[go: up one dir, main page]

EP4058567A1 - Polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase, en particulier polypeptide monomérique recombinant présentant une activité hydrogénase - Google Patents

Polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase, en particulier polypeptide monomérique recombinant présentant une activité hydrogénase

Info

Publication number
EP4058567A1
EP4058567A1 EP20803204.5A EP20803204A EP4058567A1 EP 4058567 A1 EP4058567 A1 EP 4058567A1 EP 20803204 A EP20803204 A EP 20803204A EP 4058567 A1 EP4058567 A1 EP 4058567A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
identity
hydrogenase
seq
preferably still
host cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP20803204.5A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Damien GODAUX
Philippe LORGE
Bart GHYSELS
Nathalie Job
Fabrice FRANCK
Giuseppe CALDARELLA
Pierre CARDOL
Claire REMACLE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
H2win SA
Original Assignee
H2win SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from BE20195783A external-priority patent/BE1027221B1/fr
Application filed by H2win SA filed Critical H2win SA
Publication of EP4058567A1 publication Critical patent/EP4058567A1/fr
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0067—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen as donor (1.12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P3/00—Preparation of elements or inorganic compounds except carbon dioxide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E60/00—Enabling technologies; Technologies with a potential or indirect contribution to GHG emissions mitigation
    • Y02E60/30—Hydrogen technology
    • Y02E60/50—Fuel cells

