré. Le solide a été purifié par chromatographie flash. Les nouveaux composés suivants ont été préparés en utilisant cette procédure. 2-oxo-6-phenyl-2H-chromene-3-carboxylique acid (LSP17-1154)
C16H10O4 PM = 266.25 g. mol'1
Selon la procédure générale 9, le 6-iodo-2-oxo-2H-chromène-3-carboxylate d'éthyle (0,2 g, 0,63 mmol, 1 équiv.) dans THF-H2O (4:1 , 10 mL) a été mis en réaction avec le 4,4,5,5-tétraméthyl-2-phényl-1 ,3,2-dioxaborolane (0,155 g, 0,75 mmol, 1. 2 équiv.), Pd(PPh3)4 (0,146 g, 0,126 mmol, 20% équiv.) et Na2CO3 (0,905 g, 3,16 mmol, 5 équiv.) qui, après chromatographie sur colonne (60% CH2CI2, AcOEt 40%, AcOH 0,5%), a donné le composé désiré sous forme de solide jaune (0. 128 g, rendement 76 %) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.79 (s, 1 H, CHCCO2H), 8.23 (d, 1 H, J = 1 .5 Hz, ArH), 8.03 (dd, 1 H, J = 1 .5 Hz, 9 Hz, ArH), 7.51 (m, 3 H, ArH), 7.41 (m, 1 H, ArH) ; 13C NMR (62. 9 MHz, DMSO-d6) 5C : 156.7, 153.9, 148.4, 148.3, 138.4, 136.7, 132.5, 129.1 , 127.9, 126.7 (x2), 118.8, 118.8, 118.4, 116.7 ; HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- : calculé pour [C16H9O4]-, 265.0506, trouvé 265.0518.
7-methoxy-2-oxo-6-phenyl-2H-chromene-3-carboxylique acid (LSP17-1161 )
C17H12O5 PM = 296.27 g. mol'1
Selon la procédure générale 9, le 6-iodo-7-méthoxy-2-oxo-2H-chromène-3- carboxylate d'éthyle (0,2 g, 0,58 mmol, 1 équiv.) dans THF-H2O (4:1 , 10 mL) a été mis en réaction avec le 4,4,5,5-tétraméthyl-2-phényl-1 ,3,2-dioxaborolane (0. 141 g, 0,69 mmol, 1 ,2 équiv.), Pd(PPh3)4 (0,133 g, 0,115 mmol, 20% équiv.) et Na2CO3 (0,807 g, 2,89 mmol, 5 équiv.) qui, après chromatographie sur colonne (90% CH2CI2, 10% MeOH), a donné le composé désiré (0. 015 g, rendement de 8%) sous forme d'un solide beige ; RMN 1 H (500 MHz, DMSO-d6) 5H : 8.80 (s, 1 H, CHCCO2H), 7.90 (s, 1 H, CHC), 7.54-7.44 (m, 4 H, ArH), 7.48-7.44 (m, 1 H, ArH), 7.26 (s, 1 H, CHCO), 3.96 (s, 3 H, OCH3) ; RMN 13C (62. 9 MHz, DMSO-d6) 5C : 164.1 , 161.6, 157.2, 156.3, 149.0, 136.3 ; 134.0, 131.4, 129.3, 128.2, 127.9, 127.4, 127.3, 114.3, 111 .5, 99.3, 56.7 ; HR-MS (ESI, m/z) [M-H]- : calculé pour [C17H13O5]-, 297.0757, trouvé 297.0768.