Definitions

  • Monomeric polypeptide exhibiting hydrogenase activity in particular recombinant monomeric polypeptide exhibiting hydrogenase activity
  • the present invention relates to a monomeric polypeptide exhibiting hydrogenase activity, in particular a recombinant monomeric polypeptide exhibiting hydrogenase activity, a host cell including this monomeric polypeptide and a host cell including a polynucleotide encoding this monomeric polypeptide.
  • the present invention also relates to a process for obtaining a monomeric polypeptide exhibiting a hydrogenase activity, in particular a process for obtaining a recombinant monomeric polypeptide exhibiting a hydrogenase activity and to the use of such a monomeric polypeptide. , in particular on the use of such a recombinant monomeric polypeptide.
  • Hydrogen is considered a promising renewable energy carrier due to its high energy content and the lack of pollution when used in fuel cells.
  • the production of dT1 ⁇ 2 is currently carried out by chemical extraction of fossil hydrocarbons, electrolysis of water or pyrolysis of biomass.
  • bio-hydrogen also called bio-hydrogen
  • the amount of research on the production of bio-hydrogen has increased dramatically over the past decade. This includes microbial production mainly through the process of fermentation in bacteria and photosynthesis in microalgae, but also the enzymatic generation of hydrogen by "electro-enzymology". All of these methods rely on special enzymes called hydrogenases.
  • Hydrogenases are metallo-enzymes that catalyze the reaction chemical: 2 H + + 2e ⁇ ® H2. This enzyme-dependent hydrogen production or consumption reaction is defined as hydrogenase activity. The reaction is reversible and its direction depends on the redox potential of the components capable of interacting with the enzyme. In the presence of H2 and an electron acceptor, a hydrogenase consumes hydrogen. In the presence of a low potential electron donor, a hydrogenase uses protons as electron acceptors and produces I ⁇ 2. Hydrogenases are widely used among microorganisms because many of them use hydrogen as a vector or source of energy. These enzymes have many representatives in the field of bacteria and archaea and are also present in some unicellular eukaryotic organisms.
  • hydrogenases are divided into three phylogenetically distinct classes: [Fe] - hydrogenases, [FeFe] -hydrogenases and [NiFe ] -hydrogenases. Each class is characterized by a distinctive metallic composition of the active site. Physiologically, these enzymes have been shown to function as a valve for excess electrons.
  • the catalytic center of [Fe] -hydrogenases does not contain any FeS or Ni center and has therefore been named "iron-sulfur center free hydrogenase” or [Fe] - hydrogenases (Shima and Thauer. 2007. A third type of hydrogenase catalyzing H2 activation Chem Rec 7: 37-46).
  • [Fe] -hydrogenases are limited to certain methanogenic microorganisms (Pilak et al. 2006. The crystal structure of the apoenzyme of the iron-sulfur cluster-free hydrogenase. J Mol Biol 358: 798-809) where they are essential for growth during nickel deficiency (Thauer. 1998. Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson.
  • [FeFej-hydrogenases are monomeric enzymes with a highly conserved catalytic center. It is a bi-nuclear iron site linked to a [4Fe-4S] center by a cysteine bridge. The non-protein ligands, cyanide (CN) and carbon monoxide (CO), are bound to iron atoms in the bi-nuclear center. Iron atoms also share two sulfur ligands (Nicolet et al. 2000. A novel FeS cluster in Fe-only hydrogenases. Trends Biochem Sci 25: 138-143, Nicolet et al. 2002. Fe-only hydrogenases: structure, function and evolution. J Inorg Biochem 91: 1-8).
  • HydE Three chaperone proteins named HydE, HydF and HydG are known to be necessary for the correct assembly of [FeFej-hydrogenases (Vignais et al. 2001. Classification and phylogeny of hydrogenases. FEMS Microbiol Rev 25: 455-501).
  • [NiFe] -hydrogenases form globular heteromultimers (Volbeda et al. 1995. Crystal structure of the nickel-iron hydrogenase from Desulfovibrio gigas. Nature 373: 580-587).
  • the bi-metallic active site [NiFe] is located in the large subunit where it is coordinated by four cysteines and three non-protein ligands, one CO molecule and two CN, linked to the iron atom (Happe et al. 1997. Biological activation of hydrogen. Nature 385: 126, Pierik et al. 1999. Carbon monoxide and cyanide as intrinsic ligands to iron in the active site of [NiFe] - hydrogenases.
  • NiFe (CN) 2CO Biology's way to activate H2. J Biol Chem 274: 3331- 3337).
  • the other subunits of the heteromimer contain several medial and distal FeS centers, which conduct electrons between the active site and the physiological electron donor or acceptor.
  • the [4Fe-4S] group located near the active site is considered essential for the activity (Albracht. 1994. Nickel hydrogenases: in search of the active site. Biochim Biophys Acta 1188: 167-204).
  • [NiFe] -hydrogenases are enzymes quite widespread among prokaryotes with many representatives in bacteria and archaea.
  • the classification of [NiFe] -hydrogenases is based on the amino acid sequence alignments of the different subunits and divides [NiFe] -hydrogenases into four groups. Remarkably, this classification agrees well with the groups derived from the functions physiological (Vignais and Billoud. 2007. Occurrence, classification, and biological function of hydrogenases: an overview. Chem Rev 107: 4206-4272).
  • [NiFe] -hydrogenases are described as being more resistant than [FeFe] -hydrogenases to oxygen damage.
  • the [NiFe] -hydrogenases are reversibly inactivated by O2.
  • the soluble [ NiFe] - hydrogenase from Ralstonia eutropha contains four cyanides in its active site, one of which is responsible for the insensitivity towards oxygen. J Biol Inorg Chem 9: 616- 626).
  • HoxEFUYH is a well-characterized [NiFe] -hydrogenase present in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803.
  • HoxEFUYH is a [NiFe] - pentameric and cytoplasmic hydrogenase.
  • HoxY and HoxH form the “hydrogenase” part while HoxE, HoxF and HoxU constitute the part in contact with the redox cofactor (Carrieri et al. 2011. The role of the bidirectional hydrogenase in cyanobacteria. Bioresour Technol 102: 8368-8377).
  • HoxH is the subunit responsible for the catalytic activity, that is to say the subunit comprising the active site of [NiFe] -hydrogenase.
  • HoxH contains the conserved residues for the bonding of nickel and iron atoms.
  • HoxY contains the proximal group [4Fe-4S] near the NiFe catalytic center.
  • HoxF and HoxU are iron-sulfur type proteins responsible for in vivo interaction with the substrate (NADH, flavodoxin or reduced ferredoxin).
  • HoxFU contain the medial and distal FeS centers carrying electrons to FloxYFI. The function of FloxE is unclear, but it may be a membrane anchor subunit.
  • the AbrB2 autorepressor expressed from an atypical promoter, represses the hydrogenase operon to regulate hydrogen production in Synechocystis strain PCC6803. J Bacteriol 194: 5423-5433 ). It is regulated by various environmental conditions, such as the availability of hydrogen, light, nitrates, nickel, oxygen or sulfur (Oliveira and Lindblad. 2009. Transcriptional regulation of the cyanobacterial bidirectional Hox-hydrogenase. Dalton Trans 9990- 9996). It is important to note that the hox genes are expressed constitutively in the presence of oxygen (Kiss et al. 2009. Transcriptional regulation of the bidirectional hydrogenase in the cyanobacterium Synechocystis 6803.
  • a common and efficient method for producing a large amount of a protein of interest is the recombinant production of that protein within a heterologous host.
  • This biotechnological process involves the introduction and expression of genes of interest in the genome of the host organism in order to produce a large amount of the protein of interest, with an excellent degree of purity.
  • the prokaryotic system remains the fastest and easiest system to produce a protein of interest, the eukaryotic system being slower and more complicated to implement.
  • Each organism has its own advantages and disadvantages.
  • There is not yet a universally applicable system of expression It is very difficult to predict which host will work best for a particular protein or for a particular end use.
  • Escherichia coli E.
  • coli is the reference organism for recombinant production. Indeed, this bacterium is very well known from the point of view of genetic and physiological engineering, with for example: optimized cell (high productivity, use of codons, inhibition of endogenous proteases), optimized culture medium, short doubling time, low contamination, availability of many commercial vectors, industrial scale-up, high production yield.
  • FloxEFUYFI being a prokaryotic protein of the cyanobacterium Synechocystis
  • the E. coli system is suitable for its recombinant production. This production in E. coli has already been carried out successfully. In this sense, Maeda and his colleagues have shown an in vivo increase in hydrogen production in E. coli cells expressing, in anoxic condition, the cyanobacterial HoxEFUYH enzyme (Maeda et al. 2007. Inhibition of hydrogen uptake in Escherichia coli by expressing the hydrogenase from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. BMC Biotechnol 7:25). Such increased hydrogen production in the presence of FloxEFUYFI is due to inhibition of the activity of endogenous Fte-consuming hydrogenases 1 and 2 in E. coli.
  • Document D2 describes the characterization of a native subunit of [NiFe] -hydrogenase from Alcaligenes eutrophus H16. This peptide represents the catalytic subunit of [NiFe] -hydrogenase and is described as totally inactive with NAD as redox mediator, but showing very low residual activity with methylene blue, ferricyanide and cytochrome C.
  • Document D3 suggests the existence of [NiFe] - hydrogenase type monomers with hydrogenase activity.
  • document D3 mentions, citing document D2, [NiFe] -hydrogenase from Alcaligenes eutrophus, and also [NiFe] -hydrogenase-1 from Escherishia coli.
  • a monomeric polypeptide comprising a single subunit comprising the active site of a protein of [NiFe] -hydrogenase type, said monomeric polypeptide exhibiting enzymatic activity, in particular enzymatic activity of hydrogenase type, more particularly catalytic activity, more particularly catalytic activity of hydrogenase type.
  • said monomeric polypeptide comprises a single subunit comprising the active site of a protein of [NiFe] -hydrogenase type.
  • said monomeric polypeptide consists of a single subunit comprising the active site of a protein of [NiFe] -hydrogenase type.
  • said monomeric polypeptide consists of a single subunit comprising the active site of a protein of [NiFe] -hydrogenase type.
  • a monomeric polypeptide comprising a single subunit comprising only the active site of a protein of [NiFe] -hydrogenase type, said monomeric polypeptide alone exhibiting a enzymatic activity, in particular an enzymatic activity of hydrogenase type, more particularly a catalytic activity, more particularly still a catalytic activity of hydrogenase type.
  • the production of a single monomeric polypeptide greatly simplifies the complex folding process in comparison with the dimeric, tetrameric and pentameric enzymes for which a correct assembly of the active site, of each of the subunits and finally of the entire enzyme. is particularly difficult to control and guarantee, which constitutes an obstacle to their use.
  • adequate folding of a single subunit is necessary and no assembly between different subunits is required to form a heteromimeric complex.
  • the three-dimensional structure of a monomeric polypeptide according to the invention can be easily modeled, in particular to determine the residues exposed at the surface of the protein, for example to facilitate the orientation as well as the adsorption with respect to an interface, by example compared to a carbon electrode.
  • This characteristic advantageously makes it possible, for example, to improve the stability of the link between the interface and the enzymatic catalyst, but also to optimize the direct transfer of electrons between the interface and the active site. Energy efficiency is therefore improved by the absence of additional redox relays, which limits energy losses.
  • the monomeric polypeptide is indeed active and capable of producing by catalysis of H2 (for example via the standard test for in-vitro production of FL by hydrogenases using the reduced methyl viologen as redox mediator) as well as consumption by catalysis of H2 (for example via the standard test of in-vitro consumption of H2 by hydrogenases using oxidized benzyl viologen as redox mediator), without the presence of Proximal FeS center present in the small-subunit and described as essential, nor for that matter of any other redox relay.
  • This is quite surprising since such a thorough simplification of the heteromimeric enzyme has never made it possible to demonstrate the hydrogenase activity in the state of the art.
  • the monomeric polypeptide is isolated from its natural environment, in particular isolated from a natural protein of [NiFe] -hydrogenase type.
  • said monomeric polypeptide can be derived from / isolated from a prokaryote.
  • examples include, but are not limited to a member of the genus Escherichia (eg, Escherichia coli), a member of the genus Desulfovibrio (eg, Desulfovibrio gigas), a member of the genus Hydrogenophilus (eg, Hydrogenophilus thermoluteolus), a member of the genus Desulfomicrobium (such as, for example, Desulfomicrobium baculatum), Synechocystis (such as, for example, Synechocystis sp.
  • said monomeric polypeptide can be derived from a cell or a microbe or can be produced in vitro or in vivo.
  • the monomeric polypeptide is recombinant or heterologous.
  • the monomeric polypeptide is purified.
  • the monomeric polypeptide has a truncated or non-truncated amino acid sequence exhibiting at least 15% identity, preferably at least 20% identity, more preferably at least 40% identity, more preferably still at least 60% identity, plus more preferably still at least 80% identity, more preferably still at least 90% identity, more preferably still at least 95% identity, more preferably still at least 99% identity, relative to the acid sequence amino acids of SEQ ID NO: 2 and / or relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the monomeric polypeptide has a truncated or non-truncated amino acid sequence exhibiting at least 81% identity, at least 82% identity, at least 83% identity, at least 84 % identity, at least 85% identity, at least 86% identity, at least 87% identity, at least 88% identity, at least 89% identity, at least 90% d 'identity, at least 91% identity, at least 92% identity, at least 93% identity, at least 94% identity, at least 95% identity, at least 96% identity , at least 97% identity, at least 98% identity, at least 99% identity, relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and / or relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • said monomeric polypeptide is characterized in that said subunit comprising the active site of a protein of [NiFe] -hydrogenase type is the HoxH subunit of the protein of [NiFe] -hydrogenase type.
  • FloxEFUYFI in / from Synechocystis sp. PCC6803.
  • said monomeric polypeptide exhibits a hydrogenase activity of at least 0.01 mitioI H2. min -1 . _1 mg of enzyme, preferably at least 0.05 mitioI H2. min -1 . rng -1 enzyme, preferably at least 10 mitioI H2. m 1 . rng -1 enzyme.
  • the present invention also relates to a host cell including a monomeric polypeptide according to the invention, said monomeric polypeptide comprising a single subunit comprising the active site of a protein of [NiFe] -hydrogenase type, said monomeric polypeptide exhibiting hydrogenase activity. .
  • the present invention relates to a host cell including a monomeric polypeptide according to the invention, the subunit comprising the active site of a protein of [NiFe] -hydrogenase type is the subunit HoxH of the [NiFe] -hydrogenase-type protein HoxEFUYH in / from Synechocystis sp. PCC6803.
  • the host cell in particular for the expression of said monomeric polypeptide, perhaps a host bacterial cell of the genus Escherichia (such as for example Escherichia coll), of the genus Bacillus (such as for example Bacillus subtilis), of the genus Streptomyces (such as for example Streptomyces coelicolor), of the genus Synéchocystis (such as for example Synéchocystis sp.
  • Escherichia such as for example Escherichia coll
  • Bacillus such as for example Bacillus subtilis
  • Streptomyces such as for example Streptomyces coelicolor
  • Synéchocystis such as for example Synéchocystis sp.
  • genus Synéchococcus such as for example Synéchococcus WFI8102
  • any other prokaryotic cell a eukaryotic cell for example of the genus Chlamydomonas (such as, for example, Chlamydomonas reinhardtii), of the genus Saccharomyces (such as, for example, Saccharomyces cerevisiae), of the Pichia type (such as, for example, Pichia pastoris), or another type of eukaryotic cell.
  • Chlamydomonas such as, for example, Chlamydomonas reinhardtii
  • Saccharomyces such as, for example, Saccharomyces cerevisiae
  • Pichia type such as, for example, Pichia pastoris
  • another type of eukaryotic cell such as, for example, Pichia pastoris
  • said unrelated monomeric polypeptide in said host cell may itself but not necessarily be derived from the expression of an unwanted gene in an expression vector, for example in a plasmid inserted into said host cell.
  • said monomeric polypeptide induced in said host cell has a truncated or non-truncated amino acid sequence exhibiting at least 20% identity, more preferably at least 40% identity, more preferably still at least 60%. identity, more preferably still at least 80% identity, more preferably still at least 90% identity, more preferably still at least 95% identity, more preferably still at least 99% identity, relative to to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and / or to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • said host cell can include one or more maturation factors of said [NiFe] -hydrogenase type protein, preferably one or more maturation factors of said [NiFe] -hydrogenase type protein selected from , the group consisting of the maturation factors FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF and FloxW a) whose respective amino acid sequences each have at least 15% identity, preferably at least 20% identity, more preferably at least 40% identity, more preferably still at least 60% identity, more preferably still at least 80% identity, more preferably still at least 90% identity, more preferably still at least 95% identity, more preferably still at least 99% identity, respectively with respect to the sequences in amino acids SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18; or b) encoded together by a concatenary nucleotide
  • said at least one maturation factor may be endogenous to the host cell and / or exogenous to the host cell.
  • said monomeric polypeptide and / or said at least one maturation factor is / are derived from the expression of at least one undue gene in an expression vector, said expression vector being induced in said host cell.
  • the present invention also relates to a host cell including a polynucleotide encoding a monomeric polypeptide according to the invention comprising a single subunit comprising the active site of a protein of [NiFe] -hydrogenase type, said monomeric polypeptide exhibiting hydrogenase activity. .
  • the present invention relates to a host cell including a polynucleotide encoding a monomeric polypeptide whose sub- unit comprising the active site of a [NiFe] -hydrogenase-like protein is the HoxH subunit of the [NiFe] -hydrogenase-like protein FloxEFUYFI in / from Synechocystis sp. PCC6803.
  • said polynucleotide encoding a monomeric polypeptide exhibits a nucleotide sequence having at least 15% identity, preferably at least 20% identity, more preferably at least 40% identity, more preferably still at least 60% identity, more preferably still at least 80% identity, more preferably still at least 90% identity, more preferably still at least 95% identity, more preferably still at least 99% d identity, respectively with respect to the sequences, with respect to the nucleotide sequences SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 3.
  • the host cell including a polynucleotide encoding a monomeric polypeptide according to the invention, and being used in particular for the expression of said monomeric polypeptide can be a host bacterial cell of the genus Escherichia (such as for example Escherichia coli), of the genus Bacillus (such as for example Bacillus subtilis), of the genus Streptomyces (for example Streptomyces coelicolor), a photosynthetic bacterial cell of the genus Synechocystis (such as for example Synéchocystis sp.
  • Escherichia such as for example Escherichia coli
  • Bacillus such as for example Bacillus subtilis
  • Streptomyces for example Streptomyces coelicolor
  • Synechocystis such as for example Synéchocystis sp.
  • Synéchococcus (as for example Synechococcus WFI8102) or any other prokaryotic cell, a eukaryotic cell for example of the genus Chlamydomonas (for example Chlamydomonas reinhardtii), of the genus Saccharomyces (for example Saccharomyces cerevisiae), of the Pichia type (for example Pichia pastoris), or another eukaryotic cell type.
  • said polynucleotide induced in said host cell may itself but not necessarily be induced in an expression vector, for example in a plasmid, inserted into said host cell.
  • said monomeric polypeptide encoded by said induced polynucleotide in said host cell has a truncated or non-truncated amino acid sequence exhibiting at least 20% identity, more preferably at least 40% identity, more preferably still at least 60% identity, more preferably still at least 80% identity, more preferably still at least 90% identity, more preferably still at least 95% of identity, more preferably still at least 99% identity, relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and / or relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • said host cell including a polynucleotide encoding a monomeric polypeptide can include one or more maturation factors of said [NiFe] -hydrogenase type protein, preferably one or more maturation factors of said protein of type [NiFe] - hydrogenase chosen from the group consisting of the maturation factors FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF and FloxW a) whose respective amino acid sequences each have at least 15% identity, preferably at least 20% identity, more preferably at least 40% identity, more preferably still at least 60% identity, more preferably still at least 80% identity, more preferably still at least 90% identity , more preferably still at least 95% identity, more preferably still at least 99% identity, respectively relative to the amino acid sequences SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18; or b) encoded together by a concatenary nucleotide sequence exhibiting at least 15% identity, preferably at least 20% identity, more preferably at least 40% identity, more preferably still at least 60% identity, more preferably still at least 80% identity, more preferably still at least 90% identity, more preferably still at least 95% identity, more preferably still at least 99% identity, relative to the nucleotide sequence SEQ ID NO: 19, which codes for all of these ripening factors.
  • said at least one maturation factor can be endogenous to the host cell and / or exogenous to the host cell.
  • said monomeric polypeptide and / or said at least one maturation factor is / are derived from the expression of at least one undue gene in an expression vector, said expression vector being induced in said host cell.
  • the present invention also relates to a process for obtaining, for example in a host cell (for example in E. coli), a monomeric polypeptide exhibiting hydrogenase activity according to the invention, said process comprising the following steps:
  • the method according to the invention makes it possible to produce a single subunit comprising the active site of a protein of [NiFe] -hydrogenase type.
  • the polynucleotide may itself but not necessarily be included in an expression vector, for example in a plasmid.
  • said step of modifying said expression vector consists of an inclusion in said expression vector of said exogenous polynucleotide, at least part of which codes for said polypeptide.
  • monomer in which the amino acid sequence, truncated or not, has at least 20% identity, more preferably at least 40% identity, more preferably still at least 60% identity, more preferably still at least 80% identity , more preferably still at least 90% identity, more preferably still at least 95% identity, more preferably still at least 99% identity, relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and / or relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • said step of modifying said expression vector may comprise the inclusion in said expression vector of one or more factors for maturation of said protein of [NiFe] - hydrogenase type, preferably one or more maturation factors of said [NiFe] -hydrogenase type protein chosen from the group consisting of the maturation factors FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF and FloxW a) whose respective acid sequences amines each have at least 15% identity, preferably at least 20% identity, more preferably at least 40% identity, more preferably still at least 60% identity, more preferably still at least 80% d 'identity, more preferably still at least 90% identity, more preferably still at least 95% identity, more preferably still at least 99% identity, respectively relative to the amino acid sequences SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18; or b
  • a sequence encoding one or more maturation factors of said [NiFe] -hydrogenase type protein can itself but not necessarily be included in a vector. expression, for example in a plasmid.
  • the method according to the invention comprises a subsequent step of isolation and / or purification of said monomeric polypeptide.
  • the invention relates to a process for obtaining a monomeric polypeptide exhibiting hydrogenase activity according to the invention, said process comprising the following steps:
  • a step of incubation of said genetically modified entity for example of said genetically modified host cell or of said genetically expression vector, to obtain a monomeric polypeptide comprising a single subunit comprising the active site of a protein of type [ NiFe] -hydrogenase, said monomeric polypeptide exhibiting hydrogenase activity.
  • said step of genetic modification carried out in-vivo or in-vitro, consists of: a) a genetic modification of a host cell and / or of an expression vector by including therein a polynucleotide exogenous at least one part of which codes for a monomeric polypeptide comprising a single subunit comprising the active site of a protein of [NiFe] -hydrogenase type, to obtain a genetically modified host cell and / or a vector of genetically modified expression to be incubated during said incubation step carried out under incubation conditions making it possible to ensure expression of said exogenous polynucleotide to produce said monomeric polypeptide; or b) by inducing at least one genetic mutation in the genetic material of a host cell to obtain a genetically modified host cell to be incubated during said incubation step carried out under incubation conditions to produce said polypeptide monomeric.
  • said induction of at least one genetic mutation is carried out by homologous recombination, a method well known to those skilled in the art.
  • said step of genetic modification of said host cell by inclusion of an exogenous polynucleotide consists of an inclusion in said host cell of an expression vector, in particular of a modified expression vector, including said exogenous polynucleotide.
  • said step of genetic modification of said host cell consists of an inclusion in said host cell of said exogenous polynucleotide, at least part of which codes for said monomeric polypeptide, the amino acid sequence of which is or is not present at least. 15% identity, preferably at least 20% identity, more preferably at least 40% identity, more preferably still at least 60% identity, more preferably still at least 80% identity, more preferably still at least 90% identity, more preferably still at least 95% identity, more preferably still at least 99% identity, relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and / or relative to to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • said step of genetic modification of said host cell further comprises the inclusion in said host cell of at least one maturation factor of said [NiFe] -hydrogenase type protein, said at least one maturation factor being endogenous to the host cell and / or exogenous to the host cell, preferably the inclusion of at least a maturation factor of said [NiFe] -hydrogenase type protein chosen from the group consisting of maturation factors FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF and HoxW a) whose respective amino acid sequences each have at least 15 % identity, preferably at least 20% identity, more preferably at least 40% identity, more preferably still at least 60% identity, more preferably still at least
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 19 or b) encoded together by a concatenary nucleotide sequence exhibiting at least 15% identity, preferably at least 20% identity, more preferably at least 40% identity, more preferably still at least 60% identity, more preferably still at least 80% identity, more preferably still at least 90% identity, more preferably still at least 95% identity, more preferably still at least 99% identity, relative to the nucleotide sequence SEQ ID NO: 19, which codes for all of these ripening factors.
  • said at least one maturation factor is derived from the expression of at least one undue gene in an expression vector, said expression vector being induced in said host cell.
  • the process for obtaining a polypeptide monomer exhibiting a hydrogenase activity according to the invention gives rise to the production of a monomeric polypeptide of which the subunit comprising the active site of a protein of [NiFe] -hydrogenase type is the HoxH subunit of the protein of type [NiFe] -hydrogenase FloxEFUYFI in Synechocystis sp. PCC6803.
  • the present invention also relates to a use of a monomeric polypeptide according to the invention comprising a single subunit comprising the active site of a protein of [NiFe] -hydrogenase type, said monomeric polypeptide exhibiting hydrogenase activity and being present or not in a cell, to produce or consume hydrogen by incubating said monomeric polypeptide under incubation conditions making it possible to ensure production or consumption of hydrogen.
  • the present invention also relates to a use of a monomeric polypeptide according to the invention or of a monomeric polypeptide obtained according to the process according to the invention comprising a single subunit comprising the active site of a protein of [NiFe] type. -hydrogenase, said monomeric polypeptide exhibiting hydrogenase activity and being present or not in a cell, for coating a surface, in particular for coating a surface with an electrical conductor, for example for coating a surface of an anode or a cathode.
  • polypeptide By the term “polypeptide”, it is understood, within the meaning of the present invention, a single chain composed of a minimum of two amino acids linked together by a peptide bond between the carboxylic group of an amino acid and the amine group. of the following amino acid.
  • polypeptide also includes molecules which contain more than one polypeptide, the latter linked together, for example by disulfide bridges, or polypeptide complexes, the latter linked together, for example covalently or not. -covalent, and forming a multimer (for example a dimer, a trimer, a quadrimer, a pentamer).
  • a polypeptide can also contain non-protein ligands, such as for example inorganic iron (Fe), nickel (Ni), an iron-sulfur center (FeS), or other organic ligand such as for example carbon monoxide (CO) , cyanide (CN) or a flavin.
  • non-protein ligands such as for example inorganic iron (Fe), nickel (Ni), an iron-sulfur center (FeS), or other organic ligand such as for example carbon monoxide (CO) , cyanide (CN) or a flavin.
  • the terms peptide, polypeptide, enzyme, subunit or protein are all included within the definition of polypeptide and these terms can be used interchangeably.
  • the definition of "polypeptide” does not take into account the length of said polypeptide or the way in which said polypeptide is produced.
  • recombinant polypeptide or “heterologous polypeptide”, it is understood, within the meaning of the present invention, a polypeptide which is not naturally present in the environment and / or which is not naturally present in the cell.
  • host used for its production in particular in a host cell, and the production of which is carried out by recombinant techniques, for example by adding genetic material to a host cell.
  • polypeptide By the terms “monomeric polypeptide”, it is understood, within the meaning of the present invention, a single chain composed of a minimum of two amino acids linked together by a peptide bond between the carboxylic group of an amino acid and the group. amine of the next amino acid.
  • the term “monomeric polypeptide” includes only molecules which contain only one polypeptide, that is, without interaction with any other polypeptide. For example, it is in no case a multimer (for example a dimer, a trimer, a quadrimer, a pentamer, ).
  • a monomeric polypeptide can also contain non-protein ligands, such as for example inorganic iron (Fe), nickel (Ni), iron-sulfur centers (FeS), or other organic ligand such as for example carbon monoxide (CO ), cyanide (CN) or a flavin.
  • non-protein ligands such as for example inorganic iron (Fe), nickel (Ni), iron-sulfur centers (FeS), or other organic ligand such as for example carbon monoxide (CO ), cyanide (CN) or a flavin.
  • non-protein ligands such as for example inorganic iron (Fe), nickel (Ni), iron-sulfur centers (FeS), or other organic ligand such as for example carbon monoxide (CO ), cyanide (CN) or a flavin.
  • CO carbon monoxide
  • CN cyanide
  • recombinant monomeric polypeptide or “heterologous monomeric polypeptide”, it is understood, within the meaning of the present invention, that the monomeric polypeptide is not naturally present in the environment, in particular in a host cell, and of which the production is carried out by recombinant techniques, for example by adding genetic material to a host cell.
  • polypeptide exhibiting hydrogenase activity it is understood, within the meaning of the present invention, that the polypeptide monomeric is able to catalyze the reversible reaction H2 ⁇ ® 2H + + 2e.
  • This definition of hydrogenase activity is not related to the experimental conditions but only to the production or consumption of hydrogen through the enzymatic activity of hydrogenase.
  • the part of the polypeptide may comprise, for example, several portions of the amino acid sequence and / or the linkage with one or more non-protein ligands.
  • polynucleotide it is understood, within the meaning of the present invention, a single chain composed of a minimum of two nucleotides linked together, for example by a covalent bond, regardless of whether they are ribonucleotides. or deoxynucleotides. This therefore includes RNAs and DNAs, single stranded or double stranded.
  • the definition of “polynucleotide” does not take into account the length of said polynucleotide, nor of the function, nor of the form, nor of the way in which said polynucleotide is produced.
  • a polynucleotide can be, for example, a plasmid, part of a plasmid, a gene or a gene fragment.
  • exogenous polynucleotide it is understood, within the meaning of the present invention, a polynucleotide which is not normally present in the host cell.
  • the exogenous polynucleotide can be a coding sequence for a polypeptide which is not naturally present in the host cell or a plasmid.
  • plasmid a double-stranded DNA molecule distinct from chromosomal DNA, exogenous, capable of autonomous replication, by virtue of its own origin of replication.
  • the plasmid can also contain other sequences of interest, such as by example a gene encoding a selection factor (resistance to an antibiotic, etc.), a multiple cloning site allows the addition of polynucleotide, and / or sequences for regulating transcription.
  • the terms "plasmid” or "expression vector” are interchangeable.
  • host cell it is understood, within the meaning of the present invention, a cell which has undergone a modification.
  • This modification can for example be the introduction of an exogenous polynucleotide into the cell, for example via a plasmid.
  • aturation factor any molecule, biological or not, which participates in the formation of the structure of another biological molecule, for example of a protein.
  • endogenous maturation factor any molecule, biological or not, which participates in the formation of the structure of another biological molecule, for example of a protein. , and which is naturally present in the host cell, that is to say without genetic modification of said host cell.
  • exogenous maturation factor any molecule, biological or not, which participates in the formation of the structure of another biological molecule, for example of a protein. , and which is not naturally present in the host cell, that is to say that a genetic modification of said host cell is necessary in order to add said exogenous maturation factor thereto, for example by adding a vector d 'expression.
  • isolated it is understood, within the meaning of the present invention, any molecule which has been removed from its natural environment, for example which has been removed from a [natural NiFej-hydrogenase.
  • purified it is understood within the meaning of the present invention, any molecule which has been lonely by means of biochemical techniques. This definition does not take into account the way in which the molecule is produced, for example naturally or by recombination, chemically or enzymatically synthesized, nor the biochemical techniques used for the production. purification, such as affinity chromatography or molecular sieve.
  • a polynucleotide, a polypeptide or I ⁇ 2 can be purified.
  • a substance is purified when it represents at least 60% relative to the other components which are associated with it, preferably 75% relative to the other components which are associated with it, preferably 90% relative to the other components which are associated with it. associates.
  • identity a structural similarity between two polynucleotides or two polypeptides.
  • Structural similarity is determined by an alignment between the two sequences, which alignment optimizes the number of identical nucleotides or the number of identical amino acids along the sequence. Holes in one or both sequences are allowed in order to optimize alignment and therefore structural similarity. The nucleotide or amino acid sequences must however remain the same.
  • genetic material it is understood, within the meaning of the present invention, the genome of an entity and more precisely all the nucleic acids of this entity, coding and non-coding sequences included.
  • genetic mutation it is understood, within the meaning of the present invention, an accidental or induced modification of the genetic material of an entity, for example of a host cell or of an expression vector.
  • entity comprising genetic material it is understood, within the meaning of the present invention, an entity which comprises genetic material according to the definition given above, for example a host cell or an expression vector such as 'a plasmid.
  • genetically modified entity an entity comprising genetic material according to the definition given above and which has undergone a modification of its genetic material, for example a genetic mutation or the introduction of an exogenous polynucleotide in the cell, such as, for example, via a plasmid.
  • a host cell by the terms “genetically modified host cell”, it is understood, within the meaning of the present invention, a host cell according to the definition given above and which has undergone a modification of its genetic material, for example a genetic mutation or the introduction of an exogenous polynucleotide into the cell, such as for example via a plasmid.
  • genetically modified expression vector an expression vector or a plasmid according to the definition given above and which has undergone a modification of its genetic material, by example the addition of a sequence of interest, such as for example a gene encoding a particular polypeptide.
  • Figure 1 illustrates the map of plasmid pET-26b (+) (5360bp).
  • Figure 2 illustrates the agarose gel analysis of the digestion of the pET26b (+) + HoxH expression vector by the restriction enzymes Ndel and Blpl.
  • Figure 3 illustrates the map of the plasmid pACYCDuet-1 (4008bp).
  • Figure 4 illustrates the agarose gel analysis of the digestion of pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW expression vector by restriction enzymes Ncol and Hindi II.
  • Figure 5 illustrates the agarose gel analysis of the digestion of the expression vector pET26b (+) + HoxH, derived from plasmid DNA from a colony of E. coli, by restriction enzymes Ndel and Blpl.
  • Figure 6 illustrates the agarose gel analysis of the digestion of the expression vector pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW, derived from the plasmid DNA of a colony of E. coli, by the restriction enzymes Ncol and Hindlll.
  • FIG. 7 illustrates the method of purification of the recombinant protein of interest HoxH. NA, sample not absorbed on the Ni-NTA affinity column. Washing, sample eluted with the washing buffer containing 10 mM in Imidazole. 50 mM, sample eluted at a concentration of 50 mM in imidazole. 100 mM, sample eluted at a concentration of 100 mM in imidazole. 150 mM, sample eluted at a concentration of 150 mM in imidazole. 200 mM, sample eluted at a concentration of 200 mM in imidazole. 250 mM, sample eluted at a concentration of 250 mM in imidazole.
  • Figure 8 illustrates the SDS-PAGE analysis of the protein composition of various fractions collected during affinity chromatography.
  • Load supernatant applied to the Ni-NTA affinity column and obtained from the lysis of recombinant E. coli cells; NA, sample not absorbed on Ni-NTA affinity column.
  • Washing sample eluted with the washing buffer containing 10 mM in Imidazole. M, molecular weight marker.
  • 50 mM sample eluted at a concentration of 50 mM in imidazole.
  • 100 mM sample eluted at a concentration of 10OmM in imidazole.
  • 150 mM sample eluted at a concentration of 150 mM in imidazole.
  • 200 mM sample eluted at a concentration of 200 mM in imidazole.
  • 250 mM sample eluted at a concentration of 250 mM in imidazole.
  • Figure 9 illustrates the analysis by immunodetection (Western blot) of the presence of HoxH in various fractions collected during affinity chromatography.
  • M molecular weight marker.
  • Load supernatant applied to the Ni-NTA affinity column and obtained from the lysis of recombinant E. coli cells.
  • NA sample not absorbed on Ni-NTA affinity column; 50 mM, sample eluted at a concentration of 50 mM in imidazole. 200 mM, sample eluted at a concentration of 200 mM in imidazole.
  • Figure 10 is a schematic representation of the structure of HoxEFUYH, [NiFe] -hydrogenase from Synechocystis sp. PCC 6803.
  • HoxE 19KDa and 1 FeS center
  • HoxF 57.5KDa, 2 FeS centers and one FMN center
  • HoxU 26KDa and 4 FeS centers
  • HoxY 20KDa and an FeS center
  • HoxH 53KDa and the active site.
  • Figure 11 is a schematic representation (gray arrow) of electron transfer and expected interactions with NADPH and methylviologen (MV) in HoxEFUYH, [NiFe] -hydrogenase from Synechocystis sp. PCC 6803.
  • Figure 12 is a schematic representation where the question mark asks whether the active site of the recombinant protein HoxH may or may not accept electrons directly from the MV and therefore produce hydrogen in the absence of additional redox relays.
  • Figure 13 illustrates the demonstration of the hydrogenase activity by the production of hydrogen which results from the addition of the recombinant protein HoxH to a reagent containing methyl-viologen previously reduced with sodium dithionite in the absence of oxygen.
  • HoxH is able to take electrons from previously reduced methyl viologen to combine them with protons (present in the buffer) to produce hydrogen according to the equation H2 ⁇ ® 2H + + 2e which represents the reaction catalyzed by l hydrogenase.
  • the level of hydrogen dissolved in the reagent is continuously measured using a micro-sensor (Unisense®, Denmark).
  • the arrow shows the moment when the addition of the recombinant HoxH protein is carried out, a moment concomitant with the increase in the level of dissolved hydrogen detected by the micro-sensor.
  • FIG. 14 illustrates the demonstration of the hydrogenase activity by the reduction of benzyl viologen which results from the addition of the recombinant protein HoxH to a reagent containing benzyl viologen (BV) in the presence of H2.
  • HoxH is able to take electrons from hydrogen to transfer them to a redox mediator, for example benzyl viologen, at the same time as the production of protons according to the equation H2 ⁇ ® 2H + + 2e which represents the reaction catalyzed by hydrogenase.
  • the level of hydrogen consumed is equivalent to the level of reduced benzyl viologen, a level which can be measured continuously by spectrophotometry at a wavelength of 578 nm.
  • FIG. 15 illustrates the demonstration of the hydrogenase activity by the production of hydrogen which results from the addition of the recombinant protein HoxH, produced in the absence of the HupABCDEFHoxW maturation factors exogenous to E. coli, to a reagent containing methyl-viologen previously reduced with sodium dithionite in the absence of oxygen.
  • HoxH is able to take electrons from previously reduced methyl viologen to combine them with protons (present in the buffer) to produce hydrogen according to the equation H2 ⁇ ® 2H + + 2e which represents the reaction catalyzed by l hydrogenase. Examples
  • HoxH corresponds to the large subunit comprising the active site of [NiFe] -hydrogenase HoxEFUYH in Synechocystis sp. PCC6803.
  • Genbank accession number in Genbank is BAA18091.1.
  • the theoretical isoelectric point of HoxH is 5.86 for a theoretical molecular mass of 52996.53 Daltons.
  • the nucleotide sequence (1425bp) of HoxH is as follows and is called SEQ ID NO: 1 in the context of the present invention: atgtctaaaaccattgttatcgatcccgttacccggattgaaggccatgccaaaatctccatttcctcaacgaccagg gcaacgtagatgatgttcgtttccatgtggtggagtatcggggttttgaaaaattttgcgaaggtcgtcccatgtggga aatggctggtattaccgcccgtatttgcggcatttgtccggttagccatctgctctgtgcggctaaaaccggggataag ttactggcggtgcaaatccctccagccggggaaaactggggtgcaaatccctccagcgg
  • the amino acid sequence (474 aa) of HoxH is as follows and is named SEQ ID NO: 2 in the context of the present invention: MSKTIVIDPVTRIEGHAKISIFLNDQGNVDDVRFHVVEYRGFEKFCEGRPMWEMA GITARICGICPVSHLLCAAKTGDKLLAVQIPPAGEKLRRLMNLGQITQSHALSFFHL SSPDFLLGWDSDPATRNVFGLIAADPDLARAGIRLRQFGQTVIELLGAKKIHSAWS VPGGVRSPLSEEGRQWIVDRLPEAKETVYLALNLFKNMLDRFQTEVAEFGKFPSL FMGLVGKNNEWEHYGGSLRFTDSEGNIVADNLSEDNYADFIGESVEKWSYLKFP YYKSLGYPDGIYRVGPLARLNVCHHIGTPEADQELEEYRQRAGGVATSSFFYHYA RLVEILACLEAIELLMADPDILSKNCRAKAEINCTEAVGVSEAPRGTLFHHYKIDE
  • Figure 1 shows the map of the plasmid pET26b (+) used to construct the FloxFI expression vector by insertion of SEQ ID NO: 3 into pET26b (+).
  • pET26b (+) is a 5360bp plasmid possessing an origin of replication for E. coli, a kanamycin resistance gene, a multiple cloning site (MCS) containing numerous restriction sites, the promoter 77 and the transcription terminator T7. It also contains the lad gene encoding a transcription repressor. This repression of transcription can be removed by adding IPTG.
  • the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 are optimized for the use of codons in E. coli.
  • the Ndel (catatg) and Blpl (gctnagc) restriction sites are added respectively at the start and at the end of the nucleotide sequence for cloning into the plasmid pET26b (+) and the caccaccaccatcac sequence (underlined below) is also added (sequence encoding the poly-histidine tag near the N-terminal end of the protein).
  • the optimized nucleotide sequence (1453bp) is as follows and is named SEQ ID NO: 3 in the context of the present invention: cafafqaqccaccaccaccatcacaaaaccatcqtcatcqacccaqtcacccqcatcqaaqqccacqcca aaattagcatttttctgaacgaccagggcaacgtcgacgacgtccgctttcacgttgttgaataccgtggcttcgaaa aattttgtgaaggtcgtccgatgtgggaaatggccggtatcacggcacgtatttgtggaatttgtccggtgagccatct gctgcaaaaaccggagataactgctggcagtgcagattccgcggcaggtgaaaactgctggcagtgcagatt
  • the optimized amino acid sequence (480 aa) is as follows and is named SEQ ID NO: 4 in the context of the present invention:
  • Plasmid pET26b (+) is used to construct the HoxH expression vector by inserting SEQ ID NO: 3 into pET26b (+).
  • FIG. 2 shows the analysis of the digestion of the expression vector pET26b (+) + HoxH (SEQ ID NO: 3) by the restriction enzymes Ndel and Blpl. Two DNA fragments at approximately 5300 bp (linearized pET26b (+)) and at approximately 1500 bp (HoxH sequence excised from the plasmid pET26b (+)) are demonstrated. This confirms the presence of the HoxH sequence of interest in the expression vector pET26b (+).
  • HypA HypA
  • HypB HypC
  • HypD HypD
  • HypE HypF
  • HoxW HoxW
  • HypA is a FloxEFUYFI [NiFe] hydrogenase expression / formation protein in Synéchocystis sp. PCC6803.
  • Genbank accession number in Genbank is BAA18357.1.
  • the theoretical isoelectric point of HypA is 4.94 for a theoretical molecular mass: 12,773.47 Daltons.
  • the nucleotide sequence (342bp) of Hypa is as follows and is called SEQ ID NO: 5 in the context of the present invention: atgcacgaagttagtctgatggagcaaactttggcgatcgccattgcccaggcggaagaccatggagccagcca aatccatcgtttaaccctgcgggtggggcaacagtctggggtggtggccgatgccctacggtttgcgtttgaagtggt gcgacaaataccatggccgcgaggcgagattggaaattgaagaaattcccgttacctgtcgttgccaacactg ccacgaaaattttcagccagaggattggatttaccgctgtccccactgcgaccagattagccaaacagtaatggat ggcaaaa
  • the amino acid sequence (113 aa) of HypA is as follows and is named SEQ ID NO: 6 in the context of the present invention:
  • HypB is a [NiFe] - HoxEFUYH hydrogenase expression / formation protein in Synechocystis sp. PCC6803.
  • Genbank accession number of the protein in Genbank is BAA18312.1.
  • the theoretical isoelectric point of HyB is 5.75 for a theoretical molecular mass: 31,242.97 Daltons.
  • the nucleotide sequence (858bp) of HYPB is as follows and is called SEQ ID NO: 7 in the context of the present invention: atgtgccaaaactgcggttgtagtgcggtgggaaccgttgcccatagccaccatcaccatggcgatggaaattttgc ccacagccatgatgaccatgaccagcaagaacatcatcaccaccatggcaactacagcaaaagtccaagtccaagtcag cagactgtgaccattgaacccgatcgccagtccattggccaaggcattctcagcaagaatgaccgcctag cggaaaggaatcggggctatttccaggctaagggcttactggtgatgaatttcctctcccggagccggtaaaa ctgctctgatcgaaaaaatggtcggcgatcgaa
  • the amino acid sequence (285 aa) of HypB is as follows and is named SEQ ID NO: 8 in the context of the present invention:
  • FlypC is an expression / formation protein of [NiFe] - FloxEFUYFI hydrogenase in Synéchocystis sp. PCC6803.
  • the accession number of the protein in Genbank is BAA18180.1.
  • the theoretical isoelectric point of HypC is 4.20 for a theoretical molecular mass: 7987.42 Daltons.
  • the nucleotide sequence (231 bp) of HypC is as follows and is named SEQ ID NO: 9 in the context of the present invention: atgtgtctagccctacctggccaggttgtcagtttaatgcccaactccgatcccctgttactgacgggaaaggttagct ttgggggcatcattaaaaccattagccttgcctacgtacccgaggttaaggtgggggattacgtgattgtccatgtgg gctttgccattagcattgtggacgaagaggcggcccaggaaactttgatagacttggcagaaatgggagtttaa
  • SEQ ID NO: 10 The amino acid sequence (76 aa) of HypC is as follows and is called SEQ ID NO: 10 in the context of the present invention:
  • FlypD is a FloxEFUYFI [NiFe] hydrogenase expression / formation protein in Synechocystis sp. PCC6803.
  • Genbank Genbank accession number in Genbank is BAA16622.1.
  • the theoretical isoelectric point of HypD is 6.31 for a theoretical molecular mass of 40,632.94 Daltons.
  • the nucleotide sequence (1125bp) of HYPD is as follows and is called SEQ ID NO: 11 in the context of the present invention: atgaaatacgttgatgaatatcgggatgcccaggcggtggcccattaccgtcaggcgatcgccagggagataacc aaaccttggacgctgatggagatttgcggcggccagacccacagcattgtcaaatatggcttggatgctttgttgccg aagaatttgactctgatccatggtccccggctgtgtgtgcgtcactccgatggaattaattgaccaggctttgtggtta gctaagcaaccggagatcattttttttgttggcccttggcgatatgtggtgagctaagcaaccggagatcattttttttgtgg
  • the amino acid sequence (374 aa) of HypD is as follows and is named SEQ ID NO: 12 in the context of the present invention: MKYVDEYRDAQAVAHYRQAIAREITKPWTLMEICGGQTHSIVKYGLDALLPKNLTL IHGPGCPVCVTPMELIDQALWLAKQPEIIFCSFGDMLRVPGSGADLLSIKAQGGDV RIVYSPLDCLAIARENPNREVVFFGVGFETTAPATAMTLHQARAQGISNFSLLCAH VLVPPAMEALLGNPNSLVQGFLAAGHVCTVTGERAYQHIAEKYQVPIVITGFEPVD IMQGIFACVRQLESGQFTCNNQYRRSVQPQGNAHAQKIIDQVFEPVDRHWRGLG LIPASGLGLRPAFAPWDAAVKFANLLQTMAPTMGETVCISGEILQGQRKPSDCPA FGTICTPEQPLGAPMVSSEGACAAYYRYRQQLPEPVGAARV
  • FlypE is a FloxEFUYFI [NiFe] hydrogenase expression / formation protein in Synechocystis sp. PCC6803.
  • Genbank Genbank accession number in Genbank is BAA17478.1.
  • the theoretical isoelectric point of HypE is 4.93 for a theoretical molecular mass of 36425.60 Daltons.
  • nucleotide sequence (1038bp) of hype is as follows and is called SEQ ID NO: 13 in the context of the present invention: gtgaacttagtctgtcccgttccccttgatcgttatccccaggtactgttagcccacggcggcggcggtaagttgagcc aacaattacttaagcaaattttttttaccggccttttggcgcttctgaaacgggtagtcatgatgcggcggtttttactgcca accaaagttctttagctttcaccaccgactcctatgtgatcaatcccctcttttttcctgggggcgatattggttcttggca gtccacggcaccgttaatgacctagccatggccggcgcaacccctctcgctatatcagcg
  • the amino acid sequence (345 aa) of HypE is as follows and is named SEQ ID N0: 14 in the context of the present invention: MNLVCPVPLDRYPQVLLAHGGGGGKLSQQLLKQIFLPAFGASETGSHDAAVFTAN QSSLAFTTDSYVINPLFFPGGDIGSLAVGFEGTVNDILE METLWRVAQSLGQAAQNCGVEILTGDTKVVDRGKGDGIFINTSGIGSLDHQQTIH PNQVQVGDRLILSGDLGRHGMAIMAVRQGLEFETTIESDSAPVHREVQALLSAGI PIHCLRDLTRGGLASAVNEIAQTSGVTMALRETLIPVEAEVQAACELLGFDPLYVA NEGRFLAIVPPEAEQKTVEILQTFHPQATAIGTVTGKSAQTLGLVSLESSIGAPRLL DMISGEQLPRIC
  • FlypF is a FloxEFUYFI [NiFe] hydrogenase expression / formation protein in Synéchocystis sp. PCC6803.
  • the accession number of the protein in Genbank is BAA10154.1.
  • the theoretical isoelectric point of FlypF is 8.19 for a theoretical molecular mass of 85358.25 Daltons.
  • the nucleotide sequence (2304bp) of HypF is as follows and is called SEQ ID NO: 15 in the context of the present invention: atgttaaaaaccgttgccatacaggtccagggaagggtgcaaggagtgggttttcgtccctttgtttatacccttgccc aggaaatgggactgaatggttgggtgaataattccactcaaggagctaccgttgtcattaccgccgacgaaaaagg cgatcgcgactttacggagagattaacgaagacattacctccccctggtttgattgaacaattagccgttgaacagt taccgctggaaagtttactaactttactatccgccccagtagtgatggccctaaaactgcgagt
  • the amino acid sequence (767 aa) of HypF is as follows and is called SEQ ID NO: 16 in the context of the present invention: mlktvaiqvqgrvqgvgfrpfvytlaqemglngwvnnstqgatvvitadekaiadfterltktlpppglieqlaveqlpl esftnftirpssdgpktasilpdlstcsacltelfdpsdrrylypfincthcgprytiiealpydrcrttmarfrqctdcereyk qpgdrrfhaqpnacprcgpqlafwnrqgqviaeanealnfavdnlkvgniiaikglggfhlccdatdfeaveklrlrkh rpdkplavmygnlgqiveh
  • HoxW is a hypothetical protein in Synechocystis sp. PCC6803.
  • Genbank accession number of the protein in Genbank is BAA17680.1.
  • HoxW's theoretical isoelectric point is 4.93 for a theoretical molecular mass of 17129.53 Daltons.
  • the nucleotide sequence (474bp) of HoxW is as follows and is called SEQ ID NO: 17 in the context of the present invention: atgccaggccaatccaccaagtccactttaatcatcggttacggcaataccctgcggggggacgacggcgtggg gcgttacctagcggaagaaattgctcagcaaaactggccccattgtggagttattttccacccatcaactcaccccag aattggccgaggcgatcgcgctgtggaccgggtaattttcattgatgcccaactgcaggaatcagcaaacgacgac catcggtggaagttgtggccttaaaaccctggaacccaacgaactgtcaggggatttggggcaccggggtaatc ccagggaactctttaaaactct
  • all of the FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF and FloxW maturation factors are assembled in the form of a concatenary nucleotide sequence (6515bp).
  • This nucleotide sequence comprises the Ncol restriction site (CCATGG) at the start of the sequence and the Avril restriction site (CCTAGG) at the end of the sequence to carry out the cloning in the plasmid pACYCDuet-1.
  • This nucleotide sequence concaténaire is as follows and is called SEQ ID NO: 19 in the context of the present invention: ccaiggcccacgaagttagcctgatggaacagacgctggccattgccattgcgcaggcggaagaccacggggc gagccaaattcaccgtttaacgctgcgcgttgggcagcagtcgggtgttgtgcagatgcattacgctttgcatttgaa gtttcgccagaacacaatggctgcagaagcacgtctggaaatcgaggaaattccggttacctgtcgttgtcagca ttgtcatgaaaattttcagccggaggattggatatatagatgtccccattgtgaccagattagtcaaaccgttatggac ggca,
  • FIG. 3 represents the map of the plasmid pACYCDuet-1 used to construct the vector for the expression of at least one of the maturation factors HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF and HoxW by insertion of SEQ ID NO: 5 and / or SEQ ID NO: 7 and / or SEQ ID NO: 9 and / or SEQ ID NO: 11 and / or SEQ ID NO: 13 and / or SEQ ID NO: 15 and / or SEQ ID NO: 17 and / or SEQ ID NO: 19 in pACYCDuet-1.
  • pACYCDuet- 1 is a 4008bp plasmid, possessing an origin of replication for E.
  • FIG. 4 shows the analysis of the digestion of the expression vector pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW (concatenary sequence SEQ ID NO: 19) by the restriction enzymes Ncol and Hindlll. Two DNA fragments at approximately 6000 bp and at approximately 4000 bp are demonstrated, as expected for such an enzymatic digestion of the expression vector pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW. This confirms the presence of the sequence HypABCDEFHoxW in the expression vector pACYCDuet-1.
  • the competent BL21 (DE3) cells of E. coli were used for the recombinant expression of the HoxH subunit of [NiFe] -hydrogenase HoxEFUYH from Synechocystis sp. PCC6803. These cells are used routinely for the production of recombinant protein under the control of the T7 promoter.
  • a colony of E. coli containing the two expression vectors was used to inoculate 4 Erlenmeyer flasks with a volume of 250ml each.
  • the culture medium used is 2XYT medium (16g of tryptone, 10g of yeast extract, 5g of NaCl per liter) supplemented with 100mM FeAmCi, 50mM NiSC, 50mM cysteine, 50mg / ml kanamycin and 25pg / ml chloramphenicol.
  • a purification method has been developed to confirm the production of the recombinant form of the HoxH subunit of [NiFe] - HoxEFUYH hydrogenase from Synechocystis sp. PCC6803.
  • This method makes it possible to purify FloxFI to apparent homogeneity in a single affinity chromatography step.
  • the method involves immobilized metal affinity chromatography (IMAC).
  • the chelating agent is nitrilotriacetic acid (NTA) which allows the bond between the immobile phase and the metal ion.
  • the immobilized metal is nickel (Ni). This chromatography allows a very specific separation of proteins containing a polyhistidine tag.
  • E. coli After 20 h of recombinant production of HoxH at 18 ° C, 1 liter of E. coli is harvested by centrifugation (15min at 4500rpm). The cells are resuspended in 25ml of lysis buffer (20mM sodium phosphate buffer pH 7.5300mM KCI + 2mI benzonase + 50mI 1M MgCL + 1 pellet composed of a cocktail of protease inhibitors without EDTA) and then lysed with French press.
  • lysis buffer (20mM sodium phosphate buffer pH 7.5300mM KCI + 2mI benzonase + 50mI 1M MgCL + 1 pellet composed of a cocktail of protease inhibitors without EDTA
  • the supernatant (25ml) is recovered by centrifugation (15min at 15000rpm), filtered (0.45miti) and applied to the Ni-NTA column (1 ml) previously equilibrated in the washing buffer (20mM sodium phosphate buffer pH 7.5 300mM KCl + 10mM imidazole).
  • the column is then washed with 35 ml of washing buffer (20 mM sodium phosphate buffer pH 7.5 300 mM KCl + 10 mM imidazole) until the absorbance at 280 nm (representative of the protein concentration) falls back to zero.
  • the elution is then carried out via 5 stages with increasing concentration of imidazole, respectively 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM and 250 mM) (see FIG. 7).
  • the recombinant HoxH protein is also present in the fraction not absorbed by the Ni-NTA column. This indicates that the loading capacity of the Ni-NTA column is exceeded and that a proportion of the recombinant HoxH protein has not been able to bind to it. No signal appears in the “50 mM elution fraction”. The recombinant HoxH protein remains attached to the Ni-NTA column at this low concentration of imidazole. Finally, the presence of the recombinant HoxH protein is confirmed by immunodetection in the 200 mM fraction at the expected size, that is to say close to 54 kDa. This unambiguously confirms the purification of the recombinant HoxH protein in a single affinity chromatography step.
  • FIG 10 shows the structure of HoxEFUYH, [NiFe] -hydrogenase from Synechocystis sp. PCC 6803.
  • NADPH is the cofactor of HoxEFUYH in vivo in Synechocystis sp.
  • Methyl viologen (MV) is used as a redox mediator in the standard in vitro test for [NiFe] -hydrogenase activity.
  • Figure 11 is a schematic representation (gray arrow) of electron transfer and expected interactions between HoxEFUYH and NADPH and / or MV.
  • the MV can directly transmit electrons to one or more FeS centers bypassing the FMN.
  • the only HoxH subunit containing the active site of [NiFej-HoxEFUYH hydrogenases from Synechocystis sp. PCC 6803, can accept electrons directly from the MV and therefore produce hydrogen in the absence of an additional redox relay.
  • This standard test for in vitro activity of [NiFej-hydrogenases includes the use of a 2 ml flask closed with a septum, airtight and degassed in the air. 'nitrogen.
  • 1 ml of reaction mixture composed of 100 mM of sodium dithionite and 10 mM of MV dissolved in 10 mM phosphate buffer pH 6.8 and also degassed with nitrogen, is added to the flask using a syringe. 200 ⁇ g of recombinant HoxH proteins are also added to the reaction mixture.
  • the production of hydrogen starts from the moment when the recombinant HoxH proteins are added (moment indicated by an arrow in FIG.
  • the protein content was determined by the Bradford method (Bradford. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254). Hydrogen production is continuously monitored using a pre-calibrated hydrogen micro-sensor (Unisense, Aarhus, Denmark).
  • the activity of the recombinant HoxH protein can therefore be calculated since the quantity of recombinant HoxH protein added (in mg.ml _1 ) is known as the rate of hydrogen evolution (pmol H2.min _1 ) for this specific quantity of recombinant protein added.
  • This specific activity can, for example, be 0.1 mlH 2 min _1 mg _1 of enzyme.
  • reaction mixture composed of 40 pmoles of benzyl viologen dissolved in 50 mM Tris buffer pH 7.6 and also degassed with hydrogen, is added to the flask using a syringe.
  • the experiment is carried out at 40 ° C. 340 pg of recombinant HoxH proteins are also added to the reaction mixture.
  • the consumption of hydrogen and therefore the reduction of benzyl viologen starts the moment the recombinant HoxH proteins are added.
  • the protein content was determined by the Bradford method (Bradford. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254).
  • the reduction of benzyl viologen is monitored spectrophotometrically at a wavelength of 578nm. A molar extinction coefficient of 8,600 M _1 cm -1 was taken into account.
  • the activity of the recombinant HoxH protein can therefore be calculated since the quantity of recombinant HoxH protein added (in mg.ml -1 ) is known as the rate of hydrogen consumption (pmol H2.min _1 ), equivalent to the rate of reduction of benzyl viologen for that specific amount of recombinant protein added.
  • This specific activity can, for example, be 0.1 mitioI H2.min _1 .mg ⁇ 1 of enzyme.
  • the recombinant protein HoxH is capable on its own of catalyzing the reduction of protons, accepting electrons from a redox mediator (eg methyl viologen) without the intermediary of additional FeS centers serving as redox relays.
  • the HoxH protein is also capable on its own of catalyzing the oxidation of I ⁇ 2, reducing a redox mediator (eg benzyl viologen) without the intermediary of an additional FeS center serving as a redox relay.
  • the expression vector pET26b (+) + HoxH is introduced into E. coli (competent cells BL21 (DE3)) by transformation according to the traditional method of heat shock well known from the a person skilled in the art, and that in the absence of the expression vector pACYCDUET-1 + HypABCDEFHoxW. Transformants show resistance to kanamycin (50 ⁇ g / ml).
  • the HoxH protein was produced recombinantly in E. coli, but in the absence of the pACYCDUET-1 + HupABCDEFHoxW plasmid encoding the exogenous HupABCDEFHoxW processing factors.
  • the HoxH protein was then purified by affinity chromatography, similar to Example 5 above.
  • This standard test for in vitro activity of [NiFe] - hydrogenases includes the use of a 2 ml flask closed by a septum, airtight and degassed with nitrogen. 1 ml of reaction mixture, composed of 10OmM sodium dithionite and 10mM MV dissolved in 10mM phosphate buffer pH 6.8 and also degassed with nitrogen, is added to the flask using a syringe. 750pg of recombinant HoxH proteins are also added to the reaction mixture. The production of hydrogen starts from the moment when the recombinant HoxH proteins are added (moment indicated by an arrow in FIG. 15).
  • the protein content was determined by the Bradford method (Bradford. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254). Hydrogen production is continuously monitored using a pre-calibrated hydrogen micro-sensor (Unisense, Aarhus, Denmark).
  • the activity of the recombinant HoxH protein can therefore be calculated since the quantity of recombinant HoxH protein added (in mg.ml _1 ) is known as the rate of hydrogen evolution (pmol H2.min _1 ) for this specific quantity of recombinant protein added.
  • This specific activity can, for example, be 0.1 mitioI H2.min 1 .mg 1 of enzyme.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