7-(diethylamino)-2-oxo-6-phenyl-2H-chromene-3-carboxylique acid (LSP17- 1129) C20H19NO4 PM = 337.37 g.mol-1
Le composé A49-IV, l'acide 7-(diéthylamino)-6-iodo-2-oxo-2H-chromène-3- carboxylique (0,2 g, 0,52 mmol, 1 équiv.) dans du DMF (4 mL) a été mis à réagir pendant 24 h à 60 °C avec du 4,4,5,5-tétraméthyl-2-phényl-1 ,3,2-dioxaborolane (0,42 g, 0,21 mmol), du Pd(PPh3)2CI2 (0. 02 g, 0,025 mmol, 0,05 équiv.) et CsF (0,314 g, 2,06 mmol, 4 équiv.) qui, après chromatographie sur colonne (6:4:0, 5% de DCM/AcOEt/AcOH), a donné le composé désiré sous forme de solide jaune (0,061 g, rendement de 35%) ; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6 + quelques gouttes de TFA-d) 5H : 8. 67 (s, 1 H, CHCOOH), 7.61 (s, 1 H, ArH), 7.47 (br, 2 H, ArH), 7.46 (d, 2 H, J = 2.5 Hz, ArH), 7.36 (m, 1 H, ArH), 6. 98 (s, 1 H, CHCN(CH2CH3)2), 3.04 (q, 4 H, J = 7.0 Hz, CH2CH3, 0.9 (t, 6 H, J = 7.0 HZ, CH2CH3) ; 13C NMR (62. 9 MHz, + quelques gouttes de TFA-d) 5C : 164.2, 157.9, 155.7, 154.6, 149.0, 140.3, 133.2, 130.7, 128.7, 128.0, 127.2, 112.2, 111 .0, 105.1 , 45.2, 11.9 ; HR-MS (ESI, m/z) [M+H]+ : calcd. pour [C20H20N04]-, 338.1387, trouvé 338.1396.
II. Il Synthèse dérivés de quinoléine a) Molécules Type 1 :
- LSP013-172 - YL 173 a. 6,6'-2,2'-(biphenyl-4,4'-diyl)bis(ethene-2,1-diyl)diquinoline-2,4- dicarboxylic acid (X=C) Schéma de synthèse :
Synthèse du composé 4,4'-divinylbiphenyl : 7
LSP13-1171- YL171 Le 4,4'-divi nyl biphenyl est obtenu par homocouplage de l’acide 4-vinylphenyl borique, cette réaction est catalysée par le complexe cuivre-1 ,10 phenanthroline. L’utilisation de la 4, 7 phenanthroline n’a pas permis d’isolé le produit attendu.
Le complexe cuivre-phenanthroline est préparé suivant le protocole décrit par Kirai et al.7
1H NMR (5, ppm) (CDCI3, 250 MHz) 7.56 (d, J = 8.1 Hz, 4H), 7.47 (J = 8.1 Hz, 4H), 6.75 (dd, J = 17.6, 10.9 Hz, 2H), 5.78 (d, J = 17.6 Hz, 2H), 5.26 (d, J = 10.9 Hz, 2H). 13C NMR (5, ppm) (CDCI3, 250 MHz) 137.7, 136.6, 127.2 (2C), 126.8 (2C), 114.1.
Synthèse du dérivé diéthyl 6-bromoquinoline-2,4-dicarboxylate 2 , ,
LSP13-1135- YL135
La 6-bromoquinoléine est obtenue suivant la réaction de Pfitzinger (une modification de la méthode de Friedlander). Dans cette réaction, la 5-bromoisatin est condensée avec le sodium pyruvate en milieu basique (KOH) pour conduire à la quinoléine 2- 4,dicarboxylique acide.1’ 3-6 Cette quinoléine est purifiée par précipitation à pH 3.
La quinoléine diéthyle ester 2,4 dicarboxylique est obtenue par estérification en présence de SOCI2 au reflux d’éthanol.