La présente invention porte sur un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d'une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.

Description

Polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase, en particulier polypeptide monomérique recombinant présentant une activité hydrogénase
La présente invention porte sur un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase, en particulier sur un polypeptide monomérique recombinant présentant une activité hydrogénase, sur une cellule hôte incluant ce polypeptide monomérique et sur une cellule hôte incluant un polynucléotide codant pour ce polypeptide monomérique. La présente invention porte également sur un procédé d’obtention d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase, en particulier sur un procédé d’obtention d’un polypeptide monomérique recombinant présentant une activité hydrogénase et sur l’utilisation d’un tel polypeptide monomérique, en particulier sur l’utilisation d’un tel polypeptide monomérique recombinant.
La disponibilité décroissante de sources d'énergie fossile et la crainte d'un changement climatique dramatique ont favorisé l'émergence de technologies propres et renouvelables. L’hydrogène (H2) est considéré comme un vecteur d’énergie renouvelable prometteur en raison de sa forte teneur en énergie et de l’absence de pollution lors de son utilisation dans les piles à combustible. La production dT½ est actuellement réalisée par extraction chimique d'hydrocarbures fossiles, électrolyse de l'eau ou pyrolyse de biomasse. Cependant, le manque de systèmes de production à la fois non-polluants et commercialement viables est une limitation majeure. L'utilisation de méthodes de production biotechnologique d’H2, aussi appelé bio-hydrogène, pourrait être une solution. Le nombre de recherches sur la production de bio-hydrogène a considérablement augmenté au cours de la dernière décennie. Cela inclut la production microbienne principalement par le processus de la fermentation dans les bactéries et de la photosynthèse dans les microalgues, mais aussi la génération enzymatique d’hydrogène par « électro- enzymologie ». Toutes ces méthodes reposent sur des enzymes particulières appelées hydrogénases.
Les hydrogénases sont des métallo-enzymes qui catalysent la réaction chimique : 2 H+ + 2e <® H2. Cette réaction de production ou de consommation de l’hydrogène dépendante de l’enzyme est définie comme l’activité hydrogénase. La réaction est réversible et sa direction dépend du potentiel redox des composants capables d'interagir avec l'enzyme. En présence d’H2et d’un accepteur d’électrons, une hydrogénase consomme l’hydrogène. En présence d’un donneur d’électrons de faible potentiel, une hydrogénase utilise des protons comme accepteurs d’électrons et produit de IΉ2. Les hydrogénases sont largement répandues parmi les microorganismes car nombre d’entre eux utilisent l’hydrogène comme vecteur ou source d'énergie. Ces enzymes comptent de nombreux représentants dans le domaine des bactéries et des archées et sont également présentes dans certains organismes eucaryotes unicellulaires. Malgré leur diversité à bien des égards (hôte, taille, structure quaternaire, donneurs ou accepteurs d'électrons), les hydrogénases sont divisées en trois classes phylogénétiquement distinctes : les [Fe]- hydrogénases, les [FeFe]-hydrogénases et les [NiFe]-hydrogénases. Chaque classe est caractérisée par une composition métallique distinctive du site actif. Physiologiquement, il a été démontré que ces enzymes fonctionnent comme une valve pour un excès d’électrons.
Le centre catalytique des [Fe]-hydrogénases ne contient aucun centre FeS ou Ni et a donc été nommé « hydrogénase libre de centre fer-soufre » ou [Fe]- hydrogénases (Shima and Thauer. 2007. A third type of hydrogénase catalyzing H2 activation. Chem Rec 7:37-46). Les [Fe]-hydrogénases sont limitées à certains microorganismes méthanogènes (Pilak et al. 2006. The crystal structure of the apoenzyme of the iron-sulphur cluster-free hydrogénase. J Mol Biol 358:798-809) où elles sont essentielles à la croissance lors d’une carence en nickel (Thauer. 1998. Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson. 1998 Marjory Stephenson Prize Lecture. Microbiology 144 :2377-2406). Associé à un cofacteur spécifique, ces enzymes ont des propriétés catalytiques très différentes des autres types d’hydrogénases. En effet, elles ne catalysent pas la réaction réversible de production d’H2 (Vignais and Billoud. 2007. Occurrence, classification, and biological function of hydrogénases: an overview. Chem Rev 107:4206-4272). Pour cette raison, ainsi que par leur faible distribution, cette classe d'hydrogénases a été peu étudiée. La grande majorité des hydrogénases connues appartiennent aux deux autres classes.
Les [FeFej-hydrogénases sont des enzymes monomériques dont le centre catalytique est hautement conservé. Il s'agit d'un site de fer bi-nucléaire lié à un centre [4Fe-4S] par un pont de cystéine. Les ligands non protéiques, le cyanure (CN) et le monoxyde de carbone (CO), sont liés aux atomes de fer du centre bi- nucléaire. Les atomes de fer partagent également deux ligands soufre (Nicolet et al. 2000. A novel FeS cluster in Fe-only hydrogenases. Trends Biochem Sci 25:138- 143, Nicolet et al. 2002. Fe-only hydrogenases: structure, function and évolution. J Inorg Biochem 91 :1-8). Des domaines supplémentaires hébergent plusieurs centres FeS et assurent le transfert d'électrons entre la source d'électrons externe et le site actif intégré dans ces protéines monomériques. De plus, un canal hydrophobe relie la surface au site actif et fournit un accès pour les protons et une sortie pour les molécules d’H2. Trois protéines chaperonnes nommées HydE, HydF et HydG sont connues comme nécessaires à l'assemblage correct des [FeFej-hydrogénases (Vignais et al. 2001 . Classification and phylogeny of hydrogenases. FEMS Microbiol Rev 25:455-501). Ces enzymes sont présentes dans les procaryotes anaérobies (genres Clostridium ou Desulfovibrio), mais aussi dans quelques eucaryotes inférieurs tels que les champignons anaérobies ou les microalgues unicellulaires (genres Chlorella ou Chlamydomonas ) (Vignais and Billoud. 2007. Occurrence, classification, and biological function of hydrogenases: an overview. Chem Rev 107:4206-4272). Les [FeFej-hydrogénases favorisent thermodynamiquement la réoxydation du cofacteur (ferrédoxine ou NADH) et génèrent ainsi de IΉ2. Ces enzymes sont donc généralement impliquées dans l'élimination d’un excès d’équivalents réducteurs dans la cellule afin d’éviter, par exemple, un arrêt de la fermentation. Elles sont également capables d'interagir avec la chaîne photosynthétique d'un groupe restreint de microalgues pour oxyder la chaîne photosynthétique et ainsi activer la fixation du carbone après une incubation anoxique (Ghysels et al. 2013. Function of the chloroplast hydrogenase in the microalga Chlamydomonas: the rôle of hydrogenase and State transitions during photosynthetic activation in anaerobiosis. PLoS One 8:e64161 , Godaux et al. 2015. Induction of Photosynthetic Carbon Fixation in Anoxia Relies on Hydrogenase Activity and Proton-Gradient Regulation-Likel-Mediated Cyclic Electron Flow in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol 168:648-658).
Les [NiFe]-hydrogénases forment des hétéro-multimères globulaires (Volbeda et al. 1995. Crystal structure of the nickel-iron hydrogenase from Desulfovibrio gigas. Nature 373:580-587). Le site actif bi-métallique [NiFe] est situé dans la grande sous-unité où il est coordonné par quatre cystéines et trois ligands non protéiques, une molécule de CO et deux CN, liés à l’atome de fer (Happe et al. 1997. Biological activation of hydrogen. Nature 385:126, Pierik et al. 1999. Carbon monoxide and cyanide as intrinsic ligands to iron in the active site of [NiFe]- hydrogenases. NiFe(CN)2CO, Biology's way to activate H2. J Biol Chem 274:3331- 3337). Les autres sous-unités de l’hétéro-multimère contiennent plusieurs centres FeS médiaux et distaux, qui conduisent les électrons entre le site actif et le donneur ou l'accepteur d'électrons physiologique. Le groupe [4Fe-4S] situé à proximité du site actif est considéré comme essentiel à l'activité (Albracht. 1994. Nickel hydrogenases: in search of the active site. Biochim Biophys Acta 1188:167-204). En plus des gènes structurels, il existe plusieurs gènes accessoires impliqués dans la maturation et l'insertion de Ni, Fe, CO et CN dans le site actif de ces hétéro- multimères. En effet, la maturation des [NiFe]-hydrogénases suit une voie complexe impliquant au moins sept protéines auxiliaires (HypA-F et une endopeptidase) (Vignais and Billoud. 2007. Occurrence, classification, and biological function of hydrogenases: an overview. Chem Rev 107:4206-4272). Une autre caractéristique du site actif des [NiFe]-hydrogénases est la forte affinité pour l’hydrogène. Ces enzymes agissent donc principalement en consommant IΉ2 chez le micro organisme hôte, même si certaines [NiFe]-hydrogénases présentent une bonne capacité de production d’hydrogène. Les [NiFe]-hydrogénases sont des enzymes assez répandues parmi les procaryotes avec de nombreux représentants chez les bactéries et les archées. La classification des [NiFe]-hydrogénases est basée sur les alignements de séquences en acides aminés des différentes sous-unités et divise les [NiFe]-hydrogénases en quatre groupes. Remarquablement, cette classification est en bon accord avec les groupes dérivés des fonctions physiologiques (Vignais and Billoud. 2007. Occurrence, classification, and biological function of hydrogenases: an overview. Chem Rev 107:4206-4272).
L’extrême sensibilité des hydrogénases à l’oxygène aussi bien in vitro que in vivo est un problème lorsqu’on considère ces enzymes pour la production d’hydrogène à un niveau industriel. L’oxygène se lie en tant que ligand au site actif, accepte les électrons et est réduit en espèce réactive de l'oxygène (ROS) piégée dans l'enzyme. Cela peut entraîner des dommages permanents lorsque le ROS survit suffisamment longtemps pour attaquer le centre catalytique vulnérable. Les [FeFe]-hydrogénases présentent une sensibilité grave à GO2 car l'enzyme est endommagée de manière irréversible après une exposition à de petites concentrations d'02 (Ghirardi et al. 1997. Oxygen sensitivity of algal H2- production. Appl Biochem Biotechnol 63-65:141 -151 ). Cependant, les [NiFe]-hydrogénases sont décrites comme étant plus résistantes que les [FeFe]-hydrogénases aux dommages causés par l'oxygène. De plus, les [NiFe]-hydrogénases sont inactivées de manière réversible par O2. Certains micro-organismes, tels que Ralstonia sp., ont même développé un site actif tolérant à l'oxygène, et sont capables d'oxyder l'hydrogène même en présence d'air (Van der Linden et al. 2004. The soluble [NiFe]- hydrogenase from Ralstonia eutropha contains four cyanides in its active site, one of which is responsible for the insensitivity towards oxygen. J Biol Inorg Chem 9:616- 626). Ces diverses caractéristiques font des [NiFe]-hydrogénases de meilleurs candidats pour une utilisation technologique industriellement viable.
HoxEFUYH est une [NiFe]-hydrogénase bien caractérisée présente chez la cyanobactérie Synéchocystis sp. PCC6803. HoxEFUYH est une [NiFe]- hydrogénase pentamérique et cytoplasmique. HoxY et HoxH forment la partie « hydrogénase » tandis que HoxE, HoxF et HoxU constituent la partie en contact avec le cofacteur redox (Carrieri et al. 2011. The rôle of the bidirectional hydrogenase in cyanobacteria. Bioresour Technol 102:8368-8377). HoxH est la sous-unité responsable de l'activité catalytique, c’est-à-dire la sous-unité comprenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénase. HoxH contient les résidus conservés pour la liaison des atomes de nickel et de fer. HoxY contient le groupe proximal [4Fe-4S] prèRs du centre catalytique NiFe. HoxF et HoxU sont des protéines de type fer-soufre responsables de l’interaction in vivo avec le substrat (NADH, flavodoxine ou ferrédoxine réduite). HoxFU contiennent les centres FeS médiaux et distaux transportant les électrons vers FloxYFI. La fonction de FloxE n'est pas claire, mais il peut s'agir d'une sous-unité d’ancrage dans la membrane. Une analyse mutationnelle de la voie de maturation a identifié sept facteurs de maturation essentiels, appelés FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF et FloxW (Floffmann et al. 2006. Mutagenesis of hydrogenase accessory genes of Synechocystis sp. PCC 6803. Additional homologues of hypA and hypB are not active in hydrogenase maturation. FEBS J 273:4516-4527). Un modèle de maturation de HoxEFUYH a été proposé (Carrieri et al. 2011. The rôle of the bidirectional hydrogenase in cyanobacteria. Bioresour Technol 102:8368-8377, Cassier-Chauvat et al. 2014. Advances in the function and régulation of hydrogenase in the cyanobacterium Synechocystis PCC6803. Int J Mol Sci 15:19938-19951). La sous-unité HoxH est traitée par la protéase spécifique HoxW et le site [Ni-Fe] est ajouté à la sous-unité catalytique par le complexe HypABCDEF. Le génome complet de Synéchocystis sp. PCC6803 a été séquencé. Les gènes HoxEFUYH ont été identifiés comme étant regroupés dans un opéron octacistronique, contrairement aux gènes hypABCDEF dispersés dans le chromosome de Synéchocystis. Le promoteur de l'opéron hoxEFUYH n'est pas très actif (Dutheil et al. 2012. The AbrB2 autorepressor, expressed from an atypical promoter, represses the hydrogenase operon to regulate hydrogen production in Synechocystis strain PCC6803. J Bacteriol 194:5423-5433). Il est régulé par diverses conditions environnementales, telles que les disponibilités en hydrogène, en lumière, en nitrates, en nickel, en oxygène ou en soufre (Oliveira and Lindblad. 2009. Transcriptional régulation of the cyanobacterial bidirectional Hox-hydrogenase. Dalton Trans 9990-9996). Il est important de noter que les gènes hox sont exprimés de manière constitutive en présence d’oxygène (Kiss et al. 2009. Transcriptional régulation of the bidirectional hydrogenase in the cyanobacterium Synechocystis 6803. J Biotechnol 142:31-37), mais que l'enzyme, sensible à l'oxygène, est par conséquent inactive en conditions aérobies. La fonction physiologique précise fait encore l’objet de débats, mais HoxEFUYH fonctionnerait comme une valve de sécurité qui dissipe l’excès d’électrons en conditions redox défavorables, maintenant ainsi une balance oxydation/réduction adéquate dans la cellule pendant la fermentation ou la photosynthèse (Carrieri et al. 2011 . The rôle of the bidirectional hydrogenase in cyanobacteria. Bioresour Technol 102:8368-8377).
Il existe un grand nombre d'études sur HoxEFUYH. De nombreuses caractéristiques font de cette enzyme un bon candidat pour la production de bio hydrogène. Premièrement, cette [NiFe]-hydrogénase présente un biais en faveur de la réduction des protons (Mclntosh et al. 2011. The [NiFe]-hydrogenase of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 works bidirectionally with a bias to H2 production. J Am Chem Soc 133:11308-11319). L’opéron, et par conséquent l’enzyme, sont faiblement exprimés dans Synéchocystis sp. PCC6803 en condition aérobie (Kiss et al. 2009. Transcriptional régulation of the bidirectional hydrogenase in the cyanobacterium Synechocystis 6803. J Biotechnol 142:31-37). L’inactivation de FloxEFUYFI en présence d’oxygène est totale et presque instantanée. Cependant, FloxEFUYFI peut être réactivé rapidement (délais de l’ordre de la minute) en condition redox (par exemple par réduction avec de l'hydrogène et/ou par élimination de l'oxygène) (Appel et al. 2000. The bidirectional hydrogenase of Synechocystis sp. PCC 6803 works as an électron valve during photosynthesis. Arch Microbiol 173:333-338, Germer et al. 2009. Overexpression, isolation, and spectroscopic characterization of the bidirectional [NiFe] hydrogenase from Synechocystis sp. PCC 6803. J Biol Chem 284:36462-36472, Mclntosh et al. 2011 . The [NiFe]-hydrogenase of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 works bidirectionally with a bias to H2 production. J Am Chem Soc 133:11308-11319). Plusieurs protocoles de purification (Schmitz et al. 2002. HoxE-a subunit spécifie for the pentameric bidirectional hydrogenase complex (HoxEFUYH) of cyanobacteria. Biochim Biophys Acta 1554:66-74, Germer et al. 2009. Overexpression, isolation, and spectroscopic characterization of the bidirectional [NiFe] hydrogenase from Synechocystis sp. PCC 6803. J Biol Chem 284:36462- 36472) et de mise en œuvre en électrochimie (Mclntosh et al. 2011. The [NiFe]- hydrogenase of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 works bidirectionally with a bias to H2 production. J Am Chem Soc 133:11308-11319) sont disponibles. La possibilité de catalyser efficacement la production d'hydrogène, et avec une sensibilité limitée à l'oxygène, a permis à HoxEFUYH d'être identifié comme un bon candidat.
Un procédé commun et efficace pour produire une grande quantité d'une protéine d'intérêt est la production recombinante de cette protéine au sein d'un hôte hétérologue. Ce processus biotechnologique implique l'introduction et l'expression de gènes d'intérêts dans le génome de l'organisme hôte afin de produire une grande quantité de la protéine d'intérêt, avec un excellent degré de pureté. Il existe plusieurs systèmes de production recombinante. Le système procaryote reste le système le plus rapide et le plus facile afin de produire une protéine d'intérêt, le système eucaryote étant plus lent et plus compliqué à mettre en œuvre. Chaque organisme a ses propres avantages et inconvénients. Il n’existe pas encore de système d’expression universellement applicable. Il est très difficile de prédire quel hôte fonctionnera le mieux pour une protéine particulière ou pour une utilisation finale particulière. Escherichia coli (E. coli) est l'organisme de référence pour la production recombinante. En effet, cette bactérie est très connue du point de vue de l’ingénierie génétique et physiologique, avec par exemple : cellule optimisée (productivité élevée, utilisation de codons, inhibition des protéases endogènes), milieu de culture optimisé, temps de doublement court, faible contamination, disponibilité de nombreux vecteurs commerciaux, mise à l'échelle industrielle, rendement de production important.
La production et l'ingénierie d'hydrogénases recombinantes, à l'instar des métalloprotéines en général, ont connu un succès limité. La littérature fournit des exemples de [FeFe]-hydrogénases exprimées de manière hétérologue dans E. coli (King et al. 2006. Functional studies of [FeFe] hydrogenase maturation in an Escherichia coli biosynthetic System. J Bacteriol 188:2163-2172, Yacoby et al. 2012. Optimized expression and purification for high-activity préparations of algal [FeFe]- hydrogenase. PLoS One 7:e35886, Kuchenreuther et al. 2009. Tyrosine, cysteine, and S-adenosyl méthionine stimulate in vitro [FeFe] hydrogenase activation. PLoS One 4:e7565). Les [FeFe]-hydrogénases sont des enzymes monomériques nécessitant un nombre limité de facteurs de maturation.
La production hétérologue de [NiFe]-hydrogénases est qualifiée de difficile (English et al. 2009. Recombinant and in vitro expression Systems for hydrogenases: new frontiers in basic and applied studies for biological and synthetic H2 production. Dalton Trans 9970-9978).
Premièrement, la difficulté provient de la complexité et de la spécificité du processus d'assemblage du site actif [NiFe], qui nécessite théoriquement au moins sept facteurs de maturation pour un assemblage fonctionnel.
Deuxièmement, le repliement correct de chacune des sous-unités de l’hétéro-multimère est requis, ce qui est particulièrement difficile à contrôler et à assurer lors d’une production hétérologue.
Troisièmement, l'assemblage correct de chaque sous-unité dans le complexe hétéro-multimérique est obligatoire. Un mauvais repliement peut mener à un phénomène d’agrégation et donc à une diminution de la quantité d’enzyme active (Singh et al. 2015. Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process. Microb Cell Fact 14:41 ). L’obtention d’une séquence précise est nécessaire pour obtenir une activité enzymatique, ce qui peut s’avérer être difficile à contrôler et à assurer chez un hôte hétérologue.
Tout ceci explique pourquoi les [NiFe]-hydrogénases ne sont pas toujours actives lorsqu'elles sont produites par recombinaison hétérologue. Cependant, il existe plusieurs cas dans la littérature où une [NiFej-hydrogénase active a été produite dans E. coli (Kim et al. 2011 . Production of biohydrogen by heterologous expression of oxygen-tolerant Flydrogenovibrio marinus [NiFej- hydrogenase in Escherichia coli. J Biotechnol 155:312-319, Maier et al. 2015. Identification, cloning and heterologous expression of active [NiFej-hydrogenase 2 from Citrobacter sp. SG in Escherichia coli. J Biotechnol 199:1 -8, Schiffels et al. 2013. An innovative cloning platform enables large-scale production and maturation of an oxygen-tolerant [NiFej-hydrogenase from Cupriavidus necator in Escherichia coli. PLoS One 8:e68812, Weyman et al. 2011 . Genetic analysis of the Alteromonas macleodii [NiFej-hydrogenase. FEMS Microbiol Lett 322:180-187).
En particulier, les travaux de Sun et de ces collaborateurs (Sun et al. 2010. Fleterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFej- hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PLoS One 5:e10526) ont permis l’expression de la [NiFe]-hydrogénase de Pyrococcus furiosus en anoxie dans E. coli par l’intermédiaire de quatre vecteurs d'expression permettant la co-expression de 13 gènes hétérologues (quatre gènes de structure et neuf facteurs de maturation). Plus spécifiquement, les travaux de Sun et al. ont permis d’obtenir une enzyme recombinante tétramérique de type [NiFe]-hydrogénase comprenant les quatre sous-unités dénommées PF0891 , PF0892, PF0893 et PF0894. Après purification, cette enzyme recombinante tétramérique s'est révélée être fonctionnellement similaire à l'enzyme native purifiée à partir de P. furiosus.
FloxEFUYFI étant une protéine procaryote de la cyanobactérie Synéchocystis , le système E. coli convient à sa production recombinante. Cette production dans E. coli a déjà été réalisée avec succès. En ce sens, Maeda et ses collègues ont montré une augmentation in vivo de la production d'hydrogène dans les cellules de E. coli exprimant, en condition anoxique, l’enzyme HoxEFUYH cyanobactérienne (Maeda et al. 2007. Inhibition of hydrogen uptake in Escherichia coli by expressing the hydrogenase from the cyanobacterium Synéchocystis sp. PCC 6803. BMC Biotechnol 7:25). Une telle production d'hydrogène accrue en présence de FloxEFUYFI est due à l’inhibition de l'activité des hydrogénases endogènes 1 et 2 consommatrices d’Fte chez E. coli.
Citons également Wells et ses collaborateurs qui ont introduit les gènes FloxEFUYFI et ces facteurs de maturation associés dans E. coli (Wells et al. 2011 . Engineering a non-native hydrogen production pathway into Escherichia coli via a cyanobacterial [NiFe] hydrogenase. Metab Eng 13:445-453). Ce travail a démontré la production d'hydrogène, en anoxie, aussi bien in vivo que in vitro via HoxEFUYH dans un hôte nul pour les hydrogénases endogènes. Ils indiquent un couplage avec des systèmes de transfert d'électrons de l'hôte comme la fermentation et montrent le potentiel de HoxEFUYH dans l'ingénierie métabolique pour améliorer les rendements de production d’hydrogène.
Dans l’état de la technique, il n’y a pas de divulgation d’un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFej-hydrogénase, en particulier d’un monomère isolé issu d’un complexe de type [NiFej-hydrogénase, présentant à lui seul une activité hydrogénase, quand bien même les documents D2 (Hornhardt et al. 1986. Characterization of a native subunit of the NAD-linked hydrogenase isolated from a mutant of Alcaligenes eutrophus H16. Biochimie, Masson, Paris, FR, vol. 68(1), pages 15-24) et D3 (Przybyla et al. 1992. Structure-function relationships among the nickel-containing hydrogenases. FEMS Microbiol Rev 8:109-135) semblent vouloir le faire croire.
Le document D2 décrit la caractérisation d’une sous-unité native de la [NiFe]-hydrogénase d 'Alcaligenes eutrophus H16. Ce peptide représente la sous- unité catalytique de la [NiFe]-hydrogénase et est décrit comme totalement inactif avec le NAD comme médiateur redox, mais présentant une activité résiduelle très faible avec le bleu de méthylène, le ferricyanure et le cytochrome C.
Le document D3 suggère l’existance de monomères de type [NiFe]- hydrogénase présentant une activité hydrogénase. Comme exemples, le document D3 mentionne, en citant le document D2, la [NiFe]-hydrogénase d’ Alcaligenes eutrophus, et aussi la [NiFe]-hydrogénase-1 d ’Escherishia coli.
Cependant, des études publiées ultérieurement, y compris les études décrites dans les documents D1 (Massanz et al. 1998. Subforms and in vitro reconstitution of the NAD-reducing hydrogenase of Alcaligenes eutrophus. J Bacteriol 180:1023-1029), D4 (Senger et al. 2017. Proteolytic cleavage orchestrâtes cofactor insertion and protein assembly in [NiFe]-hydrogenase biosynthesis. J Biol Chem 292:11670-11681) et D5 (Pinske et al. 2011. Efficient électron transfer from hydrogen to benzyl viologen by the [NiFe]-hydrogenases of Escherichia coli is dépendent on the coexpression of the iron-sulfur cluster-containing small subunit. Arch Microbiol 193:893-903), ont montré que les conclusions des études des documents D2 et D3 sont erronées.
L’étude décrite dans le document D1 a démontré que la sous-unité contenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénase d ’Alcaligenes eutrophus H16 toute seule ne présentait aucune activité de type hydrogénase, et ce avec plusieurs médiateurs redox, notamment le benzyl viologène. Le document D1 mentionne que la plus petite entité de la [NiFe]-hydrogénase d ’Alcaligenes eutrophus susceptible d’avoir une activité hydrogénase consiste en la large sous-unité contenant le centre [NiFe] et la petite sous-unité avec un minimum d’un centre FeS. De manière similaire, les études présentées dans les documents D4 et D5 s’opposent à l’enseignement du document D3 en montrant que la sous-unité catalytique seule de l’hydrogénase-1 [NiFe] d ’Escherishia coli ne présente aucune activité hydrogénase La majorité des travaux réalisés sur ce sujet, y compris les études des documents D1 , D4 et D5 considèrent que le centre [4Fe-4S] situé dans la petite sous-unité est essentiel et indispensable à l'activité hydrogénase de la grande sous- unité des [NiFe]-hydrogénases (Albracht. 1994. Nickel hydrogenases: in search of the active site. Biochim Biophys Acta 1188:167-204). En outre, les analyses structurelles des [NiFe]-hydrogénases ont largement démontré l’absence de centre FeS dans la sous-unité catalytique contenant le site actif (Lubitz et al. 2014. Hydrogenases. Chem Rev 114:4081-4148),
Ainsi, les résultats décrits précédemment dans le document D2 ne peuvent s’expliquer que par une contamination de la sous-unité catalytique par la petite sous-unité, comme en atteste la mise en évidence de centre FeS dans les préparations permettant la faible activité hydrogénase mesurée.
En conclusion, l’ensemble des travaux réalisés qui constituent l’état de la technique considèrent que la réduction du nombre de sous-unités n’est ni favorable à l’activité ni à la stabilité des hydrogénases et que la sous-unité contenant le centre NiFe, isolée des complexes multimériques des hydrogénases de type NiFe, ne présente pas d’activité hydrogénase à elle seule.
Malheureusement, comme il ressort notamment de l’état de la technique mentionné ci-dessus, il demeure plusieurs inconvénients freinant considérablement l’utilisation des [NiFe]-hydrogénases, et notamment l’utilisation de HoxEFUYH, pour une bio-production d’hydrogène commercialement rentable.
A ce jour, il existe donc un réel besoin de surmonter les obstacles freinant l’utilisation des [NiFe]-hydrogénases pour une production d’hydrogène dès lors que, comme indiqué plus haut, les [NiFe]-hydrogénases présentent indéniablement un haut potentiel pour la production d’hydrogène.
Pour résoudre ces problèmes, il est prévu suivant l’invention, un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité enzymatique, en particulier une activité enzymatique de type hydrogénase, plus particulièrement une activité catalytique, plus particulièrement encore une activité catalytique de type hydrogénase.
De préférence, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique comprend une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase.
De préférence, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique est constitué d’une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase.
De préférence, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique consiste en une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase.
En d’autres termes, préférentiellement, il est prévu selon l’invention, un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant uniquement le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant à lui seul une activité enzymatique, en particulier une activité enzymatique de type hydrogénase, plus particulièrement une activité catalytique, plus particulièrement encore une activité catalytique de type hydrogénase.
Dans le cadre de la présente invention, il a été mis en évidence qu’un tel polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase et présentant une activité hydrogénase permet de s’affranchir au moins en partie des obstacles freinant l’utilisation des [NiFe]-hydrogénases pour une production d’hydrogène, ceci tout en garantissant une activité hydrogénase d’au moins 0,01 mitioI H2 . min-1 . mg_1 d’enzyme, de préférence d’au moins 0,05 mitioI H2 . min-1 . rng-1 d’enzyme.
En effet, dès lors qu’il s’agit selon l’invention d’un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, les difficultés rencontrées avec les [NiFe]- hydrogénases, notamment pour assurer l’assemblage du site actif, pour assurer un repliement adéquat de chacune des sous-unités impliquées et pour assurer un assemblage correct de chaque sous-unité dans un complexe hétéro-multimérique, sont fortement réduites voire éliminées. Ceci permet d’augmenter la reproductibilité lors du processus d’obtention de la [NiFe]-hydrogénase puisqu’une seule sous-unité est impliquée. En effet, la production d’un seul polypeptide monomérique simplifie fortement le processus complexe de repliement en comparaison avec les enzymes dimérique, tétramérique et pentamérique pour lesquelles un assemblage correct du site actif, de chacune des sous-unités et enfin de l’enzyme entière est particulièrement difficile à contrôler et à garantir, ce qui constitue un obstacle à leur utilisation. Selon l’invention, le repliement adéquat d’une seule sous-unité est nécessaire et aucun assemblage entre différentes sous-unités n’est requis pour former un complexe hétéro-multimérique.
Par ailleurs, il a été mis en évidence que le procédé de fabrication d’un tel polypeptide monomérique selon l’invention peut être totalement réalisé en condition aérobie (pas de précaution requise par rapport à l’oxygène lors des étapes d’expression et de purification), ce qui écarte les problématiques rencontrées avec les procédés de fabrication des [NiFe]-hydrogénases dimériques, tétramériques et pentamériques recombinantes rencontrées dans l’état de la technique et pour lesquelles les procédés de fabrication sont réalisés en anoxie. Comme mentionné plus haut, même si l’accumulation de biomasse est réalisée en présence d’oxygène, la phase de production de l’hydrogénase recombinante est quant à elle réalisée en anoxie selon les procédés connus de l’état de la technique (Sun et al. 2010. Fleterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]- hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PLoS One 5:e10526, Wells et al. 2011 . Engineering a non-native hydrogen production pathway into Escherichia coli via a cyanobacterial [NiFe] hydrogenase. Metab Eng 13:445-453). L’absence d’oxygène est également rapportée (boite anoxie, dithionite de sodium dans les tampons) lors des diverses étapes chromatographiques de la purification. Le maintien d’un tel niveau d’anoxie aux cours du procédé implique évidemment une augmentation des coûts liés à la production recombinante, ce qui est solutionné par la présente invention. De façon avantageuse suivant l’invention, la taille du polypeptide monomérique selon l’invention est nettement plus faible en comparaison avec l’hétéro-multimère, une augmentation de l’activité massique de l’enzyme (nombre d’entité catalytiquement active par mg de protéine total) étant ainsi obtenue.
Une meilleure intégration et une densification du catalyseur enzymatique est également réalisable, par exemple, lors d’une mise en œuvre électrochimique du polypeptide monomérique selon l’invention, comme par exemple dans une pile à combustible.
En outre, la structure tridimensionnelle d’un polypeptide monomérique selon l’invention est facilement modélisable notamment pour déterminer les résidus exposés à la surface de la protéine, par exemple pour faciliter l’orientation ainsi que l’adsorption par rapport à une interface, par exemple par rapport à une électrode de carbone. Cette caractéristique permet avantageusement, par exemple, d’améliorer la stabilité du lien entre l’interface et le catalyseur enzymatique, mais aussi une optimisation du transfert d’électrons direct entre l’interface et le site actif. Le rendement énergétique est dès lors amélioré en l’absence de relais redox supplémentaires, ce qui limite les pertes énergétiques.
Dans le contexte de la présente invention, il a également été démontré que le polypeptide monomérique est bien actif et apte à la production par catalyse d’H2 (par exemple via le test standard de production in-vitro d’FL par les hydrogénases utilisant le méthyl-viologène réduit comme médiateur redox) ainsi qu’à la consommation par catalyse d’H2 (par exemple via le test standard de consommation in-vitro d’H2 par les hydrogénases utilisant le benzyl viologène oxydé comme médiateur redox), sans présence du centre FeS proximal présent dans la petite-sous-unité et décrit comme essentiel, ni d’ailleurs d’aucun autres relais redox. Ceci est tout à fait surprenant puisqu’une simplification aussi poussée de l’enzyme hétéro-multimérique n’a jamais permis la mise en évidence de l’activité hydrogénase dans l’état de la technique.
De façon d’autant plus avantageuse, alors que seule une production d’H2 limitée est actuellement obtenue avec les [NiFej-hydrogénases recombinantes connues (Sun et al. 2010. Fleterologous expression and maturation of an NADP- dépendent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PLoS One 5:e10526, Schiffels et al. 2013. An innovative cloning platform enables large-scale production and maturation of an oxygen-tolerant [NiFe]-hydrogenase from Cupriavidus necator in Escherichia coli. PLoS One 8:e68812, Maier et al. 2015. Identification, cloning and heterologous expression of active [NiFe]-hydrogenase 2 from Citrobacter sp. SG in Escherichia coli. J Biotechnol 199:1 -8), il a été montré que le polypeptide monomérique selon l’invention présente une activité hydrogénase au moins équivalente voire même supérieure à celles obtenues avec les [NiFe]-hydrogénases (recombinantes) connues.
Selon un mode de réalisation suivant l’invention, le polypeptide monomérique est isolé de son environnement naturel, en particulier isolé d’une protéine naturelle de type [NiFe]-hydrogénase.
A titre d’exemple, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique peut être issu/isolé d’un procaryote. Les exemples incluent, mais ne sont pas limité à un membre du genre Escherichia (comme par exemple Escherichia coli), un membre du genre Desulfovibrio (comme par exemple Desulfovibrio gigas ), un membre du genre Hydrogenophilus (comme par exemple Hydrogenophilus thermoluteolus), un membre du genre Desulfomicrobium (comme par exemple Desulfomicrobium baculatum), Synéchocystis (comme par exemple Synéchocystis sp. PCC6803), un membre du genre Phormidium (comme par exemple Phormidium ambiguum) ou un membre du genre Spirulina (comme par exemple Spirulina platensis). Par exemple, ledit polypeptide monomérique peut être issu d’une cellule ou d’un microbe ou peut être produit in vitro ou in vivo.
Selon un mode de réalisation suivant l’invention, le polypeptide monomérique est recombinant ou hétérologue.
Avantageusement, selon l’invention, le polypeptide monomérique est purifié.
Préférentiellement, selon l’invention, le polypeptide monomérique présente une séquence en acides aminés tronquée ou non présentant au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.
De façon encore préférée, selon l’invention, le polypeptide monomérique présente une séquence en acides aminés tronquée ou non présentant au moins 81 % d’identité, au moins 82% d’identité, au moins 83% d’identité, au moins 84% d’identité, au moins 85% d’identité, au moins 86% d’identité, au moins 87% d’identité, au moins 88% d’identité, au moins 89% d’identité, au moins 90% d’identité, au moins 91% d’identité, au moins 92% d’identité, au moins 93% d’identité, au moins 94% d’identité, au moins 95% d’identité, au moins 96% d’identité, au moins 97% d’identité, au moins 98% d’identité, au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.
Avantageusement, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique est caractérisé en ce que ladite sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase est la sous-unité HoxH de la protéine de type [NiFe]- hydrogénase FloxEFUYFI chez / de Synechocystis sp. PCC6803.
De préférence, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique présente une activité hydrogénase d’au moins 0,01 mitioI H2 . min-1 . mg_1 d’enzyme, de préférence d’au moins 0,05 mitioI H2 . min-1 . rng-1 d’enzyme, préférentiellement d’au moins 10 mitioI H2 . m1 . rng-1 d’enzyme.
La présente invention porte également sur une cellule hôte incluant un polypeptide monomérique selon l’invention, ledit polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.
Préférentiellement, la présente invention porte sur une cellule hôte incluant un polypeptide monomérique selon l’invention dont la sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase est la sous-unité HoxH de la protéine de type [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH chez / de Synechocystis sp. PCC6803.
A titre d’exemple, selon l’invention, la cellule hôte, notamment pour l’expression dudit polypeptide monomérique, peut-être une cellule bactérienne hôte du genre Escherichia (comme par exemple Escherichia coll), du genre Bacillus (comme par exemple Bacillus subtilis), du genre Streptomyces (comme par exemple Streptomyces coelicolor), du genre Synéchocystis (comme par exemple Synéchocystis sp. PCC6803), du genre Synéchococcus (comme par exemple Synéchococcus WFI8102), ou toute autre cellule procaryote, une cellule eucaryote par exemple du genre Chlamydomonas (comme par exemple Chlamydomonas reinhardtii), du genre Saccharomyces (comme par exemple Saccharomyces cerevisiae), de type Pichia (comme par exemple Pichia pastoris), ou un autre type de cellule eucaryotes.
Selon l’invention, ledit polypeptide monomérique indu dans ladite cellule hôte peut lui-même mais non indispensablement être issu de l’expression d’un gène indu dans un vecteur d’expression, par exemple dans un plasmide inséré dans ladite cellule hôte.
Avantageusement, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique indu dans ladite cellule hôte a une séquence en acides aminés tronquée ou non présentant au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.
De préférence, selon l’invention, ladite cellule hôte peut inclure un ou plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase, de préférence un ou plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]- hydrogénase choisi dans, le groupe constitué des facteurs de maturation FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF et FloxW a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, respectivement par rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l’ensemble de ces facteurs de maturation.
Selon l’invention, ledit au moins un facteur de maturation peut être endogène à la cellule hôte et/ou exogène à la cellule hôte.
Avantageusement, pour une cellule hôte selon l’invention, ledit polypeptide monomérique et/ou ledit au moins un facteur de maturation est/sont issu(s) de l’expression d’au moins un gène indu dans un vecteur d’expression, ledit vecteur d’expression étant indu dans ladite cellule hôte.
La présente invention porte également sur une cellule hôte incluant un polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique selon l’invention comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.
Préférentiellement, la présente invention porte sur une cellule hôte incluant un polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique dont la sous- unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase est la sous- unité HoxH de la protéine de type [NiFe]-hydrogénase FloxEFUYFI chez / de Synechocystis sp. PCC6803.
De préférence, selon l’invention, ledit polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique présente une séquence nucléotidique ayant au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, respectivement par rapport aux séquences, par rapport aux séquences nucléotidiques SEQ ID NO :1 et/ou SEQ ID NO :3.
A titre d’exemple, selon l’invention, la cellule hôte incluant un polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique selon l’invention, et étant utilisée notamment pour l’expression dudit polypeptide monomérique, peut être une cellule bactérienne hôte du genre Escherichia (comme par exemple Escherichia coli), du genre Bacillus (comme par exemple Bacillus subtilis), du genre Streptomyces (comme par exemple Streptomyces coelicolor), une cellule bactérienne photosynthétique du genre Synéchocystis (comme par exemple Synéchocystis sp. PCC6803) ou Synéchococcus (comme par exemple Synéchococcus WFI8102) ou toute autre cellule procaryote, une cellule eucaryote par exemple du genre Chlamydomonas (comme par exemple Chlamydomonas reinhardtii), du genre Saccharomyces (comme par exemple Saccharomyces cerevisiae), de type Pichia (comme par exemple Pichia pastoris), ou un autre type de cellule eucaryotes.
Selon l’invention, ledit polynucléotide indu dans ladite cellule hôte peut lui-même mais non indispensablement être indu dans un vecteur d’expression, par exemple dans un plasmide, inséré dans ladite cellule hôte.
Avantageusement, selon l’invention, ledit polypeptide monomérique codé par ledit polynucléotide indu dans ladite cellule hôte a une séquence en acides aminés tronquée ou non présentant au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.
De préférence, selon l’invention, ladite cellule hôte incluant un polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique peut inclure un ou plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase, de préférence un ou plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]- hydrogénase choisi dans, le groupe constitué des facteurs de maturation FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF et FloxW a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, respectivement par rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID
NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l’ensemble de ces facteurs de maturation.
Selon l’invention, ledit au moins un facteur de maturation peut être endogène à la cellule hôte et/ou exogène à la cellule hôte.
Avantageusement, pour une cellule hôte selon l’invention, ledit polypeptide monomérique et/ou ledit au moins un facteur de maturation est/sont issu(s) de l’expression d’au moins un gène indu dans un vecteur d’expression, ledit vecteur d’expression étant indu dans ladite cellule hôte.
La présente invention porte encore sur un procédé d’obtention, par exemple dans une cellule hôte (par exemple dans E. coli), d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase selon l’invention, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
• modification d’un vecteur d’expression, par exemple d’un plasmide, en y incluant un polynucléotide exogène dont au moins une partie code pour un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase ; et
• incubation dudit vecteur d’expression modifié selon des conditions d’incubation permettant d’assurer une expression dudit polynucléotide exogène pour produire un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]- hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.
Le procédé selon l’invention permet de réaliser une production de la seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase.
L’homme de métier est bien entendu à même de définir les conditions d’incubation requises et adéquates.
Selon l’invention, lors de l’étape de modicfication génétique d’une cellule hôte, le polynucléotide peut lui-même mais non indispensablement être indu dans un vecteur d’expression, par exemple dans un plasmide.
Avantageusement, selon l’invention, ladite étape de modification dudit vecteur d’expression consiste en une inclusion dans ledit vecteur d’expression dudit polynucléotide exogène dont au moins une partie code pour ledit polypeptide monomérique dont la séquence en acides aminés tronquée ou non présente au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.
De préférence, selon l’invention, ladite étape de modification dudit vecteur d’expression peut comprendre l’inclusion dans ledit vecteur d’expression d’un ou de plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]- hydrogénase, de préférence d’un ou de plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase choisi dans, le groupe constitué des facteurs de maturation FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF et FloxW a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, respectivement par rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l’ensemble de ces facteurs de maturation. Selon l’invention, lors de l’étape de modification dudit vecteur d’expression, une séquence codant pour un ou plusieurs facteurs de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase peut elle-même mais non indispensablement être incluse dans un vecteur d’expression, par exemple dans un plasmide.
Avantageusement, le procédé selon l’invention comprend une étape subséquente d’isolation et/ou de purification dudit polypeptide monomérique.
En particulier et de préférence, l’invention porte sur un procédé d’obtention d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase suivant l’invention, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
• une étape de modification génétique, réalisée in-vivo ou in-vitro, d’une entité comprenant un matériel génétique, par exemple d’une cellule hôte ou d’un vecteur d’expression, pour obtenir une entité génétiquement modifiée, par exemple une cellule hôte génétiquement modifiée ou un vecteur d’expression génétiquement modifié ;
• une étape d’incubation de ladite entité génétiquement modifiée, par exemple de ladite cellule hôte génétiquement modifiée ou dudit vecteur d’expression génétiquement, pour obtenir un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.
Préférentiellement, selon l’invention, ladite étape de modification génétique, réalisée in-vivo ou in-vitro, consiste : a) en une modification génétique d’une cellule hôte et/ou d’un vecteur d’expression en y incluant un polynucléotide exogène dont au moins une partie code pour un polypeptide monomérique comportant une seule sous- unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, pour obtenir une cellule hôte génétiquement modifiée et/ou un vecteur d’expression génétiquement modifié à incuber lors de ladite étape d’incubation réalisée selon des conditions d’incubation permettant d’assurer une expression dudit polynucléotide exogène pour produire ledit polypeptide monomérique ; ou b) en l’induction d’au moins une mutation génétique dans le matériel génétique d’une cellule hôte pour obtenir une cellule hôte génétiquement modifiée à incuber lors de ladite étape d’incubation réalisée selon des conditions d’incubation pour produire ledit polypeptide monomérique.
L’homme de métier est bien entendu à même de définir les conditions d’incubation requises et adéquates.
Par exemple, selon l’invention, ladite induction d’au moins une mutation génétique est effectuée par recombinaison homologue, méthode bien connue de l’homme de métier.
Avantageusement, selon l’invention, ladite étape de modification génétique de ladite cellule hôte par inclusion d’un polynucléotide exogène consiste en une inclusion dans ladite cellule hôte d’un vecteur d’expression, en particulier d’un vecteur d’expression modifié, incluant ledit polynucléotide exogène.
De préférence, selon l’invention, ladite étape de modification génétique de ladite cellule hôte consiste en une inclusion dans ladite cellule hôte dudit polynucléotide exogène dont au moins une partie code pour ledit polypeptide monomérique dont la séquence en acides aminés tronquée ou non présente au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.
Avantageusement, selon l’invention, ladite étape de modification génétique de ladite cellule hôte comprend en outre l’inclusion dans ladite cellule hôte d’au moins un facteur de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit au moins un facteur de maturation étant endogène à la cellule hôte et/ou exogène à la cellule hôte, de préférence l’inclusion d’au moins un facteur de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase choisi dans le groupe constitué des facteurs de maturation FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF et HoxW a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins
80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, respectivement par rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID
NO:18 ; ou b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l’ensemble de ces facteurs de maturation.
De préférence, selon l’invention, ledit au moins un facteur de maturation est issu de l’expression d’au moins un gène indu dans un vecteur d’expression, ledit vecteur d’expression étant indu dans ladite cellule hôte.
Préférentiellement, le procédé d’obtention d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase suivant l’invention donne lieu à l’obtention d’un polypeptide monomérique dont la sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase est la sous-unité HoxH de la protéine de type [NiFe]-hydrogénase FloxEFUYFI chez Synechocystis sp. PCC6803.
La présente invention porte encore sur une utilisation d’un polypeptide monomérique suivant l’invention comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase et étant présent ou non dans une cellule, pour produire ou consommer de l’hydrogène par incubation dudit polypeptide monomérique selon des conditions d’incubation permettant d’assurer une production ou une consommation d’hydrogène.
La présente invention porte encore sur une utilisation d’un polypeptide monomérique suivant l’invention ou d’un polypeptide monomérique obtenu selon le procédé suivant l’invention comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase et étant présent ou non dans une cellule, pour revêtir une surface, en particulier pour revêtir une surface d’un conducteur électrique, par exemple pour revêtir une surface d’une anode ou d’une cathode.
Définitions
Par le terme « polypeptide », il est entendu, au sens de la présente invention, une chaîne unique composée d’un minimum de deux acides aminés liés entre eux par un lien peptidique entre le groupement carboxylique d’un acide aminé et le groupement amine de l’acide aminé suivant. Le terme « polypeptide » inclut également les molécules qui contiennent plus qu’un polypeptide, ceux-ci liés entre eux, par exemple par des ponts disulfures, ou des complexes de polypeptides, ceux- ci liés entre eux par exemple de manière covalente ou non-covalente, et formant un multimère (par exemple un dimère, un trimère, un quadrimère, un pentamère). Un polypeptide peut aussi contenir des ligands non-protéiques, comme par exemple le fer inorganique (Fe), le nickel (Ni), un centre fer-soufre (FeS), ou autre ligand organique comme par exemple le monoxyde de carbone (CO), le cyanure (CN) ou une flavine. Les termes peptide, polypeptide, enzyme, sous-unité ou protéine sont tous inclus dans la définition du polypeptide et ces termes peuvent être interchangeables. La définition de « polypeptide » ne tient pas compte de la longueur dudit polypeptide ni de la façon dont ledit polypeptide est produit.
Par le terme « polypeptide recombinant » ou « polypeptide hétérologue », il est entendu, au sens de la présente invention, un polypeptide qui n’est pas naturellement présent dans l’environnement et/ou qui n’est pas présent naturellement dans la cellule hôte utilisée pour sa production, en particulier dans une cellule hôte, et dont la production est réalisée par des techniques recombinantes, par exemple par ajout de matériel génétique dans une cellule hôte.
Par les termes « polypeptide monomérique », il est entendu, au sens de la présente invention, une chaîne unique composée d’un minimum de deux acides aminés liés entre eux par un lien peptidique entre le groupement carboxylique d’un acide aminé et le groupement amine de l’acide aminé suivant. Par opposition au terme « polypeptide », le terme « polypeptide monomérique » inclut seulement les molécules qui ne contiennent qu’un polypeptide, c’est-à-dire sans interaction avec d’autre polypeptide. Par exemple, il ne s’agit en aucun cas d’un multimère (par exemple un dimère, un trimère, un quadrimère, un pentamère, ...). Un polypeptide monomérique peut aussi contenir des ligands non-protéiques, comme par exemple le fer inorganique (Fe), le nickel (Ni), les centres fer-soufre (FeS), ou autre ligand organique comme par exemple le monoxyde de carbone (CO), le cyanure (CN) ou une flavine. La définition de « polypeptide monomérique » ne tient pas compte de la longueur dudit polypeptide ni de la façon dont ledit polypeptide est produit.
Par les termes « polypeptide monomérique recombinant » ou « polypeptide monomérique hétérologue », il est entendu, au sens de la présente invention, que le polypeptide monomérique n’est pas naturellement présent dans l’environnement, en particulier dans une cellule hôte, et dont la production est réalisée par des techniques recombinante, par exemple par ajout de matériel génétique dans une cellule hôte.
Par les termes « polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase », il est entendu, au sens de la présente invention, que le polypeptide monomérique est apte à catalyser la réaction réversible H2 <® 2H+ + 2e . Cette définition de l’activité hydrogénase n’est pas liée aux conditions expérimentales mais seulement à la production ou la consommation d’hydrogène par l’intermédiaire de l’activité enzymatique de l’hydrogénase.
Par les termes « site actif », il est entendu, au sens de la présente invention, la partie du polypeptide qui, lorsque la structure tertiaire est formée, est responsable de l’activité catalytique dudit polypeptide, par exemple de l’activité hydrogénase. La partie du polypeptide peut comprendre, par exemple, plusieurs portions de la séquence en acides aminés et/ou la liaison avec un ou plusieurs ligands non-protéiques.
Par le terme « polynucléotide », il est entendu, au sens de la présente invention, une chaîne unique composée d’un minimum de deux nucléotides liés entre eux, par exemple par un lien covalent, peu importe qu’il s’agisse de ribonucléotides ou de désoxynucléotides. Cela inclut donc les ARN et les ADN, simple brin ou double brin. La définition de « polynucléotide » ne tient pas compte de la longueur dudit polynucléotide, ni de la fonction, ni de la forme, ni de la façon dont ledit polynucléotide est produit. Un polynucléotide peut être, par exemple, un plasmide, une partie d’un plasmide, un gène ou un fragment de gêne.
Par les termes « polynucléotide exogène », il est entendu, au sens de la présente invention, un polynucléotide qui n’est pas normalement présent dans la cellule hôte. Par exemple, le polynucléotide exogène peut être une séquence codante pour un polypeptide qui n’est pas naturellement présent dans la cellule hôte ou un plasmide.
Par le terme « concaténaire », il est entendu, au sens de la présente invention, un enchaînement de plusieurs séquences afin de n’en former qu’une seule, par exemple de séquences polynucléotidiques ou de séquences polypeptidiques.
Par le terme « plasmide », il est entendu, au sens de la présente invention, une molécule d’ADN double brins distinct de l’ADN chromosomique, exogène, capable de réplication autonome, grâce à sa propre origine de réplication. Le plasmide peut comporter également d’autres séquences d’intérêts, comme par exemple un gène codant pour un facteur de sélection (résistance à un antibiotique, etc), un site de clonage multiple permet l’ajout de polynucléotide, et/ou des séquences de régulation de la transcription. Les termes « plasmide » ou « vecteur d’expression » sont interchangeables.