Couplage de HECK : tetraethyl 6,6'-2,2'-(biphenyl-4,4'-diyl)bis(ethene- 2,1-diyl)diquinoline-2,4- dicarboxylate (LSP013-172 - YL 172)
Le composé LSP013-172 est obtenu par condensation de la 6-bromoquinoléine diethyldicarboxylate et du le 4,4'-divinylbiphenyl, cette réaction de couplage (HECK) est catalysée par le palladium (II) acétate en présence de K3PO4 comme base et du N-diméthyleacétamide.8
Hydrolyse des esters 6,6'-2,2'-(biphenyl-4,4'-diyl)bis(ethene-2,1- diyl)diquinoline-2,4-dicarboxylic acid (LSP013-173 - YL 173) Le composé quinoléine acide est obtenu après hydrolyse de son précurseur ester en milieu basique. Le produit acide est récupéré par précipitation à pH = 3. b) Molécules type II :
- LSP13-1153- YL153
- LSP13-1160 - YL160
Première étape : couplage de Suzuki et Sonogashira
Tetraethyl 6,6'-(biphenyl-4,4'-diyl)diquinoline-2,4-dicarboxylate (LSP13-
1153- YL153)
Le 6-bromo-2,4-quinolinedicarboxylate de diéthyle (300 mg, 0,85 mmol) et la tétrakistriphénylphosphine de palladium (81 mg, 0,07 mmol) ont été dissous dans un mélange de solvants dégazés EtOH/H2O/DME. À cette solution, on a ajouté l'acide biphényl-4-ylboronique (120 mg, 0,51 mmol) et Na2CO3 (208 mg, 2 mmol). Le mélange réactionnel a ensuite été chauffé à 90 °C pendant 24 h et la réaction a été suivie par CCM (cyclohexane/acétate d'éthyle 4:1 ). Le solvant a été éliminé sous vide et le produit brut pour donner un solide jaune, qui a été surveillé par l'acétate d'éthyle. La phase organique a été concentrée sous pression réduite pour donner un solide jaune, et la matière insoluble a été collectée et séchée sous vide. Le chlorure de thionyle (5 ml) a été ajouté goutte à goutte au matériau insoluble dans l'éthanol (50 ml), et le mélange a été porté à reflux pendant 18h.
Le solvant a été évaporé sous vide, et les deux fractions du produit brut ont été purifiées par chromatographie sur colonne (cyclohexane/acétate d'éthyle 4:1 ) pour donner un solide jaune (124 mg, 21 %). 1H NMR (5, ppm) (CDCh, 250 MHz) 9.14 (s, 2H), 8.67 (s, 2H), 8.43 (d, J = 9.3, 2H), 8.15 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 7.87 (d, J = 8.1 Hz, 4H), 7.79 (d, J = 8.1 Hz, 4H), 4.58 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 4.55 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 1 .50 (t, J = 7.1 Hz, 12H), 13C NMR (5, ppm) (CDCI3, 250 MHz) 165.9, 165.1 , 148.3, 147.7, 142.3, 140.5, 139.3, 136.4, 132.0, 130.1 , 128.4 (2C), 127.9 (2C), 126.9, 123.3, 122.9, 62.7, 62.4, 14.6, 14.5.
Deuxième étape : hydrolyse des esters
6,6'-(Biphenyl-4,4'-diyl)diquinoline-2,4-dicarboxylic acid (LSP13-1160 - YL160)
LSP-13-1160 - YL160
Le 6,6'-(biphényl-4,4'-diyl) diquinoléine-2,4-dicarboxylate de tétraéthyle (70 mg, 0,1 mmol) a été dissous dans une solution de solvant 1 :1 de THF et H2O. A cette solution a été ajouté de l'hydroxyde de sodium (24 mg, 0,6 mmol). Le mélange réactionnel a été suivi par CCM (acétate d'éthyle/cyclohexane 1 :1). La solution de THF/H2O a été éliminée sous vide et le produit souhaité a été dissous dans l'eau et précipité avec du HCl 6 M (pH 3). Solide rouge (30 mg, 51%). c) Composés de type III :
- LSP13-1148 - YL148, et
- LSP13-1152 - YL152
1. Schéma de synthèse . biphenyl-4-ylboronic acid
Première étape : couplage de Suzuki et Sonogashira
LSP-13-1148 - YL148
Diethyl 6-(biphenyl-4-yl)quinoline-2,4-dicarboxylate (LSP13-1148 - YL148)
Le diethyl 6-bromo-2,4-quinolinedicarboxylate (150 mg, 0.42 mmol) et le palladium tetrakistriphenylphosphine (29 mg, 0.025 mmol) ont été dissous dans un mélange de solvants dégazés EtOH/H2O/DME (5:5:15). À cette solution, on a ajouté l'acide biphényl-4-ylboronique (101 mg, 0,51 mmol) et Na2CO3 (106 mg, 0,98 mmol). Le mélange réactionnel a ensuite été chauffé à 90 °C pendant 24 h et la réaction a été suivie par CCM (cyclohexane/acétate d'éthyle 4:1 ). Le solvant a été éliminé sous vide et le produit brut pour donner un solide jaune, qui a été lavé par de l'acétate d'éthyle. La phase organique a été concentrée sous pression réduite pour donner un solide jaune, et la matière insoluble a été collectée et séchée sous vide. Le chlorure de thionyle (3 ml) a été ajouté goutte à goutte au matériau insoluble dans l'éthanol (50 ml), et le mélange a été porté à reflux pendant 18h.