Par le terme « cellule hôte », il est entendu, au sens de la présente invention, une cellule qui a subi une modification. Cette modification peut par exemple être l’introduction d’un polynucléotide exogène dans la cellule, par exemple par l’intermédiaire d’un plasmide.
Par les termes « facteur de maturation », il est entendu, au sens de la présente invention, toute molécule, biologique, ou non, qui participe à la formation de la structure d’une autre molécule biologique, par exemple d’une protéine.
Par les termes « facteur de maturation endogène », il est entendu, au sens de la présente invention, toute molécule, biologique, ou non, qui participe à la formation de la structure d’une autre molécule biologique, par exemple d’une protéine, et qui est naturellement présent dans la cellule hôte, c’est-à-dire sans modification génétique de ladite cellule hôte.
Par les termes « facteur de maturation exogène », il est entendu, au sens de la présente invention, toute molécule, biologique, ou non, qui participe à la formation de la structure d’une autre molécule biologique, par exemple d’une protéine, et qui n’est pas naturellement présent dans la cellule hôte, c’est-à-dire qu’une modification génétique de ladite cellule hôte est nécessaire pour y ajouter ledit facteur de maturation exogène, par exemple par ajout d’un vecteur d’expression.
Par le terme « isolé », il est entendu, au sens de la présente invention, toute molécule qui a été retirée de son environnement naturel, par exemple qui a été retirée d’une [NiFej-hydrogénase naturelle.
Par le terme « purifié », il est entendu au sens de la présente invention, toute molécule qui a été esseulée par l’intermédiaire de techniques biochimiques. Cette définition ne tient pas compte de la façon dont est produite la molécule, par exemple de manière naturel ou par recombinaison, synthétisée chimiquement ou enzymatiquement, ni des techniques biochimiques mises en œuvre pour la purification, comme par exemple une chromatographie d’affinité ou un tamis moléculaire. Par exemple, un polynucléotide, un polypeptide ou IΉ2 peuvent être purifiés. De manière préférentielle, une substance est purifiée lorsqu’elle représente au minimum 60% par rapport aux autres composants qui lui sont associés, préférentiellement 75% par rapport aux autres composants qui lui sont associés, préférentiellement 90% par rapport aux autres composants qui lui sont associés.
Par le terme « homogénéité apparente », il est entendu, au sens de la présente invention, toute molécule purifiée représentant minimum 90% par rapport aux autres composants qui lui sont associés.
Par le terme « identité », il est entendu, au sein de la présente invention, une similarité structurelle entre deux polynucléotides ou deux polypeptides. La similarité structurelle est déterminée par un alignement entre les deux séquences, alignement qui optimise le nombre de nucléotides identiques ou le nombre d’acides aminés identiques le long de la séquence. Les trous dans une ou les deux séquences sont permis afin d’optimiser l’alignement et donc la similarité structurelle. Les séquences des nucléotides ou des acides aminés doivent cependant rester les mêmes.
Par les termes « matériel génétique », il est entendu, au sens de la présente invention, le génome d’une entité et plus précisément l’ensemble des acides nucléiques de cette entité, séquences codantes et non-codantes comprises.
Par les termes « mutation génétique », il est entendu, au sens de la présente invention, une modification accidentelle ou provoquée du matériel génétique d’une entité, par exemple d’une cellule hôte ou d’un vecteur d’expression.
Par les termes « entité comprenant un matériel génétique », il est entendu, au sens de la présente invention, une entité qui comprend du matériel génétique selon la définition reprise ci-dessus, par exemple une cellule hôte ou un vecteur d’expression tel qu’un plasmide.
Par les termes « entité génétiquement modifiée », il est entendu, au sens de la présente invention, une entité comprenant du matériel génétique selon la définition reprise ci-dessus et qui a subi une modification de son matériel génétique, par exemple une mutation génétique ou l’introduction d’un polynucléotide exogène dans la cellule, comme par exemple par l’intermédiaire d’un plasmide.
Par les termes « cellule hôte génétiquement modifiée », il est entendu, au sens de la présente invention, une cellule hôte selon la définition reprise ci- dessus et qui a subi une modification de son matériel génétique, par exemple une mutation génétique ou l’introduction d’un polynucléotide exogène dans la cellule, comme par exemple par l’intermédiaire d’un plasmide.
Par les termes « vecteur d’expression génétiquement modifié », il est entendu, au sens de la présente invention, un vecteur d’expression ou un plasmide selon la définition reprise ci-dessus et qui a subi une modification de son matériel génétique, par exemple l’ajout d’une séquence d’intérêts, comme par exemple un gène codant pour un polypeptide particulier.
D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention ressortiront des exemples donnés ci-après, à titre non limitatif et en faisant référence aux figures annexées.
La figure 1 illustre la carte du plasmide pET-26b(+) (5360pb).
La figure 2 illustre l’analyse par gel d’agarose de la digestion du vecteur d’expression pET26b(+) + HoxH par les enzymes de restrictions Ndel et Blpl.
La figure 3 illustre la carte du plasmide pACYCDuet-1 (4008pb).
La figure 4 illustre l’analyse par gel d’agarose de la digestion du vecteur d’expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW par les enzymes de restrictions Ncol et Hindi II.
La figure 5 illustre l’analyse par gel d’agarose de la digestion du vecteur d’expression pET26b(+) + HoxH, issus de l’ADN plasmidique d’une colonie d’E. coli, par les enzymes de restrictions Ndel et Blpl.
La figure 6 illustre l’analyse par gel d’agarose de la digestion du vecteur d’expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW, issus de l’ADN plasmidique d’une colonie d’E. coli, par les enzymes de restrictions Ncol et Hindlll.
La figure 7 illustre la méthode de purification de la protéine recombinante d’intérêt HoxH. NA, échantillon non-absorbé sur la colonne d’affinité Ni-NTA. Lavage, échantillon élué avec le tampon de lavage contenant 10mM en Imidazole. 50mM, échantillon élué à une concentration de 50mM en imidazole. 100mM, échantillon élué à une concentration de 100mM en imidazole. 150mM, échantillon élué à une concentration de 150mM en imidazole. 200mM, échantillon élué à une concentration de 200mM en imidazole. 250mM, échantillon élué à une concentration de 250mM en imidazole.
La figure 8 illustre l’analyse par SDS-PAGE de la composition protéique de diverses fractions récoltées lors de la chromatographie d’affinité. Charge, surnageant appliqué sur la colonne d’affinité Ni-NTA et issus de la lyse des cellules de E. coli recombinante ; NA, échantillon non-absorbé sur la colonne d’affinité Ni-NTA. Lavage, échantillon élué avec le tampon de lavage contenant 10mM en Imidazole. M, marqueur de poids moléculaire. 50mM, échantillon élué à une concentration de 50mM en imidazole. 100mM, échantillon élué à une concentration de 10OmM en imidazole. 150mM, échantillon élué à une concentration de 150mM en imidazole. 200mM, échantillon élué à une concentration de 200mM en imidazole. 250mM, échantillon élué à une concentration de 250mM en imidazole.
La figure 9 illustre l’analyse par immuno-détection (Western blot) de la présence de HoxH dans diverses fractions récoltées lors de la chromatographie d’affinité. M, marqueur de poids moléculaire. Charge, surnageant appliqué sur la colonne d’affinité Ni-NTA et issus de la lyse des cellules de E. coli recombinante. NA, échantillon non-absorbé sur la colonne d’affinité Ni-NTA ; 50mM, échantillon élué à une concentration de 50mM en imidazole. 200mM, échantillon élué à une concentration de 200mM en imidazole.
La figure 10 est une représentation schématique de la structure de HoxEFUYH, la [NiFe]-hydrogénase de Synéchocystis sp. PCC 6803. HoxE, 19KDa et 1 centre FeS ; HoxF, 57.5KDa, 2 centres FeS et un centre FMN ; HoxU, 26KDa et 4 centres FeS ; HoxY, 20KDa et un centre FeS ; HoxH, 53KDa et le site actif.
La figure 11 est une représentation schématique (flèche grisée) du transfert d’électrons et des interactions attendues avec le NADPH et le methyl- viologène (MV) chez HoxEFUYH, la [NiFe]-hydrogénase de Synéchocystis sp. PCC 6803.
La figure 12 est une représentation schématique où le point d’interrogation pose la question de savoir si le site actif de la protéine recombinante HoxH peut accepter ou non les électrons directement du MV et donc produire de l’hydrogène en l’absence de relais redox additionnels.
La figure 13 illustre la mise en évidence de l’activité hydrogénase par la production d’hydrogène qui résulte de l’ajout de la protéine recombinante HoxH à un réactif contenant du methyl-viologène préalablement réduit par du dithionite de sodium en absence d’oxygène. HoxH est capable de prendre les électrons du méthyl-viologène préalablement réduit pour les combiner avec des protons (présents dans le tampon) afin de produire de l’hydrogène selon l’équation H2 <® 2H+ + 2e qui représente la réaction catalysée par l’hydrogénase. Le niveau d’hydrogène dissout dans le réactif est mesuré en continu à l’aide d’un micro-senseur (Unisense®, Danemark). La flèche montre le moment où l’ajout de la protéine recombinante HoxH est réalisé, moment concomitant avec l’augmentation du niveau d’hydrogène dissout détecté par le micro-senseur.
La figure 14 illustre la mise en évidence de l’activité hydrogénase par la réduction du benzyl viologène qui résulte de l’ajout de la protéine recombinante HoxH à un réactif contenant du benzyl viologène (BV) en présence d’H2. HoxH est capable de prendre les électrons de l’hydrogène pour les transférer à un médiateur redox, par exemple le benzyl viologène, en même temps que la production de protons selon l’équation H2 <® 2H+ + 2e qui représente la réaction catalysée par l’hydrogénase. Le niveau d’hydrogène consommé est équivalent au niveau de benzyl viologène réduit, niveau que l’on peut mesurer en continu par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 578nm.
La figure 15 illustre la mise en évidence de l’activité hydrogénase par la production d’hydrogène qui résulte de l’ajout de la protéine recombinante HoxH, produite en l’absence des facteurs de maturation HupABCDEFHoxW exogènes à E. coli, à un réactif contenant du methyl-viologène préalablement réduit par du dithionite de sodium en absence d’oxygène. HoxH est capable de prendre les électrons du méthyl-viologène préalablement réduit pour les combiner avec des protons (présents dans le tampon) afin de produire de l’hydrogène selon l’équation H2 <® 2H+ + 2e qui représente la réaction catalysée par l’hydrogénase. Exemples
1. Construction d’un vecteur d’expression de HoxH 1.1. Séquence « simple » de HoxH
HoxH correspond à la grande sous-unité comprenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA18091.1. Le point isoélectrique théorique de HoxH est de 5,86 pour une masse moléculaire théorique de 52996.53 Daltons. La séquence en nucléotides (1425bp) de HoxH est la suivante et est nommée SEQ ID NO:1 dans le cadre de la présente invention : atgtctaaaaccattgttatcgatcccgttacccggattgaaggccatgccaaaatctccattttcctcaacgaccagg gcaacgtagatgatgttcgtttccatgtggtggagtatcggggttttgaaaaattttgcgaaggtcgtcccatgtggga aatggctggtattaccgcccgtatttgcggcatttgtccggttagccatctgctctgtgcggctaaaaccggggataag ttactggcggtgcaaatccctccagccggggaaaaactgcgccgtttaatgaatttagggcaaattacccaatccc acgccctaagttttttccatctcagcagtcctgattttctgcttggttgggacagtgatcccgctactcgcaatgtgtttggt ttaattgctgctgaccccgatttagctagggcaggtattcggttacggcaatttggccaaacggtaattgaacttttggg agctaaaaaaatccactctgcttggtcagtgcccggtggagtccgatcgccgttgtcggaagaaggcagacaatg gattgtggaccgtttaccagaagcaaaagaaaccgtttatttagccttaaatttgtttaaaaatatgttggaccgcttcc aaacagaagtggcagaatttggcaaatttccctccctatttatgggcttagttgggaaaaataatgaatgggaacatt atggcggctccctgcggtttaccgacagtgaaggcaatattgtcgcggacaatctcagtgaagataattacgctgat tttattggtgaatcggtggaaaaatggtcctatttaaaatttccctactacaaatctctgggttatcccgatggcatttatc gggttggtccccttgcccgccttaatgtttgtcatcacattggcaccccggaagcagaccaagaattagaagaatat cggcaacgggctggaggtgtggccacgtcctctttcttttatcattacgcccgcttggtggaaattcttgcctgtttagaa gccatcgaattgttaatggctgaccctgatattttgtccaaaaattgtcgagctaaggcagaaattaattgtaccgaag cggtgggagtgagcgaagcaccccggggtactttattccaccattacaagatagatgaagatggtctaattaagaa agtgaatttgatcattgccacgggcaacaataacttagccatgaataaaaccgtggcccaaattgccaaacactac attcgcaatcatgatgtgcaagaagggtttttaaaccgggtggaagcgggtattcgttgttatgatccctgccttagttgt tctacccatgcagcgggacaaatgccattgatgatcgatttagttaaccctcagggggaactaattaagtccatcca gcgggattaa
La séquence en acides aminés (474 aa) de HoxH est la suivante et est nommée SEQ ID NO:2 dans le cadre de la présente invention : MSKTIVIDPVTRIEGHAKISIFLNDQGNVDDVRFHVVEYRGFEKFCEGRPMWEMA GITARICGICPVSHLLCAAKTGDKLLAVQIPPAGEKLRRLMNLGQITQSHALSFFHL SSPDFLLGWDSDPATRNVFGLIAADPDLARAGIRLRQFGQTVIELLGAKKIHSAWS VPGGVRSPLSEEGRQWIVDRLPEAKETVYLALNLFKNMLDRFQTEVAEFGKFPSL FMGLVGKNNEWEHYGGSLRFTDSEGNIVADNLSEDNYADFIGESVEKWSYLKFP YYKSLGYPDGIYRVGPLARLNVCHHIGTPEADQELEEYRQRAGGVATSSFFYHYA RLVEILACLEAIELLMADPDILSKNCRAKAEINCTEAVGVSEAPRGTLFHHYKIDED GLIKKVNLIIATGNNNLAMNKTVAQIAKHYIRNHDVQEGFLNRVEAGIRCYDPCLSC STHAAGQMPLMIDLVNPQGELIKSIQRD
La figure 1 représente la carte du plasmide pET26b(+) utilisé pour construire le vecteur d’expression de FloxFI par insertion de SEQ ID NO:3 dans pET26b(+). pET26b(+) est un plasmide de 5360pb possédant une origine de réplication pour E. coli, un gène de résistance à la kanamycine, un site de clonage multiple (MCS) contenant de nombreux sites de restriction, le promoteur 77 et le terminateur de transcription T7. Il contient également le gène lad codant pour un répresseur de transcription. Cette répression de la transcription peut être levée par ajout d’IPTG.
1.2. Séquence « optimisée » de HoxH
Optionnellement, selon un mode de réalisation suivant l’invention, les séquences SEQ ID NO:1 et SEQ ID NO:2 sont optimisées pour l’usage des codons chez E. coli. En particulier, les sites de restriction Ndel ( catatg ) et Blpl ( gctnagc ) sont ajoutés respectivement en début et en fin de la séquence de nucléotides pour le clonage dans le plasmide pET26b(+) et la séquence caccaccaccaccatcac (soulignée ci-dessous) est également ajoutée (séquence codant pour l’étiquette poly-histidines proche de l’extrémité N-terminal de la protéine). La séquence de nucléotides optimisée (1453bp) est la suivante et est nommée SEQ ID NO:3 dans le cadre de la présente invention : cafafqaqccaccaccaccaccatcacaaaaccatcqtcatcqacccaqtcacccqcatcqaaqqccacqcca aaattagcatttttctgaacgaccagggcaacgtcgacgacgtccgctttcacgttgttgaataccgtggcttcgaaa aattttgtgaaggtcgtccgatgtgggaaatggccggtatcacggcacgtatttgtggaatttgtccggtgagccatct gctgtgtgccgcaaaaaccggagataaactgctggcagtgcagattccgccggcaggtgaaaaactgcgtcgtct gatgaatctgggtcagattacacagtcgcatgcactgtctttctttcatctgagtagcccagattttctgctggggtggg atagcgacccggcaacacgtaatgtgtttggtctgattgcggctgatccggatctggcgcgtgccggtattcgtctgc gtcagtttggtcagacagttattgagctgctgggggcgaaaaagattcatagtgcatggtctgtgccgggtggtgttc gtagtccgctgagtgaagaaggtcgtcagtggattgttgatcgtctgccggaggcaaaagaaacggtctatctggc actgaatctgtttaaaaatatgctggatcgtttccagacagaagttgcagaatttggaaaatttccgtcactgtttatgg gtctggttggtaaaaataatgaatgggaacactatggtggtagcctgcgtttcacggactctgaaggtaatattgttgc ggataatctgagcgaagacaattatgcagattttatcggtgaaagtgtggaaaaatggagctatctgaaatttccgta ttacaaaagcctgggctatccggatgggatctaccgtgttggaccgctggcacgtctgaacgtttgtcatcatattggt accccggaagcagatcaggaactggaagaatatcgtcagcgtgcgggtggtgttgcgactagcagctttttttatca ttatgcacgtctggttgaaattctggcctgtctggaggcaattgaactgctgatggcagatcctgatattctgtctaaaa attgtcgtgcaaaagcagaaattaactgtaccgaggcagttggtgttagtgaggcgccgcgtggtaccctgtttcatc actataaaattgacgaagatggtctgattaaaaaggttaatctgattatcgcaaccggtaacaataatctggcaatg aataaaaccgttgcacagattgcaaaacactacattcgcaaccacgatgttcaggaagggtttctgaatcgtgtag aagccggcattcgctgttatgatccgtgtctgagctgtagcacccatgcagcaggtcagatgcctctgatgattgacc tggttaatccgcagggtgagctgattaaaagcattcagcgtgattaagcigagc
La séquence en acides aminés (480 aa) optimisée est la suivante et est nommée SEQ ID N0:4 dans le cadre de la présente invention :
MSHHHHHHKTIVIDPVTRIEGHAKISIFLNDQGNVDDVRFHVVEYRGFEKFCEGRP MWEMAGITARICGICPVSHLLCAAKTGDKLLAVQIPPAGEKLRRLMNLGQITQSHA LSFFHLSSPDFLLGWDSDPATRNVFGLIAADPDLARAGIRLRQFGQTVIELLGAKKI HSAWSVPGGVRSPLSEEGRQWIVDRLPEAKETVYLALNLFKNMLDRFQTEVAEF GKFPSLFMGLVGKNNEWEHYGGSLRFTDSEGNIVADNLSEDNYADFIGESVEKW SYLKFPYYKSLGYPDGIYRVGPLARLNVCHHIGTPEADQELEEYRQRAGGVATSS FFYHYARLVEILACLEAIELLMADPDILSKNCRAKAEINCTEAVGVSEAPRGTLFHH YKIDEDGLIKKVNLIIATGNNNLAMNKTVAQIAKHYIRNHDVQEGFLNRVEAGIRCY DPCLSCSTHAAGQMPLMIDLVNPQGELIKSIQRD
Le plasmide pET26b(+) est utilisé pour construire le vecteur d’expression de HoxH par insertion de SEQ ID NO:3 dans pET26b(+).
La figure 2 montre l’analyse de la digestion du vecteur d’expression pET26b(+) + HoxH (SEQ ID NO:3) par les enzymes de restrictions Ndel et Blpl. Deux fragments d’ADN à environ 5300pb (pET26b(+) linéarisé) et à environ 1500pb (séquence HoxH excisé du plasmide pET26b(+)) sont mis en évidence. Ceci confirme la présence de la séquence HoxH d’intérêt dans le vecteur d’expression pET26b(+).
2. Construction du vecteur d’expression d’au moins un facteur de maturation
Au moins les facteurs de maturation suivants sont considérés dans le cadre de la présente invention : HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW.
HypA est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogenase FloxEFUYFI chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA18357.1. Le point isoélectrique théorique de HypA est de 4,94 pour une masse moléculaire théorique : 12773,47 Daltons. La séquence en nucléotides (342bp) de HypA est la suivante et est nommée SEQ ID NO:5 dans le cadre de la présente invention : atgcacgaagttagtctgatggagcaaactttggcgatcgccattgcccaggcggaagaccatggagccagcca aatccatcgtttaaccctgcgggtggggcaacagtctggggtggtggccgatgccctacggtttgcgtttgaagtggt gcgacaaaataccatggccgccgaggcgagattggaaattgaagaaattcccgttacctgtcgttgccaacactg ccacgaaaattttcagccagaggattggatttaccgctgtccccactgcgaccagattagccaaacagtaatggat ggcaaacagttggaactagcatccctagaactgagttga
La séquence en acides aminés (113 aa) de HypA est la suivante et est nommée SEQ ID NO:6 dans le cadre de la présente invention :
MHEVSLMEQTLAIAIAQAEDHGASQIHRLTLRVGQQSGVVADALRFAFEVVRQNT
MAAEARLEIEEIPVTCRCQHCHENFQPEDWIYRCPHCDQISQTVMDGKQLELASL
ELS
HypB est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogènase HoxEFUYH chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA18312.1. Le point isoélectrique théorique de HyB est de 5,75 pour une masse moléculaire théorique : 31242,97 Daltons. La séquence en nucléotides (858bp) de HypB est la suivante et est nommée SEQ ID NO:7 dans le cadre de la présente invention : atgtgccaaaactgcggttgtagtgcggtgggaaccgttgcccatagccaccatcaccatggcgatggaaattttgc ccacagccatgatgaccatgaccagcaagaacatcatcaccaccatggcaactacagcaaaagtccaagtcag cagactgtgaccattgaacccgatcgccagtccattgccattggccaaggcattctcagcaagaatgaccgcctag cggaaaggaatcggggctatttccaggctaagggcttactggtgatgaatttcctctcttctcccggagccggtaaaa ctgctctgatcgaaaaaatggtcggcgatcgacaaaaagaccatcccaccgccgtcattgtgggggatttagcca ccgataacgatgcccaacgtctccgcagtgccggggcgatcgccattcaggtcaccacaggaaatatttgccatct ggaagcggaaatggtggccaaggcggcccaaaagttagatttagacaatatcgatcaattgatcattgaaaatgtt ggtaatttggtttgccccaccacctatgatctaggggaagatttacgggtcgtattattttccgtcacagaaggggagg ataaaccccttaaatatcccgccaccttcaaatcagcccaggttattttagtcaccaaacaggacattgccgccgca gtggattttgatgcagagctggcttggcaaaacctacggcaagtggccccccaagcccaaatttttgcagtgtctgc ccgcacggggaaaggattgcagtcctggtatgagtatttggatcaatggcaactccaacactattcgccgttggttg atccagcattggcctaa
La séquence en acides aminés (285 aa) de HypB est la suivante et est nommée SEQ ID N0:8 dans le cadre de la présente invention :
MCQNCGCSAVGTVAHSHHHHGDGNFAHSHDDHDQQEHHHHHGNYSKSPSQQ TVTIEPDRQSIAIGQGILSKNDRLAERNRGYFQAKGLLVMNFLSSPGAGKTALIEK MVGDRQKDHPTAVIVGDLATDNDAQRLRSAGAIAIQVTTGNICHLEAEMVAKAAQ KLDLDNIDQLIIENVGNLVCPTTYDLGEDLRVVLFSVTEGEDKPLKYPATFKSAQVI LVTKQDIAAAVDFDAELAWQNLRQVAPQAQIFAVSARTGKGLQSWYEYLDQWQL QHYSPLVDPALA
FlypC est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogenase FloxEFUYFI chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA18180.1. Le point isoélectrique théorique de HypC est de 4,20 pour une masse moléculaire théorique : 7987,42 Daltons. La séquence en nucléotides (231 bp) de HypC est la suivante et est nommée SEQ ID NO:9 dans le cadre de la présente invention : atgtgtctagccctacctggccaggttgtcagtttaatgcccaactccgatcccctgttactgacgggaaaggttagct ttgggggcatcattaaaaccattagccttgcctacgtacccgaggttaaggtgggggattacgtgattgtccatgtgg gctttgccattagcattgtggacgaagaggcggcccaggaaactttgatagacttggcagaaatgggagtttaa La séquence en acides aminés (76 aa) de HypC est la suivante et est nommée SEQ ID NO:10 dans le cadre de la présente invention :
MCLALPGQVVSLMPNSDPLLLTGKVSFGGIIKTISLAYVPEVKVGDYVIVHVGFAISI
VDEEAAQETLIDLAEMGV
FlypD est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogènase FloxEFUYFI chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA16622.1. Le point isoélectrique théorique de HypD est de 6,31 pour une masse moléculaire théorique de 40632,94 Daltons. La séquence en nucléotides (1125bp) de HypD est la suivante et est nommée SEQ ID NO:11 dans le cadre de la présente invention : atgaaatacgttgatgaatatcgggatgcccaggcggtggcccattaccgtcaggcgatcgccagggagataacc aaaccttggacgctgatggagatttgcggcggccagacccacagcattgtcaaatatggcttggatgctttgttgccg aagaatttgactctgatccatggtcccggctgtcctgtgtgcgtcactccgatggaattaattgaccaggctttgtggtta gctaagcaaccggagatcattttttgttcctttggcgatatgttgcgggtgcccggcagtggggcggatttgctgagca ttaaagcccagggcggcgatgtgcgcattgtctattctcctttggattgtttggcgatcgccagggagaatcctaatcg ggaagtggtatttttcggagtaggttttgaaactacagcccctgccacggccatgactctccaccaagctagggccc agggaattagcaatttcagtttactttgcgcccatgtattggtgcccccggctatggaggctttattaggcaatcccaatt ccctcgtgcagggctttttggcggcagggcatgtctgtacggtgaccggggaaagggcctatcaacatatcgctga aaaataccaagtacccattgtcatcactggctttgaacctgtggatattatgcagggcatctttgcctgtgtgcgccaa ctggagtcgggacaattcacctgcaacaatcaatatcggcgatcggtccaaccccagggcaatgcccatgctcag aaaattattgaccaagtgtttgagccagtcgatcgccattggcggggtttgggattaattccggccagcggtttgggttt aaggccagcatttgccccctgggatgccgcagttaaattcgccaatttattgcaaaccatggccccaacgatggga gaaacagtgtgtattagcggggaaattttacagggacaacggaagcccagcgattgtccagcctttggtactatctg caccccagaacaacccttgggggctcccatggtttcctcggaaggagcctgtgccgcctattaccgttatcgccaac aattaccggaaccagtgggagcggccagagtttag
La séquence en acides aminés (374 aa) de HypD est la suivante et est nommée SEQ ID NO:12 dans le cadre de la présente invention : MKYVDEYRDAQAVAHYRQAIAREITKPWTLMEICGGQTHSIVKYGLDALLPKNLTL IHGPGCPVCVTPMELIDQALWLAKQPEIIFCSFGDMLRVPGSGADLLSIKAQGGDV RIVYSPLDCLAIARENPNREVVFFGVGFETTAPATAMTLHQARAQGISNFSLLCAH VLVPPAMEALLGNPNSLVQGFLAAGHVCTVTGERAYQHIAEKYQVPIVITGFEPVD IMQGIFACVRQLESGQFTCNNQYRRSVQPQGNAHAQKIIDQVFEPVDRHWRGLG LIPASGLGLRPAFAPWDAAVKFANLLQTMAPTMGETVCISGEILQGQRKPSDCPA FGTICTPEQPLGAPMVSSEGACAAYYRYRQQLPEPVGAARV
FlypE est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogènase FloxEFUYFI chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA17478.1. Le point isoélectrique théorique de HypE est de 4,93 pour une masse moléculaire théorique de 36425,60 Daltons. La séquence en nucléotides (1038bp) de HypE est la suivante et est nommée SEQ ID NO:13 dans le cadre de la présente invention : gtgaacttagtctgtcccgttccccttgatcgttatccccaggtactgttagcccacggcggcggcggtaagttgagcc aacaattacttaagcaaatttttttaccggcctttggcgcttctgaaacgggtagtcatgatgcggcggtttttactgcca accaaagttctttagctttcaccaccgactcctatgtgatcaatcccctcttttttcctgggggcgatattggttctttggca gtccacggcaccgttaatgacctagccatggccggcgcaacccctcgctatatcagcgttggttttatcctcgaaga aggattgcccatggagaccctctggcgggtggcccaatccctagggcaagcggcccaaaactgtggggtggaa attcttaccggtgataccaaagtggtggaccggggtaagggagacggcattttcatcaacaccagcggcattggtt ccctcgaccatcaacaaactatccatcccaatcaggtacaggtaggcgatcgcctaattttgagcggtgatttggga cgtcatggcatggccattatggcagtgcgccaaggattagaatttgaaaccaccattgaaagtgattcggccccggt tcacagagaagtgcaggcattattgtcggcagggatcccaatccattgtctgcgggatttaaccagggggggatta gccagtgcggttaatgaaattgcccaaacttccggggtaaccatggctttacgagaaacgttaatcccggtggagg ccgaagtacaagccgcctgtgaactgttgggttttgaccccctctatgtggccaatgagggaagattcctggccattg tgcccccggaagcagaacagaagaccgtggaaattttgcaaactttccatccccaagctacggcgatcggtaca gtaacaggcaaaagtgcacaaaccttggggttagtcagtttggaaagttccattggtgccccccggttgctagacat gatcagtggggagcaattaccccgtatttgttag
La séquence en acides aminés (345 aa) de HypE est la suivante et est nommée SEQ ID N0:14 dans le cadre de la présente invention : MNLVCPVPLDRYPQVLLAHGGGGKLSQQLLKQIFLPAFGASETGSHDAAVFTAN QSSLAFTTDSYVINPLFFPGGDIGSLAVHGTVNDLAMAGATPRYISVGFILEEGLP METLWRVAQSLGQAAQNCGVEILTGDTKVVDRGKGDGIFINTSGIGSLDHQQTIH PNQVQVGDRLILSGDLGRHGMAIMAVRQGLEFETTIESDSAPVHREVQALLSAGI PIHCLRDLTRGGLASAVNEIAQTSGVTMALRETLIPVEAEVQAACELLGFDPLYVA NEGRFLAIVPPEAEQKTVEILQTFHPQATAIGTVTGKSAQTLGLVSLESSIGAPRLL DMISGEQLPRIC
FlypF est une protéine d’expression/formation de la [NiFe]- hydrogènase FloxEFUYFI chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA10154.1. Le point isoélectrique théorique de FlypF est de 8,19 pour une masse moléculaire théorique de 85358,25 Daltons. La séquence en nucléotides (2304bp) de HypF est la suivante et est nommée SEQ ID NO:15 dans le cadre de la présente invention : atgttaaaaaccgttgccatacaggtccagggaagggtgcaaggagtgggttttcgtccctttgtttatacccttgccc aggaaatgggactgaatggttgggtgaataattccactcaaggagctaccgttgtcattaccgccgacgaaaagg cgatcgccgactttacggagagattaacgaagacattacctccccctggtttgattgaacaattagccgttgaacagt taccgctggaaagttttactaactttactatccgccccagtagtgatggccctaaaactgcgagtattttacccgatttat ccacttgttccgcctgcttaacagaactatttgaccctagcgatcgccgttatctttacccctttattaactgtacccattg cggtccccgctacaccattattgaagccctaccttacgaccgttgtcgtaccaccatggctaggtttcgccaatgtacc gactgtgaaagggaatataagcaaccaggcgatagacgcttccatgcccaacctaatgcctgtcctcgctgtggc ccccaactggctttttggaaccgacaaggccaagtaattgcagaagcaaatgaagctttaaactttgctgtagataa tttaaaagtcggcaatattatcgctattaaaggcttaggtggcttccatttgtgttgtgatgccactgattttgaagctgtg gaaaaattaagattaaggaaacatcgaccggataaacctttggcggtaatgtatggtaatcttggtcaaattgtgga gcattaccaacctaataatctagaagttgaattgttacaaagtgccgccgcccctattgtgttattaaacaaaaaaaa acaattaattttggtggaaaatattgccccaggcaacccccgagtcggcgtaatgttagcctatactcctttgcatcac ttattactaaaaaaattaaagaaacccatggtagctaccagtggtaacttagctggggagcaaatttgcattgataat attgacgctttaacccggttacaaaatattgctgacggttttctcgttcatgatcgcccgattgtttgtccagtggatgattc cgttgtccaaatagtagctgggaagccattatttttgcgtcgagcccggggttacgctcctcaacccattactttacca aagcctactcaaaaaaaactattggcgatgggaggtcattataaaaatacagtggcgatcgccaaacaaaatca agcttacgtcagccaacatttgggcgatttgaattctgctcccacctaccaaaattttgaagaagccattgcccattta agccagctatacgatttctctccccaggaaattgttgcagatttacaccctgattatttcagtcatcaatatgctgaaaa ccaagctttgcctgtcacttttgtgcagcatcactatgctcatattttagcggttatggcggaacatggagttatggagg agtccgtgttaggtattgcttgggatggcactggctacggcatggacggtactatttgggggggagaatttttaaaaat cacccaaggtacttggcagagaattgctcatctacaaccatttcatttattaggtaatcaacaagccattaaatatccc catcggattgctttggcgttgttatggcccacttttggtgatgatttttctgctgattctttaggaaattggttgaatttcaata atgggtttaaaaacaagataaacagcaggttaaatcaggatctaaacaacaaaaatttacgtcaactttggcaac gagggcaagcaccgctcacttcgagtatgggaagattatttgacggtattgcgacactgataggattgattaacgaa gtaacttttgaaggtcaggcggccatagctctggaagctcagattatgccaaatttaactgaggagtattatcctttga ctctaaacaacaaggaaaaaaaattagctgttgattggcgccccttaattaaagctataaccacagaagatagaa gcaaaactaacctaatagccactaaattccacaacagtttagtaaatttaattatcactattgcccaacagcaggga atcgaaaaagttgctctggggggaggttgctttcaaaattgttatttgcttgccagtaccattactgccctcaaaaaag ctggtttttctcctttgtggcccagagaactaccgcccaacgacggtgccatttgcatgggtcaactgttagctaaaatt caggctcggcaatatatctgttaa
La séquence en acides aminés (767 aa) de HypF est la suivante et est nommée SEQ ID NO:16 dans le cadre de la présente invention : mlktvaiqvqgrvqgvgfrpfvytlaqemglngwvnnstqgatvvitadekaiadfterltktlpppglieqlaveqlpl esftnftirpssdgpktasilpdlstcsacltelfdpsdrrylypfincthcgprytiiealpydrcrttmarfrqctdcereyk qpgdrrfhaqpnacprcgpqlafwnrqgqviaeanealnfavdnlkvgniiaikglggfhlccdatdfeaveklrlrkh rpdkplavmygnlgqivehyqpnnlevellqsaaapivllnkkkqlilveniapgnprvgvmlaytplhhlllkklkkp mvatsgnlageqicidnidaltrlqniadgflvhdrpivcpvddsvvqivagkplflrrargyapqpitlpkptqkkllam gghykntvaiakqnqayvsqhlgdlnsaptyqnfeeaiahlsqlydfspqeivadlhpdyfshqyaenqalpvtfv qhhyahilavmaehgvmeesvlgiawdgtgygmdgtiwggeflkitqgtwqriahlqpfhllgnqqaikyphrial allwptfgddfsadslgnwlnfnngfknkinsrlnqdlnnknlrqlwqrgqapltssmgrlfdgiatliglinevtfegqa aialeaqimpnlteeyypltlnnkekklavdwrplikaittedrsktnliatkfhnslvnliitiaqqqgiekvalgggcfqn cyllastitalkkagfsplwprelppndgaicmgqllakiqarqyic