Le solvant a été évaporé sous vide, et les deux fractions du produit brut ont été purifiées par chromatographie sur colonne (cyclohexane/acétate d'éthyle 4:1 ) pour donner un solide jaune (103 mg, 57%).
1H NMR (5, ppm) (CDCb, 250 MHz) 9.12 (m, 1 H), 8.67-7.66 (m, 1 H), 8.43-8.40 (m, 1 H), 8.14-8.12 (m, 1 H), 7.84-7.82 (m, 2H), 7.73-7.69 (m, 2H), 7.64-7.63(m, 2H), 7.45- 7.43 (m, 2H), 7.37-7.35 (m, 1 H), 4.58-4.52 (m, 4H), 1.49-1.48 (m, 6H). 13C NMR (5, ppm) (CDCb, 250 MHz) 165.9, 165.1 , 148.3, 147.7, 142.3, 141.4, 140.5, 138.9, 136.4,
131.9, 130.2, 129.1 (2C), 128.2 (2C), 127.9 (2C), 127.8, 127.2 (2C), 126.8, 123.2,
122.9, 62.7, 62.4, 14.6, 14.5.
Deuxième étape : hydrolyses des esters
LSP13-1148 - YL148 LSP13-1152 - YL152
6-(Biphenyl-4-yl) quinoline-2,4-dicarboxylic acid (LSP13-1152 - YL152)
LSP13-1152 - YL152
Le diethyl 6-(biphenyl-4-yl)quinoline-2,4-dicarboxylate (100 mg, 0.23 mmol) a été dissous dans une solution de solvant 1 :1 de THF et H2O (10 mL). A cette solution a été ajouté de l'hydroxyde de sodium (24 mg, 0,58 mmol). Le mélange réactionnel a été suivi par CCM (acétate d'éthyle/ cyclohexane 1 :1 ). La solution de THF/H2O a été éliminée sous vide et le produit souhaité a été dissous dans l'eau et précipité avec du HCl 6 M (pH 3). Solide rouge (52 mg, 61 %).
1H NMR (5, ppm) (DMSO-de, 250 MHz) 13.86 (brs, 2H), 9.14 (s, 1 H), 8.53 (s, 1 H), 8.32 (brs, 2H), 7.92-7.87 (m, 4H), 7.75 (brs, 2H), 7.50 (brs, 2H), 7.40 (brs, 1 H). 13C NMR (5, ppm) (DMSO-de, 250 MHz) 165.9, 165.6, 148.3, 147.3, 140.7, 140.1 , 139.3, 138.0, 136.9, 131.1 , 129.6, 128.9 (2C) 127.8 (2C), 127.7, 127.4 (2C), 126.6 (2C), 125.8, 122.7, 122.1.

Claims

Revendications
Revendication 1 . Composé de formule développée dans lequel :
- A représente un hétérocycle à 6 atomes fusionné au noyau phényle et choisi parmi les hétérocycles de formule (II) ou (III) :
- Ri représente indépendamment un atome d’hydrogène, un groupement alkyle en [Ci à Ce] ou un groupement cyclo alkyle [Ce à Ce] ;
- R2 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou d’halogène ;
- R3 représente indépendamment un atome d’hydrogène, ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle, un alcoxy (alkyloxy) en [Ci à Ce], un amino, un alkylamino en [Ci à Ce] ;
- R4 représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un hydrogène, un hydroxyle, un alcoxy en [Ci à Ce], un alkylamino en [Ci à Ce] et un dialkylamino comportant des radicaux alkyles en [Ci à Ce] ;
- Q représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un groupement alcényle, alcynyle, azo, amide, un groupe monocyclique sans hétéroatome, un groupe monocyclique avec au moins un hétéroatome, un groupe polycyclique sans hétéroatome, un groupe
93 polycyclique avec au moins un hétéroatome, un monoaryle, un polyaryle, un hétéroaryle, lesdits groupements étant substitués par au moins un substituant Rs ;
- Rs représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un aryle, un diphényle, un hétéroaryle ledit groupement Rs pouvant être substitué par au moins un groupement Re;
- Re représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un hydrogène, un halogène, un alkyle en [Ci à Ce], un hydroxyle, un alkoxy, un groupe amino, un alkylamino, un dialkylamino, un groupe nitrile, un groupe nitro, un groupe sulfhydryle, un groupe sulfure, un groupe sulfone ; ou dans lequel Re représente un substituant correspondant à un deuxième composé de formule (I) comportant un hétérocycle de formule II ou III, ledit deuxième composé de formule (I) étant substitué par les mêmes atomes ou groupements choisis pour Ri, R2, R3, R4, Q et Rs du premier composé de formule (I), les substituants Rs de chaque composé de formule (I) se substituant entre eux pour relier les deux composés de formule (I) ;
Ri ne représentant pas un atome d’hydrogène :
- lorsque A représente un hétérocycle de formule (II) et Q représente un groupement -C=C- ou -N=N-, substitué par un groupement Rs aryle substitué avec un Re alcoxy ou alkylamino ;
- ou lorsque A représente un hétérocycle de formule (III) et Q représente un groupement -N=N- ou phényle.
Revendication 2. Composé selon la revendication 1 , comportant un hétérocycle de formule (II) et correspondant à un dérivé de la coumarine, dans lequel :
- Ri représente un atome d’hydrogène, un groupement alkyle en [Ci à Ce], tel qu’un méthyle ou un éthyle, ou un groupement cyclo alkyle [C3 à Ce] ;
- R2 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou d’halogène ;
- R3 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle et un alcoxy) en [Ci à Ce], un amino, ou un alkylamino en [Ci à Ce] ;
- R4 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou un groupement, OMe, -OH, -NHMe, -N(Me)2, -NHEt ou -N(Et)2 ;
- Q représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un groupement triazole, hétéroaryle, dyphenyle, -C=C-, -C=C-, -N=N-, - C(O)-NH, lesdits groupements étant substitués par au moins un substituant Rs ;
94 - Rs représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un aryle, un diphényle, ou un hétéroaryle, ledit groupement Rs pouvant être le cas échéant, substitué par au moins un groupement Re;
- Re représente indépendamment un atome d’hydrogène ou d’halogène, ou l’un des groupements sélectionnés parmi un alkyle en [Ci à Ce], un hydroxyle, un alkoxy, un groupe amino , un alkylamino, un dialkylamino, un groupe nitrile, un groupe nitro, un groupe sulfhydryle, un groupe sulfure, un groupe sulfone ;
Ri ne représentant pas un atome d’hydrogène :
- lorsque A représente un hétérocycle de formule (II) et Q représente un groupement -C=C- ou -N=N- substitué par un groupement Rs aryle substitué avec un Re alcoxy ou alkylamino ;
Revendication 3. Composé dérivé de la coumarine selon la revendication 2, dans lequel :
- Ri est un hydrogène ou un groupement méthyl ou éthyle ;
- R2 et R3 sont des hydrogènes
- Q représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un groupe un groupe alcynyle et groupe triazole substitué par Rs
- R4 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle, un diéthylamino, un méthoxy ; et
- Rs est un diphényle substitué par un groupe Re étant un groupe -NH2.