HoxW est une protéine hypothétique chez Synéchocystis sp. PCC6803. Le numéro d’accession de la protéine dans Genbank est BAA17680.1. Le point isoélectrique théorique de HoxW est de 4,93 pour une masse moléculaire théorique de 17129,53 Daltons. La séquence en nucléotides (474bp) de HoxW est la suivante et est nommée SEQ ID NO:17 dans le cadre de la présente invention : atgccaggccaatccaccaagtccactttaatcatcggttacggcaataccctgcggggggacgacggcgtggg gcgttacctagcggaagaaattgctcagcaaaactggccccattgtggagttatttccacccatcaactcaccccag aattggccgaggcgatcgccgctgtggaccgggtaattttcattgatgcccaactgcaggaatcagcaaacgaac catcggtggaagttgtggccttaaaaaccctggaacccaacgaactgtcaggggatttggggcaccggggtaatc ccagggaactcttgaccctggctaaaattctctacggcgttgaggtaaaggcttggtgggtgttgattccggccttcac ctttgattatggagagaaattgtctcccctgaccgcccgggcccaagccgaagccttagcccagatccgccccttg gtattgggggagagataa La séquence en acides aminés (157 aa) de HoxW est la suivante et est nommée SEQ ID N0:18 dans le cadre de la présente invention :
MPGQSTKSTLIIGYGNTLRGDDGVGRYLAEEIAQQNWPHCGVISTHQLTPELAEAI AAVDRVIFIDAQLQESANEPSVEVVALKTLEPNELSGDLGHRGNPRELLTLAKILY GVEVKAWWVLIPAFTFDYGEKLSPLTARAQAEALAQIRPLVLGER
Optionnellement, selon un mode de réalisation suivant l’invention, l’ensemble des facteurs de maturations FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF et FloxW sont assemblés sous forme d’une séquence nucléotidique concaténaire (6515bp). Cette séquence nucléotidique comporte le site de restriction Ncol ( CCATGG ) en début de séquence et le site de restriction Avril ( CCTAGG ) en fin de séquence pour réaliser le clonage dans le plasmide pACYCDuet-1 . Cette séquence nucléotidique concaténaire est la suivante et est nommée SEQ ID NO:19 dans le cadre de la présente invention : ccaiggcccacgaagttagcctgatggaacagacgctggccattgccattgcgcaggcggaagaccacggggc gagccaaattcaccgtttaacgctgcgcgttgggcagcagtcgggtgttgttgcagatgcattacgctttgcatttgaa gttgttcgccagaacacaatggctgcagaagcacgtctggaaatcgaggaaattccggttacctgtcgttgtcagca ttgtcatgaaaattttcagccggaggattggatatatagatgtccccattgtgaccagattagtcaaaccgttatggac ggcaaacagctggagttagcaagcctggaactgagctaagcatggaaaggaggtcgttattatgtgccagaactg tgggtgtagcgcggttgggaccgttgcgcatagccaccatcaccacggggatggcaactttgcgcatagccatga cgaccacgaccagcaggagcaccaccaccaccacggtaactattcaaaatcaccatcacagcagaccgtaac catagaaccagacagacaaagcatagcaattggccaaggaattctgagcaaaaacgatcgtctggcagaacg caaccgcggctacttccaggccaaaggtctgttagtaatgaatttcctgagcagcccgggagcaggcaaaaccg cactgatcgaaaaaatggttggtgatcgtcagaaagatcatccgaccgcagttattgttggtgatctggcaaccgat aatgatgcacagcgtctgcgtagcgcaggtgcaattgcaattcaggttaccaccggtaatatttgtcatctggaagc agaaatggttgcaaaagcagcacagaaactggatctggataatattgatcagctgattattgaaaatgttggtaatct ggtttgtccgaccacctatgatctgggtgaagatctgcgtgttgttctgtttagcgttaccgaaggtgaagataaaccg ctgaaatatccggcaacctttaaaagcgcacaggttattctggttaccaaacaggatattgcagcagcagttgatttt gatgcagaactggcatggcagaatctgcgtcaggttgcaccgcaggcacagatttttgcagttagcgcacgtaccg gtaaaggtctgcagagctggtatgaatatctggatcagtggcagctgcagcattatagcccgctggttgatccggca ctggcataagagttgaaaggaggtttcctccatgtgcctggcgttaccggggcaggttgtttcgttaatgccgaactc ggatccgctgttattaaccgggaaagttagctttggtggtattattaaaaccattagcctggcgtatgttccggaagtta aagttggcgattatgttattgttcatgttggttttgctatcagtattgttgatgaagaagcagcacaggagacactgattg atctggccgagatgggcgtttaattcctaaaaggaggttttagccatgaagtacgttgacgaataccgcgacgcgc aggcagttgcccactaccgccaggccattgcccgtgaaattaccaaaccgtggacgctgatggaaatttgtgggg gccagacccatagcatcgttaaatatggtctggatgcattattaccgaaaaacttaaccttaatccacggtccgggtt gtccggtttgtgttacgccgatggaactgattgatcaggcattatggctggcaaaacagccggagattattttttgtagc tttggtgatatgctgcgcgtgccgggtagtggtgcagatctgctgagcattaaagcacaggggggagacgttcgtat agtttattctccgttagattgtctggcgattgcgcgtgaaaatccgaatcgtgaagttgttttttttggtgtgggttttgaaac taccgccccggcaaccgcaatgacactgcatcaggcacgggcccagggtattagcaattttagcttattatgtgcac acgtgttagttccgccggcgatggaagctctgctgggtaacccgaatagcctggttcaagggtttttagcagcaggtc atgtttgtacggttaccggtgagcgggcgtatcagcatattgcagagaaatatcaggttccgatagttattaccggtttt gaaccggttgatattatgcagggtatttttgcatgtgttcgtcagctggagagcgggcagtttacatgtaataatcagta ccggcggtcggttcagccgcagggtaacgcacatgcccagaaaattattgaccaggtttttgaaccggtggatcgt cattggcgtggattaggtcttattccggcctcaggtttaggtttacgtccggcatttgcaccgtgggacgcagcagttaa attcgcaaatctgttacagacaatggctccgacaatgggtgaaaccgtttgtatttctggcgaaattttacagggtcag cgcaaacctagtgattgtcctgcatttggtaccatctgcaccccggaacaaccgctgggcgcccctatggttagcag tgaaggcgcttgtgccgcctattatcgttatcgtcagcaattaccggaaccggttggtgccgcacgtgtttaattttgca aaggaggtcctgccaatgaacctggtgtgtccggtgccgctggaccgctacccgcaggttttactggcacacggg gggggggggaagctgagtcagcagctgttaaaacagatttttctgccggcgtttggtgcatcagaaaccggtagcc atgatgcagcagtttttaccgcaaatcagagcagcttagcatttacaacagattcctatgttatcaatccgctgttttttcc tggtggtgatattggtagtcttgcagttcatggaaccgttaatgatttagcaatggcaggtgcaacaccgcgttatatta gcgttgggtttattctggaggagggtttaccgatggagacactttggcgtgttgcacaaagcctgggtcaggcagca cagaattgtggagttgaaatattaacaggtgataccaaagttgttgatcgtgggaagggagatggtatttttattaata catcgggtatcggtagtttagatcaccagcaaaccattcatccgaatcaggttcaggttggtgatcgtctgattctgag tggggatttaggacggcatggtatggcaattatggcagttcgtcagggcctggaatttgaaacaaccattgaaagc gatagcgcaccggttcatcgtgaggttcaggctctgctgagcgcagggattccgattcactgtctgcgtgacttaaca cgtggtggtctggcaagcgccgtgaacgaaattgcacaaacctcaggtgttacaatggctctgcgtgaaaccttaat tccggttgaggcggaagttcaagccgcctgtgaactgctgggttttgatcctttatatgttgcgaacgaaggccgtttcc tggccattgttccgccggaagccgaacagaaaaccgttgaaattctgcagacctttcacccgcaggcgaccgcaa ttggtaccgttaccggcaagagtgcacagaccttaggtctggttagcctggagagtagcataggtgccccacgtctg ttagatatgattagcggagaacaactgccacgtatttgttaagactccaaaggaggctagattaatgctgaaaaccg ttgccattcaggttcaggggcgcgttcagggggttggttttcggccgtttgtttacaccttagcccaggaaatgggtctg aatggctgggttaataactctacgcagggtgcaaccgttgttattaccgcagatgagaaagcaattgcagattttacc gaacgtctgaccaaaacactgccgccaccgggactgatcgaacaactggcagtggaacagctgccgctggaa agctttaccaactttaccattagaccgagtagcgatggtccgaaaaccgcaagcatcctgccagatctgagcacat gtagcgcctgtctgaccgaattatttgatcccagtgatcgtcgttatctgtacccttttattaattgtacccactgtggtcct cgctataccattattgaagcactgccttatgaccgttgtcgtaccacaatggctcgttttcgtcagtgtacggattgtgaa cgtgaatataagcagccgggggaccgccgttttcatgcacagccaaacgcgtgtccgcgttgtggtccgcagctg gcattctggaaccgtcagggtcaagttattgcagaagccaatgaagcactgaatttcgcagtagataatttaaaggt cggtaatattatcgcaatcaaaggtctgggtggttttcatttatgttgtgatgcaaccgattttgaagccgttgaaaaact gcgtttacgtaaacatcgcccggataagccgctggccgttatgtacggtaatctgggtcagattgttgagcattatca gccgaataatttagaagttgagctgctgcagagcgcagcagcacctattgttcttctgaataaaaagaaacagctg attctggttgaaaatattgcaccgggcaatccgcgtgtgggtgttatgctggcatataccccgttacatcacctgttactt aaaaagttaaagaagccgatggttgcaacctccggtaacttagcaggcgaacagatttgtattgacaatattgacg cactgacccgtttacaaaatattgccgacggctttctggttcacgatcgtccgattgtttgtccggttgacgatagtgttgt tcagattgtggcaggtaaaccgttatttttaagaagagcccgcggttatgcaccgcagccgattacccttcctaaacc cacccagaaaaagttattagcaatgggaggccattataaaaataccgttgcaattgcaaagcagaatcaggcata tgtaagccagcatttaggtgatttaaacagcgcaccaacctaccaaaatttcgaagaggcgatagcccatttatcac agctgtatgactttagtccccaggaaattgtcgcagatctgcatccggattactttagccatcagtacgcagaaaacc aagccctgccggtgacgtttgtacagcatcattatgcacatattctggcagttatggcagaacatggtgttatggaag aaagcgttttaggcattgcatgggatggcaccggttatggtatggatggtaccatttggggtggtgaatttctgaaaatt acgcaggggacctggcaaagaattgcacatctgcagccgtttcatctgttagggaatcagcaggcaattaaatatc cgcaccggattgcacttgctctgctgtggccgacattcggggacgattttagcgccgatagtctgggtaattggttaaa ttttaacaacggtttcaagaacaagatcaacagccgtttaaaccaagacttaaataataagaacctgagacaactg tggcagcgtgggcaggcaccgctgacctcgagcatgggcagattatttgatggtatcgcaacactgattggtctgat caatgaagtaacctttgaaggccaggcagcaattgcattagaggcacaaattatgccgaatctgaccgaagaata ctatccgcttaccctgaataacaaagaaaaaaaactggcagttgattggcgtccgctgattaaagcaattaccacc gaagatcgtagcaaaaccaatctgattgcaaccaaatttcataatagcctggttaatctgattattaccattgcacag cagcagggtattgaaaaagttgcactgggtggtggttgttttcagaattgttatctgctggcaagcaccattaccgcac tgaaaaaagcaggttttagcccgctgtggccgcgtgaactgccgccgaatgatggtgcaatttgtatgggtcagctg ctggcaaaaattcaggcacgtcagtatatttgttaactcaacaaaggaggagctggttatgccgggtcagagcacc aaaagcaccctgattatcgggtacgggaacaccttacgtggggacgatggggtggggcgctacctggcagaag aaatagcacagcagaactggccgcactgtggtgttattagcacacatcagctgaccccggaactggccgaagca attgcagcagtggatagagtgatttttattgacgcccaactgcaggaaagtgcaaatgaaccgtcagttgaagttgtt gccctgaaaaccttagaacccaatgaattaagtggagatctgggtcatcgtggtaatccgcgtgagctgctgacctt agccaaaatattatatggtgttgaagtcaaagcgtggtgggttctgattccggcctttacctttgattatggtgagaaatt atcgcccttaacagcacgtgctcaggccgaagcactggcacagattcgtccgctggttctgggggaacgttaaccf agg
La figure 3 représente la carte du plasmide pACYCDuet-1 utilisé pour construire le vecteur d’expression d’au moins un des facteurs de maturation HypA, HypB, HypC, HypD, HypE, HypF et HoxW par insertion de SEQ ID NO:5 et/ou SEQ ID NO:7 et/ou SEQ ID NO:9 et/ou SEQ ID NO:11 et/ou SEQ ID NO:13 et/ou SEQ ID NO:15 et/ou SEQ ID NO:17 et/ou SEQ ID NO:19 dans pACYCDuet-1. pACYCDuet- 1 est un plasmide de 4008pb, possédant une origine de réplication pour E. coli, un gène de résistance au chloramphénicol, deux sites de clonage multiple (MCS) contenant de nombreux sites de restriction, le promoteur T7 et le terminateur de transcription T7. Il contient également le gène lad codant pour un répresseur de transcription. Cette répression de la transcription peut être levée par ajout d’IPTG. La figure 4 montre l’analyse de la digestion du vecteur d’expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW (séquence concaténaire SEQ ID NO:19) par les enzymes de restrictions Ncol et Hindlll. Deux fragments d’ADN à environ 6000pb et à environ 4000pb sont mis en évidence, comme attendu pour une telle digestion enzymatique du vecteur d’expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW. Ceci confirme la présence de la séquence HypABCDEFHoxW dans le vecteur d’expression pACYCDuet-1 .
3. Introduction des vecteurs d’expressions pET26b(+) + HoxH et pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW chez E. coli.
Les cellules compétentes BL21 (DE3) d’E. coli ont été utilisées pour l’expression recombinante de la sous-unité HoxH de la [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803. Ces cellules sont utilisées en routine pour la production de protéine recombinante sous le contrôle du promoteur T7.
Les deux vecteurs d’expression « pET26b(+) + HoxH » et
« pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW » ont été introduits dans ces cellules par co transformation selon la méthode traditionnelle du choc thermique bien connue de l’homme de métier. Les transformants présentant la double résistance à la kanamycine (50pg/ml) et au chloramphénicol (25pg/ml) ont été conservés sur milieu gélosé à 4°C.
4. Vérification de la présence des séquences d’ADN d’intérêts chez E. coli.
Il est possible que certaines colonies possèdent les deux plasmides permettant la résistance aux marqueurs de sélections utilisés sans pour autant posséder les séquences d’ADN d’intérêts, à savoir HoxH et HypABCDEFHoxW. Par conséquent, il est important de vérifier la présence de ces séquences d’ADN d’intérêts. Une expérience, bien connue de l’homme de métier et consistant en une extraction de l’ADN plasmidique de la colonie suivie par une digestion enzymatique de cet ADN plasmidique par les enzymes de restrictions utilisés lors de l’insertion des séquences d’ADN d’intérêts dans les plasmides, a été réalisé.
Ainsi, une extraction d’ADN plasmidique, selon un protocole bien connu de l’homme de métier, a été réalisée sur une colonie présentant la double résistance à la kanamycine et au chloramphénicol.
La digestion enzymatique a ensuite été réalisée, selon un protocole bien connu de l’homme de métier. La digestion du vecteur d’expression pET26b(+) + HoxH par les enzymes de restriction Ndel et Blpl donne deux fragments d’ADN, respectivement le plasmide pET26b(+) linéarisé à 5300pb et le fragment d’ADN d’intérêt HoxH à 1500pb (voir figure 5). La digestion du vecteur d’expression pACYCDuet-1 + HypABCDEFHoxW par les enzymes de restriction Ncol et Hindi II donne deux fragments d’ADN, respectivement le plasmide pACYCDuet-1 linéarisé à 4000pb et le fragment d’ADN d’intérêt HypABCDEFHoxW à 6500pb (voir la figure 6). Ceci confirme la présence dans la colonie bactérienne de la séquence HoxH et HypABCDEFHoxW, respectivement dans les vecteurs d’expression pET26b(+) et PACYCDuet-1 .
5. Production recombinante et purification par chromatographie d’affinité de HoxH chez E. coli.
Pour obtenir la forme recombinante de la sous-unité HoxH de la [NiFe]- hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803, une colonie d’E. coli contenant les deux vecteurs d’expressions a été utilisée pour ensemencer 4 erlenmeyers d’un volume de 250ml chacun. Le milieu de culture utilisé est le milieu 2XYT (16g de tryptone, 10g d’extrait de levure, 5g de NaCI par litre) complété par FeAmCi 100mM, NiSC 50mM, cystéine 50mM, kanamycine 50mg/ml et chloramphénicol 25pg/ml. A une densité optique (DO 600nm) de 1.2, 0,2mM IPTG sont ajoutés à la culture afin d’induire la production recombinante de la sous-unité HoxH à 18°C et sous agitation (vitesse d’agitation) de 200rpm. La durée de la production est de 20h à 18°C. Les cellules sont ensuite récoltées par centrifugation (15min à 4500rpm) avant d’entamer le processus de purification.
Une méthode de purification a été mise au point afin de confirmer la production de la forme recombinante de la sous-unité HoxH de la [NiFe]- hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803. Cette méthode (voir figure 7) permet de purifier FloxFI jusqu’à une apparente homogénéité en une seule étape de chromatographie d’affinité. La méthode implique une chromatographie d’affinité avec un métal immobilisé (IMAC). L’agent chélatant est l’acide nitrilotriacetique (NTA) qui permet la liaison entre la phase immobile et l’ion métallique. Le métal immobilisé est le nickel (Ni). Cette chromatographie permet une séparation très spécifique de protéines contenant une étiquette poly-histidines. Après 20 h de production recombinante de HoxH à 18°C, 1 litre de culture d’E. coli est récolté par centrifugation (15min à 4500rpm). Les cellules sont re-suspendues dans 25ml de tampon de lyse (tampon sodium phosphate 20mM pH 7.5300mM KCI + 2mI benzonase + 50mI MgCL 1 M + 1 pastille composée d’un cocktail d’inhibiteurs de protéases sans EDTA) et ensuite lysées par la presse de French. Le surnageant (25ml) est récupéré par centrifugation (15min à 15000rpm), filtré (0,45miti) et appliqué sur la colonne Ni-NTA (1 ml) préalablement équilibré dans le tampon de lavage (tampon sodium phosphate 20mM pH 7.5 300mM KCI + 10mM imidazole). La colonne est ensuite lavée avec 35ml de tampon de lavage (tampon sodium phosphate 20mM pH 7.5 300mM KCI + 10mM imidazole) jusqu’à ce que l’absorbance à 280nm (représentative de la concentration en protéine) retombe à zéro. L’élution est alors réalisée par l’intermédiaire de 5 paliers avec concentration croissante en imidazole, respectivement 50mM, 100mM, 150mM, 200mM et 250mM) (voir figure 7).
L’analyse SDS-PAGE des diverses fractions obtenues lors de la chromatographie montre une bande prédominante proche de 54kDa, ce qui est la taille attendue pour la sous-unité HoxH, dans les fractions éluées à une concentration de 100mM, 150mM, 200mM et 250mM en imidazole (voir figure 8). HoxH montre par ailleurs un excellent degré de pureté puisqu’aucune bande supplémentaire n’est visualisable dans les fractions éluées à des concentrations de 150mM, 200mM et 250mM en imidazole. Ceci nous permet de conclure que HoxH a été purifié jusqu’à une apparente homogénéité en une seule étape de chromatographie d’affinité. Afin de confirmer qu’il s’agit bien de la forme recombinante de la sous- unité HoxH comprenant le site actif de la [NiFe]-hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803, une immuno-détection à l’aide d’un anticorps anti étiquette poly-histidines a été réalisée (voir figure 9). Un marqueur de poids moléculaire contenant une protéine marquée d’une étiquette poly-histidines a été ajouté afin de servir de contrôle positif. La protéine recombinante FloxFI est bien détectée dans la charge, c’est-à-dire le surnageant issu de la lyse des cellules d’E. coli et appliqué sur la colonne d’affinité Ni-NTA. La protéine recombinante HoxH est également présente dans la fraction non-absorbée par la colonne Ni-NTA. Cela indique que la capacité de chargement de la colonne Ni-NTA est dépassée et qu’une proportion de la protéine recombinante HoxH n’a pas pu s’y fixer. Aucun signal n’apparait dans la « fraction élution 50mM ». La protéine recombinante HoxH reste accrochée à la colonne Ni-NTA à cette faible concentration en imidazole. Enfin, la présence de la protéine recombinante HoxH est confirmée par immuno-détection dans la fraction 200mM à la taille attendue, c’est-à-dire proche de 54 kDa. Ceci confirme de manière non-ambiguë la purification de la protéine recombinante HoxH en une seule étape de chromatographie d’affinité. Lorsque la protéine recombinante HoxH est mise en évidence par immuno-détection dans une fraction, quelques bandes de faible intensité apparaissent également à des poids moléculaires inférieurs à 54kDa. Il s’agit vraisemblablement de la protéine recombinante HoxH partiellement dégradé à l’extrémité C-terminal. La proportion de protéines recombinantes HoxH dégradées semble minimum car l’analyse SDS-PAGE ne montre pas la présence de ces bandes. Pour rappel, l’immuno-détection est une méthode extrêmement sensible mettant en évidence de très petite quantité de protéine. 6. Mise en évidence de l’activité hydrogénase chez la protéine recombinante HoxH
La faculté d’exprimer de manière recombinante les [NiFej- hydrogénases permet une large gamme de possibilités dans l’optique de produire des formes mutantes aux propriétés très différentes de l’enzyme native. La figure 10 montre la structure de HoxEFUYH, la [NiFe]-hydrogénase de Synéchocystis sp. PCC 6803. Le NADPH est le cofacteur de HoxEFUYH in vivo chez Synéchocystis sp. PCC 6803. Le méthyl-viologène (MV) est utilisé comme médiateur redox lors du test standard d’activité in vitro des [NiFe]-hydrogénases. La figure 11 est une représentation schématique (flèche grisée) du transfert d’électrons et des interactions attendues entre HoxEFUYH et le NADPH et/ou le MV.
Il est généralement acquis de l’homme de métier que le MV peut transmettre directement les électrons à un ou plusieurs centres FeS en évitant le FMN. Cependant, comme illustré à la figure 12, il n’est pas connu à ce jour si la seule sous-unité HoxH, contenant le site actif de la [NiFej-hydrogénases HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC 6803, peut accepter les électrons directement du MV et donc produire de l’hydrogène en l’absence de relais redox additionnel.
Dans le cadre de la présente invention, pour tester cette possibilité, a été mis en oeuvre le test standard d’activité in vitro des [NiFej-hydrogénases en présence de la protéine recombinante HoxH et de MV préalablement réduit par le dithionite de sodium (voir figure 13). HoxH est capable de prendre les électrons du méthyl-viologène préalablement réduit pour les combiner avec des protons présents dans le tampon afin de produire de l’hydrogène selon l’équation H2 <® 2H+ + 2e qui représente la réaction catalysée par l’hydrogénase. Ce test standard d’activité in vitro des [NiFej-hydrogénases, selon un protocole bien connu de l’homme de métier, inclut l’utilisation d’une fiole de 2ml fermée par un septum, étanche à l’air et dégazé à l’azote. 1 ml de mélange réactionnel, composé de 100mM de dithionite de sodium et 10mM de MV dissout dans du tampon phosphate 10mM pH 6.8 et également dégazé à l’azote, est ajouté dans la fiole à l’aide d’une seringue. 200pg de protéines recombinantes HoxH sont également ajoutés au mélange réactionnel. La production d’hydrogène démarre dès le moment où les protéines recombinantes HoxH sont ajoutées (moment indiqué par une flèche sur la figure 13). Le contenu en protéines a été déterminé par la méthode Bradford (Bradford. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-254). La production d’hydrogène est monitorée en continu à l’aide d’un micro-senseur à hydrogène préalablement calibré (Unisense, Aarhus, Danemark).
L’activité de la protéine recombinante HoxH peut donc être calculée puisque la quantité de protéine recombinante HoxH ajoutée (en mg.ml_1) est connue tout comme la vitesse de dégagement d’hydrogène (pmol H2.min_1) pour cette quantité spécifique de protéine recombinante ajouté. Cette activité spécifique peut, par exemple, être de 0.1 mitioI H2.min_1.mg_1d’enzyme.
De façon inattendue et surprenante, le fait que la seule sous-unité catalytique HoxH contenant le site actif de la [NiFej-hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803 puisse catalyser la réduction des protons, acceptant les électrons d’un médiateur redox (par exemple, le méthyl-viologène) sans l’intermédiaire de centres FeS additionnel servant de relais redox, a été mis en évidence dans le cadre de la présente invention.
Dans le cadre de la présente invention a également été mis en oeuvre le test standard d’activité in vitro des [NiFej-hydrogénases en présence de la protéine recombinante HoxH, de benzyl viologène et d’hydrogène (voir figure 14). HoxH est capable de prendre les électrons de l’hydrogène pour les donner au benzyl viologène, produisant au passage des protons selon l’équation H2 <® 2H+ + 2e qui représente la réaction catalysée par l’hydrogénase. Ce test standard d’activité in vitro des [NiFej-hydrogénases, selon un protocole bien connu de l’homme de métier, inclut l’utilisation d’une fiole de 2ml fermée par un septum, étanche à l’air et saturé en gaz hydrogène. 2ml de mélange réactionnel, composé de 40pmoles de benzyl viologène dissout dans du tampon Tris 50mM pH 7.6 et également dégazé à l’hydrogène, est ajouté dans la fiole à l’aide d’une seringue. L’expérience est réalisée à 40°C. 340pg de protéines recombinantes HoxH sont également ajoutés au mélange réactionnel. La consommation de l’hydrogène et donc la réduction du benzyl viologène démarre dès le moment où les protéines recombinantes HoxH sont ajoutées. Le contenu en protéines a été déterminé par la méthode Bradford (Bradford. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-254). La réduction du benzyl viologène est monitorée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 578nm. Un coefficient d’extinction molaire de 8.600 M_1 cm-1 a été pris en compte.
L’activité de la protéine recombinante HoxH peut donc être calculée puisque la quantité de protéine recombinante HoxH ajoutée (en mg.ml-1) est connue tout comme la vitesse de consommation d’hydrogène (pmol H2.min_1), équivalente à la vitesse de réduction du benzyl viologène pour cette quantité spécifique de protéine recombinante ajoutée. Cette activité spécifique peut, par exemple, être de 0.1 mitioI H2.min_1.mg·1 d’enzyme.
De façon inattendue et surprenante, le fait que la seule sous-unité catalytique HoxH contenant le site actif de la [NiFej-hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803 puisse catalyser l’oxydation de l’hydrogène, produisant des protons et donnant les électrons à un médiateur redox (par exemple, le benzyl viologène) sans l’intermédiaire de centres FeS additionnel servant de relais redox, a été mis en évidence dans le cadre de la présente invention.
En l’absence de l’expression des autres sous-unités du pentamère HoxEFUYH, les problèmes inhérents à l’état de la technique sont solutionnés au moins en partie : la protéine recombinante HoxH est capable à elle seule de catalyser la réduction des protons, acceptant les électrons d’un médiateur redox (par exemple le méthyl-viologène) sans l’intermédiaire de centres FeS additionnel servant de relais redox. La protéine HoxH est également capable à elle seule de catalyser l’oxydation de IΉ2, réduisant un médiateur redox (par exemple le benzyl viologène) sans l’intermédiaire de centre FeS additionnel servant de relais redox. Cette caractéristique exceptionnelle démontre le grand avantage de la présente invention, en particulier la production recombinante d’une seule sous-unité possédant le site actif d’une [NiFej-hydrogénase et étant catalytiquement active. 7. Production recombinante, purification par chromatographie d’affinité et mise en évidence de l’activité hydrogénase chez la protéine recombinante HoxH produite de manière recombinante chez E. coli en l’absence des facteurs de maturation exogène
De manière semblable à l’exemple 3 ci-dessus, le vecteur d’expression pET26b(+) + HoxH est introduit chez E. coli (cellules compétentes BL21 (DE3)) par transformation selon la méthode traditionnelle du choc thermique bien connue de l’homme de métier, et cela en l’absence du vecteur d’expression pACYCDUET-1 + HypABCDEFHoxW. Les transformants présentent la résistance à la kanamycine (50pg/ml).
De manière semblable à l’exemple 4 ci-dessus, la présence de la séquence d’ADN d’intérêts HoxH a été vérifiée par l’enchainement des expériences bien connues de l’homme de métier que sont l’extraction d’ADN plasmidique et la digestion enzymatique.
De manière semblable à l’exemple 5 ci-dessus, la protéine HoxH a été produite de manière recombinante chez E. coli, mais en absence du plasmide pACYCDUET-1 + HupABCDEFHoxW codant pour les facteurs de maturation exogènes HupABCDEFHoxW. La protéine HoxH a ensuite été purifiée par chromatographie d’affinité, de manière semblable à l’exemple 5 ci-dessus.
De manière semblable à l’exemple 6 ci-dessus, l’activité hydrogénase de la protéine HoxH produite de manière recombinante chez E. coli en l’absence des facteurs de maturation exogène a été mise en évidence selon le protocole impliquant le MV et bien connu de l’homme de métier
Ainsi, dans le cadre de la présente invention a été mis en oeuvre le test standard d’activité in vitro des [NiFe]-hydrogénases en présence de la protéine recombinante HoxH et de MV préalablement réduit par le dithionite de sodium (voir figure 15). HoxH est capable de prendre les électrons du méthyl-viologène préalablement réduit pour les combiner avec des protons présents dans le tampon afin de produire de l’hydrogène selon l’équation H2 <® 2H+ + 2e qui représente la réaction catalysée par l’hydrogénase. Ce test standard d’activité in vitro des [NiFe]- hydrogénases, selon un protocole bien connu de l’homme de métier, inclut l'utilisation d’une fiole de 2ml fermée par un septum, étanche à l’air et dégazé à l’azote. 1 ml de mélange réactionnel, composé de 10OmM de dithionite de sodium et 10mM de MV dissout dans du tampon phosphate 10mM pH 6.8 et également dégazé à l’azote, est ajouté dans la fiole à l’aide d’une seringue. 750pg de protéines recombinantes HoxH sont également ajoutés au mélange réactionnel. La production d’hydrogène démarre dès le moment où les protéines recombinantes HoxH sont ajoutées (moment indiqué par une flèche sur la figure 15). Le contenu en protéines a été déterminé par la méthode Bradford (Bradford. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-254). La production d’hydrogène est monitorée en continu à l’aide d’un micro-senseur à hydrogène préalablement calibré (Unisense, Aarhus, Danemark).
L’activité de la protéine recombinante HoxH peut donc être calculée puisque la quantité de protéine recombinante HoxH ajoutée (en mg.ml_1) est connue tout comme la vitesse de dégagement d’hydrogène (pmol H2.min_1) pour cette quantité spécifique de protéine recombinante ajouté. Cette activité spécifique peut, par exemple, être de 0.1 mitioI H2.min 1.mg 1 d’enzyme.
A été mis en évidence, dans le cadre de la présente invention, le fait que la seule sous-unité catalytique HoxH contenant le site actif de la [NiFe]- hydrogénase HoxEFUYH de Synéchocystis sp. PCC6803 peut catalyser la réduction des protons, acceptant les électrons d’un médiateur redox (par exemple, le méthyl-viologène) sans l’intervention des facteurs de maturation HupABCDEFHoxW exogènes à E. coli.
La présente invention a été décrite en relation avec des modes de réalisations spécifiques, qui ont une valeur purement illustrative et ne doivent pas être considérés comme limitatifs. D’une manière générale, il apparaîtra évident pour l’homme du métier que la présente invention n’est pas limitée aux exemples illustrés et/ou décrits ci-dessus.
L’usage des verbes « comprendre », « inclure », « comporter », ou toute autre variante, ainsi que leurs conjugaisons, ne peut en aucune façon exclure la présence d’éléments autres que ceux mentionnés.
L’usage de l’article indéfini « un », « une », ou de l’article défini « le », « la » ou « », pour introduire un élément n’exclut pas la présence d’une pluralité de ces éléments.