Revendication 4. Composé dérivé de la coumarine selon l’une des revendications 2 à 3, sélectionné parmi les molécules suivantes :
(IV) (C07)
Revendication 5. Composé dérivé de la coumarine selon la revendication 2, dans lequel :
- Ri représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un méthyl et un éthyle ;
- R2 est un atome d’hydrogène ;
96 - R3 et R4 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle, un méthoxy et un éthoxy ;
- Q représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un groupe alcényle et un groupe azo ; et
- Rs représente indépendamment un phényl para-substitué par un halogène et o/ï/?o-substitué par un groupement Re.
Revendication 6. Composé dérivé de la coumarine selon la revendication 2 ou 5, dans lequel :
- Ri représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un méthyl et un éthyle ;
- R2 est un atome d’hydrogène ;
- R3 et R4 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle, un méthoxy et un éthoxy ;
- Q représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un groupe alcényle et un groupe azo ;
- Rs représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un phényle para-substitué par un brome un phényle para-substitué par un brome et ort/io-substitué par un méthoxy.
Revendication 7. Composé dérivé de la coumarine selon l’une des revendications 2, 5 ou 6, sélectionné parmi les molécules suivantes : formule (X) dans laquelle :
- Ri représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un méthyl et un éthyle ;
- R4 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle, un méthoxy et un éthoxy ; et
- Re représente un atome d’hydrogène ; et formule (XI) dans laquelle :
-Ri représente indépendamment un atome d’hydrogène, ou un groupement méthyle ou éthyle,
- R3 représente indépendamment un atome d’hydrogène, ou un méthoxy et un éthoxy ;
- R4 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle, un méthoxy et un éthoxy ;
- Re en ortho du groupement azo représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un méthoxy et un éthoxy ; et
- Re en para du groupement azo représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un hydrogène et un halogène X, de préférence X=Br.
Revendication 8. Composé dérivé de la coumarine selon la revendication 7, dans laquelle Ri représente un hydrogène.
Revendication 9. Composé selon la revendication 1 , comportant un hétérocycle de formule (III)
Ledit composé correspondant à un dérivé de la quinoléine, et dans lequel
- Ri représente indépendamment un atome d’hydrogène, un groupement alkyle en [Ci à Ce] ou un groupement cyclo alkyle [C3 à Ce] ;
- R2 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou d’halogène ;
- R3 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou l’un des groupements sélectionnés parmi un hydroxyle et un alcoxy(alkyloxy) en [Ci à Ce], un amino, ou un alkylamino en [Ci à Ce] ;
- R4 représente indépendamment un atome d’hydrogène ou un groupement, OMe, -OH, -NHMe, -N(Me)2, -NHEt ou -N(Et)2 ;
- Q représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un groupement triazole, hétéroaryle, dyphenyle, -C=C-, -C=C-, -N=N-, -
98 C(O)-NH, lesdits groupements étant substitués par au moins un substituant Rs ;
- Rs représente indépendamment l’un des groupements sélectionnés parmi un aryle, un diphényle, ou un hétéroaryle, ledit groupement Rs pouvant être le cas échéant, substitué par au moins un groupement Re;
- Re représente indépendamment un atome d’hydrogène ou d’halogène, ou l’un des groupements sélectionnés parmi un alkyle en [C1 à C6], un hydroxyle, un alkoxy, un groupe amino, un alkylamino, un dialkylamino, un groupe nitrile, un groupe nitro, un groupe sulfhydryle, un groupe sulfure, un groupe sulfone; ou dans lequel Re représente un substituant correspondant à un deuxième composé de formule (I) comportant ledit hétérocycle de formule (III), ledit deuxième composé de formule (I) étant substitué par les mêmes atomes ou groupements choisis pour Ri, R2, R3, R4, Q et Rs du premier composé de formule (I), les substituants Rs de chaque composé de formule (I) se substituant entre eux pour relier les deux composés de formule (I),
Ri ne représentant pas un atome d’hydrogène :
- lorsque A représente un hétérocycle de formule (III) et Q représente un groupement -N=N- ou phényle.
Revendication 10. Composé dérivé de quinoléine selon la revendication 9, dans lequel :
-Ri représente indépendamment un atome d’hydrogène, ou un groupement méthyle ou éthyle,
-R2, R3, et R4 sont des atomes d’hydrogène ;
-Q est un groupement phényle substitué par un groupement R5 phenyle.
Revendication 11 . Composé dérivé de quinoléine selon l’une des revendications 9 ou 10 choisi parmi les molécules suivantes :
Revendication 12. Composé dérivé de quinoléine selon la revendication 9, dans lequel R6 représente un substituant correspondant à un deuxième composé de formule (I) comportant un hétérocycle de formule (III), ledit deuxième composé de formule (I) étant substitué par les mêmes atomes ou groupements choisis pour Ri, R2, R3, R4, Q et Rs du premier composé de formule (I), les substituants R5 de chaque composé de formule (I) se substituant entre eux pour relier les deux composés de formule (I), ledit composé étant choisi parmi l’une des molécules suivantes :
(XVII) LSP13-1160 - YL160
Revendication 13. Utilisation de l’un des composés selon l’une des revendications 1 à 12, ou de l’un de ses sels, en tant que sonde fluorophore in vitro ou ex-vivo.
Revendication 14. Utilisation de l’un des composés selon l’une des revendications 1 à 12, ou de l’un de ses sels, en tant que fluorophore pour l’étude d’au moins un transporteur vésiculaire du glutamate VGLUT.
Revendication 15. Utilisation selon la revendication 14, dans lequel le transporteur vésiculaire du glutamate est VGLUT3. Revendication 16. Utilisation d’une substance dérivée de la coumarine comportant un squelette coumarine selon la formule (XIII) : ou d’une substance dérivée de la quinoléine comportant un squelette quinoléine selon la formule (XIV) pour la mise en œuvre d’une méthode de diagnostic in vitro ou ex-vivo d’au moins une pathologie sélectionnée parmi une maladie neurologique de préférence une maladie psychiatrique.
Revendication 17. Utilisation d’une substance dérivée de la coumarine selon la revendication 16, dans laquelle la substance consiste en l’un des composés selon l’une des revendications 1 à 8, ou un mélange de ceux- ci ou l’un de ses sels dans une formulation pharmaceutique acceptable.
Revendication 18. Utilisation d’une substance dérivée de la quinoléine selon la revendication 16, dans laquelle la substance consiste en l’un des composés selon l’une des revendications 9 à 12, ou un mélange de ceux-ci ou l’un de ses sels dans une formulation pharmaceutique acceptable
Revendication 19. Utilisation selon l’une des revendications 16 à 18, dans laquelle la méthode de diagnostic met en œuvre une technique d’imagerie de fluorescence réalisée par microscopie de superrésolution.
Revendication 20. Substance dérivée de la coumarine comportant un squelette coumarine selon la formule (XIII) : ou substance dérivée de la quinoléine comportant un squelette quinoléine selon la formule (III) pour son utilisation pour la mise en œuvre d’une méthode de diagnostic in vivo d’au moins une pathologie sélectionnée parmi une maladie neurologique ou une maladie psychiatrique.
Revendication 21 . Substance dérivée de la coumarine selon la revendication 20, dans laquelle la substance consiste en l’un des composés selon l’une des revendications 1 à 8 ou l’un de ses sels dans une formulation pharmaceutique acceptable.
Revendication 22. Substance dérivée de la quinoléine selon la revendication 20, dans laquelle la substance consiste en l’un des composés selon l’une des revendications 9 à 12 ou l’un de ses sels dans une formulation pharmaceutique acceptable.
Revendication 23. Substance dérivée de la coumarine ou de la quinoléine selon l’une des revendications 20 à 22, dans laquelle la méthode de diagnostic met en œuvre une technique d’imagerie de fluorescence réalisée par microscopie de super-résolution.
Revendication 24. Composition pharmaceutique pour la thérapie ou l’imagerie par fluorescence d’une maladie sélectionnée parmi au moins une maladie neurologique et au moins une maladie psychiatrique, comprenant au moins un composé selon l’une des revendications 1 à 12, ou un mélange de ceux-ci ou de ses sels pharmaceutiquement acceptables. Revendication 25. Composition pharmaceutique selon la revendication 24, dans laquelle la maladie sélectionnée parmi les maladies neurodégénératives, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, l’épilepsie, l'atrophie corticale postérieure ou encore la sclérose latérale amyotrophique.