Claims

Revendications
1. Polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.
2. Polypeptide monomérique selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu’il est isolé de son environnement naturel, en particulier isolé d’une protéine naturelle de type [NiFe]-hydrogénase.
3. Polypeptide monomérique selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu’il est recombinant ou hétérologue.
4. Polypeptide monomérique selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il est purifié.
5. Polypeptide monomérique selon l’une quelconque des revendications précédentes dont la séquence en acides aminés tronquée ou non présente au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ
ID NO:4.
6. Polypeptide monomérique selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase est la sous-unité FloxFI de la protéine de type [NiFe]-hydrogénase FloxEFUYFI chez / de Synechocystis sp. PCC6803.
7. Polypeptide monomérique selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il présente une activité hydrogénase d’au moins 0,01 mitioI H2 . min-1 . rng-1 d’enzyme, de préférence d’au moins 0,05 mitioI H2 . min-1 . mg_1 d’enzyme, préférentiellement d’au moins 10 mitioI H2 . min-1 . mg_1 d’enzyme.
8. Cellule hôte incluant un polypeptide monomérique selon l’une quelconque des revendications 1 à 7.
9. Cellule hôte selon la revendication 8, caractérisée en ce qu’elle inclut en outre au moins un facteur de maturation de ladite protéine de type [NiFe]- hydrogénase, ledit au moins un facteur de maturation étant endogène à la cellule hôte et/ou exogène à la cellule hôte, de préférence au moins un facteur de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase choisi dans le groupe constitué des facteurs de maturation FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF et FloxW a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, respectivement par rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l’ensemble de ces facteurs de maturation.
10. Cellule hôte selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce que ledit polypeptide monomérique et/ou ledit au moins un facteur de maturation est/sont issu(s) de l’expression d’au moins un gène indu dans un vecteur d’expression, ledit vecteur d’expression étant indu dans ladite cellule hôte.
11. Cellule hôte incluant un polynucléotide codant pour un polypeptide monomérique selon l’une quelconque des revendications 1 à 7.
12. Cellule hôte selon la revendication 11 , caractérisée en ce qu’elle inclut en outre au moins un facteur de maturation de ladite protéine de type [NiFe]- hydrogénase, ledit au moins un facteur de maturation étant endogène à la cellule hôte et/ou exogène à la cellule hôte, de préférence au moins un facteur de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase choisi dans le groupe constitué des facteurs de maturation FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF et FloxW a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, respectivement par rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l’ensemble de ces facteurs de maturation.
13. Cellule hôte selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que ledit polypeptide monomérique et/ou ledit au moins un facteur de maturation est/sont issu(s) de l’expression d’au moins un gène indu dans un vecteur d’expression, ledit vecteur d’expression étant indu dans ladite cellule hôte.
14. Procédé d’obtention d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
• une étape de modification génétique, réalisée in-vivo ou in-vitro, d’une entité comprenant un matériel génétique, par exemple d’une cellule hôte ou d’un vecteur d’expression, pour obtenir une entité génétiquement modifiée, par exemple une cellule hôte génétiquement modifiée ou un vecteur d’expression génétiquement modifié ; • une étape d’incubation de ladite entité génétiquement modifiée, par exemple de ladite cellule hôte génétiquement modifiée ou dudit vecteur d’expression génétiquement, pour obtenir un polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase.
15. Procédé d’obtention d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite étape de modification génétique, réalisée in-vivo ou in-vitro, consiste : a) en une modification génétique d’une cellule hôte et/ou d’un vecteur d’expression en y incluant un polynucléotide exogène dont au moins une partie code pour un polypeptide monomérique comportant une seule sous- unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, pour obtenir une cellule hôte génétiquement modifiée et/ou un vecteur d’expression génétiquement modifié à incuber lors de ladite étape d’incubation réalisée selon des conditions d’incubation permettant d’assurer une expression dudit polynucléotide exogène pour produire ledit polypeptide monomérique ; ou b) en l’induction d’au moins une mutation génétique d’une cellule hôte pour obtenir une cellule hôte génétiquement modifiée à incuber lors de ladite étape d’incubation réalisée selon des conditions d’incubation pour produire ledit polypeptide monomérique.
16. Procédé d’obtention d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase selon la revendication 15, caractérisé en ce que ladite étape de modification génétique de ladite cellule hôte par inclusion d’un polynucléotide exogène consiste en une inclusion dans ladite cellule hôte d’un vecteur d’expression, en particulier d’un vecteur d’expression modifié, incluant ledit polynucléotide exogène.
17. Procédé d’obtention d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que ladite étape de modification génétique de ladite cellule hôte consiste en une inclusion dans ladite cellule hôte dudit polynucléotide exogène dont au moins une partie code pour ledit polypeptide monomérique dont la séquence en acides aminés tronquée ou non présente au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:2 et/ou par rapport à la séquence en acides aminés de SEQ ID NO:4.
18. Procédé d’obtention d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase selon l’une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que ladite étape de modification génétique de ladite cellule hôte comprend en outre l’inclusion dans ladite cellule hôte d’au moins un facteur de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit au moins un facteur de maturation étant endogène à la cellule hôte et/ou exogène à la cellule hôte, de préférence l’inclusion d’au moins un facteur de maturation de ladite protéine de type [NiFe]-hydrogénase choisi dans le groupe constitué des facteurs de maturation FlypA, HypB, FlypC, HypD, HypE, HypF et FloxW a) dont les séquences respectives en acides aminés présente chacune au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, respectivement par rapport aux séquences en acides aminés SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 ; ou b) codés ensemble par une séquence nucléotidique concaténaire présentant au moins 15% d’identité, de préférence au moins 20% d’identité, plus préférentiellement au moins 40% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 60% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 80% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 90% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 95% d’identité, plus préférentiellement encore au moins 99% d’identité, par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID NO:19, laquelle code pour l’ensemble de ces facteurs de maturation.
19. Procédé d’obtention d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase selon la revendication 18, caractérisé en ce que ledit au moins un facteur de maturation est issu de l’expression d’au moins un gène indu dans un vecteur d’expression, ledit vecteur d’expression étant indu dans ladite cellule hôte.
20. Procédé d’obtention d’un polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase selon l’une quelconque des revendications 14 à 20, caractérisé en ce qu’il comprend une étape subséquente d’isolation et/ou de purification dudit polypeptide monomérique.
21 . Utilisation d’un polypeptide monomérique selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 ou d’un polypeptide monomérique obtenu selon le procédé suivant les revendications 14 à 20, ledit polypeptide monomérique comportant une seule sous-unité comprenant le site actif d’une protéine de type [NiFe]-hydrogénase, ledit polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase et étant présent ou non dans une cellule, pour produire ou consommer de l’hydrogène par incubation dudit polypeptide monomérique selon des conditions d’incubation permettant d’assurer une production ou une consommation d’hydrogène ou pour revêtir une surface, en particulier pour revêtir une surface d’un conducteur électrique, par exemple pour revêtir une surface d’une anode ou d’une cathode.
EP20803204.5A 2019-11-13 2020-11-12 Polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase, en particulier polypeptide monomérique recombinant présentant une activité hydrogénase Pending EP4058567A1 (fr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19208856 2019-11-13
BE20195783A BE1027221B1 (fr) 2019-11-13 2019-11-13 Polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase, en particulier polypeptide monomérique recombinant présentant une activité hydrogénase
PCT/EP2020/081931 WO2021094465A1 (fr) 2019-11-13 2020-11-12 Polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase, en particulier polypeptide monomérique recombinant présentant une activité hydrogénase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP4058567A1 true EP4058567A1 (fr) 2022-09-21

Family

ID=73138861

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP20803204.5A Pending EP4058567A1 (fr) 2019-11-13 2020-11-12 Polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase, en particulier polypeptide monomérique recombinant présentant une activité hydrogénase

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230011570A1 (fr)
EP (1) EP4058567A1 (fr)
JP (1) JP2023502034A (fr)
CN (1) CN114901814B (fr)
CA (1) CA3160285A1 (fr)
WO (1) WO2021094465A1 (fr)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2020437A1 (fr) * 2007-08-03 2009-02-04 Commissariat A L'energie Atomique (NiFe)-hydrogénases dotées d'une résistance améliorée au dioxygène, procédé pour leur obtention et application correspondante
WO2009075798A2 (fr) * 2007-12-05 2009-06-18 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Polypeptide hydrogénase et ses procédés d'utilisation
BR112017010973A2 (pt) * 2014-11-26 2018-02-14 Invista Tech Sarl métodos para fabricação de 7-hidroxioctanoato e para biossintetização de 6-hidroxi-hexanoato, hospedeiro recombinante, produto bioderivado, produto de base biológica ou produto derivado de fermentação, organismo, rede bioquímica, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, e, composição.
US20160145657A1 (en) * 2014-11-26 2016-05-26 Invista North America S.á.r.l. Methods and Materials for Producing 7-Carbon Chemicals via a C9 Route

Also Published As

Publication number Publication date
CA3160285A1 (fr) 2021-05-20
JP2023502034A (ja) 2023-01-20
WO2021094465A1 (fr) 2021-05-20
CN114901814A (zh) 2022-08-12
CN114901814B (zh) 2024-12-27
US20230011570A1 (en) 2023-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
King et al. Functional studies of [FeFe] hydrogenase maturation in an Escherichia coli biosynthetic system
Burgdorf et al. The soluble NAD+-reducing [NiFe]-hydrogenase from Ralstonia eutropha H16 consists of six subunits and can be specifically activated by NADPH
Posewitz et al. Discovery of two novel radical S-adenosylmethionine proteins required for the assembly of an active [Fe] hydrogenase
Sun et al. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production
Singh et al. Identification of an atypical membrane protein involved in the formation of protein disulfide bonds in oxygenic photosynthetic organisms
EP2764107B1 (fr) Système de régénération de cofacteurs
Lauterbach et al. Catalytic properties of the isolated diaphorase fragment of the NAD+-reducing [NiFe]-hydrogenase from Ralstonia eutropha
Schwarze et al. Requirements for construction of a functional hybrid complex of photosystem I and [NiFe]-hydrogenase
US9249440B2 (en) Hydrogenase polypeptide and methods of use
Bialek et al. Deeply branching c 6-like cytochromes of cyanobacteria
Kim et al. Production of hydrogenases as biocatalysts
Doron et al. Towards using bacterial microcompartments as a platform for spatial metabolic engineering in the industrially important and metabolically versatile Zymomonas mobilis
BE1027221B1 (fr) Polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase, en particulier polypeptide monomérique recombinant présentant une activité hydrogénase
Kaewbai-ngam et al. Production of glycogen, PHB, biohydrogen, NAD (P) H, and proteins in Synechocystis sp. PCC 6803 disrupted in metabolically linked biosynthetic pathway (s)
EP4058567A1 (fr) Polypeptide monomérique présentant une activité hydrogénase, en particulier polypeptide monomérique recombinant présentant une activité hydrogénase
Sybirna et al. New insights into the systems for heterologous synthesis and maturation of hydrogenases, the most efficient biohydrogen producers
US20150140592A1 (en) Development of microorganisms for hydrogen production
Wu et al. Characterization and cloning of oxygen-tolerant hydrogenase from Klebsiella oxytoca HP1
CN105264081A (zh) 通过生产蚁酸(甲酸)储存气态氢的方法
EP1809754B1 (fr) Production d&#39;hydrogene par expression heterologue d&#39;une nad (p) h deshydrogenase de type ii chez chlamydomonas.
Lee et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for the utilization of methylsuccinate, the product of methane activation via fumarate addition
Davies Characterisation of the reversible formate dehydrogenases of Shewanella
Schwarz et al. Hydrogenases and hydrogen metabolism in photosynthetic prokaryotes
US12492413B2 (en) Genetically modified phototrophic cell for in-vivo production of hydrogen
Choe et al. Expression of the NAD-dependent FDH1 β-subunit from Methylobacterium extorquens AM1 in Escherichia coli and its characterization

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: UNKNOWN

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20220511

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)