Revendication 26. Complexe comportant une protéine d’une cellule animale ou humaine, ladite cellule étant isolée du corps dudit animal ou dudit humain, lié à au moins un composé selon l’une des revendications 1 à 12.
Revendication 27. Complexe selon la revendication 25, dans laquelle le complexe : protéine - composé est isolé de la cellule animale ou humaine.
Revendication 28. Utilisation d’un complexe selon l’une des revendications 26 ou 27 dans une méthode de criblage moléculaire.
Revendication 29. Kit comportant :
- un composé dérivé de la coumarine ou de la quinoléine selon l’une des revendication 1 à 12 ;
- un composé inhibiteur de référence se liant audit transporteur VGLUT, et optionnellement
- - des cellules exprimant un transporteur vésiculaire de glutamate VGLUT, tel que des cellules BON transfectées exprimant un transporteur VGLUT de type VGLUT1 , GVLUT2 et/ou VGLUT3.
Revendication 30. Méthode d’identification et/ou de quantification des transporteurs vésiculaires du glutamate VGLUTs, comportant les actions suivantes :
- le marquage des cellules à analyser avec l’un des composés dérivés de la coumarine ou de la quinoléine selon l’une des revendication 1 à 12 pour former un complexe d’étude, ledit composé comportant une fluorescence intrinsèque et/ou comportant au moins un marquage radioactif ou fluorescent ;
- l’observation et quantification d’un marquage des cellules par mesure d’une intensité de fluorescence et/ou de radioactivité dudit complexe ;
- la détermination d’une présence ou d’une concentration de transporteurs glutamatergiques VGLUTs en fonction de ladite intensité de marquage mesurée.
Revendication 31 . Méthode selon la revendication 30, comportant : - la préincubation des cellules à analyser avec un inhibiteur de référence se liant audit transporteur VGLUT ; et
- la détermination d’une diminution ou absence de marquage desdites cellules par ladite étape de préincubation, ladite diminution de marquage ou absence de marquage confirmant la sélectivité du marquage pour ledit transporteur VGLUT.
Revendication 32. Méthode de détermination d’un degré d’affinité d’un composé dérivé de la coumarine ou d’un composé dérive de la quinoléine pour un transporteur vésiculaire du glutamate VGLUT, et comportant :
-la formation d’un complexe de référence par incubation des cellules exprimant un transporteur VGLUT avec un composé de référence présentant une affinité connue pour ledit transporteur VGLUT et avec un composé à analyser comportant une fluorescence intrinsèque ou marqué par un marquage fluorescent ou radioactif ;
-la formation d’un complexe d’étude comportant des cellules exprimant un transporteur vésiculaire VGLUT avec ledit composé à analyser ;
- mesure de la fluorescence ou de la radioactivité du complexe de référence et du complexe d’étude ;
- détermination d’un degré d’affinité dudit composé à analyser en fonction d’un différentiel de fluorescence ou radioactivité mesurée entre le complexe d’étude et le complexe de référence.
Revendication 33. Méthode selon la revendication 32, dans lequel le composé à analyser est un composé selon l’une des revendications 1 à 12.
Revendication 34. Méthode de détermination d’un degré d’affinité d’un composé cible pour un transporteur vésiculaire du glutamate VGLUT, et comportant :
Revendication 35.
- la formation d’un complexe de référence par incubation des cellules exprimant un transporteur VGLUT avec un composé cible à analyser et l’un des composés selon l’une des revendications 1 à 12 comportant une fluorescence intrinsèque et/ou marqué par un marquage fluorescent ou radioactif, et
-la formation d’un complexe d’étude comportant des cellules exprimant un transporteur vésiculaire VGLUT avec ledit composé cible ;
- la mesure de la fluorescence ou de la radioactivité du complexe de référence et du complexe d’étude ;
104 - la détermination d’un degré d’affinité dudit composé cible en fonction d’un différentiel de marquage fluorescent ou radioactif mesuré entre le complexe d’étude et le complexe de référence.
105
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